ES2312806T3

ES2312806T3 - Ensayo de vhc.

Info

Publication number: ES2312806T3
Application number: ES03755795T
Authority: ES
Inventors: Phillip Arcangel; David Chien
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2002-09-09
Filing date: 2003-09-08
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2023-09-08
Also published as: CN1694971B; BR0314166A; ATE410693T1; PL209710B1; US7166426B2; CA2498228C; CA2498228A1; DE60324003D1; NZ538711A; PL375600A1; WO2004021871A2; JP2009258128A; CN1694971A; AU2003273296B2; AU2003273296A1; EP1546414A2; JP2005538355A; EP1546414A4; NO337695B1; WO2004021871A3

Abstract

Un procedimiento de ensayo de tipo sándwich de antígeno-anticuerpo-antígeno de detección de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento: (a) proporcionar un soporte sólido de inmunoensayo que comprende antígenos del VHC unidos al mismo, en el que los antígenos del VHC están constituidos por uno o más antígenos aislados de una primera región de la poliproteína del VHC y en el que el uno o más antígenos aislados de la primera región de la poliproteína del VHC son uno o más epítopos conformacionales de NS3/4a aislados; (b) combinar una muestra biológica con dicho soporte sólido en condiciones que permiten a los anticuerpos frente al VHC, cuando están presentes en la muestra biológica, unirse a dicho uno o más antígenos del VHC; (c) añadir al soporte sólido de la etapa (b) en condiciones de formación de complejos un antígeno de fusión de múltiples epítopos del VHC (MEFA) marcado de manera detectable, en el que dicho MEFA marcado comprende al menos un epítopo de la región NS3/4a, en el que dicho MEFA se une a dicho anticuerpo frente al VHC unido; (d) detectar los complejos formados entre dicho anticuerpo frente al VHC y dicho uno o más antígenos de la primera región de la poliproteína del VHC y dicho MEFA, si hay alguno, como indicación de la infección por VHC en la muestra biológica.

Description

Ensayo del VHC. Campo técnico

La presente invención se refiere en general al diagnóstico viral. En particular, la invención se refiere a ensayos de tipo sándwich de antígeno/anticuerpo/antígeno que utilizan un primer antígeno aislado derivado de una región de la poliproteína del virus de la hepatitis C y un antígeno de fusión de múltiples epítopos que incluye múltiples epítopos de la poliproteína del VHC, múltiples epítopos que incluyen uno o más epítopos de la misma región de la poliproteína como el primer antígeno, para el diagnóstico preciso de la infección por el virus de la hepatitis C.

Antecedentes de la invención

El virus de la hepatitis C (VHC) es la causa principal de hepatitis no A, no B parenteral (NANBH) que se transmite en gran parte a través de transfusión de sangre y contacto sexual. El virus está presente en el 0,4 al 2,0% de los donantes de sangre. Se desarrolla hepatitis crónica en aproximadamente el 50% de las infecciones y de éstas, aproximadamente el 20% de los individuos infectados desarrollan cirrosis hepática que algunas veces conduce a carcinoma hepatocelular. Por consiguiente, el estudio y control de la enfermedad es de importancia médica.

El VHC se caracterizó e identificó por primera vez como una causa de NANBH por Houghten et al. Se conoce la secuencia genómica viral del VHC, así como procedimientos para obtener la secuencia. Véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales números WO 89/04669; WO 90/11089 y WO 90/14436. El VHC tiene un genoma de ARN monocatenario, de sentido positivo de 9,5 kb y es un miembro de la familia de virus Flaviridae. Se han identificado al menos seis genotipos distintos pero relacionados del VHC, basándose en análisis filogenéticos (Simmonds et al., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). El virus codifica una única poliproteína que tiene más de 3000 residuos de aminoácido (Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715). La poliproteína se procesa de manera co- y post-traduccional tanto en proteínas estructurales como no estructurales (NS).

En particular, tal como se muestra en la figura 1, están codificadas varias proteínas por el genoma del VHC. El orden y la nomenclatura de los productos de rotura de la poliproteína del VHC son tal como sigue: NH_{2}-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. La rotura inicial de la poliproteína está catalizada por proteasas del huésped que liberan tres proteínas estructurales, la proteína de la nucleocápsida N-terminal (denominada "núcleo") y dos glicoproteínas de la envuelta, AE1" (también conocida como E) y AE2" (también conocida como E2/NS1), así como proteínas no estructurales (NS) que contienen las enzimas virales. Las regiones NS se denominan NS2, NS3, NS4 y NS5. NS2 es una proteína integral de membrana con actividad proteolítica y, en combinación con NS3, rompe el enlace sissle NS2-NS3 que a su vez genera el extremo N-terminal de NS3 y libera una poliproteína grande que incluye tanto actividades serina proteasa como ARN helicasa. La proteasa NS3 sirve para procesar la poliproteína restante. En estas reacciones, NS3 libera un cofactor de NS3 (NS4a), dos proteínas (NS4b y NS5a) y una ARN polimerasa dependiente de ARN (NS5b). La finalización de la maduración de la poliproteína se inicia mediante rotura autocatalítica en la unión NS3-NS4a, catalizada por la serina proteasa NS3.

Se han descrito varios polipéptidos generales y específicos útiles como reactivos inmunológicos y de diagnóstico para el VHC, derivados de la poliproteína del VHC. Véanse, por ejemplo, Houghton et al., publicaciones europeas números 318.216 y 388.232; Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Houghton et al., Hepatology (1991) 14:381-388; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., publicación internacional número WO 93/00365; Chien, D.Y., publicación internacional número WO 94/01778. Estas publicaciones proporcionan unos antecedentes extensos sobre el VHC en general, así como sobre la fabricación y usos de reactivos inmunológicos de polipéptido del VHC.

Procedimientos específicos, sensibles, para detectar e identificar portadores del VHC y sangre o hemoderivados contaminados con VHC proporcionarían un importante avance en medicina. La hepatitis post-transfusional (HPT) se produce en aproximadamente el 10% de los pacientes a los que se ha realizado una transfusión, y el VHC ha explicado hasta el 90% de estos casos. El cuidado de los pacientes así como la prevención y la transmisión del VHC mediante sangre y hemoderivados o mediante el contacto personal estrecho requieren herramientas de diagnóstico y pronóstico fiables. Por consiguiente, se han desarrollado varios ensayos para el serodiagnóstico de la infección por VHC. Véanse, por ejemplo, Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Choo et al., Br. Med. Bull. (1990) 46: 423-441; Ebeling et al., Lancet (1990) 335:982-983; van der Poel et al., Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel et al., Lancet (1991) 337:317-319; Chien, D.Y., publicación internacional número WO 94/01778; Valenzuela et al., publicación internacional número WO 97/44469; y Kashiwakuma et al., patente estadounidense número 5.871.904.

Un problema significativo encontrado en algunos ensayos a base de suero es que hay un intervalo significativo entre la infección y la detección del virus que a menudo supera los 80 días. Este intervalo del ensayo puede provocar un gran riesgo para los receptores de transfusiones de sangre. Para superar este problema, se han desarrollado pruebas a base de ácido nucleico (NAT) que detectan ARN viral directamente, y pruebas del antígeno del núcleo del VHC que someten a ensayo el antígeno viral en lugar de la respuesta de anticuerpos. Véanse por ejemplo, Kashiwakuma et al., patente estadounidense número 5.871.904; Bold et al., Transfusion (2000) 40:575-579.

El documento WO 01/96870 describe un ensayo para detectar el VHC en el que se unen un epítopo de NS3/4a y un MEFA a un soporte sólido.

Chien et al (1999) Journal of Clinical Microbiology, vol. 37(5): 1393-97 describen un inmunoensayo que usa anticuerpo anti-ser humano unido a partículas paramagnéticas para capturar anticuerpos frente al VHC. Los anticuerpos frente al VHC se detectan usando un antígeno anti-SOD y MEFA.

El documento US 6.306.579 describe antígenos recombinantes de la región NS3 del VHC. Estos antígenos pueden usarse en un inmunoensayo para detectar el VHC.

El documento US 6.210.675 describe un ensayo para detectar NANBH (hepatitis no A, no B).

Sin embargo, persiste una necesidad de herramientas de diagnóstico y pronóstico sensibles, precisas, con el fin de proporcionar cuidados adecuados a los pacientes así como para prevenir la transmisión del VHC mediante sangre y hemoderivados o mediante el contacto personal estrecho.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el hallazgo de que el uso de un primer antígeno derivado de la poliproteína del VHC, en combinación con un antígeno de fusión de múltiples epítopos que incluye un epítopo de la misma región de la poliproteína del VHC que el primer antígeno, proporciona un procedimiento sensible y fiable para detectar el VHC. Los ensayos descritos en el presente documento puede detectar la infección por VHC provocada por cualquiera de los seis genotipos conocidos del VHC.

El primer antígeno incluye un epítopo conformacional de NS3/4a y el segundo antígeno es un antígeno de fusión de múltiples epítopos que incluye uno o más epítopos de la región NS3/4a. El uso de proteínas de fusión de múltiples epítopos disminuye los problemas de enmascaramiento, mejora la sensibilidad y detecta anticuerpos proporcionando un mayor número de epítopos en un área unitaria de sustrato y mejorando la selectividad. Además, los ensayos descritos en el presente documento pueden realizarse rápidamente y pueden usarse mayores volúmenes de muestra sin efectos de fondo.

Por consiguiente, en una realización, la invención objeto se refiere a un procedimiento de detección de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en una muestra biológica. El procedimiento comprende:

(a): proporcionar un soporte sólido de inmunoensayo que comprende antígenos del VHC unidos al mismo, en el que los antígenos del VHC están constituidos por uno o más antígenos aislados de una primera región de la poliproteína del VHC y en el que el uno o más antígenos aislados de la primera región de la poliproteína del VHC son uno o más epítopos conformacionales de NS3/4a aislados;

(b): combinar una muestra biológica con el soporte sólido en condiciones que permiten a los anticuerpos frente al VHC, cuando están presentes en la muestra biológica, unirse al uno o más antígenos del VHC;

(c): añadir al soporte sólido de la etapa (b) en condiciones de formación de complejos un antígeno de fusión de múltiples epítopos del VHC (MEFA) marcado de manera detectable, en el que el MEFA marcado comprende al menos un epítopo de la región NS3/4a; en el que el MEFA se une al anticuerpo frente al VHC unido;

(d): detectar los complejos formados entre el anticuerpo frente al VHC y el uno o más antígenos de la primera región de la poliproteína del VHC y dicho MEFA, si hay alguno, como indicación de la infección por VHC en la muestra biológica.

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En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección de la infección por VHC en una muestra biológica. El procedimiento comprende:

(a): proporcionar un soporte sólido de inmunoensayo que comprende antígenos del VHC unidos al mismo, en el que los antígenos del VHC están constituidos por uno o más antígenos de fusión de múltiples epítopos (MEFA);

(b): combinar una muestra biológica con el soporte sólido en condiciones que permiten a los anticuerpos frente al VHC, cuando están presentes en la muestra biológica, unirse al uno o más MEFA;

(c): añadir al soporte sólido de la etapa (b) en condiciones de formación de complejos un antígeno del VHC aislado marcado de manera detectable de una región de la poliproteína del VHC presente en el uno o más MEFA, en el que el antígeno del VHC aislado es un epítopo conformacional de NS3/4a aislado y el MEFA comprende al menos un epítopo de la región NS3/4a, y en el que el antígeno aislado se une al anticuerpo frente al VHC unido;

(d): detectar los complejos formados entre el anticuerpo frente al VHC y el antígeno del VHC aislado y dicho MEFA, si hay alguno, como indicación de la infección por VHC en la muestra biológica.

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Todavía en otra realización, la invención se refiere a un procedimiento de detección de la infección por VHC en una muestra biológica. El procedimiento comprende:

(a): proporcionar un soporte sólido de inmunoensayo que comprende antígenos del VHC unidos al mismo, en el que los antígenos del VHC están constituidos por uno o más epítopos conformacionales de NS3/4a del VHC;

(b): combinar una muestra biológica con el soporte sólido en condiciones que permiten a los anticuerpos frente al VHC, cuando están presentes en la muestra biológica, unirse al uno o más epítopos de NS3/4a;

(c): añadir al soporte sólido de la etapa (b) en condiciones de formación de complejos un antígeno de fusión de múltiples epítopos del VHC (MEFA) marcado de manera detectable, en el que el MEFA marcado comprende al menos un epítopo de la región NS3/4a del VHC, en el que el MEFA se une al anticuerpo frente al VHC unido;

(d): detectar los complejos formados entre el anticuerpo frente al VHC y el epítopo conformacional de NS3/4a y el MEFA, si hay alguno, como indicación de la infección por VHC en la muestra biológica.

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(a): proporcionar un soporte sólido de inmunoensayo que comprende antígenos del VHC unidos al mismo, en el que los antígenos del VHC están constituidos por uno o más antígenos de fusión de múltiples epítopos (MEFA) en el que el uno o más MEFA comprenden al menos un epítopo de la región NS3/4a del VHC;

(c): añadir al soporte sólido de la etapa (b) en condiciones de formación de complejos un epítopo conformacional de NS3/4a del VHC marcado de manera detectable, en el que el epítopo conformacional de NS3/4a se une al anticuerpo frente al VHC unido;

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En los procedimientos anteriores, el epítopo conformacional de NS3/4a y/o el MEFA comprenden un epítopo de la región proteasa NS3/4a de la poliproteína del VHC y/o un epítopo de la región helicasa NS3/4a de la poliproteína del VHC. En realizaciones particulares, el epítopo conformacional de NS3/4a comprende la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 3A-3D (SEC ID Nº: 1 y 2).

En realizaciones adicionales, el MEFA comprende los aminoácidos 1193-1657, numerados en relación con la secuencia del VHC-1. Aún en otras realizaciones, el MEFA comprende un epítopo de la región c33c de la poliproteína del
VHC, tales como los aminoácidos 1211-1457 y/o los aminoácidos 1192-1457, numerados en relación con el VHC-1.

En otras realizaciones, el MEFA comprende un epítopo de la región 5-1-1 de la poliproteína del VHC, tales como los aminoácidos 1689-1735, numerados en relación con el VHC-1.

En realizaciones particulares, el MEFA comprende la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 6A-6F (SEC ID Nº: 3 y 4) o la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 8A-8F (SEC ID Nº: 5 y 6).

Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos. Además, se exponen diversas referencias en el presente documento que describen en más detalle ciertos procedimientos o composiciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una representación esquemática del genoma del VHC, que representa las diversas regiones de la poliproteína de las que se derivan los reactivos del presente ensayo (proteínas y anticuerpos).

La figura 2 es un dibujo esquemático de un ensayo de tipo sándwich de antígeno/anticuerpo/antígeno representativo según la invención, usando MEFA 12.

Las figuras 3A a 3D (SEC ID Nº: 1 y 2) representan la secuencia de ADN y de aminoácidos correspondiente de un antígeno conformacional de NS3/4a representativo para su uso en los presentes ensayos. Los aminoácidos en las posiciones 403 y 404 de las figuras 3A a 3D representan sustituciones de Thr por Pro y Ser por Ile, de la secuencia de aminoácidos nativa del VHC-1.

La figura 4 es un diagrama de la construcción de pd.HCV1a.ns3ns4aPI.

La figura 5 es una representación esquemática de MEFA 12.

Las figuras 6A-6F (SEC ID Nº: 3 y 4) representan la secuencia de ADN y de aminoácidos correspondiente de MEFA 12.

La figura 7 es una representación esquemática de MEFA 7.1.

Las figuras 8A-8F (SEC ID Nº: 5 y 6) representan la secuencia de ADN y de aminoácidos correspondiente de MEFA 7.1.

Las figuras 9A-9C muestran MEFA representativos para su uso con los inmunoensayos objeto. La figura 9A es una representación esquemática de MEFA 3. La figura 9B es una representación esquemática de MEFA 5. La figura 9C es una representación esquemática de MEFA 6.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e inmunología, dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se explican en detalle en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Fundamental Virology, 2ª edición, vol. I & II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, vol. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Protein: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

Debe indicarse que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contenido establezca claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un antígeno" incluye una mezcla de dos o más antígenos, y similares.

Se usan las siguientes abreviaturas de aminoácidos a lo largo de todo el texto:

Alanina: Ala (A): Arginina: Arg (R)

Asparagina: Asn (N): Ácido aspártico: Asp (D)

Cisteína: Cys (C): Glutamina: Gln (Q)

Ácido glutámico: Glu (E): Glicina: Gly (G)

Histidina: His (H): Isoleucina: Ile (I)

Leucina: Leu (L): Lisina: Lys (K)

Metionina: Met (M): Fenilalanina: Phe (F)

Prolina: Pro (P): Serina: Ser (S)

Treonina: Thr (T): Triptófano: Trp (W)

Tirosina: Tyr (Y): Valina: Val (V)

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I. Definiciones

En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y pretenden definirse tal como se indica a continuación.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácido y no se limitan a una longitud mínima del producto. Por tanto, se incluyen péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares dentro de la definición. Se abarcan por la definición tanto proteínas de longitud completa como fragmentos de las mismas. Los términos también incluyen modificaciones tras la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, para los fines de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa), de la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como mediante mutaciones de los huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a amplificación por PCR.

Un polipéptido del VHC es un polipéptido, tal como se definió anteriormente, derivado de la poliproteína del VHC. No es necesario que el polipéptido se derive físicamente del VHC, sino que puede producirse de manera sintética o recombinante. Además, el polipéptido puede derivarse de cualquiera de las diversas cepas y aislados del VHC, tales como, pero sin limitarse a, cualquiera de los aislados de las cepas 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 del VHC. Se conocen varias regiones conservadas y variables entres estas cepas y, en general, las secuencias de aminoácidos de epítopos derivados de estas regiones tendrán un alto grado de homología de secuencia, por ejemplo, una homología de la secuencia de aminoácidos superior al 30%, preferiblemente superior al 40%, cuando se alinean las dos secuencias. Por tanto, por ejemplo, el término polipéptido "NS3/4a" se refiere a NS3/4a nativa de cualquiera de las diversas cepas del VHC, así como analogos, muteínas y fragmentos inmunogénicos de NS3/4a, tal como se definen adicionalmente a continuación. Se conocen los genotipos completos de muchas de estas cepas. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense número 6.150.087 y los números de acceso de GenBank AJ238800 y AJ238799.

Los términos "análogo" y "muteína" se refieren a derivados biológicamente activos de la molécula de referencia, o fragmentos de tales derivados, que conservan la actividad deseada, tal como inmunorreactividad en los ensayos descritos en el presente documento. En general, el término "análogo" se refiere a compuestos que tienen una secuencia y estructura de polipéptido nativas con una o más adiciones, sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa) y/o deleciones de aminoácidos, en relación con la molécula nativa, siempre que las modificaciones no destruyan la actividad inmunogénica. El término "muteína" se refiere a péptidos que tienen uno o más peptidomiméticos ("peptoides"), tales como los descritos en la publicación internacional número WO 91/04282. Preferiblemente, el análogo o la muteína tiene al menos la misma inmunoactividad que la molécula nativa. Se conocen en la técnica procedimientos para preparar análogos y muteínas de polipéptido y se describen adicionalmente a continuación.

Los análogos particularmente preferidos incluyen sustituciones que son de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Específicamente, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos, aspartato y glutamato; (2) básicos, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, puede pronosticarse de manera razonable que una sustitución aislada de leucina por isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido relacionado estructuralmente, no tendrán un efecto importante sobre la actividad biológica. Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta aproximadamente 5-10 sustituciones de aminoácidos no conservativas, o incluso hasta aproximadamente 15-25 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, o cualquier número entero entre 5-25, siempre que permanezca intacta la función deseada de la molécula. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente regiones de la molécula de interés que pueden tolerar el cambio mediante referencia a los gráficos de Hopp/Woods y Kyte-Doolittle, bien conocidos en la técnica.

Por "fragmento" se quiere decir un polipéptido que está constituido por sólo una parte de la secuencia y estructura de polipéptido de longitud completa intacta. El fragmento puede incluir una deleción C-terminal y/o una deleción N-terminal del polipéptido nativo. Un "fragmento inmunogénico" de una proteína del VHC particular incluirá generalmente al menos aproximadamente 5-10 residuos de aminoácido contiguos de la molécula de longitud completa, preferiblemente al menos aproximadamente 15-25 residuos de aminoácido contiguos de la molécula de longitud completa, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 20-50 o más residuos de aminoácido contiguos de la molécula de longitud completa, que definen un epítopo, o cualquier número entero entre 5 aminoácidos y la secuencia de longitud completa, siempre que el fragmento en cuestión conserve la inmunorreactividad en los ensayos descritos en el presente documento. Por ejemplo, los fragmentos inmunogénicos preferidos para su uso en los MEFA incluyen pero no se limitan a fragmentos del núcleo del VHC que comprenden, por ejemplo, los aminoácidos 10-45, 10-53, 67-88 y 120-130 de la poliproteína, el epítopo 5-1-1 (en la región de NS3 del genoma viral) así como epítopos definidos derivados de las regiones de E1, E2, c33c (NS3), c100 (NS4), NS3/4a y NS5 de la poliproteína del VHC, así como cualquiera de los otros diversos epítopos identificados a partir de la poliproteína del VHC. Véanse, por ejemplo, Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., publicación internacional número WO 93/00365; Chien, D.Y., publicación internacional número WO 94/01778; patentes estadounidenses números 6.150.087 y 6.121.020.

El término "epítopo" tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de al menos aproximadamente 3 a 5, preferiblemente de aproximadamente 5 a 10 ó 15, y no más de aproximadamente 1.000 aminoácidos (o cualquier número entero entre ellos), que definen una secuencia que por sí misma o como parte de una secuencia mayor, se une a un anticuerpo generado en respuesta a tal secuencia. No hay un límite superior crítico para la longitud del fragmento, que puede comprender casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprende dos o más epítopos de la poliproteína del VHC. Un epítopo para su uso en la invención objeto no se limita a un polipéptido que tiene la secuencia exacta de la parte de la proteína original de la que se deriva. De hecho, los genomas virales están en un estado de flujo constante y contienen varios dominios variables que presentan grados de variabilidad relativamente altos entre aislados. Por tanto, el término "epítopo" abarca secuencias idénticas a la secuencia nativa, así como modificaciones en la secuencia nativa, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa).

Pueden identificarse regiones de un polipéptido dado que incluyen un epítopo usando muchísimas técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, pueden determinarse epítopos lineales sintetizando, por ejemplo, de manera simultánea grandes números de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a partes de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras que los péptidos están unidos todavía a los soportes. Tales técnicas se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense número 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Usando tales técnicas, se han identificado varios epítopos del VHC. Véase, por ejemplo, Chien et al., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) págs. 320-324, y otros a continuación. De manera similar, se identifican fácilmente epítopos conformacionales determinando la conformación espacial de los aminoácidos tal como, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, citado anteriormente. También pueden identificarse regiones antigénicas de proteínas usando gráficos de antigenicidad e hidropatía convencionales, tales como los calculados usando, por ejemplo, el programa Omiga versión 1.0 disponible del Oxford Molecular Group. Este programa informático emplea el procedimiento de Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 para determinar perfiles de antigenicidad y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., J Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para los gráficos de hidropatía.

Para una descripción de diversos epítopos del VHC, véanse, por ejemplo, Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:533-39; Chien et al., publicación internacional número WO 93/00365; Chien, D.Y., publicación internacional número WO 94/01778; y las patentes estadounidenses números 6.280.927 y 6.150.087.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "epítopo conformacional" se refiere a una parte de una proteína de longitud completa, o un análogo o muteína de la misma, que tiene características estructurales nativas para la secuencia de aminoácidos que codifica el epítopo dentro de la proteína natural de longitud completa. Las características estructurales nativas incluyen, pero no se limitan a, la glicosilación y la estructura tridimensional. La longitud de la secuencia que define el epítopo puede estar sometida a amplias variaciones y se cree que estos epítopos se forman mediante la conformación tridimensional del antígeno (por ejemplo, plegamiento). Por tanto, los aminoácidos que definen el epítopo pueden ser relativamente pocos en número, pero ampliamente dispersos a lo largo de la longitud de la molécula (o incluso en diferentes moléculas en el caso de dímeros, etc.), que se llevan a una conformación correcta del epítopo mediante plegamiento. Las partes del antígeno entre los residuos que definen el epítopo pueden no ser críticas para la estructura conformacional del epítopo. Por ejemplo, la deleción o sustitución de estas secuencias intermedias puede no afectar al epítopo conformacional siempre que se mantengan las secuencias críticas para la conformación del epítopo (por ejemplo, cisteínas implicadas en enlaces disulfuro, sitios de glicosilación, etc.).

Los epítopos conformacionales presentes, por ejemplo, en la región NS3/4a se identifican fácilmente usando los procedimientos tratados anteriormente. Además, la presencia o ausencia de un epítopo conformacional en un polipéptido dado puede determinarse fácilmente a través de la selección del antígeno de interés con un anticuerpo (suero policlonal o monoclonal frente al epítopo conformacional) y comparando su reactividad con la de una versión desnaturalizada del antígeno que conserva sólo epítopos lineales (si conserva alguno). En tal selección usando anticuerpos policlonales, puede ser ventajoso absorber el suero policlonal en primer lugar con el antígeno desnaturalizado y observar si conserva anticuerpos frente al antígeno de interés. Adicionalmente, en el caso de NS3/4a, una molécula que conserva la conformación nativa también tendrá actividades enzimáticas proteasa y, opcionalmente, helicasa. Tales actividades pueden detectarse usando ensayos enzimáticos, tal como se describe adicionalmente a continuación.

Preferiblemente, se produce un epítopo conformacional de manera recombinante y se expresa en una célula de la que puede extraerse en condiciones que conservan sus características estructurales deseadas, por ejemplo sin desnaturalización del epítopo. Tales células incluyen células de bacterias, levaduras, insectos y mamíferos. La expresión y el aislamiento de epítopos conformacionales recombinantes a partir de la poliproteína del VHC se describen, por ejemplo, en las publicaciones internacionales números WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734. Como alternativa, es posible expresar los antígenos y renaturalizar además la proteína tras su recuperación. También se entiende que la síntesis química también puede proporcionar mimítopos de antígeno conformacional que reaccionan de manera cruzada con el epítopo conformacional del antígeno "nativo".

El término "antígeno de fusión de múltiples epítopos" o "MEFA" tal como se usa en el presente documento significa un polipéptido en el que múltiples antígenos del VHC son parte de una única cadena continua de aminoácidos, cadena que no se produce en la naturaleza. Los antígenos del VHC pueden conectarse directamente entre sí mediante enlaces peptídicos o pueden estar separados por secuencias de aminoácidos intermedias. Los antígenos de fusión también pueden contener secuencias exógenas a la poliproteína del VHC. Además, las secuencias del VHC presentes puede ser de múltiples genotipos y/o aislados del VHC. Los ejemplos de MEFA particulares para su uso en los presentes inmunoensayos se detallan, por ejemplo, en las publicaciones internacionales números WO 01/96875, WO 01/09609, WO 97/44469 y las patentes estadounidenses números 6.514.731 y 6.428.792.

Un "anticuerpo" significa una molécula que, a través de medios químicos o físicos, se une específicamente a un polipéptido de interés. Por tanto, un anticuerpo frente a NS3/4a del VHC es una molécula que se une específicamente a un epítopo de una proteína NS3/4a del VHC. El término "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento incluye anticuerpos obtenidos de preparaciones tanto policlonales como monoclonales, así como los siguientes: moléculas de anticuerpos híbridos (quiméricos) (véanse, por ejemplo, Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299; y la patente estadounidense número 4.816.567); fragmentos F(ab')2 y F(ab); moléculas de Fv (heterodímeros no covalentes, véanse, por ejemplo, Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096); moléculas de Fv de cadena sencilla (sFv) (véase, por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883); constructos de fragmentos de anticuerpos diméricos y triméricos; minicuerpos (véanse, por ejemplo, Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126); moléculas de anticuerpos humanizados (véanse, por ejemplo, Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536; y la publicación de patente británica número GB 2.276.169, publicada el 21 de septiembre de 1994); y cualquier fragmento funcional obtenido a partir de tales moléculas, en los que tales fragmentos conservan propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo original.

Una proteína "recombinante" es una proteína que conserva la actividad deseada y que se ha preparado mediante técnicas de ADN recombinante tal como se describe en el presente documento. En general, el gen de interés se clona y luego se expresa en organismos transformados, tal como se describe adicionalmente a continuación. El organismo huésped expresa el gen foráneo para producir la proteína en condiciones de expresión.

Por "aislado" se quiere decir, cuando se refiere a un polipéptido, que la molécula indicada está separada y diferenciada del organismo completo con el que la molécula se encuentra en la naturaleza o está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "aislado" con respecto a un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico que carece, en su totalidad o en parte, de las secuencias asociadas normalmente con ella en la naturaleza; o una secuencia, tal como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas en asociación con ella; o una molécula disociada del cromosoma.

Por "determinante antigénico equivalente" se quiere decir un determinante antigénico de diferentes subespecies o cepas del VHC, tal como de las cepas 1, 2, 3, etc. del VHC. Más específicamente, se conocen epítopos, tales como 5-1-1, y tales epítopos varían entre las cepas 1, 2 y 3. Por tanto, el epítopo 5-1-1 de las tres cepas diferentes son determinantes antigénicos equivalentes y por tanto son "copias" incluso aunque sus secuencias no sean idénticas. En general, las secuencias de aminoácidos de determinantes antigénicos equivalentes tendrán un alto grado de homología de secuencia, por ejemplo una homología de la secuencia de aminoácidos superior al 30%, preferiblemente superior al 40%, cuando se alinean las dos secuencias.

"Homología" se refiere a la similitud en porcentaje entre dos restos de polinucleótido o dos restos de polipéptido. Dos secuencias de ADN o dos secuencias de polipéptido son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias presentan una similitud de secuencia de al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 80%-85%, preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%-98% a lo largo de una longitud definida de las moléculas. Tal como se usa en el presente documento, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa con la secuencia de ADN o polipéptido especificada.

En general, "identidad" se refiere a una correspondencia de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido exacta de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptido, respectivamente. La identidad en porcentaje puede determinarse mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas alineando las secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100.

Pueden usarse programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el análisis de la similitud e identidad, tales como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 supl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 para el análisis de péptidos. Están disponibles programas para determinar la similitud de secuencias de nucleótidos en el Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package al que se hizo referencia anteriormente. Por ejemplo, puede determinarse la similitud en porcentaje de una secuencia de nucleótidos particular con respecto a una secuencia de referencia usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización por hueco de seis posiciones de nucleótidos.

Otro procedimiento de establecimiento de la similitud en porcentaje en el contexto de la presente invención es usar el paquete MPSRCH de programas cuyos derechos están registrados por la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). A partir de esta serie de paquetes, puede emplearse el algoritmo de Smith-Watennan en el que se usan parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización por apertura de hueco de 12, penalización por extensión de hueco de uno y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor de "coincidencia" refleja la "similitud de secuencia". Se conocen generalmente en la técnica otros programas adecuados para calcular la identidad o similitud en porcentaje entre secuencias, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, usado con parámetros por defecto. Por ejemplo, pueden usarse BLASTN y BLASTP usando los siguientes parámetros por defecto: código genético = convencional; filtro = ninguno; cadena = ambas; punto de corte = 60; esperado = 10; matriz = BLOSUM62; descripciones = 50 secuencias; clasificación mediante = HIGH SCORE; bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Pueden encontrarse detalles de estos programas en la siguiente dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Como alternativa, puede determinarse la homología mediante hibridación de polinucleótidos en condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido por digestión con nucleasa(s) específica(s) de cadena sencilla y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Pueden identificarse secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas en un experimento de hibridación de tipo Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas, tal como se definen para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro del conocimiento de la técnica. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; DNA Cloning, citado anteriormente; Nucleic Acid Hybridization, citado anteriormente.

"Soporte sólido común" significa una única matriz sólida a la que se unen los polipéptidos del VHC usados en los inmunoensayos objeto de manera covalente o por medios no covalentes tales como adsorción hidrófoba.

"Inmunológicamente reactivo" significa que el antígeno en cuestión reaccionará específicamente con anticuerpos anti-VHC presentes en una muestra biológica de un individuo infectado por VHC.

"Complejo inmunitario" significa la combinación formada cuando un anticuerpo se une a un epítopo en un antígeno.

Tal como se usa en el presente documento, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislada de un sujeto, que incluye pero no se limita a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, muestras de la piel, secreciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro que incluyen pero no se limitan a medios condicionados que resultan del crecimiento de células y tejidos en medio de cultivo, por ejemplo, células recombinantes y componentes
celulares.

Tal como se usan en el presente documento, las expresiones "marcador" y "marcador detectable" se refieren a una molécula que puede detectarse, incluyendo, pero sin limitarse a, isótopos radiactivos, agentes que fluorescen, agentes de quimioluminiscencia, cromóforos, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, colorantes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (por ejemplo, biotina, estreptavidina o haptenos) y similares. El término "agente de fluorescencia" se refiere a un sustrato o una parte del mismo que puede presentar fluorescencia en el intervalo detectable. Los ejemplos particulares de marcadores que pueden usarse en la invención incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa del rábano blanco (HRP), fluoresceína, FITC, rodamina, dansilo, umbeliferona, éster de dimetilacridinio (DMAE), rojo Texas, luminol, NADPH y \alpha,\beta-galactosidasa.

II. Modos de llevar a cabo la invención

Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a formulaciones o parámetros de procedimiento particulares ya que tales pueden variar, por supuesto. Debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es sólo para el fin de describir realizaciones particulares de la invención, y no pretende ser limitante.

Aunque pueden usarse varias composiciones y procedimientos similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica de la presente invención, los materiales y procedimientos preferidos se describen en el presente documento.

Tal como se indicó anteriormente, la presente invención se basa en el descubrimiento de procedimientos de diagnóstico de tipo sándwich de antígeno/anticuerpo/antígeno novedosos para la detección de la infección por VHC de manera precisa. Los procedimientos pueden ponerse en práctica rápida y eficazmente y eliminar los efectos de fondo que pueden producirse por el uso de grandes volúmenes de muestra. Los procedimientos utilizan preferiblemente antígenos del VHC sumamente inmunogénicos que están presentes durante los estadios tempranos de la seroconversión por VHC, aumentando de ese modo la precisión de la detección y reduciendo la incidencia de resultados
falsos.

En particular, los inmunoensayos descritos en el presente documento utilizan dos antígenos del VHC básicos, uno presente en la fase sólida y otro presente en la fase en disolución. Ambos antígenos pueden unirse a anticuerpos frente al VHC presentes en muestras biológicas de individuos infectados. Un antígeno usado en los ensayos objeto es un antígeno aislado de una región de la poliproteína del VHC. El segundo antígeno usado es un antígeno de fusión de múltiples epítopos ("MEFA") que comprende diversos polipéptidos del VHC, de los mismos o bien de diferentes genotipos y aislados del VHC. El MEFA incluye al menos uno o más epítopos derivados de la misma región de la poliproteína del VHC que el antígeno del VHC aislado.

En realizaciones particularmente preferidas, uno de los antígenos usados en los ensayos objeto es un epítopo conformacional sumamente inmunogénico derivado de la región NS3/4a de la poliproteína del VHC. En estas realizaciones, el segundo antígeno usado es un MEFA que incluye uno o más epítopos de la región NS3/4a (lineales o bien conformacionales), tal como se describe adicionalmente a continuación. Por tanto, el MEFA puede incluir múltiples dominios inmunodominantes derivados de la región NS3/4a de uno o más aislados del VHC. Si se usan múltiples epítopos de NS3/4a en la fusión de múltiples epítopos, pueden ser epítopos iguales o diferentes. Como alternativa, el antígeno de fusión puede incluir uno o más epítopos derivados de la región NS3/4a, así como epítopos lineales importantes de otras regiones del VHC tales como, sin limitación, secuencias del núcleo del VHC, E1, E2, P7, NS4b, NS5a y NS5b.

Los procedimientos pueden ponerse en práctica de manera conveniente en un único ensayo, usando cualquiera de los varios formatos de ensayo descritos a continuación, tales como pero sin limitarse a, formatos de ensayo que utilizan un soporte sólido al que se unen el antígeno del VHC aislado, tal como el epítopo conformacional de NS3/4a o bien el MEFA. Por tanto, el MEFA puede proporcionarse en la fase en disolución o bien en la sólida. Si se proporciona en disolución, el antígeno del VHC aislado está presente en la fase sólida.

Por ejemplo, en el procedimiento de la invención, el ensayo se realiza sobre un soporte sólido al que se han unido uno o más polipéptidos que incluyen uno o más epítopos conformacionales derivados de la región NS3/4a de la poliproteína del VHC. En esta realización, el MEFA se proporciona en la fase en disolución. En una realización alternativa, el ensayo se realiza sobre un soporte sólido al que se han unido uno o más MEFA. En esta realización, el polipéptido que incluye el epítopo de NS3/4a conformacional se proporciona en la fase en disolución. Por tanto, si el epítopo de NS3/4a conformacional está presente sobre el soporte sólido, el MEFA está presente en la fase en disolución y viceversa.

Con el fin de entender adicionalmente la invención, se proporciona una discusión más detallada a continuación referente a los diversos MEFA y antígenos de polipéptido del VHC para su uso en los procedimientos objeto, así como la producción de las proteínas y los procedimientos de uso de las proteínas.

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Antígenos del VHC y MEFA

Los genomas de las cepas del VHC contienen un único marco de lectura abierto de aproximadamente 9.000 a 12.000 nucleótidos, que se transcribe en una poliproteína. Tal como se muestra en la figura 1 y la tabla 1, una poliproteína del VHC, tras la rotura, produce al menos diez productos distintos, en el orden de NH_{2}-núcleo-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. El polipéptido del núcleo aparece en las posiciones 1-191, numeradas en relación con el VHC-1 (véase, Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:2451-2455, para el genoma del VHC-1). Este polipéptido se procesa adicionalmente para producir un polipéptido del VHC con aproximadamente los aminoácidos 1-173. Los polipéptidos de la envuelta, E1 y E2, aparecen aproximadamente en las posiciones 192-383 y 384-746, respectivamente. El dominio P7 se encuentra aproximadamente en las posiciones 747-809. NS2 es una proteína integral de la membrana con actividad proteolítica y se encuentra aproximadamente en las posiciones 810-1026 de la poliproteína. NS2, en combinación con NS3, (que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1027-1657), rompe el enlace sissle NS2-NS3 que a su vez genera el extremo N-terminal de NS3 y libera una poliproteína grande que incluye actividades tanto de serina proteasa como de ARN helicasa. La proteasa NS3, que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1027-1207, sirve para procesar la poliproteína restante. La actividad de helicasa se encuentra aproximadamente en las posiciones 1193-1657. NS3 libera un cofactor de NS3 (NS4a, que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1658-1711), dos proteínas (NS4b que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1712-1972 y NS5a que se encuentra aproximadamente en las posiciones 1973-2420) y una ARN polimerasa dependiente de ARN (NS5b que se encuentra aproximadamente en las posiciones 2421-3011). La finalización de la maduración de la poliproteína se inicia mediante la rotura autocatalítica en la unión NS3-Ns4a, catalizada por la serina proteasa NS3.

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Un componente de los procedimientos objeto es un antígeno aislado de cualquiera de la región NS3/4a de la poliproteína del VHC tal como se describió anteriormente. Se han determinado las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de varias cepas y aislados del VHC, incluyendo las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de las diversas regiones descritas anteriormente. Por ejemplo, el aislado HCV J1.1 se describe en Kubo et al. (1989) Japan. Nucl Acids Res. 17:10367-10372; Takeuchi et al. (1990) Gene 91:287-291; Takeuchi et al. (1990) J. Gen. Virol. 71:3027-3033; y Takeuchi et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:4626. Las secuencias codificantes completas de dos aislados independientes, HCV-J y BK, se describen por Kato et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9524-9528 y Takamizawa et al., (1991) J. Virol. 65:1105-1113 respectivamente.

Las publicaciones que describen aislados del VHC-1 incluyen Choo et al. (1990) Brit Med. Bull. 46:423-441; Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455 y Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:1711-1715. Los aislados HC-J1 y HC-J4 del VHC se describen en Okamoto et al. (1991) Japan J. Exp. Med. 60:167-177. Los aislados HCT 18, HCT 23, Th, HCT 27, EC1 y EC10 del VHC se describen en Weiner et al. (1991) Virol. 180:842-848. Los aislados Pt-1, HCV-K1 y HCV-K2 del VHC se describen en Enomoto et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 170:1021-1025. Los aislados A, C, D y E del VHC se describen en Tsukiyama-Kohara et al. (1991) Virus Genes 5:243-254.

Se ha descrito la región NS3/4a de la poliproteína del VHC y se dan a conocer la secuencia de aminoácidos y la estructura global de la proteína, por ejemplo, en Yao et al., Structure (noviembre de 1999) 7:1353-1363; Sali et al., Biochem. (1998) 37:3392-3401; y Bartenschlager, R, J. Viral Hepat. (1999) 6:165-181. Véase, también, Dasmahapatra et al., patente estadounidense número 5.843.752. Los inmunoensayos objeto pueden utilizar al menos un epítopo conformacional derivado de la región NS3/4a que existe en la conformación tal como se encuentra en la partícula del VHC que se produce en la naturaleza o su producto infeccioso, tal como se comprueba mediante la conservación de la proteasa y, opcionalmente, actividades enzimáticas helicasa presentadas normalmente por el producto génico de NS3/4a y/o inmunorreactividad del antígeno con anticuerpos en una muestra biológica de un sujeto infectado por HCV, y una pérdida de la inmunorreactividad del epítopo con la desnaturalización del antígeno. Por ejemplo, el epítopo conformacional puede perturbarse mediante calentamiento, cambiando el pH hasta extremadamente ácido o básico o añadiendo desnaturalizantes orgánicos conocidos, tales como ditiotreitol (DTT) o un detergente apropiado. Véase, por ejemplo, Protein Purification Methods, a practical approach (E.L.V. Harris y S. Angal eds., IRL Press) y el producto desnaturalizado en comparación con el producto que no se trata como anteriormente.

Puede determinarse la actividad de proteasa y helicasa usando ensayos enzimáticos convencionales bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la actividad de proteasa puede determinarse usando ensayos bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Takeshita et al., Anal. Biochem. (1997) 247:242-246; Kakiuchi et al., J. Biochem. (1997) 122:749-755; Sali et al., Biochemistry (1998) 37: 3392-3401; Cho et al., J. Virol. Meth. (1998) 72:109-115; Cerretani et al., Anal. Biochem. (1999) 266:192-197; Zhang et al., Anal. Biochem. (1999) 270:268-275; Kakiuchi et al., J. Virol. Meth. (1999) 80:77-84; Fowler et al., J. Biomol. Screen. (2000) 5:153-158; y Kim et al., Anal. Biochem. (2000) 284:42-48. Un ensayo particularmente conveniente para someter a prueba la actividad proteasa se expone en los ejemplos a continuación.

De manera similar, se conocen bien en la técnica ensayos de la actividad de helicasa y puede determinarse la actividad de helicasa de un epítopo de NS3/4a usando, por ejemplo, un ensayo ELISA, tal como se describe en, por ejemplo, Hsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 253:594-599; un sistema de ensayo de proximidad de centelleo, tal como se describe en Kyono et al., Anal. Biochem. (1998) 257: 120-126; ensayos de selección de alto rendimiento tal como se describen, por ejemplo, en Hicham et al., Antiviral Res. (2000) 46:181-193 y Kwong et al., Methods Mol. Med. (2000) 24:97-116; así como mediante otros procedimientos de ensayo conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Khu et al., J. Viral. (2001) 75:205-214; Utama et al., Virology (2000) 273:316-324; Paolini et al., J. Gen. Virol. (2000) 81: 1335-1345; Preugschat et al., Biochemistry (2000) 39:5174-5183; Preugschat et al., Methods Mol. Med. (1998) 19: 353-364; y Hesson et al., Biochemistry (2000) 39:2619-2625.

Si se usa un epítopo de NS3/4a conformacional, la longitud del antígeno es suficiente para mantener un epítopo conformacional inmunorreactivo. A menudo, el polipéptido que contiene el antígeno usado será casi de longitud completa, sin embargo, el polipéptido también puede estar truncado, por ejemplo, para aumentar la solubilidad o para mejorar la secreción. Generalmente, el epítopo conformacional que se encuentra en NS3/4a se expresa como un polipéptido recombinante en una célula y este polipéptido proporciona el epítopo en una forma deseada, tal como se describe en detalle a continuación.

Una secuencia de aminoácidos representativa para un polipéptido de NS3/4a se muestra en las figuras 3A a 3D (SEC ID Nº: 1 y 2). La secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 2-686 de las figuras 3A a 3D corresponde a las posiciones de aminoácidos 1027-1711 del VHC-1. Se muestra un codón de iniciación (ATG) que codifica Met, como la posición 1. Adicionalmente, la Thr que aparece normalmente en la posición 1428 del VHC-1 (posición de aminoácido 403 de la figura 3) está mutada a Pro, y la Ser que aparece normalmente en la posición 1429 del VHC-1 (posición de aminoácido 404 de la figura 3) está mutada a Ile. Sin embargo, pueden usarse la secuencia nativa, con o sin una Met N-terminal, el análogo representado, con o sin la Met N-terminal, o bien otros análogos y fragmentos en los ensayos objeto, siempre que el epítopo se produzca usando un procedimiento que conserve o reinstaure su conformación nativa de modo que la actividad de proteasa y, opcionalmente la actividad de helicasa, se conservan. Dasmahapatra et al., patente estadounidense número 5.843.752 y Zhang et al., patente estadounidense número 5.990.276, describen ambas análogos de NS3/4a.

La proteasa NS3 de NS3/4a se encuentra aproximadamente en las posiciones 1027-1207, numeradas en relación con el VHC-1, posiciones 2-182 de la figura 3. Se conocen la estructura de la proteasa NS3 y el sitio activo. Véase, por ejemplo, De Francesco et al., Antivir. Ther. (1998) 3:99-109; Koch et al., Biochemistry (2001) 40:631-640. Los cambios en la secuencia nativa que se tolerarán normalmente serán aquéllos fuera del sitio activo de la molécula. Particularmente, se desea mantener los aminoácidos 1- o 2-155 de la figura 3, con pocas o solamente sustituciones conservativas. Los aminoácidos que aparecen más allá de la posición 155 tolerarán cambios mayores. Adicionalmente, si se usan fragmentos de la secuencia de NS3/4a, estos fragmentos incluirán generalmente al menos los aminoácidos 1- o 2-155, preferiblemente los aminoácidos 1- o 2-175, y lo más preferiblemente los aminoácidos 1- o 2-182, con o sin la Met N-terminal. El dominio helicasa se encuentra aproximadamente en las posiciones 1193-1657 del VHC-1 (posiciones 207-632 de la figura 3). Por tanto, si se desea actividad helicasa, se mantendrá estar parte de la molécula con pocos o sólo cambios conservativos. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente otras regiones que tolerarán el cambio basándose en la estructura conocida de NS3/4a.

Se conocen varios antígenos que incluyen epítopos derivados de NS3/4a, incluyendo, pero sin limitarse a antígenos derivados de las regiones c33c, c200, c100 y 5-1-1, así como proteínas de fusión que comprenden un epítopo de NS3, tal como c25.

Para una descripción de estos y otros epítopos del VHC diversos de otras regiones del VHC, véanse, por ejemplo, Houghton et al, patente estadounidense número 5.350.671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., publicación internacional número WO 93/00365; Chien, D.Y., publicación internacional número WO 94/01778; y patentes estadounidenses números 6.280.927 y 6.150.087.

Los inmunoensayos descritos en el presente documento utilizan también antígenos de fusión de múltiples epítopos (denominados "MEFA"), tal como se describe en publicaciones internacionales números WO 01/96875, WO 01/09609, WO 97/44469 y patentes estadounidenses números 6.514.731 y 6.428.792. Los MEFA para su uso en los ensayos objeto incluyen múltiples epítopos derivados de cualquiera de las diversas regiones virales mostradas en la figura 1 y tabla 1, y tal como se describió anteriormente.

Los múltiples antígenos del VHC son parte de una única cadena continua de aminoácidos, cadena que no aparece en la naturaleza. Por tanto, el orden lineal de los epítopos es diferente de su orden lineal en le genoma en el que aparecen. El orden lineal de las secuencias de los MEFA para su uso en el presente documento está dispuesto preferiblemente para una antigenicidad óptima. Preferiblemente, los epítopos provienen de más de una cepa de VHC, proporcionando así la capacidad añadida para detectar múltiples cepas de VHC en un único ensayo. Por tanto, los MEFA para su uso en el presente documento pueden comprender diversas regiones inmunogénicas derivadas de la poliproteína descrita anteriormente.

Tal como se explicó anteriormente, se usa un epítopo de NS3/4a como antígeno del VHC aislado. En esta realización, el MEFA incluye al menos uno o más epítopos derivados de la región NS3/4a (lineal o bien conformacional). El MEFA puede incluir por tanto múltiples epítopos inmunodominantes derivados de la región NS3/4a de uno o más aislados del VHC. Si se usan múltiples epítopos de NS3/4a en la fusión de múltiples epítopos, éstos pueden ser epítopos iguales o diferentes. Como alternativa, el antígeno de fusión puede incluir uno o más epítopos derivados de la región NS3/4a, así como epítopos lineales principales de otras regiones del VHC tales como, sin limitación, secuencias de E1, E2, P7, NS4b, NS5a, NS5b y del núcleo del VHC.

Los polipéptidos que comprenden epítopos derivados de la región NS3/4a incluyen, sin limitación, polipéptidos que comprenden todas o parte de las regiones de NS3, NS4a y NS3/4a. Se conocen varios epítopos de estas regiones, incluyendo, pero sin limitarse a antígenos derivados de las regiones c33c, c200 y c100, así como proteínas de fusión que comprenden un epítopo de NS3, tal como c25. Éstos y otros epítopos de NS3 son útiles en los presentes ensayos y se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Houghton et al, patente estadounidense número 5.350.671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:533-39; Chien et al., publicación internacional número WO 93/00365; Chien, D.Y., publicación internacional número WO 94/01778; y patentes estadounidenses números 6.346.375 y 6.150.087.

Además, el determinante antigénico conocido como 5-1-1 está parcialmente dentro de la región de NS4a (véase la figura 1) y es particularmente útil en los MEFA para su uso en los ensayos objeto. Este determinante antigénico aparece en tres formas diferentes en tres cepas virales diferentes de VHC. Por consiguiente, en una realización preferida de la invención las tres formas de 5-1-1 aparecen en el antígeno de fusión de múltiples epítopos usado en los inmunoensayos objeto.

Los epítopos de VHC adicionales para su uso en los MEFA incluyen cualquiera de los diversos epítopos descritos anteriormente, tales como epítopos derivados de la región hipervariable de E2, tal como una región que abarca los aminoácidos 384-410 ó 390-410, o la secuencia consenso de esta región. tal como se describió anteriormente (Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn) (SEC ID Nº: 7), que representa una secuencia consenso para los aminoácidos 390-410 del genoma del VHC tipo 1. Un epítopo de E2 representativo presente en un MEFA de la invención puede comprender un epítopo híbrido que abarca los aminoácidos 390-444. Un epítopo de E2 híbrido puede incluir una secuencia consenso que representa los aminoácidos 390-410 fusionados a la secuencia de aminoácidos nativa para los aminoácidos 411-444 de E2 del VHC.

Tal como se explicó anteriormente, los antígenos pueden derivarse de diversas cepas de VHC. Se conocen múltiples cepas virales de VHC, y pueden usarse epítopos derivados de cualquiera de estas cepas en una proteína de fusión. Se conoce bien que cualquier especie dada de organismo varia de un organismo individual a otro y además que un organismo dado como un virus puede tener varias cepas diferentes. Por ejemplo, tal como se explicó anteriormente, el VHC incluye al menos 6 genotipos. Cada uno de estos genotipos incluye determinante antigénicos equivalentes. Más específicamente, cada cepa incluye varios determinantes antigénicos que están presentes en todas las cepas del virus pero son ligeramente diferentes de una cepa viral a otra. De manera similar, también pueden estar presentes determinantes antigénicos equivalentes de la región del núcleo de diferentes cepas de VHC. En general, los determinantes antigénicos equivalentes tienen un alto grado de homología en cuando a la secuencia de aminoácidos, grado de homología que generalmente es del 30% o más, preferiblemente del 40% o más, cuando se alinean. El epítopo de múltiples copias de la presente invención puede incluir también múltiples copias que son copias exactas del mismo epítopo.

Los MEFA representativos para su uso con los presentes ensayos se muestran en las figuras 5, 7 y 9A-9C, y se describen en las publicaciones internacionales números WO 01/96875, WO 01/09609, WO 97/44469 y las patentes estadounidenses números 6.514.731 y 6.428.792. Los MEFA representativos para su uso en el presente documento incluyen aquéllos denominados MEFA 3, MEFA 5, MEFA 6, MEFA 7.1, MEFA 12, MEFA 13 y MEFA 13.1. Ha de entenderse que estos MEFA son meramente representativos y que tendrán utilidad otros epítopos derivados del genoma del VHC con los presentes ensayos y pueden incorporarse a estos u otros MEFA.

La secuencia de ADN y secuencia de aminoácidos correspondiente de MEFA 12 se muestra en las figuras 6A a 6F (SEC ID Nº:3 y 4). La fórmula estructural general para MEFA 12 se muestra en la figura 5 y es tal como sigue: hSOD-E1(tipo 1)-consenso de NVR de E2(tipo 1a)-consenso de HVR de E2(tipos I y 2)-c33c corta(tipo 1)-5-1-1(tipo 1)-5-1-1(tipo 3)-5-1-1(tipo 2)-c100(tipo 1)-NS5(tipo 1)-NS5(tipo 1)-núcleo(tipos 1+2)-núcleo(tipos 1+2). Este epítopo de múltiples copias incluye la siguiente secuencia de aminoácidos, enumerada en relación con el VHC-1 (la numeración de los aminoácidos expuesta a continuación sigue la designación de la numeración proporcionada Choo, et al. (1991) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, en la que el aminoácido nº 1 es la primera metionina codificada por la secuencia codificante de la región del núcleo): aminoácidos 1-69 de superóxido dismutasa (SOD truncada, usada para potenciar la expresión recombinante de la proteína); aminoácidos 303 a 320 de la poliproteína de la región de E1; aminoácidos 390 a 410 de la poliproteína, que representa una secuencia consenso para la región hipervariable de E2 de VHC-1a; aminoácidos 384 a 414 de la poliproteína de la región de E2, que representa una secuencia consenso para las regiones hipervariables de E2 del VHC-1 y VHC-2; aminoácidos 1211-1457 de la poliproteína del VHC-1 que definen la helicasa; tres copias de un epítopo de 5-1-1, aminoácidos 1689-1735, una del VHC-1, una de VHC-3 y una del VHC-2, copias que son determinantes antigénicos equivalentes de las tres cepas virales diferente de VHC; polipéptido de VHC c100 del VHC-1, aminoácidos 1901-1936 de la poliproteína; dos copias exactas de un epítopo de la región de NS5 del VHC-1, cada una con los aminoácidos 2278 a 2313 de la poliproteína del VHC; y dos copias de tres epítopos de la región del núcleo, dos del VHC-1 y una del VHC-2, copias que son determinantes antigénicos equivalentes representados por los aminoácidos 9 a 53 y 64-88 del VHC-1 y 67-84 del VHC-2.

La tabla 2 muestra las posiciones de aminoácidos de los diversos epítopos en MEFA 12 con referencia a las figuras 6A a 6F en el presente documento (SEC ID Nº:3 y 4). La numeración en las tablas es en relación con el VHC-1. Véase, Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455. Los MEFA 13 y 13.1 comparten también la fórmula general especificada anteriormente para MEFA 12, con modificaciones tal como se indica en las tablas 3 y 4, respectivamente.

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3

4

6

La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos correspondiente de otro antígeno de fusión de múltiples epítopos representativo, MEFA 7.1, se muestra en las figuras 8A a 8F (SEC ID Nº: 5 y 6). La fórmula estructural general para MEFA 7.1 se muestra en la figura 7 y es tal como sigue: hSOD-E1(tipo 1)-consenso de HVR de E2(tipo 1a)-consenso de HVR de E2(tipos 1 y 2)-helicasa(tipo 1)-5-1-1(tipo 1)-5-1-1(tipo 3)-5-1-1(tipo 2)-c100(tipo 1)-NS5(tipo 1)-NS5(tipo 1)-núcleo(tipos 1+2)-núcleo(tipos 1+2). Este epítopo de múltiples copias incluye la siguiente secuencia de aminoácidos, numerada en relación con el VHC-1 (la numeración de los aminoácidos expuesta a continuación sigue la designación de la numeración proporcionada en Choo, et al. (1991) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, en la que el aminoácido nº 1 es la primera metionina codificada por la secuencia codificante de la región del núcleo): aminoácidos 1-156 de superóxido dismutasa (SOD, usada para potenciar la expresión recombinante de la proteína); aminoácidos 303 a 320 de la poliproteína de la región de E1; aminoácidos 390 a 410 de la poliproteína, que representan una secuencia consenso para la región hipervariable de E2 de VHC-1a; aminoácidos 384 a 414 de la poliproteína de la región de E2, que representan una secuencia consenso para las regiones hipervariables de E2 del VHC-1 y VHC-2; aminoácidos 1193-1658 de la poliproteína del VHC-1 que definen la helicasa; tres copias de un epítopo de 5-1-1, aminoácidos 1689-1735, una del VHC-1, una del VHC-3 y una del VHC-2, copias que son determinantes antigénicos equivalentes de las tres cepas virales diferentes del VHC; polipéptido del VHC C100 del VHC-1, aminoácidos 1901-1936 de la poliproteína; dos copias exactas de un epítopo de la región de NS5 del VHC-1, cada una con los aminoácidos 2278 a 2313 de la poliproteína del VHC; y dos copias de un epítopo de la región del núcleo, una del VHC-1 y otra del VHC-2, copias que son determinantes antigénicos equivalentes representados por los aminoácidos 9 a 32, 39-42 y 64-88 del VHC-1 y 67-84 del VHC-2.

La tabla 5 muestra las posiciones de aminoácidos de los diversos epítopos con referencia a las figuras 8A a 8F en el presente documento (SEC ID Nº: 5 y 6).

8

En un formato de ensayo, se combina la muestra con el soporte sólido, tal como se describe más adelante adicionalmente. El soporte sólido incluye el antígeno del VHC aislado, tal como uno o más epítopos conformacionales de NS3/4a, o bien un MEFA tal como se describió anteriormente, incluyendo el MEFA uno o más epítopos derivados de la misma región de la poliproteína como el antígeno del VHC, tal como de la región NS3/4a. Tal como se explicó anteriormente, se conocen varios antígenos que incluyen tales epítopos, incluyendo, pero sin limitarse a antígenos derivados de las regiones c33c y c100, así como proteínas de fusión que comprenden un epítopo de NS3, tal como c25, y el determinante antigénico conocido como 5-1-1 que está parcialmente dentro de la región de NS4a (véase, la figura 1). Estos y otros epítopos de NS3/4a son útiles en los presentes ensayos y se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Houghton et al, patente estadounidense número 5.350.671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:533-39; Chien et al., publicación internacional número WO 93/00365; Chien, D.Y., publicación internacional número WO 94/01778; y patentes estadounidenses números 6.346.375 y 6.150.087.

Si la muestra está infectada por VHC, los anticuerpos frente al VHC para un epítopo presente en el soporte sólido se unirán a los componentes del soporte sólido. También se añade en la fase de disolución un antígeno marcado de manera detectable que también reacciona con el anticuerpo frente al VHC capturado de la muestra biológica. Por ejemplo, si el antígeno unido al soporte sólido es un epítopo conformacional de NS3/4a, el antígeno marcado de manera detectable usado en la fase de disolución es un MEFA que incluye un epítopo de NS3/4a. Si el antígeno unido al soporte sólido es un MEFA que incluye un epítopo de NS3/4a, el antígeno marcado de manera detectable usado en la fase de disolución incluye un epítopo conformacional de NS3/4a.

En la figura 2 se representa un ensayo representativo según la invención. Tal como se muestra en la figura, el soporte sólido incluye un epítopo conformacional de NS3/4a. Se añade la muestra biológica al soporte sólido. Los anticuerpos frente al VHC dirigidos contra el epítopo de NS3/4a presente en la muestra se unirán al epítopo conformacional de NS3/4a en el soporte sólido. Entonces se añade MEFA 12 marcado con peroxidasa del rábano blanco (HRP), que incluye un epítopo al que se unen los anticuerpos de la muestra. MEFA 12 se une al anticuerpo que también está unido mediante el epítopo conformacional de NS3/4a. Los componentes no unidos se eliminan por lavado y la detección del marcador indica la presencia de infección por VHC.

Los ensayos de tipo sándwich de antígeno/anticuerpo/antígeno descritos anteriormente son particularmente ventajosos ya que el uso de dos antígenos que se unen al anticuerpo de muestra permite el uso de mayores volúmenes de muestra. Adicionalmente, el ensayo puede completarse rápidamente.

Producción de antígenos para su uso en los inmunoensayos del VHC

Tal como se explicó anteriormente, las moléculas de la presente invención se producen generalmente de manera recombinante. Por tanto, pueden obtenerse polinucleótidos que codifican antígenos del VHC para su uso con la presente invención utilizando técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótido que codifican las moléculas descritas anteriormente pueden obtenerse usando procedimientos recombinantes, tales como mediante exploración en librerías genómicas y de ADNc a partir de células que expresan el gen, o mediante derivación del gen a partir de un vector que se sabe que incluye el mismo. Además, el gen deseado puede aislarse directamente de moléculas de ácido nucleico viral, usando técnicas descritas en la técnica, tal como en Houghton et al., patente estadounidense número 5.350.671. El gen de interés también puede producirse sintéticamente, en lugar de clonarse. Las moléculas pueden diseñarse con codones apropiados para la secuencia particular. La secuencia completa se ensambla entonces a partir de oligonucleótidos solapantes preparados mediante procedimientos convencionales y se ensamblan en una secuencia codificante completa. Véanse, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; y Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

Por tanto, pueden obtenerse secuencias de nucleótidos particulares a partir de vectores que albergan las secuencias deseadas o pueden sintetizarse completamente o en parte usando diversas técnicas de síntesis de oligonucleótidos conocidas en la técnica, tales como técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuando sea apropiado. Véase, por ejemplo, Sambrook, citado anteriormente. En particular, un procedimiento de obtención de secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias deseadas es mediante la reasociación de conjuntos complementarios de oligonucleótidos sintéticos solapantes producidos en un sintetizador de polinucleótidos automático convencional, seguido por acoplamiento con una ADN ligasa apropiada y amplificación de la secuencia de nucleótidos acoplados mediante PVR. Véase, por ejemplo, Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088. Adicionalmente, puede usarse síntesis dirigida por oligonucleótidos (Jones et al. (1986) Nature 54:75-82), mutagénesis dirigida por oligonucleótidos de regiones de nucleótidos pre-existentes (Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 y Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), y rellenado enzimático de oligonucleótidos con huecos usando la ADN polimerasa de T4 (Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033) según la invención para proporcionar moléculas que tienen capacidades de unión a antígeno alteradas o mejoradas y/o inmunogenicidad reducida.

Una vez preparadas o aisladas las secuencias codificantes, tales secuencias pueden clonarse en cualquier vector o replicón adecuado. Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de clonación y la selección de un vector de clonación apropiado es cuestión de elección. Los vectores adecuados incluyen, pero sin limitarse a, plásmidos, fagos, transposones, cósmidos, cromosomas o virus que pueden replicarse cuando se asocian con los elementos de control apropiados.

Entonces se coloca la secuencia codificante bajo el control de elementos de control adecuados, dependiendo del sistema que va a usarse para la expresión. Por tanto, la secuencia codificante puede colocarse bajo el control de un promotor, sitio de unión a ribosomas (para la expresión en bacterias) y, opcionalmente, un operador, de modo que la secuencia de ADN de interés se transcribe en ARN mediante un transformante adecuado. La secuencia codificante puede contener o no un péptido señal o secuencia líder que puede eliminarse más tarde mediante el procesamiento post-traduccional en el huésped. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397.

Además de las secuencias de control, podría ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias en relación con el crecimiento de la célula huésped. Los expertos en la técnica conocen las secuencias reguladoras y los ejemplos incluyen las que producen la expresión de un gen que va a activarse o desactivarse en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes en el vector otros tipos de elementos reguladores. Por ejemplo, pueden usarse en el presente documento elementos de potenciador para aumentar los niveles de expresión de los constructos. Los ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano de SV40 (Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761), el potenciador/promotor derivado de la repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777) y elementos derivados del CMV humano (Boshart et al. (1985) Cell 41:521), tales como elementos incluidos en la secuencia del intrón A del CMV (patente estadounidense número 5.688.688). El casete de expresión puede incluir además un origen de replicación para la replicación autónoma en una célula huésped adecuada, uno o más marcadores seleccionables, uno o más sitios de restricción, un potencial para un número de copias alto y un
promotor fuerte.

Se construye un vector de expresión de modo que la secuencia codificante particular se ubica en el vector con las secuencias reguladoras, la colocación y la orientación de la secuencia codificante apropiadas con respecto a las secuencias de control que son tales que la secuencia codificante se transcribe bajo el "control" de las secuencias de control (es decir, la ARN polimerasa que se une a la molécula de ADN en las secuencias de control transcribe la secuencia codificante). Puede ser deseable la modificación de las secuencias que codifican la molécula de interés para lograr este fin. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de modo que pueda unirse a las secuencias de control en la orientación apropiada; es decir, para mantener el marco de lectura. Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden acoplarse a la secuencia codificante antes de su inserción en un vector. Como alternativa, la secuencia codificante puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.

Tal como se explicó anteriormente, puede ser deseable producir mutantes y análogos del antígeno de interés. Esto es particularmente cierto con NS3/4a. Los procedimientos para hacer esto se describen en, por ejemplo, Dasmahapatra et al., patente estadounidense número 5.843.752 y Zhang et al., patente estadounidense número 5.990.276. Pueden prepararse mutantes o análogos de esta y otras proteínas del VHC para su uso en los ensayos objeto mediante la deleción de una parte de la secuencia que codifica el polipéptido de interés, mediante la inserción de una secuencia y/o mediante la sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas para modificar las secuencias de nucleótidos, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y similares. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; Kunkel, T.A. (1985) Pro. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al. (1987) BioTechniques 5: 786; Zoller y Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 6409.

Las moléculas pueden expresarse en una amplia variedad de sistemas, incluyendo sistemas de expresión de insectos, mamíferos, bacterias, virus y levaduras, tal como se conoce bien en la técnica.

Por ejemplo, los expertos en la técnica conocen los sistemas de expresión de insectos, tales como los sistemas de baculovirus, y se describen en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Boletín Nº 1555 (1987). Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión en células de baculovirus/insecto están comercialmente disponibles en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). De manera similar, los sistemas de expresión en células de bacterias y mamíferos se conocen bien en la técnica y se describen en, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente. Los sistemas de expresión en levaduras también se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, Londres.

También se conocen varias células huésped apropiadas para su uso con los sistemas anteriores. Por ejemplo, se conocen en la técnica líneas celulares de mamífero e incluyen líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo Culture (ATCC), tal como, pero sin limitarse a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido (BHK), células de riñón de mono (COS), células de riñón embrionario humano, células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñón bovino Madin-Darby ("MDBK"), así como otras. De manera similar, los huéspedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp., encontrarán uso con los presentes constructos de expresión. Los huéspedes de levaduras útiles en la presente invención incluyen, entre otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las células de insecto para su uso con vectores de expresión de baculovirus incluyen, entre otros, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni.

Las moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de nucleótidos de interés pueden integrarse de manera estable en un genoma de célula huésped o pueden mantenerse en un elemento episomal estable en una célula huésped adecuada usando diversas técnicas de suministro de genes bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.399.346.

Dependiendo del sistema de expresión y del huésped seleccionados, las moléculas se producen haciendo crecer las células huésped transformadas mediante un vector de expresión descrito anteriormente en condiciones mediante las cuales se expresa la proteína. Entonces se aísla la proteína expresada de las células huésped y se purifica. Si el sistema de expresión secreta la proteína en los medios de crecimiento, el producto puede purificarse directamente de los medios. Si no se secreta, puede aislarse de los lisados celulares. La selección de las condiciones de crecimiento y los procedimientos de recuperación apropiados están dentro del conocimiento de la técnica.

Se ha descrito la producción recombinante de diversos antígenos del VHC. Véanse, por ejemplo, Houghton et al., patente estadounidense número 5.350.671; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien et al., publicación internacional número WO 93/00365; Chien, D.Y., publicación internacional número WO 94/01778.

Ensayos de inmunodiagnóstico

Una vez producidos, los antígenos del VHC anteriores se colocan sobre un soporte sólido apropiado para su uso en los inmunoensayos objeto. Un soporte sólido, para los fines de esta invención, puede ser cualquier material que sea una matriz insoluble y puede tener una superficie rígida o semirrígida. Los soportes sólidos a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitarse a, sustratos tales como nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de pocillo de microtitulación o membrana); poli(cloruro de vinilo) (por ejemplo, pocillos de microtitulación o láminas); látex de poliestireno (por ejemplo, placas de microtitulación o perlas); poli(fluoruro de vinilideno); papel diazotado; membranas de nailon; perlas activadas, perlas que responden magnéticamente y similares. Los soportes particulares incluyen placas, gránulos, discos, capilares, fibras huecas, agujas, pasadores, fibras sólidas, perlas de celulosa, perlas de vidrio poroso, geles de sílice, perlas de poliestireno opcionalmente reticulado con divinilbenceno, perlas de copolímero injertado, perlas de poliacrilamida, perlas de látex, perlas de dimetilacrilamida opcionalmente reticulada con N-N'-bis-acriloiletilendiamina y partículas de vidrio revestidas con un polímero hidrófobo.

Si se desea, las moléculas que van a añadirse al soporte sólido pueden funcionalizarse fácilmente para crear restos de estireno o acrilato, permitiendo así la incorporación de las moléculas en poliestireno, poliacrilato u otros polímeros tales como poliimida, poliacrilamida, polietileno, polivinilo, polidiacetileno, polifenilenvinileno, polipéptido, polisacárido, polisulfona, polipirrol, poliimidazol, politiofeno, poliéter, resinas epoxídicas, vidrio de sílice, gel de sílice, siloxano, polifosfato, hidrogel, agarosa, celulosa y similares.

En un contexto, se hace reaccionar en primer lugar un soporte sólido con el antígeno del VHC aislado o bien con el MEFA (denominado "el componente de la fase sólida" en el presente documento), en condiciones de unión adecuadas de manera que las moléculas estén suficientemente inmovilizadas en el soporte. En ocasiones, la inmovilización en el soporte puede mejorarse acoplando en primer lugar el antígeno a una proteína con mejores propiedades de unión a la fase sólida. Las proteínas de acoplamiento adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, macromoléculas tales como albúminas séricas incluyendo albúmina sérica bobina (BSA), hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la técnica. Otros reactivos que pueden usarse para unir moléculas al soporte incluyen polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido y similares. Tales moléculas y procedimientos de acoplamiento de estas moléculas a los antígenos se conocen bien por los expertos habituales en la técnica. Véanse, por ejemplo, Brinkley, M.A. (1992) Bioconjugate Chem. 3:2-13; Hashida et al. (1984) J. Appl. Biochem. 6:56-63; y Anjaneyulu y Staros (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30:117-124.

Tras hacer reaccionar el soporte sólido con los componentes de la fase sólida, se eliminan los componentes de la fase sólida no inmovilizados del soporte mediante lavado y entonces se ponen en contacto los componentes unidos al soporte con una muestra biológica que se sospecha que contiene anticuerpos frente al VHC (denominadas "moléculas de ligando" en el presente documento) en condiciones de unión adecuadas. Tras lavar para eliminar cualquier molécula de ligando no unida, se añade un segundo antígeno del VHC (un antígeno del VHC aislado o bien el MEFA, dependiendo de qué antígeno esté unido al soporte sólido), en condiciones de unión adecuadas. Este segundo antígeno se denomina "componente de la fase de disolución" en el presente documento. El antígeno añadido incluye un marcador detectable, tal como se describió anteriormente, y se une a moléculas de ligando que han reaccionado con el antígeno unido al soporte. Por tanto, las moléculas de ligando se unen al componente de la fase sólida así como al componente de la fase de disolución. Las moléculas de ligando no unidas y los componentes de la fase de disolución se eliminan mediante lavado. Por tanto, la presencia de un marcador indica la presencia de anticuerpos frente al VHC en la muestra biológica.

Más particularmente, puede usarse un procedimiento de ELISA, en el que los pocillos de una placa de microtitulación están revestidos con los componentes de la fase sólida. Entonces se añade una muestra biológica que contiene o que se sospecha que contiene moléculas de ligando a los pocillos revestido. Tras un periodo de incubación suficiente para permitir la unión ligando-molécula al componente de la fase sólida inmovilizado, puede(n) lavarse la(s) placa(s) para eliminar los restos no unidos y se añade un componente de la fase de disolución marcado de manera detectable. Se permite que estas moléculas reaccionen con cualquier anticuerpo de muestra capturado, se lava la placa y se detecta la presencia del marcador usando procedimientos bien conocidos en la técnica.

Los reactivos de ensayo descritos anteriormente, incluyendo el soporte sólido de inmunoensayo con antígenos unidos, así como los antígenos que van a reaccionar con la muestra capturada, pueden proporcionarse en kits, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios, con el fin de realizar inmunoensayos tal como se describió anteriormente. El kit también puede contener, dependiendo del inmunoensayo particular usado, marcadores adecuados y otros materiales y reactivos envasados (es decir, tampones de lavado y similares). Usando estos kits, pueden realizarse inmunoensayos convencionales, tales como los descritos anteriormente.

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III. Parte experimental

A continuación se encuentran ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solamente para fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ningún modo.

Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero debe permitirse, por supuesto, cierto error y desviación experimentales.

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Ejemplo 1 Producción de un epítopo conformacional de NS3/4a con sustituciones de Thr por Pro y Ser por Ile

Se obtuvo un epítopo conformacional de NS3/4a tal como sigue. Este epítopo tiene la secuencia especificada en las figuras 3A a 3D (SEC ID Nº: 1 y 2) y se diferencia de la secuencia nativa en las posiciones 403 (aminoácido 1428 de la secuencia de longitud completa del VHC-1) y 404 (aminoácido 1429 de la secuencia de longitud completa del VHC-1). De manera específica, la Thr que aparece de manera natural en la posición 1428 de la secuencia nativa se ha mutado a Pro y la Ser que aparece en la posición 1429 de la secuencia nativa se ha mutado a Ile.

En particular, el vector de expresión de levadura usado fue pBS24,1. Este vector de expresión de levadura contiene secuencias de 2\mu y repeticiones invertidas (RI) para la replicación autónoma en levadura, el terminador de \alpha-factor para garantizar la terminación de la transcripción, y los leu2-d y URA3 de levadura para la selección. El origen de replicación de ColE1 y el gen de \beta-lactamasa también están presentes para la propagación y selección en E. coli (Pichuantes et al. (1996) "Expression of Heterologous Gene Products in Yeast." En: Protein Engineering: A Guide to Design and Production, Capítulo 5. J. L. Cleland y C. Craik, eds., Wiley-Liss, Inc., Nueva York, N.Y. págs.
129-161.

Se produjo el plásmido pd.VHC1a.ns3ns4aPI, que codificada un epítopo de NS3/4a representativo usado en los inmunoensayos objeto, tal como sigue. Se usó un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, se acoplaron entre sí las siguientes partes de ADN: (a) oligonucleótidos sintéticos que proporcionarían un sitio de clonación HindIII en el sentido 5', seguido de la secuencia ACAAAACAAA (SEC ID Nº: 8), el iniciador ATG, y codones para VHC-Ia, comenzando con el aminoácido 1027 y continuando hasta un sitio BglI en el aminoácido 1046; (b) un fragmento de restricción BglI-ClaI de 683 pb (que codifica los aminoácidos 1046-1274) de pAcHLTns3ns4aPI; y (c) un vector pSP72 (Promega, Madison; WI, número de acceso de GenBank/EMBL X65332) que se había digerido con HindIII y ClaI, desfosforilado y purificado en gel. Se derivó el plásmido pAcHLTns3ns4aPI de pAcHLT, un vector de expresión de baculovirus comercialmente disponible de BD Pharmingen (San Diego, CA). En particular, se preparó un vector de EcoRI-PstI pAcHLT, así como los siguientes fragmentos: EcoRI-AlwnI, 935 pb, correspondiente a los aminoácidos 1027-1336 del genoma del VHC-1; AlwnI -SacII, 247 pb, correspondiente a los aminoácidos 1336-1419 del genoma del VHC-1; HinfI-BglI, 175 pb, correspondiente a los aminoácidos 1449-1509 del genoma del VHC-1; BglI-PstI, 619 pb, correspondiente a los aminoácidos 1510-1711 del genoma del VHC-1, más el codón de terminación de la transcripción. Se ligó un fragmento generado sintéticamente de SacII-HinfI de 91 pb, correspondiente a los aminoácidos 1420-1448 del genoma del VHC-1 y que contenía las mutaciones PI (Thr-1428 mutada a Pro, Ser-1429 mutada a Ile), con el fragmento de 175 pb de HinfI-BglI y el fragmento de 619 pb de BglI-PstI descritos anteriormente y subclonados en un vector pGEM-5Zf(+) digerido con SacII y PstI. pGEM-5Zf(+) es un vector de E. coli comercialmente disponible (Promega, Madison, WI, número de acceso de GenBank/EMBL X65308). Tras la transformación de células HB101 competentes, análisis de mini-selección de clones individuales y verificación de secuencia, se purificó en gel un fragmento de SacII-PstI de 885 pb a partir del gen 2 de pGEM5.PI. Se ligó este fragmento con el fragmento de 935 pb de EcoRI-AlwnI, el fragmento de 247 pb de AlwnI-SacII y el vector pAcHLT de EcoRI-PstI, descritos anteriormente. El constructo resultante se denominó pAcHLTns3ns4aPI.

Se transformó la mezcla de acoplamiento anterior en células competentes HB101 y se sembró en placa en placas de agar Luria que contenían ampicilina 100 \mug/ml. Los análisis Miniprep de los clones individuales condujeron a la identificación de supuestos positivos, dos de los cuales se amplificaron. El ADN del plásmido para pSP72 1aHC, clones nº 1 y nº 2 se prepararon con un kit Maxiprep de Qiagen y se secuenciaron.

A continuación, se acoplaron entre sí los siguientes fragmentos: (a) un fragmento de 761 pb de HindIII-ClaI a partir de pSP721aHC nº 1 (pSP72,1aHC se generó acoplando entre sí lo siguiente: pSP72 que se había digerido con HindIII y ClaI, oligonucleótidos sintéticos que proporcionarían un sito de clonación HindIII en el sentido de 5', seguido de la secuencia ACAAAACAAA (SEC ID Nº: 8), el codón de iniciación ATG, y codones para VHC1a, comenzando con el aminoácido 1027 y continuando hasta un sitio BglII en el aminoácido 1046, y un fragmento de restricción de 683 pb de BglII-ClaI (que codifica los aminoácidos 1046-1274) de pAcHLTns3ns4aPI); (b) un fragmento de 1353 pb de BamHI-HindIII para el promotor híbrido de levadura ADH2/GAPDH; (c) un fragmento de 1320 pb de ClaI-SalI (que codifica los aminoácidos 1046-1711 de VHC1a con la Thr 1428 mutada a Pro y la Ser 1429 mutada a Ile) de pAcHLTns3ns4aPI; y (d) el vector de expresión de levadura pBS24,1 que se había digerido con BamHI y SalI, desfosforilado y purificado en gel. Se transformó la mezcla de acoplamiento en HB 101 competentes y se sembró en placa en placas de agar Luria que contenían ampicilina 100 \mug/ml. Los análisis Miniprep de colonias individuales condujeron a la identificación de clones con el inserto de 3446 pb de BamHI-SalI esperado que estaba constituido por el promotor ADH2/GAPDH, el codón iniciador ATG y NS3/4a de VHC1a de los aminoácidos 1027-1711 (mostrados como aminoácidos 1-686 de las figuras 3A-3D), con la Thr 1428 (posición de aminoácido 403 de las figuras 3A-3D) mutada a Pro y la Ser 1429 (posición de aminoácido 404 de las figuras 3A-3D) mutada a Ile. El constructo se denominó pd.VHC1a.ns3ns4aPI (véase la figura 4).

Se transformó la cepa AD3 de S. cerevisiae con pd.VHC1a.ns3ns4aPI y se examinaron transformantes individuales para determinar la expresión tras el agotamiento de glucosa en el medio. Se expresó la proteína recombinante a altos niveles en levadura, tal como se detecta mediante tinción con azul de Coomassie y se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo policlonal para el dominio helicasa de NS3.

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Ejemplo 2 Purificación del epítopo conformacional de NS3/4a

Se purificó el epítopo conformacional de NS3/4a tal como sigue. Se recogieron células de S. cerevisiae de anteriormente, que expresan el epítopo de NS3/4a tal como se describió anteriormente. Se suspendieron las células en tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0,1 \muM, leupeptina 1 \muM) y se lisaron en un Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basilea, Suiza) o aparato equivalente usando perlas de vidrio, a una proporción de 1:1:1 células:tampón:perlas de vidrio de 0,5 mm. Se centrifugó el lisado a 30100 x g durante 30 min. a 4ºC y se añadió el sedimento que contenía la fracción de proteína insoluble al tampón de lavado (6 ml/g de peso de sedimento celular inicial) y se sacudió a temperatura ambiente durante 15 min. El tampón de lavado estaba constituido por NaPO_{4} 50 mM pH 8,0, NaCl 0,3 M, \beta-mercaptoetanol 5 mM, glicerol al 10%, octilglucósido al 0,05%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0,1 \muM, leupeptina 1 \muM. Se separó el residuo celular mediante centrifugación a 30100 x g durante 30 min. a 4ºC. Se desechó el sobrenadante y se conservó el sedimento.

Se extrajo proteína del sedimento tal como sigue. Se añadió tampón de extracción 6 ml/g y se sacudió a temperatura ambiente durante 15 min. El tampón de extracción estaba constituido por Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 1 M, \beta-mercaptoetanol 5 mM, glicerol al 10%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0,1 \muM, leupeptina 1 \muM. Esto se centrifugó a 30100 x g durante 30 min. a 4ºC. Se conservó el sobrenadante y se añadió sulfato de amonio hasta el 17,5% usando la siguiente fórmula: volumen de sobrenadante (ml) multiplicado por x% de sulfato de amonio/(1 - x% de sulfato de amonio) = ml de sulfato de amonio saturado 4,1 M para añadir al sobrenadante. Se añadió gota a gota el sulfato de amonio mientras se agitaba sobre hielo y se agitó la disolución sobre hielo 10 min. Se centrifugó la disolución a 17700 x g durante 30 min. a 4ºC y se conservó el sedimento y se almacenó a de 2ºC a 8ºC durante hasta
48 horas.

Se resuspendió el sedimento y se hizo pasar en una columna Poly U (Poly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) a 4ºC tal como sigue. Se resuspendió el sedimento en 6 ml de tampón de equilibrio Poly U por gramo de peso de sedimento. El tampón de equilibrio estaba constituido por, HEPES 25 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, DTT 5 mM (añadido reciente), glicerol al 10%, 1,2 octilglucósido. Se sacudió la disolución 4ºC durante 15 min. y se centrifugó a 31000 x g durante 30 min. a 4ºC.

Se preparó una columna Poly U (1 ml de resina por gramo de peso de sedimento inicial). El caudal lineal era de 60 cm/h y el caudal de empaquetado era del 133% de 60 cm/h. Se equilibró la columna con tampón de equilibrio y se cargó el sobrenadante del sulfato de amonio resuspendido en la columna equilibrada. Se lavó la columna para el nivel inicial con el tampón de equilibrio y se eluyó la proteína con una etapa de elución en el siguiente tampón elución Poly U: HEPES 25 mM pH 8,0, NaCl 1 M, DTT 5 mM (añadido reciente), glicerol al 10%, 1,2 octilglucósido. Se hizo pasar el eluato de la columna en SDS-PAGE (teñido con Coomassie) y se congelaron alícuotas y se almacenaron a -80ºC. Se confirmó la presencia del epítopo de NS3/4a mediante inmunotransferencia tipo Western, usando un anticuerpo policlonal dirigido frente al dominio de proteasa de NS3 y un anticuerpo monoclonal frente al epítopo 5-1-1
(VHC 4a).

Adicionalmente, se controló la actividad enzimática de proteasa durante la purificación tal como sigue. Se diluyeron un péptido NS4A (KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK) (SEC ID Nº: 9), y la muestra que contenía el epítopo conformacional de NS3/4a, en 90 \mul de tampón de reacción (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 0,15 M, EDTA 0,5 mM, glicerol al 10%, n-docecil-B-D-maltósido 0,05, DTT 5 mM) y se dejó mezclar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 90 \mul de la mezcla a una placa de microtitulación (Costar, Inc., Corning, NY) y se añadieron 10 \mul de sustrato de VHC (AnaSpec, Inc., San José CA). Se mezcló la placa y se leyó en un lector de placas Fluostar. Los resultados se expresaron como unidades relativas de fluorescencia (URF) por minuto.

Usando estos procedimientos, el producto de la extracción con NaCl 1 M contenía una actividad de 3,7 URF/min., el precipitado de sulfato de amonio tenía una actividad de 7,5 URF/min. y el producto de la purificación Poly U tenía una actividad de 18,5 URF/min.

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Ejemplo 3 Inmunorreactividad del epítopo conformacional de NS3/4a frente a NS3/4a desnaturalizada

La inmunorreactividad del epítopo conformacional de NS3/4a, producido tal como se describió anteriormente, se comparó con NS3/4a que se había desnaturalizado añadiéndole SDS a la preparación de epítopo conformacional de NS3/4a hasta una concentración final del 2%. Se revistieron NS3/4a desnaturalizada y NS3/4a conformacional sobre placas de microtitulación tal como se describió anteriormente. El antígeno c200 (Hepatology (1992) 15:19-25, disponible en sistema de prueba de ELISA ORTHO VHC Versión 3.0, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, Nueva Jersey) se revistió también sobre placas de microtitulación. Se usó el antígeno c200 como comparación, se supone que no es conformacional debido a la presencia de agente reductor (DTT) y detergente (SDS) en su formulación.

Se sometió a prueba la inmunorreactividad frente a dos paneles de seroconversión de VHC temprana, PHV 904 y PHV 914 (muestras de sangre humana comercialmente disponibles de Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA). Los resultados se muestran en la tabla 6. Los datos sugieren que la forma desnaturalizada o linealizada de NS3/4a (así como c200) no detecta paneles de seroconversión temprana tan pronto como el epítopo conformacional de NS3/4a.

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También se sometió a prueba la inmunorreactividad del epítopo conformacional usando anticuerpos monoclonales frente a NS3/4a, preparados usando procedimientos convencionales. Entonces se sometieron a prueba estos anticuerpos monoclonales en el formato de ELISA frente a NS3/4a y antígeno c200 y NS3/4a desnaturalizada. Los datos muestran que los anticuerpos monoclonales anti-NS3/4a reaccionan frente a la NS3/4a y NS3/4a desnaturalizada de manera similar a los paneles de seroconversión mostrados en la tabla 7. Este resultado proporciona también una evidencia adicional de que el NS3/4a es de naturaleza conformacional ya que pueden prepararse anticuerpos monoclonales que tienen reactividad similar a los paneles de seroconversión de c33c temprana.

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Ejemplo 4 Revestimiento de soporte sólido con los antígenos del VHC

Se reviste sobre placas el epítopo conformacional del VHC de antígeno NS3/4a o MEFA tal como sigue. Se filtra tampón de revestimiento de VHC (NaPO_{4} 50 mM pH 7,0, EDTA 2 mM y cloroacetamida al 0,1%) a través de una unidad de filtro de 0,22 \mu. Entones se añaden los siguientes reactivos secuencialmente al tampón de revestimiento de VHC y se agita después de cada adición: BSA-sulfhidrilo modificado 2 \mug/ml, de una disolución 10 mg/ml (Bayer Corp. Pentex, Kankakee, Illinois); DTT 5 mM de una disolución 1 M (Sigma, St. Louis, MO); NS3/4a 0,45 \mug/ml (concentración de proteína de 0,3 mg/ml); o MEFA 7.1 0,375 \mug/ml (concentración de proteína de 1 mg/ml). Se agita la disolución final durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Se añaden 200 \mul de la disolución anterior a cada pocillo de una placa de fondo plano, de alta unión Costar (Corning Inc., Coming, Nueva York) y se incuban las placas durante la noche en una cámara de humedad. Entonces se lavan las placas con tampón de lavado (1 x PBS, TWEEN-20 al 0,1%), se secan con golpes suaves y se añaden 285 \mul de tampón de post-revestimiento Ortho (1 x PBS, pH 7,4, BSA al 1%, sacarosa al 3%). Se incuban las placas durante al menos 1 hora, se golpean suavemente y se secan durante la noche 2-8ºC. Las placas se embolsan con desecantes para su uso futuro.

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Ejemplo 5 Inmunoensayos

Con el fin de someter a prueba la capacidad de los inmunoensayos objeto para detectar la infección por VHC, se usan paneles de muestras de sangre humana comercialmente disponibles que están infectados por VHC. Tales paneles están comercialmente disponibles de Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBI); Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP); y North American Biologics, Inc., BocoRatan, FL (NABI).

Se realiza el ensayo tal como sigue. Se añaden 200 \mul de tampón diluyente de muestra (caseína 1 g/l, SOD humana recombinante 100 mg/l, cloracetamida 1 g/l, BSA 10 g/l, extracto de levadura 500 mg/l, EDTA 0,366 g/l, KPO_{4} 1,162 g/l, Tween-20 5 ml/l, NaCl 29,22 g/l, NaPO_{4} 1,627 g/l, SDS al 1%) a las placas revestidas. Entonces se añaden 20 \mul de muestra. Esto se incuba a 37ºC durante 30-60 minutos. Se lavan las placas con tampón de lavado (1 x PBS, pH 7,4, Tween-20 al 0,1%). Se añaden 200 \mul del componente de fase de disolución marcado (MEFA marcado con HRP o bien epítopo conformacional de NS3/4a marcado con HRP, dependiendo del antígeno unido al soporte sólido), diluido 1:22.000 en el sistema de prueba de ELISA ORTHO VHC 3.0 con diluyente de conjugado en masa Enhanced SAVe (Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, Nueva Jersey) y se incuba durante 30-60 minutos a 37ºC. Esto se lava como anteriormente, y se añaden 200 \mul de disolución de sustrato (1 comprimido de OPD/10 ml). El comprimido de OPD contiene diclorhidrato de o-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno para el desarrollo de color en la reacción de peroxidasas del rábano. Esto se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se detiene la reacción mediante la adición 50 \mul de H_{2}SO_{4} 4 N y se leen las placas a 492 nm, en relación con la absorbancia a 690 nm como control.

<110> CHIRON CORPORATION

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<120> ENSAYO DE VHC

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<130> 2300-19199.40

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<150> 60/409,515

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<151> 09-09-2002

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<160> 9

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 2058

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de ADN del epítopo conformacional de NS3/41

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<400> 1

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16

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<210> 2

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<211> 686

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos del epítopo conformacional de NS3/41

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<400> 2

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20

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<210> 3

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<211> 2499

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia de ADN de MEFA 12

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

22

23

24

25

26

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<210> 4

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<211> 829

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos de MEFA 12

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

27

28

29

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<210> 5

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<211> 3297

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Secuencia de ADN de MEFA 7.1

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<400> 5

30

31

32

33

34

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 1099

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Secuencia de aminoácidos de MEFA 7.1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

35

36

37

38

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<210> 7

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Secuencia consenso

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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39

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<210> 8

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<211> 10

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Secuencia tras el sitio HindIII

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaaaacaaa

\hfill

10

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Péptido NS4A

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<400> 9

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41

Claims

1. Un procedimiento de ensayo de tipo sándwich de antígeno-anticuerpo-antígeno de detección de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar un soporte sólido de inmunoensayo que comprende antígenos del VHC unidos al mismo, en el que los antígenos del VHC están constituidos por uno o más antígenos aislados de una primera región de la poliproteína del VHC y en el que el uno o más antígenos aislados de la primera región de la poliproteína del VHC son uno o más epítopos conformacionales de NS3/4a aislados;

(b) combinar una muestra biológica con dicho soporte sólido en condiciones que permiten a los anticuerpos frente al VHC, cuando están presentes en la muestra biológica, unirse a dicho uno o más antígenos del VHC;

(c) añadir al soporte sólido de la etapa (b) en condiciones de formación de complejos un antígeno de fusión de múltiples epítopos del VHC (MEFA) marcado de manera detectable, en el que dicho MEFA marcado comprende al menos un epítopo de la región NS3/4a, en el que dicho MEFA se une a dicho anticuerpo frente al VHC unido;

(d) detectar los complejos formados entre dicho anticuerpo frente al VHC y dicho uno o más antígenos de la primera región de la poliproteína del VHC y dicho MEFA, si hay alguno, como indicación de la infección por VHC en la muestra biológica.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho epítopo conformacional de NS3/4a comprende un epítopo de la región proteasa NS3/4a de la poliproteína del VHC.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho epítopo conformacional de NS3/4a comprende un epítopo de la región helicasa NS3/4a de la poliproteína del VHC.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho epítopo conformacional de NS3/4a comprende la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 3A-3D (SEC ID Nº: 2).

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho MEFA comprende un epítopo de la región proteasa NS3/4a de la poliproteína del VHC.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho MEFA comprende un epítopo de la región helicasa NS3/4a de la poliproteína del VHC.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho MEFA comprende aminoácidos numerados en relación con la secuencia del VHC-1.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho MEFA comprende un epítopo de la región c33c de la poliproteína del VHC.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho MEFA comprende los aminoácidos 1211-1457, numerados en relación con el VHC-1.

10. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho MEFA comprende los aminoácidos 1192-1457, numerados en relación con el VHC-1.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho MEFA comprende un epítopo de la región 5-1-1 de la poliproteína del VHC.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho MEFA comprende los aminoácidos 1689-1735, numerados en relación con el VHC-1.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho MEFA comprende la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 6A-6F (SEC ID Nº: 4).

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho MEFA comprende la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 8A-8F (SEC ID Nº: 6).

15. Un procedimiento de ensayo de tipo sándwich de antígeno-anticuerpo-antígeno de detección de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar un soporte sólido de inmunoensayo que comprende antígenos del VHC unidos al mismo, en el que los antígenos del VHC están constituidos por uno o más antígenos de fusión de múltiples epítopos (MEFA);

\newpage

(b) combinar una muestra biológica con dicho soporte sólido en condiciones que permiten a los anticuerpos frente al VHC, cuando están presentes en la muestra biológica, unirse a dicho uno o más MEFA;

(c) añadir al soporte sólido de la etapa (b) en condiciones de formación de complejos un antígeno del VHC aislado marcado de manera detectable de una región de la poliproteína del VHC presente en el uno o más MEFA, en el que el antígeno del VHC aislado es un epítopo conformacional de NS3/4a aislado y el MEFA comprende al menos un epítopo de la región NS3/4a, en el que dicho antígeno aislado se une a dicho anticuerpo frente al VHC unido;

(d) detectar los complejos formados entre dicho anticuerpo frente al VHC y dicho antígeno del VHC aislado y dicho MEFA, si hay alguno, como indicación de la infección por VHC en la muestra biológica.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho epítopo conformacional de NS3/4a comprende un epítopo de la región proteasa NS3/4a de la poliproteína del VHC.

17. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho epítopo conformacional de NS3/4a comprende un epítopo de la región helicasa NS3/4a de la poliproteína del VHC.

18. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho epítopo conformacional de NS3/4a comprende la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 3A-3D (SEC ID Nº: 2).

19. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en el que dicho MEFA comprende un epítopo de la región proteasa NS3/4a de la poliproteína del VHC.

20. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en el que dicho MEFA comprende un epítopo de la región helicasa NS3/4a de la poliproteína del VHC.

21. El procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicho MEFA comprende los aminoácidos 1193-1657, numerados en relación con la secuencia del VHC-1.

22. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en el que dicho MEFA comprende un epítopo de la región c33c de la poliproteína del VHC.

23. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicho MEFA comprende los aminoácidos 1211-1457, numerados en relación con el VHC-1.

24. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicho MEFA comprende los aminoácidos 1192-1457, numerados en relación con el VHC-1.

25. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en el que dicho MEFA comprende un epítopo de la región 5-1-1 de la poliproteína del VHC.

26. El procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicho MEFA comprende los aminoácidos 1689-1735, numerados en relación con el VHC-1.

27. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en el que dichos MEFA comprenden la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 6A-6F (SEC ID Nº: 4).

28. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en el que dicho MEFA comprende la secuencia de aminoácidos representada en las figuras 8A-8F (SEC ID Nº: 6).

29. Uso de un soporte sólido de inmunoensayo que comprende antígenos del VHC unidos al mismo y un MEFA del VHC marcado de manera detectable en un procedimiento para detectar la infección por VHC en una muestra biológica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que los antígenos del VHC están constituidos por uno o más antígenos aislados de una primera región de la poliproteína del VHC, y el MEFA marcado comprende al menos un epítopo de la misma región de la poliproteína del VHC como el uno o más antígenos aislados.

30. Uso de un soporte sólido de inmunoensayo que comprende antígenos del VHC unidos al mismo y un antígeno del VHC aislado marcado de manera detectable en un procedimiento para detectar la infección por VHC en una muestra biológica según una cualquiera de las reivindicaciones 15-28, en el que los antígenos del VHC están constituidos por uno o más MEFA, y el antígeno del VHC aislado marcado es de una región de la poliproteína del VHC presente en el uno o más MEFA.