ES2315255T3

ES2315255T3 - Utilizacion de trombopoyetina como medicamento para la terapia y la prevencion de trombocitopenia.

Info

Publication number: ES2315255T3
Application number: ES01123002T
Authority: ES
Inventors: Griffith R. Thomas
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-01-25
Filing date: 1997-01-13
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2017-01-13
Also published as: DK0876152T3; ATE216257T1; ES2175333T3; DE69739050D1; US5879673A; EP0876152A1; EP0876152B1; EP1201246B1; JP2000504325A; AU711639B2; DE69712036D1; ATE411039T1; CA2242417A1; EP1201246A3; PT876152E; WO1997026907A1; DE69712036T2; EP1201246A2; AU1533597A; DK1201246T3

Abstract

Uso de una trombopoyetina para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un mamífero que padece trombocitopenia o que está en riesgo de padecerla, caracterizado porque el medicamento se administra en forma de dos dosis terapéuticas en un único día, en donde la citada dosis terapéutica oscila entre 0,5 y 1,5 mug/kg cada una, en una administración en dos dosis, sin tratamiento suplementario con trombopoyetina, o en forma de una única dosis terapéutica, sin tratamiento suplementario con trombopoyetina, en donde la trombocitopenia es generada por quimioterapia o radioterapia.

Description

Utilización de trombopoyetina como medicamento para la terapia y la prevención de trombocitopenia.

La presente solicitud, y la materia contenida en la misma, está relacionada con la siguiente solicitud de patente y con su contenido: solicitud de patente internacional PCT/US94/14550, depositada el 28 de diciembre de 1994 (publicada bajo número WO95/18858, el 13 de julio de 1995).

Campo de la invención

La presente solicitud está relacionada con un nuevo uso para la trombopoyetina y con los isoformos y derivados biológicamente activos de la misma, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la trombocitopenia. Se contempla la co-administración de los citados materiales, conjuntamente con una citoquina, en especial, con un factor estimulador de colonia o con una interleukina. El medicamento va destinado al tratamiento de un mamífero que padece, o que esta en riesgo de padecer, trombocitopenia, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del(de los) citado(s) material(es) al mamífero que precise del citado tratamiento.

Antecedentes de la invención

El sistema hematopoyético produce las células sanguíneas maduras altamente especializadas, conocidas por resultar necesarias para la supervivencia de los mamíferos. Entre las citadas células maduras se incluyen los eritrocitos, especializados en el transporte de oxígeno y dióxido de carbono, los linfocitos T- y B-, responsables de las respuestas inmunes mediadas por anticuerpo y por célula, las plaquetas o trombocitos, especializados en la formación de coágulos sanguíneos, y los granulocitos y los macrófagos, especializados como barredores y como células accesorias para combatir la infección. La totalidad de estas células sanguíneas maduras especializadas proceden de un único tipo de células primitivas comunes, identificadas como las células madres pluripotentes, encontradas principalmente en la médula ósea.

Las células sanguíneas altamente especializadas maduras tienen que ser producidas en grandes cantidades de forma continua, a lo largo de toda la vida del mamífero. La inmensa mayoría de estas células sanguíneas especializadas están destinadas a permanecer funcionalmente activas durante un período de tiempo que oscila entre tan solo unas horas y semanas. Por consiguiente, la renovación continua de estas células sanguíneas maduras, la de las propias células madre primitivas, al igual que la de cualquier intermedio o linaje, la de las líneas celulares de progenitor comprometidas, alineadas entre las células maduras y las maduras, resulta necesaria con vistas a mantener las necesidades normales continuas de células sanguíneas para la continuidad de la vida del mamífero.

En el corazón del sistema hematopoyético se encuentran las células madre pluripotentes. Estas células resultan ser relativamente pequeñas en número y sufren una auto-renovación a través de la proliferación, para generar células madre hijas, o las mismas se transforman, en una serie de pasos de diferenciación, en células progenitoras restringidas por linaje maduras, formando en última instancia la(s) célula(s) madura(s) altamente especializada(s).

El principio subyacente del sistema celular hematopoyético normal parece residir en la reducida capacidad para la auto-renovación a medida que se pierde la multipotencia y se adquiere madurez y restricción por linaje. Por consiguiente, en un extremo del espectro celular hematopoyético se encuentra la célula madre pluripotente, que posee la capacidad de auto-renovación y de diferenciación en la totalidad de las diversas células progenitoras comprometidas, de linaje específico. En el otro extremo del espectro se encuentran los progenitores de linaje altamente restringido y su progenie, los cuales ha perdido la capacidad de auto-renovarse, pero han adquirido la actividad funcional madura.

La proliferación y el desarrollo de células madre y de células progenitoras restringidas por linaje se controla a través de una diversidad de factores de crecimiento o citoquinas. Por consiguiente, los factores de crecimiento hematopoyéticos pueden influir en el crecimiento y en la diferenciación de uno o más linajes, pueden solaparse con otros factores de crecimiento, afectando a una única línea general o pueden actuar sinérgicamente con otros factores.

Se apreciará, a partir de lo indicado anteriormente, que podría resulta interesante disponer de factores de crecimiento que afecten a la supervivencia, a la proliferación, a la diferenciación o a la maduración de cualquiera de las células madres de los predecesores de las mismas, especialmente cuando se trata de ayudar al restablecimiento de un sistema hematopoyético reducido, provocado por enfermedad o después de terapia de radiación o de quimioterapia.

Las plaquetas son elementos críticos del mecanismo de formación de coágulos en la sangre. La reducción del nivel de plaquetas en circulación, denominada trombocitopenia, tiene lugar y se manifiesta por medio de diversas dolencias y trastornos clínicos. La trombocitopenia clínica se define habitualmente como una dolencia en la que el contaje de plaquetas está situado por debajo de aproximadamente 150 x 10^{9} por litro. Las principales causas de trombocitopenia pueden ser ampliamente divididas en tres categorías, en base a la duración de la vida de la plaqueta. En particular: 1) producción dificultada de plaquetas por parte de la médula ósea, por ejemplo, trombocitopenia generada por terapia de radiación o quimioterapia (2) secuestro de plaquetas en el bazo (esplenomegalia) y 3) destrucción incrementada de plaquetas en la circulación periférica, por ejemplo, trombocitopenia provocada por trastornos autoinmunes. Adicionalmente, en pacientes que reciben grandes volúmenes de productos sanguíneos pobres en plaquetas, administrados de forma rápida, se puede desarrollar la trombocitopenia debido a factores de dilución. En Schafner. "Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Disfunction", Internal Medicine, John J. Hutton et al., Eds. Little, Brown & Co., Boston/Toronto/Londol, Third Ed. (1990), al igual que en la solicitud de de patente Nº. PCT/US94/14553 (publicación internacional Nº PCT/US94/14553 (Publicación Internacional Nº. WO95/18858, mencionada anteriormente.

El planteamiento terapéutico para el tratamiento de pacientes con trombocitopenia es el que dicta la gravedad y la urgencia de la situación clínica. El tratamiento es similar tanto para la trombocitopenia relacionada con HIV, como para la no asociada con HIV y, a pesar de que se han utilizado un número diferente de planteamientos terapéuticos, la terapia permanece clínicamente controvertida.

De acuerdo con lo indicado anteriormente, los expertos en la materia valorarán el hecho de que una de las vías para tratar la trombocitopenia pasaría por obtener un agente que fuese capaz de acelerar la diferenciación y la maduración de megacariocitos, o de precursores de los mismos, hacia la forma productora de plaquetas. Se han efectuado esfuerzos considerables para identificar tales agentes. Uno a los que se hacen continuas referencias es la trombopoyetina (TPO), el objeto de la presente solicitud. Entre la relación de otros nombres encontrados habitualmente en la literatura se incluyen: el factor estimulador de trombocitopoyesis (TSF); el factor estimulador de colonias de megacariocitos (MK-CSF); el factor de desarrollo y de crecimiento de megacariocitos, el factor estimulador de megacariocitos, el factor potenciador de megacariocitos y el ligando mpl.

La ya citada solicitud de patente PCT/US94/14553 describe la identificación, el aislamiento, la producción y el uso de una proteína que favorece la maduración y la proliferación megacariocitopoyética en mamífero aislada, denominada el "ligando MPL" (ML) o, más habitualmente, "trombopoyetina" (TPO), acerca de la cual se ha averiguado que resulta capaz de estimular la proliferación, la maduración y/o la diferenciación de megacariocitos hacia la forma madura productora de plaquetas.

La atención se dirige también hacia las solicitudes de patente WO95/26746, WO95/21919 y WO95/21920.

La solicitud PCT/US94/14553 incluye diversos aspectos de realizaciones asociadas con TPO, incluyendo un procedimiento para el tratamiento de un mamífero que padece, o que está en riesgo de padecer, un trastorno hematopoyético, especialmente trombocitopenia, que comprende la administración al mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de materiales TPO. Opcionalmente, la TPO es administrada como tal o en combinación con una citoquina, especialmente con un factor estimulador de colonias o interleukina. A los efectos descritos en la citada solicitud de patente internacional, la TPO se define de forma amplia, incluyendo la propia TPO o diversas variantes, derivados o isoformas de la misma, incluyendo fragmentos que comparten al menos una propiedad biológica en común con la TPO intacta, para el tratamiento de la trombocitopenia. El término "propiedad biológica", cuando se utiliza conjuntamente con la definición de los diversos materiales TPO útiles, tal y como se describe en la citada solicitud, significa que existe actividad trombocitopénica o una función efectora o una actividad antigénica in vivo, provocada, o llevada a cabo, directa o indirectamente, por el material TPO.

En relación con el uso terapéutico de materiales trombopoyetina, tal y como se describe en la citada solicitud de patente internacional PCT/US94/14553, los materiales TPO se describen en la misma para la administración, en mezcla con un soporte farmacéuticamente aceptable, a través de cualquiera de diversos modos de administración. El régimen diario es descrito como oscilante entre aproximadamente 0,1 y 100 \mug/kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y 50 \mug/kg de peso corporal, preferiblemente a una dosis inicial que oscila entre aproximadamente 1 y 5 \mug/kg por día. De forma implícita dentro de lo que se describe en la citada solicitud, se hace referencia a un régimen de administración de la citada dosis a lo lago de un periodo que oscila entre diversos y muchos días, con posterioridad a un estado proyectado o real de contaje reducido de plaquetas.

Estudios clínicos publicados de trombopoyetina administrada clínicamente indican una dosis y un régimen de administración que comprende la administración de trombopoyetina, de forma subcutánea, a dosis de entre 0,03 y 5,0 \mug/kg de peso corporal, por día, a lo largo de un período de diez días, para una dolencia marcada por la trombocitopenia. Ver Abstract 1977, Blood (1995). Ver también Abstracts 1012, 1014 y 1978, Blood 86 (1995).

De forma similar, el compuesto epoetina alfa, el cual corresponde a un nombre otorgado a la eritropoyetina (comercializada como Epogen por Amgen, Inc.), es una glicoproteína indicada para la estimulación de la producción de glóbulos rojos. Se hace referencia a una dosis y a un régimen de administración que comprende dosis de partida a lo largo de la banda comprendida entre 150 y 300 unidades por kg, tres veces por semana durante un período de muchas semanas, con vistas a estimular la proliferación de glóbulos rojos en pacientes que sufren de una reducción de los mismos, sin importar como la misma se haya generado.

El filgastrim, comercializado por Amgen Inc como Neupogen, es un factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF). Su régimen indicado es la administración de entre 5 a 10 \mug/kg, por vía subcutánea, diariamente durante dos semanas.

En base a esta evidencia anecdótica, el régimen convencional en la administración de materiales para la proliferación de glóbulos rojos u otras células sanguíneas para invertir los efectos de la trombocitopenia, se basa en la administración de cantidades terapéuticamente eficaces del material biológico diariamente, durante un período de muchos días, a pacientes que precisan de la citada terapia, después de un episodio que ha dado lugar a una trombocitopenia.

Para la conveniencia de los doctores, y en especial de los pacientes, existe un objetivo de desarrollar regímenes de dosificación/administración alternativos de los citados materiales biológicos, los cuales resulten ventajosa y terapéuticamente equivalentes o superiores a la hora de invertir los efectos de la trombocitopenia.

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Resumen de la invención

La presente invención se basa en el sorprendente e inesperado descubrimiento de que materiales trombopoyetina biológicamente activos pueden producir efectos terapéuticos mediante la administración de una dosis única, o de múltiples dosis bajas, de una cantidad terapéuticamente eficaz a un paciente que padezca o que tenga necesidad de tratamiento frente a trombocitopenia.

La presente invención va dirigida a la materia definida en las reivindicaciones. En su aspecto preferido, la presente invención va dirigida a la administración única de una cantidad terapéuticamente eficaz.

A través del término "múltiple-baja", en conexión con la dosificación, se quiere dar a entender la administración de múltiples dosis de cantidades terapéuticamente eficaces a lo largo de un corto período de tiempo, el cual se ha averiguado en el presente documento, resulta independiente del inicio de la respuesta terapéutica, a saber, incrementa los niveles de producción de plaquetas. Por consiguiente, como práctica fundamental, la presente invención se dirige a la mera administración única de una cantidad terapéuticamente eficaz de una trombopoyetina. Se ha averiguado que el referido régimen de administración produce un efecto terapéutico equivalente al realizado cuando una cantidad terapéuticamente eficaz del mismo material es administrada a lo largo del régimen de administración múltiple convencional de muchos días de duración sugerido y descrito en el estado de la técnica
existente.

Se da por entendido el hecho de que se ha averiguado que una administración única de una trombopoyetina a un paciente resulta terapéuticamente eficaz para el tratamiento de la trombocitopenia. En el presente caso, se ha averiguado que una dosis única estimula el inicio de la respuesta terapéutica.

Se ha averiguado, de acuerdo con la presente invención, que el régimen de administración única de la presente invención resulta eficaz a dosis relativamente bajas del orden de aproximadamente 0,1 a 10, preferiblemente de aproximadamente 0,3 a 10, más preferiblemente de entre aproximadamente 0,5 y 10, todavía mas preferiblemente de entre aproximadamente 0,5 y 5 \mug/kg de peso corporal del paciente. En régimen de dosificación única, resultaría preferida la administración de entre aproximadamente 2 \pm 1,5 \mug/kg de peso corporal. En un régimen de dosificación múltiple baja de dos dosis terapéuticas en un único día, resultaría preferida la administración de entre aproximadamente 0,5 y 1,5 \mug/kg de peso corporal, por dosis. Las dosis indicadas anteriormente pueden ser predicadas en la administración intravenosa preferida. En administración a través de la ruta subcutánea, la cantidad total administrada estaría comprendida en la banda de entre uno y tres veces la cantidad administrada a través de la ruta intravenosa, preferiblemente aproximadamente 2 veces.

La frecuencia de dosis y el régimen óptimos serán determinados por el médico presente, tomando en consideración diversos factores conocidos por modificar la acción de fármacos, incluyendo la gravedad y el tipo de enfermedad, el peso corporal, el sexo, la dieta, la hora y vía de administración, otras medicaciones y otros factores clínicos relevantes. De acuerdo con la presente invención, el régimen de la presente invención comprenderá la administración única de un material trombopoyetina en la banda amplia que oscila entre aproximadamente 0,1 y 100 \mug/kg de peso corporal, preferiblemente una dosis dentro de la banda comprendida entre aproximadamente 0,1 y 50 \mug/kg de peso corporal. Muy preferiblemente, la presente invención se basa en el inesperado resultado de que una administración única de una dosis que oscila entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,0, más preferiblemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5 \mug/kg, produce un efecto terapéutico que resulta terapéuticamente equivalente a la administración de la misma cantidad de material o de una cantidad superior a lo largo de un régimen que conlleva la administración diaria a lo largo de varios días, por encima de una semana o más.

Los materiales trombopoyetina biológicamente activos de la presente invención pueden ser administrados, de acuerdo con lo que se indica en el presente documento, a través de diversas rutas, incluyendo la vía nasal o la pulmonar, la subcutánea y, preferiblemente, la intravenosa. En todos los casos, en función de cual sea la ruta de administración, los materiales trombopoyetina biológicamente activos son preferiblemente administrados en combinación con un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable. Cuando se administra de modo sistemático, la composición terapéutica debe estar exenta de pirógenos y en forma de solución parenteralmente aceptable, habida cuenta de la isotonicidad a pH fisiológico y la estabilidad. Estas condiciones resultan ser generalmente bien conocidas y aceptadas por los expertos en la materia.

Brevemente, formulaciones en dosis de los materiales de la presente invención se preparan para almacenamiento o administración mediante el mezclado del compuesto que presenta el grado de pureza deseado con soportes, excipientes y/o estabilizadores fisiológicamente aceptables. Los citados materiales son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácido orgánico; antioxidantes, tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular, tales como poliarginina, proteínas tales como sueroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes azucarados , tales como manitol o sorbitol; contra-iones tales como sodio y/o tensoactivos no iónicos, tales como Tween, Pluronics o polietilenglicol.

Los materiales trombopoyetina biológicamente activos del presente documento pueden ser administrados en forma de ácido libre, en forma de base o como sus sales farmacéuticamente aceptables y son formulados con un vehículo, soporte, excipiente, aglutinante, conservante, estabilizador, agente aromatizante, etc., de acuerdo con lo que se describe en la práctica farmacéutica aceptada.

Las composiciones estériles para inyección pueden ser formuladas según la práctica farmacéutica o farmacológica convencional. Por ejemplo, puede desearse la disolución o la suspensión del material activo en un vehículo tal como agua, o aceite vegetal de origen natural, como aceite de sésamo, de cacahuete, de semilla de algodón, o un vehículo graso sintético, tal como etiolato o similar. De nuevo, tampones, conservantes, anti-oxidantes y similares pueden ser incorporados según la práctica farmacéutica aceptada. Los materiales trombopoyetina biológicamente activos de la presente invención pueden ser utilizados en solitario o ser administrados en combinación con otras citoquinas, hematopoyetinas, interleukinas, factores de crecimiento, o anticuerpos, en el tratamiento de los trastornos y dolencias identificadas anteriormente, marcadas por la trombocitopenia. Por lo tanto, los presentes materiales activos pueden ser utilizados en combinación con otras proteínas o péptidos marcados por la trombocitopenia. Por lo tanto, los actuales materiales activos pueden ser utilizados en combinación con otras proteínas o péptidos que tienen actividad trombopoyética, incluyendo: G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-2, IL-3, eritropoyetina (EPO), kit de ligando, IL-6, IL-11, ligando FLT-3 y etcétera.

Entre los ejemplos de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, las cuales se presentan en forma de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles [por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), tal y como se describe en Langer et al., J. Biomed., Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tec.., 12: 98-105 (1982) o poli(vinilalacohol)], poliactidas (patente US nº. 3.779.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer et al., supra), copolímeros ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como Lupron-Depot® (microesferas inyectables compuestas de copolímero ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988).

Si bien los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas a lo largo de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando proteínas encapsuladas permanecen en el organismo durante un largo período de tempo, las mismas pueden ser desnaturalizadas o acumuladas como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de la actividad biológica y a posibles cambios en la inmunogenecidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización de proteínas, en función de cual es el mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de acumulación reside en la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio disulfuro, la estabilización puede ser lograda mediante la modificación de los restos sulfidrilo, liofilización a partir de soluciones ácidas, control del contenido en humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matriz polimérica en desarrollo.

Las composiciones de proteína trombopoyética de liberación sostenida incluyen también proteína megacariocitopoyética atrapada en liposomas. Los liposomas que contienen proteína megacariocitopoyética se preparan a través de procedimientos conocidos per se: DE 3.218.121; Epstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 82: 3688-3698 [1985]: Hwang et al. Proc. Natl. Acad. Ci. USA, 77: 4030-4034 [1980]; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes US nºs. 4.485.045 y 4.544.545, y EP 102.324. Ordinariamente, los liposomas son de tipo unilamelar pequeño (aproximadamente entre 200 y 800 Angstroms), en los cuales el contenido en lípidos es superior a aproximadamente 30% mol. de colesterol, siendo la proporción correcta ajustada para la óptima terapia de proteína megacariocitopoyética.

Un tipo de modificación covalente de TPO o de ligando mpl comprende la unión de polipéptido TPO a uno de entre una diversidad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma expuesta en las patentes US nºs. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Los polipéptidos TP unidos covalentemente a los polímeros mencionados anteriormente son identificados en el presente documento como TPO pegilada.

Se apreciaré el hecho de que para seleccionar la variante óptima para la unión a un mpl y poder disponer de la actividad biológica y/o inmunológica definida anteriormente hará falta llevar a cabo algún tipo de cribado de la variante de TPO recuperada. Se puede efectuar un cribado para determinar la estabilidad en cultivo celular recombinante o en plasma (por ejemplo, frente a la rotura proteolítica), la elevada afinidad para un componente mpl, la estabilidad oxidativa, la capacidad de ser secretada en rendimientos elevados y similares. Por ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico del polipéptido TPO, tal como la afinidad para un determinado anticuerpo, se mide mediante a través de un inmunoensayo de tipo competitivo. Otras potenciales modificaciones de las propiedades de la proteína o del polipéptido, tales como la estabilidad redox o térmica, la hidrofobicidad o la susceptibilidad frente a la degradación proteolítica son ensayadas a través de procedimientos conocidos en el estado de la técnica.

Se da por entendido que la presente invención va dirigida a todos los aspectos asociados y a las realizaciones abarcadas dentro de la invención descrita en el presente documento. Estos y otros detalles que les conciernen y la presente invención en general, forman parte de la continua descripción de la presente invención en la forma descriptiva más detallada que se muestra más adelante.

Breve descripción de los gráficos

Figura 1- Animales convertidos en pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación \gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía subcutánea con 0,1 \mug rmTPO(335), durante 1, 2, 4 u 8 días. El panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de tratamiento, mientras que los paneles B y C representan, respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada en el panel B se refiere a los tres paneles.

Figura 2- Animales convertidos en pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación \gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía subcutánea con una dosis única, a varios niveles, de rmTPO(335), 24 horas después del inicio del experimento. El panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de tratamiento, mientras que los paneles B y C representan, respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada en el panel B se refiere a los tres paneles.

Figura 3- Representaciones log. lineales de las respuestas proporcionadas por las plaquetas (panel A) y por los eritrocitos (panel B) frente a administraciones únicas de rmTPO(335), proporcionadas ya sea por medio de vía subcutánea o intravenosa, en animales convertidos en pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación \gamma y carboplatino (1,2 mg). Los números de células representadas gráficamente son los que se han medido el día 14 después del inicio del experimento. \Phi es el nivel cero de base.

Figura 4- Animales convertidos en pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación \gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía subcutánea con una dosis única, a varios niveles, de rmTPO(335), 24 horas después del inicio del experimento. El panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de tratamiento, mientras que los paneles B y C representan, respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada en el panel B se refiere a los tres paneles.

Figura 5- Animales convertidos en pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación \gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía subcutánea con una dosis única, 24 horas después del inicio del experimento, con varias formas de rmTPO(153) conjugada con polietilenglicol (peg) de o bien 20K ó 40K de peso molecular. El panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de tratamiento, mientras que los paneles B y C representan, respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada en el panel B se refiere a los tres paneles.

Figura 6- Animales convertidos en pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación \gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía subcutánea con una dosis única, 24 horas después del inicio del experimento, con, o bien rmTPO(335) ó rmTPO(153), conjugadas con polietilenglicol (peg) de 40K de peso molecular. El panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de tratamiento, mientras que los paneles B y C representan, respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada en el panel B se refiere a los tres paneles.

Figura 7- Animales convertidos en pancitopénicos, mediante una combinación de 5,0 Gy de irradiación \gamma y carboplatino (1,2 mg), fueron inyectados por vía subcutánea con una dosis única, 24 horas después del inicio del experimento, con, o bien rmTPO(335) ó rmTPO(153), conjugadas con polietilenglicol (peg) de 40K de peso molecular. El panel A muestra la respuesta plaquetaria frente a los regímenes de tratamiento, mientras que los paneles B y C representan, respectivamente, las respuestas de los eritrocitos y de los leucocitos a lo largo de un período de 28 días. La leyenda mostrada en el panel B se refiere a los tres paneles.

Descripción detallada Definiciones

El término "citoquina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediador celular. Constituyen ejemplos de tales citoquinas las linfoquinas, las monoquinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Incluidas entre las citoquinas figuran la hormona del crecimiento, los factores de crecimiento de tipo insulina, la hormona del crecimiento humana, incluyendo la hormona de crecimiento humana N-metionílica, la hormona del crecimiento bovina, la hormona paratiroidea, la tiroxina, la insulina, la proinsulina, la relaxina, la prorrelaxina, hormonas glicoproteínicas, tales como la hormona estimuladora del folículo (FSH), la hormona estimuladora de la tiroides (TSH) y la hormona leutinizante (LH), el factor de crecimiento hematopoyético, el factor de crecimiento hepático, el factor de crecimiento de fibroblasto, la prolactina, el lactógeno placentario, el factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha y TNF-\beta), la sustancia inhibidora mulleriana, el péptido asociado a gonadotropina de ratón, la inhivina, la activina, el factor de crecimiento endotélico, la integrina, factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-\beta, factores I y II de crecimiento de tipo insulina, la eritropoyetina (EPO), los factores osteoinductores, los interferones (IFN), tales como el interferon-\alpha, -\beta y -\gamma, los factores estimuladores de colonias (CSFs), tales como el macrófago-CSF (M-CSF), el granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) y el granulocito-CSF (G-CSF), interleukinas (IL's), tales como IL-1, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF, SCF, ligando FLT-3 y ligando-kit (KL). Tal y como se utilizan en el presente documento, los términos anteriores intentan incluir proteínas procedentes de fuentes de tipo natural o procedentes de cultivos celulares recombinantes. De forma similar, los términos pretenden incluir equivalentes biológicamente activos, por ejemplo, que difieren en la secuencia de aminoácidos en uno o más aminoácidos o en el tipo o la extensión de la glicosilación.

El término "biológicamente activo", cuando se utiliza conjuntamente con trombopoyetina (TPO) significa trombopoyetina o un polipéptido trombopoyetina que muestra actividad trombopoyética o comparte una función efectora del ligando mpl aislado a partir de plasma porcino aplástico o expresado en cultivos celulares recombinantes. Una función efectora principal conocida del mpl y estimuladora de la incorporación de nucleótidos marcados (^{3}H-timidina) en el DNA de células Ba/F3 dependientes de IL-3, transfectadas con mplP de origen humano. Otra función efectora conocida del ligando mpl o del polipéptido del presente documento, es la capacidad para estimular la incorporación de ^{35}S en plaquetas circulantes, en un ensayo rebote con plaqueta de ratón. Todavía otra función efectora del ligando mpl es la capacidad de estimular la megacariocitopoyesis humana in vitro, la cual puede ser cuantificada por medio de la utilización de un anticuerpo monoclonal radiomarcado específico para la glicoproteína megacariocito GPII_{b}III_{a}.

Los términos "ligando mpl", "polipéptido ligando mpl", "ML", "trombopoyetina" o "TPO" se utilizan de forma intercambiable en el presente documento y comprenden cualquier polipéptido que posea la propiedad de unirse a mpl, un miembro de la superfamilia de receptores de citoquina, y que tenga una propiedad biológica de ML. Una de las propiedades biológicas ejemplarizadas es la capacidad de estimular la incorporación de nucleótidos marcados (por ejemplo, ^{3}H-timidina) en el DNA de células Ba/F3 dependientes de IL-3, transfectadas con mpl humano. Otra propiedad biológica ejemplarizada es la capacidad para estimular la incorporación de ^{35}S en plaquetas circulantes, en un ensayo rebote con plaqueta de ratón. Esta definición abarca el polipéptido aislado a partir de una fuente de ligando mpl, tal como el plasma porcino aplástico descrito en el presente documento o a partir de otras fuentes, tales como otra especie animal, incluyendo humanos, o preparado por medio de procedimientos sintéticos o recombinantes e incluye formas variantes que incluyen derivados funcionales, fragmentos, alelos, isoformas y análogos de los mismos.

Un "fragmento de ligando mpl" o un "fragmento de TPO" es una parte de un ligando mpl de longitud completa maduro de origen natural o una secuencia de TPO que tiene uno o más restos aminoácido o unidades carbohidrato suprimidas. La supresión del (de los) resto(s) aminoácido(s) puede tener lugar en cualquier parte del péptido, incluyendo en la posición N-terminal o C-terminal o internamente. El fragmento compartirá al menos una propiedad biológica con el ligando mpl. Los fragmentos de ligando mpl contendrán habitualmente una secuencia consecutiva de al menos 10, 15, 20, 25, 30 ó 40 restos aminoácido que son idénticos a las secuencias del ligando mpl aislado a partir de un mamífero, incluyendo el ligando aislado a partir de plasma porcino aplástico o el ligando humano o múrido, especialmente el dominio EPO de los mismos. El hML_{153} o el TPO(Met^{-1} 1-153) constituyen ejemplos representativos de fragmentos N-terminales.

Los términos "variantes TPO", "variantes de ligando Mpl" o "variantes de secuencia de ligando mpl" o "derivados", asociados a TPO, etc., tal y como se definen en el presente documento, significan un material biológicamente activo, tal y como se define más adelante, que tiene menos del 100% de identidad de secuencia con el ligando mpl o la TPO aislada a partir de cultivos celulares recombinantes o plasma porcino aplástico o el ligando humano. Habitualmente, un ligando mpl biológicamente activo o una variante TPO tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 de identidad de secuencia de aminoácido con el ligando mpl/TPO aislado a partir de plasma porcino aplástico o el múrido maduro o el ligando humano o fragmentos de los mismos, preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, todavía más preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y ,más preferiblemente, al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia.

Un polipéptido "quimérico" es un polipéptido que comprende un padre de longitud completa (TPO o ligando mpl) o uno o más fragmentos de los mismos, fusionados o unidos a un segundo polipéptido heterólogo o a uno o más fragmentos de los mismos. La quimera compartirá al menos una propiedad biológica en común. El segundo polipéptido será habitualmente una citoquina, una inmunoglobulina o uno de sus fragmentos.

El término "actividad biológica", cuando se utiliza conjuntamente con cualquiera de los términos "ligando mpl" o "ligando mpl Aislado" o "TPO" significa que posee una actividad trombopoyética o que tiene una función efectora o antigénica in vivo o una actividad provocada o generada, directa o indirectamente, por un ligando mpl o ``TPO (ya sea en su configuración natural o en la desnaturalizada) o un fragmento de los mismos. Entre las funciones efectoras se incluyen la unión mpl y cualquier actividad de unión a soporte, agonismo o antagonismo de mpl, especialmente transducción de una señal proliferativa que incluye replicación, función reguladora de DNA, modulación de la actividad biológica de otras citoquinas, activación de receptores (especialmente citoquina), desactivación, infra o sobre-regulación, crecimiento o diferenciación celular y similares. Una función antigénica significa la posesión de un punto epítope o antigénico que es capaz de reaccionar cruzadamente con anticuerpos generados contra el ligando mpl de origen natural o la TPO. La principal función antigénica de un ligando mpl o de un polipéptido TPO reside en la unión del mismo con una afinidad de al menos aproximadamente 10^{6} l/mol con un anticuerpo generado frente al ligando mpl o la TPO, aislado a partir de plasma porcino aplástico. Habitualmente, el polipéptido se une con una afinidad de al menos aproximadamente 10^{7} l/mol. Muy preferiblemente, el ligando mpl antigénicamente activo o el polipéptido TPO es un polipéptido que se une a un anticuerpo generado contra el ligando mpl o la TPO, que tiene una de las funciones efectoras descritas anteriormente. Los anticuerpos utilizados para definir la "propiedad biológica" son anticuerpos policlonales de conejo generados mediante la formulación del ligando mpl o la TPO aislada a partir de cultivo celular recombinante o plasma porcino aplástico en medio adyuvante completo de Freund, inyectando subcutáneamente la formulación y estimulando la respuesta inmune mediante inyección intraperitoneal de la formulación hasta que el título de ligando mpl o de anticuerpo TPO se estabiliza.

A través del término "polipéptidos TPO pegilados" o variaciones gramaticales del mismo, se quiera dar a entender un polipéptido TPO que ha sido modificado covalentemente mediante unión del polipéptido TPO con uno de entre una diversidad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, con polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, tal y como se ha indicado anteriormente.

En humanos, el término "trombocitopenia" se define como una dolencia en la que el contaje de plaquetas se sitúa por debajo de 150 x 10^{9} por litro de sangre.

La "actividad trombopoyética" se define como la actividad biológica que comprende la aceleración de la proliferación, la diferenciación y/o la maduración de megacariocitos o de precursores de megacariocitos hacia la forma productora de plaquetas de estas células. Esta actividad pude ser medida en diversos ensayos, incluyendo un ensayo de síntesis rebote en plaqueta de ratón in vivo, inducción de ensayos de antígeno en superficie celular de plaqueta, medido a través de un inmunoensayo antiplaqueta (anti-GPII_{b}III_{a}) para una línea celular megacarioblástica de leucemia humana (CMK) e inducción de poliploidización en una línea celular megacarioblástica (DAMI).

La "trombopoyetina (TPO)" se define como un compuesto que tiene actividad trombopoyética o que es capaz de incrementar el contaje de plaquetas en suero en un mamífero. La TPO resulta preferiblemente capaz de incrementar los contajes de plaquetas endógenos en al menos un 10%, más preferiblemente en un 50% y, muy preferiblemente, de elevar el contaje de plaquetas en un humano a niveles superiores a aproximadamente 150 x 10^{9} por litro de sangre. También se hace referencia a otros nombres presentes en la literatura para la TPO, tal y como se discutido anteriormente en relación a los documentos de solicitud de patente citados.

El término polipéptido "ligando mpl" o "TPO" de esta invención presenta preferiblemente al menos el 70% de identidad de secuencia global con la secuencia de aminoácidos del polipéptido ligando mpl porcino homogéneo sustancialmente altamente purificado y al menos un 80% de identidad de secuencia con el "dominio EPO" del polipéptido ligando mpl. Opcionalmente, el ligando mpl (TPO) de esta invención es ligando mpl humano maduro (hML), o una variante o una forma modificada post-transcripcionalmente del mismo o una proteína que tiene aproximadamente el 80% de identidad de secuencia con el ligando mpl humano maduro. Opcionalmente, la variante de ligando mpl es un fragmento, especialmente un aminoácido terminal o un fragmento de "dominio-EPO", del ligando mpl humano maduro (hML). Preferiblemente, el fragmento amino terminal retiene sustancialmente la totalidad de la secuencia de ML de origen humano entre el primer y el cuarto resto cisteína, pero puede contener adiciones, supresiones o sustituciones sustanciales fuera de esta región. Según esta realización, el polipéptido fragmento puede ser representado a través de la fórmula:

X-hTPO(7-151)-Y

en la que hTPO(7-151) representa la secuencia de aminoácidos TPO (hML) humana desde Cys^{7} hasta Cys^{151}, inclusive; X representa el grupo amino de Cys^{7} o uno o más de los restos aminoácido amino-terminales de la TPO madura o extensiones de restos de aminoácido de las mismas, tales como Met, Lys, Tyr o sustituciones de aminoácido de las mismas, tales como arginina a lisina o secuencias líderes que contienen, por ejemplo, puntos de rotura proteolíticos (por ejemplo, Factor Xa o trombina); e Y representa el grupo carboxi terminal de Cys^{151} o uno o más restos aminoácido carboxi-terminales de la TPO madura o extensiones de la misma.

Procedimientos de preparación Aislamiento del gen ligando mpl (TPO) humano

Clones de DNA genómico humano del gen de TPO fueron aislados mediante cribado de una librería genómica humana en \lambda-Gem12 con pR45, en condiciones de restricción bajas o bajo condiciones de restricción altas, con un fragmento correspondiente a la mitad 3' de cDNA humano que codifica para el ligando mpl. Dos clones lambda que se superponen abarcando 35 kb fueron aislados. Dos fragmentos que se solapan (BamH1 y Ncori) conteniendo el gen TPO completo fueron subclonados y secuenciados.

La estructura del gen humano se compone de 6 exones dentro de 7 kb de DNA genómico. Los límites de todas las uniones están en consonancia con el motivo consensuado establecido para los genes de mamífero (Shapiro, M.B. et al., Nucl. Acids, Res. 15: 7155 [1987]). El exón 1 y el exón 2 contienen la secuencia 5' no traducida y los cuatro aminoácidos iniciales del péptido señal. El resto de señal secretora y los primeros 26 aminoácidos de la proteína madura son codificados dentro del exón 3. El dominio carboxilo completo y el 3' no traducido, al igual que aproximadamente 50 aminoácidos del dominio similar a la eritropoyetina son codificados dentro del exón 6. Los cuatro aminoácidos involucrados en la supresión observada dentro de hML-2(hTPO-2) son codificados en el extremo 5' del exón 6.

El análisis de DNA genómico humano por medio de análisis Southern indicaba que el gen para TPO se encontraba presente en una copia única. La localización cromosómica del gen fue determinada por medio de hibridación fluorescente in situ (FISH), la cual permitió mapear el cromosoma 3q27-28.

Expresión y purificación de TPO a partir de células 293

La preparación y purificación de ML o de TPO procedente de células 293 se describe en detalle en el Ejemplo 1. Brevemente, cDNA correspondiente al marco de lectura abierta completa de TPO fue obtenido por medio de PCR, utilizando pRK5-hmpl1. El producto PCR fue purificado y clonado entre los puntos de restricción ClaI y XbaI del plásmido pRK5tkneo.ORF (un vector que codifica para el marco de lectura abierta completo).

Un segundo vector que codifica para el dominio homólogo de EPO fue generado de igual manera, pero utilizando cebadores PCR diferentes, para obtener la construcción final denominada pRK5-tkneoEPO-D.

Estas dos construcciones fueron transfectadas en células Kidney Human Embryonic, mediante el procedimiento CaPO_{4} y los clones resistentes a la neomicina fueron seleccionados y dejados crecer hasta confluencia. La expresión de ML_{153} o de ML_{332} en el medio acondicionado a partir de estos clones fue valorada utilizando el ensayo de proliferación Ba/F3-mpl.

La purificación de rhML_{332} fue llevada a cabo tal y como se describe en el Ejemplo 1. Brevemente, medio acondicionado 293-rhML_{332} fue aplicado a una columna Blue-Sepharose® (Pharmacia), la cual fue subsiguientemente lavada con un tampón conteniendo urea 2M. La columna fue eluida con un tampón conteniendo urea 2M y NaCl 1M. El agrupado de elución con Blue-Sepharose® fue después aplicado directamente a una columna de WGA-Sepharose®, lavado con 20 volúmenes de columna de tampón conteniendo urea 2M y NaCl 1M y eluido con el mismo tampón conteniendo N-acetil-D-glucosamina 0,5M. El eluido de WGA-Sepharose® fue aplicado a una columna C4-HPLC (Synchrom, Inc.) y eluido con un gradiente de propanol discontinuo. Por medio de SDS-PAGE, el 293-fhML_{332} purificado migra, en forma de banda amplia en la región 68-80 kDa del gel.

Se llevó también a cabo la purificación de rhML_{153}, tal y como se describe en el Ejemplo 1. Brevemente, medio acondicionado 293-rhML_{332} fue resuelto sobre Blue-Sepharose®, tal y como se describe para rhML_{332}. El eluido Blue-Sepharose® fue aplicado directamente a una columna de afinidad mpl, tal y como se ha descrito anteriormente. El eluido rhML_{153} procedente de la columna de afinidad mpl fue purificado hasta homogeneidad utilizando una columna Ca-HPLC, funcionando bajo las mismas condiciones utilizadas para rhML_{332.} Por medio de SDS-PAGE, el rhML_{153} se resuelve en 20 bandas importantes y 2 bandas menores, con Mr de entre aproximadamente 18.000 a 22.000.

Expresión y purificación de TPO procedente de células de ovario de hámster chino (CHO)

Los vectores de expresión utilizados para transfectar células CHO se designan: pSV15.ID.LL.MLORF (longitud completa de TPO_{332}) y pSV15.ID.LL.MLEPO-D (truncado o TPO_{153}).

cDNA correspondiente al marco de lectura abierta completo de TPO fue obtenido por medio de PCR. El producto PCR fue purificado y clonado entre los puntos de restricción (ClaI y SalI) del plásmido pSV15.ID.LL, para obtener el vector pSV15.ID.MLORF. Una segunda construcción, correspondiente al dominio homólogo de EPO, fue generada de la misma forma pero utilizando un cebador inverso diferente (EPOD.Sal). La construcción final para el vector que codifica pata el dominio homólogo EPO de TPO se denomina pSV15.ID.LL.MLEPO-D.

Estas dos construcciones fueron linearizadas con NotI y transfectadas en células de ovario de hámster chino (células CHO-DP12, EP 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989), por medio de electroporación. 10^{7} células fueron electroporadas en un aparato de electroporación BRL (350 voltios, 330 mF, capacitancia baja), en presencia de 10, 25 0 50 mg de DNA, tal y como se ha descrito (Andreason, G.L. J. Tissue Cult. Meth., 15: 56 [1993]). El día siguiente a la transfección, las células fueron separadas en medio selectivo para DHFR (DMEM-F12 50:50 glucosa elevada, sin glicina, glutamina 2 mM, suero de ternera fetal dializado 2-5%). Transcurridos entre 10 y 15 días, las colonias individuales fueron transferidas a placas de 96 pocillos y se dejaron crecer hasta confluencia. La expresión de ML_{153} o de ML_{332} en medio acondicionado a partir de estos clones fue valorada utilizando el ensayo de proliferación Ba/F3-mpl.

El procedimiento para purificar y aislar TPO a partir de fluido recogido de cultivo celular de CHO se describe en el Ejemplo 2. Brevemente, el fluido de cultivo celular recogido (HCCF) es aplicado a una columna Blue-Sepharose® (Pharmacia), a una relación de aproximadamente 100L de HCCF por litro de resina. La columna es lavada después con entre 3 y 5 volúmenes de columna de tampón, seguido de entre 3 y 5 volúmenes de columna de un tampón que contiene urea 2.0M. La TPO es eluida después con entre 3 y 5 volúmenes de columna de tampón conteniendo urea 2,0M y NaCl 1,0M.

El agrupado de eluido de Bleu Sepharose que contiene TPO es después aplicado a una columna Wheat Germ Lectin Sepharose (Pharmacia), equilibrada en tampón de elución Bleu Sepharose, a una relación de entre 8 y 16 ml de eluido por ml de resina. La columna es lavada después con entre 2 y 3 volúmenes de tampón de equilibrio. La TPO es después eluida con entre 2 y 5 volúmenes de columna de un tampón que contiene urea 2,0M y N-acetil-D-glucosamina 0,5M.

El eluido Wheath Germ Lectin que contiene TPO es después acidificado y se añade C_{12}E_{8,} hasta una concentración final de 0,04%. El agrupado resultante es aplicado a una columna C4 en fase inversa, equilibrada en TFA 0,1%, C_{12}E_{8} 0,04%, a una carga de aproximadamente entre 0,2 y 0,5 mg de proteína por ml de resina.

La proteína es eluida en un gradiente lineal de dos fases de acetonitrilo, que contiene TFA 0,1% y C_{12}E_{8} 0,04% y se prepara un agrupado en base a SDS-PAGE.

El agrupado C4 es posteriormente diluido y diafiltrado frente a aproximadamente 6 volúmenes de tampón sobre una membrana Amicon YM o una membrana de ultrafiltración similar, que tiene un corte comprendido entre 10.000 y 30.000 Daltons de peso molecular. El diafiltrado resultante puede ser después procesado directamente o concentrado nuevamente mediante ultrafiltración. El diafiltrado/concentrado es habitualmente ajustado hasta una concentración final de Tween® 80 0,01%.

La totalidad o una parte del diafiltrado/concentrado equivalente a entre el 2 y el 5% del volumen de columna calculado es después aplicada a una columna HR de Sephacryl S-300 HR (Pharmacia), equilibrada en un tampón que contiene Tween® 80 0,01% y es cromatografiado. Las fracciones que contienen TPO, exentas de productos de degradación proteolítica y de agregados, son posteriormente agrupadas en base a SDS-PAGE. El agrupado resultante es filtrado y almacenado a entre 2-8ºC.

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Procedimientos para la transformación y la inducción de síntesis de TPO en un microorganismo y aislamiento, purificación y renaturalización de la TPO obtenida en los mismos

La construcción de vectores de expresión de E. coli TPO se describe en detalle en el Ejemplo 3. Brevemente, los plásmidos pMP121, pMP151, pMP141, pMP57 y pMP202 fueron todos ellos diseñados para expresar los primeros 155 aminoácidos de TPO, aguas debajo de un pequeño líder que varía entre las diferentes construcciones. Los líderes proporcionan principalmente un elevado nivel de inicio de traducción y una purificación rápida. Los plásmidos pMP210-1, T8, -21, -22, -24, -25 son diseñados a los efectos de expresar los primeros 155 aminoácidos de TPO aguas debajo de una metionina de inicio y tan solo difieren en el uso del codon para los 6 primeros aminoácidos de TPO, mientras que el plásmido pMP251 es un derivado de pMP210-1, en el que el extremo carboxi terminal de la TPO es extendido en dos aminoácidos. La totalidad de los plásmidos mencionados anteriormente generarán elevados niveles de expresión intracelular de TPO en E. Coli, tras inducción del promotor triptófano (Yansure, D.G. et al, Methods in Enzymology, 185: 54- 60 (Goeddel, D.V., Ed) Academic Press, San Diego [1990]). Los plásmidos pMP1 y pMP172 son intermedios en la construcción de los plásmidos de expresión intracelular de TPO mencionados anteriormente.

Los plásmidos de expresión de TPO mencionados anteriormente fueron utilizados para transformar la E. coli utilizando el procedimiento de choque de calor con CaCl_{2} (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53: 159-162, [1970]) y otros procedimientos descritos en el Ejemplo 3. Brevemente, las células transformadas fueron cultivadas primero a 37ºC, hasta que la densidad óptica (60 nm) del cultivo alcanzó un valor situado aproximadamente entre 2-3. El cultivo fue entonces diluido y, después de crecimiento con aireación, se añadió ácido. Se permitió entonces que el cultivo continuase creciendo con aireación, durante un período de otras 15 horas, transcurrido el cual las células fueron recogidas por medio de centrifugación.

Los procedimientos de aislamiento, purificación y renaturalización proporcionados más adelante para la producción de TRO humana renaturalizada, biológicamente activa, o de fragmentos de la misma, descritos en el Ejemplo 4, pueden ser aplicados a la recuperación de cualquier variante de TPO, incluyendo las formas extendidas N y C terminales. Otros procedimientos adecuados para la renaturalización, recombinante o sintética de TPO, pueden encontrarse en las siguientes patentes: Builder et al., USP 4.511.502; Jones et al., USP 4.512.922; Olson, USP 4.518.526 y Builder et al., USP 4.620.948; para una descripción general de los procesos de recuperación y renaturalización relativos a una diversidad de proteínas recombinantes expresadas en una forma insoluble en E. coli.

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Procedimientos para la medición de actividad trombopoyética

La actividad trombopoyética puede ser medida en diversos ensayos, incluyendo el ensayo de ligando mpl Ba/F3. Un ensayo in vivo de síntesis de rebote de plaqueta en ratón, inducción de ensayo de antígeno de superficie celular de plaqueta, medido a través de inmunoensayo anti-plaqueta (anti-GPII_{b}III_{a}), para determinar una línea celular megacarioblástica de leucemia humana (CMK) (ver Sato et al., Brit. J. Haematol. 72: 184-190) e inducción de poliploidización en línea celular megacarioblástica (DAMI) (ver Ogura et al., Blood, 72/1): 49-60 [1988]). La maduración de megacariocitos a partir de células mayoritariamente no sintetizadoras de DNA, inmaduras, hacia megacariocitos morfológicamente identificables conlleva un procedimiento que incluye la aparición de organelos citoplásmicos, la adquisición de antígenos de membrana (GPII_{b}III_{a}), la endorreplicación y liberación de plaquetas, tal como se describe en el estado de la técnica. Cabría esperar que un promotor específico del linaje (a saber, el ligando mpl), de maduración magacariocita, indujera al menos algunos de estos cambios en megacariocitos inmaduros que conducen a la liberación de plaquetas y al alivio de la trombocitopenia. Así pues, se diseñaron ensayos para medir la emergencia de estos parámetros en líneas celulares de megacariocitos inmaduras, a saber, células CMK y DAMI. El ensayo CMK mide la aparición de un marcador de plaquetas específico, el GPII_{b}III_{a}, y la eliminación de plaquetas. El ensayo DAMI mide la endorreplicación, dado que los incrementos en la ploidía constituyen marcas de identidad de los megacariocitos maduros. Los magecariocitos reconocibles tienen valores de ploidía de 2N, 4N, 8N, 16N, 32N, etc. Finalmente, el ensayo de rebote en plaqueta de ratón in vivo resulta de utilidad a la hora de demostrar que la administración del compuesto de prueba (aquí, el ligando mpl) da como resultado una elevación en los números de plaquetas.

Para medir la actividad TPO se han desarrollado dos ensayos in vitro adicionales. El primero de ellos es una activación del receptor quinasa (KIRA)ELISA, en el cual células CHO son transfectadas con quimera mpl-Rse y la fosforilización de tirosina de Rse es medida a través de ELISA, después de la exposición de la parte mpl de la quimera al ligando mpl. El segundo es un receptor basado en ELISA, en el cual IgG anti-humana de conejo revestida con placa ELISA captura el receptor quimérico humano mpl-IgG, el cual se une al ligando mpl que está siendo ensayado. Para detectar el ligando mpl unido se utiliza un anticuerpo policlonal biotinilado de conejo frente al ligando mpl (TPO_{155}), procediéndose a llevar a cabo la medición utilizando estrepavin-peroxidasa.

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Uso terapéutico de materiales trombopoyetínicos

La proteína trombopoyética biológicamente activa (TPO) puede ser utilizada en una preparación o formulación farmacéutica estéril para estimular la actividad megacariocitopoyética o trombopoyética, en pacientes que sufren de trombocitopenia debido a una producción defectuosa, secuestro o a un incremento en la destrucción de plaquetas. La hipoplasia de médula ósea asociada a trombocitopenia (por ejemplo, anemia aplástica subsiguiente a quimioterapia o transplante de médula ósea) puede ser tratada de forma eficaz con los compuestos de esta invención, al igual que trastornos tales como la coagulación intravascular diseminada (DIC), la trombocitopenia inmune (incluyendo ITP inducida por HIV e ITP no inducida por HIV), la trombocitopenia idiopática crónica, la trombocitopenia congénita, la mielodisplasia, y la trombocitopenia trombótica. Adicionalmente, estas proteínas megacariocitopoyéticas pueden resultar de utilidad en el tratamiento de enfermedades trombocitóticas mieloproliferativas, al igual que en el de la trombocitosis derivada de dolencias inflamatorias y en la deficiencia en hierro.

Entre los usos preferidos de la proteína trombocitopoyética (TPO) de esta invención se encuentran: en quimioterapia mielotóxica para el tratamiento de la leucemia o de tumores sólidos, en quimioterapia mieloablativa para transplante de médula ósea alogénico o autólogo, en mielodisplasia, en anemia aplástica idiopática, en trombocitopenia congénita y en trombocitopenia inmune.

En la relación de todavía otros trastornos tratados con las proteínas trombopoyetinas de esta invención se incluyen defectos o daños a plaquetas que resultan de fármacos, intoxicación o activación sobre superficies artificiales. En estos casos, los presentes compuestos pueden ser utilizados para estimular la "eliminación" o nuevas plaquetas "no dañadas".

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Ejemplo

Ejemplo 1 Expresión y purificación de TPO a partir de una preparación de células 293 de vectores de expresión de células 293

Un cDNA correspondiente al marco de lectura abierta completa de TPO fue obtenido por medio de PCR, utilizando los siguientes oligómeros como cebadores:

1

Se utilizó prk5-Hmpl como plantilla para la reacción en presencia de polimerasa DNA pfu (Stratagene). La desnaturalización inicial duró 7 minutos a 94ºC, seguido de 25 ciclos de amplificación (1 min. a 94ºC, 1 min. a 55ºC y 1 min. a 72ºC). La extensión final fue de 15 min. a 72ºC. El producto PCR fue purificado y clonado entre los puntos de restricción ClaI y XbaI del plásmido pRK5tkneo, un vector derivado de pRK5 modificado para expresar un gen resistente a la neomicina bajo control del promotor timidina quinasa, para obtener el vector pRK5tkneo.ORF. Una segunda construcción correspondiente al dominio homólogo epo fue generada del mismo modo pero utilizando Cla.FL.F como cebador delantero y el siguiente cebador inverso:

100

La construcción final se denomina pRK5-tkaneoEPO-D. La secuencia de ambas construcciones fue verificada.

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Transfección de células de riñón embriónico humano

Estas dos construcciones fueron transfectadas en células Human Embryonic Kidney, por el procedimiento CaPO_{4}. Transcurridas 24 horas desde la transfección, se dió inicio a la selección de los clones resistentes a la neomicina, en presencia de G418 0,4 mg/ml. Entre 10 y 15 días más tarde las colonias individuales fueron transfectadas a placas de 96 pocillos y se dejaron crecer hasta confluencia. La expresión de ML_{153} o de ML_{332} (TPO153 o TPO332) en el medio acondicionado a partir de estos clones fue valorada utilizando el ensayo de proliferación Ba/F3-mpl.

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Purificación de rhML_{332}

El medio acondicionado con 392-rhML_{332} fue aplicado a una columna Blue-Sepharose® (Pharmacia) que fue equilibrada en fosfato sódico 10 mM, pH 7,4 (tampón A). La columna fue después lavada con 10 volúmenes de columna de tampón A y de tampón A conteniendo urea 2M. La columna fue después eluida con tampón A conteniendo urea 2M y NaCl 1M. El agrupado de elución Bleu-Sepharose® fue después aplicado directamente a una columna de WGA-Sepharose® equilibrada en tampón A. La columna de WGA-Sepharose® fue después lavada con 10 volúmenes de columna de tampón A conteniendo urea 2M y NaCl 1 m y eluida con el mismo tampón conteniendo N-acetil-D-glucosamina 0,5M. El eluido WGA-Sepharose® fue aplicado a una columna C4-HPLC (Synchrom, Inc), equilibrado en TFA 0,1%. La columna C4-HPLC fue eluida con gradiente de propanol discontinuo (0-25%, 25-35%, 35-70%). Se averiguó que rhML_{332} eluía en la región propanol 28-30% del gradiente, por medio de SDS-PAGE el rhML_{332} migra en forma de banda ancha en la región de 68-8-kDa del gel.

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Purificación de rhML_{153}

Medio acondicionado con 392-rhML_{153} fue resuelto sobre Blue-Sepharose®, tal y como se describe para rhML_{332}. El eluido Blue-Sepharose® fue aplicado directamente a una columna de afinidad mpl, tal y como se ha descrito anteriormente. El eluido rhML_{153} procedente de la columna de afinidad mpl fue purificado hasta homogeneidad, utilizando una columna C4-HPLC, operada utilizando las mismas condiciones que las descritas para rhML_{332}. A través de SDS-PAGE el rhML_{153} se resuelve en dos bandas mayores y 2 bandas menores con Mr de aproximadamente entre 18.000 y 21.000.

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Ejemplo 2 Expresión y purificación de TPO a partir de CHO 1. Descripción de vectores de expresión de CHO

Se han designado los vectores de expresión utilizados en los protocolos de electroporación descritos más adelante:

pSV15.ID.LL.MLORF (longitud completa o hTPO_{332}), y

pSV15.ID.LL.MLEPO-D (truncado o hTPO_{153}).

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2. Preparación de vectores de expresión CHO

Un cDNA correspondiente al marco de lectura abierta completa hTPO fue obtenido por medio de PCR, utilizando los cebadores oligonucleótido de la siguiente tabla:

2

Para la reacción en presencia de pfu DNA polimerasa (Stratagene) se utilizó PRKS-hmpl como plantilla. La desnaturalización inicial duró 7 min. a 94ºC, seguida de 25 ciclos de amplificación (1 min. a 94ºC, 1 min. a 55ºC y 1 min. a 72ºC). La extensión final fue de 15 min. a 72C. El producto PCR fue purificado y clonado entre los puntos de restricción ClaI y SalI del plásmido pSV15.ID.LL para obtener el vector pSV15.ID.LL.MOLRF. Se generó una segunda construcción, correspondiendo al dominio homólogo EPO, haciendo lo mismo, pero utilizando Cla.FL.F2 como cebador delantero y el siguiente cebador inverso:

101

La construcción final se denomina pSV15.ID.LL.MLEPO.D. La secuencia de ambas construcciones fue verificada.

En esencia, las secuencias que codifican para el ligando de longitud completa y el ligando fueron introducidas en el punto de clonado múltiple del vector de expresión de CHO pSVqi.ID.LL. Este vector contiene la región promotora/reforzadora temprana SV40, una unidad de empalme que contiene el DHFR cDNA de ratón, un punto de clonado múltiple para la introducción del gen de interés (en este caso, las secuencias de TPO descritas), una señal de poliadenilación de SV40 y origen de replicación y el gen beta-lactamasa para selección de plásmido y amplificación en bacterias.

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3. Metodología para establecer líneas celulares CHO estables que expresan TPO_{332} y TPO_{153} humana recombinante a. Descripción de la línea celular padre de CHO

La línea celular CHO huésped (Ovario de Hámster Chino) utilizada para la expresión de las moléculas TPO descritas en el presente documento es conocida como CHO-DP12 (ver, EP 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989). Esta línea celular de mamífero fue seleccionada clonalmente a partir de una transfección de la línea padre (CHO-K1 DUX-B11 (DHFR-)-, facilitada por el Dr. Frank Lee de la Universidad de Stanford, con la autorización del Dr. L. Chasin), con un vector que expresa la pre-proinsulina, para obtener clones con bajo requerimiento de insulina. Estas células son también menos DHFR y el escaneado de los clones puede ser seleccionado para determinar la presencia de secuencias del vector DHFR cDNA, a través de crecimiento en medio privado de suplementos nucleósido (glicina, hipoxantina, y timidina). Este sistema de selección se utiliza habitualmente para líneas celulares que
expresan CHO.

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b. Procedimiento de transfección (electroporación)

Las líneas celulares que expresan TPO_{332} y TPO_{153} fueron generadas por medio de transfección de células DP12 a través de electroporación (ver, por ejemplo, Andreason, G.L. J. Tiss. Cult. Meth., 15, 56 (1993), con plásmidos pSV15.ID.LL.MLORF o pSV15.ID.LL.MLEPO-D linearizados, respectivamente. Se establecieron tres (3) mezclas de reacción de enzimas para cada uno de los cortes de plásmido; 10 \mug, 25 \mug y 50 \mug del vector con el enzima NOTI, a través de procedimientos de biología molecular estándar. Este punto de restricción es tan solo encontrado una vez en el vector en la región de linearización 3' y fuera de las unidades de transcripción de ligando TPO (ver la Fig. 23). Las reacciones de 100 \mul fueron programadas para incubación durante el transcurso de una noche a 37 grados. Al día siguiente, las mezclas fueron extraídas con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (50:49:1) una vez y precipitadas sobre hielo durante aproximadamente una hora. El precipitado fue recogido después mediante microcentrifugación durante 15 minutos y secado. El DNA linearizado fue resuspendido en 50 \mul de medio Harm DMEM:F12 1:1, suplementado con antibióticos estándar y glutamina 2 mM.

Las células DP12 cultivadas en suspensión fueron recogidas, lavadas una vez en el medio descrito para la resuspensión de DNA y, finalmente, resuspendidas en el mismo medio a una concentración de 10^{7} células por 750 \mul. Alícuotas de células (750 \mul) y de cada una de las mezclas de DNA linearizado fueron incubadas conjuntamente a temperatura ambiente durante una hora y después transferidas a una cámara de electroporación BRL. Cada una de las mezclas de reacción fue después sometida a electroporación en un aparato para electroporación BRL estándar, a 350 voltios, programado a 330 \muF y a baja capacitancia. Finalizada la electroporación, se permitió que las células se asentaran en el aparato durante un período de 5 minutos y después sobre hielo durante un período adicional de incubación de 10 minutos. Las células electroporadas fueron transferidas a platos de cultivo celular de 60 mm conteniendo 5 ml de medio de crecimiento completo estándar para células CHO (glucosa elevada DM6M-1= 12 50:50, sin suplemento de glicina con 1 X GHT, glutamina 2 mM y suero de ternera fetal 5%) y se cultivaron durante el transcurso de una noche en una incubadora de cultivo celular con CO_{2} 5%.

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c. Procedimiento de selección y cribado

Al día siguiente, las células fueron tripsinizadas fuera de las placas a través de procedimientos estándar y transferidas a platos de cultivo tisulares de 150 mm conteniendo medio selectivo DHFR (el medio Ham DMEM-F12, 1:1 descrito anteriormente, suplementado con, o bien suero de ternera fetal dializado al 2% o al 5%, pero privado de glicina, hipoxantina y timidina, este es el medio de selección DHFR estándar que utilizamos). Células procedentes de cada uno de los platos de 60 mm fueron reubicadas posteriormente en platos de 5/150 mm. Las células fueron después incubadas durante un período de entre 10 y 15 días (con un cambio de medio) a 37ºC/CO_{2} 15%, hasta que los clones empezaron a aparecer y alcanzar tamaños manejables para ser transferidos a platos de 96 pocillos. A los largo de un período de entre 4 y 5 días, las líneas celulares fueron transferidas a platos de 96 pocillos utilizando puntas amarillas estériles sobre una pipettman fijada en 50 ml. Las células fueron dejadas crecer hasta alcanzar la confluencia (habitualmente 3-5 días) y después las bandejas fueron tripsinizadas y 2 copias de la bandeja original fueron reproducidas. Dos de estas copias fueron almacenadas a corto plazo en un congelador, con las células en cada uno de los pocillos diluidas en 50 \mul pf de FCS al 10% en DMSO. Las muestras acondicionadas en medio exento de suero durante 5 días fueron sometidas a ensayo desde los pocillos confluentes en la tercera bandeja para determinar la expresión de TPO a través de ensayo de actividad basado en células Ba/F. Los clones de expresión más elevada basados en este ensayo fueron revividos desde el almacenaje y escalados hasta dos matraces T de 150 mm, confluyentes, para transferencia al grupo de cultivo celular, con vistas a determinar la adaptación a la suspensión, el re-ensayo y la creación de bancos.

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d. Protocolo de amplificación

Varias de las líneas celulares de título más elevado procedentes de la selección mencionada anteriormente fueron sometidas posteriormente a un régimen de amplificación con metotrexato estándar, con vistas a generar clones de título más elevado. Clones de células CHO son expandidos y colocados en placas en platos de 10 cm a 4 diferentes concentraciones de metotrexato (a saber, 50nM, 100nM, 200nM y 400nM), a dos o tres números de células (105,5 x 105 y 106 células por plato). Estos cultivos son después incubados a 37ºC /CO_{s} 5%, hasta que los clones se han establecido y resultan manejables para ser transferidos a platos de 96 pocillos para un nuevo ensayo. Varios clones de título más elevado procedentes de esta selección fueron sometidos de nuevo a concentraciones más elevadas de metotrexato (a saber, 600nM, 800nM, 1000nM y 1200nM) y, al igual que antes, se permitió que los clones resistentes se establecieran y fueran después transferidos a platos de 96 pocillos y sometidos a ensayo.

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4. Cultivo de líneas celulares de CHO estables que expresan TPO_{332} y TPO_{153} humana recombinante

Células del banco fueron descongeladas y la población celular expandida por medio de procedimientos de crecimiento celular, ya sea en medio exento de suero o en medio que contenía suero. Una vez lograda la expansión hasta una densidad celular suficiente, se lavaron las células para eliminar el medio de cultivo consumido. Las células fueron después cultivadas por medio de cualquier procedimiento estándar, incluyendo producción por lotes, cultivo discontinuo o cultivo continuo, a entre 25 y 40ºC, pH neutro, con un contenido de O_{2} disuelto de al menos el 5%, hasta que se acumuló la TPO secretada. El fluido de los cultivos celulares fue después separado de las células a través de medios mecánicos, tales como la centrifugación.

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5. Purificación de TPO humana recombinante procedente de fluidos de cultivo de CHO

Fluido de cultivo celular recogido (HCCF) es directamente aplicado a una columna Blue Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia), equilibrada en fosfato sódico 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15M, a una proporción de aproximadamente 100 mL de HCCF por litro de resina y a un caudal lineal de aproximadamente 300 ml/hr/cm^{2}. La columna es después lavada con entre 3 y 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio, seguido de entre 3 y 5 volúmenes de fosfato sódico 0,01M, pH 7,4, urea 2,0M. La TPO es después eluida con entre 3 y 5 volúmenes de columna de fosfato sódico 0,01M, pH 7,4, urea 2,0M, NaCl 1,0M.

El agrupado de Blue Sepharose® que contiene la TPO es después aplicado a una columna Sepharose® 6MB, de lectina de germen de trigo (Pharmacia), equilibrada en fosfato sódico 0,01M, pH 7,4, urea 2,0M y NaCl 1,0M, a una proporción de entre 8 y 16 ml de agrupado de Blue Sepharose® por ml de resina, a un caudal de aproximadamente 50 ml/hr/cm^{2}. la columna es lavada después con entre 2 y 3 volúmenes de tampón de equilibrio. La TPO es después eluida con entre 2 y 5 volúmenes de fosfato sódico 0,01M, pH 7,4, urea 2,0M, N-acetil-D-glucosamina 0,5M.

El agrupado de lectina de germen de trigo es después ajustado hasta alcanzar una concentración final de C_{12}E_{8} 0,04% y ácido trifluoroacético (TFA) 0,1%. El agrupado resultante es aplicado a una columna en fase inversa C4 (Vydac 214TP1022), equilibrada en TFA 0,1%, C_{12}E_{8}, a una carga de aproximadamente entre 0,2 y 0,5 mg de proteína por ml de resina, a un caudal de 157 ml/hr/cm^{2}.

La proteína es eluida en un gradiente lineal de dos fases de acetonitrilo que contiene TFA 0,1%, C_{12}E_{8} 0,04%. La primera fase está compuesta de de un gradiente lineal de entre 0 y 30% de acetonitrilo, en 15 minutos, la segunda fase está compuesta por un gradiente lineal de entre 30 y 60% de acetonitrilo, en 60 minutos. La TPO es eluida a aproximadamente 50% de acetonitrilo. Se obtiene un agrupado en base a SDS-PAGE.

El agrupado de C4 es después diluido con 2 volúmenes de fosfato sódico 0,01M pH 7,4, NaCl 0,15M y diafiltrado versus aproximadamente 6 volúmenes de fosfato sódico 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15M, sobre una membrana de ultrafiltración Amicon YM o similar, que tiene un corte de entre 10.000 y 30.000 daltons de peso molecular. El diafiltrado resultante es después procesado directamente o concentrado adicionalmente por medio de ultrafiltración. El diafiltrado/concentrado es ajustado hasta alcanzar una concentración final de Tween® 80 0,01%.

La totalidad o una parte del diafiltradio/concentrado, equivalente a entre el 2 y el 5% del volumen de columna calculado, es después aplicada a una columna Sephacryl®S-3000 HR (Pharmacia), equilibrada en fosfato sódico 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15M, Tween® 80 0,01% y cromatografiada a un caudal de aproximadamente 17 ml/hr/cm^{2}. Las fracciones que contienen TPO que están exentas de acumulado y de productos de degradación proteolítica son agrupados en base a SDS-PAGE. El agrupado resultante es filtrado sobre un filtro de 0,22\mu. Millex-GV o similar, y almacenado a 2-8ºC.

Ejemplo 3 Transformación e inducción de síntesis de proteína TPO en E. coli 1. Construcción de vectores de expresión de TPO en E. coli

Los plásmidos pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 y pMP202 han sido, todos ellos, diseñados para expresar los primeros 155 aminoácidos de TPO, aguas debajo de un líder pequeño, que varía entre diferentes construcciones. Los líderes proporcionan primeramente un elevado nivel de inicio de traducción y una purificación rápida. Los plásmidos pMP210-1, -T8, -21, -22, -24, -25 son diseñados para expresar los primeros 153 aminoácidos de TPO, aguas debajo de una metionina de inicio, y difieren tan solo en el codon utilizado para los 6 primeros aminoácidos de TPO, mientras que el plásmido pMP251 es un derivado de pMP210-1, en el cual la terminación carboxi terminal de TPO es extendida en dos aminoácidos. La totalidad de plásmidos mencionada anteriormente producirá niveles elevados de expresión intracelular de TPO en E. coli, tras inducción del promotor triptófano (Yansura, D.G. et al., Methods in Enzymology (Goeddel D.V., Ed) 185: 54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Los plásmidos pMP1 y pMP172 son intermedios en la construcción de los plásmidos de expresión intracelular de TPO mencionados anteriormente.

(a) Plásmido pMP1

El plásmido pMP1 es un vector de secreción para los 155 primeros aminoácidos de TPO, y fue construido mediante la unión conjunta de 5 fragmentos de DNA. El primero de ellos era el vector pPho21, en el cual el fragmento pequeño de MluI-BamHI había sido eliminado. El pPho21 es un derivado de phGH1 (Chang, C.N. et al., Gene 55: 189-196(1987), en el cual el gen de la hormona de crecimiento humano ha sido sustituido por el gen phoA de E. coli, y un punto de restricción MluI ha sido introducido, mediante ingeniería, en la secuencia de codificación para la secuencia señal STII en el aminoácidos 20-21.

Los siguientes dos fragmentos, una pieza HinfI-PstI de 258 pares de base de DNA procedente de pRK5-hpml que codifica para los aminoácidos de TPO 19-103, y el siguiente DNA sintético que codifica para los aminoácidos 1-18.

102

fueron preligados con T4-DNA ligasa, y el segundo corte con PstI. El cuarto era un fragmento PstI-HaelII de 152 pares de base, que codifica para los aminoácidos 104-155 de TPO. El último era un fragmento Stut-BamHI, de 412 pares de base, procedente de pdh108, que contiene el finalizador lambda hasta el finalizador lambda a transcripcional, tal y como se ha escrito anteriormente (Scholtissek, S. et al., NAR 15:3185 [1987]).

(B) Plásmido pM21

El plásmido pMP21 es diseñado para expresar los primeros 155 aminoácidos de TPO, con la ayuda de un líder de 13 aminoácidos que comprende parte de la secuencia señal STII. Fue construido uniendo conjuntamente tres (3) fragmentos de DNA, siendo el primero de ellos el vector pVEG31, en el cual el fragmento XbaI-SphI pequeño ha sido eliminado. El vector pVEG31 es un derivado de pHGH207-1 (de Boer, H.A. et al.), en Promoter Structure and Function (Rodriguez, R.L. and Chamberlain, M.J. Ed.), 462, Praeger, New York [1982]), en el cual el gen de la hormona de crecimiento humana ha sido sustituido por el gen para el factor de crecimiento endotélico (este fragmento de vector idéntico puede ser obtenido a partir de este último plásmido).

La segunda parte en la unión era un dúplex de DNA sintético, con la siguiente secuencia:

103

La última pieza era un fragmento MluI-SphI de 1072 pares de base procedente de pMP1, que codifica para 155 aminoácidos de TPO.

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(c) Plásmido pMP151

El plásmido pMP151 es diseñado para expresar los primeros 155 aminoácidos de TPO, aguas debajo de un líder que comprende 7 aminoácidos de la secuencia señal STII, 8 histidinas y un factor de punto de rotura Xa. El pMP151 fue construido uniendo conjuntamente tres fragmentos de DNA, siendo el primero de ellos el vector pVEG31 descrito anteriormente, a partir del cual se había eliminado el fragmento XbaI-SphI pequeño. El segundo era un dúplex de DAN sintético con la siguiente secuencia:

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El último era un fragmento BglI-SphI de 1064 pares de base, procedente de pMP11, que codifica para 154 aminoácidos de TPO. El plásmido pMP11 es idéntico a pMP1, con la excepción de unos pocos cambios en la secuencia señal STII (este fragmento puede ser obtenido en pMP1).

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(d) Plásmido pMP202

El plásmido pMP202 es muy similar al vector de expresión pMP151, con la excepción de que el factor punto de rotura Xa en el líder ha sido sustituido por un punto de rotura trombina. Tal como se muestra en la Fig. 36, el pMP202 fue construido uniendo conjuntamente tres fragmentos de DNA. El primero de ellos era el pVEG31 descrito anteriormente, en el cual el fragmento XbaI-SphI pequeño había sido eliminado. El segundo era un dúplex de DNA sintético, con la siguiente secuencia:

110

105

La última pieza era un fragmento BglI-SphI de 1064 pares de base, procedente del plásmido pMP11 escrito anteriormente.

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(e) Plásmido pMP172

El plásmido pMP172 es un vector de secreción para los 153 primeros aminoácidos de TPO, y es un intermedio para la construcción de pMP210. Se preparó el pMP172 uniendo conjuntamente tres fragmentos de DNA, el primero de los cueles era un vector pLS321 amB, en el que se había eliminado la sección EcorI-HindI pequeña. El segundo era un fragmento pLS321 de 946 pares de base, procedente del plásmido pMP11 descrito anteriormente. La última pieza era un dúplex de DNA sintético, con la siguiente secuencia:

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(f) Plásmido pMP210

El plásmido pMP210 es diseñado para expresar los primeros 153 aminoácidos de TPO, después de un inicio metionina traduccional. Realmente, el plásmido fue preparado como un banco de plásmidos en el cual los primeros 6 codones de TPO fueron aleatorizados en la tercera posición de cada uno de los codones y construido uniendo tres fragmentos de DNA. El primero de ellos era el descrito previamente como pVEG31, en el cual el fragmento XbaI-SphI pequeño había sido eliminado. El segundo era un dúplex de DNA sintético, mostrado más adelante, tratado primero con DNA polimerasa (Klenow), seguido de digestión con XbaI e HinI y que codifica para la metionina de inicio y los 6 primeros codones randomizados de TPO.

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El tercero era un fragmento HinfI-SphI de 890 pares de bases, procedente de pMP172 que codifica para los aminoácidos 19-153 de TPO.

El banco de plásmidos pMP210, de aproximadamente 3700 clones, fue retransformado en placas LB con alto contenido en tetraciclina (50 \mug/ml), con vistas a seleccionar clones de inicio de traducción elevada (Yansura, D.G. et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4: 151-158 [1992]). De las 8 colonias que aparecieron en las placas con elevado contenido en tetraciclina, cinco de las mejores, en términos de expresión de TPO, fueron sometidas a secuenciado de DNA.

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(g) Plásmido pMP41

El plásmido pMP41 es diseñado para expresar los primeros 155 aminoácidos de TPO fusionados a un líder de 7 aminoácidos de la secuencia señal STII, después de un punto de rotura factor Xa. El plásmido fue construido uniendo conjuntamente tres piezas de DNA, la primera de las cuales era el vector pVEG31 descrito previamente, en el que el fragmento XbaI-SphI había sido eliminado. El segundo era el siguiente dúplex de DNA:

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La última pieza de la unión era el fragmento BgII-SphI de 1064 pares de base, procedente del plásmido pMP11 descrito anteriormente.

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(h) Plásmido pMP57

El plásmido pMP57 expresa los primeros 155 aminoácidos de TPO, aguas abajo de un líder que comprende 9 aminoácidos de la secuencia señal StlI y el punto Lys-Arg dibásico. Este punto dibásico proporciona un medio para eliminar el líder con la proteasa ArgC. Este plásmido fue construido uniendo conjuntamente tres piezas de DNA. La primera de ellas era el vector pVEG31 descrito anteriormente, en el que el fragmento XbaI-SphI pequeño había sido eliminado. El segundo era el siguiente dúplex de DNA:

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La última parte de la unión era el fragmento BglI-SphI de 1064 pares de base, procedente del plásmido pMP11 descrito anteriormente.

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(i) Plásmido pMP251

El plásmido pMP251 es un derivado de pMP210-1 en el que dos aminoácidos de TPO adicionales son incluidos en el extremo terminal carboxilo. Este plásmido fue construido uniendo conjuntamente dos piezas de DNA, siendo la primera de ellas el pMP21 descrito anteriormente, en el que el fragmento XbaI-ApaI pequeño había sido eliminado. La segunda parte de la unión era un fragmento XbaI-ApaI de 316 pares de base, procedente de pM210-1.

2. Transformación e inducción de E. coli con vectores de expresión de TPO. Para transformar la cepa 44C6 (w31 10 tonA \DeltarpoHts lon\Delta cip\Delta gaIE) de Ec. Coli, utilizando el procedimiento de choque de calor CaCl_{2} (Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53: 159-162, [1970]), se utilizaron los plásmidos de expresión de TPO mencionados anteriormente. Las células transformadas fueron primero cultivadas a 37ºC en medio LB conteniendo carbenicilina 50 pg/ml, hasta que la densidad óptica (600 nm) del cultivo se situó aproximadamente entre 2 y 3. El cultivo LB fue después diluido 20x en medio M9 conteniendo casaminoácidos 0,49% (peso/volumen) y carbenecilina aproximadamente 50 g/ml. Después del crecimiento con aireación a 30ºC durante 1 horas, se añadió ácido indol-3-acrílico, hasta alcanzar una concentración final de 50 11g/ml. Se dejó entonces que el medio de cultivo continuara creciendo a 30ºC, con aireación, durante otro período de 15 minutos, en cuyo momento se recogieron las células mediante centrifugación.

Ejemplo 4 Producción de TPO biológicamente activa (Met-1 1-153) en E. coli

Los procedimientos expuestos mas adelante para la producción de TPO renaturalizada, biológicamente activa, (Met^{-1} 1-153) pueden ser aplicados por analogía para la recuperación de otras variantes de TPO, incluyendo las formas extendidas N y C terminales.

Recuperación de TPO no soluble (Met^{-1} 1-153)

Células de E. coli que expresan la TPO (Met^{-1} 1-153) codificada por el plásmido pMP210-1 son fermentadas tal y como se ha descrito anteriormente. Habitualmente, aproximadamente 100 g de células son resuspendidas en 1 (10 volúmenes) de tampón de interrupción celular (Tris 10 mM, EDTA 5 mM, pH 8), con un homogeneizador Polytron y las células centrifugadas a 5000xg, durante un período de 30 minutos. El pellet celular lavado es de nuevo resuspendido en 1 L de tampón de interrupción celular con el homogeneizador Polytron y la suspensión celular es pasada a través de un Disrupter Cell LH (LH Inceltech, Inc) o a través de un Microfluidizer (Microfluidics International), de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. La suspensión es centrifugada a 5.000 x g durante un período de 30 minutos y resuspendida y centrifugada una segunda vez, para obtener un pellet lavado de cuerpo refráctil. El pellet lavado es utilizado inmediatamente o almacenado congelado a -70ºC.

B. Solubilización y purificación de TPO monómera (Met^{-1} 1-153)

El pellet obtenido anteriormente es resuspendido en 5 volúmenes en peso de Tris 20 mM, pH 8, con guanidina 6-8M, y DTT 25 mM (ditiotreitol) y sometido a agitación durante un período de entre 1 y 3 horas, o durante el transcurso de una noche, a 4ºC, para efectuar la solubilización de la proteína TPO. Concentraciones elevadas de urea (6-8M) resultan también de utilidad, pero generalmente a rendimientos más bajos, en comparación con guanidina. Finalizada la solubilización, la solución es centrifugada a aproximadamente 30.000 x g, durante un período de 30 minutos, para producir un sobrenadante claro que contiene la proteína TPO monómera, desnaturalizada. El sobrenadante es después cromatografiado sobre una columna de filtración en gel Superdex® 200 (Pharmacia, 2,6 x 60 cm), a un caudal de 2 ml/min y la proteína es eluida con fosfato sódico 20 mM, pH 6,0, con DTT 10 mM. Las fracciones que contienen la proteína TPO desnaturalizada monómera, eluyendo a entre 160 y 200 ml, son agrupadas. La proteína TPO es purificada adicionalmente sobre una columna en fase inversa C4 semi-preparativa (2 x 20 cm VYDAC). La muestra es aplicada a 5 ml/min. a una columna equilibrada en TFA (ácido trifluoroacético) al 0,1%, con acetonitrilo 30%. La proteína es eluida con un gradiente lineal de acetonitrilo (30-60%, en 60 minutos). La proteína reducida purificada eluye a aproximadamente acetonitrilo 50%. Este material es utilizado para renaturalizar, para obtener la variante TPO biológicamente activa.

C. Generación de TPO biológicamente activa (Met^{-1} 1-153)

Aproximadamente 20 mg de proteína TPO desnaturalizada y reducida, monómera, en 40 ml de TFA 0,1%/acetonitrilo 50% son diluidos en 360 ml de tampón renaturalizado, que contiene óptimamente los siguientes reactivos:

Tris 50 mM

NaCl 0,3M

EDTA 5 mM

Detergente CHAPS 2%

Glicerol 25%

Glutationa oxidada 5 mM

Glutationa reducida 1 mM

pH ajustado a 8,3

Después del mezclado, el tampón renaturalizador es agitado suavemente a 4ºC, durante un período de entre 12 y 48 horas, para proporcionar los máximos rendimientos de renaturalización de la forma de TPO unida correctamente a disulfuro (ver más adelante). La solución es después acidificada con TFA, hasta una concentración final del 0,2%, filtrada a través de un filtro de 0,45 o de 0,22 micras y se le añaden 110 volúmenes de acetonitrilo. La solución es después bombeada directamente hacia una columna en fase inversa C4 y la TPO purificada, renaturalizada (Met-1 1-153) es eluida con el mismo programa de gradiente mencionado anteriormente. La TPO biológicamente activa, renaturalizada, es eluida a aproximadamente acetonitrilo 45%, bajo estas condiciones, las versiones de TPO no correctamente unidas a disulfuro, son eluidas con anterioridad. La TPO final purificada (Met-1 1-153) resulta tener una pureza superior al 95%, valorada según los geles de SDS y cromatografía en fase inversa analítica en C4. Para estudios con animales, el material purificado en C4 fue sometido a dializais en tampones fisiológicamente compatibles. Se utilizaron tampones isotónicos (Acectato sódico 10 mM, pH 5,5, succinato sódico 10 mM, pH 5,5 ó fosfato sódico 10 mM, pH 7,4), conteniendo NaCl 150 mM y Tween® 80 0,01%.

Debido a la elevada potencia de la TPO en el ensayo Ba/F3 (la mitad de la estimulación máxima se alcanza a aproximadamente 3 pgml), resulta posible obtener material biológicamente activo utilizando muchos tampones diferentes, detergentes y condiciones redox. No obstante, bajo la mayoría de las condiciones, tan solo se obtiene una pequeña cantidad de material adecuadamente renaturalizado (<10%). Para procesos de fabricación industrial, resulta deseable alcanzar rendimientos de renaturalización de al menos el 10%, más preferiblemente de entre el 30 y el 50% y, muy preferiblemente, > al 50%. Para determinar la eficacia, con vistas a apoyar la obtención de elevados rendimientos de renaturalización, se valoraron muchos detergentes diferentes (Triton® X-100, dodecil-beta-maltosido, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarcosil, Tween® 20 y Tween® 80, Zwittergent 3-14 y otros). De entre estos detergentes, tan solo la familia CHAPS (CHAPS y CHAPSO) resultó ser generalmente útil en esta reacción de renaturalización para limitar la acumulación de proteína y la incorrecta formación de disulfuro. Los niveles de CHAPS superiores al 1% resultaron ser muy útiles. Para mejorar los rendimientos resultó necesaria la presencia de cloruro sódico, situándose los niveles óptimos entre 0,1M y 0,5M. La presencia de EDTA (1-5 mM) limitó la cantidad de oxidación catalizada por metal (y acumulación) que fue observada con algunas preparaciones. Las concentraciones de glicerol superiores a 15% proporcionaron las mejores condiciones para la renaturalización. Para la obtención de los rendimientos máximos, resultó esencial disponer de la glutationa oxidada y de la glutationa reducida y de la cisteína oxidada y reducida, como par de reactivos redox. Por regla general, los rendimientos más elevados fueron observados cuando la relación molar de reactivo oxidado es igual o superior al del componente reactivo reducido del par redox, y los valores de pH comprendidos entre 7,5 y aproximadamente 9, resultaron ser óptimos para la renaturalización de estas variantes de TPO. Los disolventes orgánicos (por ejemplo, etanol, acetonitrilo, metanol) fueron tolerados a concentraciones de entre el 10 y el 15% o inferiores. Niveles de disolventes orgánicos más elevados incrementaban la cantidad de formas plegadas incorrectamente. Los tampones tris y fosfato resultaron ser generalmente útiles. La incubación a 4ºC generó también rendimientos más elevados de TPO adecuadamente plegada.

Rendimientos de renaturalización de entre el 40 y el 60% (en base a la cantidad de TPO reducida y desnaturalizada utilizada en la reacción de renaturalización) resultan ser habituales para preparaciones de TPO que han sido purificadas a través del primer paso C4. El material activo puede ser obtenido con preparaciones menos puras (por ejemplo, directamente después de la columna Superdex 200 o después de la extracción inicial de cuerpo refráctil), si bien los rendimientos son inferiores debido a la precipitación extensiva y a la interferencia de proteínas no TPO durante el proceso de renaturalización.

Dado que la TPO (Met^{-1} 1-153) contiene 4 restos cisteína, resulta posible generar tres diferentes versiones disulfuro de esta proteína:

Versión 1: disulfuros entre los restos cisteína 1-4 y 2-3

Versión 2: disulfuros entre los restos cisteína 1-2 y 3-4

Versión 3: disulfuros entre los restos cisteína 1-3 y 2-4

Durante la exploración inicial para la determinación de las condiciones de renaturalización, se separaron, por medio de cromatografía en fase inversa C4, diferentes picos que contenían la proteína TPO. Tan solo uno de estos picos presentaba actividad biológica significativa, tal y como se determinó por medio del ensayo Ba/F3. Subsiguientemente, las condiciones de renaturalización fueron optimizadas para generar, preferentemente, esa versión. Bajo estas condiciones, las versiones plegadas incorrectamente resultan ser inferiores en un 20-30% del total de TPO monómero obtenida.

Por medio de espectrometría de masas y de secuenciado de proteínas, se ha determinado que el patrón disulfuro para la TPO biológicamente activa era 1-4 y 2-3 (a saber, la versión 1). Alícuotas de los diversos picos resueltos en C4 (entre 5-10 nmoles) fueron digeridos con tripsina (relación molar 1:25 de tripsina a proteína). La mezcla de digestión fue analizada por medio de espectroscopía de masa láser de desorpción, asistida por matriz, antes y después de la reducción con DDT. Finalizada la reducción, se detectaron las masas correspondientes a la mayoría de los péptidos trípticos de TPO más voluminosos. En las muestras no reducidas, faltaban algunas de estas masas y se detectó la presencia de otras nuevas. La masa de los nuevos picos correspondía básicamente a la suma de los péptidos trípticos individuales involucrados en el par disulfuro. Por lo tanto, resultaba posible asignar, de forma inequívoca, el patrón disulfuro del producto renaturalizado, recombinante, biológicamente activo de TPO, a 1-4 y 2-3. Esto está de acuerdo con el conocido patrón disulfuro de la molécula eritropoyetina relacionada.

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D. Actividad biológica de TPO renaturalizada, recombinante (Met 1-153)

La TPO renaturalizada y purificada (Met^{-1} 1-153) presenta actividad tanto en ensayos in vitro como en ensayos in vivo. En el ensayo Ba/F3, la mitad de la estimulación máxima de la incorporación de timidina en las células Ba/F3 fue alcanzada a los 3,3 pg/ml (0,3pM). En el ensayo ELISA basado en receptor mpl, la mitad de la estimulación máxima tenía lugar a 1,9 ng/ml (120 pM). En animales normales y en animales que presentan mielosupresión a raíz de radiación X casi mortal, la TPO (Met^{-1} 1-153) resultó altamente potente (se observó actividad a dosis tan bajas como 30 ng/ratón), para estimular la producción de nuevas plaquetas.

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Ejemplo 5 Datos procedentes de ratón con mielosupresión (carboplatino/irradiación) Procedimientos Animales

La totalidad de los estudios fueron aprobados por el Institutional Care and Use Committee of Genentech Inc. Con anterioridad al inicio del experimentos, todos los animales fueron marcados en la oreja para su identificación y se obtuvo un contaje de sangre completa de base (CBC). Grupos de 10 ratones hembras C57BL/6 fueron irradiados con 5,0 Gy de irradiación gamma, procedente de una fuente ^{137}Cs. Dentro de las siguientes 6 horas, a los animales se les proporcionaron 1,2 mg de carboplatino, en forma de inyección intraperitoneal de 200 \mul.

Se indican seguidamente los protocolos y los resultados obtenidos utilizando trombopoyetina de múrido recombinante (rmTPO), en un modelo de ratón estándar. Debe darse por entendido que un experto en la materia considera que este modelo resulta trasladable a los seres humanos. La trombopoyetina humana ha sido objeto de prueba en el mismo modelo de ratón y se averiguó que la misma mostraba una relevante actividad, si bien a un nivel más bajo, debido a la especificidad de la especie. Por lo tanto, se eligió el siguiente protocolo utilizando la contrapartida de TPO de múrido adecuada para la especie, a los efectos de poder demostrar el efecto relevante. De nuevo, la utilización de TPO humana en el protocolo de ratón proporcionaría un efecto similar, difiriendo tan solo en el grado. Obviamente, la utilización de TPO humana en seres humanos, otro modelo adecuado de comparación, requiere de la aprobación de las pruebas clínicas por parte de la FDA.

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Obtención de muestras de sangre

Con anterioridad al experimento y en puntos temporales a lo largo del estudio, 40 \mul de sangre fueron extraídos del seno orbital e inmediatamente diluidos en 10 mL de diluyente, con vista a evitar la coagulación. El contaje de la sangre completa (CBC) a partir de cada una de las muestras de sangre fue determinado en un analizador de sangre Serrono Baker system 9018, dentro de los 60 minutos posteriores a su recogida. Tan solo se extrajo sangre a la mitad de los animales en cada grupo de dosis en un determinado día, por lo que se extrajeron muestras de sangre de cada uno de los animales en puntos temporales alternativos.

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Regímenes de tratamiento

Experimento 1: con vistas a determinar la respuesta frente a trombopoyetina de múrido recombinante (mTPO335aa) en animales convertidos en trombocitopénicos, grupos de animales fueron tratados durante 1, 2, 4 u 8 días consecutivos con 0,1 \mug/día (5 \mug/kg/día, aproximadamente). El tratamiento con rmTPO (335aa) comenzó a aplicarse 24 horas después del inicio del modelo y se proporcionó mediante inyección diaria subcutánea de 100 \mul.

Experimento 2: con vistas a determinar la naturaleza de la relación dosis-respuesta para la rmTPO(335) en este modelo, se les proporcionó a los animales una única inyección de rmTPO(335), transcurridas 24 horas desde el inicio del modelo. Grupos de animales recibieron uno de 0,01, 0,03, 0,1 ó 0,3 \mug de rmTPO(335) en forma de inyección subcutánea única de 100 \mul. Con vistas a comparar dos rutas de administración, un experimento contemporáneo utilizó 4 grupos de animales que habían recibido idénticas dosis de rmTPO(335), pero a través de una vía intravenosa (vena de cola lateral).

Experimento 3: esta serie de experimentos fue efectuada para comparar la eficacia de diversas moléculas rmTPO truncadas pegiladas [(rmTPO(153)], acopladas a polietilenglicol (PEG).

i.: En este experimento, animales trombocitopénicos fueron inyectados (0,1 \mug, vía subcutánea) con una de las siguientes moléculas rmTPO(153) pegiladas: sin PEG, un PEG de 20K ó un PEG de 40K.

ii.: En el experimento final se compararon los efectos de la administración de una única molécula rmTPO(153) PEG 40K, proporcionando 0,1 \mug, ya sea a través de vía subcutánea o de vía intravenosa, a animales convertidos en trombocitopénicos. Como control positivo se utilizó rmTPO(335)(0,1 \mug).

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Resultados

La combinación de irradiación subletal y de carboplatino se tradujo en una respuesta reproducible que proporcionó una trombocitopenia consistente en el 100% de los animales. El nadir de la trombocitopenia tuvo lugar el día 10, con una recuperación gradual del número de plaquetas entre el día 21 y el día 28. Acompañando a esta trombocitopenia se generó una anemia pronunciada, con el nadir teniendo lugar ligeramente más tarde, entre el día 14 y el 17, y la recuperación hasta contaje de glóbulos rojos control, el día 28. Los contajes de glóbulos blancos presentaban también reducciones durante el curso del experimento.

Experimento 1: una dosis única de 0,1 \mug de rmTPO(335) fue proporcionada 24 horas después del inicio del modelo, acelerando la recuperación del número de plaquetas en este modelo múrido. Esta administración única de rmTPO(335) elevó el nadir de la respuesta desde 196 x 10^{3} \pm 33 x 10^{3}/ \mul el día 10, hasta 434 x 10^{3} \pm 7 x 10^{3}/\mul, el día 7. La tasa inicial de descenso en el número de plaquetas permanecía invariable pero la fase de recuperación resultaba mucho más rápida con números de plaquetas que volvían a la normalidad el día 14, lo cual ocurría el día 21 en el grupo control. Se observó alguna mejora adicional en la velocidad de recuperación proporcionando 0,1 \mug/día el día 1 y el día 2, pero la misma resultaba ser marginal. No se observó ninguna mejora adicional proporcionando rmTPO(335) durante 4 u 8 días consecutivos (Fig. 1a). Además de la recuperación acelerada en el número de plaquetas, la anemia que se desarrolla en estos animales resultó también atenuada por una única dosis de rmTPO(335, proporcionada el día 1. Al igual que ocurría con el contaje de plaquetas, no pudo obtenerse ninguna ventaja adicional proporcionando la rmTPO(335) más de una vez (Fig 1b). La rmTPO(335) no generaba efecto alguno sobre la leucocitopenia que acompaña a las caídas de plaqueta y a los contajes de glóbulos rojos (Fig 1c).

Experimento 2: la respuesta a dosis subcutáneas únicas de rmTPO(335), proporcionada 24 horas después del inicio del modelo, dependía de la dosis. La dosis experimentada más baja (0,01 \mug) no tenía efecto alguno sobre la recuperación de plaquetas, en comparación con los controles. No obstante, la respuesta era casi máxima cuando se administran 0,03 \mug (Fig. 2a). Esta curva dosis respuesta extremadamente escarpada se aprecia mejor cuando los números de plaquetas en el día 14 son expresados gráficamente sobre una gráfica logarítmica lineal (Fig. 3a). Una dosis respuesta similarmente escarpada es observada para la regulación de eritrocitos en este modelo (Fig 3b). La administración intravenosa de rmTPO(335) proporcionó una respuesta dependiente de dosis similar. No obstante, la dosis más baja experimentada (0,01 \mug) resultaba eficaz ciando se proporcionaba por vía iv, (Fig. 4a), sugiriendo que la curva dosis respuesta está desplazada hacia la izquierda. Este incremento en la potencia resulta pequeño, dado que el desplazamiento es de menos de la mitad de un orden de magnitud /Fig. 3a). Lo que resulta más importante es que ambas rutas de administración presentan los máximos comparables (Fig. 3a). Las rutas de administración subcutánea y la intravenosa aumentaron también la recuperación de la anemia, de una manera dependiente de la dosis (Figs. 2a, 3b, 4b). No obstante, ni la ruta de administración subcutánea ni la intravenosa tenían efecto alguno sobre la leucocitopenia, a lo largo de la gama de dosis experimentada (Figs, 2c, 4c).

Experimento 3

i.: La pegilación de la rmTPO(153) con, o bien PEG 20K o un único PEG 40K, tenía un efecto superior sobre la recuperación de plaquetas, que el de una molécula no pegilada. A diferencia de la molécula de longitud completa, ninguna de las moléculas rmTPO(153) pegiladas afectaba al nadir de la trombocitopenia, pero aceleraba en gran manera la fase de recuperación del modelo cuando se proporcionaba en forma de dosis única de 0,1 \mug sc., 24 horas antes del inicio del modelo (Fig 5a). Esto resulta muy evidente en el día 14, cuando los contajes de plaquetas son 80 x 10^{3} \pm 15 x 10^{3}/\mul. 268 x 10^{3} \pm 67 x 10^{3}/\mul, 697 x 10^{3} \pm 297 x 10^{3}/\mul y 878 x 10^{3} \pm 31 x 10^{3}/\mul para controles, rmTPO(153) no PEG, rmTPO(153) + PEG 20K y rmTPO(153) + PEG 40K, respectivamente (Fig. 5a). El mismo perfil resultaba también evidente sobre la respuesta de eritrocitos (Fig 5b). Ninguna de estas moléculas basadas en rmTPO(153) tenía efecto alguno sobre la leucocitopenia en este modelo (Fig. 5c).

ii.: La rmTPO(153) + PEG 40K (0,1 \mug), proporcionó una respuesta consistente cuando se administró ya sea en forma de inyección intravenosa única o de inyección subcutánea. En este experimento, la ruta subcutánea modificaba ligeramente el nadir el día 10 y devolvía a las plaquetas a los niveles control el día 14, en comparación con el día 28 del grupo control (Fig 6a). En los animales a los cuales se les había administrado el fármaco por vía intravenosa, se generaba un efecto similar sobre el nadir y la velocidad de recuperación (Fig 7a). La respuesta a la molécula rmTPO(153) truncada pegilada 40K resulta casi idéntica a la respuesta a la rmTPO(335), tanto sobre la recuperación de plaquetas como la de eritrocitos, cuando se proporciona ya sea por vía subcutánea (Fig. 6b) o por vía intravenosa (Fig. 7b). Tal como ocurre con los otros experimentos, la rmTPO(153) + PEG 40K, proporcionada o bien subcutánea o intravenosa, no tenía efecto algo sobre los niveles circulantes de glóbulos blancos (Figs. 6c y 7c). En experimentos paralelos, la utilización de versiones pegiladas 10K de esta molécula no modificaba la respuesta a rmTPO(153), tanto sobre la repoblación de plaquetas como la de eritrocitos.

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Se proporcionan seguidamente protocolos y resultados que utilizan terapia de dosis única con trombopoyetina humana recombinante (rhTPO_{332}) n pacientes humanos que reciben quimioterapia citotóxica:

Terapia de dosis única con trombopoyetina humana recombinante (rhTPO) en pacientes que reciben quimioterapia citotócixa.

Modelos preclínicos de quimiorradioterapia intensiva demostraron que una dosis única de rhTPO incruenta el nadir de plaquetas y reduce el periodo de trombocitopenia aguda. Se presentan los resultados obtenidos en el interim de dos estudios en Fases I, en los cuales dosis únicas de rhTPO fueron administradas a pacientes que reciben quimioterapia.

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Pacientes y procedimientos

Ambos estudios comenzaron con períodos de pre-quimioterapia de 21 días (ciclo 0), para valoración de la seguridad de rhTPO y de la respuesta de las plaquetas después de inyecciones en bolo IV únicas de 0,3, 0,6 ó 1,2 meg/kg (3 pacientes por grupo en cada uno de los estudios). Los pacientes recibieron después las mismas dosis de rhTPO después de la quimioterapia, en ciclos subsiguientes seleccionados. La población del primer estudio estaba compuesta por pacientes con malignidades avanzadas, los cuales recibieron rhTPO al día siguiente de la quimioterapia de rescate con tiotepa (65 mg/m^{2} q28d), en cada uno de dos ciclos de quimioterapia consecutivos. El segundo estudio incluía pacientes con sarcoma, sin tratamiento previo con quimioterapia, sometidos a tratamiento con inducción con quimioterapia Al (doxorrubicina 90 mg/m^{2}, 10 g/m^{2} q21d. Finalizado el ciclo 0, los pacientes de este estudio fueron monitorizados durante el primer ciclo de quimioterapia y recibieron una única inyección de rhTPO al día siguiente de completar la quimioterapia (d5), durante el segundo y los subsiguientes ciclos.

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Resultados

14 pacientes han sido tratados hasta la fecha. La rhTPO fue bien tolerada, sin que se haya informado al respecto de acontecimientos adversos graves atribuidos al fármaco en estudio. No se han observado anticuerpos frente a rhTPO. En el ciclo 0 la dosis más baja (0,3 mcg/kg) resultaba ser débilmente activa, incrementándose la actividad a dosis más elevadas, tal y como se muestra más adelante.

3

El contaje de plaquetas máximo, durante el ciclo 0, tenía lugar, en promedio, el día 11 (banda 7-14). No se detectaron cambios significativos en WBC o HCT. Los análisis FACS de médula ósea mostraron incrementos en todos los subgrupos CD34+ en 2/2 pacientes, después de 0,6 mcg/kg. Se observaron también incrementos en células CD34+ en sangre periférica en estos pacientes, sugiriendo que la TPO podría tener actividad movilizadora en células madre. El cálculo de la dosis y el tratamiento posterior a la quimioterapia están en curso.

Estos estudios en fase 1 sugirieron, en conjunto, que la administración única de dosis de rhTPO resulta segura y bien tolerada. Los niveles de dosis 0,3, 0,6 y 1,2 mcg/kg mostraron una creciente actividad trombopoyética. El tratamiento en curso de pacientes a niveles de dosis más elevadas someterá a prueba la hipótesis de que una única dosis de rhTPO resulta eficaz a la hora de mejorar la trombocitopenia, después de un tratamiento intenso con quimioterapia.

Conclusiones de interés

La descripción precedente detalla procedimientos específicos que pueden ser utilizados para llevar a la práctica la presente invención. Una vez detallados tales procedimientos específicos, los expertos en la materia conocerán perfectamente como diseñar procedimientos fiables alternativos y llegar a la misma información utilizando los frutos de la presente invención. Por lo tanto, con independencia del grado de detalle que aparece en las pruebas, el mismo no debe ser construido como limitativo de su campo de cobertura global; sino más bien que el ámbito de la presente invención tiene que ser tan solo determinado a través de la legal construcción de las reivindicaciones anexas.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 9414550 W [0001]

\bullet WO 9518858 A [0001] [0009]

\bullet US 9414553 W [0009] [0012] [0014] [0015]

\bullet WO 9526746 A [0013]: \bullet WO 9521919 A [0013]

\bullet WO 9521920 A [0013]: \bullet US 3779919 A [0031]

\bullet EP 58481 A [0031]: \bullet EP 133988 A [0031]

\bullet DE 3218121 [0033]: \bullet EP 52322 A [0033]

\bullet EP 36676 A [0033]: \bullet EP 88046 A [0033]

\bullet EP 143949 A [0033]: \bullet EP 142641 A [0033]

\bullet JP 58118008 A [0033]: \bullet US 4485045 A [0033]

\bullet US 4544545 A [0033]: \bullet EP 102324 A [0033]

\bullet US 4640835 A [0034]: \bullet US 4496689 A [0034]

\bullet US 4301144 A [0034]: \bullet US 4670417 A [0034]

\bullet US 4791192 A [0034]: \bullet US 4179337 A [0034]

\bullet EP 307247 A [0060] [0084]: \bullet US 4511502 A [0069]

\bullet US 4512922 A [0069]: \bullet US 4518526 A [0069]

\bullet US 4620948 A [0069]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

\bullet Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Disfunction. SCHAFNER et al. Internal Medicine. Brown & Co, 1990 [0009]

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\bulletLANGER et al. J. Biomed.. Mater. Res, 1981, vol. 15, 167-277 [0031]

\bulletLANGER. Chem. Tec, 1982, vol. 12, 98-105 [0031]

\bulletSIDMAN et al. Biopolymers, 1983, vol. 22, 547-556 [0031]

\bulletEPSTEIN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 3688-3698 [0033]

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\bulletANDREASON, G.L. J. Tissue Cult. Meth, 1993, vol. 15, 56 [0060]

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\bulletMANDEL, M. et al. J. Mol. Biol., 1970, vol. 53, 159-162 [0115]

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE: GENENTCH, INC.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVA ADMINISTRACIÓN DE TROMBOPOYETINA

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS:22

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Flehr, Hohbach, Test, Albritton & Herbert

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(B): CALLE: Four Embarcadero Center, Suite 3400

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(C): CIUDAD: San Francisco

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(D): ESTADO: California

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(E): PAÍS: Estados Unidos

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(F): ZIP: 94111

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(V): FORMA LEIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: disco flexible

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(B): ORDENADOR: IBM compatible PC

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: Patentln release #1.0, Version #1.30

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(vi):: DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/

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(B): FECHA DE SOLICITUD: CON LA PRESENTE

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii):: DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/697.631

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(B): FECHA DE SOLICITUD: 28-AGO-1996

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii):: DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/641.443

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(B): FECHA DE SOLICITUD: 29-ABRIL-1996

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(vii):: DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/591.925

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(B): FECHA DE SOLICITUD: 25-ENE-1996

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(viii):: INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE

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(A): NOMBRE: Dreger, Walter H.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 24.190

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/ARCHIVO: FP-62953-2

\vskip0.800000\baselineskip

(ix):: INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (415) 781-1989

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (415) 398-3249

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTAGCTCTA GACAGGGAAG GGAGCTGTAC ATGAGA

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 62 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

200

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 61 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

201

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGTTAAGA AGAAATGCGA TATTCTTTTT CATAATT

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 66 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

202

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 64 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

203

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 65 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

204

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 66 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

205

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCACCCTCT GCGTCAGGT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTACCTGA CGCAGAGG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 62 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

206

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGGACATG GGAGTCACGA AGCAGTTTAC TGAGAACAAA TGACTCTTG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACGACCTTC GATAAATGCG ATATTCTTTT TCATAATT

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i):: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACGTTTAAG AAGAAATGCG ATATTCTTTT TCATAATT

\hfill

Claims

1. Uso de una trombopoyetina para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un mamífero que padece trombocitopenia o que está en riesgo de padecerla, caracterizado porque el medicamento se administra en forma de dos dosis terapéuticas en un único día, en donde la citada dosis terapéutica oscila entre 0,5 y 1,5 \mug/kg cada una, en una administración en dos dosis, sin tratamiento suplementario con trombopoyetina, o en forma de una única dosis terapéutica, sin tratamiento suplementario con trombopoyetina, en donde la trombocitopenia es generada por quimioterapia o radioterapia.

2. Uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la quimioterapia es quimioterapia mielotóxica, destinada al tratamiento de leucemia o de tumores sólidos, o quimioterapia mieloablativa, para transplante de médula ósea autólogo o alogénico.

3. Uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el medicamento se destina al tratamiento del mamífero que padece o está en riesgo de padecer trombocitopenia, por medio de administración en forma de dosis terapéutica única.

4. Uso según la reivindicación 3, en donde la citada dosis terapéutica oscila entre 0,1 y 100 \mug/kg.

5. Uso según la reivindicación 4, en donde la citada dosis terapéutica oscila entre 0,1 y 1 \mug/kg.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se destina al tratamiento del mamífero que padece o está en riesgo de padecer trombocitopenia, en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente seleccionado de entre el grupo que comprende una citoquina, un factor estimulante de colonia e interleukina.

7. Uso según la reivindicación 6, en donde el agente es seleccionado de entre KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, FLR-3, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 e IL-11.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento está destinado para el tratamiento de un mamífero que padece o está en riesgo de padecer trombocitopenia, mediante administración intra-
venosa.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el medicamento está destinado al tratamiento de un mamífero que padece o esté en riesgo de padecer trombocitopenia, mediante administración subcutánea.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento está destinado para el tratamiento de un mamífero que padece o está en riesgo de padecer trombocitopenia, en combinación con un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. Uso según la reivindicación 10, en donde el citado soporte o excipiente contiene un agente quelante.

12. Uso según la reivindicación 11, en donde el citado agente quelante es EDTA.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la trombopoyetina es seleccionada de entre el grupo que comprende:

a): un fragmento de polipéptido;

b): un polipéptido variante;

c): un polipéptido quimérico;

d): un polipéptido pegilado.

14. Uso según la reivindicación 13, en donde el citado polipéptido pegilado es preparado con polietilenglicol.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la trombopoyetina es seleccionada de entre el grupo que comprende:

a): el polipéptido que es aislado procedente de un mamífero;

b): el polipéptido que es obtenido mediante medios recombinantes; y

c): el polipéptido que es obtenido mediante medios sintéticos.

\newpage

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la citada trombopoyetina es seleccionada de entre el grupo que comprende:

a): el polipéptido que es humano; y

b): el polipéptido que es no inmunógeno en un humano.

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la citada trombopoyetina está representada a través de la fórmula:

X-hTPO(7-151)-Y

en donde hTPO(7-151) representa la secuencia de aminoácidos TPO(hML) humana desde Cys^{7} hasta Cys^{151} inclusive; X representa el grupo amino de Cys^{7} o uno o más de los restos aminoácido amino-terminales de la TPO madura o sus extensiones de restos aminoácido, tales como Met, Lys, Tyr o sus sustituciones de aminoácido, tales como de arginina a lisina o trombina); e Y representa el grupo carboxi terminal de Cys^{151} o uno o más restos aminoácido carboxi-terminales de la TPO madura o de sus extensiones.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la citada trombopoyetina es trombopoyetina humana.

19. Uso según la reivindicación 18, en donde la citada trombopoyetina es trombopoyetina humana (332).

20. Uso según la reivindicación 19, en donde la citada trombopoyetina es trombopoyetina humana (153).

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde la citada trombopoyetina es rhTPO_{332}.

22. Trombopoyetina para ser utilizada en un procedimiento para el tratamiento de un mamífero que padece o está en riesgo de padecer trombocitopenia, comprendiendo el procedimiento la administración de la trombopoyetina en forma de dos dosis terapéuticas en un único día, en donde la citadas dosis terapéutica oscila entre 0,5 y 1,5 \mug/kg cada una, en una administración en dos dosis, sin tratamiento suplementario con trombopoyetina, o en forma de una única dosis terapéutica, sin tratamiento suplementario con trombopoyetina, en donde la trombocitopenia es generada por quimioterapia o radioterapia.

23. Trombopoyetina para ser utilizada según la reivindicación 22, en donde la quimioterapia es quimioterapia mielotóxica, destinada al tratamiento de leucemia o de tumores sólidos, o quimioterapia mieloablativa, destinada al transplante de médula ósea autólogo o alogénico.

24. Trombopoyetina para ser utilizada según la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en donde la trombopoyetina tiene que ser administrada en forma de dosis terapéutica única.

25. Trombopoyetina para ser utilizada según la reivindicación 24, en donde la citada dosis terapéutica oscila entre 0,1 y 100 \mug/kg.

26. Trombopoyetina para ser utilizada según la reivindicación 25, en donde la citada dosis terapéutica oscila entre 0,1 y 1 \mug/kg.

27. Trombopoyetina para ser utilizada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en donde la trombopoyetina está destinada para ser administrada en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente seleccionado de entre el grupo que comprende una citoquina, un factor estimulante de colonia e interleukina.

28. Trombopoyetina para ser utilizada según la reivindicación 27, en donde el agente es seleccionado de entre KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, FLR-3, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 e IL-11.

29. Trombopoyetina para ser utilizada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, en donde la trombopoyetina está destinada a ser administrada por vía intravenosa.

30. Trombopoyetina para ser utilizada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, en donde la trombopoyetina está destinada a ser administrada por vía subcutánea.

31. Trombopoyetina para ser utilizada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, en donde la trombopoyetina está destinada a ser administrada en combinación con un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.

32. Trombopoyetina para ser utilizada según la reivindicación 31, en donde el citado soporte o excipiente contiene un agente quelante.

33. Trombopoyetina para ser utilizada según la reivindicación 32, en donde el citado agente quelante es EDTA.

34. Trombopoyetina para ser utilizada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 33, en donde la trombopoyetina es seleccionada de entre el grupo que comprende:

a): un fragmento de polipéptido;

b): un polipéptido variante;

c): un polipéptido quimérico;

d): un polipéptido pegilado.

35. Trombopoyetina para ser utilizada según la reivindicación 34, en donde el citado polipéptido pegilado es obtenido con polietilenglicol.

36. Trombopoyetina para ser utilizada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 35, en donde la trombopoyetina es seleccionada de entre el grupo que comprende:

a): el polipéptido que es aislado procedente de un mamífero;

b): el polipéptido que es obtenido por medio de medios recombinantes; y

c): el polipéptido que es obtenido a través de medios sintéticos.

37. Trombopoyetina para ser utilizada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 36, en donde la trombopoyetina es seleccionada de entre el grupo que comprende:

a): el polipéptido que es humano; y

b): el polipéptido que es no inmunógeno en humanos

38. Trombopoyetina para ser utilizada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 37, en donde la citada trombopoyetina está representada a través de la fórmula:

X-hTPO(7-151)-Y

en donde hTPO(7-151) representa la secuencia de aminoácidos TPO(hML) humana desde Cys^{7} hasta Cys^{151} inclusive; X representa el grupo amino de Cys^{7} o uno o más de los restos aminoácido amino-terminales de la TPO madura o sus extensiones de restos aminoácido tales como Met, Lys, Tyr o sus sustituciones de aminoácido, tales como arginina a lisina o trombina); e Y representa el grupo carboxi terminal de Cys^{151} o uno o más restos aminoácido carboxi-terminales de la TPO madura o de sus extensiones.

39. Trombopoyetina para ser utilizada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 38, en donde la citada trombopoyetina es trombopoyetina humana.

40. Trombopoyetina para ser utilizada según la reivindicación 39, en donde la citada trombopoyetina es trombopoyetina humana (332).

41. Trombopoyetina para ser utilizada según la reivindicación 40, en donde la citada trombopoyetina es trombopoyetina humana (153).

42. Trombopoyetina para ser utilizada según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 41, en donde la citada trombopoyetina es rhTPR_{332}.