ES2315221T3 - Cepas atenuadas del virus del dengue y su utilizacion en una composicion vaccinea. - Google Patents
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Abstract
Cepa aislada atenuada del serotipo 1 del virus del Dengue, designada con la referencia 16007 PDK 13 y depositada en la CNCM con la referencia I-2480.
Description
Cepas atenuadas del virus del Dengue y su
utilización en una composición vaccínea.
La invención se refiere al campo de los virus
del Dengue y, más particularmente, a cepas atenuadas del virus del
Dengue, así como a una composición vacunal que comprende al menos
una de estas cepas.
El Dengue, así como su forma grave, la fiebre
hemorrágica, es una enfermedad tropical de origen viral. El virus
responsable forma parte de la familia de los Flaviviridae (género
Flavivirus), que comprende igualmente el virus de la fiebre
amarilla así como el de la encefalitis japonesa. Se conocen 4
serotipos susceptibles de provocar el Dengue. Aunque esta
enfermedad está actualmente en progresión en el mundo, actualmente
no hay ninguna vacuna disponible comercialmente. En efecto, para
poder proponer con todas las garantías de prevenir eficazmente el
Dengue, una vacuna debe, presentando garantías de inocuidad, ser
capaz de inducir en el individuo al que se administra una respuesta
del sistema inmunitario susceptible de protegerlo durante una
contaminación posterior con virus salvajes. Ahora bien, hasta el
momento, ninguna de las vacunas candidatas estudiadas ha presentado
todas las cualidades nece-
sarias.
sarias.
Por lo tanto, existe una necesidad de disponer
de cepas del virus del Dengue suficientemente atenuadas para poder
administrarse con total seguridad a los seres humanos y
principalmente a los niños, conservando un poder de infección y un
carácter inmunógeno suficientes para inducir una respuesta
inmunitaria que permita una prevención de la enfermedad.
Con el fin de conseguir este objetivo, la
invención propone una cepa aislada atenuada del serotipo 1 del virus
del Dengue, designada con la referencia 16007 PDK 13 y depositada
en la CNCM del Instituto Pasteur de París con la referencia
I-2480.
La invención tiene igualmente por objeto una
cepa aislada atenuada del serotipo 2 del virus del Dengue, designada
con la referencia 16881 PDK 53 y depositada en la CNCM del
Instituto Pasteur de París con la referencia
I-2481.
La invención tiene igualmente por objeto una
cepa aislada atenuada del serotipo 3 del virus del Dengue, designada
con la referencia 16562 PGMK 30-FrhL 3 y depositada
en la CNCM del Instituto Pasteur de París con la referencia
I-2482.
La invención tiene también por objeto una cepa
aislada atenuada del serotipo 4 del virus del Dengue, designada con
la referencia 1036 PDK 48 y depositada en la CNCM del Instituto
Pasteur de París con la referencia I-2483.
La invención tiene igualmente por objeto una
composición vacunal que comprende al menos una cepa atenuada del
virus del Dengue elegida entre las cepas siguientes: la cepa
I-2480, la cepa I-2481, la cepa
I-2482 y la cepa I-2483 o una cepa
que se deriva de una de ellas.
La invención tiene igualmente por objeto la
utilización de una cepa atenuada del virus del Dengue elegida entre
las cepas siguientes: la cepa I-2480, la cepa
I-2481, la cepa I-2482 y la cepa
I-2483 o cualquier cepa derivada de ellas para la
fabricación de una composición vacunal.
La invención tiene igualmente por objeto un
método de inmunización contra el Dengue, según el cual se administra
a adultos o a niños, una composición vacunal que comprende al menos
una cepa atenuada del virus del Dengue elegida entre las cepas
siguientes: la cepa I-2480, la cepa
I-2481, la cepa I-2482 y la cepa
I-2483 o una cepa derivada de
ellas.
ellas.
Todas las cepas de virus según la presente
invención se han obtenido a partir del suero de pacientes que han
padecido el Dengue en el Sudeste Asiático. Los aislamientos se
propagaron en células de mamíferos y se inocularon por vía
intratorácica (IT) a mosquitos del ganado (Toxorhynchites o
Aedes aegypti). Esta etapa permitió eliminar virus
contaminantes eventuales que no sean arbovirus; en efecto, sólo los
arbovirus migran a nivel de las glándulas salivares del mosquito
después de una administración intratorácica; por lo tanto fue
preciso separar la cabeza del resto del cuerpo del mosquito y
triturarla para obtener la cepa viral purificada.
A continuación, los virus de los serotipos 1, 2
y 4 se propagaron en células primarias de riñón de perro (PDK), a
32ºC, cada 5 a 10 días, mientras que el virus del serotipo 3 se
atenuó por propagación en células de riñón de mono (PGMK) y se
cultivó en células pulmonares de fetus Rhesus (FRhL).
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Las cepas atenuadas que se obtienen tienen las
características siguientes:
- -
- Cuando se efectúan titulaciones en células de mamíferos, por ejemplo en células LLC-MK2 que son células procedentes de riñón de mono, las cepas atenuadas dan lugar a halos de lisis pequeños comparativamente con las cepas parentales de las que derivan.
- -
- En los ratoncillos recién nacidos, cuando se inoculan por vía intracerebral, tienen una virulencia baja.
- -
- En el mono, cuando se inoculan por vía subcutánea, provocan una viremia baja (incluso no detectable).
- -
- Son sensibles a una temperatura cercana a 40ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
En los términos de la presente invención, se
entiende por cepa derivada de las cepas que son el objeto de los
depósitos de la CNCM I-2480, I-2481,
I-2482 y I-2483, las cepas virales
obtenidas a partir de estas cepas, pero que se han sometido a
propagaciones adicionales en células permisivas a los virus,
conservando las propiedades mencionadas anteriormente.
La cepa 16007, del serotipo 1, se aisló en 1964
de un paciente afectado de Dengue asociado a un síndrome de choque
en Tailandia. El suero virémico original se propagó en cultivos de
tejido antes de inocularse en el mosquito Toxorhynchites
amboinensis. A continuación, el virus obtenido se propagó en
células PGMK para preparar la siembra viral madre. La siembra se
propagó en células PDK, hasta 43 veces. La cepa obtenida después de
13 propagaciones en células PDK presenta todas las características
de atenuación para una utilización vacunal; la que forma el objeto
del depósito I-2480 efectuado en la CNCM.
Aunque esta cepa sea la preferida para la
composición vacunal según la invención, es totalmente posible
utilizar una cepa derivada de ella y principalmente una cepa que se
haya sometido a algunas propagaciones adicionales en células PDK o
una cepa que se haya cultivado posteriormente en células que la
permitan conservar su carácter inmunógeno sin disminuir su carácter
virulento. Así, podrían convenir igualmente las cepas que se hayan
cultivado en células VERO. Se considera que cualquier cepa derivada
de la cepa I-2480 forma parte de la presente
invención.
La cepa 16681, del serotipo 2, se aisló de un
paciente que representaba un caso fatal de Dengue en Tailandia en
1964. Esta cepa se propagó 2 veces en los mosquitos
Toxorhynchites amboinensis y una vez en células de riñón de
mono para producir la siembra madre. La cepa 16681 PDK 53 que es
conveniente para los fines de la invención y que es objeto del
depósito I-2481 efectuado en la CNCM, se obtuvo
después de 53 propagaciones sucesivas semanales en células PDK.
Aunque esta cepa sea la preferida para la
composición vacunal según la invención, es totalmente posible
utilizar una cepa derivada de ella y principalmente una cepa que se
haya sometido a algunas propagaciones adicionales en células PDK o
una cepa que se haya cultivado posteriormente en células que la
permitan conservar su carácter inmunógeno sin disminuir su carácter
virulento. Así, podrían convenir igualmente las cepas que se hayan
cultivado en células VERO. Se considera que cualquier cepa derivada
de la cepa I-2481 forma parte de la presente
invención.
La cepa 16562, del serotipo 3, se aisló de un
paciente afectado de Dengue en Manila en 1972. Se atenuó por 30
propagaciones sucesivas en células PGMK y se cultivó en células
FRhL. La cepa vacunal 16562 PGMK 30 FRhL 3, objeto del depósito
I-2482 efectuado en la CNCM y que es conveniente
para los fines de la invención, se sometió a 3 propagaciones
sucesivas en células FRhL después de las 30 propagaciones en células
PGMK. Aunque esta cepa sea la preferida para la composición vacunal
según la invención, es totalmente posible utilizar una cepa
derivada de ella y principalmente una cepa que se haya sometido a
algunas propagaciones adicionales en células PGMK o FRhL o una cepa
que se haya cultivado posteriormente en células que la permitan
conservar su carácter inmunógeno sin disminuir su carácter
virulento. Así, podrían convenir igualmente las cepas que se hayan
cultivado en células VERO. Se considera que cualquier cepa derivada
de la cepa I-2482 forma parte de la presente
invención.
La cepa 1036, del serotipo 4, se aisló de un
niño afectado de Dengue clásico en Indonesia. Esta cepa se atenuó
por propagaciones sucesivas en células PDK. La cepa 1036 PDK 48, que
es conveniente para los fines de la invención y que es objeto del
depósito I-2483 efectuado en la CNCM, se propagó 48
veces en células PDK.
Aunque esta cepa sea la preferida para la
composición vacunal según la invención, es totalmente posible
utilizar una cepa derivada de ella y principalmente una cepa que se
haya sometido a algunas propagaciones adicionales en células PDK o
una cepa que se haya cultivado posteriormente en células que la
permitan conservar su carácter inmunógeno sin disminuir su carácter
virulento. Así, podrían convenir igualmente las cepas que se hayan
cultivado en células VERO. Se considera que cualquier cepa derivada
de la cepa I-2483 forma parte de la presente
invención.
Las cepas según la invención se utilizan para la
preparación de composiciones vacunales. Estas composiciones
vacunales pueden ser composiciones monovalentes, bivalentes,
trivalentes o tetravalentes en el sentido en el que pueden
comprender de 1 a 4 serotipos del virus del Dengue. Pueden
comprender igualmente otros antígenos vacunales, lo que permite
vacunar simultáneamente contra varias enfermedades.
En cada uno de estos casos, la cantidad de virus
de cada uno de los serotipos se determina de manera que la dosis
administrada induce una producción de anticuerpos neutralizantes
frente al serotipo administrado, sin dar lugar sin embargo a
reacciones secundarias indeseables. Se han obtenido buenos
resultados gracias a vacunas monovalentes que contienen 10^{3}
pfu/ml cuando se trata del serotipo 4 y 10^{3} a 10^{4} pfu/ml
cuando se trata de los demás serotipos.
Se han realizado igualmente ensayos con vacunas
bivalentes obtenidas por mezcla simple de 0,5 ml de cada uno de los
serotipos 1 y 2, o bien 1 y 4, o bien 2 y 4. Como se ha descrito en
el artículo de Bhamarapravati y Yoksan (1989) "Study of
bivalent vaccine in volunteers", Lancet, 1077, todas las
composiciones vacunales se han revelado inmunógenas y sin peligro,
dando lugar a una tasa de seroconversión del 100% para cada una de
las formulaciones ensayadas.
De la misma forma, una vacuna trivalente
obtenida por mezcla de 0,33 ml de cada uno de los serotipos 1, 2 y
4 se ha ensayado igualmente en pacientes y ha dado lugar a una tasa
de seroconversión del 100% como se ha descrito por Natth
Bhamarapravati y SuteeYoksan en "The clinical trial of
trivalent Dengue vaccine", 1990, Southeast Asian Journal of
Tropical Medicine and Public Health, Vol 21 (4) p. 709.
Se ha preparado igualmente una formulación
tetravalente por mezcla de las formulaciones monovalentes y se ha
obtenido una composición que ha dado lugar a una seroconversión del
100% de los sujetos vacunados.
Según un modo particular de la invención, la
composición vacunal puede administrarse igualmente en 2 dosis, que
pueden ser, bien dosis complementarias si se consideran los
serotipos que contienen o bien dosis idénticas destinadas a
administrarse 2 veces.
La inoculación de una vacuna monovalente o que
contiene varios serotipos de Dengue a voluntarios previamente
inmunes contra el Dengue no está acompañada de ninguna anomalía y
principalmente de efectos secundarios indeseables como podría
preverse cuando se refiere a la hipótesis de los anticuerpos
facilitantes. Esta hipótesis elaborada por Halstead en los años 60
precisa que un factor de riesgo del Dengue hemorrágico era la
aparición de un Dengue secundario en sujetos que presentan
anticuerpos facilitantes obtenidos durante una primera infección.
En otros términos, la aparición del Dengue hemorrágico parece
deberse a 2 infecciones sucesivas por 2 serotipos diferentes del
virus del Dengue. En las investigaciones realizadas con la vacuna,
un determinado número de voluntarios estaban preinmunizados frente
a un virus del Dengue. Después de la vacunación, no aparecieron
efectos secundarios superiores en frecuencia y en intensidad
comparativamente con sujetos seronegativos.
Además, se ha constatado que después de la
administración de la 1ª dosis de una composición según la invención,
la administración de una 2ª dosis se toleraba perfectamente bien y
daba lugar en los sujetos que no habían tenido una respuesta frente
a los 4 serotipos, a una complementación de la respuesta
inmunitaria, es decir, a una respuesta de anticuerpos contra los
serotipos frente a los que la respuesta era negativa durante la 1ª
dosis.
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Los ejemplos siguientes ilustran algunos modos
particulares de realización de la presente invención.
Ejemplo
1
Se dispone de la cepa 16681 PDK 53 obtenida por
propagaciones sucesivas en las células PDK y preparada en albúmina
humana a una concentración del 3,5%. La suspensión viral se
centrifuga a 1.050 g durante 1 hora a 0-4ºC. El
sobrenadante se filtra mediante filtros 0,22 \mum y se reparte en
ampollas de 1 ml que se almacenan a -80ºC. La titulación viral de
la vacuna candidata va de 2 a 5x10^{4} pfu/ml en células
LLC-MK2. Los ensayos de control de calidad se
realizaron según las monografías aplicables para las vacunas virales
vivas atenuadas y se vio que eran satisfac-
torios.
torios.
Las dosis destinadas a administrarse por vía
subcutánea, se preparan mezclando 2 dosis de 1 ml, siendo la mitad
para la inmunización y la otra mitad para la determinación de la
titulación viral.
La población objeto del ensayo está constituida
por 10 adultos de sexo masculino que habitan en la provincia de
Lampoon en Tailandia. Su edad está comprendida entre 18 y 30 años.
Los exámenes clínicos, bioquímicos y hematológicos permiten
concluir un buen estado de salud, con la excepción de algunos casos
que presentan una infestación de parásitos intestinales con una
eosinofilia baja a moderada. De los 10 voluntarios, 5 no presentan
ningún signo serológico de una infección precedente con Dengue o
Encefalitis japonesa, cuando los ensayos realizados son ensayos de
neutralización y de reducción de halos de lisis (PRNT para Ensayos
de Neutralización por Reducción del Halo de Lisis) o ensayos de
inhibición de la hemaglutinación (HI para Inhibición de la
Hemaglutinación). Los otros 5 voluntarios mostraron respuestas PRNT
positivas al virus de la encefalitis japonesa (JEV para Virus de la
Encefalitis Japonesa).
Después de la administración de la vacuna
candidata, los voluntarios se examinan regularmente durante 21
días.
Se efectúan tomas de sangre en los días
siguientes: J0, J6, J10, J14, J18, J21, J30, J60, J180, 1 año y 1
año 1/2 después de la inmunización. En las muestras sanguíneas
recogidas, se efectúan ensayos de aislamiento del virus,
dosificaciones serológicas, así como análisis bioquímicos y
hematológicos.
Los resultados del ensayo son los
siguientes.
Ninguno de los voluntarios presentó reacciones
secundarias graves, tales como una temperatura elevada, hemorragias,
hipotensión u otras. En la mitad de los voluntarios se observaron
reacciones ligeras, tales como dolores de cabeza y dolores
abdominales.
En lo que concierne a los análisis químicos,
durante el estudio no se constató ninguna anormalidad.
Los análisis hematológicos mostraron que el
número total de glóbulos blancos disminuyó en todos los voluntarios
aproximadamente en J10 para volver a los valores normales en J14 o
más tarde. Sin embargo, no apareció leucopenia verdadera. En el
mismo momento, se pudo observar una linfocitosis, una monocitosis y
una formación de linfocitos atípicos.
Por otra parte, en 6 de los 10 voluntarios, se
observó la presencia de plaquetas gigantes sin trombocitopenia.
La titulación de la vacuna inoculada mostró que
los voluntarios recibieron entre 1,9 y 2,7 10^{4} pfu/ml. Se
constató una viremia en uno de los voluntarios en J10, después de
amplificación en LLC-MK2 y C6/36. El virus
detectado formaba halos de lisis pequeños y no se extendía a
37,9ºC.
Las dosificaciones inmunológicas y
principalmente los ensayos PRNT muestran que todos los voluntarios
desarrollaron una respuesta de anticuerpos contra el serotipo 2 del
Dengue. Los resultados se presentan en la tabla 5 siguiente.
Aunque no aparece en la tabla, se remarcó que
determinados voluntarios desarrollaron igualmente una respuesta
contra otros serotipos del Dengue; en los voluntarios que
presentaban, antes del ensayo, anticuerpos contra la encefalitis
japonesa, se observó una respuesta contra los 4 serotipos del
Dengue, siendo sin embargo la respuesta contra el serotipo 2 la más
importante.
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Los voluntarios 1, 2, 4, 5 y 10 (5 primeras
líneas) son los 5 voluntarios que no presentan anticuerpos contra
la encefalitis japonesa antes de la inoculación del presente ensayo,
mientras que los voluntarios 3, 6, 7, 8 y 9 son los que no
presentaban anticuerpos contra el Dengue pero que poseían
anticuerpos contra la encefalitis japonesa.
Esta tabla pone de manifiesto el hecho de que la
tasa de anticuerpos neutralizantes está en su máximo alrededor de
J21-J30 y que estos anticuerpos persisten en el
tiempo.
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Ejemplo
2
Se dispone de la cepa 16007, aislada de un
paciente, que se ha sometido a un determinado número de
propagaciones en células PDK. Por lo tanto, se obtienen las cepas
correspondientes con diferentes niveles de atenuación, que se
administran por vía subcutánea a voluntarios Tailandeses, en forma
de una dosis de 1 ml.
Los resultados obtenidos en términos de
seroconversión 6 meses después de la fecha de inoculación se reúnen
en la Tabla 6 siguiente:
En este ensayo, se considera que hay
seroconversión cuando aparecen anticuerpos neutralizantes con una
titulación superior a 1/10.
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Estos resultados muestran que la tasa de
seroconversión es relativamente baja cuando las cepas se propagan
de 20 a 43 veces en células PDK. En cambio, su reactogenicidad era
igualmente baja, lo que es favorable. Si la cepa está muy atenuada
ha perdido en parte su poder inmunógeno.
Después de 13 propagaciones, lo que corresponde
a la cepa I-2480 objeto del depósito efectuado en la
CNCM, la vacuna candidata presenta siempre una reactogenicidad
mínima, pero en cambio la tasa de seroconversión después de la
administración de una única dosis es el 78%.
Se administra una segunda dosis 1 mes después de
la 1ª a 2 voluntarios que no se han seroconvertido con la cepa
16007 PDK 13; después de esta 2ª dosis, la tasa de seroconversión es
el 100%.
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Ejemplo
3
Se dispone de la cepa 16562 que se ha atenuado
por 30 propagaciones en células PGMK y se cultivó por 3
propagaciones en células FRhL; esta cepa es objeto del depósito
efectuado en la CNCM con el Nº I-2482.
Administrada a 4 voluntarios, da lugar a un
episodio de fiebre de 38,5ºC en uno de ellos. Entre los voluntarios
inmunizados, 3 se seroconvirtieron después de la 1ª dosis; el
voluntario que no se seroconvirtió recibió una segunda dosis 1 mes
después de la 1ª y se seroconvirtió igualmente.
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Ejemplo
4
Se dispone de la cepa 1036 que se atenuó por 48
propagaciones sucesivas en células PDK. Esta cepa es objeto del
depósito CNCM Nº I-2483. Formulada en forma vacunal,
se administra a 5 voluntarios y muestra una reactogenicidad mínima
para una tasa de seroconversión del 100%.
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Ejemplo
5
A partir de vacunas monovalentes tales como las
descritas en los ejemplos anteriores, se preparan vacunas
bivalentes. Se preparan así dosis de 1 ml mezclando 0,5 ml de cada
una de las vacunas monovalentes 1 y 2, 1 y 4, así como 2 y 4. Las
vacunas obtenidas se administran a voluntarios de la misma forma que
las vacunas monovalentes. Los resultados obtenidos son
particularmente satisfactorios ya que las formulaciones vacunales
son seguras y dan lugar a una seroconversión del 100 % de los
sujetos inmunizados desde la 1ª inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
A partir de las vacunas monovalentes de los
ejemplos 1, 2 y 4, se prepara una vacuna trivalente, en forma de
dosis de 1 ml obtenida mezclando 0,33 ml de las vacunas monovalentes
de los ejemplos anteriores. Administrada a voluntarios masculinos
de 19 a 35 años, esta vacuna trivalente da lugar a una
seroconversión de todos los sujetos inmunizados desde la 1ª
inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una vacuna tetravalente a partir de
las composiciones monovalentes de los ejemplos 1 a 4 anteriores.
La composición de la dosis vacunal se indica en
la tabla 7 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta composición se administró a 14 voluntarios,
entre los que algunos tenían un estado inmunológico sin activar
frente a los Flavivirus mientras que otros presentaban ya
anticuerpos anti-Flavivirus antes de la
administración de la vacuna candidata. Sin embargo,
independientemente del estado inmunológico previo, todos los
voluntarios se seroconvirtieron durante la administración de una
única dosis de la vacuna candidata según la invención. Durante este
ensayo, se observaron algunas reacciones secundarias ligeras en los
sujetos vacunados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se dispone de una composición vacunal
tetravalente. La población objeto del ensayo es una población de
niños que tienen de 1 a 14 años; está segmentada de la forma
siguiente: niños entre 10 y 14 años, niños entre 5 y 9 años y niños
entre 1 año y 4 años. Se utilizan diferentes dosis y diferentes
formulaciones. Se inmunizan aproximadamente 169 niños. En el grupo
de 5 a 9 años, con dosis que van de 4.000 a 6.000 pfu, se obtiene
una tasa de seroconversión de casi el 80%. Se observan reacciones
clínicas ligeras que consisten en fiebre (38ºC) y erupción durante
1 a 2 días en aproximadamente el 1% de los inmunizados.
A 22 niños que recibieron una 1ª dosis de 1.350
pfu/ml, se les administra después de 6 meses una 2ª dosis que va de
1.300 a 3.000 pfu/ml y se obtiene una fuerte respuesta inmunitaria.
Se observa en 20 sujetos la presencia de anticuerpos neutralizantes
contra los 4 serotipos. Estos resultados confirman el interés de la
administración de una segunda dosis.
Claims (10)
1. Cepa aislada atenuada del serotipo 1 del
virus del Dengue, designada con la referencia 16007 PDK 13 y
depositada en la CNCM con la referencia I-2480.
2. Cepa aislada atenuada del serotipo 2 del
virus del Dengue, designada con la referencia 16881 PDK 53 y
depositada en la CNCM con la referencia I-2481.
3. Cepa aislada atenuada del serotipo 3 del
virus del Dengue, designada con la referencia 16562 PGMK
30-FrhL 3 y depositada en la CNCM con la referencia
I-2482.
4. Cepa aislada atenuada del serotipo 4 del
virus del Dengue, designada con la referencia 1036 PDK 48 y
depositada en la CNCM con la referencia I-2483.
5. Composición vacunal que comprende al menos
una cepa atenuada del virus del Dengue según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores.
6. Composición vacunal que comprende al menos
una cepa atenuada del virus del Dengue derivada de una cepa según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Composición vacunal que comprende al menos
una cepa de cada uno de los serotipos 1 a 4 del virus del Dengue,
siendo las cepas las cepas atenuadas según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 o las cepas derivadas de éstas.
8. Composición vacunal según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, caracterizada porque está destinada
a administrarse en 2 dosis.
9. Composición vacunal según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, caracterizada porque está destinada
a administrarse por inyección subcutánea, en 2 dosis separadas por
un intervalo de tiempo de al menos 1 mes.
10. Utilización de al menos una de las cepas
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación
de una composición vacunal contra el Dengue.
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