ES2320867T3 - Peptidos de bolisina antimicrobianos. - Google Patents
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Abstract
Péptidos con actividad antimicrobiana con la secuencia de aminoácidos en la que son R1- ZX3X3X1BX3RX2X3X4BRX2BX3X3B - R2, R1 un grupo amino (NH2), un aminoácido o un péptido con hasta 10 aminoácidos y R2 COOH, CONH2, un aminoácido o un péptido con hasta 10 aminoácidos; Z un aminoácido aromático (W, Y, F), preferentemente tirosina (Y); X1 arginina (R) o un aminoácido aromático (W, Y, F), preferentemente triptófano (W); X 2 serina (S), un aminoácido básico (R, K), preferentemente arginina (R), o un aminoácido aromático (W, Y, F), preferentemente triptófano (W); X3 treonina (T), un aminoácido hidrófobo (I, V, A, L) o arginina (R); X 4 ácido aspártico (D), prolina (P), un aminoácido básico (K, R), preferentemente arginina (R), o un aminoácido aromático (W, Y, F), preferentemente triptófano (W), y B un aminoácido básico (K, R), así como sus derivados y/o fragmentos con actividad antimicrobiana, en especial los derivados y/o fragmentos amidados, acilados, acetilados, alquilados, sulfatados, fosforilados, halogenados, en especial halogenados en las cadenas laterales aromáticas de aminoácidos, glucosilados, oxidados, modificados por esterificación o formación de lactona y/o ciclados, no comprendiendo los péptidos la secuencia de aminoácidos R 3-YIVYKIRSADKRSKALK-R 4, en la que R 3 representa un grupo amino (NH 2), un aminoácido o un péptido con hasta 50 aminoácidos y R 4 COOH, CONH2, un aminoácido o un péptido con hasta 50 aminoácidos, así como tampoco los derivados amidados, acetilados, sulfatados, fosforilados, glucosilados, oxidados ni los fragmentos con propiedades antimicrobianas derivados de la secuencia de aminoácidos, en particular los fragmentos obtenidos por sustitución conservadora o deleción de aminoácidos.
Description
Péptidos de bolisina antimicrobianos.
La invención se refiere a péptidos con actividad
antimicrobiana de alta eficacia, a un procedimiento para su
preparación, así como a su uso.
Se sabe que los péptidos presentes en la
naturaleza pueden tener un efecto antibiótico. Así, por ejemplo, el
documento WO 97/35877 describe la presencia y la purificación de
péptidos antibióticos a partir de leche de vaca, y el documento
PCT/EP 01/06518, la obtención de péptidos antimicrobianos a partir
de extracto de placenta humana y de extracto de timo bovino, así
como su uso.
Uno de los péptidos purificados a partir de
extracto de timo bovino es la bolisina (documento PCT/EP 01/06518,
Sec. ID. nº 5). La bolisina es un fragmento de 17 aminoácidos del
proteolípido mitocondrial bovino e inhibe el crecimiento de
microorganismos patógenos en medios de cultivo pobres en sal.
El documento DE 4444753 A1 da a conocer un
procedimiento para la producción de un preparado peptídico con
efecto antibiótico a partir de leche de vaca. Estos péptidos se
pueden obtener bien mediante un tratamiento selectivo de leche
certificada o bien por síntesis química de péptidos.
El documento WO 97/35877 da a conocer asimismo
péptidos con la secuencia de aminoácidos
H_{2}N-X_{1}-R-X_{3}-X_{2}-COOH,
en la que X_{1} es cero o X_{1} y/o X_{2} son restos con al
menos cinco aminoácidos.
La invención se propone el objetivo de
proporcionar péptidos basados en la bolisina que presenten una
actividad específica especialmente alta en diferentes condiciones.
También es objetivo de la invención proporcionar péptidos que
inhiban el crecimiento de microorganismos en ambientes con una
concentración salina fisiológica y presenten al mismo tiempo una
actividad hemolítica lo más baja posible.
El objetivo se alcanza sorprendentemente
proporcionando péptidos con la secuencia
R_{1}-ZX_{3}X_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}X_{3}X_{4}BRX_{2}BX_{3}X_{3}B-R_{2},
en la que
son
R_{1} un grupo amino (NH_{2}), un aminoácido
o un péptido con hasta 10 aminoácidos y R_{2} COOH, CONH_{2},
un aminoácido o un péptido con hasta 10 aminoácidos;
Z un aminoácido aromático (W, Y, F),
preferentemente tirosina (Y) o un aminoácido halogenado una o varias
veces en el anillo aromático, preferentemente tirosina (Y);
X_{1} arginina (R) o un aminoácido aromático
(W, Y, F), preferentemente triptófano (W) o un aminoácido halogenado
una o varias veces en el anillo aromático, preferentemente
triptófano;
X_{2} serina (S), un aminoácido básico (R, K),
preferentemente arginina (R), o un aminoácido aromático (W, Y, F),
preferentemente triptófano (W) o un aminoácido halogenado una o
varias veces en el anillo aromático, preferentemente
triptófano;
X_{3} treonina (T), un aminoácido hidrófobo
(I, V, A, L) o arginina (R);
X_{4} ácido aspártico (D), prolina (P), un
aminoácido básico (K, R), preferentemente arginina (R), o un
aminoácido aromático (W, Y, F), preferentemente triptófano (W) o un
aminoácido halogenado una o varias veces en el anillo aromático,
preferentemente triptófano, y
B un aminoácido básico (K, R).
El objeto de la invención son también derivados
y/o fragmentos de los péptidos de acuerdo con la invención con
actividad antimicrobiana, en especial los derivados y/o fragmentos
amidados, acilados, acetilados, alquilados, sulfatados,
fosforilados, halogenados, en especial halogenados en las cadenas
laterales aromáticas de aminoácidos, glucosilados, oxidados,
modificados por esterificación o formación de lactona y/o ciclados.
Los péptidos halogenados preferentemente están halogenados en
restos aromáticos de las cadenas laterales de aminoácidos. Los
aminoácidos se designan mediante el código de una sola letra.
Los péptidos no comprenden la secuencia de
aminoácidos
R_{3}-YIVYKIRSADKRSKALK-R_{4},
en la que R_{3} representa un grupo amino (NH_{2}), un
aminoácido o un péptido con hasta 50 aminoácidos y R_{4} COOH,
CONH_{2}, un aminoácido o un péptido con hasta 50 aminoácidos, así
como tampoco los derivados amidados, acetilados, sulfatados,
fosforilados, glucosilados, oxidados ni los fragmentos con
propiedades antimicrobianas derivados de la secuencia de
aminoácidos, en particular los fragmentos obtenidos por sustitución
conservadora o deleción de aminoácidos.
Los péptidos de acuerdo con la invención
presentan preferentemente las secuencias
R_{1}-ZIX_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}ADBRX_{2}BALB-R_{2}
(secuencia ID nº: 2, 4, 8, 12, 13, 15)
R_{1}-ZIX_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}APBRX_{2}BALB-R_{2}
(secuencia ID nº: 11)
R_{1}-ZIX_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}ABBRX_{2}BALB-R_{2}
(secuencia ID nº: 1, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 18, 21-24,
28, 29, 31, 32, 35, 38, 41, 45, 47, 48, 51)
R_{1}-ZIX_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}AZBRX_{2}BALB-R_{2}
(secuencia ID nº: 14, 16, 17, 19, 20, 25-27, 30,
33, 34, 36, 37, 42-44, 46, 49, 50, 52, 53, 54)
R_{1}-ZIX_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}TZBRX_{2}BALB-R_{2}
(secuencia ID nº: 55),
en las que X_{3} es un aminoácido
hidrófobo (I, V) o arginina (R) y R_{1}, R_{2}, Z, X_{1},
X_{2} y B presentan los significados antes expuestos. En la tabla
1 se exponen los péptidos preferidos de la invención. También son
objeto de la invención sus derivados y/o fragmentos con actividad
antimicrobiana, en especial los derivados y/o fragmentos amidados,
acilados, acetilados, alquilados, sulfatados, fosforilados,
halogenados, glucosilados, oxidados, modificados por esterificación
o formación de lactona y/o
ciclados.
La invención comprende los péptidos modificados
por esterificación o formación de lactona, así como los péptidos de
acuerdo con la invención que se hacen reaccionar en un grupo amino
libre con polioxialquilenglicol activado o con un conjugado de un
polioxialquilenglicol y, por ejemplo, un ácido graso. Se prefieren
ácidos grasos con una longitud de cadena de 12 a 18 átomos de
carbono y polioxietileno con una longitud de cadena de 2 a 100 como
polioxialquilenglicol. Asimismo se prefieren ésteres de polisorbato
activados y sus derivados. Los conjugados peptídicos se preparan
para mejorar las propiedades farmacológicas de los péptidos.
Además de los derivados mencionados, los
péptidos también pueden presentar en lugar de los
L-aminoácidos naturales los
D-aminoácidos correspondientes, así como
imino-aminoácidos y aminoácidos raros, tales como
hidroxilisina, homoserina y ornitina. La invención comprende
asimismo los péptidos retro, inversos y
retro-inversos. Con péptidos retro se designan los
péptidos de acuerdo con la invención con una secuencia de
aminoácidos inversa, los péptidos inversos representan los péptidos
de acuerdo con la invención que se componen de
D-aminoácidos y los péptidos
retro-inversos son aquellos péptidos que presentan
una secuencia de aminoácidos inversa formada por
D-aminoáci-
dos.
dos.
También son objeto de la invención péptidos
miméticos de los péptidos de acuerdo con la invención. Éstos se
caracterizan por la modificación de uno o varios enlaces peptídicos,
por ejemplo por un enlace peptídico inverso o un enlace éster.
En el caso de los análogos de bolisina de
acuerdo con la invención se trata de péptidos catiónicos con un
efecto antibiótico. Los análogos de bolisina contienen al menos 9 y
como máximo 37 restos de aminoácido, preferentemente no más de 20
restos de aminoácido.
Los análogos peptídicos de bolisina de acuerdo
con la invención presentan una actividad antimicrobiana claramente
aumentada. Los péptidos descritos en esta invención inhiben
eficazmente el crecimiento de los gérmenes patógenos también en
medios de cultivo que presentan una concentración salina
fisiológica, por lo que, al contrario que la bolisina presente en
la naturaleza, pueden aprovecharse para numerosas aplicaciones.
También los gérmenes patógenos para los seres humanos con
resistencia a antibióticos se destruyen ya a concentraciones bajas
de los péptidos.
Como fragmentos se consideran en especial
péptidos acortados por el extremo N- o C-terminal,
pero también péptidos en los que se han delecionado aminoácidos
aislados, preferentemente no más del 10% de los aminoácidos. Estos
fragmentos son objeto de la invención siempre que presenten
propiedades antimicrobianas. "Propiedades antimicrobianas del
fragmento" significa que el fragmento presenta al menos un 50% de
la actividad del péptido original, es decir, que requiere como
máximo una doble concentración inhibidora. Como organismos de ensayo
se usan o bien Staphylococcus aureus o bien Escherichia
coli, dependiendo de cuál sea el microorganismo frente al que
el péptido presenta una mayor actividad. Los microorganismos se
caracterizan como sigue:
Staphylococcus aureus: cocos Gram
positivos, ATCC 25923
Escherichia coli: bacilos Gram negativos,
ATCC 25922
La invención comprende también ácidos nucleicos
que codifican los péptidos de acuerdo con la invención y vectores y
plásmidos que contienen tales ácidos nucleicos.
El objeto de la invención es también un
medicamento que contiene uno o varios péptidos de acuerdo con la
invención.
Los péptidos de acuerdo con la invención son
adecuados para el tratamiento de afecciones asociadas a
colonizaciones microbianas inapropiadas, tales como infecciones,
inflamaciones, tumores inducidos por microorganismos, afecciones
degenerativas asociadas a microorganismos, diarreas, cólicos,
alteraciones de la flora bucal, intestinal y vaginal, caries,
sepsis, estados de choque tóxico. La colonización microbiana
inapropiada puede deberse, por ejemplo, a bacterias, hongos,
levaduras, protistas, virus, micoplasmas, filarias y/o plasmodios.
Se pueden usar en el caso de afecciones tanto agudas como crónicas
en seres humanos y animales.
Los péptidos de acuerdo con la invención se usan
preferentemente en preparaciones farmacéuticas. La preparación
farmacéutica contiene uno o varios de los péptidos de acuerdo con la
invención, o una sal fisiológicamente tolerable de los péptidos.
Las preparaciones farmacéuticas pueden contener coadyuvantes
farmacéuticamente habituales que, por ejemplo, contribuyen a la
solubilidad, estabilidad o esterilidad del medicamento o aumentan
el grado de eficacia de la absorción en el cuerpo. Asimismo pueden
estar contenidas sustancias antibióticas adicionales, por ejemplo
del grupo de las penicilinas, cefalosporinas, carbacefems,
cefamicinas, carbapenems, quinolonas, tetraciclinas,
aminoglucósidos, macrólidos, glucopéptidos, cloranfenicoles,
glicilciclinas, licosamidas, fluoroquinolonas y antibióticos
peptídicos.
La forma y composición del medicamento que
contiene los péptidos se rige por la vía de administración.
Preferentemente se usan preparaciones galénicas y se eligen formas
de administración en las que los péptidos llegan al lugar de acción
sin ser degradados. Los péptidos se pueden administrar por vía
enteral, parenteral, intranasal, oral y por inhalación. Los
péptidos se confeccionan preferentemente en un preparado para
inyección, bien en forma de solución o bien en forma de liofilizado
para la disolución inmediatamente antes del uso. Por ejemplo, los
péptidos se pueden inyectar por vía intravenosa, inyectar o
implantar por vía intraperitoneal, inyectar o implantar por vía
subcutánea, inyectar por vía intradérmica, inyectar o implantar por
vía intramuscular, inyectar por vía intratecálica, inhalar
(aerosol, nebulización) o administrar tópicamente (por ejemplo
cremas, pomadas, colirios, gotas óticas, champús). Los análogos de
bolisina se pueden administrar localmente en forma de inyección,
gotas, aerosoles, comprimidos, supositorios, cremas, pomadas, geles,
etc. Existe la posibilidad de administrarlos en forma de bolo o
varias veces a lo largo de un periodo de tiempo.
La dosis que se ha de administrar de los
péptidos depende de la indicación y del uso de derivados
determinados. Preferentemente, los péptidos de acuerdo con la
invención se usan en cantidades de 0,1 a 100 mg/kg de peso
corporal.
El objeto de la invención es también un agente
de diagnóstico que contiene los péptidos o ácidos nucleicos de
acuerdo con la invención.
Los péptidos de acuerdo con la invención también
se pueden usar como aditivos para alimentos. Se pueden usar como
coadyuvantes en la producción de alimentos, en especial en alimentos
que se producen por fermentación y otros procesos bacterianos. En
el caso de los preparados de acuerdo con la patente se trata de
conservantes naturales. Otras posibilidades de aplicación de los
péptidos de acuerdo con la invención residen en el uso como
desinfectantes para todas las situaciones en las que no se deseen
microorganismos. Son ejemplos el uso para la desinfección de
superficies o como recubrimiento de productos médicos, filtros de
aire y artículos accesorios como, por ejemplo, ropa y bisutería.
Por productos médicos se entienden todos los coadyuvantes médicos
que se usan en el paciente, como, por ejemplo, implantes, prótesis,
prótesis endovasculares, tubos, cánulas, catéteres, sistemas
vasculares sintéticos, válvulas cardíacas artificiales y agujas. Por
productos médicos se entienden asimismo recipientes para el
almacenamiento de sangre o de componentes sanguíneos, así como
recipientes para el transporte de órganos, etc. También es posible
el uso en el tratamiento del agua o como componente de champús y
jabones, como aditivos para alimentos, conservantes cosméticos,
aditivos para la conservación de medios de cultivo celular, etc. y
como agentes fitosanitarios.
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La síntesis peptídica de los análogos de
bolisina se basa en el procedimiento convencional de la estrategia
Fmoc en fase sólida. Para la síntesis automatizada se usó un
sintetizador ABI 433 A (Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania).
De fase sólida sirvió una resina
Fmoc-Lys(boc)-Wang. Durante
la síntesis peptídica se controlaron los pasos de acoplamiento
individuales para asegurarse de que cada aminoácido se incorporaba
con un alto rendimiento. Los péptidos se disociaron de la resina
mediante 94% de ácido trifluoroacético (TFA), 3% de etanoditiol y
3% de agua y a continuación se purificaron por cromatografía.
Para la purificación cromatográfica se usó la
HPLC de fase inversa (RP). De fase sólida sirvió una columna RP C18
preparativa (PrepPak 500 C18, 47x300 mm), de eluyente acetonitrilo
(disolvente A: TFA al 0,07% en agua; disolvente B: acetonitrilo al
80%/TFA al 0,07% en agua). Los péptidos se eluyeron de la fase
sólida mediante el procedimiento de gradiente (aumento de 0,5% de
disolvente B/min en el eluyente) a una velocidad de flujo de 40
ml/min y se detectaron a una longitud de onda de 215 nm.
Los péptidos sintéticos se analizaron por
espectrometría de masas. La pureza de los péptidos se controló
mediante electroforesis capilar de zona y HPLC de fase inversa
analítica (pureza \geq 95%). La secuencia de aminoácidos de los
péptidos se comprobó mediante la degradación automatizada de
Edman.
En la tabla 1 se indican las secuencias de
aminoácidos de los análogos de bolisina sintetizados de acuerdo con
la invención usando el código de una letra.
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Se estudió la adecuación de los análogos de
bolisina de la presente invención como agentes terapéuticos
antibióticos con la ayuda de diferentes ensayos biológicos. Para
ello se estudió la actividad antimicrobiana de los péptidos
sintetizados químicamente frente a tres cepas bacterianas Gram
positivas y tres Gram negativas, así como frente a una
levadura.
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La actividad antibiótica de los análogos de
bolisina se estudió con la ayuda de la determinación de la
concentración mínima inhibidora. La concentración mínima inhibidora
de un análogo designa la concentración peptídica más baja necesaria
para inhibir completamente el crecimiento de microorganismos después
de un tiempo de incubación de 18 \pm 2 h. Este procedimiento
permite realizar una afirmación cuantitativa acerca de la potencia
antimicrobiana de los péptidos. Estos estudios se llevaron a cabo
conforme a las recomendaciones (M7-A3) publicadas
por el NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards,
Comité Nacional para Normas de Laboratorios Clínicos) usando el
ensayo de dilución en medio líquido, en el que se usaron los
péptidos sintetizados químicamente (secuencias peptídicas de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3). Salvo que se indique lo
contrario, se usó como medio de ensayo el caldo Mueller Hinton
según las recomendaciones del NCCLS. La tabla 2 muestra la actividad
antimicrobiana de los análogos peptídicos claramente mejorada en
comparación con el péptido original bolisina. Las concentraciones
mínimas inhibidoras se indican en [\mug/ml].
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Los valores entre paréntesis designan una
inhibición del 75% del crecimiento de los microorganismos a la
concentración peptídica indicada. En este caso no se pudo alcanzar
una inhibición completa del crecimiento. Para la determinación de
la concentración mínima inhibidora se usaron los siguientes
microorganismos:
- 1.
- Staphylococcus aureus ATCC 25923.
- 2.
- Enterococcus faecalis ATCC 51299 (resistente a vancomicina).
- 3.
- Streptococcus pneumoniae DSM 11865 (resistente a penicilina).
- 4.
- Escherichia coli ATCC 25922.
- 5.
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.
- 6.
- Klebsiella pneumoniae ATCC 10031.
- 7.
- Candida albicans ATCC 10231.
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Los péptidos de acuerdo con la invención inhiben
eficazmente el crecimiento tanto de bacterias Gram positivas y Gram
negativas como de levaduras. Se destruyen eficazmente los gérmenes
patógenos para los seres humanos, tales como Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella
pneumoniae. De especial importancia es la inhibición muy eficaz
del crecimiento de las bacterias con una resistencia a antibióticos
preexistente, como, por ejemplo, Streptococcus pneumoniae
(resistente a penicilina) y Enterococcus faecalis
(resistente a vancomicina). La potencia de acción de los análogos de
bolisina es bastante mayor que la del péptido original
bolisina.
bolisina.
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También para estos estudios se determinó la
concentración mínima inhibidora de los péptidos frente a
microorganismos Gram positivos y Gram negativos (microorganismos 1
a 6). Como medio de ensayo se usó caldo tripticasa soja (3 g/l) con
una concentración fisiológica de sal (cloruro sódico 150 mM). La
tabla 3 muestra la actividad antimicrobiana de los análogos
peptídicos en medio salino, también claramente mejorada respecto al
péptido original bolisina.
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Los valores entre paréntesis designan una
inhibición del 75% del crecimiento de los microorganismos a la
concentración peptídica indicada. En este caso no se pudo alcanzar
una inhibición completa del crecimiento.
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Se seleccionaron los análogos de bolisina con
una buena actividad antimicrobiana frente a al menos una de las
siete cepas de microorganismos ensayadas (CMI \leq 37,5 \mug/ml)
para comprobar su actividad citotóxica.
La capacidad de los péptidos antimicrobianos
para adherirse a las membranas plasmáticas y para permeabilizarlas
se considera en muchos casos el mecanismo de acción de estas
sustancias. Resulta deseable que sean dañadas selectivamente las
membranas bacterianas, debiendo permanecer inalteradas las células
del huésped. Como modelo sencillo para estudiar el efecto
citotóxico que ejerce un péptido sobre las células eucariotas se usa
el ensayo de hemolisis, en el que se analiza la actividad lítica y,
por lo tanto, tóxica de los péptidos frente a los glóbulos rojos
(eritrocitos). El procedimiento para la determinación de la
actividad hemolítica de los péptidos se realizó conforme a
Helmerhorst y col. (Helmerhorst y col., 1999, FEBS Lett. 449:
105-110).
Los eritrocitos se aislaron de la sangre
completa citrada de un probando sano por centrifugación (1.500 x g,
20ºC, 10 min) y se diluyeron 200 veces con medio de ensayo. Los
péptidos se dispusieron a diferentes concentraciones en una placa
de microvaloración de 96 pocillos con fondo en forma de V y se
incubaron durante 1 h a 37ºC con la suspensión de eritrocitos
diluida. Los eritrocitos se separaron por centrifugación siguiente
(1.000 x g durante 5 min). Los sobrenadantes teñidos a causa de la
hemoglobina liberada se transfirieron a una placa de
microvaloración de 96 pocillos con fondo plano y se determinó su
absorción a una longitud de onda de \lambda = 450 nm mediante un
lector de placas de microvaloración. Como valor de referencia para
una hemolisis del 100% sirvió la incubación con una solución al 1%
del detergente Tween-20. Como control negativo
sirvieron eritrocitos incubados sólo con medio de ensayo.
La actividad hemolítica de los análogos de
bolisina se indicó respecto a la hemolisis total con
Tween-20 y se calculó según la fórmula
siguiente:
Hemolisis\ [%]
= [A_{450\ nm}\ (péptido) - A_{450\ nm}\ (control\
negativo)]/[A_{450\ nm}\ (Tween-20\ 1%) - A_{450\
nm}\ (control\
negativo)]*100
\newpage
Como medio de ensayo sirvió medio TSB con
glucosa 287 mM. La concentración isotónica de glucosa debe prevenir
la hemolisis inespecífica en el ambiente hipotónico (protección
osmótica).
Resulta deseable que los péptidos de acuerdo con
la invención sólo muestren propiedades líticas moderadas frente a
eritrocitos o carezcan de ellas. Propiedades líticas moderadas
significa una lisis inferior al 30% de los eritrocitos cuando se
aplican concentraciones peptídicas eficaces contra
microorganismos.
La figura 1 muestra que los análogos de bolisina
no causan una hemolisis digna de mención a concentraciones eficaces
contra microorganismos (< 5%). También a concentraciones elevadas
(500 \mug/ml) se observa sólo una actividad lítica moderada (<
30%). Como comparación se ha representado la actividad hemolítica
del péptido antimicrobiano MBI-28 (GOUGH y col.,
1996, Infect. Immun. 64(12): 4922-7).
Claims (19)
1. Péptidos con actividad antimicrobiana con la
secuencia de aminoácidos
R_{1}-ZX_{3}X_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}X_{3}X_{4}BRX_{2}BX_{3}X_{3}B-R_{2},
en la que
son
R_{1} un grupo amino (NH_{2}), un aminoácido
o un péptido con hasta 10 aminoácidos y R_{2} COOH, CONH_{2},
un aminoácido o un péptido con hasta 10 aminoácidos;
Z un aminoácido aromático (W, Y, F),
preferentemente tirosina (Y);
X_{1} arginina (R) o un aminoácido aromático
(W, Y, F), preferentemente triptófano (W);
X_{2} serina (S), un aminoácido básico (R, K),
preferentemente arginina (R), o un aminoácido aromático (W, Y, F),
preferentemente triptófano (W);
X_{3} treonina (T), un aminoácido hidrófobo
(I, V, A, L) o arginina (R);
X_{4} ácido aspártico (D), prolina (P), un
aminoácido básico (K, R), preferentemente arginina (R), o un
aminoácido aromático (W, Y, F), preferentemente triptófano (W),
y
B un aminoácido básico (K, R),
así como sus derivados y/o
fragmentos con actividad antimicrobiana, en especial los derivados
y/o fragmentos amidados, acilados, acetilados, alquilados,
sulfatados, fosforilados, halogenados, en especial halogenados en
las cadenas laterales aromáticas de aminoácidos, glucosilados,
oxidados, modificados por esterificación o formación de lactona y/o
ciclados, no comprendiendo los péptidos la secuencia de aminoácidos
R_{3}-YIVYKIRSADKRSKALK-R_{4},
en la que R_{3} representa un grupo amino (NH_{2}), un
aminoácido o un péptido con hasta 50 aminoácidos y R_{4} COOH,
CONH_{2}, un aminoácido o un péptido con hasta 50 aminoácidos, así
como tampoco los derivados amidados, acetilados, sulfatados,
fosforilados, glucosilados, oxidados ni los fragmentos con
propiedades antimicrobianas derivados de la secuencia de
aminoácidos, en particular los fragmentos obtenidos por sustitución
conservadora o deleción de amino-
ácidos.
ácidos.
2. Péptidos según la reivindicación 1, con una
de las secuencias
- R_{1}-ZIX_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}ADBRX_{2}BALB-R_{2}
- R_{1}-ZIX_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}APBRX_{2}BALB-R_{2}
- R_{1}-ZIX_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}ABBRX_{2}BALB-R_{2}
- R_{1}-ZIX_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}AZBRX_{2}BALB-R_{2} o
- R_{1}-ZIX_{3}X_{1}BX_{3}RX_{2}TZBRX_{2}BALB-R_{2}
en las que X_{3} es un aminoácido
hidrófobo (I, V) o arginina (R) y R_{1}, R_{2}, Z, X_{1},
X_{2} y B presentan los significados indicados en la
reivindicación 1, así como sus derivados y/o fragmentos con
actividad antimicrobiana, en especial los derivados y/o fragmentos
amidados, acilados, acetilados, alquilados, sulfatados,
fosforilados, halogenados, en especial halogenados en las cadenas
laterales aromáticas de aminoácidos, glucosilados, oxidados,
modificados por esterificación o formación de lactona y/o
ciclados.
3. Péptidos según la reivindicación 1 y/o 2, con
una de las secuencias de aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(Continuación)
así como sus derivados y/o
fragmentos con actividad antimicrobiana, en especial los derivados
y/o fragmentos amidados, acilados, acetilados, alquilados,
sulfatados, fosforilados, halogenados, en especial halogenados en
las cadenas laterales aromáticas de aminoácidos, glucosilados,
oxidados, modificados por esterificación o formación de lactona y/o
ciclados.
4. Péptidos según una de las reivindicaciones 1
a 3, en los que uno o varios aminoácidos están sustituidos por los
D-aminoácidos correspondientes, y péptidos retro,
inversos o retro-inversos de los péptidos según una
de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Péptidos miméticos de los péptidos según una
de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracterizan por uno o
varios enlaces peptídicos modificados, en especial por enlace
peptídico inverso o enlace éster.
6. Conjugados de péptidos según al menos una de
las reivindicaciones 1 a 5 con polímeros, preferentemente con
polisorbato.
7. Ácidos nucleicos que codifican los péptidos
según una de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Vectores y plásmidos que contienen los ácidos
nucleicos según la reivindicación 7.
9. Medicamento que contiene al menos uno de los
péptidos según las reivindicaciones 1 a 6, ácidos nucleicos según
la reivindicación 7 o vectores o plásmidos según la reivindicación
8.
10. Medicamento según la reivindicación 9, que
contiene al menos un principio activo antibiótico adicional.
11. Medicamento según la reivindicación 10, en
el que el principio activo antibiótico corresponde al grupo de las
penicilinas, cefalosporinas, carbacefems, cefamicinas, carbapenems,
quinolonas, tetraciclinas, aminoglucósidos, macrólidos,
glucopéptidos, cloranfenicoles, glicilciclinas, licosamidas,
fluoroquinolonas y antibióticos peptídicos.
12. Medicamento según la reivindicación 9 ó 10,
que contiene al menos un principio activo antiviral, antiparasitario
y/o antifúngico.
13. Medicamento según al menos una de las
reivindicaciones 9 a 12 en una forma adecuada para la
administración, como infusión, pomada, comprimido, aerosol o
cápsula de liberación lenta.
14. Agente de diagnóstico que contiene al menos
uno de los péptidos según las reivindicaciones 1 a 6, ácidos
nucleicos según la reivindicación 7 o vectores o plásmidos según la
reivindicación 8.
15. Alimento que contiene los péptidos según al
menos una de las reivindicaciones 1 a 6.
16. Procedimiento para la inhibición del
crecimiento de microorganismos, en el que los microorganismos se
ponen en contacto con una cantidad eficaz contra microorganismos de
uno o varios de los péptidos según las reivindicaciones 1 a 6.
17. Procedimiento para la preparación de los
péptidos según una de las reivindicaciones 1 a 6 por expresión en
microorganismos procariotas o eucariotas o por síntesis química.
18. Uso de los péptidos según al menos una de
las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de afecciones causadas por microorganismos, de
afecciones del organismo humano y animal, en especial con
implicación del tracto gastrointestinal, de las vías respiratorias y
del tracto urogenital, del integumento y sus glándulas anexas, para
el tratamiento de afecciones crónicas, para el tratamiento de
afecciones asociadas a colonizaciones microbianas inapropiadas
causadas por bacterias, hongos, levaduras, protistas, virus,
micoplasmas, filarias y/o plasmodios, de infecciones, inflamaciones,
tumores inducidos por microorganismos, afecciones degenerativas
asociadas a microorganismos, diarreas, cólicos, alteraciones de la
flora bucal, intestinal y vaginal, sepsis y/o caries provocados por
colonizaciones microbianas inapropiadas.
19. Uso de los péptidos según al menos una de
las reivindicaciones 1 a 6 como conservante para alimentos, piensos
y cosméticos, como conservante para evitar contaminaciones
microbianas de medios y artículos de uso corriente para el cultivo
celular, como desinfectante, para la prevención de colonizaciones
microbianas de productos médicos, para la prevención de
colonizaciones microbianas de artículos accesorios, en especial de
ropa y bisutería, como coadyuvante en procesos de fermentación
industriales, en especial en la elaboración de cerveza y en la
producción de yogur.
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