ES2332310T3 - Deteccion de oligomerizacion de receptor. - Google Patents

Abstract

Método de detección de dímeros de analitos asociados a membrana en una membrana celular, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar un compuesto de unión específico para un primer analito asociado a membrana de un dímero, comprendiendo el dímero el primer analito asociado a membrana y un segundo analito unido a membrana, y teniendo el compuesto de unión uno o más marcadores moleculares cada uno unido al mismo mediante un enlace escindible, teniendo cada uno del uno o más marcadores moleculares una característica de separación; proporcionar una sonda de escisión específica para el segundo analito unido a membrana, teniendo la sonda de escisión un resto que induce la escisión con una proximidad eficaz; mezclar la sonda de escisión, el compuesto de unión y la membrana celular de modo que la sonda de escisión se une específicamente al primer analito asociado a membrana y el compuesto de unión se une específicamente al segundo analito asociado a membrana y de modo que los enlaces escindibles del compuesto de unión están dentro de la proximidad eficaz del resto que induce la escisión de manera que se liberan los marcadores moleculares; y separar e identificar los marcadores moleculares liberados para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de dímero en la membrana celular, en el que dicho primer analito asociado a membrana y dicho segundo analito asociado a membrana son cada uno receptores del factor de crecimiento epidérmico en dicha membrana celular.

Description

Detección de oligomerización de receptor.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para medir la oligomerización de moléculas de superficie celular, particularmente receptores de membrana de superficie celular.

Antecedentes de la invención

Las interacciones de componentes de membrana de superficie celular desempeñan papeles cruciales en la transmisión de señales extracelulares a una célula en la fisiología normal, y en estados patológicos. En particular, muchos tipos de receptores de superficie celular experimentan dimerización u oligomerización en relación con la transducción de una señal o un acontecimiento extracelular, por ejemplo la unión ligando-receptor, en una respuesta celular, tal como la proliferación, aumento o disminución de la expresión génica o similar, por ejemplo George et al, Nature Reviews Drug Discovery, 1: 808-820 (2002); Mellado et al, Ann. Rev. Immunol., 19: 397-421 (2001); Schlessinger, Cell, 103: 211-225 (2000); Yarden, Eur. J. Cancer, 37: S3-S8 (2001). El papel de tales acontecimientos de transducción de señales en enfermedades, tales como el cáncer, ha sido el objeto de investigación intensa y ha conducido al desarrollo de varios nuevos fármacos y candidatos a fármaco, por ejemplo Herbst y Shin, Cancer, 94: 1593-1611 (2002); Yarden y Sliwkowski, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2: 127-137 (2001).

Se ha usado una amplia variedad de técnicas para estudiar la dimerización y oligomerización de receptores de superficie celular, incluyendo inmunoprecipitación, reticulación química, transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y similares, por ejemplo Price et al, Methods in Molecular Biology, 218: 255-267 (2003); McVey et al, J. Biol. Chem, 17: 14092-14099 (2001); Salim et al, J. Biol. Chem., 277: 15482-15485 (2002); Angers et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 3684-3689 (2000). Además, Rios et al., en Pharmacology & Therapeutics, 92: 71-87, (2001), proporcionan un resumen de técnicas farmacológicas, bioquímicas y biofísicas con el fin de estudiar receptores de proteínas G y su regulación y función por medio de oligomerización. Desafortunadamente, a pesar de la importancia de la dimerización y oligomerización de receptores en procesos de transducción de señales, las técnicas para medir tales interacciones son difíciles de aplicar, carecen de flexibilidad y carecen de sensibilidad. La falta de una técnica conveniente y sensible para analizar la oligomerización de moléculas de superficie celular ha aumentado mucho la dificultad de desarrollar nuevos métodos terapéuticos y de diagnóstico basados en tales fenómenos.

En vista de lo anterior, la disponibilidad de una técnica conveniente, sensible y económica para detectar o medir la dimerización u oligomerización de analitos de superficie celular haría avanzar a la técnica en muchos campos en los que tales mediciones se están volviendo cada vez más importantes, incluyendo la investigación de ciencias biológicas, investigación médica y diagnóstico, descubrimiento de fármacos y similares.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método de detección de dímeros de analitos asociados a membrana en una membrana celular, comprendiendo el método las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión específico para un primer analito asociado a membrana de un dímero, comprendiendo el dímero el primer analito asociado a membrana y un segundo analito unido a membrana, y teniendo el compuesto de unión uno o más marcadores moleculares cada uno unido al mismo mediante un enlace escindible, teniendo cada uno del uno o más marcadores moleculares una característica de separación;

proporcionar una sonda de escisión específica para el segundo analito unido a membrana, teniendo la sonda de escisión un resto que induce la escisión con una proximidad eficaz;

mezclar la sonda de escisión, el compuesto de unión y la membrana celular de modo que la sonda de escisión se une específicamente al primer analito asociado a membrana y el compuesto de unión se une específicamente al segundo analito asociado a membrana y de modo que los enlaces escindibles del compuesto de unión están dentro de la proximidad eficaz del resto que induce la escisión de manera que se liberan los marcadores moleculares; y

separar e identificar los marcadores moleculares liberados para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de dímero en la membrana celular, en el que dicho primer analito asociado a membrana y dicho segundo analito asociado a membrana son cada uno receptores del factor de crecimiento epidérmico en dicha membrana celular.

En una realización de dicho método, dicha característica de separación de dicho uno o más marcadores moleculares es la movilidad electroforética.

En una realización preferida, dicha etapa de separación y detección incluye además separar electroforéticamente dichos marcadores moleculares liberados en un tampón de separación.

En una realización preferida adicional, dicho resto que induce la escisión de dicha sonda de escisión es un fotosensibilizador y en la que dicha sonda de escisión y dicho compuesto de unión comprenden cada uno una composición de unión a anticuerpo.

En una realización preferida adicional, dichos receptores de superficie celular se seleccionan del grupo que consiste en Her1, Her2, Her3 y Her4.

La presente invención también proporciona un método de detección de un dímero que comprende un primer tipo de receptor y un segundo tipo de receptor en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de

proporcionar uno o más compuestos de unión específicos para diferentes determinantes antigénicos del dímero, teniendo cada compuesto de unión uno o más marcadores moleculares cada uno unido al mismo mediante un enlace escindible, y teniendo los marcadores moleculares de diferentes compuestos de unión diferente característica de separación de modo que se forman picos diferenciados en un perfil de separación tras la separación;

proporcionar una sonda de escisión que tiene un resto que induce la escisión con una proximidad eficaz, siendo la sonda de escisión específica para un determinante antigénico del dímero diferente de los determinantes antigénicos para el uno o más compuestos de unión, con la condición de que al menos uno de dichos determinantes antigénicos está en el primer tipo de receptor y al menos uno de dichos determinantes antigénicos está en el segundo tipo de receptor;

formar una mezcla de ensayo que comprende la sonda de escisión, el uno o más compuestos de unión y la muestra biológica de modo que la sonda de escisión y el uno o más compuestos de unión se unen específicamente a sus respectivos determinantes antigénicos y los enlaces escindibles del uno o más compuestos de unión están dentro de la proximidad eficaz del resto que induce la escisión de manera que se liberan los marcadores moleculares; y

separar e identificar los marcadores moleculares liberados para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de dímero en la muestra biológica, en el que dicho primer tipo de receptor y dicho segundo tipo de receptor son receptores del factor de crecimiento epidérmico.

En una realización de dicho método, dicha característica de separación es la movilidad electroforética y dicha etapa de separación e identificación incluye separar electroforéticamente dichos marcadores moleculares liberados para formar picos diferenciados en un electroferograma.

En una realización preferida, dicha etapa de formación incluye las etapas de incubar dicha sonda de escisión, dicho uno o más compuestos de unión y dicha muestra biológica en un tampón de unión, e intercambiar el tampón de unión por un tampón de separación antes de dicha separación de dichos marcadores moleculares liberados.

En una realización preferida adicional, dicho resto que induce la escisión es un sensibilizador y en la que dicha etapa de formación incluye inducir dicho sensibilizador para generar una especie activa que escinde dichos enlaces escindibles dentro de dicha proximidad eficaz del mismo.

En una realización incluso más preferida, dicho sensibilizador es un fotosensibilizador y en la que dicha especie activa es oxígeno en estado singlete.

En una realización preferida adicional, dicha sonda de escisión y dicho uno o más compuestos de unión comprenden cada uno una composición de unión a anticuerpo.

En una realización preferida adicional, al menos uno de dichos determinantes antigénicos es un sitio de fosforilación de dicho primer tipo de receptor o dicho segundo tipo de receptor.

En una realización incluso más preferida, dicho uno o más compuestos de unión son una pluralidad de compuestos de unión en el intervalo de desde 2 hasta 10.

En una realización incluso más preferida, dicho primer tipo de receptor y dicho segundo tipo de receptor se seleccionan cada uno del grupo que consiste en Her1, Her2, Her3 y Her4.

En una realización incluso más preferida, dicho dímero es un heterodímero u homodímero que comprende tipos de receptores seleccionados del grupo que consiste en Her1, Her2, Her3 y Her4.

En una realización incluso más preferida, dicho dímero es un homodímero Her1-Her1, un heterodímero Her1-Her2, un heterodímero Her1-Her3 o un heterodímero Her2-Her3.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B ilustran esquemáticamente una realización del método de la invención para medir la presencia de dímeros de receptor en las superficies de células biológicas.

Las figuras 2A-2E ilustran esquemáticamente una realización del método de la invención para crear un perfil de frecuencias de dímeros de una pluralidad de tipos de receptores.

Las figuras 3A-3F ilustran enlaces lábiles a la oxidación y sus respectivas reacciones de escisión mediadas por oxígeno en estado singlete.

Las figuras 4A-4B ilustran derivados de fluoresceína que pueden usarse para construir marcadores moleculares de la invención.

La figura 5A ilustra una metodología general para la conjugación de un marcador a un anticuerpo para formar una sonda marcada, y la reacción de la sonda marcada resultante con oxígeno en estado singlete para producir un resto de ácido sulfínico como marcador liberado. La figura 5B explica de manera resumida la química de síntesis de marcadores moleculares marcados con fluoresceína.

Las figuras 6A-J muestran las estructuras de marcadores que se han diseñado y sintetizado.

Las figuras 7 A-D ilustran las químicas de síntesis de los restos de marcador ilustrados en la figura 6.

Las figuras 8A-8C ilustran esquemáticamente un dispositivo de microfluidos para implementar una etapa de separar electroforéticamente marcadores moleculares.

Las figuras 9A-9E ilustran datos de ensayos en lisados celulares para determinar heterodímeros de receptor usando un método de la invención.

Las figuras 10A-10C ilustran datos de ensayos en muestras tisulares para determinar heterodímeros de receptor usando un método de la invención.

Las figuras 11A y 11B ilustran datos de ensayos de la invención para detectar homodímeros y la fosforilación de Her1.

La figura 12 muestra datos de ensayos de la invención que muestran poblaciones de dímero de Her2 en dos líneas de células diferentes.

Las figuras 13A-13B muestran datos de ensayos de la invención que detectan heterodímeros de Her1 y Her3 en células.

Definiciones

"Anticuerpo" significa una inmunoglobulina que se une específicamente a, y por eso se define como complementario con, una organización polar y espacial particular de otra molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede preparase mediante técnicas que se conocen bien en la técnica tales como inmunización de un huésped y recogida de sueros (policlonales) o preparando líneas de células híbridas continuas y recogiendo la proteína secretada (monoclonal), o clonando y expresando secuencias de nucleótidos o versiones mutagenizadas de las mismas que codifican al menos para las secuencias de aminoácidos requeridas para la unión específica de anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, inmunoglobulinas que incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1 IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Los fragmentos de las mismas pueden incluir Fab, Fv y F(ab')2, Fab'. Además, pueden usarse agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos en caso apropiado siempre que se mantenga la afinidad de unión para un polipéptido particular.

"Composición de unión a anticuerpo" significa una molécula o un complejo de moléculas que comprenden uno o más anticuerpos y su especificidad de unión se deriva de un anticuerpo. Las composiciones de unión a anticuerpo pueden incluir pares de anticuerpos en los que un primer anticuerpo se une específicamente a una molécula diana y un segundo anticuerpo se une específicamente a una región constante del primer anticuerpo; un anticuerpo biotinilado que se une específicamente a una molécula diana y estreptavidina derivatizada con restos tales como marcadores moleculares o fotosensibilizadores; anticuerpos específicos para una molécula diana y conjugados con un polímero, tal como dextrano, que, a su vez, está derivatizado con restos tales como marcadores moleculares o fotosensibilizadores; anticuerpos específicos para una molécula diana y conjugados con una perla, o microperla, u otro soporte en fase sólida, que, a su vez, está derivatizado con restos tales como marcadores moleculares o fotosensibilizadores o polímeros que contienen estos últimos.

"Determinante antigénico" o "epítopo" significa un sitio en la superficie de un analito asociado a membrana al que se une una única molécula de anticuerpo; generalmente un analito asociado a membrana tiene varios o muy diferentes determinantes antigénicos y reacciona con anticuerpos de especificidades muy diferentes. Cuando los analitos asociados a membrana son receptores de superficie celular implicados en los procesos de transducción de señales, un determinante antigénico preferido es un sitio de fosforilación de un receptor.

\newpage

"Resto de unión" significa cualquier molécula a la que pueden unirse directa o indirectamente marcadores moleculares, que puede unirse específicamente a un analito asociado a membrana. Los restos de unión incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, composiciones de unión a anticuerpo, péptidos, proteínas, particularmente proteínas secretadas y proteínas secretadas huérfanas, ácidos nucleicos y moléculas orgánicas que tienen un peso molecular de hasta 1000 daltons y que consisten en átomos seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo.

"De tamaño capilar" en relación con una columna de separación significa un canal o tubo capilar en una placa o un dispositivo de microfluidos, en el que el diámetro o la dimensión más grande de la columna de separación es de entre aproximadamente 25-500 micras, permitiendo la disipación de calor eficaz por todo el medio de separación, por consiguiente con baja convección térmica dentro del medio.

"Cromatografía" o "separación cromatográfica" tal como se usa en el presente documento significa o se refiere a un método de análisis en el que el flujo de una fase móvil, habitualmente un líquido, que contiene una mezcla de compuestos, por ejemplo marcadores moleculares, promueve la separación de tales compuestos basándose en una o más propiedades físicas o químicas mediante una distribución diferencial entre la fase móvil y una fase estacionaria, habitualmente un sólido. La una o más características físicas que forman la base para la separación cromatográfica de analitos, tales como marcadores moleculares, incluyen pero no se limitan al peso molecular, forma, solubilidad, pKa, hidrofobicidad, carga, polaridad y similares. En un aspecto, tal como se usa en el presente documento, la "cromatografía de líquidos de alta presión (o resolución)" ("HPLC") se refiere a una separación cromatográfica en fase líquida que (i) emplea una columna de separación cilíndrica rígida que tiene una longitud de hasta 300 mm y un diámetro interno de hasta 5 mm, (ii) tiene una fase sólida que comprende partículas esféricas rígidas (por ejemplo sílice, alúmina o similar) que tienen el mismo diámetro de hasta 5 \mum rellenas en la columna de separación, (iii) tiene lugar a una temperatura en el intervalo de desde 35ºC hasta 80ºC y a una presión de columna de hasta 150 bares, y (iv) emplea una velocidad de flujo en el intervalo de desde 1 \mul/min. hasta 4 ml/min. Preferiblemente, las partículas en fase sólida para su uso en HPLC se caracterizan además porque (i) tienen una estrecha distribución de tamaño alrededor del diámetro medio de partícula, estando sustancialmente todos los diámetros de partícula dentro del 10% de la media, (ii) tienen el mismo tamaño de poro en el intervalo de desde 70 hasta 300 angstroms, (iii) tienen un área superficial en el intervalo de desde 50 hasta 250 m^{2}/g, y (iv) tienen una densidad de fase de unión (es decir, el número de ligandos de retención por unidad de área) en el intervalo de desde 1 hasta 5 por nm^{2}. Los medios de cromatografía de fase inversa a modo de ejemplo para separar marcadores moleculares incluyen partículas, por ejemplo sílice o alúmina, que tienen unido a sus superficies ligandos de retención, tales como grupos fenilo, grupos ciano o grupos alifáticos seleccionados del grupo que incluye C_{8} a C_{18}. La cromatografía puede incluir "electrocromatografía capilar" ("ECC") y técnicas relacionadas. La ECC es una técnica cromatográfica en fase líquida en la que el fluido se conduce mediante un flujo electroosmótico a través de una columna de tamaño capilar, por ejemplo con diámetros internos en el intervalo de desde 30 hasta 100 \mum. La ECC se da a conocer en Svec, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 76: 1-47 (2002); Vanhoenacker et al, Electrophoresis, 22: 4064-4103 (2001). La columna para ECC puede usar los mismos materiales en fase sólida que los usados en HPLC de fase inversa convencional y adicionalmente pueden usarse los denominados rellenos no particulares "monolíticos". En algunas formas de ECC, la presión así como la electroosmosis conduce un disolvente que contiene analito a través de una columna.

Tal como se usa en el presente documento, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de suministro para suministrar materiales. En el contexto de ensayos de reacción, tales sistemas de suministro incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o suministro de reactivos de reacción (por ejemplo, sondas, enzimas, etc. en los envases apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, tampones, instrucciones por escrito para realizar el ensayo, etc.) de una ubicación a otra. Por ejemplo, los kit incluyen uno o más receptáculos (por ejemplo, cajas) que contienen los reactivos de reacción y/o materiales de soporte relevantes. Tales contenidos pueden suministrarse al receptor deseado juntos o por separado. Por ejemplo, un primer envase puede contener una enzima para su uso en un ensayo, mientras que un segundo envase contiene sondas.

El término "ligando" también se usa en el presente documento para referirse a una proteína secretada o proteína de la misma que se une a un receptor dado, a través de una interacción ligando-receptor.

"Analito asociado a membrana" significa una sustancia, un compuesto, una molécula o un componente o una parte de cualquiera de los anteriores que se une directa o indirectamente a una membrana, especialmente una membrana biológica tal como la membrana de superficie celular de un tejido o una célula de mamífero. La unión puede ser directa, por ejemplo, cuando un analito asociado a membrana tiene un resto lipófilo, o está unido a otra molécula que tiene un resto lipófilo, que puede anclarlo en una membrana. La unión también puede ser indirecta, por ejemplo, cuando un analito asociado a membrana es un ligando soluble que se une a, y forma un complejo estable con, un receptor de superficie celular. Un analito asociado a membrana puede ser un péptido, una proteína, un polinucleótido, un polipéptido, un oligonucleótido, una molécula orgánica, un hapteno, un epítopo, una parte de una célula biológica, una modificación postraduccional de una proteína, un receptor, un azúcar complejo unido a un componente de membrana tal como un receptor, un compuesto soluble que forma un complejo estable con una membrana como receptor tal como una vitamina, una hormona, una citocina o similar, que forma y similares. Puede haber más de un analito asociado con una única entidad molecular, por ejemplo diferentes sitios de fosforilación en la misma proteína. Los analitos asociados a membrana incluyen moléculas de superficie celular, tales como receptores de membrana celular. En un aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones, los analitos asociados a membrana son receptores de membrana celular seleccionados de receptores del factor de crecimiento epidérmico. En particular, los receptores del factor de crecimiento epidérmico incluyen receptores Her1, Her2, Her3 y Her4, por ejemplo Yarden (citado anteriormente); Yarden y Sliwkowski (citado anteriormente). "Dímero" en referencia a analitos asociados a membrana significa una asociación estable, habitualmente no covalente, de dos analitos asociados a membrana. Un dímero de analitos asociados a membrana puede formarse como resultado de la interacción con un ligando, es decir una dimerización inducida por ligando, por ejemplo Schlessinger, Cell, 110: 669-672 (2002). "Oligómero" en referencia a analitos asociados a membrana significa una asociación estable, habitualmente no covalente, de al menos dos analitos asociados a membrana.

"Polipéptido" se refiere a una clase de compuestos que se componen de residuos de aminoácidos unidos químicamente entre sí mediante enlaces amida con la eliminación de agua entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro aminoácido. Un polipéptido es un polímero de residuos de aminoácido, que puede contener un gran número de tales residuos. Los péptidos son similares a los polipéptidos, excepto porque, generalmente, están compuestos por un menor número de aminoácidos. Los péptidos se denominan a veces oligopéptidos. No existe una distinción bien definida entre polipéptidos y péptidos. Por conveniencia, en esta descripción y reivindicaciones, el término "polipéptido" se usará para referirse en general a péptidos y polipéptidos. Los residuos de aminoácido pueden ser naturales o sintéticos.

"Proteína" se refiere a un polipéptido, habitualmente sintetizado por una célula biológica, plegado en una estructura tridimensional definida. Generalmente, las proteínas tienen un peso molecular de desde aproximadamente 5.000 hasta aproximadamente 5.000.000 o más, más habitualmente un peso molecular de desde aproximadamente 5.000 hasta aproximadamente 1.000.000, y pueden incluir modificaciones postraduccionales, tales como acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclajes por GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación y ubiquitinación, por ejemplo Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, págs. 1-12 en Post-translational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983. Las proteínas incluyen citocinas o interleucinas, enzimas tales como, por ejemplo, cinasas, proteasas, galactosidasas, etcétera, protaminas, histonas, albúminas, inmunoglobulinas, escleroproteínas, fosfoproteínas, mucoproteínas, cromoproteínas, lipoproteínas, nucleoproteínas, glicoproteínas, receptores de células T, proteoglicanos, proteínas no clasificadas, por ejemplo, somatotropina, prolactina, insulina, pepsina, proteínas que se encuentran en el plasma humano, factores de coagulación sanguínea, factores de grupo sanguíneo, hormonas proteicas, antígenos cancerígenos, antígenos específicos de tejido, hormonas peptídicas, marcadores nutricionales, antígenos específicos de tejido y péptidos sintéticos.

El término "muestra" significa una cantidad de material que se sospecha que contiene analitos asociados a membrana que van a detectarse o medirse. Tal como se usa en el presente documento, el término puede incluir un espécimen (por ejemplo, una biopsia o espécimen médico) o un cultivo (por ejemplo, cultivo microbiológico). También incluye tanto muestras biológicas como ambientales. Una muestra puede incluir un espécimen de origen sintético. Las muestras biológicas pueden proceder de un animal, incluyendo un ser humano, un fluido, sólido (por ejemplo heces) o tejido, así como ingredientes y productos alimenticios y piensos líquidos y sólidos tales como productos lácteos, hortalizas, carne y subproductos cárnicos, y desechos. Las muestras biológicas pueden incluir materiales tomados de un paciente incluyendo cultivos, sangre, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, leche, linfa, esputo, semen, aspirados por punción y similares. Pueden obtenerse muestras biológicas de todos los animales de las diversas familias de animales domésticos, así como animales asilvestrados o salvajes, incluyendo, ungulados, osos, peces, roedores, etc. Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como muestras industriales, de agua, de suelo y de materia de superficie, así como muestras obtenidas a partir de instrumentos, aparatos, equipo, utensilios, artículos desechables y no desechables de procesamiento de alimentos y productos lácteos. En particular, las muestras biológicas incluyen especímenes biológicos fijados, tales como especímenes de biopsia de pacientes tratados con un fijador, especímenes biológicos incluidos en parafina, especímenes biológicos congelados, frotis y similares.

Un "perfil de separación" en referencia a la separación de marcadores moleculares significa un diagrama, un gráfico, una curva, un gráfico de barras u otra representación de datos de intensidad de señal frente a un parámetro relacionado con los marcadores moleculares, tal como el tiempo de retención, la masa o similar, que proporciona una lectura, o medida, del número de marcadores moleculares de cada tipo producidos en un ensayo. Un perfil de separación puede ser un electroferograma, un cromatograma, un electrocromatograma, un espectrograma de masas o una representación gráfica de datos similar dependiendo de la técnica de separación empleada. Un "pico" o una "banda" o una "zona" en referencia a un perfil de separación significa una región en la que se concentra un compuesto separado. Puede haber múltiples perfiles de separación para un único ensayo si, por ejemplo, diferentes marcadores moleculares tienen diferentes etiquetas fluorescentes que tienen espectros de emisión diferenciados y los datos se recogen y se registran a múltiples longitudes de onda. En un aspecto, los marcadores moleculares liberados se separan mediante diferencias en la movilidad electroforética para formar un electroferograma en el que diferentes marcadores moleculares corresponden a picos diferenciados en el electroferograma. Una medida de la diferenciación, o falta de solapamiento, de picos adyacentes en un electroferograma es la "resolución electroforética", que puede tomarse como la distancia entre máximos de picos adyacentes dividida entre cuatro veces la mayor de las dos desviaciones estándar de los picos. Los picos adyacentes pueden tener una resolución de al menos 1,0, al menos 1,5, o, al menos 2,0. En un sistema de separación y detección dado, puede obtenerse la resolución deseada seleccionando una pluralidad de marcadores moleculares cuyos miembros tienen movilidades electroforéticas que difieren en al menos una cantidad de resolución de picos, dependiendo tal cantidad de varios factores bien conocidos por el experto, incluyendo un sistema de detección de señales, la naturaleza de los restos fluorescentes, los coeficientes de difusión de los marcadores, la presencia o ausencia de matrices de cribado, la naturaleza del aparato electroforético, por ejemplo la presencia o ausencia de canales, la longitud de canales de separación y similares.

"Específico" o "especificidad" en referencia a la unión de una molécula a otra molécula, tal como un compuesto de unión, o una sonda, para un analito diana, significa el reconocimiento, el contacto y la formación de un complejo estable entre la sonda y la diana, junto con sustancialmente menos reconocimiento, contacto o formación de complejos de la sonda con otras moléculas. En un aspecto, "específico" en referencia a la unión de una primera molécula a una segunda molécula significa que en el grado en que la primera molécula reconoce y forma un complejo con otras moléculas en una reacción o muestra, forma el mayor número de los complejos con la segunda molécula. En un aspecto, este número más grande es al menos el cincuenta por ciento de todos estos complejos formados por la primera molécula. En general, las moléculas implicadas en un acontecimiento de unión específica tienen zonas en sus superficies o en cavidades que dan lugar al reconocimiento específico entre las moléculas que se unen entre sí. Los ejemplos de unión específica incluyen interacciones antígeno-anticuerpo, interacciones enzima-sustrato, formación de dupletes o tripletes entre polinucleótidos y/o oligonucleótidos, interacciones receptor-ligando y similares. Tal como se usa en el presente documento, "contacto" en referencia a la especificidad o unión específica significa que dos moléculas están lo bastante próximas de modo que interacciones químicas no covalentes débiles, tales como fuerzas de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas e hidrófobas y similares, dominan la interacción de las moléculas. Tal como se usa en el presente documento, "complejo estable" en referencia a dos o más moléculas significa que tales moléculas forman agregados unidos de manera no covalente, por ejemplo mediante unión específica, que en condiciones de ensayo son más favorables termodinámicamente que un estado no agregado.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "que puede resolverse espectralmente" en referencia a una pluralidad de etiquetas fluorescente significa que las bandas de emisión fluorescente de las etiquetas están suficientemente diferenciadas, es decir son no solapantes de manera suficiente, de modo que los marcadores moleculares a los que están unidas las respectivas etiquetas pueden distinguirse basándose en la señal fluorescente generada por las respectivas etiquetas mediante sistemas de fotodetección habituales, por ejemplo empleando un sistema de filtros de paso de banda y tubos fotomultiplicadores o similar, tal como se pone como ejemplo mediante los sistemas descritos en las patentes estadounidenses n.º^{s} 4.230.558; 4.811.218 o similares, o en Wheeless et al, págs. 21-76, en Flow Cytometry: Instrumentation and Data Analysis (Academic Press, Nueva York, 1985).

La expresión "proteína secretada" o "proteína soluble" se refiere a proteínas que (i) se expresan intracelularmente, (ii) se secretan de la célula en el medio extracelular, por ejemplo, requiriendo habitualmente una secuencia líder que dirige la proteína expresada desde el retículo endoplasmático a través de la membrana celular, y (iii) actúan sobre un receptor, habitualmente un receptor de superficie celular, para efectuar o iniciar algún acontecimiento o actividad celular, que puede ser un acontecimiento intracelular, incluyendo la proliferación o estimulación celular, un acontecimiento de superficie celular o un acontecimiento de interacción intercelular.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "sonda diana" se refiere a una sonda que se une a una molécula diana en la superficie de una membrana celular, es decir analito asociado a membrana, y que comprende uno o más marcadores moleculares unidos a un agente de unión de la sonda a través de un enlace escindible. Tal como se usa en el presente documento, se usa "sonda marcada" de manera sinónima con "compuesto de unión".

Descripción detallada de la invención

Se describen métodos para determinar la presencia y/o cantidad de dímeros u oligómeros de uno o más analitos asociados a membrana en una muestra liberando de manera selectiva marcadores moleculares de los compuestos de unión que forman complejos estables junto con los analitos asociados a membrana y una sonda de escisión. Un aspecto es la escisión limitada de marcadores moleculares de los compuestos de unión en tales complejos que están en las proximidades de la sonda de escisión, pero sustancialmente no escinde los marcadores moleculares de los compuestos de unión que no forman tales complejos. Es decir, las sondas de escisión comprenden un resto que induce la escisión que puede inducirse para escindir ciertos enlaces que están dentro de sus proximidades. Tal como se describe con más detalle a continuación, se logra una escisión local de este tipo usando restos que inducen la escisión denominados en el presente documento "sensibilizadores" que pueden inducirse para generar una especie activa, es decir, una entidad química reactiva, de vida corta, difusible, que puede reaccionar con los enlaces escindibles de los marcadores moleculares para provocar su liberación de un compuesto de unión.

Se presenta esquemáticamente una ilustración en las figuras 1A y 1B. Los compuestos de unión (100) que tienen los marcadores moleculares "mT_{1}" y "mT_{2}" y la sonda de escisión (102) que tiene un fotosensibilizador "PS" se combinan con células biológicas (104). Los compuestos de unión que tienen el marcador molecular "mT_{1}" son específicos para receptores de superficie celular R_{1} (106) y los compuestos de unión que tienen el marcador molecular "mT_{2}" son específicos para receptores de superficie celular R_{2} (108). Los receptores de superficie celular R_{1} y R_{2} están presentes como monómeros, por ejemplo (106) y (108), y como dímeros (110) en la membrana de superficie celular (112). Después de éstos, se incuban los componentes de ensayo en un tampón de unión adecuado para permitir la formación (114) de complejos estables entre los compuestos de unión y sus respectivas dianas receptoras y entre la sonda de escisión y su diana receptora. Tal como se ilustra, los compuestos de unión y las sondas de escisión pueden comprender cada uno una composición de unión a anticuerpo, que permite que los marcadores moleculares y el resto que induce la escisión se dirijan específicamente hacia los componentes de membrana. En un aspecto, tales composiciones de unión a anticuerpo son anticuerpos monoclonales. Los tampones de unión pueden comprender tampones usados en técnicas ELISA convencionales o similares. Tras la unión de los compuestos y las sondas de escisión para dar complejos estables (116), la mezcla de ensayo se ilumina (118) para inducir los fotosensibilizadores (120) para generar oxígeno en estado singlete. El oxígeno en estado singlete reacciona rápidamente con los componentes de la mezcla de ensayo de manera que su proximidad eficaz (122) para escindir los enlaces escindibles de los marcadores moleculares se limita espacialmente de manera que sólo se liberan (124) los marcadores moleculares que resultan estar dentro de la proximidad eficaz. Tal como se ilustra, los únicos marcadores moleculares liberados son aquéllos en los compuestos de unión que forman complejos estables con dímeros R_{1}-R_{2} y una sonda de escisión. Los marcadores moleculares liberados (126) se retiran de la mezcla de ensayo y se separan (128) de acuerdo con una característica de separación de manera que se forma un pico diferenciado (130) en un perfil de separación (132). Tal retirada y separación puede ser la misma etapa. Opcionalmente, antes de la iluminación puede retirarse el tampón de unión y sustituirse por un tampón más adecuado para la separación, es decir un tampón de separación. Por ejemplo, los tampones de unión tienen habitualmente concentraciones salinas que pueden degradar el rendimiento de algunas técnicas de separación, tales como electroforesis capilar, para separar marcadores moleculares en picos diferenciados. Tal intercambio de tampones puede realizarse mediante filtración con membrana.

Las figuras 2A-2E ilustran un ejemplo para crear un perfil de dimerización entre una pluralidad de tipos de receptores. La figura 2A resume las etapas básicas de un ensayo de este tipo. Las membranas celulares (200) que van a someterse a ensayo para determinar dímeros de receptores de superficie celular se combinan con conjuntos de compuestos de unión (202) y (204) y sonda de escisión (206). Las fracciones de membrana (200) contienen tres tipos diferentes de moléculas de receptor monoméricas ("1", "2" y "3") en su membrana celular que se asocian para formar tres heterodímeros diferentes: 1-2, 1-3 y 2-3. Se combinan tres reactivos de anticuerpo (202) y (204) con una fracción de membrana (200), teniendo cada uno de los reactivos de anticuerpo que tienen especificidad de unión para una de las tres moléculas de receptor, siendo el anticuerpo (206) específico para la molécula de receptor 1, siendo el anticuerpo (204) específico para la molécula de receptor 2 y siendo el anticuerpo (202) específico para la molécula de receptor 3. El anticuerpo para la primera molécula de receptor está acoplado covalentemente a una molécula de fotosensibilizador, PS marcado. Los anticuerpos para las moléculas de receptor segunda y tercera están unidos a dos marcadores diferentes, T_{2} y T_{3} marcados, respectivamente, a través de un enlace escindible por una especie activa generada por el resto de fotosensibilizador.

Tras mezclar, se deja que los anticuerpos se unan (208) a moléculas en la superficie de las membranas. El fotosensibilizador se activa (210), escindiendo el enlace entre los marcadores y anticuerpos que están dentro de una distancia viable de una molécula de sensibilizador, liberando de ese modo los marcadores en el medio de ensayo. Entonces el material de la reacción se separa (212), por ejemplo, mediante electroforesis capilar, tal como se ilustra. Tal como se muestra en la parte inferior de la figura 2A, se liberan los marcadores T_{2} y T_{3}, y la separación mediante electroforesis revelará dos bandas que corresponden a estos marcadores. Ya que los marcadores se diseñan para que tengan una movilidad electroforética conocida, cada una de las bandas puede asignarse de manera única a uno de los marcadores usados en el ensayo.

Tal como se muestra en la figura 2A, sólo dos de los tres heterodímeros diferentes que están presentes en la membrana celular se unirán tanto a un anticuerpo que contiene fotosensibilizador como a un anticuerpo que contiene marcador, y por tanto sólo estas dos especies deben dar lugar a marcadores liberados. Sin embargo, se requieren múltiples experimentos para medir las cantidades relativas de los diferentes dímeros. La figura 2B proporciona una tabla que incluye cinco combinaciones de ensayo diferentes. En la figura 2C están los resultados ilustrativos para cada composición de ensayo. El ensayo I representa los resultados del ensayo completo, tal como se describe en la figura 2A. En el ensayo II, se omite el anticuerpo específico para la molécula de receptor 1, que se une al fotosensibilizador. Este ensayo no proporciona ninguna señal, lo que indica que las señales T_{2} y T_{3} obtenidas en el ensayo I requieren el reactivo fotosensibilizador. De manera similar, el ensayo V muestra que las señales de marcador requieren la presencia de las membranas. Los ensayos III y IV muestran que cada reactivo marcado no requiere la presencia del otro para escindirse. Estos resultados, cuando se consideran en conjunto, permiten sacar conclusiones referentes a la presencia y composición de los heterodímeros de receptor presentes en la membrana, tal como se facilita en la figura 2C, es decir, que está presente tanto el heterodímero 1-2 como el 1-3. Además, las intensidades de señal relativas de cada marcador permiten estimar la abundancia relativa de cada uno de los heterodímeros.

Sin embargo, no puede extraerse ninguna conclusión referente a la existencia del heterodímero 2-3 con la combinación de reactivos usados en este ensayo. No se obtendrá ninguna señal que represente este complejo, ya esté presente o no el complejo, ya que no tendrá unido al mismo un reactivo fotosensibilizador. Con el fin de sacar conclusiones referentes a cada posible combinación dimérica de los tres monómeros, o bien debe usarse un cuarto reactivo que pueda localizarse en cada posible oligómero que comprende los monómeros 1, 2 y/o 3, o bien los tres agentes de unión usados en este experimento deben acoplarse en diferentes combinaciones a marcadores y moléculas de sensibilizador. Esta última estrategia se ilustra en las figuras 2D y 2E. En la tabla de la izquierda de la figura 2D se incluyen tres posibles combinaciones de distribución de fotosensibilizador y marcador entre los tres reactivos de anticuerpo. La primera combinación comprende un fotosensibilizador acoplado al anticuerpo específico para el monómero número 1, y es la misma combinación usada en la ilustración de las figuras 2A-2C, y tiene la misma población de dímeros que en la figura 2C. La segunda combinación comprende un fotosensibilizador acoplado al anticuerpo específico para el monómero número 2, y el perfil de población proporciona el mismo número para el heterodímero 1-2, más un valor para el heterodímero 2-3. La tercera combinación comprende un fotosensibilizador acoplado al anticuerpo específico para el monómero número 3, y el perfil de población proporciona el mismo número para el heterodímero 1-3 y 2-3 tal como se obtiene a partir de las dos primeras combinaciones. Estos resultados pueden combinarse proporcionando el perfil de población de heterodímeros global facilitado en la figura 2E.

Tal como se mencionó anteriormente, otro aspecto se refiere a determinar la formación de uno o más complejos oligoméricos de moléculas de superficie celular en membranas celulares. Los complejos que pueden determinarse incluyen homo-oligómeros que comprenden dos o más moléculas de una única especie molecular, y hetero-oligómeros que comprenden dos o más especies moleculares diferentes. Clases preferidas de moléculas de superficie celular son receptores, de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico.

Los métodos de la invención, tal como se definen en las reivindicaciones, comprenden poner en contacto al menos dos moléculas de superficie celular con dos agentes de unión diferenciados, el primero conjugado con un marcador a través de un enlace escindible, en el que el marcador comprende un grupo de detección, y el segundo conjugado con un agente de escisión que puede escindir el enlace escindible cuando el enlace está dentro de una proximidad del agente de escisión que es eficaz para la reacción. Esta región reactiva se denomina la "proximidad eficaz" del agente de escisión. La liberación del marcador por el agente de escisión indica la ubicación de la sonda marcada dentro de la proximidad eficaz de la sonda de escisión. Una composición de los agentes de unión primero y segundo puede ser moléculas de anticuerpo, por ejemplo anticuerpos monoclonales. Un grupo de detección puede ser un fluoróforo. Una realización preferida de un agente de escisión es una molécula de sensibilizador que puede activarse para producir una especie de escisión activa. Más preferiblemente, el agente de escisión comprende un fotosensibilizador que se activa mediante la luz para producir un agente oxidante que escinde un enlace lábil a la oxidación que conjuga el marcador al primer agente de unión de la sonda marcada.

En otro aspecto descrito en el que se desea determinar la formación de una pluralidad de complejos de superficie celular o la formación de un único complejo de superficie celular que comprende una pluralidad de diferentes especies moleculares, los métodos emplean una pluralidad de primeros agentes de unión, cada uno conjugado con un marcador diferenciado, formando de ese modo una pluralidad de sondas marcadas. Cada marcador en la pluralidad de marcadores comprenderá un grupo de detección y un modificador de la movilidad que proporciona medios para distinguir cada marcador que puede liberarse de todos los demás marcadores que pueden liberarse en la pluralidad. Un medio de distinción preferido de los marcadores liberados es la separación física mediante electroforesis, en la que los modificadores de la movilidad confiere diferencias en la movilidad electroforética. Los modos preferidos de electroforesis incluyen electroforesis capilar, incluyendo tanto electroforesis capilar convencional como separaciones sobre tarjetas de microfluidos. Otros medios de distinción preferidos incluyen la resolución espectral basada en diferencias en las propiedades ópticas de los grupos de detección de los marcadores, y la separación física mediante espectrometría de masas basada en diferencias en la masa de los marcadores.

Otro aspecto descrito se refiere a determinar el efecto de un compuesto sobre la formación de un complejo oligomérico en la superficie de membranas celulares. Estos métodos comprenden preparar dos combinaciones de membranas celulares, sondas marcadas y sondas de escisión, en los que se añade un compuesto a una de las dos combinaciones. Tras la incubación para permitir la escisión de la sonda marcada, se detecta la cantidad de marcador liberado en cada combinación, y se comparan las dos mezclas. La invención proporciona además métodos para determinar el efecto de un compuesto sobre la formación de una pluralidad de complejos de superficie celular.

Se describe un método para determinar la formación de un complejo oligomérico que comprende una primera y segunda molécula de superficie celular en una membrana celular, comprendiendo el método las etapas: (a) mezclar en condiciones de unión: (i) la membrana celular, (ii) una sonda marcada que comprende un primer agente de unión que puede unirse específicamente a la primera molécula de superficie celular y al menos una molécula de un marcador que comprende un grupo de detección, estando conjugado el marcador a través de un enlace escindible con el primer agente de unión, y (iii) una sonda de escisión que comprende un segundo agente de unión que puede unirse específicamente a la segunda molécula de superficie celular y un agente de escisión que puede escindir el enlace escindible cuando se encuentra dentro de una proximidad eficaz, en el que cuando el complejo oligomérico se forma en la membrana celular y se une mediante tanto la sonda marcada como la sonda de escisión, al menos un enlace escindible de la sonda marcada está dentro de la proximidad eficaz del agente de escisión; (b) incubar la mezcla en condiciones que permiten la escisión del enlace escindible que está dentro de la proximidad eficaz del agente de escisión, liberando de ese modo el marcador de la sonda marcada; y (c) detectar el marcador liberado, determinando de ese modo la formación del complejo oligomérico.

Se describe un método para determinar la formación de uno o más complejos oligoméricos, comprendiendo cada complejo oligomérico una primera y segunda molécula de superficie celular en una membrana celular, comprendiendo el método las etapas: (a) mezclar en condiciones de unión: (i) la membrana celular, (ii) una pluralidad de sondas marcadas, comprendiendo cada sonda marcada un primer agente de unión que puede unirse específicamente a uno de un conjunto de las primeras moléculas de superficie celular, y al menos una molécula de un marcador de un conjunto de marcadores, en el que el marcador comprende un grupo de detección y un modificador de la movilidad que proporciona medios para distinguir cada marcador de todos los demás marcadores del conjunto, estando conjugado el marcador a través de un enlace escindible con el primer agente de unión, y (iii) una sonda de escisión que comprende un segundo agente de unión que puede unirse específicamente a la segunda molécula de superficie celular y un agente de escisión que puede escindir los enlaces escindibles cuando se encuentra dentro de una proximidad eficaz,

en el que cuando el complejo oligomérico se forma en la membrana celular y se une mediante tanto la sonda marcada como la sonda de escisión, al menos un enlace escindible de la sonda marcada está dentro de la proximidad eficaz del agente de escisión; (b) incubar la mezcla en condiciones que permiten la escisión de los enlaces escindibles que están dentro de la proximidad eficaz del agente de escisión, para generar marcadores liberados de las sondas marcadas; (c) separar los marcadores liberados según los medios para la distinción; y (d) detectar los marcadores separados, determinando de ese modo la formación de cada uno de los complejos oligoméricos.

Se describe un método para determinar el efecto de un compuesto sobre la formación de un complejo oligomérico que comprende una primera y segunda molécula de superficie celular en una membrana celular, comprendiendo el método las etapas: (a) preparar dos mezclas en condiciones de unión que comprenden: (i) la membrana celular, (ii) una sonda marcada que comprende un primer agente de unión que puede unirse específicamente a la primera molécula de superficie celular y al menos una molécula de un marcador que comprende un grupo de detección, estando conjugado el marcador a través de un enlace escindible con el primer agente de unión, y (iii) una sonda de escisión que comprende un segundo agente de unión que puede unirse específicamente a la segunda molécula de superficie celular y un agente de escisión que puede escindir el enlace escindible cuando se encuentra dentro de una proximidad eficaz, en la que cuando el complejo oligomérico se forma en la membrana celular y se une mediante tanto la sonda marcada como la sonda de escisión, al menos un enlace escindible de la sonda marcada está dentro de la proximidad eficaz del agente de escisión; (b) añadir el compuesto a una de las dos mezclas; (c) incubar las mezclas en condiciones que permiten la escisión del enlace escindible que está dentro de la proximidad eficaz del agente de escisión, liberando de ese modo el marcador de la sonda marcada; (d) detectar e identificar la cantidad del marcador liberado en cada unas de las dos combinaciones de la etapa (c); y (e) comparar la cantidad de marcador liberado en las dos mezclas, determinando de ese modo el efecto del compuesto sobre la formación del complejo oligomérico.

Se describe un método para determinar el efecto de un compuesto sobre la formación de cualquiera o todos de una pluralidad de complejos oligoméricos, comprendiendo cada complejo oligomérico una primera y segunda molécula de superficie celular en una membrana celular, comprendiendo el método las etapas: (a) preparar dos mezclas en condiciones de unión que comprenden: (i) la membrana celular, (ii) una pluralidad de sondas marcadas, comprendiendo cada sonda marcada un primer agente de unión que puede unirse específicamente a una de las primeras moléculas de superficie celular de la pluralidad de complejos oligoméricos, y al menos una molécula de un marcador de un conjunto de marcadores, en el que el marcador comprende un grupo de detección y un modificador de la movilidad que proporciona medios para distinguir cada marcador de todos los demás marcadores del conjunto, estando conjugado el marcador a través de un enlace escindible con el primer agente de unión, y (iii) una sonda de escisión que comprende un segundo agente de unión que puede unirse específicamente a una de las segundas moléculas de superficie celular de la pluralidad de complejos oligoméricos, y un agente de escisión que puede escindir los enlaces escindibles cuando se encuentra dentro de una proximidad eficaz, en el que cuando el complejo oligomérico se forma en la membrana celular y se une mediante tanto la sonda marcada como la sonda de escisión, al menos un enlace escindible de la sonda marcada está dentro de la proximidad eficaz del agente de escisión; (b) añadir el compuesto a una de las dos mezclas; (c) incubar las mezclas en condiciones que permiten la escisión de los enlaces escindibles que están dentro de la proximidad eficaz del agente de escisión, liberando de ese modo los marcadores de las sondas marcadas; (d) separar los marcadores liberados según los medios para la distinción; (e) detectar e identificar la cantidad de cada uno de los marcadores separados liberados en cada una de las dos mezclas de la etapa (c); y (f) comparar la cantidad de cada marcador liberado en las dos mezclas, determinando de ese modo el efecto del compuesto sobre la formación de los complejos oligoméricos.

Las muestras que contienen analitos asociados a membrana diana pueden proceder de una amplia variedad de fuentes que incluyen cultivos celulares, tejidos animales o vegetales, microorganismos, biopsias de pacientes o similares. Las muestras se preparan para los ensayos de la invención usando técnicas convencionales, que pueden depender de la fuente a partir de la cual se toma una muestra. Puede encontrarse orientación para preparar membranas celulares para análisis en tratados convencionales, tales como Sambrook et al, Molecular Cloning, segunda edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989); Innis et al, editores, PCR Protocols (Academic Press, Nueva York, 1990); Berger y Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques", vol. 152, Methods in Enzymology (Academic Press, Nueva York, 1987); Ohlendieck, K. (1996). Protein Purification Protocols; Methods in Molecular Biology, Humana Press Inc., Totowa, NJ. vol. 59: 293-304; Method Booklet 5, "Signal Transduction" (Biosource International, Camarillo, CA, 2002). Para las células de cultivo de tisular de mamífero, o fuentes similares, pueden prepararse muestras de analitos asociados a membrana diana mediante técnicas de lisis celular convencionales (por ejemplo NaCl 0,14 M, MgCl_{2} 1,5 mM, Tris-Cl 10 mM (pH 8,6), Nonidet P-40 al 0,5% e inhibidores de proteasas y/o fosfatasas si se requieren). Para biopsias y especímenes médicos: Bancroft JD & Stevens A, eds. Theory and Practice of Histological Techniques (Churchill Livingstone, Edimburgo, 1977); Pearse, Histochemistry. Theory and applied. 4ª ed. (Churchill Livingstone, Edimburgo, 1980).

Tal como se describe con más detalle a continuación, se determinan analitos asociados a membrana diana mediante separación e identificación de los marcadores moleculares liberados. Puede emplearse una amplia variedad de técnicas de separación que pueden distinguir moléculas basándose en una o más diferencias físicas, químicas u ópticas entre las moléculas que están separándose incluyendo movilidad electroforética, peso molecular, forma, solubilidad, pKa, hidrofobicidad, carga, razón carga/masa, polaridad o similar. En un aspecto, los marcadores moleculares en una pluralidad difieren en las características de detección óptica y movilidad electroforética y se separan mediante electroforesis. En otro aspecto, los marcadores moleculares en una pluralidad difieren en peso molecular, forma, solubilidad, pKa, hidrofobicidad, carga, polaridad y se separan mediante HPLC de fase normal o de fase inversa, HPLC de intercambio iónico, eletrocromatografía capilar, espectroscopía de masas, cromatografía en fase gaseosa o técnica similar.

Se describe otro aspecto que proporciona conjuntos de marcadores moleculares que pueden separarse en bandas o picos diferenciados mediante la técnica de separación empleada tras liberarse de los compuestos de unión. Los marcadores moleculares dentro de un conjunto pueden ser químicamente diversos; sin embargo, por conveniencia, habitualmente los conjuntos de marcadores moleculares están químicamente relacionados. Por ejemplo, pueden ser todos péptidos o pueden consistir en diferentes combinaciones de los mismos monómeros o elementos estructurales básicos o pueden sintetizarse usando el mismo armazón básico con diferentes grupos sustituyentes para conferir diferentes características de separación, tal como se describe con más detalle a continuación. El número de marcadores moleculares en una pluralidad puede variar dependiendo de varios factores incluyendo el modo de separación empleado, las etiquetas usadas en los marcadores moleculares para la detección, la sensibilidad de los restos de unión, la eficacia con la que se escinden los enlaces escindibles y similares. En un aspecto, el número de marcadores moleculares en una pluralidad oscila desde 2 hasta varias decenas, por ejemplo 30. En otros aspectos, el tamaño de la pluralidad puede estar en el intervalo de desde 2 hasta 20, de 2 a 10, de 3 a 20, de 3 a 10, de 4 a 30, de 4 a 10, de 5 a 20 o de 5 a 10.

Marcadores moleculares y enlaces escindibles

En una realización tal como se define en las reivindicaciones, se escinden los marcadores moleculares de un compuesto de unión, o la sonda marcada, mediante la reacción de un enlace escindible con una especie activa, tal como oxígeno en estado singlete, generado por un resto que induce la escisión, por ejemplo Singh et al, publicaciones de patente internacional WO 01/83502 y WO 02/95356.

Se describen mezclas de pluralidades de diferentes compuestos de unión, en las que cada compuesto de unión diferente tiene uno o más marcadores moleculares unidos a través de enlaces escindibles. La naturaleza del compuesto de unión, el enlace escindible y el marcador molecular puede variar ampliamente. Un compuesto de unión puede comprender una composición de unión a anticuerpo, un anticuerpo, un péptido, un ligando peptídico o no peptídico para un receptor de superficie celular, una proteína, un oligonucleótido, un análogo de oligonucleótido, tal como un ácido nucleico peptídico, una lectina o cualquier otra entidad molecular que puede unirse específicamente o formar complejos con un analito asociado a membrana de interés. En un aspecto, un compuesto de unión, que puede representarse mediante la fórmula a continuación, comprende uno o más marcadores moleculares unidos a un resto de unión específico de analito.

B-(L-E)_{k}

en la que B es un resto de unión; L es un enlace escindible; y E es un marcador molecular. Preferiblemente, en ensayos homogéneos para detectar analitos distintos a polinucleótidos, el enlace escindible, L, es un enlace lábil a la oxidación, y más preferiblemente, es un enlace escindible mediante oxígeno en estado singlete. El resto "-(L-E)_{k}" indica que un único compuesto de unión puede tener múltiples marcadores moleculares unidos a través de enlaces escindibles. En un aspecto, k es un número entero mayor o igual a uno, k puede ser mayor que varias centenas, por ejemplo de 100 a 500, o k es mayor que varias centenas hasta como mucho varios miles, por ejemplo de 500 a 5000. Habitualmente, cada una de la pluralidad de diferentes tipos de compuesto de unión tiene un marcador molecular diferente, E. Los enlaces escindibles, por ejemplo enlaces lábiles a la oxidación, y los marcadores moleculares, E, están unidos a B por medio de químicas convencionales.

B puede ser una composición de unión a anticuerpo. Tales composiciones se forman fácilmente a partir de una amplia variedad de anticuerpos disponibles comercialmente, tanto monoclonales como policlonales, específicos para analitos asociados a membrana. En particular, se dan a conocer anticuerpos específicos para receptores del factor de crecimiento epidérmico en las siguientes patentes 5.677.171; 5.772.997; 5.968.511; 5.480.968; 5.811.098. La patente estadounidense 6.488.390, da a conocer anticuerpos específicos para un receptor acoplado a proteínas G, CCR4. La patente estadounidense 5.599.681 da a conocer anticuerpos específicos para sitios de fosforilación de proteínas.

Cuando L es lábil a la oxidación, L es preferiblemente un tioéter o su análogo de selenio; o una olefina, que contiene dobles enlaces carbono-carbono, en la que la escisión de un doble enlace para dar un grupo oxo, libera el marcador molecular, E. Se dan a conocer enlaces tioéter ilustrativos en Willner et al, patente estadounidense 5.622.929. Las olefinas ilustrativas incluyen sulfuros de vinilo, éteres de vinilo, enaminas, iminas sustituidas en los átomos de carbono con un \alpha-metino (CH, un átomo de carbono que tiene al menos un átomo de hidrógeno), en las que el grupo vinilo puede estar en un anillo, el heteroátomo puede estar en un anillo o sustituido en el átomo de carbono olefínico cíclico, y habrá al menos uno y hasta cuatro heteroátomos unidos a los átomos de carbono olefínicos. El dioxetano resultante puede descomponerse de manera espontánea, calentando por encima de la temperatura ambiental, habitualmente por debajo de aproximadamente 75ºC, mediante reacción con ácido o base, o mediante fotoactivación en ausencia o presencia de un fotosensibilizador. Tales reacciones se describen en: Adam y Liu, J. Amer. Chem. Soc. 94, 1206-1209, 1972, Ando, et al., J.C.S. Chem. Comm. 1972, 477-8, Ando, et al., Tetrahedron 29, 1507-13, 1973, Ando, et al., J. Amer. Chem. Soc. 96, 6766-8, 1974, Ando y Migita, ibíd. 97, 5028-9, 1975, Wasserman y Terao, Tetra. Lett. 21, 1735-38, 1975, Ando y Watanabe, ibíd. 47, 4127-30, 1975, Zaklika, et al., Photochemistry and Photobiology 30, 35-44, 1979, y Adam, et al., Tetra. Lett. 36, 7853-4, 1995. Véase también la patente estadounidense n.º 5.756.726.

La formación de dioxetanos se obtiene mediante la reacción de oxígeno en estado singlete con una olefina activada sustituida con un marcador molecular en un átomo de carbono y el resto de unión en el otro átomo de carbono de la olefina. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.807.675. Estos enlaces escindibles pueden representarse mediante la siguiente fórmula:

-W-(X)_{n}C_{\alpha} = C_{\beta}(Y)(Z)-

en la que:

W puede ser un enlace, un heteroátomo, por ejemplo, O, S, N, P, M (pretendiendo ser un metal que forma un enlace covalente estable), o una funcionalidad, tal como carbonilo, imino, etc., y puede estar unido a X o C_{\alpha}, al menos un X será alifático, aromático, alicíclico o heterocíclico y estará unido a C_{\alpha} a través de un heteroátomo, por ejemplo, N, O o S y el otro X puede ser igual o diferente y puede ser además hidrógeno, alifático, aromático, alicíclico o heterocíclico, siendo habitualmente aromático o heterocíclico aromático, pudiendo tomarse un X junto con Y para formar un anillo, habitualmente un anillo heterocíclico, con los átomos de carbono a los que están unidos, generalmente cuando es distinto de hidrógeno siendo desde aproximadamente 1 hasta 20, habitualmente de 1 a 12, más habitualmente de 1 a 8 átomos de carbono y un X tendrá de 0 a 6, habitualmente de 0 a 4 heteroátomos, mientras que el otro X tendrá al menos un heteroátomo y hasta 6 heteroátomos, habitualmente de 1 a 4 heteroátomos;

Y irá dentro de la definición de X, estando habitualmente unido a C_{\beta} a través de un heteroátomo y tal como se indica puede tomarse junto con X para formar un anillo heterocíclico;

Z será habitualmente aromático, incluyendo aromático heterocíclico, de desde aproximadamente 4 hasta 12, habitualmente de 4 a 10 átomos de carbono y de 0 a 4 heteroátomos, tal como se describió anteriormente, estando unido directamente a C_{\beta} o a través de un heteroátomo, tal como se describió anteriormente;

n es 1 ó 2, dependiendo de si el marcador molecular está unido a C_{\alpha} o X;

en la que uno de Y y Z tendrá una funcionalidad para unirse al resto de unión, o estará unido al resto de unión, por ejemplo sirviendo como, o incluyendo un grupo de enlace, a un resto de unión, T.

W, X, Y y Z pueden seleccionarse de manera que tras la escisión, el marcador molecular, E, está dentro de los límites de tamaño descritos a continuación.

Los enlaces escindibles ilustrativos incluyen ácido S(marcador molecular)-3-tiolacrílico, N(marcador molecular), ácido N-metil-4-amino-4-butenoico, 3-hidroxiacroleína, N-(4-carboxifenil)-2-(marcador molecular)-imidazol, oxazol y tiazol.

Son también de interés los derivados de N-alquil-acridinilo, sustituidos en la posición 9 con un grupo divalente de fórmula:

-(CO)X^{1}(A)-

en la que:

X^{1} es un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en O, S, N y Se, habitualmente uno de los tres primeros; y

A es una cadena de al menos 2 átomos de carbono y habitualmente no más de 6 átomos de carbono sustituida con un marcador molecular, pudiendo satisfacerse las otras valencias de A mediante hidrógeno, aunque la cadena puede estar sustituida con otros grupos, tales como grupos alquilo, arilo, heterocíclicos, etc., siendo A generalmente de no más de 10 átomos de carbono.

Son también de interés compuestos heterocíclicos, tales como diheterociclopentadienos, tal como se pone como ejemplo mediante imidazoles, tiazoles, oxazoles, etc. sustituidos, en los que los anillos estarán habitualmente sustituidos con al menos un grupo aromático y en algunos casos será necesaria hidrólisis para liberar el marcador molecular.

Son también de interés los derivados de teluro (Te), en los que el Te está unido a un grupo etileno que tiene un átomo de hidrógeno \beta con respecto al átomo de Te, siendo el grupo etileno parte de un anillo alicíclico o heterocíclico, que puede tener un grupo oxo, que puede estar condensado con un anillo aromático y la otra valencia del Te está unida al marcador molecular. Los anillos pueden ser cumarina, benzoxazina, tetralina, etc.

Varios enlaces escindibles y sus productos de escisión se ilustran en las figuras 3 A-F. El enlace escindible de tiazol, "-CH_{2}-tiazol-(CH2)_{n}-C(=O)-NH-proteína," mostrado en la figura 3A, da como resultado un marcador molecular con el resto "-CH_{2}-C(=O)-NH-CHO". Preferiblemente, n está en el intervalo de desde 1 hasta 12, y más preferiblemente, desde 1 hasta 6. El enlace escindible de oxazol, "-CH_{2}-oxazol-(CH2)_{n}-C(=O)-NH-proteína," mostrado en la figura 3B, da como resultado un marcador molecular con el resto "-CH_{2}-C(=O)O-CHO". Un enlace escindible de olefina (figura 3C) se muestra en relación con la realización del compuesto de unión "B-L-M-D", descrito anteriormente y siendo D un colorante de fluoresceína. Puede emplearse el enlace escindible de olefina. La escisión del enlace de olefina ilustrado da como resultado un marcador molecular de la forma: "R-(C=O)-M-D", en el que "R" puede ser cualquier sustituyente dentro de la descripción general de los marcadores moleculares, E, proporcionada anteriormente. R puede ser un grupo donador de electrones, por ejemplo Ullman et al, patente estadounidense 6.251.581; Smith y March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5ª Edición (Wiley-Interscience, Nueva York, 2001). R puede ser un grupo donador de electrones que tiene desde 1-8 átomos de carbono y desde 0 hasta 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S y N. R puede ser -N(Q)_{2}, -OQ, p-[C_{6}H_{4}N(Q)_{2}], furanilo, n-alquilpirrolilo, 2-indolilo o similar, en los que Q es alquilo o arilo. En referencia adicional al enlace escindible de olefina de la figura 3C, los sustituyentes "X" y "R" son equivalentes a los sustituyentes "X" e "Y" de la fórmula anterior que describe el enlace escindible, L. En particular, X en la figura 3C es preferiblemente morfolino, -OR' o -SR", en los que R' y R" son alifáticos, aromáticos, alicíclicos o heterocíclicos que tienen desde 1 hasta 8 átomos de carbono y de 0 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S y N. Un enlace escindible de tioéter se ilustra en la figura 3D que tiene la forma "-(CH_{2})_{2}-S-CH(C_{6}H_{5})C(=O)NH-(CH_{2})_{n}-NH-", en el que n está en el intervalo de desde 2 hasta 12, y más preferiblemente, en el intervalo de desde 2 hasta 6. Los enlaces escindibles de tioéter del tipo mostrado en la figura 3D pueden unirse a restos de unión, T, y marcadores moleculares, E, por medio de los compuestos precursores mostrados en las figuras 3E y 3F. Para unirse a un grupo amino de un resto de unión, T, el hidroxilo terminal se convierte en un éster de NHS mediante química convencional. Tras la reacción con el grupo amino y la unión, se elimina el grupo protector Fmoc para producir una amina libre que entonces se hace reaccionar con éster de NHS del marcador molecular.

El marcador molecular, E, puede comprender un marcador electrofórico tal como se describe en las siguientes referencias cuando se lleva a cabo la separación de pluralidades de marcadores moleculares mediante cromatografía de gases o espectrometría de masas: Zhang et al, Bioconjugate Chem., 13: 1002-1012 (2002); Giese, Anal. Chem., 2: 165-168 (1983); y patentes estadounidenses 4.650.750; 5.360.819; 5.516.931; 5.602.273.

El marcador molecular, E, puede ser un compuesto orgánico soluble en agua que es estable con respecto a la especie activa, especialmente oxígeno en estado singlete, y que incluye un grupo indicador o de detección. Por otra parte, E puede variar ampliamente de tamaño y estructura. En un aspecto, E tiene un peso molecular en el intervalo de desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 2500 daltons, desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 1500 daltons. Las estructuras de E se describen con más detalle a continuación. E puede comprender un grupo de detección para generar una señal electroquímica, fluorescente o cromogénica. Cuando la detección se realiza por la masa, E puede no tener un resto separado para los fines de detección. El grupo de detección puede generar una señal fluorescente.

Los marcadores moleculares dentro de una pluralidad se seleccionan de manera que cada uno tiene una característica de separación única y/o una propiedad óptica única con respecto a los demás miembros de la misma pluralidad. En un aspecto, la característica de separación cromatográfica o electroforética es el tiempo de retención en un conjunto de condiciones de separación habituales, convencionales en la técnica, por ejemplo voltaje, presión de columna, tipo de columna, fase móvil, medio de separación electrofóretica o similar. En otro aspecto, la propiedad óptica es una propiedad de fluorescencia, tal como el espectro de emisión, duración de fluorescencia, intensidad de fluorescencia a una longitud de onda o banda de longitudes de onda dada o similar. Por ejemplo, cada marcador molecular de una pluralidad puede tener las mismas propiedades de emisión fluorescente, pero cada uno diferirá de los demás en virtud a un tiempo de retención único. Por otra parte, o dos o más de los marcadores moleculares de una pluralidad puede tener tiempos de retención idénticos, pero tendrán propiedades fluorescentes únicas, por ejemplo espectros de emisión que pueden resolverse espectralmente, de manera que todos los miembros de la pluralidad pueden distinguirse mediante la combinación de separación molecular y medición de fluorescencia.

Pueden detectarse marcadores moleculares liberados mediante separación electroforética y la fluorescencia de un grupo de detección, por ejemplo marcadores moleculares que tienen propiedades de fluorescencia sustancialmente idénticas tienen diferentes movilidades electroforéticas de manera que se forman picos diferenciados en un electroferograma en condiciones de separación. Pueden separarse pluralidades de marcadores moleculares mediante un aparato de electroforesis capilar convencional, o bien en presencia o bien en ausencia de una matriz de cribado convencional. Los aparatos de electroforesis capilar a modo de ejemplo incluyen los modelos 310, 3100 y 3700 de Applied Biosystems (Foster City, CA); el modelo P/ACE MDQ de Beckman (Fullerton, CA); MegaBACE 1000 o 4000 de Amersham Biosciences (Sunnyvale, CA); sistema de análisis genético SpectruMedix; y similares. La movilidad electroforética es proporcional a q/M^{2/3}, en la que q es la carga en la molécula y M es la masa de la molécula. De manera deseable, la diferencia en la movilidad en las condiciones de la determinación entre las etiquetas electroforéticas más próximas será al menos de aproximadamente 0,001, habitualmente 0,002, más habitualmente de al menos aproximadamente 0,01, y puede ser de 0,02 o más. En tal aparato convencional, las movilidades electroforéticas de marcadores moleculares de una pluralidad difieren en al menos un uno por ciento, o al menos un porcentaje en el intervalo de desde el 1 hasta el 10 por ciento.

En un aspecto, el marcador molecular, E, es (M, D), siendo M un resto modificador de la movilidad y siendo D un resto de detección. La notación "(M, D)" se usa para indicar que el orden de los restos M y D pueden ser de modo que cualquier resto puede estar adyacente al enlace escindible, L. Es decir, "B-L-(M, D)" designa un compuesto de unión de cualquiera de las dos formas: "B-L-M-D" o "B-L-D-M".

El resto de detección, D, puede ser un colorante o una etiqueta fluorescente, un colorante o una etiqueta cromogénica, una etiqueta electroquímica o un colorante fluorescente. Los colorantes fluorescentes a modo de ejemplo para su uso con la invención incluyen colorantes de rodamina solubles en agua, fluoresceínas, 4,7-diclorofluoresceínas, colorantes de benzoxanteno y colorantes de transferencia de energía. Los colorantes de fluoresceína a modo de ejemplo que pueden usarse se ilustran en las figuras 4A-4B.

El tamaño y la composición del resto modificador de la movilidad, M, pueden variar desde un enlace hasta aproximadamente 100 átomos en una cadena, habitualmente no más de aproximadamente 60 átomos, más habitualmente no más de aproximadamente 30 átomos, siendo los átomos carbono, oxígeno, nitrógeno, fósforo, boro y azufre. En general, cuando es distinto de un enlace, el resto modificador de la movilidad tiene desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 40, más habitualmente desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 30 heteroátomos, que además de los heteroátomos indicados anteriormente pueden incluir halógeno u otro heteroátomo. El número total de átomos distintos de hidrógeno es en general inferior a aproximadamente 200 átomos, habitualmente inferior a aproximadamente 100 átomos. Cuando están presentes grupos ácidos, dependiendo del pH del medio en el que está presente el resto modificador de la movilidad, diversos cationes pueden asociarse con el grupo ácido.

M también puede comprender cadenas poliméricas preparadas mediante métodos de síntesis de subunidades poliméricas conocidos.

En otro aspecto, tras la liberación, el marcador molecular, E, está definido por la fórmula:

A-M-D

en la que:

A es -C(=O)R, siendo R alifático, aromático, alicíclico o heterocíclico que tiene desde 1 hasta 8 átomos de carbono y de 0 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, S y N; -CH_{2}-C(=O)-NH-CHO; -SO_{2}H; -CH_{2}-C(=O)O-CHO; -C(=O)NH-(CH_{2})_{n}-NH-C(=O)C(=O)-(C_{6}H_{5}), estando n en el intervalo de desde 2 hasta 12;

D es un grupo de detección, preferiblemente un colorante fluorescente; y

M es tal como se describió anteriormente, con la condición de que el peso molecular total de A-M-D esté dentro del intervalo de desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 2500 daltons.

Unión de marcadores moleculares a restos de unión

Puede encontrarse orientación extensa en la bibliografía para unir covalentemente marcadores moleculares a compuestos de unión, tales como anticuerpos, por ejemplo Hermanson, Bioconjugate Techniques, (Academic Press, Nueva York, 1996) y similares. Uno o más marcadores moleculares pueden unirse directa o indirectamente a grupos reactivos comunes en un compuesto de unión. Los grupos reactivos comunes incluyen amina, tiol, carboxilato, hidroxilo, aldehído, cetona y similares, y pueden acoplarse a marcadores moleculares mediante agentes de reticulación disponibles comercialmente, por ejemplo Hermanson (citado anteriormente); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, novena edición (Molecular Probes, Eugene, OR, 2002), por ejemplo un éster de NHS de un marcador molecular se hace reaccionar con una amina libre en el compuesto de unión.

Tal como se ilustra en la figura 1C, los compuestos de unión comprenden un anticuerpo biotinilado (140) como resto de unión. Los marcadores moleculares (144) se unen al resto de unión (140) por medio de un puente de avidina o estreptavidina (142). El resto de unión (140) se hace reaccionar en primer lugar con analitos unidos a membrana, tras lo cual se añade (146) avidina o estreptavidina para formar un complejo (148). A los complejos (148) se les añaden (150) marcadores moleculares biotinilados para formar el compuesto de unión (152).

Una vez que se derivatiza por separado cada uno de los compuestos de unión mediante un marcador molecular diferente, se combina con otros compuestos de unión para formar una pluralidad de compuestos de unión. Habitualmente, cada tipo diferente de compuesto de unión está presente en una composición en la misma proporción; sin embargo, las proporciones pueden variarse como elección de diseño de manera que uno o un subconjunto de compuestos de unión particulares estén presentes en mayor o menor proporción. Factores que pueden afectar a tales elecciones de diseño pueden incluir la avidez y afinidad del anticuerpo por una diana particular, la prevalencia relativa de una diana, las características fluorescentes de un resto de detección de un marcador molecular.

Resto que induce la escisión que produce especies activas

Un resto que induce la escisión, o agente de escisión, es un grupo que produce una especie activa que puede escindir un enlace escindible, preferiblemente mediante oxidación. Preferiblemente, la especie activa es una especie química que muestra una actividad de vida corta de manera que sus efectos que inducen la escisión son sólo en las proximidades del sitio de su generación. O bien la especie activa es intrínsecamente de vida corta, de manera que no creará un fondo significativo más allá de las proximidades de su creación, o bien se emplea un eliminador que elimina de manera eficaz la especie activa, de manera que no está disponible para reaccionar con enlaces escindibles más allá de una corta distancia desde el sitio de su generación. Las especies activas ilustrativas incluyen oxígeno en estado singlete, peróxido de hidrógeno, NADH y radicales hidroxilo, radical fenoxilo, superóxido y similares. Los extintores ilustrativos para especies activas que provocan la oxidación incluyen polienos, carotenoides, vitamina E, vitamina C, N-conjugados de aminoácido-pirrol de tirosina, histidina y glutatión y similares, por ejemplo Beutner et al, Meth. Enzymol., 319: 226-241 (2000).

Una consideración importante para el resto que induce la escisión y el enlace escindible es que no se retiren mucho el uno del otro cuando están unidos a una proteína diana de manera que la especie activa generada por el sensibilizador difunda y pierda su actividad antes de que pueda interaccionar con el enlace escindible. Por consiguiente, un enlace escindible está dentro de 1000 nm o 20-200 nm de un resto que induce la escisión unido. Este alcance eficaz de un resto que induce la escisión se denomina como su "proximidad eficaz".

Los generadores de especies activas incluyen enzimas, tales como oxidasas, tales como glucosa oxidasa, xanteno oxidasa, D-aminoácido oxidasa, NADH-FMN oxidorreductasa, galactosa oxidasa, gliceril fosfato oxidasa, sarcosina oxidasa, colina oxidasa y alcohol oxidasa, que producen peróxido de hidrógeno, peroxidasa del rábano, que produce radical hidroxilo, diversas deshidrogenasas que producen NADH o NADPH, ureasa que produce amoníaco para crear un alto pH local.

Un sensibilizador es un compuesto que puede inducirse para generar una especie o producto intermedio reactivo, habitualmente oxígeno en estado singlete. Preferiblemente, un sensibilizador usado según la invención es un fotosensibilizador. Otros sensibilizadores incluidos dentro del alcance de la invención son compuestos que con excitación mediante calor, luz, radicación ionizante o activación química liberará una molécula de oxígeno en estado singlete. Los miembros mejor conocidos en esta clase de compuestos incluyen los endoperóxidos tales como endoperóxido de 1,4-biscarboxietil-1,4-naftaleno, 9,10-endoperóxido de 9,10-difenilantraceno y 5,12-endoperóxido de 5,6,11,12-tetrafenilnaftaleno. El calentamiento o la absorción directa de luz por estos compuestos liberan oxígeno en estado singlete. Se dan a conocer sensibilizadores adicionales en las siguientes referencias: Di Mascio et al, FEBS Lett., 355: 287 (1994) (peroxidasas and oxigenasas); Kanofsky, J.Biol. Chem. 258: 5991-5993 (1983) (lactoperoxidasa); Pierlot et al, Meth. Enzymol., 319: 3-20 (2000) (lisis térmica de endoperóxidos).

La unión de un agente de unión al resto que induce la escisión puede ser directa o indirecta, covalente o no covalente y puede lograrse mediante técnicas bien conocidas, comúnmente disponible en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva York (1978); Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970). Una amplia variedad de grupos funcionales están disponibles o pueden incorporarse. La longitud de un grupo de unión con respecto a un agente de unión puede variar ampliamente, dependiendo de la naturaleza del compuesto que está uniéndose, del efecto de la distancia sobre las propiedades de unión específicas y similares.

Puede ser deseable tener múltiples restos que inducen la escisión unidos a un agente de unión para aumentar, por ejemplo, el número de especies activas generadas. Esto puede lograrse con un material polifuncional, normalmente polimérico, que tiene una pluralidad de grupos funcionales, por ejemplo, hidroxilo, amino, mercapto, carboxilo, etilénico, aldehído, etc., como sitios para la unión. Alternativamente puede usarse un soporte. El soporte puede tener cualquiera de varias formas, tales como partícula incluyendo perla, película, membrana, tubo, pocillo, tira, varilla y similares. Para soportes en los que se incorpora el fotosensibilizador, la superficie del soporte puede ser hidrófila o puede hacerse hidrófila y el cuerpo del soporte puede ser hidrófobo. El soporte puede suspenderse en el medio en el que se emplea. Ejemplos de soportes suspendibles son materiales poliméricos tales como el látex, bicapas lipídicas, gotas de aceite, células e hidrogeles. Otras composiciones de soporte pueden incluir vidrio, metales, polímeros, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nailon, poli(butirato de vinilo), etc.; o bien usarse como tal o bien conjuntamente con otros materiales. La unión de los agente de unión al soporte puede ser directa o indirecta, covalente o no covalente y puede lograrse mediante técnicas bien conocidas, comúnmente disponibles en la bibliografía tal como se trató anteriormente. Véase, por ejemplo, "Immobilized Enzymes," Ichiro Chibata, citado anteriormente. La superficie del soporte será habitualmente polifuncional o puede estar polifuncionalizada o puede unirse a un resto de unión a diana o similar, a través de interacciones covalentes o no covalentes específicas o no específicas.

El resto que induce la escisión puede asociarse con el soporte uniéndose de manera covalente o no covalente a la superficie del soporte o incorporándose en el cuerpo del soporte. La unión a la superficie puede lograrse tal como se trató anteriormente. El resto que induce la escisión puede incorporarse en el cuerpo del soporte o bien durante o bien después de la preparación del soporte. En general, el resto que induce la escisión se asocia con el soporte en una cantidad necesaria para lograr la cantidad necesaria de especie activa. En general, la cantidad de resto que induce la escisión se determina empíricamente.

Fotosensibilizadores como restos que inducen la escisión

Tal como se mencionó anteriormente, el resto que induce la escisión preferido según la presente invención es un fotosensibilizador que produce oxígeno en estado singlete. Tal como se usa en el presente documento, "fotosensibilizador" se refiere a una molécula que absorbe luz que cuando se activa con luz convierte el oxígeno molecular en oxígeno en estado singlete. Los fotosensibilizadores pueden unirse directa o indirectamente, por medio de enlaces covalentes o no covalentes, al agente de unión de un reactivo específico de clase. Está disponible orientación para construir tales composiciones, particularmente para anticuerpos como agentes de unión, en la bibliografía, por ejemplo en los campos del tratamiento fotodinámico, inmunodiagnóstico y similares. Las siguientes son referencias a modo de ejemplo: Ullman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5426-5430 (1994); Strong et al, Ann. Nueva York Acad. Sci., 745: 297-320 (1994); Yarmush et al, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst., 10: 197-252 (1993); Pease et al, patente estadounidense 5.709.994; Ullman et al, patente estadounidense 5.340.716; Ullman et al, patente estadounidense 6.251.581; McCapra, patente estadounidense 5.516.636; y similares.

Asimismo, existe orientación en la bibliografía con respecto a las propiedades y la selección de fotosensibilizadores adecuados para su uso en la presente invención. Las siguientes son referencias a modo de ejemplo: Wasserman y R.W. Murray. Singlet Oxygen. (Academic Press, Nueva York, 1979); Baumstark, Singlet Oxygen, vol. 2 (CRC Press Inc., Boca Raton, FL 1983); y Turro, Modern Molecular Photochemistry (University Science Books, 1991).

Los fotosensibilizadores son sensibilizadores para la generación de oxígeno en estado singlete mediante excitación con luz. Los fotosensibilizadores incluyen colorantes y compuestos aromáticos, y son habitualmente compuestos que se componen de átomos unidos covalentemente, habitualmente con dobles o triples enlaces múltiples conjugados. Los compuestos normalmente absorben luz en el intervalo de longitudes de onda de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.100 nm, habitualmente, de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 nm, preferiblemente, de aproximadamente 450 a aproximadamente 950 nm, con un coeficiente de extinción en su máximo de absorbancia superior a aproximadamente 500 M^{-1}cm^{-1}, preferiblemente, de aproximadamente 5.000 M^{-1}cm^{-1}, más preferiblemente, de aproximadamente 50.000 M^{-1}cm^{-1}, en la longitud de onda de excitación. El tiempo de vida de un estado excitado producido tras la absorción de luz en ausencia de oxígeno será habitualmente al menos de aproximadamente 100 nanosegundos, preferiblemente, al menos de aproximadamente 1 milisegundo. En general, el tiempo de vida debe ser suficientemente largo como para permitir la escisión de un enlace en un reactivo según la presente invención. Un reactivo de este tipo está presente normalmente a concentraciones tal como se trata a continuación. El estado excitado del fotosensibilizador habitualmente tiene un número cuántico de espín (S) diferente que su estado fundamental y es habitualmente un triplete (S=1) cuando el estado fundamental, tal como es habitualmente el caso, es un singlete (S=0). Preferiblemente, el fotosensibilizador tiene un alto rendimiento de cruce entre sistemas. Es decir, la fotoexcitación de un fotosensibilizador habitualmente produce un estado triplete con una eficacia al menos de aproximadamente el 10%, de manera deseable al menos de aproximadamente el 40%, preferiblemente superior a aproximadamente el 80%.

Los fotosensibilizadores elegidos son relativamente fotoestables y, preferiblemente, no reaccionan de manera eficaz con el oxígeno en estado singlete. Varias características estructurales están presentes en la mayor parte de los fotosensibilizadores útiles. La mayor parte de los fotosensibilizadores tienen al menos uno y frecuentemente tres o más dobles o triples enlaces conjugados contenidos en una estructura rígida, frecuentemente aromática. Contendrán frecuentemente al menos un grupo que acelera el cruce entre sistemas tal como un grupo carbonilo o imina o un átomo pesado seleccionado de las filas 3-6 de la tabla periódica, especialmente yodo y bromo, o pueden tener estructuras aromáticas extensas.

Está disponible una gran variedad de fuentes luminosas para fotoactivar los fotosensibilizadores para generar oxígeno en estado singlete. Pueden usarse tanto fuentes policromáticas como monocromáticas siempre que la fuente sea lo suficientemente intensa como para producir bastante oxígeno en estado singlete en una duración de tiempo práctica. La duración de la irradiación depende de la naturaleza del fotosensibilizador, la naturaleza del enlace escindible, la potencia de la fuente de irradiación y su distancia de la muestra, etcétera. En general, el periodo de irradiación puede ser de menos de aproximadamente un microsegundo hasta tanto como aproximadamente 10 minutos, habitualmente en el intervalo de aproximadamente un milisegundo a aproximadamente 60 segundos. La intensidad y duración de la irradiación deben ser suficientes para excitar al menos aproximadamente el 0,1% de las moléculas de fotosensibilizador, habitualmente al menos aproximadamente el 30% de las moléculas de fotosensibilizador y de manera preferible, sustancialmente todas las moléculas de fotosensibilizador. Las fuentes luminosas a modo de ejemplo incluyen láseres tales como por ejemplo, láseres de helio-neón, láseres de argón, láseres YAG, láseres de He/Cd y láseres de rubí; fotodiodos; lámparas de vapor de mercurio, sodio y xenón; lámparas incandescentes tales como, por ejemplo, tungsteno y tungsteno/halógeno; lámparas de destellos; y similares.

Ejemplos de fotosensibilizadores que pueden utilizarse en la presente invención son aquéllos que tienen las propiedades anteriores y se enumeran en las siguientes referencias: Turro, Modern Molecular Photochemistry (citado anteriormente); Singh y Ullman, patente estadounidense 5.536.834; Li et al, patente estadounidense 5.763.602; Ullman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5426-5430 (1994); Strong et al, Ann. Nueva York Acad. Sci., 745: 297-320 (1994); Martin et al, Methods Enzymol., 186: 635-645 (1990); Yarmush et al, Crit Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst, 10: 197-252 (1993); Pease et al, patente estadounidense 5.709.994; Ullman et al, patente estadounidense 5.340.716; Ullman et al, patente estadounidense 6.251.581; McCapra, patente estadounidense 5.516.636; Wohrle, Chimia, 45: 307-310 (1991); Thetford, publicación de patente europea 0484027; Sessler et al, SPIE, 1426: 318-329 (1991); Madison et al, Brain Research, 522: 90-98 (1990); Polo et al, Inorganica Chimica Acta, 192: 1-3 (1992); Demas et al, J. Macromol. Sci., A25: 1189-1214 (1988); y similares. Se enumeran fotosensibilizadores a modo de ejemplo en la tabla 1a.

TABLA 1a

1

El resto de fotosensibilizador puede comprender un soporte, tal como se trató anteriormente con respecto al resto que induce la escisión. El fotosensibilizador puede asociarse con el soporte uniéndose de manera covalente o no covalente a la superficie del soporte o incorporándose en el cuerpo del soporte tal como se trató anteriormente. En general, el fotosensibilizador se asocia con el soporte en una cantidad necesaria para lograr la cantidad necesaria de oxígeno en estado singlete. En general, la cantidad de fotosensibilizador se determina empíricamente. Los fotosensibilizadores usados como fotosensibilizador son relativamente apolares para garantizar la disolución en un elemento lipófilo cuando el fotosensibilizador se incorpora en, por ejemplo, una partícula de látex para formar perlas de fotosensibilizador, por ejemplo tal como se da a conocer por Pease et al., patente estadounidense 5.709.994. Por ejemplo, el fotosensibilizador rosa de bengala se une covalentemente a perlas de látex de 0,5 micras por medio de grupos clorometilo en el látex para proporcionar un grupo de enlace éster, tal como se describe en J. Amer. Chem. Soc., 97: 3741 (1975).

En un aspecto, un reactivo específico de clase comprende un primer agente de unión que es un anticuerpo y un resto que induce la escisión que es un fotosensibilizador, de modo que el fotosensibilizador se une covalentemente al anticuerpo, por ejemplo usando técnicas bien conocidas tal como se da a conocer en Strong et al (citado anteriormente); Yarmush et al (citado anteriormente); o similares. Alternativamente, un reactivo específico de clase comprende un soporte en fase sólida, por ejemplo una perla, a la que se une de manera covalente o no covalente un fotosensibilizador y un anticuerpo se une, o bien directamente o bien por medio de un polímero funcionalizado, tal como aminodextrano.

Moléculas de superficie celular a modo de ejemplo

Los analitos asociados a membrana incluyen moléculas de superficie celular que forman complejos diméricos u oligoméricos. Los receptores de superficie celular implicados en la transducción de señales son de particular interés, incluyendo receptores asociados a enzimas y receptores acoplados a proteína G. Los dímeros u oligómeros pueden comprender diferentes receptores de superficie celular, es decir, receptores de superficie celular que tienen diferentes estructuras moleculares, por ejemplo diferentes secuencias de aminoácidos primarios. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "tipo de receptor" en referencia a un dímero o un oligómero significa uno de una pluralidad de diferentes moléculas de superficie celular que participan en la formación del dímero u oligómero. Por ejemplo, un heterodímero, tal como un heterodímero Her2-Her3, consiste en dos tipos de receptores diferentes (Her2 y Her3) y un homodímero, tal como un homodímero Her1-Her1, consiste en un único tipo de receptor (Her1).

Todos los receptores asociados a enzimas pueden considerarse como subunidades dentro de un posible complejo de superficie celular oligomérico. Los receptores asociados a enzimas de interés incluyen varios tipos que tienen actividades enzimáticas intrínsecas, incluyendo aquéllos con actividad tirosina cinasa, actividad tirosina fosfatasa, actividad guanilato ciclasa y actividad serina/treonina cinasa. Receptores asociados a enzimas adicionales de interés forman complejos proteína-proteína con tirosina cinasas intracelulares. Los ejemplos de receptores asociados a tirosina cinasa incluyen la familia de receptores Her, receptor de insulina, receptor de IGF-1, receptores de PDGF, receptores de FGF, receptor de VEGF, receptores de HGF y SC, la familia de receptores de neurotrofina y receptor de NGF. Los ejemplos de receptores asociados a tirosina fosfatasa incluyen, por ejemplo, proteína CD45. Los ejemplos de receptores asociados a guanilato ciclasa incluyen, por ejemplo, los receptores de péptidos natriuréticos. Los ejemplos de receptores asociados a serina/treonina cinasa incluyen, por ejemplo, receptor de activina y receptores del factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta).

Receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de interés pueden ser aquéllos que modulan la actividad adenilato ciclasa para generar AMPc como segundo mensajero, incluyendo, por ejemplo, receptores de hormonas, receptores adrenérgicos y receptores odorantes, 2) aquéllos que activan la fosfolipasa-C\gamma (PLC-\gamma), y 3) fotorreceptores. Las familias de GPCR que pueden estudiarse usando los métodos descritos pueden incluir, por ejemplo, los receptores de clase A (de tipo rodopsina), incluyendo los receptores de acetilcolina, de angiotensina, opioideos, de somatostatina, de dopamina y de bradicinina, los receptores de clase C, incluyendo receptores metabotrópicos de glutamato, sensores de Ca^{2+} y de GABA_{b}, receptores acoplados a AMPc, así como muchos otros. Los ejemplos de receptores GPCR que se sabe que forman oligómeros incluyen, por ejemplo, el receptor m3 muscarínico, receptor AT1 de angiotensina, GABA_{b}.

Membranas y células

Las membranas para su uso en la práctica de la invención pueden obtenerse de células, tales como una membrana celular, membrana nuclear, membrana mitocondrial u otra membrana intracelular, o pueden crearse artificialmente, tal como se pone como ejemplo mediante micelas y liposomas. La(s) célula(s) usada(s) en los métodos descritos en el presente documento puede(n) ser de cualquier origen, incluyendo de procariotas, eucariotas o arqueas, pero preferiblemente contienen membranas que son lipófilas. La(s) célula(s) puede(n) estar viva(s) o muerta(s). Si se obtienen de un organismo multicelular, la célula puede ser de cualquier tipo celular. Por tanto, la(s) célula(s) puede(n) ser una línea celular en cultivo o un aislado primario, la(s) célula(s) puede(n) ser de mamífero, anfibio, reptil, vegetal, de levadura, de bacteria, de espiroquetas o de protozoos. La(s) célula(s) pueden ser, por ejemplo humanas, murinas, de rata, de hámster, de pollo, de codorniz, de cabra o de perro. La célula puede ser una célula normal, una célula mutada, una célula manipulada genéticamente, una célula tumoral, hibridomas que son positivos para la secreción de anticuerpos seleccionados y similares. Son de particular interés las membranas obtenidas del tipo de célula que expresa (sobreexpresa o subexpresa) de manera diferencial un gen que causa una enfermedad. Tal como resulta evidente para un experto en la técnica, pueden obtenerse diversas líneas celulares, tales como CHO, por ejemplo, de depósitos públicos o privados. El mayor agente depositario es la Colección Americana de Cultivos Tipo (http://www.atcc.org), que ofrece una colección diversa de líneas celulares bien caracterizadas derivadas de un amplio número de organismos y muestras tisulares.

Los tipos celulares a modo de ejemplo de organismos multicelulares incluyen acidófilos, células acinares, pinealocitos, adipocitos, ameloblastos, astrocitos, células basales (madre), basófilos, hepatocitos, neuronas, células de superficie protuberantes, células C, células de músculo cardiaco, células centroacinares, células principales, condrocitos, células de Clara, células del epitelio cilíndrico, células del cuerpo lúteo, células deciduales, dendritas, células endrocrinas, células endoteliales, células enteroendocrinas, eosinófilos, eritrocitos, células mesangiales extraglomerulares, fibroblastos fetales, glóbulos rojos fetales, fibroblastos, células foliculares, células ganglionares, células gigantes de Betz, células caliciformes, células pilosas, células pilosas internas, células pilosas de tipo I, hepatocitos, células endoteliales, células de Leydig, lipocitos, células parenquimatosas hepáticas, linfocitos, células que secretan lisozimas, macrófagos, mastocitos, megacariocitos, melanocitos, células mesangiales, monocitos, células mioepiteliales, células mioides, células de la mucosa cervical, neuronas, neutrófilos, oligodendrocitos, ovocitos, osteoblastos, osteocondroclastos, osteoclastos, osteocitos, células pilares, células del surco, células paratiroideas, células parietales, células que secretan pepsinógeno, pericitos, pinealocitos, pituicitos, células plasmáticas, plaquetas, podocitos, espermatocitos, células de Purkinje, células piramidales, glóbulos rojos, reticulocitos, células de Schwann, células de Sertoli, células cilíndricas, células de músculo esquelético, células de músculo liso, células secretoras de somatostatina, células enteroendocrinas, espermátides, espermatogonias, espermatozoides, astrocitos, células de sostén de Deiter, células de sostén de Hansen, células de superficie, células epiteliales de superficie, células de la mucosa de superficie, células de glándulas sudoríparas, linfocitos T, células luteínicas de la teca, timocitos, células epiteliales del timo, células tiroideas, células epiteliales de transición, neumonocitos de tipo I y neumonocitos de tipo II.

También pueden obtenerse membranas celulares del tipo celular que está asociado con una enfermedad particular o con un estadio de la enfermedad específico. La asociación con una enfermedad particular o un estadio de la enfermedad puede establecerse mediante el comportamiento aberrante de las células en uno o más procesos biológicos tales como regulación del ciclo celular, diferenciación celular, apoptosis, quimiotaxia, movilidad celular y reorganización citoesquelética. Una célula patológica también puede confirmarse por la presencia de un patógeno que causa la enfermedad en cuestión (por ejemplo el VIH para el SIDA y el VHB para la hepatitis B). Los tipos de enfermedades que implican un funcionamiento anómalo de tipos específicos de células pueden incluir enfermedades autoinmunitarias, cáncer, obesidad, hipertensión, diabetes, enfermedades degenerativas neuronales y/o musculares, enfermedades cardiacas, trastornos endocrinos y cualquier combinación de las mismas. Los tipos de células tumorales a modo de ejemplo incluyen adenomas, carcinomas, adenocarcinomas, fibroadenomas, ameloblastomas, astrocitomas, mesoteliomas, colangiocarcinomas, colangiofibromas, colangiomas, condromas, condrosarcomas, cordomas, coriocarcinomas, craneofaringiomas, cistadenocarcinomas, cistadenomas, disgerminomas, ependimomas, epiteliomas, leucemias eritroides, fibroadenomas, fibromas, fibrosarcomas, gangliogliomas, ganglioneuromas, ganglioneuroblastomas, gliomas, leucemias granulocíticas, hemangiomas, hemangiopericitomas, hemangiosarcomas, hibernomas, histiocitomas, queratoacantomas, leiomiomas, leiomiosarcomas, lipomas, liposarcomas, luteomas, linfangiomas, linfangiosarcomas, linfomas, meduloblastomas, melanomas, meningiomas, mesoteliomas, mielolipomas, nefroblastomas, neuroblastomas, neuromioblastomas, odontomas, oligodendrogliomas, osteocondromas, osteomas, osteosarcomas, papilomas, paragangliomas, feocromocitomas, pinealomas, pituicitomas, retinoblastomas, rabdomiosarcomas, sarcomas, schwannomas, seminomas, teratomas, tecomas y timomas.

Las líneas celulares también pueden transfectarse con genes que codifican para las moléculas de superficie celular. Además, las células que expresan de manera endógena moléculas de superficie celular también pueden transfectarse para estudiar las interacciones entre las moléculas de superficie endógenas y foráneas. Las células para la transfección son aquéllas que transfectan bien y proporcionan altos niveles del producto génico transfectado expresado. Las líneas celulares que contienen receptores de superficie celular expresados de manera endógena, son útiles para la transfección por ejemplo, células CHO-K1 (de ovario de hámster chino), células HEK-293 (de riñón embrionario humano), células K562 (de leucemia mielógena crónica humana), células MDA MB-231 (de cáncer de mama humano), células MCR-7, células HeLa (de cáncer de cuello uterino humano) y células de riñón de mono COS-7. Los métodos para el cultivo y mantenimiento de estas líneas celulares se conocen bien en la técnica.

La membrana puede comprender liposomas. Los "liposomas" son estructuras de autoensamblaje que comprenden una o más bicapas lipídicas. Los liposomas se componen habitualmente de bicapas fosfolipídicas, aunque otras moléculas, tales como colesterol o ácidos grasos también pueden estar incluidas en la construcción de bicapas. Los constituyentes fosfolipídicos de los liposomas incluyen una cola lipídica hidrófoba conectada a una cabeza formada de diversos derivados de glicerilfosfato o silicona. Por tanto, los liposomas están compuestos normalmente por lípidos anfipáticos que comprenden una región de grupo de cabeza polar (hidrófilo) unida covalentemente a una o dos cadenas de acilo apolares (hidrófobas).

Métodos

Para llevar a cabo los métodos descritos se realiza una combinación de los componentes de ensayo, incluyendo las células que están sometiéndose a prueba, las sondas marcadas y la sonda de escisión. En general, los componentes de ensayo pueden combinarse en cualquier orden. En ciertas aplicaciones, sin embargo, puede ser relevante el orden de adición. Por ejemplo, puede desearse monitorizar la unión competitiva, tal como en un ensayo cuantitativo. O puede desearse monitorizar la estabilidad de un complejo ensamblado. En tales aplicaciones, las reacciones pueden ensamblarse en fases y pueden requerir incubaciones antes de que la mezcla completa se haya ensamblado, o antes de que se inicie la reacción de escisión.

Las cantidades de cada reactivo habitualmente se determinan empíricamente. El número de células usadas en un ensayo estará determinado por el número predicho de complejos diana en la superficie de cada célula y los medios de separación y detección usados para monitorizar la señal del ensayo. En general, las cantidades de las sondas marcadas y la sonda de escisión se proporcionan en un exceso molar con respecto a la cantidad esperada de las moléculas diana en las células de la muestra, en general en un exceso molar de al menos 1,5, de manera más deseable un exceso de aproximadamente 10 veces, o más. En aplicaciones específicas, la concentración usada puede ser superior o inferior, dependiendo de la afinidad de los agentes de unión y el número esperado de moléculas diana presentes en una única célula. Cuando se determina el efecto de un compuesto químico sobre la formación de complejos de superficie celular oligoméricos, el compuesto puede añadirse a las células antes de, simultáneamente con, o tras la adición de las sondas, dependiendo del efecto que esté monitorizándose.

La mezcla de ensayo se combina e incuba en condiciones que proporcionan la unión de las sondas a las moléculas de superficie celular, habitualmente en un medio acuoso, en general a un pH fisiológico (comparable al pH al que las células se cultivan), mantenido mediante un tampón a una concentración en el intervalo de aproximadamente 10 a 200 mM. Pueden usarse tampones convencionales, así como otros aditivos convencionales en caso necesario, tales como sales, medio de crecimiento, estabilizadores, etc. Normalmente se emplean temperaturas constantes y fisiológicas. Las temperaturas de incubación normalmente oscilan desde aproximadamente 4ºC hasta 70ºC, habitualmente desde aproximadamente 15ºC hasta 45ºC, más habitualmente de 25ºC a 37ºC.

Tras el ensamblaje de la mezcla de ensayo y la incubación para dejar que las sondas se unan a las moléculas de superficie celular, se trata la mezcla para activar el agente de escisión para escindir los marcadores de las sondas marcadas que están dentro de la proximidad eficaz del agente de escisión, liberando el correspondiente marcador de la superficie celular en la disolución. La naturaleza de este tratamiento dependerá del mecanismo de acción del agente de escisión. Por ejemplo, cuando se emplea un fotosensibilizador como agente de escisión, la activación de la escisión comprenderá la irradiación de la mezcla a la longitud de onda de luz apropiada para el sensibilizador particular usado.

Tras la escisión, entonces se analiza la muestra para determinar la identidad de los marcadores que se han liberado. Cuando se emplea un ensayo que emplea una pluralidad de sondas marcadas, la separación de los marcadores liberados precederá en general a su detección. Los métodos tanto para la separación como la detección se determinan en el procedimiento de diseño de los marcadores para el ensayo. Un modo preferido de separación emplea electroforesis, en la que se separan los diversos marcadores basándose en diferencias conocidas de sus movilidades electroforéticas.

Separación de marcadores moleculares liberados

Tal como se mencionó anteriormente, se diseñan marcadores moleculares para la separación mediante una técnica de separación que puede distinguir marcadores moleculares basándose en una o más características físicas, químicas y/u ópticas (denominadas en el presente documento "características de separación"). Tal como se mencionó también anteriormente, las técnicas de separación que pueden usarse con las diversas realizaciones de la invención incluyen HPLC de fase normal o fase inversa, HPLC de intercambio iónico, electrocromatografía capilar, espectroscospía de masas, cromatografía en fase gaseosa y similares. Preferiblemente, la técnica de separación seleccionada puede proporcionar información cuantitativa así como información cualitativa sobre la presencia o ausencia de marcadores moleculares (y por tanto, los correspondientes analitos). En un aspecto, se emplea una técnica de separación en fase líquida de manera que se procesa una disolución, por ejemplo disolución tampón, disolvente de reacción o similar, que contiene una mezcla de marcadores moleculares, para provocar la separación de los tipos individuales de marcadores moleculares. Habitualmente, tal separación se logra mediante el movimiento diferencial de los marcadores moleculares de una mezcla de partida de este tipo a lo largo de una trayectoria hasta que se forman bandas o picos discernibles que corresponden a regiones de aumento de concentración de los respectivos marcadores moleculares. Una trayectoria de este tipo puede definirse mediante un flujo de fluido, campo eléctrico, campo magnético. La selección de una técnica de separación particular depende de varios factores que incluyen los gastos y la conveniencia del uso de la técnica, el poder de resolución de la técnica dada la naturaleza química de los marcadores moleculares, el número de marcadores moleculares que van a separarse, el tipo de modo de detección empleado. Preferiblemente, los marcadores moleculares se separan electroforéticamente para formar un electroferograma en el que los marcadores moleculares separados están representados por picos diferenciados.

A. Separación electroforética

Se conocen bien métodos de electroforesis y existe abundante orientación para un experto en la técnica para realizar las elecciones de diseño para formar y separar pluralidades particulares de marcadores moleculares. Las siguientes son referencias a modo de ejemplo sobre electroforesis: Krylov et al, Anal. Chem., 72: 111R-128R (2000); P.D. Grossman y J.C. Colburn, Capillary Electrophoresis: Theory and Practice, Academic Press, Inc., NY (1992); patentes estadounidenses 5.374.527; 5.624.800; 5.552.028; ABI PRISM 377 DNA Sequencer User's Manual, Rev. A, enero de 1995, capítulo 2 (Applied Biosystems, Foster City, CA). En un aspecto, se separan los marcadores moleculares mediante electroforesis capilar. Las elecciones de diseño dentro del ámbito de los expertos pueden incluir la selección de instrumentos de varios modelos disponibles comercialmente, la selección de las condiciones de funcionamiento incluyendo concentración y tipo de medios de separación, pH, tiempo de separación deseado, temperatura, voltaje, dimensiones y tipo de capilar, modo de detección, el número de marcadores moleculares que van a separarse.

En un aspecto de la invención, durante o tras la separación electroforética, se detectan o identifican los marcadores moleculares registrando señales de fluorescencia y tiempos de migración (o distancias de migración) de los compuestos separados, o construyendo un diagrama de fluorescencia relativa y orden de migración de los marcadores moleculares (por ejemplo, como un electroferograma). Para realizar tal detección, los marcadores moleculares pueden iluminarse mediante medios habituales, por ejemplo una lámpara de vapor de mercurio de alta intensidad, un láser o similar. Normalmente, los marcadores moleculares se iluminan mediante luz láser generada por un láser de gas de He-Ne o un láser de diodo de estado sólido. Entonces pueden detectarse las señales de fluorescencia mediante un detector sensible a la luz, por ejemplo, un tubo fotomultiplicador, un dispositivo de carga acoplada o similar. Sistemas de detección por electroforesis a modo de ejemplo se describen en otras partes, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.º^{s} 5.543.026; 5.274.240; 4.879.012; 5.091.652; 6.142.162. En otro aspecto, los marcadores moleculares pueden detectarse electroquímicamente, por ejemplo tal como se describe en la patente estadounidense n.º 6.045.676.

La separación electroforética implica la migración y la separación de moléculas en un campo eléctrico basándose en diferencias de movilidad. Diversas formas de separación electroforética incluyen, a modo de ejemplo, electroforesis de zona libre, electroforesis en gel, isoelectroenfoque, isotacoforesis, electrocromatografía capilar y cromatografía electrocinética micelar. La electroforesis capilar implica la electroseparación, por ejemplo mediante flujo electrocinético, incluyendo flujo electroforético, dielectroforético y/o electroosmótico, realizado en un tubo o canal de dimensiones en sección transversal de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 200 micrómetros, habitualmente, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 micrómetros. El capilar puede ser un tubo capilar independiente largo o un canal en una oblea o película que se compone de silicio, cuarzo, vidrio o plástico.

En la electroseparación capilar, una alícuota de la mezcla de reacción que contiene los marcadores moleculares se somete a electroseparación introduciendo la alícuota en un canal de electroseparación que puede ser parte de, o estar conectado a, un dispositivo capilar en el que se realizan la amplificación y otras reacciones. Entonces se aplica un potencial eléctrico al medio eléctricamente conductor contenido dentro del canal para efectuar la migración de los componentes dentro de la combinación. En general, el potencial eléctrico aplicado es suficiente para lograr la electroseparación de los componentes deseados según las prácticas bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podrá determinar los potenciales eléctricos adecuados para un conjunto dado de reactivos usado en la presente invención y/o la naturaleza de las etiquetas escindidas, la naturaleza del medio de reacción, etcétera. Los parámetros para la electroseparación incluyendo aquéllos para el medio y el potencial eléctrico se optimizan habitualmente para lograr una separación máxima de los componentes deseados. Esto puede lograrse empíricamente y está muy dentro del ámbito del experto en la técnica.

La detección puede ser mediante cualquiera de los métodos conocidos asociados con el análisis de columnas de electroforesis capilar incluyendo los métodos mostrados en las patentes estadounidenses n.º^{s} 5.560.811 (columna 11, líneas 19-30), 4.675.300, 4.274.240 y 5.324.401. Los expertos en las técnicas de electroforesis reconocerán que puede usarse un amplio intervalo de potenciales eléctricos o intensidades de campo, por ejemplo, se usan campos de 10 a 1000 V/cm, siendo más típico de aproximadamente 200 a aproximadamente 600 V/cm. El límite de voltaje superior para los sistemas comerciales es de aproximadamente 30 kV, con una longitud del capilar de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 cm, proporcionando un campo máximo de aproximadamente 600 V/cm. Para ADN, normalmente el capilar está recubierto para reducir el flujo electroosmótico y el extremo de inyección del capilar se mantiene a un potencial negativo.

Para facilitar la detección, todo el aparato puede fabricarse de un material de plástico que sea ópticamente transparente, que permite en general que la luz de longitudes de onda que oscilan desde aproximadamente 180 hasta aproximadamente 1500 nm, habitualmente de aproximadamente 220 a aproximadamente 800 nm, más habitualmente de aproximadamente 450 a aproximadamente 700 nm, tenga bajas pérdidas de transmisión. Los materiales adecuados incluyen sílice fundida, plásticos, cuarzo, vidrio, etcétera.

En un aspecto, los marcadores moleculares se separan mediante electroforesis en un dispositivo de microfluidos, tal como se ilustra esquemáticamente en las figuras 16A-16C. Se describen dispositivos de microfluidos en varias solicitudes de patente publicadas y títulos de patentes nacionales e internacionales. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.º^{s} 5.750.015; 5.900.130; 6.007.690; y los documentos WO 98/45693; WO 99/19717 y WO 99/15876. De manera conveniente, se transfiere una alícuota, en general no más de aproximadamente 5 \mul, al depósito de muestra de un dispositivo de microfluidos, o bien directamente a través de inyección electroforética o neumática en un sistema integrado o mediante jeringa, capilar o similar. Las condiciones en las que se realiza la separación son convencionales y variarán con la naturaleza de los productos.

A modo de ilustración, las figuras 8A-8C muestran una red de microcanales 100 en un dispositivo de microfluidos del tipo detallado en la solicitud indicada anteriormente, para la carga de muestras y la separación electroforética de una muestra de sondas y marcadores producidos en el ensayo anterior. En resumen, la red incluye un canal de separación principal 102 que termina en depósitos aguas arriba y aguas abajo 104, 106, respectivamente. El canal principal está intersectado en posiciones axiales desviadas por un canal lateral 108 que termina en un depósito 110, y un canal lateral 112 que termina en un depósito 114. La desviación entre los dos canales laterales forma una zona de carga de muestras 116 dentro del canal principal.

En funcionamiento, se coloca una mezcla de ensayo en el depósito de muestra 110, ilustrado en la figura 8A. Tal como se indica, la mezcla de ensayo contiene una o más células diana con agente de escisión unido a la superficie, una o más sondas de proteína y, opcionalmente, patrón de marcador molecular. La reacción de ensayo, que implica la unión de la sonda inicial a célula(s) diana, seguido de la escisión de ligadores de sonda en células unidas a sonda, puede llevarse a cabo en el depósito de muestra 110 o, alternativamente, las reacciones de ensayo pueden llevarse a cabo en otro recipiente de reacción, con los componentes de la muestra que han reaccionado los añadidos al depósito de muestra.

Para cargar marcadores moleculares liberados en la zona de carga de la muestra, se aplica un campo eléctrico a través de los depósitos 110, 114, en la dirección indicada en la figura 8B, atrayéndose los marcadores moleculares liberados cargados negativamente desde el depósito 110 hacia la zona de carga 116, mientras que los componentes de la muestra cargados positivamente o no cargados permanecen en el depósito de muestra. Los marcadores liberados en la zona de carga pueden separarse ahora mediante electroforesis capilar convencional, aplicando un campo eléctrico a través de los depósitos 104, 106, en la dirección indicada en la figura 8C.

A partir del patrón electroforético resultante pueden identificarse los marcadores moleculares y los analitos correspondientes. Esto se realiza normalmente colocando un detector de fluorescencia cerca del extremo aguas abajo del canal de separación y construyendo un electroferograma de los marcadores separados moleculares, en primer lugar para determinar la característica de separación (en este caso, movilidad electroforética) tal como anteriormente y, en segundo lugar, para medir la intensidad de señal, por ejemplo, la altura de pico o el área de pico, como medición de la cantidad de marcador relativa asociada con cada sonda. Se conocen bien métodos para la detección y cuantificación de los niveles de una sonda detectable. Los marcadores moleculares pueden estar marcados con fluorescencia. Se dirige una fuente de emisión de fluorescencia convencional contra una zona de detección en una parte aguas abajo del medio de separación y se mide la emisión de fluorescencia de la zona mediante un detector de luz convencional. La altura o el área de la señal registrados proporcionan una medición de la concentración de producto y sustrato en la muestra.

Con la información de detección anterior, es ahora posible asignar cada marcador molecular detectado a una sonda particular en el conjunto de sondas, y comparar los niveles relativos de cada sonda detectable, como medición de su unión a ligando o conversión de sustrato relativa.

B. Separación cromatográfica

En un aspecto de la invención, se diseñan pluralidades de marcadores moleculares para la separación mediante cromatografía basada en una o más características físicas que incluyen pero no se limitan al peso molecular, la forma, la solubilidad, el pKa, la hidrofobicidad, la carga, la polaridad o similares. Se selecciona una técnica de separación cromatográfica basándose en parámetros tales como el tipo de columna, la fase sólida, la fase móvil y similares, seguido de la selección de una pluralidad de marcadores moleculares que pueden separarse para formar bandas o picos diferenciados o en una única operación. Varios factores determinan qué técnica de HPLC se selecciona para su uso en la invención, incluyendo el número de marcadores moleculares que han de detectarse (es decir el tamaño de la pluralidad), las cantidades estimadas de cada marcador molecular que se generará en los ensayos, la disponibilidad y facilidad de sintetizar marcadores moleculares que son candidatos para un conjunto que va a usarse en ensayos multiplexados, la modalidad de detección empleada, y la disponibilidad, la robustez, el coste y la facilidad de funcionamiento de la instrumentación de HPLC, columnas y disolventes. Generalmente, se favorecen columnas y técnicas que son adecuadas para analizar cantidades limitadas de muestra y que proporcionan separaciones de la más alta resolución. En la bibliografía puede encontrarse orientación para realizar tales selecciones, por ejemplo Snyder et al, Practical HPLC Method Development, (John Wiley & Sons, Nueva York, 1988); Millner, "High Resolution Chromatography: A Practical Approach", Oxford University Press, Nueva York (1999), Chi-San Wu, "Column Handbook for Size Exclusion Chromatography", Academic Press, San Diego (1999), y Oliver, "HPLC of Macromolecules: A Practical Approach, Oxford University Press", Oxford, Inglaterra (1989). En particular, se encuentran disponibles procedimientos para el desarrollo sistemático y la optimización de separaciones cromatográficas dadas condiciones tales como el tipo de columna, la fase sólida, por ejemplo Haber et al, J. Chromatogr. Sci., 38: 386-392 (2000); Outinen et al, Eur. J. Pharm. Sci., 6: 197-205 (1998); Lewis et al, J. Chromatogr., 592: 183-195 y 197- 208 (1992).

En un aspecto, las selecciones iniciales de candidatos de marcador molecular están determinadas por las propiedades fisioquímicas de moléculas separadas normalmente mediante la columna y la fase estacionaria seleccionadas. Las selecciones iniciales se mejoran entonces empíricamente siguiendo un procedimiento de optimización convencional, tal como se describió en la referencia anterior, y sustituyendo más marcadores moleculares candidatos adecuados para los objetivos de separación de una realización particular. En un aspecto, los objetivos de separación pueden incluir (i) separación de los marcadores moleculares de una pluralidad en bandas o picos distinguibles en un tiempo de separación inferior a 60 minutos, inferior a 40 minutos, o en un intervalo de entre 10 y 40 minutos, (ii) la formación de picos o bandas de modo que cualquier pareja tiene una resolución de al menos 1,0, al menos 1,25, o al menos 1,50, (iii) presión de la columna durante la separación inferior a 150 bar, (iv) temperatura de separación en el intervalo de desde 25ºC hasta 90ºC, o desde 35ºC hasta 80ºC, y (v) la pluralidad de picos distinguibles está en el intervalo de desde 5 hasta 30 y todos los picos en el mismo cromatograma. Tal como se usa en el presente documento, "resolución" en referencia a dos picos o bandas es la distancia entre los centros de dos picos o bandas dividida entre la amplitud de la base promedio de los picos, por ejemplo Snyder et al (citado anteriormente). Se usa un método cromatográfico para separar marcadores moleculares basándose en sus propiedades cromatográficas. Una propiedad cromatográfica puede ser, por ejemplo, un tiempo de retención de un marcador molecular en un medio cromatográfico específico en condiciones definidas, o una condición específica en la que un marcador molecular se eluye de un medio cromatográfico específico. Una propiedad cromatográfica de un marcador molecular puede ser también un orden de elución, o patrón de elución, de un marcador molecular contenido en un grupo o conjunto de marcadores moleculares que se separan cromatográficamente usando un medio cromatográfico específico en condiciones definidas. Una propiedad cromatográfica de un marcador molecular se determina por las propiedades físicas del marcador molecular y sus interacciones con un medio cromatográfico y una fase móvil. Las condiciones definidas para la cromatografía incluyen disoluciones de fase móvil, geometría de la columna, incluyendo el diámetro y la longitud de la columna, el pH, la velocidad de flujo, la presión y la temperatura de funcionamiento de la columna particulares y otros parámetros que pueden variarse para obtener la separación deseada de marcadores moleculares. Un marcador molecular, o una propiedad cromatográfica de un marcador molecular, pueden detectarse usando una variedad de métodos de cromatografía.

Los conjuntos de marcadores moleculares detectados en un único experimento son generalmente un grupo de moléculas químicamente relacionadas que difieren en masa, carga, razón masa-carga, marcador detectable, tal como etiquetas isotópicas o fluoróforos diferentes, u otra característica única. Por tanto, tanto la naturaleza química del marcador molecular como las diferencias particulares entre marcadores moleculares en un grupo de marcadores moleculares pueden considerarse cuando se selecciona un medio cromatográfico adecuado para separar marcadores moleculares en una muestra.

La separación de marcadores moleculares mediante cromatografía de líquidos puede basarse en características físicas de marcadores moleculares tales como la carga, el tamaño y la hidrofobicidad de marcadores moleculares, o características funcionales tales como la capacidad de los marcadores moleculares para unirse a moléculas tales como colorantes, lectinas, fármacos, péptidos y otros ligandos en una matriz de afinidad. Una amplia variedad de medios cromatográficos son adecuados para la separación de marcador molecular basándose en la carga, el tamaño, la hidrofobicidad y otras propiedades cromatográficas de los marcadores moleculares. La selección de un medio cromatográfico particular dependerá de las propiedades de los marcadores moleculares empleados.

Pueden detectarse marcadores moleculares separados usando una variedad de métodos analíticos, incluyendo la detección de propiedades intrínsecas de los marcadores moleculares, tales como absorbancia, fluorescencia o propiedades electroquímicas, así como la detección de un resto o grupo de detección unido a un marcador molecular. Aunque no se requiere, una variedad de restos o grupos de detección pueden estar unidos a los marcadores moleculares para facilitar la detección tras la separación cromatográfica.

Se conocen bien métodos de detección para su uso con cromatografía de líquidos, están comercialmente disponibles y pueden adaptarse a la toma de muestras automatizada y de alto rendimiento. El método de detección seleccionado para el análisis de marcadores moleculares dependerá de si los marcadores moleculares contienen un resto o grupo detectable, del tipo de grupo detectable usado y de las propiedades fisicoquímicas del marcador molecular y el grupo detectable, si se usa. Pueden usarse métodos de detección basados en fluorescencia, conductividad electrolítica, índice de refracción y dispersión de luz evaporativa para detectar diversos tipos de marcadores moleculares.

Puede usarse una variedad de detectores ópticos para detectar un marcador molecular separado mediante cromatografía de líquidos. Se conocen bien métodos para detectar ácidos nucleicos, polipéptidos, péptidos y otras macromoléculas y moléculas pequeñas usando detectores espectroscópicos de ultravioleta (UV)/visible, haciendo la detección de UV/visible el método de detección más ampliamente usado para el análisis mediante HPLC. También pueden usarse espectrofotómetros de infrarrojo para detectar macromoléculas y moléculas pequeñas cuando se usan con una fase móvil que es un líquido polar transparente.

Los detectores de red de diodos y de longitud de onda variable representan dos tipos comercialmente disponibles de espectrofotómetros de UV/visible. Una característica útil de algunos detectores UV de longitud de onda variable es la capacidad para realizar un barrido espectroscópico y lecturas de absorbancia precisas a una variedad de longitudes de onda mientras que el pico está pasando a través de la célula de flujo. La tecnología de red de diodos proporciona la ventaja adicional de permitir mediciones de absorbancia en dos o más longitudes de onda, lo que permite el cálculo de razones de tales mediciones de absorbancia. Tal razonamiento de la absorbancia a múltiples longitudes de onda es particularmente de ayuda para determinar si un pico representa uno o más de un marcador molecular.

También pueden usarse detectores de fluorescencia para detectar marcadores moleculares fluorescentes, tales como aquéllos que contienen un grupo de detección fluorescente y aquéllos que son intrínsecamente fluorescentes. Normalmente, la sensibilidad de fluorescencia es relativamente alta, proporcionando una ventaja con respecto a otros métodos de detección espectroscópicos cuando los marcadores moleculares contienen un fluoróforo. Aunque los marcadores moleculares pueden tener fluorescencia intrínseca detectable, cuando un marcador molecular contiene un grupo de detección fluorescente adecuado, puede ser posible detectar un marcador molecular individual en una muestra.

También son útiles métodos de detección electroquímicos para detectar marcadores moleculares separados mediante HPLC. La detección electroquímica se basa en la medición de la corriente resultante de la reacción de oxidación o reducción de los marcadores moleculares en un electrodo adecuado. Puesto que el nivel de corriente es directamente proporcional a la concentración de marcador molecular, la detección electroquímica puede usarse cuantitativamente, si se desea.

La detección mediante dispersión de luz evaporativa se basa en la capacidad de las partículas para producir la dispersión de fotones cuando atraviesan la trayectoria de un haz de luz policromático. El efluente de líquido de una HPLC se nebuliza en primer lugar y la niebla de aerosol resultante, que contiene los marcadores moleculares, se dirige a través de un haz de luz. Se genera una señal que es proporcional a la cantidad del marcador molecular presente en una muestra, y es independiente de la presencia o ausencia de grupos detectables tales como cromóforos, fluoróforos o grupos electroactivos. Por tanto, no se requiere la presencia de un resto o grupo de detección en un marcador molecular para la detección mediante dispersión de luz evaporativa.

También pueden usarse métodos de espectrometría de masas para detectar marcadores moleculares separados mediante HPLC. Los espectrómetros de masas pueden resolver iones con pequeñas diferencias de masa y medir la masa de iones con un alto grado de precisión y sensibilidad. En la técnica se conocen bien métodos de espectrometría de masas (véase Burlingame et al. Anal. Chem. 70:647R-716R (1998); Kinter y Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience, Nueva York (2000)).

El análisis de los datos obtenidos usando cualquier método de detección, tal como desconvolución del espectro y análisis cuantitativo, puede ser manual o asistido por ordenador, y puede realizarse usando métodos automatizados. Puede usarse una variedad de programas informáticos para determinar la integración de los picos, la altura, el área de los picos y el tiempo de retención. Tales programas informáticos pueden usarse por comodidad para determinar la presencia de un marcador molecular cualitativa o cuantitativamente. Los expertos en la técnica conocen bien programas informáticos para su uso con HPLC y los detectores correspondientes y generalmente se proporcionan con los sistemas de HPLC y detector comercialmente disponibles.

Una variedad de sistemas comercialmente disponibles son muy adecuados para el análisis de alto rendimiento de marcadores moleculares. Los expertos en la técnica pueden determinar el equipo apropiado, tal como sistemas de preparación de muestras automatizados y sistemas de autoinyección, útiles para automatizar el análisis mediante HPLC de marcadores moleculares. Pueden usarse métodos automatizados para el análisis de alto rendimiento de marcadores moleculares, por ejemplo, cuando se está procesando un gran número de muestras o para la aplicación multiplexada de los métodos de la invención para detectar analitos diana. Un sistema de instrumentación de HPLC a modo de ejemplo para
su uso con la presente invención es el sistema de HPLC serie 1100 de Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Los expertos en la técnica conocerán mediciones de control de calidad útiles para obtener análisis fiables de los marcadores moleculares, en particular cuando el análisis se realiza en un formato de alto rendimiento. Tales mediciones de control de calidad incluyen el uso de patrones de referencia externos e internos, el análisis de la forma de los picos cromatográficos, la evaluación del rendimiento del instrumento, la validación del método experimental, por ejemplo, determinando un intervalo de linealidad, la recuperación de muestra, la estabilidad de disolución de la muestra y la precisión de la medición.

C. Separación mediante espectrometría de masas

En la técnica se conocen bien métodos de espectrometría de masas (véase Burlingame et al. Anal. Chem. 70: 647R-716R (1998); Kinter y Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience, Nueva York (2000)). Los procesos básicos asociados con un método de espectrometría de masas son la generación de iones en fase gaseosa derivados de la muestra, y la medición de su masa.

El movimiento de iones en fase gaseosa puede controlarse de manera precisa usando campos electromagnéticos generados en el espectrómetro de masas. El movimiento de iones en estos campos electromagnéticos es proporcional a la m/z del ión y esto forma la base de la medición de la m/z y por tanto la masa de una muestra. El movimiento de iones en estos campos electromagnéticos permite que los iones estén contenidos y centrados, lo que explica la alta sensibilidad de la espectrometría de masas. Durante el transcurso de la medición de m/z, se transmiten iones con una alta eficacia a detectores de partículas que registran la llegada de estos iones. La cantidad de iones a cada m/z se demuestra mediante los picos en una gráfica en la que el eje x es m/z y el eje y es la abundancia relativa. Diferentes espectrómetros de masas tienen diferentes niveles de resolución, es decir, la capacidad de resolver picos entre iones estrechamente relacionados en masa. La resolución se define como R=m/delta m, es la que m es la masa iónica y delta m es la diferencia en masa entre dos picos en un espectro de masas. Por ejemplo, un espectrómetro de masas con una resolución de 1000 puede resolver un ión con una m/z de 100,0 con respecto a un ión con una m/z de 100,1.

Se encuentran disponibles varios tipos de espectrómetros o pueden producirse con diversas configuraciones. En general, un espectrómetro de masas tiene los siguientes componentes principales: una entrada de muestra, una fuente de iones, un analizador de masas, un detector, un sistema de vacío y sistema de control del instrumento, y un sistema de datos. Las diferencias en la entrada de muestra, fuente de iones y analizador de masas definen generalmente el tipo de instrumento y sus capacidades. Por ejemplo, una entrada puede ser una fuente de cromatografía de líquidos en columna-capilar o puede ser una sonda directa o fase tal como se usa en la desorción por láser asistida por matriz. Fuentes de iones comunes son, por ejemplo, electrospray, incluyendo nanospray y microspray o desorción por láser asistida por matriz. Los analizadores de masas a modo de ejemplo incluyen un filtro de masas de cuadrupolo, analizador de masas de trampa iónica y analizador de masas de tiempo de vuelo.

El proceso de formación de iones es un punto de partida para el análisis del espectro de masas. Se encuentran disponibles varios métodos de ionización, y la elección del método de ionización depende de la muestra que va a analizarse. Por ejemplo, para el análisis de polipéptidos puede ser deseable un procedimiento de ionización relativamente suave tal como ionización por electrospray (ESI). Para ESI, se hace pasar una disolución que contiene la muestra a través de una aguja fina a potencial alto, lo que crea un fuerte campo eléctrico dando como resultado una pulverización fina de gotas altamente cargadas que se dirige hacia el espectrómetro de masas. Otros procedimientos de ionización incluyen, por ejemplo, bombardeo con átomos rápidos (FAB), que usa un haz de alta energía de átomos neutros para golpear una muestra sólida produciendo la desorción e ionización. La ionización - desorción por láser asistida por matriz (MALDI) es un método en el que se usa un pulso de láser para golpear una muestra que se ha cristalizado en una matriz de compuesto absorbente de UV. Otros procedimientos de ionización conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, descarga luminiscente y de plasma, ionización - desorción por plasma, ionización de resonancia e ionización secundaria. Un indicador de marcador puede ionizarse antes de, durante o tras la escisión de la sonda marcada.

La ionización por electrospray (ESI) tiene varias propiedades que son útiles para la invención descrita en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse ESI para moléculas biológicas tales como polipéptidos que son difíciles de ionizar o vaporizar. Además, la eficacia de ESI puede ser muy alta, lo que proporciona la base para mediciones altamente sensibles. Además, ESI produce moléculas cargadas en disolución, lo que es conveniente para analizar indicadores de marcador que están en disolución. Por el contrario, procedimientos de ionización tales como MALDI requieren la cristalización de la muestra antes de la ionización.

Puesto que ESI puede producir moléculas cargadas directamente en disolución, es compatible con muestras de sistemas de cromatografía de líquidos. Por ejemplo, un espectrómetro de masas puede tener una entrada para un sistema de cromatografía de líquidos, tal como una HPLC, de manera que las fracciones fluyen desde la columna cromatográfica hacia el espectrómetro de masas. Esta disposición en línea de un sistema de cromatografía de líquidos y espectrómetro de masas se denomina a veces CL-EM. Puede usarse un sistema de CL-EM, por ejemplo, para separar indicadores de marcador no escindidos o parcialmente escindidos de indicadores de marcador escindidos antes del análisis de espectrometría de masas. Además, puede usarse cromatografía para retirar sales u otros componentes tampón de la muestra de indicador de marcador antes del análisis de espectrometría de masas. Por ejemplo, la desalación de una muestra usando una columna de HPLC de fase inversa, en línea o fuera de línea, puede usarse para aumentar la eficacia del proceso de ionización y por tanto mejorar la sensibilidad de detección mediante espectrometría
de masas.

Se encuentra disponible una variedad de analizadores de masas que pueden emparejarse con diferentes fuentes de iones. Diferentes analizadores de masas tienen diferentes ventajas tal como conoce un experto en la técnica y tal como se describe en el presente documento. El espectrómetro de masas y los métodos seleccionados para la detección dependen del ensayo particular, por ejemplo, puede usarse un analizador de masas más sensible cuando se genera una cantidad pequeña de iones para la detección. A continuación se describen varios tipos de analizadores de masas y métodos de espectrometría de masas.

La espectrometría de masas de cuadrupolo utiliza un analizador o filtro de masas de cuadrupolo. Este tipo de analizador de masas está compuesto por cuatro varillas dispuestas como dos conjuntos de dos varillas conectadas eléctricamente. Se aplica una combinación de voltajes de rf y cc a cada pareja de varillas, lo que produce campos que provocan un movimiento oscilatorio de los iones ya que éstos se mueven desde el principio del filtro de masas hasta el final. El resultado de estos campos es la producción de un filtro de masas de paso alto en una pareja de varillas y un filtro de paso bajo en la otra pareja de varillas. La superposición entre el filtro de paso alto y el de paso bajo deja una m/z definida que puede pasar ambos filtros y atravesar la longitud de cuadrupolo. Esta m/z se selecciona y permanece estable en el filtro de masas de cuadrupolo mientras que todas las demás m/z tienen trayectorias inestables y no permanecen en el filtro de masas. Resulta un espectro de masas aumentando los campos aplicados de modo que se selecciona una m/z creciente para pasar a través del filtro de masas y alcanzar el detector. Además, los cuadrupolos pueden configurarse también para contener y transmitir iones de todas las m/z aplicando un campo sólo de rf. Esto permite que los cuadrupolos funcionen como un sistema de enfoque o lente en regiones del espectrómetro de masas en las que es necesaria la transmisión de iones sin filtración de masas. Esto será útil en espectrometría de masas en tándem tal como se describe adicionalmente a continuación.

Un analizador de masas de cuadrupolo, así como los otros analizadores de masas descritos en el presente documento, pueden programarse para analizar una m/z o intervalo de masa definidos. Esta propiedad de los espectrómetros de masas es útil para la invención descrita en el presente documento. Puesto que el intervalo de masa de indicadores de marcador escindidos se conocerá antes de un ensayo, un espectrómetro de masas puede programarse para transmitir iones del intervalo de masa correcto previsto mientras que se excluyen iones de un intervalo de masa superior o inferior. La capacidad para seleccionar un intervalo de masa puede reducir el ruido de fondo en el ensayo y por tanto aumentar la razón señal con respecto a ruido. Además, puede usarse un intervalo de masa definido para excluir el análisis de cualquier sonda marcada no escindida o parcialmente escindida, que tendrían una masa superior a la masa de las sondas marcadas totalmente escindidas (indicadores de marcador). Por tanto, el espectrómetro de masas puede efectuar una etapa de separación inherente así como la detección e identificación de los indicadores de marcador.

La espectrometría de masas de trampa iónica utiliza un analizador de masas de trampa iónica. En estos analizadores de masas, se aplican campos de manera que iones de todas las m/z están inicialmente atrapados y oscilan en el analizador de masas. Iones entran en la trampa iónica desde la fuente de iones a través de un dispositivo de enfoque tal como un sistema de lente de octapolo. El atrapamiento iónico tiene lugar en la región de atrapamiento antes de la excitación y expulsión a través de un electrodo hasta el detector. El análisis de masas se realiza aplicando secuencialmente voltajes que aumentan la amplitud de las oscilaciones de un modo que expulsa iones de m/z creciente hacia fuera de la trampa y hacia el detector. Al contrario de la espectrometría de masas de cuadrupolo, se retienen todos los iones en los campos del analizador de masas excepto aquéllos con la m/z seleccionada. Una ventaja de las trampas iónicas es que tienen una sensibilidad muy alta, siempre que se tenga cuidado de limitar el número de iones que se atrapan de una vez. El control del número de iones puede efectuarse variando el tiempo a lo largo de que los iones se inyectan en la trampa. La resolución de masas de las trampas iónicas es similar a la de los filtros de masas de cuadrupolo, aunque las trampas iónicas tienen limitaciones de m/z baja.

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo utiliza un analizador de masas de tiempo de vuelo. Para este método de análisis de m/z, en primer lugar se le proporciona a un ión una cantidad fijada de energía cinética mediante aceleración en un campo eléctrico (generado mediante alto voltaje). Tras la aceleración, el ión entra en una región sin campo o "de deriva" en la que se desplaza a una velocidad que es inversamente proporcional a su m/z. Por tanto, los iones con baja m/z se desplazan más rápidamente que los iones con alta m/z. Se mide el tiempo requerido para que los iones recorran la longitud de la región sin campo y se usa para calcular la m/z del ión.

Una consideración en este tipo de análisis de masas es que el conjunto de iones que se está estudiando se introduzca en el analizador al mismo tiempo. Por ejemplo, este tipo de análisis de masas es bastante adecuado para técnicas de ionización como MALDI, que produce iones en pulsos cortos bien definidos. Otra consideración es controlar es la propagación de la velocidad producida por iones que tienen variaciones en sus cantidades de energía cinética. El uso de tubos de vuelo más largos, reflectores iónicos o mayores voltajes de aceleración puede ayudar a minimizar los efectos de la propagación de la velocidad. Los analizadores de masas de tiempo de vuelo tienen un alto nivel de sensibilidad y un intervalo de m/z más amplio que los analizadores de masas de cuadrupolo o de trampa iónica. También pueden adquirirse datos rápidamente con este tipo de analizador de masas debido a que no es necesario el escaneo del analizador de masas.

Síntesis de reactivos de ensayo

Los reactivos usados en los métodos descritos se sintetizan usando químicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica. Las referencias siguientes proporcionan orientaciones para sintetizar los reactivos descritos: publicaciones de patente internacional WO 00/66607; WO 01/83502; WO 02/95356; WO 03/06947; y patentes estadounidenses 6.322.980 y 6.514.700. Más particularmente, la figura 5A resume una metodología para la conjugación de un marcador con un anticuerpo u otro agente de unión con un grupo amino libre, y la reacción del conjugado resultante con oxígeno en estado singlete para producir un resto de ácido sulfínico como el marcador liberado. La figura 5B resume la química de la síntesis de reactivos de marcador derivados de FAM. Las figuras 6 A-J muestran varios reactivos de marcador, de los que la mayoría utiliza 5- o 6-carboxifluoresceína (FAM) como material de partida. Los métodos para la preparación de estas moléculas de marcador son tal como sigue.

1. Preparación de Pro2, Pro4 y Pro6 a Pro13

Se usa un procedimiento de cinco etapas para la preparación de los restos de marcador derivados de carboxifluoresceína, concretamente, Pro2, Pro4, Pro6, Pro7, Pro8, Pro9, Pro10, Pro11, Pro12 y Pro13. La primera etapa implica la reacción de una 5- o 6-FAM con N-hidroxisuccinimida (NHS) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) en DMF (dimetilformamida) para dar el éster correspondiente, que se trató entonces con una variedad de diaminas proporcionando la amida deseada, el compuesto 1. El tratamiento del compuesto 1 con yodoacetato de N-succinimidilo proporcionó el derivado de yodoacetamida esperado, que no se aisló sino que se hizo reaccionar adicionalmente con ácido 3-mercaptopropiónico en presencia de trietilamina. Finalmente, se convirtió el \beta-tioácido resultante (compuesto 2), tal como se describió anteriormente, en su éster de NHS. Los diversos restos de marcador se sintetizaron partiendo de 5- o 6-FAM, y una de diversas diaminas. El regioisómero de FAM y la entidad química de "X" dentro de la diamina se indican en la tabla a continuación para cada uno de los restos de marcador sintetizados. Claramente, la diamina, X, puede tener una amplia gama de formas adicionales, tal como se describió anteriormente en la discusión del resto de modificador de la movilidad.

3

Síntesis del compuesto 1

A una disolución con agitación de 5- o 6-carboxifluoresceína (0,5 mmoles) en DMF seca (5 ml) se le añadieron N-hidroxisuccinimida (1,1 equiv.) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (1,1 equiv.). Tras aproximadamente 10 minutos, empezó a formarse un sólido blanco (diciclohexilurea). Se agitó la mezcla de reacción bajo nitrógeno a temperatura ambiente durante la noche. La CCF (cromatografía de capa fina; CH_{2}Cl_{2}-MeOH 9:1) indicó la completa desaparición del material de partida.

El sobrenadante de la mezcla anterior se añadió gota a gota a una disolución con agitación de diamina (2-5 equiv.) en DMF (10 ml). Tal como es evidente a partir de la CCF (CH_{2}Cl_{2}-MeOH-H_{2}O 40:9:1), la reacción se completó instantáneamente. Se eliminó el disolvente a presión reducida. La cromatografía ultrarrápida del residuo resultante sobre sílice en Iatrobeads proporcionó la amina deseada (compuesto 1) con un rendimiento del 58-89%. La ^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}) del compuesto 1 coincidió con la estructura asignada.

Síntesis del compuesto 2

A la amina (compuesto 1) (0,3 mmoles) se le añadieron secuencialmente DMF seca (10 ml) y yodoacetato de N-succinimidilo (1,1 equiv.). Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente hasta que se obtuvo una disolución transparente. La CCF (CH_{2}Cl_{2}-MeOH-H_{2}O 40:9:1) reveló la finalización de la reacción.

Entonces se trató la disolución de reacción anterior con trietilamina (1,2 equiv.) y ácido 3-mercaptopropiónico (3,2 equiv.). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. La eliminación del disolvente a presión reducida seguida de cromatografía ultrarrápida proporcionó el \beta-tioácido (compuesto 2) con un rendimiento del 62-91%. Se asignó la estructura del compuesto 2 basándose en su ^{1}RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}).

Síntesis de Pro2, Pro4 y Pro6 a Pro13

A una disolución con agitación del \beta-tioácido (compuesto 2) (0,05 mmoles) en DMF seca (2 ml) se le añadieron N-hidroxisuccinimida (1,5 equiv.) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (1,5 equiv.). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 24-48 h (hasta que había reaccionado todo el material de partida). Se concentró la mezcla de reacción a presión reducida y entonces se purificó mediante cromatografía ultrarrápida dando la molécula diana con un rendimiento del 41-92%.

2. Preparación de Pro1

A una disolución con agitación de 5-yodoacetamidofluoresceína (compuesto 4) (24 mg, 0,047 mmoles) en DMF seca (2 ml) se le añadieron trietilamina (8 \mul, 0,057 mmoles) y ácido 3-mercaptopropiónico (5 \mul, 0,057 mmoles). Se agitó la disolución resultante a temperatura ambiente durante 1,5 h. La CCF (CH_{2}Cl_{2}-MeOH-H_{2}O 40:9:1) indicó la finalización de la reacción. Posteriormente, se añadieron N-hidroxisuccinimida (9 mg, 0,078 mmoles) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (18 mg, 0,087 mmoles). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 19 h, tiempo en el que la CCF mostró la desaparición completa del material de partida. La eliminación del disolvente a presión reducida y la cromatografía ultrarrápida posterior usando CH_{2}Cl_{2}-MeOH 25:1 y 15:1 como eluyente proporcionaron Pro1 (23 mg, 83%).

3. Preparación de Pro3

A una disolución con agitación de 6-yodoacetamidofluoresceína (compuesto 5) (26 mg, 0,050 mmoles) en DMF seca (2 ml) se le añadieron trietilamina (8 \mul, 0,057 mmoles) y ácido 3-mercaptopropiónico (5 \mul, 0,057 mmoles). Se agitó la disolución resultante a temperatura ambiente durante 1,5 h. La CCF (CH_{2}Cl_{2}-MeOH-H_{2}O 40:9:1) indicó la finalización de la reacción. Posteriormente, se añadieron N-hidroxisuccinimida (11 mg, 0,096 mmoles) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (18 mg, 0,087 mmoles). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 19 h, tiempo en el que la CCF mostró la desaparición completa del material de partida. La eliminación del disolvente a presión reducida y la cromatografía ultrarrápida posterior usando CH_{2}Cl_{2}-MeOH 30:1 y 20:1 como eluyente proporcionaron Pro3 (18 mg, 61%).

4. Síntesis de Pro5

A una disolución con agitación de 5-(bromometil)fluoresceína (compuesto 6) (40 mg, 0,095 mmoles) en DMF seca (5 ml) se le añadieron trietilamina (15 \mul, 0,108 mmoles) y ácido 3-mercaptopropiónico (10 \mul, 0,115 mmoles). Se agitó la disolución resultante a temperatura ambiente durante 2 días. La CCF (CH_{2}Cl_{2}-MeOH-H_{2}O 40:9:1) indicó la finalización de la reacción. Se evaporó la disolución de reacción a presión reducida. Finalmente, la cromatografía ultrarrápida empleando CH_{2}Cl_{2}-MeOH 30:1 y 25:1 como eluyente proporcionó el \beta-tioácido (compuesto 7) (28 mg, 66%).

A una disolución del ácido (compuesto 7) (27 mg, 0,060 mmoles) en DMF seca (2 ml) se le añadieron N-hidroxisuccinimida (11 mg, 0,096 mmoles) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (20 mg, 0,097 mmoles). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 días, tiempo en el que la CCF (CH_{2}Cl_{2}-MeOH 9:1) mostró la desaparición completa del material de partida. La eliminación del disolvente a presión reducida y la cromatografía ultrarrápida posterior con CH_{2}Cl_{2}-MeOH 30:1 proporcionaron Pro5 (24 mg, 73%).

5. Síntesis de Pro14

A 5-aminoacetamidofluoresceína (compuesto 8) (49 mg, 0,121 mmoles) se le añadieron secuencialmente DMF seca (4 ml) y yodoacetato de N-succinimidilo (52 mg, 0,184). Resultó una disolución transparente y la CCF (CH_{2}Cl_{2}-MeOH-H_{2}O 40:9:1) indicó la desaparición completa del material de partida.

Entonces se trató la disolución de reacción anterior con trietilamina (30 \mul, 0,215 mmoles) y ácido 3-mercaptopropiónico (30 \mul, 0,344 mmoles). Se agitó la mezcla resultante durante 2 h. La eliminación del disolvente a presión reducida seguida de cromatografía ultrarrápida usando CH_{2}Cl_{2}-MeOH 20:1 y 15:1 como eluyente dio el \beta-tioácido (compuesto 9) (41 mg, 62%). La asignación estructural se realizó basándose en la ^{1}RMN (300 MHz, DMSO-d_{6}).

A una disolución con agitación del compuesto 9 (22 mg, 0,04 mmoles) en DMF seca (2 ml) se le añadieron N-hidroxisuccinimida (9 mg, 0,078 mmoles) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (16 mg, 0,078 mmoles). Se agitó la disolución resultante a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante aproximadamente 24 h. Se concentró la mezcla de reacción a presión reducida y se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida usando CH_{2}Cl_{2}-MeOH 30:1 y 20:1 como eluyente dando Pro14 (18 mg, 70%).

6. Síntesis de Pro15, Pro20, Pro22 y Pro28

Los esquemas de síntesis para la producción de ésteres de NHS de los marcadores Pro15, Pro20, Pro22 y Pro28 se muestran en las figuras 7 A-D, respectivamente. Todos los reactivos y condiciones de reacción son convencionales en la técnica y avanzaron de manera similar a las reacciones descritas anteriormente.

Conjugación de moléculas de marcador con anticuerpos

En general se emplean dos enfoques diferentes para la conjugación. El primero implica la unión directa de moléculas de marcador al anticuerpo, y el segundo enfoque implica la unión de moléculas de marcador a dextrano, que se une entonces al anticuerpo. El segundo enfoque proporciona medios para la amplificación de señal, generando un reactivo de anticuerpo marcado que contiene múltiples moléculas de marcador, que pueden liberarse todas mediante una única molécula de sensibilizador.

1. Conjugación directa de moléculas de marcador Pro1 con anticuerpos

Se sintetizan moléculas de marcador con un extremo de éster de NHS que reacciona con aminas primarias del anticuerpo para formar un enlace amida estable, dando como resultado una unión aleatoria de moléculas de marcador sobre la superficie del anticuerpo. Los marcador-anticuerpos conjugados anteriormente han demostrado que la modificación con hasta de 6 a 12 moléculas que contienen éster de NHS éster por molécula de anticuerpo normalmente no da como resultado una disminución en la actividad de unión a antígenos. Incluso mayores razones de éster de NHS con respecto a anticuerpo son posibles con sólo una ligera pérdida de actividad.

Protocolo

1.

Se diluye el anticuerpo monoclonal 9E10 de ratón purificado (que reconoce la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL, específico para c-myc, de Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) hasta 2 mg/ml en 1X PBS (fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 7,2).

2.

Se disuelven moléculas de Pro1 que contienen éster de NHS en DMF (dimetilformamida) hasta una concentración final de entre 10 y 20 nmoles/\mul de DMF.

3.

Se mezclan 500 \mul de anticuerpo 9E10 diluido (6,5 nmoles) o bien con 1, 5, 25, o bien con 50 \mul de reactivo de marcador Pro1 (14, 68, 340 y 680 nmoles respectivamente). (Véase la figura 6A.)

4.

Se deja reaccionar la disolución durante 2 horas sobre hielo en la oscuridad.

5.

Se purifica el anticuerpo anti-c-myc de ratón conjugado con Pro1 mediante diálisis frente a 0,1X PBS (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 15 mM, pH 7,2) durante 20 horas a 4ºC.

2. Conjugación de Pro1-dextrano con anticuerpos

En este segundo método, en primer lugar se unen moléculas de marcador a dextrano que contiene amina por medio de un enlace amida esencialmente tal como se describió anteriormente. Los anticuerpos policlonales y algunos monoclonales contienen hidratos de carbono en la parte de Fc del anticuerpo. Estos polisacáridos pueden oxidarse con peryodato para formar restos de aldehído reactivos. Entonces se conjuga el marcador que contiene aminodextrano con los restos de aldehído de los anticuerpos oxidados a través de la formación de una base de Schiff. Este enlace se estabiliza adicionalmente mediante reducción a un enlace amina secundaria con cianoborohidruro de sodio.

El tamaño extremadamente grande del aminodextrano (peso molecular de 500.000), que contiene de 50 a 500 grupos amino disponibles para su conjugación con moléculas de marcador, permite un aumento significativo en el número de marcadores unidos a un anticuerpo, proporcionando amplificación de señal. Puesto que el dextrano se acopla a través de un hidrato de carbono en la parte de Fc del anticuerpo, se elimina suficientemente del sitio de unión a antígeno de modo que no comprenderá actividad de unión.

Protocolo para la conjugación de moléculas de marcador Pro1 con aminodextrano

1.

Se disuelve amino-dextrano (500.000 pm con 500 aminas/mol de dextrano) en DMF al 90% hasta una concentración final de 2 mg/ml (2 nmoles de amina/\mul).

2.

Se disuelven moléculas de marcador que contienen éster de NHS en DMF (dimetilformamida) hasta una concentración final de entre 10 y 20 nmoles/\mul de DMF.

3.

Se mezclan 500 \mul de amino-dextrano (1000 nmoles de amina) o bien con 500, 1000 o bien con 2000 nmoles de reactivo de marcador Pro1.

4.

Se deja reaccionar la disolución durante 2 horas sobre hielo en la oscuridad.

5.

Se purifica el amino-dextrano conjugado con marcador mediante diálisis frente a 0,1X PBS (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 15 mM, pH 7,2) durante 20 horas a 4ºC.

6.

Se retira el precipitado mediante centrifugación a 14.000 x g durante 5 minutos.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo para la oxidación de anticuerpos con peryodato de sodio

1.

Se oxidan 500 \mul (2,8 nmoles) de anticuerpo monoclonal 9E10 de ratón purificado (que reconoce la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL, específico para c-myc, de Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) en presencia de peryodato de sodio 10 mM (Aldrich).

2.

Se deja reaccionar la disolución durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

3.

Se añade etilenglicol hasta una concentración final de 100 mM y se deja incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

4.

Entonces se purifica el anticuerpo oxidado mediante diálisis frente a 0,1X PBS (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 15 mM, pH 7,2) durante 2 horas a 4ºC.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo para la conjugación de anticuerpo oxidado con peryodato con aminodextrano conjugado con Pro1

1.

Se mezclan 54 \mul (300 pmoles) de anticuerpo monoclonal 9E10 de ratón oxidado con 300 pmoles de aminodextrano conjugado con Pro1 en presencia de carbonato de sodio 200 mM, pH 9,5.

2.

Se deja reaccionar la disolución durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.

3.

Se añade cianoborohidruro de sodio (recién preparado en NaOH 1 N) hasta una concentración final de 50 mM y se deja reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

4.

Se bloquean los aldehídos que no han reaccionado mediante la adición de etanolamina 50 mM, pH 9,6 y se deja reaccionar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

5.

Entonces se purifica el anticuerpo anti-c-myc de ratón conjugado con Pro1 mediante diálisis frente a 0,1X PBS (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 15 mM, pH 7,2) durante 20 horas a 4ºC.

Conjugación de moléculas de fotosensibilizador con agentes de unión

Pueden conjugarse moléculas de sensibilizador con un anticuerpo mediante diversos métodos y configuraciones. Por ejemplo, un sensibilizador activado, tal como por ejemplo, azul de metileno o ftalocianina, activado con por ejemplo, éster de NHS, aldehído o cloruro de sulfonilo, puede hacerse reaccionar con los grupos amino en anticuerpos. Estos conjugados pueden usarse entonces directamente en diversos ensayos. También, pueden acoplarse múltiples moléculas de sensibilizador activadas con un anticuerpo, por ejemplo usando un conjugado de aminodextrano-sensibilizador que contiene 20-200 sensibilizadores y 200-500 grupos amino, acoplados con moléculas de anticuerpo oxidadas con peryodato, generando un conjugado de anticuerpo-dextrano-sensibilizador. Los protocolos para generar estos reactivos son tal como se describió anteriormente para los reactivos de marcador-anticuerpo.

Para el presente ejemplo, los conjugados de sensibilizador se generarán usando anticuerpo monoclonal 12CA5 de ratón purificado, que reconoce la secuencia de aminoácidos YPYDVPDYA, específico para hemaglutinina, de Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, acoplado con azul de metileno activado con éster de NHS, para generar anticuerpo anti-HA de ratón conjugado con azul de metileno.

Fuentes de materiales usados en los ejemplos

4

100

\vskip1.000000\baselineskip

Líneas celulares: Todas las líneas celulares se adquirieron de ATCC

Tejidos humanos: Todas las muestras de tejido humanas congeladas rápidamente se adquirieron o bien de William Bainbridge Genome Foundation (Seattle, WA) o bien de Bio Research Support (Boca Raton, FL) y se aprobaron por la Junta de Investigación Institucional (Institutional Research Board (IRB) en el proveedor.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Ensayo para la monitorización de la hetero-oligomerización de GABA_{B}R1/GABA_{B}R2

El receptor del ácido \gamma-aminobutírico_{B} (GABA)_{B}, un receptor acoplado a proteína G (GPCR), media la estimulación de la actividad de GTPasa de alta afinidad en membranas cerebrales mediante GABA para regular los canales de calcio y potasio. Se ha mostrado que la forma activa de este receptor, ubicada en la superficie celular, es un hetero-oligómero que comprende los dos receptores GABA_{B}R1 y GABA_{B}R2, que son ambos GPCR de clase III y comparten el 35% de identidad de secuencia (Jones, et al., 1998, Kaupmann, et al., 1998, White, et al., 1998, Milligan, 2001).

La hetero-oligomerización del receptor GABA_{B} puede monitorizarse usando los métodos de la presente invención. En primer lugar, se generan los receptores GABA_{B}R1 y GABA_{B}R2 marcados con epítopo y se transfectan en células HEK293T tal como se describe por White, et al. (1998).

Protocolo para la transfección de células HEK293T con secuencia codificante de GABA_{B}R1 y GABA_{B}R2

1.

Se fusiona en marco el ADNc que codifica para un epítopo de Myc (usado con el anticuerpo monoclonal 9E10) al extremo 5' del ADNc que codifica para GABA_{B}R1, y se elimina la secuencia señal nativa y se sustituye por la de CD33.

2.

Se fusiona en marco el ADNc que codifica para el epítopo de HA (usado con el anticuerpo monoclonal 12CA5) al extremo 5' del ADNc que codifica para GABA_{B}R2, y se elimina la secuencia señal nativa y se sustituye por la de T8.

3.

Se mantienen las células HEK293T en medio DMEM que contiene suero de ternero fetal al 10% y glutamina 2 mM. Se hacen crecer las células hasta el 60-80% de confluencia en placas de 60 mm, y se transfectan con 1,5 \mug de cada quimera de ADNc de GABA_{B} usando 10 \mul de reactivo lipofectamina (Life Technologies). Se recogen las células 48-72 horas tras la transfección.

\newpage

Protocolo para la monitorización de la oligomerización

1.

Se combinan células HEK293T transfectadas con GABA_{B}R1 y GABA_{B}R2 (10^{5} células) en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, con 5-20 nM de cada uno de anticuerpo anti-c-myc de ratón conjugado con Pro1 y anticuerpo anti-HA de ratón conjugado con azul de metileno en la oscuridad. Se generan tres muestras control que omiten una de las células, el anticuerpo anti-c-myc o el anticuerpo anti-HA.

2.

Se incuba la mezcla durante 30 min. a 37ºC en la oscuridad, para permitir la unión.

3.

Se elimina el anticuerpo no unido mediante centrifugación de la muestra y eliminación del sobrenadante, seguido de resuspensión de las células en el sedimento con un cambio de tampón que comprende Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, y patrón ROX T8 (de PE Biosystems), diluido 1:2000 en el tampón.

4.

Entonces se irradia la muestra durante 5 minutos a 680 nm usando un diodo emisor de luz para activar el sensibilizador para la escisión.

5.

Se centrifuga de nuevo la muestra y se recoge el sobrenadante, que contiene cualquier molécula de marcador liberada durante el ensayo.

6.

Se separan los marcadores liberados mediante electroforesis capilar o bien en un aparato de electroforesis capilar ABI3100 o bien en un dispositivo LabCard^{TM} de plástico de ACLARA (ACLARA BioSciences, Inc. Mountain View, CA). Las condiciones de separación de los marcadores liberados en un ABI3100 son las siguientes: capilar de 50 \mum, 47 cm de longitud y 36 cm de extremo a detección; tampón de separación, POP-4; 80 s de inyección a 3,0 kV; voltaje de separación, 15 kV.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Análisis de lisados celulares para determinar la heterodimerización de Her-2 y la fosforilación de receptor

En este ejemplo, se midieron los estados de fosforilación y los heterodímeros Her1-Her2 y Her2-Her3 en lisados celulares de diversas líneas celulares tras el tratamiento con diversas concentraciones de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y heregulina (HRG). Se realizan las mediciones usando tres compuestos de unión y una sonda de escisión tal como se describe a continuación.

Preparación de muestras:

1.

Cultivar línea celular de cáncer de mama privada de suero durante la noche antes de su uso.

2.

Estimular las líneas celulares con EGF y/o HRG en medios de cultivo durante 10 minutos a 37ºC. Dosis a modo de ejemplo de EGF/HRG son 0, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20, 100 nM para todas las líneas celulares (por ejemplo MCF-7, T47D, SKBR-3) excepto BT20 para la cual se aumentó la dosis máxima hasta 500 nM debido a que no se logra saturación con EGF 100 nM.

3.

Aspirar los medios de cultivo, transferir sobre hielo, y añadir tampón de lisis para lisar las células in situ.

4.

Raspar y transferir el lisado al tubo de microcentrífuga. Incubar sobre hielo durante 30 min. Microcentrifugar a 14.000 rpm, 4ºC, durante 10 min. (La centrifugación es opcional.)

5.

Recoger los sobrenadantes como lisados y dividir en alícuotas para su almacenamiento a -80ºC hasta su uso.

Ensayo:

Diseño del ensayo: Tal como se ilustra mediante diagrama en la figura 9A, se cuantifican los heterodímeros Her2-Her3 (900) con respecto a su razón basándose en la unión de la de sonda de escisión (902) y compuestos de unión (904), (906) y (908). Un fotosensibilizador indicado por "PS" se une a la sonda de escisión (902) por medio de un enlace de avidina-biotina, y se marcan los compuestos de unión (904), (906) y (908) con marcadores moleculares Pro14, Pro10 y Pro11, respectivamente. El compuesto de unión (904) es específico para un sitio de fosforilación en Her3.

El volumen de ensayo total es 40 \mul. Se ajusta el volumen de lisado a 30 \mul con tampón de lisis. Se diluyen los anticuerpos en tampón de lisis hasta 10 \mul. Normalmente se usan de \sim5000 a 15000 equivalentes celulares de lisados por reacción. El límite de detección es de \sim1000 equivalentes celulares de lisados.

\newpage

Procedimiento: concentraciones finales de compuestos de unión mezclados previamente (es decir, conjugados de marcador molecular- o biotina-anticuerpo) en la reacción:

Pro4_anti-Her-2: 0,1 \mug/ml

Pro10_Ac11 anti-Her-1: 0,05-0,1 \mug/ml

Pro11_anticuerpo anti-Her-3: 0,1 \mug/ml

Pro2_PT100 anticuerpo anti-fosfo-Tyr: 0,1 \mug/ml

Biotina_anticuerpo anti-Her-2: 1-2 \mug/ml

\vskip1.000000\baselineskip

1.

Para someter a ensayo una placa de 96 pocillos, añadir 10 \mul de mezcla de anticuerpos a 30 \mul de lisado e incubar durante 1 hora a TA.

2.

Añadir 2 \mul de sonda de escisión derivatizada con estreptavidina (2 \mug/pocillo final) para someter a ensayo el pocillo e incubar durante 45 min.

3.

Añadir 150 \mul de PBS con BSA al 1% a una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore MAGVN2250) e incubar durante 1 h a TA para bloqueo.

4.

Vaciar la placa de filtro mediante succión a vacío. Transferir las reacciones de ensayo a la placa de filtro y aplicar vacío para vaciar.

5.

Añadir 200 \mul de tampón de lavado y aplicar vacío para vaciar. Repetir una vez.

6.

Añadir 200 \mul de tampón de iluminación y aplicar vacío para vaciar. Repetir una vez.

7.

Añadir 30 \mul de tampón de iluminación e iluminar durante 20 min.

8.

Transferir 10 \mul de cada reacción a una placa de ensayo con CE para análisis usando un instrumento ABI3100 CE con un capilar de 22 cm (condiciones de inyección: 5 kV, 75 s, 30ºC; condiciones de ejecución: 600 s, 30ºC).

Los tampones de ensayo son tal como sigue:

Tampón de lisis (recién preparado y almacenado sobre hielo)

5

Tampón de lavado (almacenado a 4ºC)

7

Tampón de iluminación

8

Análisis de los datos:

1.

Normalizar la señal de las unidades de fluorescencia relativa (UFR) de cada marcador molecular frente a patrón de referencia CE A315.

2.

Restar las UFR de control de fondo "no lisado" de las señales de marcador molecular correspondiente.

3.

Indicar la heterodimerización para Her-1 o Her-3 como la correspondiente UFR con respecto a la razón con respecto a UFR de Pro4_anti-Her-2 de los pocillos de ensayo usando biotina-anticuerpo anti-Her-2.

4.

Indicar la fosforilación de receptor para Her-1,2,3 como UFR de Pro2_PT100 anticuerpo anti-fosfo-Tyr con respecto a la razón con respecto a UFR de Pro4_anticuerpo anti-Her-2 de los pocillos de ensayo usando biotina-anticuerpo anti-Her-2.

\vskip1.000000\baselineskip

Se ilustran los resultados de los ensayos en las figuras 9B-9H. La figura 9B muestra que la cantidad de heterodímeros Her1-Her2 aumenta en las células MCF-7 con el aumento de las concentraciones de EGF, mientras que la cantidad del mismo dímero no muestra ningún cambio esencialmente con el aumento de las concentraciones de HRG. La figura 9C muestra el resultado opuesto para heterodímeros Her2-Her3. Es decir, la cantidad de heterodímeros Her2-Her3 aumenta en las células MCF-7 con el aumento de las concentraciones de HRG, mientras que la cantidad del mismo dímero no muestra ningún cambio esencialmente con el aumento de las concentraciones de EGF. Las figuras 9D y 9E muestran que la cantidad de heterodímeros Her1-Her2 aumenta en las células SKPR-3 y células BT-20, respectivamente, con el aumento de las concentraciones de EGF.

\global\parskip0.990000\baselineskip

Ejemplo 3 Análisis de lisados de tejido para determinar la heterodimerización de Her2 y la fosforilación de receptor

En este ejemplo, se miden los estados de fosforilación y los heterodímeros Her1-Her2 y Her2-Her3 en lisados de tejido de muestras de cáncer de mama humanas.

Preparación de muestras:

1.

Se rompen mecánicamente tejidos congelados rápidamente en el estado congelado mediante corte.

2.

Transferir los tejidos a un tubo de microcentrífuga y añadir 3x volúmenes de tejido de tampón de lisis (del apéndice I) seguido de agitación con vórtex para dispersar los tejidos en el tampón.

3.

Incubar sobre hielo durante 30 min. con agitación con vórtex intermitente para mezclar.

4.

Centrifugar a 14.000 rpm, 4ºC, durante 20 min.

5.

Recoger los sobrenadantes como lisados y determinar la concentración de proteína total con ensayo de BCA (Pierce) usando una alícuota pequeña.

6.

Dividir en alícuotas el resto para su almacenamiento a -80ºC hasta su uso.

\vskip1.000000\baselineskip

Diseño del ensayo:

1.

El volumen de ensayo total es 40 \mul.

2.

Se someten a prueba los lisados en series de titulación en serie de 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,63, 0,31 \mug de equivalentes totales y se ajusta el volumen a 30 \mul con tampón de lisis. Los datos de las series de titulación confirman la especificidad de las señales de fosforilación o dimerización.

3.

Se usa una mezcla de anticuerpos universal que comprende todos los marcador e-anticuerpos diluidos en tampón de lisis en las siguientes concentraciones.

4.

Se añade biotina-anticuerpo individual para cada receptor por separado a las reacciones.

5.

Se realizan tres ensayos de marcador e con cada lisado de tejido, usando cada uno un biotina-anticuerpo diferente correspondiente a la dimerización de receptor específica que va a medirse.

6.

Se determina el nivel de expresión de cada receptor a partir de ensayo diferente que contiene el biotina-anticuerpo específico para el receptor.

7.

Se determinan las señales de fosforilación y dimerización con respecto a la razón solamente en el ensayo que contiene el biotina-anticuerpo anti-Her-2.

\vskip1.000000\baselineskip

Controles de ensayo: se usan las líneas celulares MCF-10A y MCF-7 como controles negativo y positivo cualitativos, respectivamente. Las líneas celulares o bien no se estimulan o bien se estimulan con EGF 100 nM o HRG 100 nM. Se incluye tampón de lisis como control de fondo cuando se sustituyen las muestras de tejido.

Concentraciones finales de los anticuerpos mezclados previamente en las reacciones:

Mezcla de anticuerpos universal:

Pro4_anticuerpo anti-Her-2: 0,1 \mug/ml

Pro10_anticuerpo anti-Her-1: 0,05 \mug/ml

Pro11_anticuerpo anti-Her-3: 0,1 \mug/ml

Pro2_anticuerpo anti-fosfo-Tyr: 0,01 \mug/ml

\vskip1.000000\baselineskip

Biotina-anticuerpo individual:

Biotina_anticuerpo anti-Her-1: 2 \mug/ml

Biotina_ anticuerpo anti-Her-2: 2 \mug/ml

Biotina_ anticuerpo anti-Her-3: 2 \mug/ml

\global\parskip1.000000\baselineskip

\newpage

\global\parskip0.900000\baselineskip

Procedimiento:

1.

Preparar la mezcla de reacción de anticuerpos añadiendo biotina-anticuerpo a la mezcla de anticuerpos universal.

2.

Para someter a ensayo en una placa de 96 pocillos, añadir 10 \mul de mezcla de reacción universal a 30 \mul de lisado e incubar durante 1 hora a TA.

3.

Añadir 2 \mul de sonda de escisión derivatizada con estreptavidina (2 \mug/pocillo final) para someter a ensayo el pocillo e incubar durante 45 min.

4.

Añadir 150 \mul de PBS con BSA al 1% a una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore MAGVN2250) e incubar durante 1 h a TA para bloqueo.

5.

Vaciar la placa de filtro mediante succión a vacío. Transferir las reacciones de ensayo a la placa de filtro y aplicar vacío para vaciar.

6.

Añadir 200 \mul de tampón de lavado y aplicar vacío para vaciar. Repetir una vez.

7.

Añadir 200 \mul de tampón de iluminación y aplicar vacío para vaciar. Repetir una vez.

8.

Añadir 30 \mul de tampón de iluminación e iluminar durante 20 min.

9.

Transferir 10 \mul de cada reacción a una placa de ensayo con CE para análisis usando instrumento de electroforesis capilar ABI3100 con un capilar de 22 cm (condiciones de inyección: 5 kV, 75 s, 30ºC; condiciones de ejecución: 600 s, 30ºC)

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis de los datos:

1.

Normalizar la señal de UFR de cada marcador molecular frente al patrón de referencia CE A315.

2.

Determinar los valores límites de UFR (cada uno para dimerización o fosforilación) por debajo de los cuales no se calculan las razones debido a que las señales son demasiado bajas ser fiables. Por debajo de los valores límites, las señales de UFR no se pueden titular en las series de dilución de lisado sometidas a prueba. Pueden determinarse los valores con un gran conjunto de tejidos normales en los que se espera que las señales de fosforilación y dimerización estén ausentes o sean mínimas. Estos valores también representan el nivel basal de dimerización o fosforilación en los tejidos normales con los que se compararán los tejidos tumorales.

3.

Para la minoría de los tejidos normales, si están presentes, con valores de UFR por encima del límite, determinar el nivel de UFR individual y las lecturas con respecto a la razón de picos de fosforilación o heterodimerización de Her-1 o Her-3 detectados. Estas muestras representan valores extremos que deben usarse como controles de donante emparejados para las correspondientes muestras de tejido tumorales mientras se puntúa.

4.

Para todas las muestras tumorales que muestran señales de UFR que pueden titularse, usar la señal más baja de cada de Her-1, Her-2, Her-3, o fosforilación de cada serie de titulación de lisado de tejido como el fondo. Restar este fondo de las señales de marcador molecular de los lisados de dosis alta (por ejemplo 40 \mug) para proporcionar señales de UFR específicas. Si no existe ninguna respuesta de dosis de señal en las series de titulación, todas las señales (que son habitualmente muy bajas) se consideran fondo y pueden usarse señales no específicas para el análisis con respecto a la razón.

5.

Indicar la heterodimerización para Her-1 o Her-3 como la correspondiente UFR específica con respecto a la razón con respecto a la UFR específica de Pro4_anticuerpo anti-Her-2. Si no se obtiene UFR específica, la dimerización es negativa.

6.

Indicar la fosforilación de receptor para Her-1,2,3 como UFR específica de Pro2_anticuerpo anti-fosfo-Tyr con respecto a la razón con respecto a la UFR específica de Pro4_anticuerpo anti-Her-2. Si no se obtiene UFR específica, la fosforilación es negativa.

\vskip1.000000\baselineskip

En las figuras 10A-10C, los datos mostrados son representativos de muestras de tejido de mama de múltiples pacientes sometidas a prueba con ensayos de la invención. El estado clínico de Her-2 a partir de inmunohistoquímica (DAKO Herceptest) de 9 de cada 10 muestras tumorales fue negativa, indicativo de o bien tinción de Her-2 no detectable, o bien tinción de menos del 10% de las células tumorales, o una tinción apenas visible y apenas perceptible en una parte de la membrana celular de más del 10% de las células tumorales. Los ensayos de la invención determinaron la expresión de Her-1, Her-2 y Her-3 tanto en tejidos normales como tumorales. Se detectó la heterodimerización de Her1 y Her2 y de Her2 y Her3 solamente en tejidos tumorales pero no en ningún tejido normal.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Análisis de lisados celulares para determinar la homodimerización de Her1 o Her2 y fosforilación de receptor

Se llevó a cabo la preparación de muestras esencialmente tal como se describe en el ejemplo 2. Se indujo la homodimerización de Her1 tratando las líneas celulares con EGF o TGF\alpha. Para la homodimerización de Her2 que no tiene un ligando, se comparan células SKBR-3 o MDA-MD-453 no estimuladas que sobrexpresan Her2 con células MCF-7 no estimuladas que expresan un bajo nivel de Her2.

Diseño del ensayo: Un anticuerpo monoclonal específico para el receptor se conjuga por separado o bien con un marcador molecular o bien con biotina (que entonces se liga con un fotosensibilizador por medio de un puente de avidina), de manera que la sonda de escisión y un compuesto de unión compiten para unirse al mismo epítopo en este ejemplo. Se usa otro compuesto de unión que consiste en un segundo anticuerpo que reconoce un epítopo solapante en el receptor, de manera que puede generarse una señal con respecto a la razón como una medida de homodimerización. La señal derivada del segundo anticuerpo también proporciona una medida de la cantidad total de receptor en una muestra. Se determina la cantidad total de receptor en un pocillo de ensayo separado. Puede cuantificarse la fosforilación de receptor junto con o bien la homodimerización o bien la cantidad total de receptor.

Procedimiento: El volumen ensayo es 40 \mul y el procedimiento general es similar al del ejemplo 2. Se establecieron dos pocillos de ensayo, A y B, para cada muestra para cuantificar la homodimerización y la cantidad total de receptor por separado.

Para la cuantificación de homodímeros Her1-Her1:

Concentraciones finales en la mezcla de anticuerpos en el pocillo de ensayo A:

Pro12_anticuerpo anti-Her-1: 0,05-0,1 \mug/ml

Biotina_anticuerpo anti-Her-1: 1-2 \mug/ml

\vskip1.000000\baselineskip

Concentraciones finales en la mezcla de anticuerpos en el pocillo de ensayo B:

Pro10_anticuerpo anti-Her-1: 0,05-0,1 \mug/ml

Pro2_anticuerpo anti-fosfo-Tyr: 0,1 \mug/ml

Biotina_anticuerpo anti-Her-1: 1-2 \mug/ml

\vskip1.000000\baselineskip

Para la cuantificación de homodímeros Her2-Her2:

Concentraciones finales en la mezcla de anticuerpos en el pocillo de ensayo A:

Pro4_anticuerpo anti-Her-1: 0,05-0,1 \mug/ml

Biotina_anticuerpo anti-Her-1: 1-2 \mug/ml

\vskip1.000000\baselineskip

Concentraciones finales en la mezcla de anticuerpos en el pocillo de ensayo B:

Pro4_anticuerpo anti-Her-1: 0,05-0,1 \mug/ml

Pro2_anticuerpo anti-fosfo-Tyr: 0,1 \mug/ml

Biotina_anticuerpo anti-Her-1: 1-2 \mug/ml

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis de los datos:

1.

Normalizar la señal de UFR de cada marcador molecular frente a patrón de referencia CE A315.

2.

Restar las UFR de control de fondo "no lisado" de las señales de marcador molecular correspondiente.

3.

Indicar la homodimerización para Her-1 o Her-2 como la correspondiente UFR normalizada del pocillo de ensayo A como con respecto a la razón con respecto a UFR normalizada de la cantidad total de receptor del pocillo de ensayo correspondiente B.

4.

Indicar la fosforilación de receptor para homodímero Her-1 o Her-2 como la UFR normalizada de Pro2_PT100 anticuerpo anti-fosfo-Tyr del pocillo de ensayo B como con respecto a la razón con respecto a UFR normalizada de la cantidad total de receptor del mismo pocillo de ensayo B.

\vskip1.000000\baselineskip

Se ilustran los resultados de los ensayos en las figuras 11A-11B y la figura 12. La figura 11A muestra que la cantidad de homodímeros Her1-Her1 en las células BT-20 aumenta con el aumento de la concentración de EGF. La figura 11B muestra que la cantidad de fosforilación de Her1 en células BT-20 aumenta con el aumento de la concentración de EGF. Se demostró la detección de homodímeros Her2-Her2 mediante comparación de señales de células SKBR-3 que expresaban Her2 con señales de células MCF-7 que expresaban un nivel reducido de Her2 en la superficie celular. Tal como se muestra en los gráficos de la figura 12, no se detectaron señales de homodímero Her2-Her2 que se podían titular específicas con células MCF-7 mientras que las señales de homodímero Her2-Her2 de células SKBR-3 estaban claramente por encima de las señales de las células MCF-7.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Análisis de lisados celulares para determinar la heterodimerización de Her1-Her3 y la fosforilación de receptor

Se preparan las muestras tal como sigue:

1.

Cultivar la línea celular de cáncer de mama privada de suero durante la noche antes de su uso.

2.

Estimular las líneas celulares con HRG en medios de cultivo durante 10 minutos a 37ºC. Dosis a modo de ejemplo de HRG son 0, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20, 100 nM para T47D.

3.

Aspirar los medios de cultivo, transferir sobre hielo, y añadir tampón de lisis para lisar las células in situ.

4.

Raspar y transferir el lisado al tubo de microcentrífuga. Incubar sobre hielo durante 30 min. Microcentrifugar a 14.000 rpm, 4ºC, durante 10 min. (La centrifugación es opcional.)

5.

Recoger los sobrenadantes como lisados y dividir en alícuotas para su almacenamiento a -80ºC hasta su uso.

\vskip1.000000\baselineskip

Diseño del ensayo: El volumen de ensayo total es 40 \mul. Se ajusta el volumen de lisado a 30 \mul con tampón de lisis. Se diluyen los anticuerpos en tampón de lisis hasta 5 \mul. Normalmente se usan de \sim5000 a 50000 equivalentes celulares de lisados por reacción. Concentraciones finales de anticuerpos mezclados previamente en la reacción:

Pro10_Ac11 anticuerpo anti-Her-1: 0,05-0,1 \mug/ml

Pro11_anticuerpo anti-Her-3: 0,1 \mug/ml

Pro2_PT100 anticuerpo anti-fosfo-Tyr: 0,1 \mug/ml

Biotina_anticuerpo anti-Her-3: 1-2 \mug/ml

\vskip1.000000\baselineskip

1.

Para someter a ensayo en placa de 96 pocillos, añadir 5 \mul de mezcla de anticuerpos a 30 \mul de lisado e incubar durante 1 hora a TA.

2.

Añadir 5 \mul de cortador molecular derivatizado con estreptavidina (final 4 \mug/pocillo) para someter a ensayo un pocillo e incubar durante 45 min.

3.

Añadir 150 \mul de PBS con BSA al 1% a una placa de filtro con 96 pocillos (Millipore MAGVN2250) e incubar durante 1 h a TA para bloqueo.

4.

Vaciar la placa de filtro mediante succión a vacío. Transferir las reacciones de ensayo a la placa de filtro y aplicar vacío para vaciar.

5.

Añadir 200 \mul de tampón de lavado y aplicar vacío para vaciar. Repetir una vez.

6.

Añadir 200 \mul de tampón de iluminación y aplicar vacío para vaciar. Repetir una vez.

7.

Añadir 30 \mul de tampón de iluminación e iluminar durante 20 min.

\newpage

8.

Transferir 10 \mul de cada reacción a placa de ensayo con CE para análisis usando instrumento de electroforesis capilar ABI3100 con un capilar de 22 cm (condiciones de inyección: 5 kV, 425 s, 30ºC; condiciones de ejecución: 600 s, 30ºC).

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis de los datos:

1.

Normalizar la señal UFR de cada indicador de marcador e frente al patrón de referencia CE A315.

2.

Restar las UFR de control de fondo "sin lisado" de las señales de indicador de marcador e correspondientes.

3.

Indicar la heterodimerización como las UFR de Pro10 derivada de Her-1 con respecto a la razón con respecto a UFR de Pro1 de anticuerpo anti-Her-3.

4.

Indicar la fosforilación de receptor para Her-1/3 como la UFR de Pro2_PT100 anticuerpo anti-fosfo-Tyr con respecto a la razón con respecto a UFR de Pro11_anticuerpo anti-Her-3 de los pocillos de ensayo usando biotina-anticuerpo anti-Her-3.

\vskip1.000000\baselineskip

Los resultados del ensayo se ilustran en las figuras 13A y 13B. Los datos muestran que tanto la heterodimerización de Her1-Her3 como la fosforilación de dímero aumentan con el aumento de las concentraciones de HRG.

Claims (16)

1. Método de detección de dímeros de analitos asociados a membrana en una membrana celular, comprendiendo el método las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión específico para un primer analito asociado a membrana de un dímero, comprendiendo el dímero el primer analito asociado a membrana y un segundo analito unido a membrana, y teniendo el compuesto de unión uno o más marcadores moleculares cada uno unido al mismo mediante un enlace escindible, teniendo cada uno del uno o más marcadores moleculares una característica de separación;

proporcionar una sonda de escisión específica para el segundo analito unido a membrana, teniendo la sonda de escisión un resto que induce la escisión con una proximidad eficaz;

mezclar la sonda de escisión, el compuesto de unión y la membrana celular de modo que la sonda de escisión se une específicamente al primer analito asociado a membrana y el compuesto de unión se une específicamente al segundo analito asociado a membrana y de modo que los enlaces escindibles del compuesto de unión están dentro de la proximidad eficaz del resto que induce la escisión de manera que se liberan los marcadores moleculares; y

separar e identificar los marcadores moleculares liberados para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de dímero en la membrana celular, en el que dicho primer analito asociado a membrana y dicho segundo analito asociado a membrana son cada uno receptores del factor de crecimiento epidérmico en dicha membrana celular.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha característica de separación de dicho uno o más marcadores moleculares es la movilidad electroforética.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha etapa de separación y detección incluye además separar electroforéticamente dichos marcadores moleculares liberados en un tampón de separación.

4. Método según la reivindicación 2, en el que dicho resto que induce la escisión de dicha sonda de escisión es un fotosensibilizador y en el que dicha sonda de escisión y dicho compuesto de unión comprenden cada uno una composición de unión a anticuerpo.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichos receptores de superficie celular se seleccionan del grupo que consiste en Her1, Her2, Her3 y Her4.

6. Método de detección de un dímero que comprende un primer tipo de receptor y un segundo tipo de receptor en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de

proporcionar uno o más compuestos de unión específicos para diferentes determinantes antigénicos del dímero, teniendo cada compuesto de unión uno o más marcadores moleculares cada uno unido al mismo mediante un enlace escindible, y teniendo los marcadores moleculares de diferentes compuestos de unión, diferente característica de separación de modo que se forman picos diferenciados en un perfil de separación tras la separación;

proporcionar una sonda de escisión que tiene un resto que induce la escisión con una proximidad eficaz, siendo la sonda de escisión específica para un determinante antigénico del dímero diferente de los determinantes antigénicos para el uno o más compuestos de unión, con la condición de que al menos uno de dichos determinantes antigénicos está en el primer tipo de receptor y al menos uno de dichos determinantes antigénicos está en el segundo tipo de receptor;

formar una mezcla de ensayo que comprende la sonda de escisión, el uno o más compuestos de unión y la muestra biológica de modo que la sonda de escisión y el uno o más compuestos de unión se unen específicamente a sus respectivos determinantes antigénicos y los enlaces escindibles del uno o más compuestos de unión están dentro de la proximidad eficaz del resto que induce la escisión de manera que se liberan los marcadores moleculares; y

separar e identificar los marcadores moleculares liberados para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de dímero en la muestra biológica, en el que dicho primer tipo de receptor y dicho segundo tipo de receptor son receptores del factor de crecimiento epidérmico.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha característica de separación es la movilidad electroforética y dicha etapa de separación e identificación incluye separar electroforéticamente dichos marcadores moleculares liberados para formar picos diferenciados en un electroferograma.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha etapa de formación incluye las etapas de incubar dicha sonda de escisión, dicho uno o más compuestos de unión y dicha muestra biológica en un tampón de unión, e intercambiar el tampón de unión por un tampón de separación antes de dicha separación de dichos marcadores moleculares liberados.

\newpage

9. Método según la reivindicación 7, en el que dicho resto que induce la escisión es un sensibilizador y en el que dicha etapa de formación incluye inducir dicho sensibilizador para generar una especie activa que escinde dichos enlaces escindibles dentro de dicha proximidad eficaz del mismo.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicho sensibilizador es un fotosensibilizador y en el que dicha especie activa es oxígeno en estado singlete.

11. Método según la reivindicación 7, en el que dicha sonda de escisión y dicho uno o más compuestos de unión comprenden cada uno una composición de unión a anticuerpo.

12. Método según la reivindicación 7, en el que al menos uno de dichos determinantes antigénicos es un sitio de fosforilación de dicho primer tipo de receptor o dicho segundo tipo de receptor.

13. Método según la reivindicación 12, en el que dicho uno o más compuestos de unión son una pluralidad de compuestos de unión en el intervalo de desde 2 hasta 10.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicho primer tipo de receptor y dicho segundo tipo de receptor se seleccionan cada uno del grupo que consiste en Her1, Her2, Her3 y Her4.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicho dímero es un heterodímero u homodímero que comprende tipos de receptores seleccionados del grupo que consiste en Her1, Her2, Her3 y Her4.

16. Método según la reivindicación 15, en el que dicho dímero es un homodímero Her1-Her1, un heterodímero Her1-Her2, un heterodímero Her1-Her3 o un heterodímero Her2-Her3.