ES2332558B1

ES2332558B1 - Grk2 terapia antitumoral.

Info

Publication number: ES2332558B1
Application number: ES200703272A
Authority: ES
Inventors: Federico Mayor Mendez; Maria Helena Holguin Asensio; Petronila Penela Marquez; Alicia Salcedo Haro; Ana Ruiz Gomez
Original assignee: Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 2007-12-11
Filing date: 2007-12-11
Publication date: 2011-01-24
Anticipated expiration: 2027-12-11
Also published as: ES2332558A1; WO2009074707A1

Abstract

GRK2 terapia antitumoral.

Empleo de siRNA para la inhibición de la expresión de GRK2 como terapia antitumoral en cánceres en los que la AKT esté cooperando con GRK2 en la adquisición de las características tumorales. Empleo de este siRNA como agente terapéutico en el tratamiento del melanoma, y cáncer de mama.

Description

GRK2 terapia antitumoral.

La presente invención pertenece al campo de la biología, biología molecular y bioquímica. Se dirige a la regulación de la expresión de GRK2 para el tratamiento del melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, gliomas y cáncer de tiroides.

Antecedentes de la invención

Las quinasas de receptores acoplados a proteínas G (GRKs - G protein-coupled receptor kinases) participan, junto con las arrestinas, en los procesos de regulación de múltiples receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de gran relevancia fisiológica y farmacológica. Estas proteínas forman una familia de siete miembros (GRK1-GRK7) que fosforilan específicamente receptores activados por agonista en residuos de serina/treonina, promoviendo procesos de internalización, reciclaje y/o degradación de GPCRs en combinación con las \beta-arrestinas (Fig. 1). Las proteínas GRKs poseen además otros sustratos de membrana no GPCRs, así como sustratos citosólicos que diversifican las consecuencias funcionales de la actividad de estas quinasas. Asimismo, se han identificado numerosas moléculas con las que las GRKs interaccionan de modo independiente de la actividad quinasa (Pao, 2002; Ribas, 2007), lo cual pone de manifiesto la existencia de funciones "scaffold" o de andamiaje para esta familia de proteínas.

Dado que los GPCR modulan procesos celulares básicos (diferenciación, migración, ciclo celular, respuestas antiapoptóticas) con frecuencia su actividad se halla involucrada en el origen y desarrollo de tumores de distinta naturaleza (Dorsam, 2007). Así, potentes mitógenos como trombina, S1P, LPA, sonic hedgehod o endotelina regulan la proliferación en células tumorales y sus receptores se hallan sobreexpresados en varios tipos de cáncer (colon, mama, próstata, melanoma). Asimismo, receptores de quimioquinas como CXCR4 o CXCR2 desempeñan un papel central en la metástasis tumoral. Las células tumorales que sobreexpresan estos receptores son activadas por quimioquinas liberadas por células estromales, macrófagos y leucocitos infiltrados en el tumor, estimulando la motilidad y supervivencia de las células cancerosas.

Dado que la señalización de los receptores GPCRs en contextos tumorales exhibe frecuentemente cambios, bien como consecuencia de una amplificación en los niveles de expresión de los mismos, bien como resultado de alteraciones en los mecanismos de regulación de su funcionalidad conducentes a una ganancia de función, es de interés general analizar los procesos que modulan a su vez la actividad de las moléculas reguladoras de estos receptores. En este sentido la proteína GRK2, que es la más ubicua y mejor caracterizada isoforma de la familia de GRKs, se perfila como una molécula clave en la señalización celular con un gran potencial fisiopatológico en contextos tumorales, ya que no sólo regularía la actividad de distintos GPCRs implicados en cáncer, sino también de proteínas citosólicas implicadas en vías de señalización proliferativas y de supervivencia (p38, Smads, entre otras), así como de proteínas de membrana no GPCRs con potencial oncogénico (receptor de EGF). Asimismo, GRK2 es capaz de modular diversas proteínas como por ejemplo PI3K, ERK o GIT1 de manera independiente de fosforilación, sugiriendo que posee propiedades de proteína adaptadora o "scaffold" (Fig. 2). Dada la compleja diversidad funcional de GRK2, existen en la célula sofisticados mecanismos que regulan tanto la actividad de la quinasa como sus niveles de expresión, cuya alteración se asocia a situaciones patológicas. Así, el estudio de los procesos que regulan la estabilidad y funcionalidad de GRK2, ha revelado que cambios en la estabilidad de la proteína y/o en su funcionalidad tienen repercusiones directas en la fisiología celular, mostrando la participación de GRK2 en la migración celular y en procesos de transformación neoplásica.

Descripción de la invención

La presente invención se enfrenta con el problema de inhibir la acción de la GRK2, no sólo a nivel de su actividad serina-treonina kinasa, sino de sus funciones "scaffold". Así, la supresión de la expresión de GRK2 en las enfermedades cancerosas en las que esta proteína se encuentra sobreexpresada, y en las que está contribuyendo o cooperando con AKT en la adquisición y mantenimiento de las características tumorales, sería una terapia apropiada.

En este sentido, la presente invención proporciona una secuencia de ribonucleótidos o RNA que pertenece al denominado siRNA (small interfering RNA), ARN pequeño de interferencia o ARN de silenciamiento, capaz de inhibir la expresión genética de la proteína GRK2 (de aquí en adelante siRNA de la invención), proporcionando nuevas técnicas eficaces contra la proliferación y la migración celular, relacionadas con el cáncer. La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han observado que es posible la inhibición de la proliferación y migración celular en determinados tipos de cáncer, mediante el uso de una molécula de RNA de secuencia concreta que se une al ARN mensajero que codifica para la proteína GRK2 impidiendo su traducción y por tanto inhibiendo su expresión. Así, el empleo de siRNA, tal y como se describe en esta memoria, permite la inhibición de la expresión de GRK2 en patologías tumorales en las que la proteína GRK2 se halla sobre-expresada como resultado de una amplificación funcional de la vía de señalización dependiente de PI3K, contribuyendo a la transformación tumoral y cooperando -con Akt.

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición (de aquí en adelante composición de la invención) que comprende un siRNA capaz de inhibir la proliferación y migración celular basado en la inhibición de la expresión de la proteína GRK2, para su uso en aquellos contextos patológicos en los que el GRK2 esté contribuyendo o cooperando con AKT en la adquisición o mantenimiento de características tumorales.

Una realización preferida de la invención, lo constituye una composición de la invención que comprenda una construcción de RNA (construcción de RNA de la invención) que al menos contenga una cualquiera de las secuencias de nucleótidos posibles de siRNA capaces de inhibir la expresión de GRK2, y sin perjuicio de que adicionalmente formen parte de la presente invención cualquiera de las secuencias y construcciones de RNA de la invención anteriormente descritas que sean objeto de modificaciones, preferentemente químicas, que conduzcan a una mayor estabilidad frente a la acción de ribonucleasas y con ello a una mayor eficiencia. Sin que dichas modificaciones supongan la alteración de su mecanismo de acción, que es la unión específica al complejo RISC (RNA-induced silencing complex), activándolo y manifestando una actividad helicasa que separa las dos hebras dejando solo la hebra antisentido asociada al complejo. El complejo ribonucleoprotéico resultante se une al mRNA diana (ARN mensajero del GRK2). Si la complementariedad no es perfecta, RISC queda asociado al mensajero y se atenúa la traducción. Pero si es perfecta, RISC actúa como RNasa, cortando al mensajero y quedando libre para repetir el proceso.

La composición de la presente invención se utiliza en el tratamiento de aquellos tipos de cáncer, en los que se ha observado que la proteína GRK2 se encuentra cooperando con la AKT, como son el melanoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, gliomas y cáncer de tiroides.

La preparación de la secuencia de siRNA de la invención o de la construcción de RNA de la invención sería evidente para un experto en la materia, y se podría llevar a cabo por síntesis química, lo cual permite además la incorporación de modificaciones químicas tanto en los distintos nucleótidos del producto como la incorporación de otros compuestos químicos en cualquiera de los extremos. Por otro lado, la síntesis también podría realizarse enzimáticamente utilizando cualquiera de las RNA polimerasas disponibles. La síntesis enzimática también permite alguna modificación química de los productos o RNAs inhibidores.

El diseño de la secuencia de nucleótidos del siRNA de la invención también sería evidente para un experto en la materia. Así, se podría realizar mediante un diseño aleatorio en el que se seleccionen 19-21 bases del ARNm diana sin tener en cuenta la secuencia o la información posicional que tiene en el transcrito. Otra alternativa no limitativa de la presente invención sería el diseño convencional mediante parámetros simples desarrollados por los pioneros de la técnica (Calipel, A. et al., 2003) completados con un análisis BLAST de nucleótidos. Otra posibilidad podría ser un diseño racional, en el que se emplee un procedimiento informático dirigido a identificar las dianas óptimas de siRNA en un ARNm. Las secuencias diana se analizan en grupos de 19 nucleótidos a la vez y se identifican las que tienen mejores ca-
racterísticas en función de un algoritmo que incorpora un gran número de parámetros termodinámicos y de secuencia.

Un segundo aspecto de la invención lo constituye una composición (de aquí en adelante segunda composición de la invención) que comprenda una construcción genética de DNA, en adelante construcción genética de DNA de la invención, la cual dirigiría la transcripción in vitro o intracelular de la secuencia siRNA o construcción de RNA de la invención, y que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de nucleótidos de DNA, preferentemente de doble cadena, que comprende, al menos, la secuencia codificante del siRNA de la invención o de la construcción de RNA de la invención para su transcripción in vitro, o, b) secuencia de nucleótidos de DNA, preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende la secuencia codificante de la secuencia de RNA de la invención operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), etc... para su uso en aquellos contextos patológicos en los que el GRK2 está contribuyendo a la adquisición o mantenimiento de características tumorales en cooperación con la vía de señalización dependiente de PI3K y Akt. Múltiples de estos sistemas o vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia (Sambrook et al., 1989) y forman parte de la presente invención.

Las composiciones de la presente invención permiten la transfección del siRNA de la invención al interior de una célula, in vivo o in vitro. La transfección se podría llevar a cabo, pero sin limitarnos a, transfección directa o vectores que faciliten el acceso del siRNA al interior de la célula. Así, ejemplos de estos vectores son, sin limitarse a, retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus del Herpes simplex, plásmidos de DNA no virales, liposomas catiónicos y conjugados moleculares.

Así, por ejemplo, los siRNA de la presente invención, así como ARN o ADN precursores de estos siRNA, pueden conjugarse con péptidos de liberación u otros compuestos para favorecer el transporte de estos siRNA al interior de la célula. Entre estas proteínas se encuentran aquellas conocidas en el estado del arte, que tienen propiedades que favorecen la penetración en las células. Como ejemplos, y sin limitarse a estos, se incluyen los que se describen en la solicitud de patente US 20040204377.

En una realización aún más preferida de la presente invención, la transferencia a las células tumorales del siRNA de la invención se podría realizar fusionando construcciones siRNA-GRK2 a RNA-aptámeros. La presencia en las construcciones de siRNA-GRK2 de RNA-aptameros con capacidad de unión selectiva a antígenos tumorales permite dirigir el siRNA a células tumorales para inhibir la expresión del GRK2. Esto permitiría una transferencia selectiva y eficiente a las células tumorales.

Normalmente los aptámeros son susceptibles a la degradación por nucleasas en el medio intracelular. En este sentido y con el fin de solucionar este problema se pueden presentar modificaciones en la estructura química que los provean de una resistencia notable a la degradación. Las modificaciones que involucran la posición 2' han sido particularmente utilizadas pues se sabe que el radical -OH en este carbono es indispensable en el mecanismo de reacción de las nucleasas. El cambio más común es la sustitución con un grupo -NH2 que permite prolongar el tiempo de vida de los oligoribonucleótidos en más de 20 veces, Otra estrategia para impedir la degradación de aptámeros es utilizar las configuraciones especulares de los blancos en una selección convencional para generar los D-aptámeros normales. Una vez conocida su secuencia son sintetizados en su conformación L-enantiomérica que es reconocida específicamente por el blanco natural pero no es sustrato de las nucleasas presentes en el medio celular.

Los siRNAs de la invención pueden también suministrarse mezclados con agentes de liberación, como por ejemplo, dendrímeros.

En un tercer aspecto de la invención se contempla que las composiciones de la presente invención son composiciones farmacéuticas, que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de la secuencia de siRNA de la invención y/o construcción de RNA de la invención y/o construcciones genéticas de DNA de la invención, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

En el contexto de la presente memoria se entiende como "siRNA" (small interfering RNA ó ARN pequeño de interferencia) una clase de ARN de doble cadena de 20 a 25 nucleótidos de largo, y más preferentemente entre 21 y 23 nucleótidos, que está involucrado en la ruta de la interferencia de ARN, donde el siRNA interfiere la expresión de un gen específico. En la presente invención, este gen específico es el GRK2. En este sentido, la presente invención utiliza a título ilustrativo como siRNA la SEQ ID NO: 2, secuencia nucleotídica capaz de inhibir la expresión de GRK2 en células tumorales, lo cual impide que dichas células malignas desarrollen tumores in vivo (ver ejemplo 6).

En el contexto de la presente invención, las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 representa las secuencias que flanquean la región 5' y 3' respectivamente de la SEQ ID NO: 2 para crear el hairpin en la estructura que se expresará con el adenovirus. La Fig. 3 muestra la estructura secundaria más probable que adoptaría esta construcción de siRNA.

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Como "GRK2", en el contexto de la presente invención, se define una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína GRK2, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucléico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1,

b) moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucléico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucléico que codifican un polipétptido que comprende la secuencia aminoacídica con una homología de un 99%, 98%, 95%, 90%, o un 80% con la SEQ ID NO: 1.

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en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucléicos posee la actividad catalítica, la actividad scaffold y las características estructurales de GRK2.

En el contexto de la presente invención el término "homología" hace referencia a la semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más concretamente, a la semejanza entre dos o más secuencias aminoacídicas.

Dado que las secuencias nucleotídicas del gen GRK2 son afines en cuanto a su evolución, y dado que la función de este depende de la secuencia aminoacídica a la que se transcribe, puede esperarse que la homología global de los genomas al nivel de los aminoácidos, en distintos grupos de poblaciones y/o individuos, y en distintos animales, y más concretamente a nivel de la secuencia aminoacídica que se recoge en la SEQ ID NO: 1, sea de un 80% o mayor, y más preferiblemente de un 90% o mayor y más preferiblemente de un 95, un 98 o un 99% o mayor. La correspondencia entre la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1 y la secuencia perteneciente a otro individuo u organismo se puede determinar por métodos conocidos en la técnica.

En el contexto de esta memoria, se entiende por "AKT" aquellas proteínas con actividad quinasa que fosforilan diversos sustratos en serinas y treoninas y son activadas por su translocación a la membrana plasmática y su unión al fosfolípido PIP3. Estas proteínas, de las que existen varias isoformas (Aktl o PKB\alpha, Akt2 o PKB\beta y Akt3 o PKB\gamma, se encuentran reguladas por numerosos factores de crecimiento y desempeñan un papel clave en la supervivencia celular, proliferación y migración celular.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "modificaciones químicas" se refiere a la introducción de nucleótidos modificados químicamente en la secuencia de RNA de la invención, por ejemplo, y sin limitarse a éstos, grupos S sustituyendo O en la cadena fosfodiéster, o la inclusión de 5 metilcitosinas, que permiten incrementar la eficiencia del mismo (conferir mayor resistencia frente a degradación, favorecer su entrada a las células, etc), así como cualquier modificación en la pentosa o en la base nitrogenada. Otras modificaciones del siRNA que pueden aumentar la estabilidad son aquellas que se describen en Bolcato-Bellemin et al. 2007 en las que se introduce cortas secuencias de poli-dA y poli-dT protuberantes y complementarias en los extremos del siRNA favoreciendo así la agregación y formación de concatémeros.

Tal y como se usa en esta memoria, el término "transfección" se refiere a la introducción o transferencia de una molécula de ácido nucléico exógena en una célula eucariota, incluyendo, pero no limitándose a ella, una molécula de ácido ribonucléico o desoxiribonucleico (por ejemplo, RNA ó DNA desnudo).

En el contexto de la presente invención se entiende por "aptámeros" moléculas de ácido nucléico que son capaces de unirse a otra molécula de particular interés con gran afinidad y especificad (Tuerk y Gold, 1990; Ellington y Szostak, 1990). En el contexto de la presente invención, esta molécula diana de particular interés sería un antígeno tumoral específico o un marcador indicativo de que la célula ha adquirido características tumorales. Un aptámero se obtiene típicamente por selección in vitro de la unión a una molécula diana. Sin embargo, la selección in vivo también es posible. Tiene típicamente entre 10 y 300 nucleótidos de longitud. Más comúnmente, un aptámero debe estar entre 30 y 100 nucleótidos de longitud.

En esta memoria, se entiende por "dendrímeros" polímeros altamente ramificados con arquitectura bien definida, capaces de liberar otros compuestos a la célula.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de secuencia de siRNA de la invención o a la cantidad de una construcción génica de RNA o DNA, que permitan su expresión intracelular calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichas secuencias y construcciones y el efecto terapéutico a conseguir. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición proporcionada por esta invención se efectúa por vía subcutánea, pudiendo ser posibles otras vías como por ejemplo la vía intraperitoneal, parenteral, etc.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Regulación de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) por las proteínas GRKs y \beta-arrestinas. La desensibilización homóloga se inicia con la fosforilación del receptor activado por las GRKs y concluye con el reclutamiento de las \beta-arrestinas que desacoplan funcionalmente al receptor de las proteínas G. Asimismo, las \beta-arrestinan interaccionan directamente con la maquinaria endocítica necesaria para llevar a cabo la internalización de receptores. Una vez presentes en endosomas, la capacidad andamio de \beta-arrestina permite el acoplamiento de los receptores desensibilizados con diversas proteínas señalizadoras como c-Src y MAPK. Posteriormente, el receptor defosforilado se recicla y se localiza de nuevo en la membrana plasmática o bien se degrada en lisosomas.

Fig. 2 Interactoma funcional de GRK2. Numerosas proteínas implicadas en la transducción de señales interaccionan con GRK2 y son reguladas por esta proteína. Así, la actividad quinasa de GRK2 no sólo determina el estado funcional de un gran número de receptores GPCR sino también el de diversos sustratos citosólicos, lo cual permite modular diferentes procesos celulares. Por otro lado, nuevas funciones de GRK2 surgen debido a su capacidad para interaccionar con multitud de proteínas, independientemente de su actividad quinasa.

Fig. 3 Construcción de siRNA que representa la estructura secundaria más probable, y que incluye la SEQ ID NO: 2, y las secuencias flanqueantes que forman el hairpin, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Es la construcción de siRNA con la que se han llevado a cabo los ejemplos de la invención.

Fig. 4 Análisis de los niveles de GRK2 y del estado de activación de AKT en muestras de pacientes con carcinoma de mama. Muestras de carcinoma ductal infiltrante de mama así como de tejido normal procedente de los mismos se procesaron para cuantificar, mediante técnicas de inmunodetección con anticuerpos específicos, los niveles de la proteína GRK2 y de fosforilación de AKT. Los datos densitométricos obtenidos se normalizaron con los niveles de actina y AKT total, respectivamente. A y B) Se representan las medias de cada individuo procedentes de 4-5 determinaciones tomando como referencia los valores de una muestra control aleatoria. Se indica en cada población (control y tumoral) el valor promedio (—). C) Representación estratificada de las muestras tumorales AKT positivas y negativas en relación al grado de expresión de GRK2, tomando como referencia el valor promedio de la población control. Se consideran muestras positivas o negativas aquellas que difieren como mínimo en un 15% del valor promedio control teniendo en cuenta la desviación estándar de la media. D) Representación en histograma de los niveles de GRK2 anteriores correspondientes a las muestras tumorales, mostrando datos clínicos relevantes.

Fig. 5 La unión de factores de crecimiento como el IGF1 a sus receptores promueve la estimulación de la PI3K y la producción del fosfolípido PIP3, el cual induce la activación de la quinasa AKT. La ligasa Mdm2, responsable de la degradación de GRK2, es fosforilada por AKT y dicha modificación dirige la ligasa al núcleo impidiendo su interacción con GRK2 y favoreciendo la estabilización de la proteína y su sobre-expresión.

Fig. 6 Los niveles de GRK2 afectan a la capacidad de migración de células MCF-7 y MCF10A en respuesta a fibronectina. Se realizaron experimentos de migración quimiotáctica en repuesta a fibronectina en células MCF7 (panel A) y MCF10A (panel B) transfectadas con el vector de expresión de GRK2, el vector de expresión de la construcción siRNA de GRK2 o el vector vacío en combinación con el vector de CD-8 y seleccionadas por el método dynabeads. Se representan las \pmSEM de 3-4 experimentos realizados por duplicados.

Fig. 7 Modulación por GRK2 de la migración inducida por distintas señales quimiotácticas difusibles. Las células MCF7 (panel A) transitoriamente transfectadas con un vector vacío, el vector de expresión de GRK2 o de la construcción de siRNA-GRK2, se seleccionaron como anteriormente para ensayos de migración quimiotáctica a las señales indicadas. Similares ensayos se llevaron a cabo en las células Hs578T (panel B) infectadas o no con el adenovirus control y la construcción de siRNA-GRK2 a MOI 100. Se representaron las medias \pmSEM de 3-4 experimentos realizados por duplicado donde *p< 0,05 y **p<0,01, cuando se comparan con los controles de transfección del vector vacío o con las células infectadas con el Adcontrol (Hs578T), no difiriendo la motilidad de éstas últimas respecto a las células sin infectar.

Fig. 8 La capacidad de invadir matrigel en células MCF7 está modulada por los niveles de GRK2. A) Las células transfectadas en las mismas condiciones mencionadas anteriormente se utilizaron para realizar experimentos de invasión en matrigel en respuesta a 20% suero. B) Las células MCF7 sin infectar e infectadas con el adenovirus control o con la construcción siRNA-GRK2 a MOI 100 se emplearon para realizar experimentos de invasión en matrigel en respuesta a los estímulos indicados. Se representan las \pmSEM de 3-4 experimentos realizados por duplicado donde *p<0,05 **p<0,01 y ***p<0,001, comparando con los controles de transfección de vector vacío o con los de células infectadas con el adenovirus control. Se muestran autorradiografías representativas de los cambios incluidos en los niveles de GRK2.

Fig. 9 Los niveles de GRK2 afectan a la capacidad invasiva de líneas celulares procedentes de tumores metastáticos. Las células de carcinoma de mama Hs578T (panel A) y el melanoma B16F10 (panel B) sin infectar e infectadas con el adenovirus control o con la construcción siRNA-GRK2 a MOI 100 se utilizaron para ensayos de invasión en matrigel en respuesta a suero. *p<0,05, **p<0,01. La reducción de los niveles de GRK2 se confirmó mediante inmunodetección.

Fig. 10 Efecto de los niveles de GRK2 en la proliferación celular. Las células MCF-7 se infectaron tal y como se ha indicado anteriormente con el vector adenoviral de la construcción siRNA de GRK2 o con el adenovirus control. La proliferación celular se determinó por el método CellTiter 96® AQueous (promega) en placas multipocillo-96 a los tiempos indicados. Se muestran las \pmSEM de 4 experimentos realizados por cuadriplicado.

*p<0,05 y **p<0,01.

Fig. 11 La Inhibición de la expresión de GRK2 en células malignas impide la formación de tumores ortotópicos en ratón. Células de carcinoma de mama MCF7 infectadas con adenovirus control o con el adenovirus de la construcción siRNA-GRK2 se inocularon por vía subcutánea en los respectivos flancos de ratones inmunodeprimidos tal y como se indica en el esquema. Durante 19 días se analizó el crecimiento tumoral y el tamaño registrado mediante calibres se representó gráficamente.

Exposición detallada de modos de realización

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de la inhibición de la expresión de GRK2 mediante siRNA en el tratamiento del cáncer que cursa con la sobre-expresión de GRK2 y la amplificación funcional de la vía de señalización PI3K/Akt, y más concretamente, en el cáncer de mama, donde GRK2 cooperaría con Akt en la adquisición de características tumorales.

Ejemplo 1 Análisis de los niveles de expresión de GRK2 y el grado de activación de AKT en una población de muestras de 27 pacientes afectados de cáncer de mama

Para este estudio, se analizaron carcinomas de mama ductales infiltrantes con distintos grados de diferenciación. Como controles se analizaron 12 muestras de tejido mamario no tumorales procedentes de los pacientes examinados. Aunque la expresión de GRK2 en la glándula mamaria de los individuos analizados exhibe en general cierto grado de variabilidad, se puede observar que los niveles detectados por "inmunoblot" son, en promedio, significativamente más bajos en las muestras control comparado con las muestras tumorales (Fig. 4A). Asimismo, la activación de AKT en las muestras no tumorales es casi imperceptible, estando frecuentemente por debajo de los límites de detección de nuestras condiciones de ensayo (Fig. 4B). De las muestras tumorales analizadas un 40% muestra altos niveles de activación de AKT (muestras Akt positivas) mientras que el 60% muestra igual o menor activación de AKT (muestras Akt negativas y no cambio) que el valor promedio observado en las muestras no tumorales. Dentro de las muestras es posible estratificar la población en función del grado de expresión de GRK2 en términos de mayor, menor o no cambio en comparación con el promedio observado en la población control. Así, en muestras AKT positivas se observa que la distribución estratificada por niveles de GRK2 es: Niveles altos de GRK2 69%, niveles bajos de GRK2 18%. Sin embargo, en las muestras AKT negativas la distribución es: Niveles altos de GRK2 40%, niveles bajos 65%. Estos datos indican una cierta correlación positiva entre el grado de activación de AKT y los niveles de la proteína GRK2 en coherencia con el eje regulador PI3K/AKT/Mdm2/GRK2 que hemos descrito previamente en los sistemas celulares de epitelio transformado de mama (Salcedo et al., 2006). La Fig. 5 muestra un esquema de estos resultados. Es más, dentro de las muestras control existen dos pacientes con altos niveles de GRK2 que se alejan del promedio de la población control y que, también muestran una alta activación de AKT.

En base a los resultados obtenidos, que muestran la regulación al alza de los niveles de GRK2 tras la activación de AKT en células de carcinoma de mama y en muestras de pacientes con carcinomas de mama positivos para la activación de AKT, en los siguientes ejemplos se tratará de determinar si GRK2 era un simple marcador pasivo de la activación de AKT o un factor "activo" en los procesos de transformación celular causados por la sobreestimulación de la vía de PI3K/AKT.

La vía de PI3K/AKT se encuentra amplificada en muchos tipos de cáncer, como los de ovario, páncreas, mama o tiroides. La activación de AKT confiere propiedades oncogénicas ya que regula la progresión del ciclo celular, promueve la supervivencia, inhibe la apoptosis, y estimula la migración e invasividad celular mediante la secreción de metaloproteasas. La presencia de GRK2 podría cooperar con AKT en la regulación de estas funciones celulares o incluso mediar algunos de los efectos de AKT en las mismas. Por tanto, analizamos la capacidad proliferativa de las células, su movilidad y su migración invasiva tras manipular la expresión de GRK2, bien aumentando sus niveles transitoriamente por transfección, bien disminuyéndolos con construcciones siRNA o por infección con adenovirus de siRNA GRK2, tanto en células transformadas HS578T, MCF-7 y BL16F10, como en células no transformadas MCF-10A.

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Ejemplo 2 Participación del GRK2 en la migración celular de MCF-7 en respuesta a fibronectina

La migración celular es un proceso complejo que requiere coordinar cambios en el citoesqueleto de la célula (necesarios para generar las fuerzas de tracción precisas para la locomoción), con los estímulos extracelulares pro-migratorios, transmitidos al interior celular por distintos receptores de membrana, entre los que destacan GPCRs y receptores con actividad quinasa. Las interacciones de receptores de integrinas y sus ligandos de la matriz extracelular no sólo son importantes en la adhesión de las células al sustrato, determinando la movilidad de las mismas, sino también en proporcionar rutas de migración actuando como guías. Este papel es crítico en el proceso de invasión de las células tumorales, que deben degradar la lámina basal y la matriz extracelular del tejido de origen y reconocer determinados componentes de la matriz extracelular como soporte físico para la locomoción. En este contexto, la fibronectina desempeña un papel importante en la progresión tumoral. Esta glicoproteína puede presentarse como molécula soluble o fibronectina plasmática, resultado de la acción de la proteasa plasmina, o como componente de la matriz extracelular en su forma no proteolizada. Una característica común a numerosos tumores es el aumento de la actividad del sistema UPAR/plasmina y la mayor presencia de fibronectina plasmática. Asimismo, numerosas células transformadas con potencial invasivo expresan receptores específicos para este tipo de fibronectina). Por tanto, caracterizamos el papel de GRK2 en la respuesta migratoria a fibronectina de las células de epitelio de mama transformadas MCF-7.

Las células se transfectaron de manera transitoria con un plásmido de expresión de GRK2 o con una construcción de siRNA específica, y se seleccionaron magnéticamente con el método "dynabeads" para enriquecer la proporción de células transfectadas. El aumento de expresión de GRK2 en células MCF-7 causa una mayor migración a fibronectina (Fig. 6A). Por el contrario, la inhibición de la expresión de la quinasa provoca una fuerte disminución de la migración en comparación con las células control que han sido transfectadas con un plásmido vacío (pcDNA3) (Fig. 6A).

Estos resultados sugerían una correlación positiva entre los niveles de GRK2 y la motilidad celular. Con el fin de generalizar esta correlación, analizamos si la presencia de GRK2 regulaba la migración en células normalmente con escasa motilidad como la línea celular no transformada MCF-10A, que posee además bajos niveles de expresión de GRK2. Como se observa en la figura 6B, la sobreexpresión de la quinasa estimula el fenotipo migratorio de estas células a señales de fibronectina. En este caso, el número de células MCF-10A que migran al aumentar los niveles de GRK2 es similar al número de células en migración registradas para MCF-7 (MCF-7=44; MCF-10A + GRK2=47,4, promedio de células que migran por campo en ambos casos). Por tanto, estos resultados sugieren que potenciales señales oncogénicas que converjan en la activación de AKT, aumentarían los niveles de GRK2 en células epiteliales normales y este aumento facilitaría la migración celular en un contexto tumoral.

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Ejemplo 3 La respuesta migratoria de células epiteliales de mama transformadas se ve afectada por variaciones en los niveles de GRK2 en respuesta a distintas señales que estimulan la actividad de AKT

La migración aberrante de las células cancerosas responde a gradientes quimiotácticos diversos que estimulan la evasión de las mismas del foco tumoral primario. Algunas de estas señales quimiotácticas, como S1P e IGF-1, proceden con frecuencia del estroma "reactivo" al tumor, producidas por fibroblastos y células del sistema inmune. Tanto S1P como IGF-1 son los factores que regulan no sólo la migración de las células epiteliales de mama, sino también su proliferación y supervivencia. Estas señales confluyen en la activación de AKT, lo cual desencadenaría la acumulación de GRK2 y la potenciación de la migración celular. Por tanto, quisimos determinar si la migración mediada por este tipo de estímulos estaba modulada por los niveles de expresión de GRK2.

En la figura 7A se muestra que el aumento en los niveles de GRK2 en células MCF-7 transitoriamente transfectadas induce una mayor migración frente a los estímulos de S1P e IGF-1. De nuevo, y de forma similar a lo observado en la migración dependiente de fibronectina, la presencia de un RNA de interferencia específico de GRK2 atenúa la respuesta migratoria de MCF-7 a estas señales solubles, reduciéndose un 50% en comparación con las células control.

Asimismo, la regulación dependiente de GRK2 de la migración a señales quimiotácticas también se extiende a otros tipos celulares transformados de epitelio de mama con un grado de diferenciación distinto al de MCF-7, tal y como observamos en la línea celular Hs578T, derivada de un carcinoma ductal infiltrante poco diferenciado. Tras la infección de estas células con el vector adenoviral siRNA de GRK2, la migración en respuesta a IGF-1 y a S1P se inhibe fuertemente, alcanzando un 45,5\pm10% de la respuesta migratoria normal a IGF-1 y un 26,2\pm5% con S1P, mientras que las células con el adenovirus control no muestran alteraciones en la motilidad comparado con las células sin tratar (Fig. 7B).

En base a estos resultados podemos concluir que los niveles de GRK2 son críticos en la migración de las células de epitelio de mama en respuesta a determinados estímulos implicados en la progresión tumoral. En este contexto, los ligandos de la familia de los receptores ErbB son especialmente relevantes en el desarrollo de tumores de mama. El proto-oncogen ErbB2 se halla sobreexpresado en cerca del 30% de este tipo de tumores. Dado que la estimulación de estos receptores es una potente señal para la inducción de la motilidad y supervivencia celulares, constituyendo su presencia un marcador pronóstico de la malignidad del tumor y de su capacidad metastática, analizamos si la expresión de GRK2 modulaba la respuesta quimiotáctica inducida por estos receptores. Ya que no se ha identificado un ligando específico para ErbB2, las células MCF-7 se estimularon con heregulina, que promueve la heterodimerización de los receptores ErbB2 con los receptores ErbB3 y ErbB4, y su activación. Como se aprecia en la figura 7A, la sobreexpresión de GRK2 aumenta notablemente la migración de células MCF-7 a heregulina. Estos resultados refuerzan la implicación funcional de esta quinasa en el desarrollo y/o adquisición de las características tumorales de las células transformadas.

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Ejemplo 4 GRK2 potencia la capacidad invasiva de diversas células tumorales de mama con distintos grados de transformación

Como ya hemos mencionado, una de las características claves de la progresión tumoral es la habilidad de metastatizar o invadir otros tejidos para lo cual las células transformadas adquieren la capacidad de degradar la lámina basal y la matriz extracelular a través de la cual migran en respuesta a gradientes quimiotácticos. Dado que GRK2 modulaba la migración a estos gradientes, nos planteamos determinar si la presencia de GRK2 tenía también algún efecto en la capacidad de invasión de las células de epitelio de mama estimuladas por señales quimiotácticas relevantes en los tumores de mama. Así, los niveles de GRK2 se modificaron en la línea celular poco invasiva MCF-7, transfectando como ya se ha descrito con el vector de expresión de la quinasa o con la construcción siRNA-GRK2, y se analizó la respuesta invasiva de estas células a estímulos presentes en el suero mediante ensayos de invasión a matrigel (Fig. 8A). Estos ensayos simulan en cierta medida las condiciones de invasión "in vivo", ya que el matrigel, matriz extracelular obtenida a partir de tumores aislados de ratón y compuesta por laminina, colágeno IV y factores de crecimiento entre otros, mimetiza la lámina basa) de los tejidos.

En estas condiciones experimentales se observa una clara correlación entre los niveles de expresión de GRK2 y la invasividad celular. Así, la sobreexpresión de la quinasa promueve un 75% más de invasión respecto a las células control, mientras que la disminución de GRK2 reduce un 50% la capacidad de invasión de células MCF-7 en respuesta a suero (Fig. 8A). De modo similar, la invasión del matrigel en respuesta a IGF-1, S1P y heregulina también se inhibe apreciablemente (más del 60%) al bloquear la expresión de GRK2 en células MCF-7 (Fig. 8B).

La siguiente cuestión fue determinar si los efectos de GRK2 en la capacidad de invasión eran extensibles también a líneas celulares con un fenotipo acusadamente invasivo. Para ello, utilizamos las células de mama HS578T y células de melanoma B16 F10, capaces de inducir tumores en ratones "nude" y metastatizar, así como de penetrar matrices de colágeno con alta eficiencia en respuesta a suero. Como se observa en la figura 9, la disminución de los niveles de GRK2, mediante infección con el vector adenoviral siRNA-GRK2, promueve una notable reducción en la capacidad de invasión a matrigel de células Hs578T y B16F10.

Este conjunto de resultados pone de manifiesto por primera vez que GRK2 es una molécula clave en la modulación de la migración y la invasión tumoral a diferentes estímulos que señalizan a través de receptores de membrana de naturaleza muy diversa. Esto sugiere, además, que GRK2 debe desempeñar un papel funcional básico y general en el proceso de migración e invasión. En línea con este concepto, la regulación de la invasividad por GRK2 se observa no sólo en líneas tumorales de muy diferente origen, como carcinomas de mama y melanomas, sino también en células no transformadas. Por tanto, GRK2 debe modular actividades fundamentales en migración, relacionadas quizás con cambios del citoesqueleto, la adhesión y/o la integración de señales migratorias difusibles en estos procesos.

En este contexto, la regulación de los niveles de expresión de GRK2 por AKT representaría un mecanismo clave por el cual las células adquirirían un mayor potencial migratorio y tendrían facilitado el proceso de transformación tumoral. Así, células con altos niveles de GRK2 podrían presentar y adquirir un fenotipo transformado. En efecto, el análisis de los niveles endógenos de GRK2 en varias líneas celulares muestra que células no transformadas y con reducida motilidad como MCF10A y 184B5 expresan menores niveles de GRK2 que células transformadas y mótiles como MCF-7 o MDA-MB-468.

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Ejemplo 5 Los niveles de GRK2 afectan a la tasa de proliferación celular

Otra de las funciones de AKT en diversos tipos de tumores anteriormente mencionada es su participación en procesos de supervivencia celular, promoviendo mecanismos de escapada de apoptosis y la proliferación celular. Dado que GRK2 está sujeto a la regulación al alza mediada por AKT, nos preguntamos si GRK2 podía estar modulando, además de la migración/invasión de células del epitelio de mama, procesos como la proliferación celular. Para ello, analizamos la tasa de crecimiento en respuesta a suero de células MCF-7 tratadas con un adenovirus control o con la construcción viral del siRNA de GRK2 tras 24, 48, 72 y 96 horas de cultivo. La disminución de los niveles de GRK2 afecta a la capacidad proliferativa de las células a partir de las 72 horas. En el intervalo de tiempo de 72 a 96 horas, las células que han sido infectadas con el adenovirus de siRNA-GRK2 muestran un menor crecimiento (163,5\pm36% y 167\pm33% de proliferación a las 72 y 96 horas, respectivamente, comparado con 24 h) que las células control (253\pm34% de proliferación a las 72 horas y 331\pm60% a las 96 horas) (Fig. 10).

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Ejemplo 6 Ensayo in vivo de un siRNA capaz de inhibir la expresión de GRK2 para su uso en el tratamiento de cánceres en los que el GRK2 se encuentre cooperando con AKT

La atenuación de la respuesta migratoria/invasiva y proliferativa de diversas líneas celulares tumorales (de epitelio de mama y melanoma) en los ensayos in vitro descritos como consecuencia de la inhibición de la expresión de la proteína GRK2 mediante el uso de construcciones siRNA, sugiere que esta estrategia de inhibición podría ser efectiva en el tratamiento de ciertos tumores. Con objeto de proporcionar evidencias de esta hipótesis, se analizó el efecto de la supresión de GRK2 en la formación y desarrollo de tumores in vivo. Para ello se procedió a la inducción de tumores ortotópicos en ratones inmunosuprimidos (athymic nude fox Nu/Un) mediante la inyección subcutánea de células transformadas de epitelio de mama MCF7 (5x106 células en una suspensión de glucosa/PBS/matrigel por ratón) infectadas con una contrucción adenoviral control o con la construcción adenoviral del siRNA-GRK2. Los resultados obtenidos muestran que la inhibición de GRK2 en células MCF7 bloquea su capacidad para formar tumores en este modelo in vivo, no observándose signos de tumoración a las tres semanas de inoculación, mientras que en ausencia del siRNA de GRK2, las células malignas MCF7 sí desarrollan el tumor. Por tanto, estos resultados indican la potencialidad de la inhibición de GRK2 con siRNA como medida de intervención en el tratamiento de tumores de mama.

Referencias

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Pao, C. S. y Benovic, J. L. (2002). Phosphorylation-Independent Desensitization of G Protein-Coupled Receptors? Sci. STKE. p42.

Ribas C., Penela P., Murga C., Salcedo A., Garcia-Hoz C., Jurado-Pueyo M. et al. (2007). The G protein-coupled receptor kinase (GRK) interactome: Role of GRKs in GPCR regulation and signaling. Biochim Biophys Acta 1768: 913-942

Salcedo, A., Mayor, F. y Penela, P. (2006). Mdm2 is involved in the ubiquitination and degradation of G-protein-coupled receptor kinase 2. EMBO J 25(20): 4752-4762

Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory

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Calipel et al., 2003, Mutation of B-Raf in Human Choroidal Melanoma Cells Mediates Cell Proliferation and Transformation through the MEK/ERK Pathway J. Biol. Chem., 278, 4240918).

<110> Universidad Autónoma de Madrid

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<120> GRK2 terapia antitumoral

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<130> ES1595.9

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<160> 4

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<170> PatentIn version 3.4

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<210> 1

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<211> 689

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> PEPTIDE

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<222> (1)..(689)

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<223> secuencia de aminoácidos de GRK2

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<400> 1

100

101

102

Claims

1. Uso de una composición que comprende un siRNA que puede ser obtenido a partir de la secuencia del RNA mensajero de GRK2, capaz de inhibir la expresión del gen GRK2, para la elaboración de un medicamento.

2. Uso de una composición que comprende un siRNA obtenido a partir de la secuencia del RNA mensajero de GRK2, capaz de inhibir la expresión del gen GRK2, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cancerígenas.

3. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el siRNA comprende la SEQ ID NO: 2.

4. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el siRNA se encuentra fusionado a aptámeros.

5. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el siRNA se encuentra incluido en una construcción genética de RNA.

6. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el siRNA está incluido en una construcción genética de DNA capaz de transcribirse in vitro ó in vivo a una secuencia de RNA.

7. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde la enfermedad cancerígena se caracteriza porque GRK2 se encuentra cooperando con AKT.

8. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, donde la enfermedad cancerígena se selecciona de la lista que comprende: melanoma y cáncer de mama.

9. Uso de una composición según la reivindicación 8, donde la enfermedad cancerígena es el melanoma.

10. Uso de una composición según la reivindicación 8, donde la enfermedad cancerígena es el cáncer de mama.