ES2317857T3 - Proceso para la produccion biologica del acido l-pipecolico. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de producción de ácido L-pipecólico que comprende la etapa de reducir ácido delta-1-piperideina-6-carboxílico mediante el uso de pirrolina-5-carboxilato reductasa.
Description
Proceso para la producción biológica del ácido
L-pipecólico.
Esta invención se refiere a un procedimiento
biológico de producción de ácido L-pipecólico (o
ácido 2-piperidinacarboxílico o
L-homoprolina), y a cepas recombinantes de
Escherichia coli o bacterias corineformes que pueden ser
utilizadas convenientemente para el procedimiento.
El ácido L-pipecólico es
importante como materia prima para la síntesis de fármacos.
Actualmente, el ácido pipecólico se obtiene por síntesis a partir
de L-lisina (J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1985,
páginas 633-635), o mediante la resolución óptica
de ácido DL-pipecólico preparado por síntesis a
partir de ácido picolínico (Method of Enzymol, 17B, páginas
174-188, 1971). Como métodos para la resolución
óptica se conocen un método de resolución de sales de
diastereoisómeros que emplea ácido D-tartárico, y un
método enzimático en el que se usa D-aminoácido
oxidasa derivada del hígado del cerdo, para descomponer el isómero D
al tiempo que deja el isómero L.
Por otra parte, es sabido que el ácido
L-pipecólico es producido en animales (J. Biol.
Chem., Vol. 211, página 851, 1954), plantas (J. Amer. Chem. Soc.,
Vol. 74, página 2949, 1952) y microorganismos (Biochemistry, Vol.
1, páginas 606-616, 1926; patente japonesa abierta a
consulta por el público, No. 38781/94). Sin embargo, dado que la
cantidad de ácido L-pipecólico acumulada en ellos es
pequeña, no ha sido puesto en uso práctico procedimiento alguno de
producción de ácido L-pipecólico usando estos
organismos. Según investigaciones previas sobre el metabolismo de
L-lisina, se conoce que el ácido
delta-1-piperideina-6-carboxílico
(al que se hace referencia también en lo sucesivo como P6C) se
forma a partir de L-lisina por medio de una reacción
de transaminación por lisina 6-aminotransferasa (a
la que se alude también en lo sucesivo como LAT) (Biochemistry, Vol.
7, páginas 4102-4109, 1968) o por la acción de la
L-lisina 6-deshidrogenasa (J.
Biochem., Vol. 105, páginas 1002-1008, 1989).
Se ha indicado que el P6C puede ser convertido
químicamente en ácido L-pipecólico por hidrogenación
usando óxido de platino (Biochemistry, Vol. 7, páginas
4102-4109, 1968), pero no hay informe alguno acerca
de la formación de ácido L-pipecólico mediante la
reducción biológica o enzimática de P6C. Además, se ha supuesto un
camino metabólico en el que Pseudomonas putida produce ácido
L-pipecólico a partir de D-lisina
por medio del ácido
delta-1-piperideina-2-carboxílico.
Asimismo, es difícil utilizar tales caminos biológicos para la
producción masiva de ácido L-pipecólico.
En los procedimientos antes descritos que llevan
consigo la resolución óptica de ácido DL-pipecólico
preparado mediante síntesis química, el agente de resolución óptica
que se usa es costoso y se requiere un procedimiento operatorio
complicado. Además, en el procedimiento que usa una enzima con fines
de resolución óptica, también es costoso el uso de una enzima
purificada. Debido a estas desventajas, ambos procedimientos no son
eficaces desde el punto de vista industrial y no pueden producir
ácido L-pipecólico barato.
Además, los procedimientos convencionales de
producción de ácido L-pipecólico usando
microorganismos, no han sido puestos en uso práctico debido a que
las cantidad de ácido L-pipecólico acumulada es
pequeña.
Aparte de esto, Coque J.J. et al., J.
Bacteriol., 1991, 173(19), páginas 6258-64,
describen que un gen que codifica la lisina
6-aminotransferasa, que forma el ácido
\alpha-aminoadípico precursor de
\beta-lactama, está situado en el conglomerado de
genes biosintéticos de la cefamicina de Nocardia
lactamdurans.
Además, el artículo de Malmberg L. H, et
al., en J. Bacteriol., 1993, 175(21), páginas
6916-24, se refiere al control del flujo de
precursores mediante la inserción cromosómica específica del gen de
la lisina \varepsilon-aminotransferasa (lat) en
la biosíntesis de cefamicina C.
Los presentes inventores han encontrado ahora
que la pirrolina-5-carboxilato
reductasa [EC 1.5.1.2] que reduce el ácido
delta-1-pirrolina-5-carboxílico
a L-prolina, según se indica seguidamente
puede reducir también eficazmente
el P6C al ácido L-pipecólico correspondiente, según
se indica a
continuación.
Además, se ha descubierto también que este
sistema de reducción puede ser usado combinándole convenientemente
con otros sistemas biológicos de producción de P6C.
La presente invención está basada en estos
descubrimientos y proporciona medios para producir eficazmente
ácido L-pipecólico, utilizando la acción de la
pirrolina-5-carboxilato
reductasa.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento de producción de ácido
L-pipecólico, que comprende la etapa de reducir el
ácido
delta-1-piperideina-6-carboxílico
(P6C) mediante el uso de
pirrolina-5-carboxilato
reductasa.
En una realización preferida de la presente
invención, la etapa de reducción de P6C se combina con la etapa de
conversión de L-lisina en P6C mediante el uso de
lisina 6-aminotransferasa (LAT).
En una realización, la presente invención se
refiere al procedimiento anterior, en el que se usa una cepa
recombinante de Escherichia coli o una bacteria corineforme
que contiene un gen que codifica la lisina
6-aminotransferasa en forma expresable.
La presente invención se refiere también a una
cepa recombinante de Escherichia coli o una bacteria
corineforme que contiene un gen que codifica LAT en forma
expresable y que contiene, además, en forma expresable, al menos un
gen seleccionado entre el grupo que consiste en un gen exógeno que
codifica pirrolina-5-carboxilato
reductasa y un gen exógeno que participa en la incorporación de
lisina, en el que el gen que participa en la incorporación de
lisina es un gen que codifica una permeasa específica de lisina o
los genes que codifican proteínas que constituyen el sistema LAO
que participa en la incorporación de lisina, arginina y
ornitina.
La Fig. 1 es una vista esquemática de un
plásmido relacionado con la presente invención, que ha sido
construido con objeto de producir ácido
L-pipecólico a partir de L-lisina,
en Escherichia coli.
La Fig. 2 es una vista esquemática de un
plásmido relacionado con la presente invención, que ha sido
construido con objeto de producir ácido
L-pipecólico en una bacteria corineforme.
La expresión "gen exógeno" tal como se
utiliza en esta memoria, significa un gen que deriva de una célula
diferente de la propia célula mencionada, tanto si la célula es
semejante o diferente de la célula o bacteria citadas.
Se sabe que la
pirrolina-5-carboxilato reductasa
(EC 1.5.1.2; a la que se hace referencia en lo sucesivo en esta
memoria como P5C reductasa), que se usa en la presente invención, es
una enzima que participa en un camino metabólico de síntesis de
prolina a partir de arginina o de ácido glutámico. Como se ha
descrito anteriormente, esta enzima posee actividad para reducir el
ácido
delta-1-pirrolina-5-carboxílico
a prolina, con ayuda de la forma reducida del dinucleótido de
adenina nicotinamida (NADH) o la forma reducida del fosfato del
dinucleótido de adenina nicotinamida (NADPH). Es sabido que la P5C
reductasa está distribuida ampliamente en una gran variedad de
bacterias, plantas, y animales.
La P5Creductasa que puede ser usada en la
presente invención, no está limitada por su origen, en tanto en
cuanto tenga actividad para reducir el P6C a ácido
L-pipecólico. La P5Creductasa puede ser usada en
cualquier forma deseada, seleccionada desde preparaciones tales
como una enzima purificada y un lisado celular, y procedente de
células vivas. Cuando se usa una preparación, puede a veces ser
necesario añadir NADH o NADPH para llevar a cabo la reducción
conforme a la presente invención.
El ácido
delta-1-piperideina-6-carboxílico
(P6C), que ha de ser reducido mediante el uso de P5C reductasa
según la presente invención, corresponde a un compuesto obtenido
cuando el 6-semialdehído del ácido
2-aminoadípico formado a partir de
L-lisina por la acción lisina
6-aminotransferasa (LAT) sufre un cierre de anillo
no enzimático con la eliminación de agua. Dado que se considera que
este semialdehído .está presente en solución acuosa como una mezcla
en equilibrio con P6C, ha de entenderse que el P6C y el semialdehído
son equivalentes uno a otro en el sistema de reacción de la
presente invención. Por consiguiente, el propio P6C, una mezcla de
P6C y el semialdehído, o el propio semialdehído, puede añadirse al
sistema de reacción de la presente invención, y todas estas
realizaciones están comprendidas en la presente invención.
Como P6C (ó 6-semialdehído del
ácido 2-aminoadípico), puede usarse cualquiera de
los productos preparados por diversos medios que incluyen síntesis
química y medios biológicos. No obstante, desde el punto de vista
de la producción económica de ácido L-pipecólico,
que es un isómero óptico particular, es preferible usar P6C que
posea una configuración estérica que corresponda a la del ácido
L-pipecólico (específicamente, en lo que respecta
al átomo de carbono asimétrico situado en la posición 2).
La etapa de reducción de P6C según la presente
invención,, se lleva a cabo haciendo que P5C reductasa actúe sobre
el P6C en condiciones que permitan proseguir las reacciones
enzimáticas ordinarias. Según se ha descrito antes, puede hacerse
que la P5C reductasa actúe sobre el P6C de cualquier forma deseada,
seleccionada entre preparaciones tales como una enzima purificada y
un lisado celular, y partiendo de células vivas. Sin embargo, a la
vista del hecho de que participa en la reacción citada una coenzima
tal como NADH o NAPDH, es preferible usar un lisado celular o las
propias células vivas. En cuanto a las células, es especialmente
preferible usar células de Escherichia coli o de una
bacteria corineforme, entre los microorganismos que ponen de
manifiesto actividad de P5C reductasa, capaz de convertir (o
reducir) el P6C en ácido L-pipecólico. Es sabido que
el gen proC que codifica P5C reductasa, está presente en
Escherichia coli, y la secuencia de proC y su
expresión han sido descritas (véase la publicación de A.H. Deutch
et al., Nucleic Acids Research, Vol. 10, 1982m
7701-7714).
Por tanto, en una realización preferida de la
presente invención, el P6C puede ser reducido a ácido
L-pipecólico incubando Escherichia coli que
posea actividad de P5C reductasa, o Escherichia coli u otro
microorganismo que contenga el gen proC antes citado en
forma expresable, junto con P6C, en condiciones que permitan que
estos microorganismos vivan y produzcan actividad de P5C reductasa.
Tal como se usa en esta memoria, la expresión "que contiene o que
integra un gen particular en forma expresable" significa que el
gen está integrado en un cromosoma de una célula huésped, si es
necesario, junto con un promotor, un regulador y semejante; o que
el gen está integrado en un vector de expresión junto con un
promotor adecuado y semejante, y luego es introducido en una célula
huésped. Las condiciones citadas que permiten a los microorganismos
producir actividad de P5C reductasa, se refieren a condiciones bajo
las que los microorganismos respectivos son viables, y,
preferiblemente, a las condiciones de cultivo en las que estos
microorganismos pueden crecer. Estas condiciones son bien conocidas
por los expertos en la técnica y sería fácil para los expertos en la
técnica determinar las condiciones haciendo referencia a los
ejemplos que serán proporcionados más adelante.
La reacción deseada puede llevarse a cabo
añadiendo P6C directamente a una suspensión o un cultivo de un
microorganismo, según se ha descrito anteriormente. Sin embargo,
según la presente invención, es preferible añadir el P6C a la etapa
de reducción anteriormente indicada usando P5C reductasa
combinándola con la etapa de conversión de
L-lisina, que puede obtenerse fácilmente, en P6C
mediante el uso de lisina 6-aminotransferasa (LAT).
Cuando se emplea Escherichia coli como origen de P5C
reductasa en una combinación tal, es necesario, habitualmente, usar
un sistema enzimático de LAT derivado de células extrañas en
combinación con el sistema enzimático de Escherichia coli,
debido a que no está presente en el Escherichia coli un
sistema enzimático que cataliza el procedimiento de conversión de
L-lisina en P6C o, incluso si está presente, su
actividad es muy baja. La LAT que puede ser usada en una
combinación tal no está limitada por su origen, con tal que posea
actividad de conversión de L-lisina en P6C. Un
ejemplo preferido es la LAT que procede de Flavobacterium
lutescens. Cepas típicas (por ejemplo, la cepa IFO 3084) de
este microorganismo se utilizan habitualmente para el bioensayo de
L-lisina y se sabe que poseen actividad de LAT [Soda
et al., Biochemistry, 7 (1968), 4102-4109;
Id., 4110-4119]. Ciertas cepas de F.
lutescens poseen la capacidad de oxidar P6C a ácido
\alpha-aminoadípico mediante la acción de
delta-1-piperideina-6-carboxilato
deshidrogenasa que poseen [Biochem. J. (1977), 327,
59-64]. Además, existe la posibilidad de que el
ácido L-pipecólico formado a partir de P6C mediante
P5C-reductasa o mediante la actividad de P6C
reductasa, pueda ser convertido en otros compuestos siguiendo otro
camino metabólico. Por consiguiente, cuando se usa el sistema
enzimático de esta bacteria, puede suceder, habitualmente, que la
conversión de L-lisina en ácido
L-pipecólico no pueda conseguirse o, incluso si
tiene lugar esta conversión, que el ácido
L-pipecólico no se acumule. Por tanto, con objeto de
conseguir la finalidad de la presente invención, es preferible usar
una combinación de sistemas enzimáticos derivados de diferentes
tipos de células (o microorganismos) según se ha descrito
anteriormente. Los microorganismos que tienen una combinación tal de
sistemas enzimáticos incluyen, aun cuando no se limita a ellos, el
Escherichia coli citado, en el que, por ejemplo, el gen
lat de F. lutescens que codifica LAT está introducido
en forma expresable; al revés, F. lutescens en el que el gen
proC de Escherichia coli está introducido; y
microorganismos huéspedes que pueden ser usados adecuadamente para
otra finalidad de la presente invención y en los que ambos genes
lat y proC han sido introducidos en forma expresable.
Cada uno de los genes puede ser introducido en el huésped por medio
de un plásmido recombinante, o puede ser integrado directamente en
un cromosoma del huésped, en forma expresable. Cuando se usa F.
lutescens como el huésped, existe la posibilidad de que este
microorganismo pueda metabolizar el ácido
L-pipecólico formado mediante otro camino
metabólico. Por consiguiente, puede ser necesario usar una variante
en la que esté bloqueado tal camino metabólico. Como el sistema
enzimático adecuado con la finalidad de convertir
L-lisina en ácido L-pipecólico,
según la presente invención, puede usarse convenientemente un
sistema enzimático construido usando Escherichia coli (que
sirve también como origen de proC en algunos casos), como el
huésped, e introduciendo en él al menos el gen lat de F.
lutescens, debido a la estabilidad del sistema, su facilidad de
tratamiento, su alta eficacia de conversión, y factores semejantes.
Además, cuando se usa Escherichia coli como el huésped,
puede introducirse un gen proC exógeno además del gen
lat. En especial, con la finalidad de facilitar la
incorporación del material de partida (es decir, la
L-lisina) en células bacterianas, es preferible
introducir un gen exógeno que codifique la enzima específica de
incorporación (o penetración) de Escherichia coli (al que se
alude también como un gen que participa en la incorporación de
lisina). Según la invención, tal gen es el gen (lysP) que
codifica una permeasa específica de lisina, y los genes (argT,
hisP e hisQ) que codifican proteínas que constituyen el
sistema LAO que participa en la incorporación de lisina, arginina y
ornitina. Por ejemplo, según J. Bacteriol., Vol. 174,
3242-3249, 1992, se ha sugerido que el
Escherichia coli en el que ha sido introducido el gen
lysP por medio de un plásmido de muchas copias, muestra un
aumento de 20 veces en el grado de incorporación de lisina.
Los sistemas descritos, que comprenden
combinaciones de sistemas enzimáticos o de genes, y que pueden ser
utilizados en la presente invención, pueden ser construidos o
preparados según técnicas que están relacionadas con la
citobiología, los cultivos celulares, la biología molecular, la
microbiología y DNAs recombinantes, y son usados comúnmente, per
se, por los expertos en la técnica. En cuanto a estas técnicas
puede hacerse referencia, por ejemplo, a Molecular Cloning - A
Laboratory Manual, 2ª Ed., compilada por Sambrook, Fritsch y
Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning,
Volúmenes I y II (D.N. Glover compilador, 1985); Oligonucleotide
Synthesis (M.J. Gait, compilador, 1984); Mullis et al.,
patente de EE.UU. No. 4.683.195; y Nucleic Acid Hybridization (B.D.
Hames y S.J. Higgins compiladores, 1984).
La construcción o preparación de sistemas
enzimáticos o de microorganismos que pueden ser usados,
preferiblemente, en la presente invención, se describe más
específicamente más adelante en asociación con realizaciones en las
que se usa Escherichia coli (al que se alude en lo sucesivo
de forma abreviada como E. coli). No obstante ha de
entenderse que la presente invención no está limitada por estas
realizaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden usarse adecuadamente cepas y vectores de
que se dispone en el comercio. Las realizaciones descritas en esta
memoria son tales que se usa como el huésped las cepas
Escherichia coli BL21 (DE3), Escherichia coli BL21 ó
Escherichia coli C600, y se usa como el vector un sistema pET
o pUC. Como otros vectores pueden usarse, preferiblemente, los
vectores que se ajustan a "Pautas para la Industrialización de
Tecnología de DNA Recombinante" (El Ministerio de Comercio e
Industria Internacional), Pauta, Sección 2, No. 3 2(2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificó LAT partiendo del sobrenadante del
cultivo de F. lutescens, cepa IFO 3084, mediante
cromatografía de hidrofobicidad, cromatografía de intercambio
iónico y cromatografía de permeabilidad de gel. La actividad
enzimática de LAT se midió mediante un método colorimétrico usando
o-aminobenzaldehído (Biochemistry, Vol. 7, páginas
4102-4109, 1968). Se determinó que el extremo amino
terminal de la LAT purificada, era KLLAPLAPLRAHAGTRLTQGL (SEQ ID
NO:26). Sobre la base de esta secuencia de aminoácidos, se diseñaron
cebadores mixtos y se usaron en PCR para amplificar fragmentos de
DNA de lat procedentes del DNA genómico de F.
lutescens, cepa IFO 3084. Luego, sobre la base de los
fragmentos de DNA obtenidos de este modo, se obtuvo el gen
lat entero de un tamaño aproximado de 1,6 Kbp, por PCR
inversa. La secuencia de DNA del lat y la secuencia de
aminoácidos de LAT se muestran en SEQ ID NO: 1 y 2. Para otros
detalles acerca de la clonación del gen lat, puede hacerse
referencia, si es necesario, a la solicitud de Patente Internacional
PCT/J99/04197, que es una solicitud de Patente en tramitación con
la presente solicitud.
Desde la secuencia de bases del gen lat
determinada de este modo, se prepararon el siguiente cebador de DNA
directo en el que una región en las proximidades del ATG del extremo
amino terminal del gen lat había sido alterada a un sitio
NdeI
| ETlaNdeF: | TCCATATGTCCCTTCTTGCCCCGCTCGCCC | (SEQ ID NO:.3). |
y el siguiente cebador de DNA inverso en el que
una región aguas abajo del codón de terminación del mismo había
sido alterada a un sitio BamHI
| ETlaBamR: | GCGGATCCTGTTGCCGCTGGTGCCGGGCAG | (SEQ ID NO 4). |
Usando estos cebadores, se llevó a cabo una PCR
para amplificar la región del gen lat de un tamaño aproximado
de 1,6 Kbp. Este fragmento amplificado se sometió a digestión con
las enzimas de restricción NdeI y BamHI para preparar
una solución de DNA de inserción. Por otra parte, el vector de
expresión pET11a (fabricado por Novagen) fue sometido a digestión
con las enzimas de restricción NdeI y BamHI, y se
sometió a una reacción de ligación con la solución de DNA de
inserción por medio del Ligation Kit, versión 2 (fabricado por
TaKaRa). El plásmido obtenido de este modo fue denominado pETlat. El
pETlat es un plásmido destinado a ocasionar la expresión de la
proteína natural de LAT. Con este plásmido se transformó E.
coli BL21(DE3) y la cepa resultante fue denominada cepa
E. coli BL21(DE3)pETlat.
\newpage
Seguidamente, el vector de expresión pET11a fue
reemplazado por pUC19, y se usó como huésped la cepa E.
coli BL21 Desde la secuencia de bases antes citada del gen
lat, se preparó el cebador de DNA directo siguiente, en el
que una región de las proximidades del ATG del extremo amino
terminal del gen lat había sido alterada a un sitio
HindIII
| lathiF19: | ATAAGCTTGTCCCTTCTTGCCCCGCTCGC | (SEQ ID NO:5) |
y se preparó el siguiente cebador de DNA inverso
en el que una región aguas abajo de su codón de terminación había
sido alterada a un sitio BamHI
| EtlaBamR: | GCGGATCCTGTTGCCGCTGGTGCCGGGCAG | (SEQ ID NO:4). |
Usando estos cebadores, se llevó a cabo una PCR
para amplificar la región del gen lat de un tamaño de 1,6
kbp aproximadamente. Este fragmento amplificado se sometió a
digestión con las enzimas de restricción HindIII y
BamHI para preparar una solución de DNA de inserción. Por
otra parte, el vector pUC19 fue sometido a digestión con las
enzimas de restricción HindIII y BamHI, y se sometió a
una reacción de ligación con la solución de DNA de inserción por
medio del Ligation Kit, versión 2 (fabricado por TaKaRa). El
plásmido obtenido de este modo fue denominado pUClat (véase la Fig.
1). El plásmido pUClat es un plásmido diseñado para ocasionar la
expresión de la proteína de fusión de Lat-LacZ. La
cepa E. coli BL21 fuetransformada con este plásmido y la
cepa resultante fue denominada cepa E. coli BL21pUClat.
Cuando cada una de las cepas E. coli
BL21(DE3)pETlat y E. coli BL21pUClat fue
cultivada en un medio de cultivo (Bactotriptona, 1,5%, extracto de
levadura, 3,0%, glicerina, 0,5%, pH 7) que contenía
L-lisina, se observó en ambos casos la acumulación
de ácido L-pipecólico en el medio de cultivo. Esto
significa que una enzima capaz de reducir el P6C formado a partir
de L-lisina mediante una reacción de transaminación
catalizada por LAT, se encuentra presente en el Escherichia
coli usado como huésped.
Se llevó a cabo una investigación para esta
enzima de reducción de P6C. De la información genética obtenida
sobre el genoma total de Escherichia coli se supuso que la
enzima de reducción de P5C reducía también el P6C. Después, se
investigó el papel desempeñado por el proC en la producción
del ácido L-pipecólico, usando la cepa RK4904 de
E. coli (obtenida del Centro del Stock Genético de E.
coli de la Universidad de Yale) que es una cepa mutante de
proC32 deficiente en proC. En primer lugar, con objeto
de examinar el efecto de proC (véase SEQ ID NO:5), se
intentó introducir el proC en pUClat. Se prepararon los
cebadores de DNA siguientes que tenían un sitio KpnI unido a
uno de sus extremos:
| procKpnF: | AGGGTACCATAAAATCGCGCATCGTCAGGC | (SEQ ID NO:8) |
| procKpnR: | CCGGTACCGCCACAGGTAACTTTACGGATT | (SEQ ID NO: 9) |
Usando estos cebadores se llevó a cabo una PCR
para amplificar un fragmento que contenía proC, de un tamaño
de 1,5 Kbp aproximadamente. Este fragmento amplificado de un tamaño
de 1,5 kbp aproximadamente, fue sometido a digestión con la enzima
de restricción KpnI para preparar una solución de DNA de
inserción. Por otra parte, el plásmido pUClat fue sometido a
digestión con la enzima de restricción KpnI, y se sometió a
una reacción de ligación con la solución de DNA de inserción por
medio del Ligation Kit, versión 2 (fabricado por TaKaRa). El
plásmido resultante en que estaban ligados lat y proC
así como que estaba orientado en sentido directo fue denominado
pUClatproC.
La cepa E. coli RK4904 fue transformada
con este plásmido y la cepa resultante fue denominada cepa E.
coli RK4904pUClatproC .
Además se preparó un plásmido que tenía solo
proC. Específicamente, el pUClatproC se sometió a digestión
con las enzimas de restricción BamHI y HindIII, se
hicieron romos los extremos mediante el Blunting Kit (fabricado por
TaKaRa), y se sometió a una reacción de autoligación. El plásmido
obtenido de este modo fue denominado pUCproC. La cepa E.
coli RK4904 se transformó con este plásmido y la cepa resultante
fue denominada cepa E. coli RK4904pUCproC. Cuando se
llevaron a cabo ensayos de producción de ácido
L-pipecólico usando la cepa E. coli
RK40904pUC19, la cepa E. coli RK4904pUClat, la cepa E.
coli RK4904pUCproC y la cepa. E. coli RK4904pUClatproC,
obtenidas de este modo, solamente la cepa E. coli
RK4904pUClatproC mostró la acumulación de ácido
L-pipecólico y las otras cepas no pusieron de
manifiesto producción de ácido L-pipecólico.
Estos resultados indican que el ácido
L-pipecólico es producido solamente cuando ambos
lat y proC están expresados en E. coli, y que
la P5C reductasa, que es una proteína codificada por proC,
reduce también al P6C. En lo que respecta al conocimiento de los
presentes inventores, no está descrita en la bibliografía
científica enzima alguna capaz de reducir el P6C, y la descripción
presente describe por vez primera una enzima tal.
Según la publicación antes citada, J.
Bacteriol., Vol. 174, 3242-3249, 1992, existe la
posibilidad de que el grado de incorporación de lisina en
Escherichia coli determine el grado de producción del ácido
L-pipecólico por el Escherichia coli. Ahora,
como se describe más adelante, se ensayó introducir el gen
LysP que codifica una permeasa específica de lisina, en el
plásmido pETlat. De la información genética sobre la secuencia del
gen lysP de Escherichia coli (véase lSEQ ID NO: 10 y
11), se prepararon los siguientes cebadores de DNA que tenían los
sitios BglII y BamHI unidos a uno de sus extremos:
| lysPBgBmF: | TGAGATCTGGATCCTGCGTGAACGCGGTTC | (SEQ ID NO:12) |
| lysPBgBmR: | GCAGATCTGGATCCCAGAAAGCCGGAACAG | (SEQ ID NO:13). |
Para la clonación de lysP, se llevó a
cabo una PCR usando estos cebadores para amplificar un fragmento de
un tamaño de 2,2 kbp, aproximadamente, que contenía el gen
lysP. Este fragmento amplificado de un tamaño de 2,2 kbp,
aproximadamente, se sometió a digestión con la enzima de restricción
BglII para preparar una solución de DNA de inserción. Por
otra parte se sometió a digestión pETlat con la enzima de
restricción BglII, y se llevó a cabo una reacción de
ligación con la solución de DNA de inserción mediante el Ligation
Kit, versión 2, (fabricado por TaKaRa). El plásmido construido de
este modo en el que lat y lysP están ligados de modo
que estén orientados en sentidos opuestos, fue denominado
pETlatLysP. La cepa E. coli BL21(DE3) fue
transformadao con este plásmido y la cepa resultante fue denominada
cepa E. coliBL21(DE3)pETlatLysP. Cuando se
realizaron ensayos de producción de ácido
L-pipecólico usando esta cepa E.
coliBL21(DE3)pETlatlysP y la cepa E.
coliBL21(DE3)pETlat (obtenida por transformación
con el pETlat preparado anteriormente), se confirmó que la cepa
E. coliBL21(DE3)pETlatlysP producía ácido
L-pipecólico en una cantidad tres veces mayor que
la cepa E. coliBL21(DE3)pETlat.
Además, el fragmento amplificado citado, de un
tamaño de 2,2 kbp, aproximadamente, se sometió a digestión con la
enzima de restricción BamHI para preparar una solución de DNA
de inserción. Por otra parte, se sometió a digestión el pUClat con
la enzima de restricción BamHI, y se llevó a cabo una
reacción de ligación con la solución de DNA de inserción por medio
del Ligation Kit, versión 2 (fabricado por TaKaRa). El plásmido así
construido en el que los genes lat y lysP están
ligados de modo que están orientados en sentido directo, fue
denominado pUClatlysP (véase la Fig. 1). Se transformó E.
coli BL21 con este plásmido y la cepa resultante se denominó
cepa E. coli BL21pUClatlysP. Cuando se llevaron a cabo
ensayos de producción de ácido L-pipecólico usando
esta cepa E. coli BL21pUClatlysP y la cepa E. coli
BL21pUClat, se confirmó que la cepa E. coli BL21pUClatlysP
producía ácido L-pipecólico en una cantidad tres
veces mayor que la cepa E. coli BL21pUClat. Así pues, cuando
se usa Escherichia coli como huésped, es deseable introducir
en él el gen lysP. La cepa E. coli BL21pUClatlysP,
según la presente invención, fue depositada el 20 de Diciembre de
1999 en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, la
Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial (1-3.
Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture,
Japón) y se la asignó el número de acceso FERM
P-17681. Después de esto, el depósito anterior fue
transferido al departamento internacional de depósito del instituto
bajo las estipulaciones del denominado Tratado de Budapest,
asignándole el número de acceso FERM BP-7326.
\vskip1.000000\baselineskip
Con objeto de mejorar la capacidad de producción
de ácido L-pipecólico de la cepa BL21pUClatlysP, se
intentó intensificar adicionalmente la actividad de lysP. El
proyecto de genoma de E. coli ha revelado la secuencia de
DNA de una región en torno a lysP. Esto indica que el gen
yeiE (véase SEQ ID NO:14 y 15) dispuesto en tándem con
lysP está presente sobre el lado aguas arriba de lysP.
De su secuencia de aminoácidos se sugiere que yeiE es una
secuencia reguladora de la transcripción de tipo lysR, que
está retenida con frecuencia en las bacterias. Puesto que se supuso
que este yeiE podría regular la transcripción de
lysP, era de esperar que la capacidad de producción de ácido
L-pipecólico pudiera mejorarse por integración de
ambos genes, yeiE y lysP en un plásmido, para
incrementar la transcripción de lysP e intensificar con ello
la capacidad de incorporación de L-lisina.
Se construyó el plásmido pUClatlysPL según se
describe a continuación.
Fueron preparados el cebador de DNA directo que
sigue, que tenía un sitio BglII unido a uno de sus
extremos.
- ATAGATCTCTTGTTGCCTAAAACCATCCCCAA
- (SEQ ID NO:16)
y el cebador de DNA inverso que sigue, que tenía
un sitio KpnI unido a uno de sus extremos
- GTGGTACCCCCCAGAAAGCCGGAACAGCCTC
- (SEQ ID NO:17).
Usando estos cebadores se llevó a cabo una PCR
para amplificar una región de un tamaño de 3 kbp, aproximadamente,
que contenía yeiE y lysP. Este fragmento amplificado
fue sometido a digestión con las enzimas de restricción
BglIII y KpnI para preparar una solución de DNA de
inserción. Por otra parte, el pUClatlysP fue digerido con las
enzimas de restricción BamHI y KpnI, y sometido a una
reacción de ligación con la solución de DNA de inserción por medio
del Ligation Kit, versión 2 (fabricado por TaKaRa). El plásmido así
obtenido fue denominado pUClatlysPL (véase la Fig. 1) E.
coli BL21 se transformó con este plásmido y la cepa resultante
fue denominada cepa E. coli BL21pUClatlysPL.
Es sabido que la expresión de lysP es
suprimida en concentraciones altas de lisina e inducida en
concentraciones bajas de lisina [J. Bacteriol. (1996), Vol. 178,
5522-5528]. Por consiguiente, se planeó introducir
un gen adicional que tomara parte en la incorporación de lisina en
células. Hasta ahora, es sabido que un sistema para la
incorporación de lisina, arginina y ornitina en células (es decir,
el sistema LAO) se encuentra presente en Escherichia coli
[Journal of Biological Chemistry, Vol. 265, páginas
1783-1786 (1990)]. Además, puesto que el gen
argT de Escherichia coli, esclarecido por el proyecto
de genoma, posee alta homología con el gen argT de
Salmonella typhimurium, que se ha indicado que participa en
el sistema LAO [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78, páginas
6038-6042 (1981)], era de esperar que el gen
argT de Escherichia coli, muy probablemente, tomara
parte en la incorporación de lisina.
Ahora, con objeto de examinar el efecto del gen
argT, se construyó el plásmido pUClatargT que tenía los
genes lat y argT integrados en él, según se describe a
continuación: Se prepararon los cebadores siguientes:
| argTkpnF: | TCGGTACCTCGACATTTTGTTTCTGCC | (SEQ ID NO:18) |
| argTkpnR: | ATGGTACCATAAAATTGACCATCAAGG | (SEQ ID NO:19) |
Usando estos cebadores y un molde que comprendía
el DNA genómico de Escherichia coli, se llevó a cabo una PCR
para amplificar argT. Las condiciones de reacción fueron
tales que un ciclo consistía en 98ºC/20 segundos, 60ºC/30 segundos
y 68ºC/1 minuto, y este ciclo se repitió 25 veces. Esta fragmento
amplificado, de 1,5 kbp aproximadamente, fue sometido a digestión
con la enzima de restricción KpnI e insertado en el sitio
KpnI del pUClatlysPL. Además, se inserto el gen de
resistencia a la tetraciclina en el sitio ScaI del plásmido
resultante. Específicamente, fueron preparados los cebadores
siguientes que tenían un sitio ScaI añadido a uno de sus
extremos:
| TetF: | TTAGTACTCTTATCATCGATAAGCTTTAAT | (SEQ ID NO: 20) |
| TetR: | GCAGTACTACAGTTCTCCGCAAGAATTGAT | (SEQ ID NO: 21) |
Usando estos cebadores y un molde que comprendía
el pBR322, se llevó a cabo una PCR para amplificar el gen de
resistencia a la tetraciclina. Este gen fue insertado en el sitio
ScaI presente en el gen de resistencia a la ampicilina del
pUClatlysPL, y el plásmido resultante fue denominado
pUClatlysPLargT-tet. Este plásmido fue introducido
en la cepa E. coli BL21 y la cepa resultante fue denominada
E. coli BL21pUClatlysPLargT-tet. La
secuencia de DNA y la secuencia de aminoácidos de argT están
indicadas en SEQ ID NO: 22 y 23.
\vskip1.000000\baselineskip
Según se ha descrito anteriormente, se ha
establecido un sistema de producción de ácido
L-pipecólico basado en la conversión de
L-lisina en ácido L-pipecólico
mediante el uso de una cepa de Escherichia coli que expresa
lat. En este sistema que usa una cepa recombinante de
Escherichia coli, se ha sugerido que, en algunos casos, la
incorporación de L-lisina en células determina el
grado de producción de ácido L-pipecólico. Por
consiguiente, puede ser deseable proporcionar una bacteria que
produzca ácido L-pipecólico, directo, que produzca
L-lisina por sí misma, y convertirla en ácido
pipecólico sin requerir la adición de L-lisina al
medio de cultivo. Este requisito puede conseguirse según la
estrategia siguiente. L-lisina es producida en
grandes cantidades por fermentación con Corynebacterium
glutamicum. Después, si puede integrarse el gen lat en
el plásmido pC2 [PLASMID, Vol. 36, 62-66 (1996)]
establecido como un sistema vector para C. glutamicum y este
plásmido pudiera ser introducido en la cepa de C. glutamicum
ATCC31831 para ocasionar la expresión de lat, la
L-lisina biosintetizada en sus células se convertirá
en P6C y este P6C se convertirá después en ácido pipecólico
mediante la acción de la
pirrolina-5-carboxilato reductasa
producida por la expresión de proC codificado en el genoma
de C. glutamicum. La validez de esta estrategia puede ser
comprobada, por ejemplo, llevando a cabo el experimento que
sigue.
Usando el plásmido antes citado, plásmido pC2,
se construyó el plásmido pClat para la expresión de lat
según se describe a continuación. Se prepararon los siguientes
cebadores de DNA directos
| ClatBamF: | GGGGTACCCATGTCCCTTCTTGCCCCGCT | (SEQ ID NO: 24) |
| ClatBamR: | GGGGATCCCGCGGCCTGTTGCCGCTGGT | (SEQ ID NO:25) |
Usando estos cebadores y un molde que comprendía
el DNA genómico de Flavobacterium lutescens, se llevó a cabo
una PCR para amplificar lat. Las condiciones de reacción
fueron tales que un ciclo consistía en 98ºC/20 segundos, y 68ºC/2
minutos, y este ciclo se repitió 25 veces. Este fragmento
amplificado, de aproximadamente 1,5 kbp, se sometió a digestión con
las enzimas de restricción KpnI y BamHI, y se ligó en
los sitios KpnI y BamHI de pC2 (Fig. 2). Este
plásmido pClat se introdujo en la cepa E. coli JM109. Usando
la cepa obtenida de este modo, se confirmó que tenía lugar la
conversión de L-lisina en ácido pipecólico, es
decir, que la cepa poseía actividad de LAT.
Seguidamente, se transformó C. glutamicum
con el pClat. Por ejemplo, se inoculó C. glutamicum en 3 ml
de medio L y se incubó a 32ºC durante 17 horas, con agitación. 30
\mul del cultivo resultante fueron inoculados en 3 ml de medio L
y se incubó a 32ºC durante 2,5 horas, con agitación. Después, se
añadió 1,5 \mul de una solución de penicilina G potásica (2
mg/ml) y se continuó la incubación durante 1,5 horas más, con
agitación. Se recogió la cantidad total de células, se lavó con 5 ml
de una solución de glicerina al 10% y se suspendió en 700 \mul de
una solución de glicerina al 10% para preparar una suspensión
electro-celular.0,2 \mul del plásmido disueltos
en una solución de TE (200 \mug/ml) se añadieron a 200 \mul de
la suspensión electro-celular y se sometió a
electroporación en condiciones que incluían 12,5 kV/cm, 25 \muF y
200 \Omega. Después se añadió 1 ml de medio L y esta mezcla se
incubó a 32ºC durante 2 horas, el cultivo resultante se extendió
sobre una placa de L que contenía 10 \mul/ml de kanamicina y se
incubó a 32ºC durante 3 días. Los transformantes deseados pueden
ser obtenidos seleccionando las colonias formadas de este modo.
Tal como se emplea en esta memoria, la expresión
"bacteria corineforme" comprende cualquier especie que
pertenece, típicamente, al género Corynebacterium, produce
L-lisina y cumple los fines de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, los genes o DNAs
que codifican las diversas enzimas anteriormente descritas, es
decir, el gen que codifica lisina
6-aminotransferasa, el gen que codifica
pirrolina-5-carboxilato reductasa,
el gen que codifica una enzima de incorporación específica de
lisina, y el gen que regular la transcripción de lysP,
comprenden también cualquiera de sus alteraciones, con tal que tales
alteraciones puedan hibridarse con los genes respectivos (véanse,
por ejemplo, las secuencias SEQ ID NO:12, SEQ ID NO.6/7; SEQ ID NO:
10/11, SEQ ID NO:14/15 y SEQ ID NO:22/23) en condiciones
restrictivas y los polipéptidos producidos por su expresión posean
las respectivas actividades enzimáticas deseadas.
Condiciones restrictivas son bien conocidas por
los expertos en la técnica y están descritas, por ejemplo, en el
manual de Sambrook et al., páginas 9.31-9.62
antes citado. Tales alteraciones pueden llevarse a cabo según
técnicas conocidas per se, tales como mutagénesis puntual,
mutagénesis dirigida al sitio y síntesis química, examinando, como
un índice, si las alteraciones tienen la deleción o adición de uno o
más aminoácidos que no son esenciales para la actividad enzimática
deseada o no ejercen influencia adversa sobre ella, o si poseen una
sustitución entre restos de aminoácidos que tienen una cadena
lateral similar, tales como restos de aminoácidos que poseen una
cadena lateral básica (lisina, arginina, histidina, etc), una cadena
lateral ácida (ácido aspártico, ácido glutámico, etc.), una cadena
lateral polar sin carga (glicina, asparagina, glutamina, serina,
treonina, tirosina, cisteína, etc.), una cadena lateral apolar
(alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,
metionina, triptófano, etc.), una cadena lateral ramificada en
\beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina, etc.) o una
cadena lateral aromática (por ejemplo, tirosina, fenilalanina,
triptófano, histidina, etc.). Además, la transformación de células
huésped con tales genes puede llevarse a cabo según los
procedimientos operatorios o los métodos anteriormente descritos,
que son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Con objeto de confirmar que el ácido pipecólico
que resulta tenía la configuración L, se empleó HPLC usando una
columna quiral (Agric. Biol. Chem., Vol. 52, páginas
1113-1116, 1988). Usando como columna una columna
DAICEL CHIRAL PAK WH (4,6 x 250 mm, fabricada por Daicel), y una
solución acuosa 0,25 mM de sulfato de cobre como fase móvil, se
llevó a cabo la HPLC con una temperatura de la columna de 50ºC y un
caudal de 1,0 ml/min. La detección se llevó a cabo por
espectrofotometría ultravioleta, con una longitud de onda de 243 nm.
En estas condiciones de la HPLC, el tiempo de retención del ácido
D-pipecólico es 11,5 minutos y el tiempo de
retención del ácido L-pipecólico es 15 minutos.
Cuando se analizó el ácido pipecólico producido mediante las cepas
recombinantes de Escherichia coli según la presente
invención, el tiempo de retención del ácido pipecólico producido de
este modo fue 15 minutos.
La presente invención se explica más
específicamente con referencia a los ejemplos que siguen.
En estos ejemplos, el ácido pipecólico se
determinó haciéndole reaccionar con dansilo y sometiéndolo luego a
cromatografía líquida de alta resolución (abreviada en lo sucesivo
como HPLC) al tiempo que se usaba prolina como patrón interno.
Específicamente, después de diluir 100 veces con agua destilada el
sobrenadante del cultivo, se hicieron pasar 10 \mul a un tubo
Eppen y se añadieron a éste 200 \mul de un tampón de carbonato de
litio 40 mM (pH 9,5) que contenía 5 \mug/ml de prolina y 100
\mul de una solución en acetonitrilo que contenía 3,0 mg/ml de
cloruro de dansilo. La mezcla resultante se agitó y se hizo
reaccionar en oscuridad, a temperatura ambiente, durante 2 horas.
Después de añadir 10 \mul de hidrocloruro de metilamina al 2%,
con agitación, el sobrenadante resultante se usó como una muestra
analítica. En cuanto a las condiciones analíticas para la HPLC, la
columna era la YMC-Pack ODS-A
A-303 (4,6 x 250 mm; fabricada por YMC), la fase
móvil era una solución de acetonitrilo al 33,2% que contenía
L-prolina 0,003M, sulfato de cobre 0,0015 M y
acetato amónico 0,0039 M (ajustada a pH 7 con solución acuosa de
amoniaco), la elución se llevó a cabo con un caudal de 0,8 ml/min y
a temperatura ambiente, y la detección se efectuó a una longitud de
onda de excitación de 366 nm y una longitud de onda de la
fluorescencia de 510 nm. En estas condiciones, el tiempo de
retención del ácido L-pipecólico fue 13
minutos.
Se llevaron a cabo ensayos de producción de
ácido L-pipecólico con respecto a la cepa E.
coli BL21pUClatlysP (FERM BP-7326), la cepa
E. coli BL21(DE3)pETlatlysP, la cepa E.
coli C600pUClatlysP y la cepa E. coli
BL21pUClatlysPL. Cada cepa fue inoculada en 3 ml de medio L (polipeptona, 1,0%; extracto de levadura, 0,5%; NaCl, 0,5%; glucosa, 0,1%; pH 7,2) que contenía 50 \mug/ml de ampicilina sódica, y se incubó a 32ºC durante la noche, con agitación. Los cultivos resultantes se usaron como cultivos semilla, y 275 \mul de cada cultivo semilla fueron inoculados en 27,5 ml de medio TB (glicerina, 0,44%; Bacto-triptona, 1,33%; extracto de Bacto-levadura, 2,67%; KH_{2}PO_{4}, 0,21%; K_{2}HPO_{4}, 1,14%) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina sódica, y se incubo a 32ºC durante 4,5 horas, con agitación. En el cultivo de un microorganismo formado con un vector pET, tal como el E. coli BL21(DE3)pETlatlysP. se añadieron 275 \mul de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 100 mM, con la finalidad de inducir lat, y la incubación se continuó a 32ºC durante un período adicional de 4 horas, con agitación. Por el contrario, cuando se usó un vector pUC, la adición de IPTG fue innecesaria. Seguidamente se añadieron a cada cultivo 500 \mul de hidrocloruro de L-lisina al 50% y 250 \mul de glicerina al 50%, disueltos en un tampón de fosfato (pH 6,8), y se continuó la incubación a 32ºC, con agitación. Además, 15 horas, 39 horas, 63 horas, 87 horas, 120 horas y 159 horas después de la adición del hidrocloruro de L-lisina, se añadieron 500 \mul de hidrocloruro de L-lisina al 50% y 500 \mul de glicerina al 50%, disueltos en un tampón de fosfato (pH 6,8). Se tomaron muestras de 100 \mul al cabo de 15 horas, 39 horas, 63 horas, 87 horas, 120 horas, 159 horas y 207 horas, y se determinó sus contenidos en ácido pipecólico por HPLC. Como resultado, todas las cepas habían acumulado ácido L-pipecólico en el medio de cultivo en las concentraciones siguientes:
BL21pUClatlysPL. Cada cepa fue inoculada en 3 ml de medio L (polipeptona, 1,0%; extracto de levadura, 0,5%; NaCl, 0,5%; glucosa, 0,1%; pH 7,2) que contenía 50 \mug/ml de ampicilina sódica, y se incubó a 32ºC durante la noche, con agitación. Los cultivos resultantes se usaron como cultivos semilla, y 275 \mul de cada cultivo semilla fueron inoculados en 27,5 ml de medio TB (glicerina, 0,44%; Bacto-triptona, 1,33%; extracto de Bacto-levadura, 2,67%; KH_{2}PO_{4}, 0,21%; K_{2}HPO_{4}, 1,14%) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina sódica, y se incubo a 32ºC durante 4,5 horas, con agitación. En el cultivo de un microorganismo formado con un vector pET, tal como el E. coli BL21(DE3)pETlatlysP. se añadieron 275 \mul de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 100 mM, con la finalidad de inducir lat, y la incubación se continuó a 32ºC durante un período adicional de 4 horas, con agitación. Por el contrario, cuando se usó un vector pUC, la adición de IPTG fue innecesaria. Seguidamente se añadieron a cada cultivo 500 \mul de hidrocloruro de L-lisina al 50% y 250 \mul de glicerina al 50%, disueltos en un tampón de fosfato (pH 6,8), y se continuó la incubación a 32ºC, con agitación. Además, 15 horas, 39 horas, 63 horas, 87 horas, 120 horas y 159 horas después de la adición del hidrocloruro de L-lisina, se añadieron 500 \mul de hidrocloruro de L-lisina al 50% y 500 \mul de glicerina al 50%, disueltos en un tampón de fosfato (pH 6,8). Se tomaron muestras de 100 \mul al cabo de 15 horas, 39 horas, 63 horas, 87 horas, 120 horas, 159 horas y 207 horas, y se determinó sus contenidos en ácido pipecólico por HPLC. Como resultado, todas las cepas habían acumulado ácido L-pipecólico en el medio de cultivo en las concentraciones siguientes:
- E. coli BL21pUClatlysP
- 10 g/l
- E. coli BL21(DE3)pETlatlysP
- 26 g/l
- E. coli C600pUClatlysP
- 0,8 g/l, y
- E. coli BL21pUClatlysPL
- 15 g/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Con objeto de esclarecer el papel de la P5C
reductasa en la producción de ácido L-pipecólico, se
examinó la capacidad de producir ácido L-pipecólico
con respecto a cuatro cepas recombinantes formadas usando como
huésped la cepa E. coli RK4904 deficiente en el gen
proC, a saber, la cepa E. coli RK4904pUC19, la cepa
E. coli RK4904pUClat, la cepa E. coli RK4904pUCproC y
la cepa E. coli RK4904pUClatproC. Cada cepa fue inoculada en
3 ml de medio L (polipeptona, 1,0%; extracto de levadura, 0,5%;
NaCl, 0,5%; glucosa, 0,1%; pH 7,2) que contenía 50 \mug/ml de
ampicilina sódica, y se incubó a 32ºC durante la noche, con
agitación. Los cultivos resultantes se usaron como cultivos
semilla, y 275 \mul de cada cultivo semilla fueron inoculados en
27,5 ml de medio TB (glicerina,
0,44%;Bacto-triptona, 1,33%;
Bacto-extracto de levadura, 2,67%; KH_{2}PO_{4},
0,21%; K_{2}HPO_{4}, 1,14%) que contenía 50 \mug/ml de
ampicilina sódica, y se incubo a 32ºC durante 8 horas, con
agitación. Después, se añadieron a esto 500 \mul de hidrocloruro
de L-lisina al 50%, y 500 \mul de glicerina al
50%, disueltos en un tampón de fosfato (pH 6,8), y la incubación se
continuó a 32ºC, con agitación. Se tomó una muestra de 100 \mul
al cabo de 40 horas y se determinó el contenido de ácido
L-pipecólico por HPLC. Como resultado de ello, solo
la cepa E. coli RK4904pUClatproC mostró acumulación de 0,765
g/l de ácido L-pipecólico, y las otras cepas no
mostraron acumulación de ácido pipecólico.
Se llevó a cabo una investigación sobre la
fuente de carbono del medio de cultivo, usando la cepa E.
coli
C600pUClatlysP. En cuanto a la composición del medio de cultivo, se emplearon medios de cultivo obtenidos sustituyendo la glicerina del medio TB (glicerina, 0,44%; Bacto-triptona, 1,33%; Bacto-extracto de levadura, 2,67%; KH_{2}PO_{4}, 0,21%; K_{2}HPO_{4}, 1,14%) por diversas fuentes de carbono. Como fuentes de carbono se examinaron glicerina, piruvato sódico, ácido cítrico, ácido propiónico, ácido maleico, ácido láctico y ácido DL-málico. 25 ml de cada medio de cultivo se colocaron en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se incubó a 32ºC, con agitación. La cantidad de ácido L-pipecólico acumulada al cabo de 24 horas de incubación fue, respectivamente, 4,8 g/l, 3,3 g/l, 2,8 g/l, 2,6 g/l, 3,5 g/l, 4,7 g/l y 4,7 g/l. Esto indica que pueden emplearse en la presente invención, ácidos orgánicos como fuentes de carbono.
C600pUClatlysP. En cuanto a la composición del medio de cultivo, se emplearon medios de cultivo obtenidos sustituyendo la glicerina del medio TB (glicerina, 0,44%; Bacto-triptona, 1,33%; Bacto-extracto de levadura, 2,67%; KH_{2}PO_{4}, 0,21%; K_{2}HPO_{4}, 1,14%) por diversas fuentes de carbono. Como fuentes de carbono se examinaron glicerina, piruvato sódico, ácido cítrico, ácido propiónico, ácido maleico, ácido láctico y ácido DL-málico. 25 ml de cada medio de cultivo se colocaron en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se incubó a 32ºC, con agitación. La cantidad de ácido L-pipecólico acumulada al cabo de 24 horas de incubación fue, respectivamente, 4,8 g/l, 3,3 g/l, 2,8 g/l, 2,6 g/l, 3,5 g/l, 4,7 g/l y 4,7 g/l. Esto indica que pueden emplearse en la presente invención, ácidos orgánicos como fuentes de carbono.
Cada una de las cepas E. coli
RK4904pUC19, E. coli RK4904pUClat, E. coli
RK4904pUCproC y E. coli
RK4904pUClatproC, fue inoculada en 3 ml de medio L que contenía 50 \mug/ml de ampicilina sódica, y se incubó a 32ºC durante la noche, con agitación. Los cultivos resultantes se usaron como cultivos semilla, y 275 \mul de cada cultivo semilla fueron inoculados en 50 ml de medio L que contenía 50 \mug/ml de ampicilina sódica, y se incubo a 32ºC durante 8 horas, con agitación. Después de centrifugar este cultivo, las células fueron lavadas con NaCl al 0,85% y se añadió 2 ml de BugBuster (Novagen). El sobrenadante resultante se usó como una suspensión de células desintegradas. A 100 \mul de cada suspensión de células desintegradas se añadió 1 ml de un tampón de fosfato 0,2 M (pH 7,2) que contenía L-lisina-HCl, 20 \mumol, ácido 2-cetoglutárico, 20 \mumol, fosfato de piridoxal, 0,075 \mumol y NADPH, 200 \mumol, seguido de reposo a 32ºC durante 15 horas. 5 \mul de cada una de las mezclas de reacción resultantes se depositaron como manchas en una placa de TLC (Merck Art. 13143), se desarrolló con un disolvente de desarrollo (1-butanol:ácido acético:agua (3:1:1) y luego se trató con ninhidrina para producir un color. Como resultado se observó una mancha de ácido L-pipecólico para la suspensión de células desintegradas de la cepa E. coli RK4904pUClatproC. Esto indica que, también en una reacción in vitro, se produce ácido L-pipecólico mediante la acción de LAT que se forma a partir del gen lat codificado sobre el plásmido y pirrolina-5-carboxilato reductasa formada a partir de proC.
RK4904pUClatproC, fue inoculada en 3 ml de medio L que contenía 50 \mug/ml de ampicilina sódica, y se incubó a 32ºC durante la noche, con agitación. Los cultivos resultantes se usaron como cultivos semilla, y 275 \mul de cada cultivo semilla fueron inoculados en 50 ml de medio L que contenía 50 \mug/ml de ampicilina sódica, y se incubo a 32ºC durante 8 horas, con agitación. Después de centrifugar este cultivo, las células fueron lavadas con NaCl al 0,85% y se añadió 2 ml de BugBuster (Novagen). El sobrenadante resultante se usó como una suspensión de células desintegradas. A 100 \mul de cada suspensión de células desintegradas se añadió 1 ml de un tampón de fosfato 0,2 M (pH 7,2) que contenía L-lisina-HCl, 20 \mumol, ácido 2-cetoglutárico, 20 \mumol, fosfato de piridoxal, 0,075 \mumol y NADPH, 200 \mumol, seguido de reposo a 32ºC durante 15 horas. 5 \mul de cada una de las mezclas de reacción resultantes se depositaron como manchas en una placa de TLC (Merck Art. 13143), se desarrolló con un disolvente de desarrollo (1-butanol:ácido acético:agua (3:1:1) y luego se trató con ninhidrina para producir un color. Como resultado se observó una mancha de ácido L-pipecólico para la suspensión de células desintegradas de la cepa E. coli RK4904pUClatproC. Esto indica que, también en una reacción in vitro, se produce ácido L-pipecólico mediante la acción de LAT que se forma a partir del gen lat codificado sobre el plásmido y pirrolina-5-carboxilato reductasa formada a partir de proC.
De modo semejante al
pUClatlysPLargT-tet, se construyó el plásmido
pUClatlysPL-tet introduciendo el gen de resistencia
a la tetraciclina en el sitio ScaI del pUClatlysPL- Usando
estos plásmidos se llevó a cabo la reacción de conversión que
sigue.
Cada uno de los cultivos semilla congelados de
dos células bacterianas, la cepa E. coli
BL21pUclatlysPLargT-tet y la cepa E. coli
BL21pUClatlysPL-tet, fue inoculado en medio L (3
ml/tubo de centrífuga) que contenía 25 \mug/ml de tetraciclina, y
se incubó a 32ºC durante 18 horas en un agitador rotatorio. Después
se inocularon 500 \mul de cada cultivo semilla en medio TB (27,5
ml/tubo de centrífuga) que contenía 25 \mug/ml de tetraciclina, y
se incubó a 32ºC durante 24 horas en un agitador rotatorio. Una vez
completada la incubación, la densidad óptica a 660 nm era 3,98 y
9,38 respectivamente. Se recogieron células desde cada uno de los
cultivos resultantes (4,71 ml y 2,00 ml, respectivamente). Después
de añadir 1 ml de un tampón de fosfato 25 mM (pH 6,8) a las células
recogidas, se añadieron 20 \mul de una solución de
L-lisina al 20% y 20 \mul de glicerina al 20%,
para iniciar la reacción de conversión a 32ºC. Dos horas, 7 horas y
24 horas después del comienzo de la reacción, se tomaron muestras
de 100 \mul y se determinaron por HPLC sus contenidos de ácido
pipecólico y de lisina.
Las cantidades de ácido pipecólico acumuladas
después de 2 horas, 7 horas y 24 horas de la reacción de conversión,
fueron 0,36 g/l, 0,73 g/l y 2,0 g/l, respectivamente, para la cepa
E. coli BL21pUClatlysPLarg/T-tet, y 0,88
g/l, 1,3 g/l y 1,4 g/l, respectivamente, para la cepa E. coli
BL21pUClatlysPL-tet. Así pues, el grado de
producción de ácido pipecólico de la cepa E. coli
BL21pUClatlysPL-tet disminuyó gradualmente,
mientras que la cepa E. coli
BL21pUClatlysPLarg-tet mantuvo un grado de
producción de ácido pipecólico casi constante, aun cuando su grado
de producción de ácido pipecólico era algo inferior. Este grado de
producción de ácido pipecólico se corresponde exactamente con el
grado de consumo de lisina. El papel del gen argT en la
producción de ácido pipecólico fue confirmado por estos resultados
experimentales.
Se llevó a cabo un ensayo de cultivo con
respecto a la cepa de una bacteria corineforme transformada con el
gen lat, a saber, la cepa C. glutamicum ATCC31831
pClat. Como testigo se ensayó también, del mismo modo, la cepa
C. glutamicum ATCC31831pC2 que tenía un plásmido exento de
lat. Después de cultivar estas dos cepas en placas de agar
para formar colonias, estas colonias fueron inoculadas en tubos de
ensayo en los que se habían colocado 3 ml de medio L que contenía
20 \mug/ml de kanamicina, y se incubó a 32ºC durante 18 horas en
un agitador rotatorio. 275 \mul de cada uno de los cultivos
resultantes fueron inoculados en matraces Erlenmeyer en los que se
habían colocado 27,5 ml de medio TB que contenía 20 \mug/ml de
kanamicina y se incubó a 32ºC en un agitador rotatorio. Cinco
horas, 15 horas, 39 horas y 63 horas después del comienzo de la
incubación se añadieron porciones de 550 \mul de glicerina al 50%
disuelta en un tampón de fosfato (pH 6,8). La incubación se
interrumpió 135 horas después del comienzo de la adición de la
glicerina y se determinó por HPLC el contenido de ácido pipecólico
del sobrenadante del cultivo. Como resultado, la cepa C.
glutamicum ATCC31831pClat había acumulado 0,7 g/l,
aproximadamente, de ácido pipecólico en 135 horas después de la
primera adición de glicerina. Por otra parte, el testigo (la cepa
C. glutamicum ATCC31831pC2) no mostró acumulación de ácido
pipecólico. Esto indica que el gen lat introducido por medio
de un plásmido, es expresado también en la bacteria corineforme y
que la pirrolina-5-carboxilato
reductasa (gen proC) de la bacteria corineforme reduce el
P6C convertido partiendo de lisina, por la acción de LAT, y produce,
con ello, ácido pipecólico.
<110> MERCIAN CORPORATION
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la producción biológica
de ácido L-pipecólico
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 12526EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 00 985 861.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-12-22
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 11/373389
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-12-28
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2663
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Flavobacterium lutescens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (798)..(2276)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 493
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Flavobacterium lutescens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1837
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (581)..(1387)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2186
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (525)..(2991)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 489
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1269)..(2147)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1295
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (228)..(1007)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 260
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia
Artificial:Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
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<211> 21
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<212> PRT
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<213> Flavobacterium lutescens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
Claims (11)
1. Un procedimiento de producción de ácido
L-pipecólico que comprende la etapa de reducir ácido
delta-1-piperideina-6-carboxílico
mediante el uso de
pirrolina-5-carboxilato
reductasa.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la pirrolina-5-carboxilato
reductasa procede de Escherichia coli o de una bacteria
corineforme.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1
ó 2, en el que el ácido
delta-1-piperideina-6-carboxílico
se obtiene mediante la etapa de conversión de
L-lisina por el uso de lisina
6-aminotransferasa.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3,
en el que la lisina 6-aminotransferasa procede de
Flavobacterium lutescens.
5. Un procedimiento según la reivindicación 3
ó 4, en el que la etapa de reducción del ácido
delta-1-piperideina-6-carboxílico
y la etapa de conversión de L-lisina en ácido
L-pipecólico por el uso de lisina
6-aminotransferasa, son llevadas a cabo mediante el
uso de una cepa de Escherichia coli o una bacteria
corineforme que poseen
pirrolina-5-carboxilato reductasa,
y transformadas con un gen que codifica lisina
6-aminotransferasa.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5,
en el que la cepa de Escherichia coli o una bacteria
corineforme, contiene, al menos, un gen seleccionado entre el grupo
que consiste en un gen exógeno que codifica
pirrolina-5-carboxilato reductasa y
un gen exógeno que participa en la incorporación de lisina, en el
que el gen que participa en la incorporación de lisina es un gen
que codifica una permeasa específica de lisina o los genes que
codifican proteínas constituyen el sistema LAO que participa en la
incorporación de lisina, arginina y ornitina.
7. Un procedimiento según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que se usa una cepa recombinante
de Escherichia coli o una bacteria corineforme, que contiene
un gen que codifica lisina 6-aminotransferasa en
forma expresable.
8. Una cepa recombinante de Escherichia
coli o una bacteria corineforme, que contiene un gen que
codifica lisina 6-aminotransferasa en forma
expresable y que contiene, además, en forma expresable, al menos un
gen seleccionado entre el grupo que consiste en un gen exógeno que
codifica pirrolina-5-carboxilato
reductasa y un gen exógeno que participa en la incorporación de
lisina, en el que el gen que participa en la incorporación de
lisina es un gen que codifica una permeasa específica de lisina o
los genes que codifican proteínas que constituyen el sistema LAO
que participa en la incorporación de lisina, arginina y
ornitina.
9. Una cepa recombinante de Escherichia
coli según la reivindicación 8, en la que el gen que participa
en la incorporación de lisina es un gen que codifica una permeasa
específica de lisina.
10. Una cepa recombinante de Escherichia
coli o una bacteria corineforme según la reivindicación 8, en
la que el gen que participa en la incorporación de lisina es un gen
que codifica una permeasa específica de lisina y que contiene,
además, una secuencia que codifica un factor de regulación de la
transcripción dispuesto en tándem sobre su lado aguas arriba.
11. Un procedimiento de producción de ácido
L-pipecólico, que comprende las etapas de cultivar
la cepa recombinante de Escherichia coli o una bacteria
corineforme según la reivindicación 8 ó 10, en un medio que contiene
L-lisina y recolectar el ácido
L-pipecólico acumulado en el cultivo que
resulta.
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