ES2309892T3 - Procedimientos y composiciones para la determinacion del perfil genomico perioperatorio. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento que comprende: a) proporcionar: i) una muestra obtenida de un sujeto perioperatorio; y ii) un ensayo para detectar dos o más marcadores genéticos, en el que dichos marcadores comprenden una mutación en dos o más genes seleccionados del grupo constituido por HBB, APOE, TNFa, TNFb, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5, de sexo, de grupos sanguíneos ABO y Rh, LQT1, LQT3, KCNH2, KCNE1, SCNA5, KCNQ1, HMBS, ABRb2, PI, PLAT y PAI; y b) someter dicha muestra a dicho ensayo para generar un perfil genómico para su uso en la selección de condiciones para la anestesia durante un procedimiento quirúrgico.
Description
Procedimientos y composiciones para la
determinación del perfil genómico perioperatorio.
La presente invención se refiere a
procedimientos para la exploración genómica perioperatoria de
sujetos, en particular a la exploración perioperatoria para
determinar marcadores indicativos de respuestas a la anestesia y
otros tratamientos y procedimientos perioperatorios u operatorios.
La presente invención también proporciona composiciones para su uso
en procedimientos de exploración.
Aunque la cirugía salva muchas vidas, las
complicaciones quirúrgicas dan como resultado muchos casos de
morbimortalidad. Las complicaciones relacionadas con la cirugía y
la anestesia incluyen infecciones, pérdida de sangre excesiva,
trombosis, náusea y vómito, y reacciones a la anestesia. Estas
complicaciones dan como resultado un aumento de la hospitalización,
un retraso de la recuperación de la cirugía y a veces incluso la
muerte. Las reacciones a la anestesia presentan un ejemplo de tales
complicaciones.
El uso de anestesia local, regional y general es
necesario para prevenir el dolor y mantener a los pacientes seguros
y estables durante la cirugía. Hay muchas opciones de técnicas de
anestesia y fármacos anestésicos específicos. La elección del
régimen, el agente y la dosis anestésicos depende del tipo de
cirugía o procedimiento, de otras medicaciones actuales y de
cualquier enfermedad subyacente o predisposición que pueda tener un
paciente. Sin embargo, aproximadamente uno de cada 170 pacientes
tiene complicaciones relacionadas con la anestesia y una de cada
2500 muertes por cirugía puede atribuirse a las complicaciones
relacionadas con la anestesia (Dan Med Bull., 41:319 [1994]).
Muchas complicaciones no son resultado del error del proveedor, sino
más bien de errores del sistema, tal como la insuficiencia de
diagnóstico con tecnologías existentes. Se estima que los errores
del sistema representan hasta el 88% de los errores totales en la
práctica clínica (Liang y Cullen, Anesthesiology, 91: 609
[1999]).
Una complicación relacionada con la anestesia es
la hipertermia maligna (HM). La HM es un rasgo autosómico dominante
que provoca una fiebre incontrolable, grave, cuando se administra la
anestesia. De uno de cada 5000 a uno de cada 15.000 niños y 1 de
cada 50.000 adultos experimentan HM en respuesta a anestésicos de
activación. La falta de tratamiento rápido puede dar como resultado
arritmia cardíaca, insuficiencia renal y muerte. La HM se trata con
el antídoto específico dantroleno sódico, sin embargo, la mejor
intervención es la prevención. Si se identifica un paciente como
que es a antes de la anestesia y fármacos anestésicos alternativos
seleccionados que no conlleven riesgo de HM. Los pacientes en
riesgo se identifican pocas veces mediante una historia familiar de
reacciones a la anestesia o mediante reacciones previas a la
anestesia en el paciente. No está disponible ningún procedimiento de
exploración de diagnóstico concluyente, sencillo.
Los sujetos con defectos en las enzimas que
metabolizan anestésicos locales y compuestos relacionados pueden
tener malas reacciones cuando se proporcionan tales fármacos antes,
durante o tras la cirugía. Por ejemplo, los relajantes musculares
proporcionados comúnmente junto con la anestesia, tales como
succinilcolina o mivacurio, pueden provocar parálisis prolongada y
apnea en un paciente después de que el paciente se haya despertado
de la anestesia. La parálisis, provocada por mutaciones en el gen
butirilcolinesterasa (BChE), se hereda como un rasgo autosómico
recesivo. El único tratamiento disponible es la ventilación
artificial y la sedación hasta que la parálisis disminuye (de 30
minutos a 8 horas). Además, el BChE es responsable del metabolismo
de anestésicos locales tipo éster. Por tanto, las mutaciones en
BChE también pueden conducir a un retraso del metabolismo y posible
toxicidad cuando se usan anestésicos locales tipo éster. Los ensayos
bioquímicos que miden el BChE son costosos, requieren tiempo y
carecen de precisión. No está disponible ningún ensayo de
exploración rápido, concluyente para determinar mutaciones del
BChE.
Además, los sujetos con mutaciones en las
enzimas del citocromo P450, que metabolizan una variedad de fármacos
proporcionados comúnmente junto con procedimientos quirúrgicos,
pueden tener reacciones adversas debido a la incapacidad de activar
o bien metabolizar ciertos fármacos (por ejemplo, antiarrítmicos y
derivados de morfina). Las complicaciones pueden evitarse
sustituyendo otras medicaciones o ajustando la dosificación.
Las reacciones a fármacos que se producen
durante la cirugía no son las únicas complicaciones quirúrgicas.
Las complicaciones también pueden surgir en el periodo de
recuperación tras la cirugía. Una complicación posquirúrgica grave
es la septicemia, una reacción sistémica provocada por infección,
caracterizada por hipotensión arterial, acidosis metabólica,
resistencia vascular sistémica disminuida, taquipnea y disfunción
orgánica. La septicemia es una causa principal de morbimortalidad
en seres humanos y otros animales. Se estima que
400.000-500.000 episodios de septicemia dieron como
resultado 100.000-175.000 muertes en humanos sólo en
los EE.UU. en 1991. A pesar de los principales avances en las
últimas décadas en el tratamiento de infecciones graves, la
incidencia y mortalidad debidas a la septicemia continúa en aumento
(Wolff, New Eng. J. Med., 324:486-488 [1991]). Los
sujetos que portan el alelo TNF2 del gen TNF\alpha tienen un
aumento de susceptibilidad frente a la septicemia y muerte por
septicemia tras la cirugía (Mira, JAMA 282: 561-568
[1999]). Sin embargo, los únicos ensayos disponibles miden la
producción de citocina directamente y son caros, transitorios e
inconvenientes. No está disponible ningún ensayo de exploración
rápido, concluyente para determinar la presencia del alelo TNF2.
Una elección apropiada del anestésico, de
fármacos relacionados y otros factores de tratamiento puede reducir
las complicaciones y la morbimortalidad asociada a la cirugía. Se
necesitan ensayos rápidos, convenientes predictivos de riesgos de
complicaciones quirúrgicas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a
procedimientos para la exploración genómica perioperatoria de
sujetos, en particular a la exploración perioperatoria para
determinar marcadores indicativos de respuestas a la anestesia y
otros tratamientos y procedimientos perioperatorios u operatorios.
La presente invención también proporciona composiciones para su uso
en procedimientos de exploración.
En algunas realizaciones, la presente invención
proporciona un procedimiento que comprende: proporcionar una
muestra de un sujeto perioperatorio (por ejemplo, una muestra de
tejido o información genética); proporcionar un ensayo para
detectar dos o más marcadores genéticos; y someter la muestra al
ensayo para generar un perfil genómico para su uso en la selección
de un ciclo de acción operatorio. En algunas realizaciones, el ciclo
de acción es la administración de anestesia durante un
procedimiento quirúrgico; en otras realizaciones, el ciclo de
acción es la administración de anestesia durante un procedimiento
médico. En algunas realizaciones, la anestesia es una anestesia
general. En otras realizaciones, la anestesia es una anestesia
regional. En algunas realizaciones, el procedimiento quirúrgico es
cirugía no invasiva. En otras realizaciones, el procedimiento
quirúrgico es cirugía invasiva.
En algunas realizaciones, un perfil genómico de
la presente invención comprende información que está relacionada
con un riesgo farmacodinámico. En otras realizaciones, el perfil
genómico comprende información que está relacionada con un riesgo
farmacocinético. En otras realizaciones, el perfil genómico
comprende un diagnóstico presintomático. Todavía en otras
realizaciones, el perfil genómico comprende información que está
relacionada con el diagnóstico diferencial de enfermedades
coexistentes reconocidas.
En algunas realizaciones, los dos o más
marcadores genéticos detectados comprenden una mutación en dos o más
genes seleccionados del grupo constituido por BChE, CYP2D6, MTHFR,
MS, CBS, del F 5 Leiden, de la protrombina, RYR1, CACNA1S y CPT
2.
La presente invención también proporciona un
procedimiento que comprende: proporcionar una muestra de un sujeto;
proporcionar un ensayo para detectar dos o más marcadores genéticos;
y someter la muestra al ensayo para generar un perfil genómico para
su uso en la selección de un ciclo de acción de tratamiento médico.
En algunas realizaciones, la muestra se toma del sujeto en un marco
de tiempo seleccionado de: antes de someterse a un procedimiento
médico, durante un procedimiento médico y tras un procedimiento
médico. En algunas realizaciones, el tratamiento médico es no
quirúrgico; en otras realizaciones, el tratamiento médico es
quirúrgico.
La presente invención proporciona además un
procedimiento, que comprende: proporcionar una muestra de un sujeto;
proporcionar un ensayo para detectar dos o más marcadores genéticos
asociados a una respuesta farmacológica; someter a prueba la
muestra en el ensayo para generar un perfil genómico; y someter al
sujeto a un procedimiento quirúrgico, en el que las condiciones
para el procedimiento se basan en el perfil genómico. En algunas
realizaciones, la respuesta farmacológica es a un anestésico. En
algunas realizaciones, la condición para el procedimiento es la
elección del anestésico. En algunas realizaciones, los dos o más
marcadores genéticos son una mutación en dos o más genes
seleccionados del grupo constituido por BChE, CYP2D6, MTHFR, MS,
CBS, de F 5 Leiden, de la protrombina, RYR1, CACNA1S y CPT 2.
La presente invención proporciona adicionalmente
un sistema que comprende un ensayo para generar un perfil genómico
de un sujeto perioperatorio en el que el ensayo comprende dos o más
marcadores genéticos indicativos de un ciclo de acción médico. En
algunas realizaciones, el ciclo de acción es un ciclo de acción
quirúrgico; en otras realizaciones, el ciclo de acción es la
administración de anestesia durante una cirugía.
En algunas realizaciones, el perfil genómico
comprende información que está relacionada con un riesgo
farmacodinámico. En otras realizaciones, el perfil genómico
comprende información que está relacionada con un riesgo
farmacocinético. En algunas realizaciones, el perfil genómico
comprende un diagnóstico presintomático. En otras realizaciones, el
perfil genómico comprende información que está relacionada con una
enfermedad coexistente reconocida.
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La figura 1 muestra un esquema del flujo de
información en algunas realizaciones de la presente invención.
La figura 2 dos muestra el flujo de una muestra
genómica y datos generados a partir de la muestra en algunas
realizaciones de la presente invención.
La presente invención se refiere a
procedimientos para exploración genómica perioperatoria de sujetos,
en particular a la exploración perioperatoria para determinar
marcadores indicativos de respuestas a la anestesia y otros
tratamientos y procedimientos perioperatorios u operatorios. La
presente invención también proporciona composiciones para su uso en
procedimientos de exploración.
La presente invención proporciona una
herramienta de diagnóstico novedosa actualmente no disponible en el
campo quirúrgico. No hay tecnología actual disponible que
proporcione la información de los perfiles genómicos
perioperatorios de la presente invención. De hecho, el estado actual
del campo quirúrgico es reducir o eliminar las pruebas
perioperatorias. Por tanto, la presente invención proporciona
soluciones para problemas que no tienen alternativas disponibles.
En ausencia de cualquier tecnología competidora para cuantificar los
contribuyentes genéticos del sujeto al riesgo perioperatorio, se
someten a prueba (por ejemplo, usando procedimientos conocidos)
alelos (por ejemplo, alelos conocidos) según categorías de selección
explícitas y criterios en bloque para establecer un perfil
genómico.
Históricamente, un amplio panel de exploración
(por ejemplo, análisis de orina y sangre, ECG y radiografía de
tórax) se realizaba rutinariamente antes de la cirugía. Sin embargo,
el procedimiento actual sencillamente es preguntar al paciente si
ha tenido cualquier dificultad previa con anestesia o cirugía.
Algunas veces, pero no siempre, también se realiza un examen físico
superficial. Normalmente se ha reducido o eliminado el uso de
pruebas de laboratorio para pacientes relativamente sanos. Las
razones para la eliminación incluyen el coste de pruebas de
exploración, la imprecisión y la falta de especificidad,
incertidumbre de cómo alterar el ciclo de acción de tratamiento en
respuesta a resultados y futuro daño a pacientes mediante un
tratamiento médico invasivo en respuesta a un hallazgo adicional.
De hecho, las pruebas actuales de anestesiología enfatizan que
estudios recientes indican una falta de beneficio de las pruebas de
laboratorio rutinarias como procedimiento de evaluación de
pacientes preoperatoriamente. Estas pruebas recalcan que las
estrategias de coste-beneficio óptimas sólo pueden
obtenerse cuando las pruebas se reducen hasta sólo lo que se indica
mediante la anamnesis (véase por ejemplo, R.D Miller, (ed),
Anesthesia, quinta edición, Churchill Livingstone, [2000], págs.
824-883).
La presente invención une los campos dispares de
la medicina (por ejemplo, anestesia y cirugía) con la genética. Las
pruebas genómicas perioperatorias de la presente invención están en
contraste directo con los paneles de pruebas actualmente
disponibles. Los perfiles genómicos perioperatorios de la presente
invención resuelven muchos de los problemas descritos anteriormente
que han conducido el movimiento lejos de las pruebas de laboratorio
preoperatorias. Los perfiles genómicos perioperatorios son eficaces
en coste y tiempo. Los marcadores para la inclusión se seleccionan
por su precisión, especificidad y valor predictivo. Los perfiles
perioperatorios de la presente invención permiten la
individualización de opciones de tratamiento para cada sujeto que
experimenta un procedimiento quirúrgico o médico.
Las pruebas de todos los pacientes
preoperatorios con un ensayo de panel permiten las pruebas de
marcadores que son poco comunes pero de utilidad. Por ejemplo, un
ensayo que incluye muchos alelos, incluso si son poco comunes,
encontrará un resultado positivo en un número suficiente de sujetos
para hacer que el ensayo merezca la pena. Los paneles genómicos
perioperatorios de la presente invención también proporcionan la
ventaja de la detección de efectos sinérgicos y aditivos de
afecciones predichas mediante más de un alelo. Los paneles
genómicos perioperatorios proporcionan además la ventaja de poder
distinguir entre mutaciones homocigóticas y heterocigóticas.
En algunas realizaciones, los marcadores
predicen una respuesta del sujeto a la anestesia u otras
medicaciones, incluyendo pero sin limitarse a aquéllas
proporcionadas junto con la anestesia (por ejemplo, defectos en el
metabolismo que conducen a complicaciones tales como parálisis o
toxicidad por fármaco). En algunas realizaciones, los marcadores
predicen un riesgo del sujeto para determinar complicaciones
relacionadas con la anestesia (por ejemplo, hipertermia maligna).
En algunas realizaciones, los marcadores predicen posibles
complicaciones que pueden surgir durante una recuperación del
sujeto de la cirugía (por ejemplo, riesgo de trombosis o
septicemia).
Los marcadores también se seleccionan para que
el ciclo de acción pueda alterarse de manera eficaz en coste y
tiempo para eliminar o reducir complicaciones quirúrgicas no
deseadas. Por ejemplo, un médico puede elegir un anestésico o
analgésico particular con el fin de evitar una respuesta
potencialmente mortal. Por tanto, un resultado negativo para un
marcador dado conlleva la posibilidad de proporcionar tanta utilidad
terapéutica como resultado positivo. Por ejemplo, si se encuentra
que un sujeto tiene un marcador indicativo de que no responde a un
fármaco dado usado en la reanimación de emergencia, no se pierde un
tiempo valioso en administrar el fármaco. Adicionalmente, si se
encuentra que un sujeto no tiene una afección subyacente, esa
afección puede eliminarse de aquéllas consideradas para preparar un
diagnóstico diferencial, disminuyendo el tiempo antes de que pueda
iniciarse una intervención que salva vidas humanas.
En algunas realizaciones, la información
obtenida a partir del perfil genómico perioperatorio se usa para
establecer el pronóstico del sujeto o la probabilidad de
supervivencia. En algunas realizaciones, la información se usa para
seleccionar el procedimiento quirúrgico más seguro y más eficaz. En
algunas realizaciones, la información se usa para determinar el
nivel de control posquirúrgico (por ejemplo, ya sea enviar al sujeto
a casa el mismo día u hospitalizarlo durante la noche o ya sea
situar al sujeto en una unidad de cuidados intensivos o no). Por
ejemplo, un sujeto que se encuentra que está en riesgo de
complicaciones posquirúrgicas puede controlarse cuidadosamente (por
ejemplo, en la unidad de cuidados intensivos) de manera la que
intervención para salvar vidas puede comenzar lo antes posible.
La información proporcionada por los perfiles
genómicos perioperatorios de la presente invención es de utilidad
para el médico incluso si el perfil no está disponible al comienzo
de la cirugía (por ejemplo, en el caso de cirugía de emergencia en
la que hay un periodo corto de tiempo entre el diagnóstico y la
cirugía). Si se completa el perfil genómico durante un
procedimiento quirúrgico, el ciclo de tratamiento puede alterarse,
si es necesario, en este punto. Además, la información relacionada
con la recuperación posquirúrgica es útil incluso tras la
cirugía.
En algunas realizaciones, la presente invención
proporciona además un sistema electrónico, integrado, (por ejemplo,
basado en la red) para la recogida, el procesamiento, la utilización
y la distribución de datos genéticos relevantes para un ciclo de
acción de tratamiento (véase la figura 1 para una visión general del
flujo de información en algunas realizaciones de la presente
invención). Por tanto, la presente invención proporciona
información económica y que salva vidas a los médicos sobre una
escala acelerada relativa a los diagnósticos actuales.
Para facilitar un entendimiento de la invención,
a continuación se definen varios términos.
El término "gen" se refiere a una secuencia
de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que comprende secuencias
codificantes necesarias para la producción de un polipéptido o
precursor. El polipéptido puede codificarse por una secuencia
codificante de longitud completa o por cualquier porción de la
secuencia codificante siempre que se conserven la actividad deseada
o las propiedades funcionales (por ejemplo, actividad enzimática,
unión a ligando, etc.) de la longitud completa o fragmento. El
término también abarca la región codificante de un gen estructural
y las secuencias incluidas localizadas adyacentes a la región
codificante en ambos extremos 5' y 3' para una distancia de
aproximadamente 1 kb en cada extremo de manera que el gen
corresponde a la longitud del ARNm de longitud completa. Las
secuencias que están localizadas en 5' de la región codificante y
que están presentes en el ARNm se denominan en lo sucesivo
secuencias no traducidas en 5'. Las secuencias que están
localizadas en 3' o hacia 3' de la región codificante y que están
presentes en el ARNm se denominan en lo sucesivo secuencias no
traducidas en 3'. El término "gen" abarca ambas formas ADNc y
genómica de un gen. Un clon o forma genómica de un gen contiene la
región codificante interrumpida con secuencias no codificantes
denominadas "intrones" o "regiones intermedias" o
"secuencias intermedias". Los intrones son segmentos de un gen
que se transcriben en ARN nuclear (ARNnh); los intrones pueden
contener elementos reguladores tales como potenciadores. Los
intrones se eliminan o "se quitan por corte o empalme" del
tránscrito primario o nuclear; por tanto los intrones están
ausentes en el tránscrito de ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona
durante la traducción para especificar la secuencia u orden de
aminoácidos en un polipéptido naciente.
Cuando se menciona "secuencia de
aminoácidos" en el presente documento para referirse a una
secuencia de aminoácidos de una molécula de proteína presente de
manera natural, "secuencia de aminoácidos" y similares
términos, tal como "polipéptido" o "proteína" no se
pretende limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de
aminoácidos nativa, completa asociada a la molécula de proteína
mencionada.
Además de contener intrones, las formas
genómicas de un gen también pueden incluir secuencias localizadas
en ambos extremos 5' y 3' de las secuencias que están presentes en
el tránscrito de ARN. Estas secuencias se denominan en lo sucesivo
secuencias o regiones "flanqueantes" (estas secuencias
flanqueantes están localizadas en 5' ó 3' con respecto a las
secuencias no traducidas presentes en el tránscrito de ARNm). La
región flanqueante en 5' puede contener secuencias reguladoras
tales como promotores y potenciadores que controlan o influyen en
la transcripción del gen. La región flanqueante en 3' puede contener
secuencias que dirigen la terminación de la transcripción, rotura
postranscripcional y poliadenilación.
La expresión "de tipo natural" se refiere a
un gen o producto génico que tiene las características de ese gen o
producto génico cuando se aísla de una fuente presente de manera
natural. Un gen de tipo natural es el que se observa más
frecuentemente en una población y por tanto se diseña
arbitrariamente la forma "normal" o "de tipo natural" del
gen. Por lo contrario, los términos "modificado",
"mutante" y "variante" se refieren a un gen o producto
génico que presenta visualmente modificaciones en la secuencia y o
propiedades funcionales (es decir, características alteradas)
cuando se compara con el gen o producto génico de tipo natural. Se
observa que pueden aislarse mutantes presentes de manera natural;
éstos se identifican por el hecho de que tienen características
alteradas cuando se comparan con el gen o producto génico de tipo
natural.
Tal como se usa en el presente documento, las
expresiones "molécula de ácido nucleico que codifica",
"secuencia de ADN que codifica" y "ADN que codifica" se
refieren al orden o a la secuencia de desoxirribonucleótidos a lo
largo de una hebra de ácido desoxirribonucleico. El orden de estos
desoxirribonucleótidos determina el orden de aminoácidos a lo largo
de la cadena de polipéptido (proteína). Por tanto, la secuencia de
ADN codifica para la secuencia de aminoácidos.
Se dice que las moléculas de ADN tienen
"extremos 5'" y "extremos 3'" porque los mononucleótidos
se hacen reaccionar para preparar oligonucleótidos o
polinucleótidos de manera que el fosfato en 5' de un anillo de
pentosa del mononucleótido se une al oxígeno en 3' de su vecino en
una dirección mediante un enlace fosfodiéster. Por tanto, un
extremo de un oligonucleótido o polinucleótido, denominado en lo
sucesivo el "extremo 5'" si su fosfato en 5' no está unido al
oxígeno en 3' de un anillo de pentosa del mononucleótido, y el
"extremo 3'" si su oxígeno en 3' no está unido a un fosfato en
5' de un anillo de pentosa del mononucleótido posterior. Tal como
se usa en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico,
incluso si es interna con respecto al oligonucleótido o
polinucleótido más largo, también puede decirse que tiene extremos
5' y 3'. En una molécula de ADN lineal o bien circular, los
elementos diferenciados se denominan en lo sucesivo que están "en
el sentido 5'" o en 5' de los elementos "en el sentido 3'"
o en 3'. Esta terminología refleja el hecho de que la transcripción
se realiza de una manera de 5' a 3' a lo largo de la hebra de ADN.
Los elementos promotor y potenciador que dirigen la transcripción
de un gen unido están localizados generalmente en 5' o en el sentido
5' de la región codificante. Sin embargo, los elementos
potenciadores pueden ejercer su efecto incluso cuando están
localizados en 3' del elemento promotor y la región codificante. La
terminación de la transcripción y las señales de poliadenilación
están localizadas en 3' o en el sentido 3' de la región
codificante.
Tal como se usa en el presente documento, las
expresiones "un oligonucleótido que tiene una secuencia de
nucleótidos que codifica un gen" y "polinucleótido que tiene
una secuencia de nucleótidos que codifica un gen", significa una
secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificante de
un gen o, en otras palabras, la secuencia de ácido nucleico que
codifica un producto génico. La región codificante puede presentarse
en forma de ADNc, ADN genómico o bien ARN. Cuando se presenta en
una forma de ADN, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser
monocatenario (es decir, la hebra sentido) o bicatenario. Elementos
de control adecuados tales como potenciadores/promotores, uniones
de corte y empalme, señales de poliadenilación, etc. pueden situarse
en proximidad cercana a la región codificante del gen si se
necesita para permitir la iniciación apropiada de la transcripción
y/o el procesamiento correcto del tránscrito de ARN primario. Como
alternativa, la región codificante utilizada en los vectores de
expresión de la presente invención puede contener
potenciadores/promotores endógenos, uniones de corte y empalme,
secuencias intermedias, señales de poliadenilación, etc., o una
combinación de ambos elementos de control, endógenos y exógenos.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "elemento regulador" se refiere a un elemento
genético que controla algún aspecto de la expresión de secuencias
de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor es un elemento
regulador que facilita la iniciación de la transcripción de una
región codificante operativamente unida. Otros elementos
reguladores incluyen señales de corte y empalme, señales de
poliadenilación, señales de terminación, etc.
Tal como se usa en el presente documento, los
términos "complementario" o "complementariedad" se usan en
relación con polinucleótidos (es decir, una secuencia de
nucleótidos) relacionados mediante las reglas de apareamiento de
bases. Por ejemplo, para la secuencia
"5'-A-G-T-3'",
es complementaria a la secuencia
"3'-T-C-A-5'".
La complementariedad puede ser "parcial", en la que sólo
algunas de las bases del ácido nucleico se ajustan según las reglas
de apareamiento de bases. O, puede existir complementariedad
"completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado
de complementariedad entre hebras de ácido nucleico tiene efectos
significativos sobre la eficacia y la fuerza de hibridación entre
las hebras de ácido nucleico. Esto es de particular importancia en
reacciones de amplificación, así como procedimientos de detección
que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.
El término "homología" se refiere a un
grado de complementariedad. Puede existir homología parcial o
homología completa (es decir, identidad). Una secuencia
parcialmente complementaria es una que al menos inhibe parcialmente
una secuencia completamente complementaria de la hibridación a un
ácido nucleico diana y se denomina usando el término funcional
"sustancialmente homóloga". La inhibición de hibridación de la
secuencia completamente complementaria a la secuencia diana puede
examinarse usando un ensayo de hibridación (transferencia de tipo
Southern o de tipo Northern, hibridación en solución y similares) en
condiciones de baja rigurosidad. Una secuencia o sonda
sustancialmente homóloga o completará para e inhibirá la unión (es
decir, la hibridación) de una secuencia completamente homóloga a
una diana en condiciones de baja rigurosidad. Esto no quiere decir
que las condiciones de baja rigurosidad son de tal manera que se
permite la unión no específica; las condiciones de baja rigurosidad
requieren que la unión de dos secuencias entre sí sea una
interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión
no específica puede someterse a prueba mediante el uso de una
segunda diana que carece incluso de un grado parcial de
complementariedad (por ejemplo, menos de aproximadamente el 30% de
identidad); en ausencia de unión no específica la sonda no hibridará
a la segunda diana no complementaria.
Cuando se usa en relación con una secuencia de
ácido nucleico bicatenario tal como un clon genómico o de ADNc, la
expresión "sustancialmente homólogo" se refiere a cualquier
sonda que puede hibridar a cualquiera o a ambas hebras de la
secuencia de ácido nucleico bicatenario en condiciones de baja
rigurosidad según lo descrito anteriormente.
Un gen puede producir especies de ARN múltiples
que se generan mediante corte y empalme diferencial del tránscrito
de ARN primario. Los ADNc que son variantes de corte y empalme del
mismo gen contendrán regiones de identidad de secuencia u homología
completa (representando la presencia del mismo exón o porción del
mismo exón en ambos ADNc) y regiones de no identidad completa (por
ejemplo, representando la presencia del exón "A" en ADNc 1 en
el que ADNc 2 contiene el exón "B" en su lugar). Debido a que
los dos ADNc contienen regiones de identidad de secuencia ambos
hibridarán a una sonda derivada del gen completo o porciones del gen
que contienen secuencias encontradas en ambos ADNc; las dos
variantes de corte y empalme son por tanto sustancialmente homólogas
a una sonda de este tipo y entre sí.
Cuando se usa en relación con una secuencia de
ácido nucleico monocatenario, la expresión "sustancialmente
homóloga" se refiere a cualquier sonda que puede hibridar (es
decir, es el complemento de) la secuencia de ácido nucleico
monocatenario en condiciones de baja rigurosidad según lo descrito
anteriormente.
\newpage
Tal como se usa en el presente documento, el
término "hibridación" se usa en referencia al apareamiento de
ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la intensidad de
hibridación (es decir, la intensidad de la asociación entre los
ácidos nucleicos) se ven afectadas mediante tales factores como el
grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, rigurosidad
de las condiciones implicadas, la T_{f} del híbrido formado, y la
proporción G:C dentro de los ácidos nucleicos.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "T_{f}" se usa en relación con la "temperatura de
fusión". La temperatura de fusión es la temperatura a la que una
población de moléculas de ácido nucleico bicatenario se disocian a
la mitad en hebras sencillas. La ecuación para calcular la T_{f}
de ácidos nucleicos se conoce bien en la técnica. Según se indica
por referencias convencionales, una estimación sencilla del valor de
T_{f} puede calcularse mediante la ecuación: T_{f} = 81,5 +
0,41 (% G + C), cuando un ácido nucleico está en disolución acuosa
en NaCl 1 M (véase por ejemplo, Anderson y Young, Quantitative
Filter Hybridization, en Nucleic Acid Hybridization [1985]). Otras
referencias incluyen cálculos más sofisticados que tienen en cuenta
características estructurales así como de secuencia para el cálculo
de T_{f}.
Tal como se usa en el presente documento el
término "rigurosidad" se usa en relación con las condiciones de
temperatura, fuerza iónica, y la presencia de otros compuestos
tales como disolventes orgánicos, en los que se llevan a cabo las
hibridaciones de ácido nucleico. Los expertos en la técnica
reconocerán que las condiciones de "rigurosidad" pueden
alterarse variando los parámetros que se acaban de describir
individualmente o bien conjuntamente. Con condiciones de "alta
rigurosidad", el apareamiento de bases de ácido nucleico sólo se
producirá entre fragmentos de ácido nucleico que tienen una alta
frecuencia de secuencias de bases complementarias (por ejemplo, la
hibridación en condiciones de "alta rigurosidad" puede
producirse entre homólogos con aproximadamente el
85-100% de identidad, de manera preferible
aproximadamente el 70-100% de identidad). Con
condiciones de rigurosidad media, el apareamiento de bases de ácido
nucleico se producirá entre ácidos nucleicos con una frecuencia
intermedia de secuencia de bases complementarias (por ejemplo, la
hibridación en condiciones de "rigurosidad media" puede
producirse entre homólogos con aproximadamente el
50-70% de identidad). Por tanto, las condiciones de
"débil" o "baja" rigurosidad a menudo se requieren con
ácidos nucleicos que derivan de organismos que son genéticamente
diversos, ya que la frecuencia de secuencias complementarias
normalmente es menor.
La "amplificación" es un caso especial de
replicación de ácido nucleico que implica especificidad de molde.
Ha de contrastar con la replicación de molde no específica (es
decir, la replicación que depende del molde pero no depende de un
molde específico). La especificidad de molde se distingue en este
caso de la fidelidad de replicación (es decir, la síntesis de la
secuencia de polinucleótido apropiada) y de la especificidad de
nucleótido (ribo o desoxirribo). La especificidad de molde se
describe frecuentemente en términos de especificidad de
"diana". Las secuencias diana son "dianas" en el sentido
de que se intenta separar de otro ácido nucleico. Las técnicas de
amplificación se han diseñado fundamentalmente para esta
separación.
La especificidad de molde se logra en la mayoría
de las técnicas de amplificación mediante la elección de la enzima.
Las enzimas de amplificación son enzimas que, en condiciones en las
que se usan, procesarán sólo secuencias de ácido nucleico
específicas en una mezcla heterogénea de ácido nucleico. Por
ejemplo, en el caso de Q\beta replicasa, ARN del
VEM-1 es el molde específico para la replicasa
(Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:3038 [1972]).
Otros ácidos nucleicos no se replicarán mediante esta enzima de
amplificación. De manera similar, en el caso de la ARN polimerasa
de T7, esta enzima de amplificación tiene una reducida
especificidad para sus propios promotores (Chamberlin et al.,
Nature, 228:227 [1970]). En el caso de la ADN ligasa de T4, la
enzima no ligará los dos oligonucleótidos o polinucleótidos, en el
que hay un apareamiento erróneo entre el sustrato de
oligonucleótido o polinucleótido y el molde en la unión de
acoplamiento (Wu y Wallace, Genomics, 4:560 [1989]). Finalmente,
Taq y Pfu polimerasas, en virtud de su capacidad de
actuar a temperatura alta, se encuentra que presentan especificidad
alta para las secuencias unidas y por tanto definidas mediante los
cebadores; la alta temperatura da como resultado condiciones
termodinámicas que favorecen la hibridación de cebadores con las
secuencias diana y la no hibridación con secuencias no diana (H.A.
Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press [1989]).
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "ácido nucleico amplificable" se usa en relación con
ácidos nucleicos que pueden amplificarse mediante cualquier
procedimiento de amplificación. Se considera que el "ácido
nucleico amplificable" normalmente comprenderá "molde de
muestra".
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "molde de muestra" se refiere a un ácido nucleico
creado a partir de una muestra que se analiza para determinar la
presencia de "diana" (definido a continuación). Por lo
contrario, "molde de fondo" se usa en relación con un ácido
nucleico distinto del molde de muestra que puede o no estar
presente en una muestra. El molde de fondo a menudo no se desea.
Puede ser el resultado del remanente, o puede deberse a la
presencia de contaminantes de ácido nucleico que se intentan
purificar lejos de la muestra. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de
microorganismos distintos de los detectados pueden presentarse como
fondo en una muestra de prueba.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, si se
produce de manera natural como en un digesto de restricción
purificado o bien producido sintéticamente, que puede actuar como
punto de iniciación de la síntesis cuando se sitúa en condiciones en
las que la síntesis de un producto de extensión de cebadores que es
complementario a una hebra de ácido nucleico se induce, (es decir,
en presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como ADN
polimerasa y a una temperatura y un pH adecuados). El cebador es
preferiblemente monocatenario para su máxima eficacia en la
amplificación, pero, como alternativa puede ser bicatenario. Si es
bicatenario, el cebador se trata en primer lugar para separar sus
hebras antes de usarse para preparar los productos de extensión.
Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El
cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los
productos de extensión en presencia del agente de inducción. Las
longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores,
incluyendo la temperatura, la fuente de cebador y el uso del
procedimiento.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "sonda" se refiere a un oligonucleótido (es decir, una
secuencia de nucleótidos), si se produce de manera natural como en
un digesto de restricción purificado o bien producido
sintéticamente, de manera recombinante o mediante amplificación por
PCR, que puede hibridar a otro oligonucleótido de interés. Una
sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Las sondas son útiles
en la detección, identificación y aislamiento de secuencias génicas
particulares. Se considera que cualquier sonda usada en la presente
invención se marcará con cualquier "molécula indicadora", de
manera que sea detectable en cualquier sistema de detección,
incluyendo, pero sin limitarse a sistemas de enzima (por ejemplo,
ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzima),
fluorescentes, radioactivos y luminescentes. No se pretende que la
presente invención se limite a cualquier sistema de detección o
marcador particular.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "diana", cuando se usa en relación con la reacción en
cadena de la polimerasa, se refiere a la región de ácido nucleico
unida mediante los cebadores usados para la reacción en cadena de
la polimerasa. Por tanto, la "diana" se intenta separar de
otras secuencias de ácido nucleico. Un "segmento" se define
como una región de ácido nucleico dentro de la secuencia diana.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") se
refiere al procedimiento de las patentes estadounidenses números
4.683.195, 4.683.202, y 4.965.188 concedidas a K.B. Mullis,
incorporadas en el presente documento por referencia, que describen
un procedimiento para aumentar la concentración de un segmento de
una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación o
purificación. Este procedimiento para amplificar la secuencia diana
está constituido por introducir un gran exceso de dos cebadores de
oligonucleótido a la mezcla de ADN que contiene la secuencia diana
deseada, seguido de una secuencia precisa de ciclos térmicos en
presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son
complementarios a sus hebras respectivas de la secuencia diana
bicatenaria. Para efectuar la amplificación, se desnaturaliza la
mezcla y entonces se reasocian los cebadores con sus secuencias
complementarias dentro de la molécula diana. Tras la reasociación,
los cebadores se extienden con una polimerasa de modo que formen un
nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de
desnaturalización, reasociación de cebadores y extensión de la
polimerasa pueden repetirse muchas veces (es decir,
desnaturalización, reasociación y extensión constituyen un
"ciclo"; puede existir numerosos "ciclos") para obtener
una concentración alta de un segmento amplificado de la secuencia
diana deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia
diana deseada se determina mediante las posiciones relativas de los
cebadores con respecto a cada uno, y por tanto, esta longitud es un
parámetro controlable. En virtud del aspecto de repetición del
procedimiento, el procedimiento se denomina en lo sucesivo la
"reacción en cadena de la polimerasa" (denominado en lo
sucesivo "PCR"). Ya que los segmentos amplificados deseados de
la secuencia diana se vuelven las secuencias predominantes (en
términos de concentración) en la mezcla, se dice que van a
"amplificarse por PCR".
Con PCR, es posible amplificar una única copia
de una secuencia diana específica en ADN genómico hasta un nivel
detectable mediante varias metodologías diferentes (por ejemplo,
hibridación con una sonda marcada; incorporación de cebadores
biotinilados seguido de detección de conjugado
avidina-enzima; incorporación de trifosfatos de
desoxinucleótido marcados con ^{32}P, tales como dCTP o dATP, en
el segmento amplificado). Además de ADN genómico, cualquier
secuencia de oligonucleótidos o polinucleótidos puede amplificarse
con el conjunto de moléculas de cebador apropiado. En particular,
los segmentos amplificados creados mediante el procedimiento de PCR
en sí mismo son, por sí mismos, moldes eficaces para las
amplificaciones por PCR posteriores.
Tal como se usa en el presente documento, las
expresiones "producto de PCR", "fragmento de PCR" y
"producto de amplificación" se refieren a la mezcla resultante
de compuestos tras completarse dos o más ciclos de las etapas de
PCR de desnaturalización, reasociación y extensión. Estos términos
abarcan el caso en el que hay amplificación de uno o más segmentos
de una o más secuencias diana.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "reactivos de amplificación" se refiere a aquellos
reactivos (trifosfatos de desoxirribonucleótido, tampón, etc.),
necesarios para la amplificación excepto por cebadores, molde de
ácido nucleico y la enzima de amplificación. Normalmente, los
reactivos de amplificación junto con otros componentes de reacción
se sitúan y están contenidos en un recipiente de reacción (tubo de
ensayo, micropocillo, etc.).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "transcriptasa inversa" o "RT-PCR"
se refiere a un tipo de PCR en el que el material de partida es
ARNm. El ARNm de partida se transforma enzimáticamente en ADN
complementario o "ADNc" usando una enzima transcriptasa
inversa. Entonces, el ADNc se usa como "molde" para una
reacción de "PCR".
Tal como se usa en el presente documento, los
términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de
restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las
cuales corta el ADN bicatenario en o cerca de una secuencia de
nucleótidos específica.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "antisentido" se usa en relación con secuencias de ARN
que son complementarias a una secuencia de ARN específica (por
ejemplo, ARNm). Incluidas dentro de esta definición están las
moléculas de ARN antisentido ("ARNas") implicadas en la
regulación génica mediante bacterias. El ARN antisentido puede
producirse mediante cualquier procedimiento, incluyendo síntesis
mediante corte y empalme del/de los gen(es) de interés en
una orientación inversa con respecto a un promotor vírico que
permite la síntesis de una hebra codificante. Una vez se introduce
en un embrión, esta hebra transcrita se combina con ARNm natural
producido mediante el embrión para formar dúplex. Entonces, estos
dúplex bloquean la transcripción adicional del ARNm o bien su
traducción. De esta manera, pueden generarse fenotipos mutantes. La
expresión "hebra antisentido" se usa en relación con una hebra
de ácido nucleico que es complementaria a la hebra "sentido".
La designación (-) (es decir, "negativa") se usa algunas veces
en relación con la hebra antisentido, con la designación (+) usada
algunas veces en relación con la hebra sentido (es decir,
"positiva").
El término "aislado" cuando se usa en
relación a un ácido nucleico, como en "un oligonucleótido
aislado" o "polinucleótido aislado" se refiere a una
secuencia de ácido nucleico que se identifica y se separa de al
menos un ácido nucleico contaminante con el que se asocia
generalmente en su fuente natural. El ácido nucleico aislado está
presente en una forma o conformación que es diferente de la que se
encuentra en la naturaleza. Por lo contrario, los ácidos nucleicos
no aislados son ácidos nucleicos tales como ADN y ARN encontrados en
el estado en el que se encuentran en la naturaleza. Por ejemplo,
una secuencia de ADN dada (por ejemplo, un gen) se encuentra en el
cromosoma de célula huésped en proximidad a genes vecinos;
secuencias de ARN, tales como una secuencia de ARNm específica que
codifica una proteína específica, se encuentran en la célula como
una mezcla con otros numerosos ARNm que codifican una multitud de
proteínas. Sin embargo, el ácido nucleico aislado también incluye
ácido nucleico en células que expresan generalmente una proteína
dada en la que el ácido nucleico está en una localización
cromosómica diferente de la de las células naturales, o de otro modo
está flanqueada por una secuencia de ácido nucleico diferente de la
que se encuentra en la naturaleza. El ácido nucleico aislado,
oligonucleótido o polinucleótido puede estar presente en forma
monocatenaria o bicatenaria. Cuando un ácido nucleico aislado,
oligonucleótido o polinucleótido va a utilizarse para expresar una
proteína, el oligonucleótido o polinucleótido contendrá como mínimo
la hebra sentido o codificante (es decir, el oligonucleótido o
polinucleótido puede ser monocatenario), pero puede contener ambas
hebras sentido y antisentido (es decir, el oligonucleótido o
polinucleótido puede ser bicatenario).
Tal como se usa en el presente documento, una
"porción de un cromosoma" se refiere a una sección discreta
del cromosoma. Los cromosomas se dividen en sitios o secciones por
citogenetistas como sigue: el brazo corto (relativo al centrómero)
de un cromosoma se denomina el brazo "p"; el brazo largo se
denomina el brazo "q". Entonces, cada brazo se divide en 2
regiones denominadas región 1 y región 2 (la región 1 es la más
cercana al centrómero). Cada región se divide adicionalmente en
bandas. Las bandas pueden dividirse adicionalmente en subbandas.
Por ejemplo, la porción 11p15.5 del cromosoma 11 humano es la
porción localizada en el cromosoma 11 (11) en el brazo corto (p) en
la primera región (1) en la 5ª banda (5) en la subbanda 5 (.5). Una
porción de un cromosoma puede "alterarse"; por ejemplo la
porción puede estar ausente debido a una deleción o puede
transponerse (por ejemplo, inversiones, translocaciones, expandidas
o contraídas debido a cambios en regiones repetidas). En el caso de
una deleción, un intento de hibridar (es decir, unir
específicamente) una sonda homóloga a una porción particular de un
cromosoma podría dar como resultado un resultado negativo (es decir,
la sonda no puede unirse a la muestra que contiene material
genético que se sospecha que contienen la porción del cromosoma que
falta). Por tanto, la hibridación de una sonda homóloga a una
porción particular de un cromosoma pude usarse para detectar alteraciones en una porción de un cromosoma.
porción particular de un cromosoma pude usarse para detectar alteraciones en una porción de un cromosoma.
La expresión "secuencias asociadas a un
cromosoma" significa preparaciones de cromosomas (por ejemplo,
prolongaciones de cromosomas metafásicos), ácido nucleico extraído
de una muestra que contiene ADN cromosómico (por ejemplo,
preparaciones de ADN genómico); el ARN que se produce mediante la
transcripción de genes ubicados en un cromosoma (por ejemplo, ARNnh
y ARNm) y copias de ADNc del ARN transcrito del ADN ubicado en un
cromosoma. Las secuencias asociadas a un cromosoma pueden
detectarse mediante numerosas técnicas incluyendo el análisis con
sonda de transferencias de tipo Southern y de tipo Northern e
hibridación in situ a ARN, ADN o cromosomas metafásicos con
sondas que contienen secuencias homólogas a los ácidos nucleicos en
las preparaciones enumeradas anteriormente.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "región codificante" cuando se usa en relación con un
gen estructural se refiere a las secuencias de nucleótidos que
codifican los aminoácidos encontrados en el polipéptido naciente
como resultado de la traducción de una molécula de ARNm. La región
codificante está unida, en eucariotas, en el lado 5' mediante el
triplete de nucleótidos "ATG" que codifica la metionina
iniciadora y en el lado 3' mediante uno de los tres tripletes que
especifican los codones de terminación (es decir, TAA, TAG,
TGA).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "purificado" o "purificar" se refiere a la
eliminación de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, los
ácidos nucleicos contenidos en una muestra (por ejemplo, sangre o
suero) se purifican mediante la eliminación de proteínas
contaminantes y moléculas pequeñas contenidas en la muestra. Los
ácidos nucleicos pueden purificarse mediante cualquier procedimiento
adecuado.
La expresión "molécula de ADN recombinante"
tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula
de ADN que está compuesta por segmentos de ADN unidos entre sí por
medio de técnicas biológicas moleculares.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "porción" cuando se usa en relación a una secuencia de
nucleótidos (como en "una porción de una secuencia de nucleótidos
dada") se refiere a fragmentos de esa secuencia. Los fragmentos
pueden oscilar en tamaño desde cuatro nucleótidos hasta la secuencia
de nucleótidos completa menos un nucleótido.
La expresión "proteína recombinante" o
"polipéptido recombinante" tal como se usa en el presente
documento se refiere a una molécula de proteína que se expresa a
partir de una molécula de ADN recombinante.
La expresión "proteína nativa" tal como se
usa en el presente documento para indicar que una proteína no
contiene restos de aminoácido codificados mediante secuencias de
vector; es decir la proteína nativa sólo contiene aquellos
aminoácidos encontrados en la proteína tal como se produce en la
naturaleza. Una proteína nativa puede producirse por medios
recombinantes o puede aislarse a partir de una fuente que se produce
de manera natural.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "porción" cuando se usa en relación con una proteína
(como en "una porción de una proteína dada") se refiere a
fragmentos de esa proteína. Los fragmentos pueden oscilar en tamaño
desde cuatro restos de aminoácido hasta la secuencia de aminoácidos
completa menos un aminoácido.
La expresión "transferencia de tipo
Southern", se refiere al análisis de ADN en geles de agarosa o
acrilamida para fraccionar el ADN según el tamaño seguido de la
transferencia del ADN desde el gel a un soporte sólido, tal como
nitrocelulosa o una membrana de nailon. Entonces, el ADN
inmovilizado se analiza con una sonda marcada para detectar las
especies de ADN complementarias a la sonda usada. El ADN puede
escindirse con enzimas de restricción antes de la electroforesis.
Tras la electroforesis, el ADN puede depurarse parcialmente y
desnaturalizarse antes de o durante la transferencia al soporte
sólido. Las transferencias de tipo Southern son una herramienta
convencional de los biólogos moleculares (Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,
NY, págs. 9,31-9,58 [1989]).
La expresión "transferencia de tipo
Northern", tal como se usa en el presente documento se refiere al
análisis de ARN mediante electroforesis de ARN en geles de agarosa
para fraccionar el ARN según el tamaño seguido de la transferencia
del ARN desde el gel a un soporte sólido, tal como nitrocelulosa o
una membrana de nailon. Entonces, el ARN inmovilizado se analiza
con una sonda marcada para detectar especies de ARN complementarias
a la sonda usada. Las transferencias de tipo Northern son una
herramienta convencional de biólogos moleculares (Sambrook, et
al., citado anteriormente, págs. 7,39-7,52
[1989]).
La expresión "inmunotransferencia de tipo
Western" se refiere al análisis de proteína(s) (o
polipéptidos) inmovilizada(s) sobre un soporte tal como
nitrocelulosa o una membrana. Las proteínas se hacen pasar por geles
de acrilamida para separar las proteínas, seguido de transferencia
de la proteína desde el gel a un soporte sólido, tal como
nitrocelulosa o una membrana de nailon. Entonces las proteínas
inmovilizadas se exponen a anticuerpos con reactividad frente a un
antígeno de interés. La unión de los anticuerpos puede detectarse
mediante diversos procedimientos, incluyendo el uso de anticuerpos
radiomarcados.
La expresión "determinante antigénico" tal
como se usa en el presente documento se refiere a esa porción de un
antígeno que se pone en contacto con un anticuerpo particular (es
decir, un epítopo). Cuando una proteína o un fragmento de una
proteína se usa para inmunizar un animal huésped, numerosas regiones
de la proteína pueden inducir la producción de anticuerpos que se
unen específicamente a una región o estructura tridimensional dada
en la proteína; estas regiones o estructuras se denominan en lo
sucesivo determinantes antigénicos. Un determinante antigénico
puede competir con el antígeno intacto (es decir, el
"inmunógeno" usado para lograr la respuesta inmunitaria) por la
unión a un anticuerpo.
El término "transgén" tal como se usa en el
presente documento se refiere a un gen foráneo que se sitúa en un
organismo introduciendo el gen foráneo dentro de huevos recién
fertilizados o embriones tempranos. El término "gen foráneo"
se refiere a cualquier ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de
gen) que se introduce dentro del genoma de un animal mediante
manipulaciones experimentales y puede incluir secuencias de gen
encontradas en ese animal siempre que el gen introducido no resida
en la misma ubicación que el gen presente de manera natural.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "vector" se usa en relación con moléculas de ácido
nucleico que transfieren segmento(s) de ADN de una célula a
otra. El término "vehículo" algunas veces se usa de manera
intercambiable con "vector".
La expresión "vector de expresión" tal como
se usa en el presente documento se refiere a una molécula de ADN
recombinante que contiene una secuencia codificante deseada y
secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la
expresión de la secuencia codificante operativamente unida en un
organismo huésped particular. Las secuencias de ácido nucleico
necesarias para la expresión en procariotas incluyen normalmente un
promotor, un operador (opcional) y un sitio de unión a ribosoma, a
menudo junto con otras secuencias. Se sabe que las células
eucarióticas utilizan promotores, potenciadores y señales de
terminación y poliadenilación.
Los términos "sobreexpresión" y "que
sobreexpresa" y equivalentes gramaticales, se refieren a la
transcripción y traducción de un gen. Tal transcripción y
traducción puede ser in vivo o in vitro.
El término "transfección" tal como se usa
en el presente documento se refiere a la introducción de ADN foráneo
en células eucarióticas. La transfección puede llevarse a cabo
mediante una variedad de medios conocidos en la técnica incluyendo
precipitación conjunta de fosfato de calcio-ADN,
transfección mediada por DEAE-dextrano,
transfección mediada por polibreno, electroporación, microinyección,
fusión de liposomas, lipofección, fusión de protoplastos, infección
retrovírica y biolística.
La expresión "transfección estable" o
"transfectado de manera estable" se refiere a la introducción e
integración de ADN foráneo en el genoma de la célula transfectada.
La expresión "transfectante estable" se refiere a una célula
que tiene integrado de manera estable ADN foráneo en el ADN
genómico.
La expresión "transfección transitoria" o
"transfectado transitoriamente" se refiere a la introducción de
ADN foráneo en una célula en la que el ADN foráneo no se integra en
el genoma de la célula transfectada. El ADN foráneo persiste en el
núcleo de la célula transfectada durante varios días. Durante este
tiempo el ADN foráneo se somete a los controles reguladores que
gobiernan la expresión de genes endógenos en los cromosomas. La
expresión "transfectante transitorio" se refiere a células que
han captado ADN foráneo pero no han integrado este ADN.
La expresión "coprecipitación de fosfato de
calcio" se refiere a una técnica para la introducción de ácidos
nucleicos en una célula. La captación de ácidos nucleicos por las
células se potencia cuando el ácido nucleico se presenta como un
coprecipitado de fosfato de calcio-ácido nucleico. La técnica
original de Graham y Van Der Eb (Graham y Van Der Eb, Virol.,
52:456 [1973]), se ha modificado por diversos grupos para optimizar
las condiciones para tipos particulares de células. La técnica es
muy consciente de estas modificaciones numerosas.
Una "composición que comprende una secuencia
de polinucleótidos dada" tal como se usa en el presente documento
se refiere ampliamente a cualquier composición que contiene la
secuencia de polinucleótidos dada. La composición puede comprender
una disolución acuosa. Las composiciones que comprenden secuencias
de polinucleótidos que codifican un polipéptido o fragmentos del
mismo pueden emplearse como sondas de hibridación. En este caso,
las secuencias de polinucleótidos se emplean normalmente en una
disolución acuosa que contiene sales (por ejemplo, NaCl),
detergentes (por ejemplo, SDS) y otros componentes (por ejemplo,
solución de Denhardt, leche en polvo, ADN de esperma de salmón,
etc.).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "perioperatorio" se refiere al periodo de tiempo
alrededor de una operación quirúrgica. El término abarca el periodo
antes, durante y tras una "operación quirúrgica". El periodo
"perioperatorio" comienza cuando la cirugía se contempla por
primera vez (por ejemplo, cuando el paciente se programa para
cirugía) y termina cuando se completa la recuperación de la cirugía
(por ejemplo, cuando ya no se requieren los servicios de un médico
encargado).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "cirugía" y las expresiones relacionadas
"quirúrgico", "operación quirúrgica" o "intervención
quirúrgica" se refieren a cualquier procedimiento médico que
implica una incisión en un tejido.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "prequirúrgico" se refiere al periodo inmediatamente
antes de la cirugía. El periodo "prequirúrgico" se utiliza
normalmente para preparar al sujeto para la cirugía. Durante el
periodo "prequirúrgico", pueden llevarse a cabo una exploración
y pruebas relevantes. No se pretende que el periodo
"prequirúrgico" se limite a una cantidad específica de tiempo
que precede a la cirugía. En algunos casos, prequirúrgico es
cualquier periodo de tiempo desde varias horas hasta varios minutos
antes de la cirugía (por ejemplo, en el caso de cirugía de
emergencia o urgente). En otros casos, el periodo
"prequirúrgico" puede ser de varios días o semanas antes de la
cirugía (por ejemplo, en el caso de cirugía que no es de emergencia
o electiva).
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "procedimiento médico" se refiere a cualquier
procedimiento clínico o de diagnóstico realizado por un médico (por
ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a un médico o auxiliar
médico, un enfermero o enfermero practicante, o un veterinario).
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "cirugía invasiva" se refiere a un "procedimiento
quirúrgico" que requiere una gran incisión. La cirugía invasiva
a menudo requiere un "anestésico general". Tal como se usa en
el presente documento, la expresión "cirugía no invasiva" se
refiere a un "procedimiento quirúrgico" que requiere una
incisión mínima. La "cirugía no invasiva" a menudo se lleva a
cabo con "anestesia regional" o "anestesia local"
complementada con sedación consciente. La "cirugía no invasiva"
a menudo se lleva a cabo como un procedimiento ambulatorio.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "anestésico" se refiere a una medicación que induce un
estado reversible de pérdida de sensación. Los "anestésicos" a
veces provocan un estado temporal de pérdida de consciencia y
parálisis. Los "anestésicos" a menudo se usan durante la
"cirugía" para prevenir el dolor.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "anestesia local" se refiere a una anestesia que
adormece una parte del cuerpo (sin afectar a otra parte del cuerpo)
durante un periodo corto de tiempo. Cuando la "anestesia
local" se administra a un sujeto, el sujeto normalmente permanece
consciente. Los ejemplos de "anestésicos locales" incluyen,
pero no se limitan a, bupivacaína y lidocaína.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "anestesia regional" se refiere a una anestesia que
adormece una parte del cuerpo (sin afectar a otra parte del cuerpo)
durante hasta varias horas. Cuando la "anestesia regional" se
administra a un sujeto, el sujeto normalmente permanece consciente.
Los ejemplos de "anestesia regional" incluyen, pero no se
limitan a, anestesia espinal o administrada por vía epidural.
\newpage
Tal como se usa en el presente documento, el
término "anestesia general" se refiere a una anestesia que
adormece todo el cuerpo durante la duración de una "cirugía".
La "anestesia general" se administra normalmente de manera
continua (por ejemplo, por vía intravenosa o por vía traqueal) a lo
largo del procedimiento. Cuando la "anestesia general" se
administra a un sujeto, el sujeto normalmente no permanece
consciente. Además, la "anestesia general" a menudo requiere
ventilación artificial (por ejemplo, intubación).
Tal como se usa en el presente documento, el
término "genómico" se refiere a una composición genética de un
"sujeto" (es decir, su genoma o genes). Por ejemplo, un
"perfil genómico" se refiere a un conjunto de información
sobre los genes de un "sujeto" dado (por ejemplo, la presencia
o ausencia de un conjunto específico de mutaciones o "SNP").
Tal como se usa en el presente documento, el término
"determinación del perfil genómico perioperatorio" se refiere
a un "perfil genómico" generado durante el periodo de tiempo
"perioperatorio".
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "agente farmacológico" se refiere a un compuesto (por
ejemplo, una molécula inorgánica o una proteína) que tiene un
efecto fisiológico o "respuesta farmacológica". Un ejemplo de
un "agente farmacológico" es un fármaco o una medicación. Tal
como se usa en el presente documento, la expresión "riesgo
farmacodinámico" se refiere al riesgo de un "sujeto" de una
respuesta clínica de magnitud anómala a un "agente
farmacológico". Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "riesgo farmacocinético" se refiere al riesgo de un
"sujeto" de absorber, metabolizar (por ejemplo, no utilizar o
utilizar de manera demasiado rápida), distribuir y excretar de
manera anómala un "agente farmacológico".
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "diagnóstico presintomático" se refiere al
diagnóstico de una afección o enfermedad médica antes de la
manifestación de los síntomas. En algunos casos, el "diagnóstico
presintomático" diagnostica una predisposición o enfermedad
genética.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "diagnóstico diferencial" como en "diagnóstico
diferencial de trastornos sintomáticos" se refiere a la
distinción entre trastornos múltiples que aparentemente pueden
parecerse entre sí (por ejemplo, tienen los mismos signos o
síntomas), pero tienen causas subyacentes diferentes y por
consiguiente requieren intervenciones distintas.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "enfermedad coexistente" se refiere a una afección
hacia la que no se dirige un procedimiento "médico" o
"quirúrgico", pero que puede ser relevante para ciertos
aspectos (por ejemplo, administración de anestesia o analgésicos)
durante un procedimiento "médico" o "quirúrgico"
dado.
dado.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "selección de un ciclo de actuación de tratamiento
médico", o en el caso de una "cirugía", "selección de un
ciclo de actuación quirúrgica" se refiere al cuidado
proporcionado durante un procedimiento "médico" o
"quirúrgico" incluyendo, pero sin limitarse a, elección de
"agente farmacológico", tipo de "anestésico" o tipo de
"cirugía".
Tal como se usa en el presente documento, el
término "marcador" se refiere a un punto de referencia (por
ejemplo, un punto en un cromosoma) para la identificación de un
cambio o una mutación (por ejemplo, un cambio de nucleótido). Tal
como se usa en el presente documento, el término "marcador
genético" se refiere a un punto (por ejemplo, en un cromosoma,
en un ácido nucleico vírico o en un ácido nucleico mitocondrial)
para el que un cambio (por ejemplo, una mutación o un polimorfismo)
provoca un cambio genotípico o fenotípico. Un ejemplo de un
"marcador genético" es un "SNP".
Tal como se usa en el presente documento, los
términos "SNP" o "polimorfismos de un solo nucleótido" se
refieren a cambios de una sola base en una ubicación específica en
el genoma de un organismo (por ejemplo, un ser humano). Los
"SNP" pueden estar ubicados en una porción de un genoma que no
codifica para un gen. Como alternativa, un "SNP" puede estar
ubicado en la región codificante de un gen. En este caso, el
"SNP" puede alterar la estructura y función de la proteína en
la que se ubica. En algunos ejemplos, un "SNP" puede afectar a
la respuesta de un individuo a un procedimiento médico o cirugía
(por ejemplo, respuesta a un anestésico o medicación contra el
dolor). La ubicación y las secuencias de muchos "SNP" están
disponible en bases de datos públicas (véase por ejemplo, NCBI's
dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)) así como bases de datos
privadas.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "ensayo" se refiere a un procedimiento de detección de
un "marcador genético". Un ensayo puede detectar uno o más
"marcadores genéticos" (por ejemplo, "SNP"). Algunos
ensayos pueden generar un "perfil genómico".
Tal como se usa en el presente documento, el
término "muestra" se usa en su sentido más amplio. En un
sentido puede referirse a una muestra de ácido nucleico o tejido.
En otro sentido, pretende incluir un espécimen o cultivo obtenido a
partir de cualquier fuente. Las muestras biológicas pueden obtenerse
a partir de animales (incluyendo seres humanos) y abarcar fluidos,
sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen, pero no
se limitan a productos sanguíneos, tales como plasma, suero y
similares. Una "muestra" también puede ser información
genética. Por ejemplo, los datos de la secuencia de un sujeto
almacenados en un dispositivo de memoria (por ejemplo, un disco).
Estos ejemplos no han de interpretarse como limitantes de los tipos
de muestra aplicables a la presente
invención.
invención.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "sujeto" se refiere a un animal (por ejemplo, un ser
humano) que experimenta un procedimiento "médico" o
"quirúrgico". Un "sujeto" puede ser un ser humano o un
animal no humano.
La presente invención proporciona procedimientos
y composiciones para la exploración genómica perioperatoria. En
algunas realizaciones, la exploración genómica se diseña para
someter a prueba para determinar mutaciones y polimorfismos
relacionados con el riesgo de un sujeto de complicaciones
relacionadas con la anestesia. En otras realizaciones, la
exploración genómica perioperatoria se diseña para someter a prueba
para determinar mutaciones o polimorfismos específicos relevantes
para otros tipos de cirugía, tratamientos quirúrgicos y
procedimientos quirúrgicos incluyendo pero sin limitarse a cirugía
cardíaca (por ejemplo, angioplastia, derivación (bypass)),
neurocirugía, cirugía abdominal (por ejemplo, trasplantes de riñón o
hígado), mastectomía, trasplantes de médula ósea, cirugía vesical,
cirugía intestinal (por ejemplo, cirugía de colon o intestino
grueso), cirugía pulmonar, cirugía espinal, cirugía reconstructiva
y estética, cirugía de la vesícula biliar, cirugía ortopédica y
cirugía pediátrica (de todos los tipos). Un experto en la técnica
relevante entiende que la presente invención abarca perfiles
genómicos perioperatorios para técnicas quirúrgicas adicionales
distintas a las enumeradas anteriormente.
Los marcadores para la inclusión en perfiles
genómicos perioperatorios se seleccionan basándose en criterios
específicos. La secuencia de la mutación o el polimorfismo, así como
el resultado clínico de llevar un alelo mutante, deben conocerse.
En realizaciones preferidas, se seleccionan marcadores para los que
no hay prueba de diagnóstico alternativa actual, o la prueba
disponible no es adecuada para la exploración perioperatoria. En
realizaciones particularmente preferidas, se seleccionan marcadores
para los que puede alterarse un ciclo de tratamiento clínico en
respuesta a la presencia o ausencia de una mutación o
polimorfismo.
Tras la selección de marcadores para la
inclusión en un perfil genómico dado, se proporciona un ensayo para
la detección. En algunas realizaciones, el ensayo es un ensayo de
secuenciación directa. En otras realizaciones, el ensayo es un
ensayo de polimorfismos de la longitud de fragmentos. En algunas
realizaciones preferidas, el ensayo es un ensayo de hibridación. En
algunas realizaciones preferidas, el ensayo es un ensayo de
hibridación que incorpora la detección por medios enzimáticos. En
otras realizaciones preferidas, el ensayo es un ensayo
espectrofotométrico de masas MALDI-TOF. Sin embargo,
los perfiles genómicos de la presente invención encuentran su uso
con cualquier procedimiento de detección que pueda detectar
secuencias específicas y pueda aplicarse a procedimientos de
detección desarrollados en el futuro que pueden, o no, basarse en
hibridación de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el proceso
de seleccionar marcadores, llevar a cabo ensayos de detección y
distribuir datos a sujetos y médicos se organiza mediante un sistema
electrónico integrado (por ejemplo, basado en la red).
Con el fin de generar los perfiles genéticos
perioperatorios de la presente invención, en primer lugar se
seleccionan marcadores para su inclusión en el perfil. Debe
conocerse la secuencia de los marcadores. En realizaciones
preferidas, los marcadores son mutaciones en un gen dado que se sabe
que tiene un fenotipo asociado. Se conocen y son accesibles
cantidades grandes de datos de secuencia y mutaciones o
polimorfismos conocidos. En realizaciones preferidas, se
seleccionan marcadores por su utilidad en proporcionar información
relevante al cuidado perioperatorio.
En algunas realizaciones de la presente
invención, los marcadores genéticos son polimorfismos de un solo
nucleótido ("SNP"). SNP conocidos están disponibles de bases
de datos públicas y privadas (véase anteriormente). En otras
realizaciones, los marcadores son mutaciones (por ejemplo,
deleciones o inserciones de nucleótidos). En algunas realizaciones,
los marcadores representan variaciones de corte y empalme. En otras
realizaciones, los marcadores representan mutaciones en ADN
mitocondrial.
Además de SNP conocidos, una variedad de
información de secuencia de nucleótidos que describe alelos de tipo
natural y mutantes de un gran número de genes está disponible en
bases de datos públicas incluyendo, pero sin limitarse a DbEST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbES); EBI/EMBL
(http://www.ebi.ac.uk/mutaciones); EBI
(http://www.ebLac.uk/ebihome.html); EMBL
(http://www.ebi.ac.uk/queries/queries.html); GDB
(http://www.gdb.org/
gdb/gdbtop.html); GeneCards (http://biomfbrmatics.weizmaim.ac.il/cards/index.html); GeneClinics (http:l/www.
geneclinics.org); Genethon (http://www.genethon.fr/genethonen.html); GSDB (http://www.ncgr.org); HGP
(http://www.ornl.gov/TechResources/HumanGenome/home.html); Human Gen Mutation Databoase (http://www.
uwcm.ac.uk/uwcm/mg/search); NCBI (http://www.ncbLn1m.nih.gov/); OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Omim/); PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/); Research Tools (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
SCIENCE96/ResTools.html); RHdb (http://www.ebi.ac.uk/RHdb); Stanford Human Genome Center (http://www.
shgc.stanford.edu/); HUGO (http://www.gen.ucl.ac.uk/hugo); TIGR (http://www.tigr.org/); The National Human Genome Research Institute (http: //www.nhgri.nih.gov/); The Whitehead Institute Center for Genome (http://www.
genoma.wi.mit.edu/); Unigene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Unigene/index.html); University of Oklahoma
(http://www.dnal.chem.ou.edu/index.html); y WEHI (http://wehih.wehi.edu.au/srs/srsc/). Un experto en la técnica relevante entiende que los datos de secuencia de nucleótidos también pueden obtenerse a partir de fuentes adicionales incluyendo, pero sin limitarse a, bases de datos públicas y privadas; así como experimentalmente.
gdb/gdbtop.html); GeneCards (http://biomfbrmatics.weizmaim.ac.il/cards/index.html); GeneClinics (http:l/www.
geneclinics.org); Genethon (http://www.genethon.fr/genethonen.html); GSDB (http://www.ncgr.org); HGP
(http://www.ornl.gov/TechResources/HumanGenome/home.html); Human Gen Mutation Databoase (http://www.
uwcm.ac.uk/uwcm/mg/search); NCBI (http://www.ncbLn1m.nih.gov/); OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Omim/); PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/); Research Tools (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
SCIENCE96/ResTools.html); RHdb (http://www.ebi.ac.uk/RHdb); Stanford Human Genome Center (http://www.
shgc.stanford.edu/); HUGO (http://www.gen.ucl.ac.uk/hugo); TIGR (http://www.tigr.org/); The National Human Genome Research Institute (http: //www.nhgri.nih.gov/); The Whitehead Institute Center for Genome (http://www.
genoma.wi.mit.edu/); Unigene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Unigene/index.html); University of Oklahoma
(http://www.dnal.chem.ou.edu/index.html); y WEHI (http://wehih.wehi.edu.au/srs/srsc/). Un experto en la técnica relevante entiende que los datos de secuencia de nucleótidos también pueden obtenerse a partir de fuentes adicionales incluyendo, pero sin limitarse a, bases de datos públicas y privadas; así como experimentalmente.
En realizaciones preferidas de la presente
invención, los marcadores genéticos seleccionados para el perfil
genómico perioperatorio se adaptan a un procedimiento médico o
quirúrgico específico. Se seleccionan los marcadores basándose en
diversos criterios incluyendo, pero sin limitarse a, validez
analítica, validez clínica, utilidad clínica y valor comercial.
En algunas realizaciones de la presente
invención, se seleccionan marcadores por su validez analítica (por
ejemplo, precisión de detección usando una técnica de detección
particular). También se seleccionan marcadores basándose en su
validez clínica, o su efecto predictivo (por ejemplo, el marcador
predice con exactitud la respuesta de un sujeto a un aspecto
específico del tratamiento). La secuencia de todas las mutaciones o
los polimorfismos que van a someterse a prueba debe estar
disponible. Para los marcadores con mutaciones o SNP múltiples se
prefiere que el resultado fenotípico de cada cambio de nucleótido se
conozca. También se prefiere que se seleccionen marcadores para los
que la predisposición no puede determinarse (por ejemplo, que no
puede determinarse económica o eficazmente) a través de medios
alternativos de detección, tales como historia clínica, examen
físico o un ensayo no genómico.
En algunas realizaciones de la presente
invención, se seleccionan marcadores para los que el tratamiento
alternativo tiene poco o ningún efecto sobre el coste o la
inconveniencia para el sujeto. Por tanto, se seleccionan marcadores
para los que ni un resultado falso negativo (se realiza el
tratamiento original y el paciente no está en peor situación que si
el ensayo no se hubiera realizado) ni un resultado falso positivo
(el tratamiento alternativo es de coste y riesgo equivalente al
tratamiento original) tiene un efecto perjudicial sobre el resultado
del sujeto.
En algunas realizaciones, el perfil genómico
perioperatorio incluye dos o más marcadores. En otras realizaciones,
el perfil genómico perioperatorio incluye cinco o más marcadores.
En algunas realizaciones, el perfil genómico perioperatorio incluye
10 o más marcadores. En algunas realizaciones preferidas, el perfil
genómico perioperatorio incluye 20 o más marcadores. En otras
realizaciones preferidas, el perfil genómico perioperatorio incluye
50 o más marcadores. En algunas realizaciones particularmente
preferidas, el perfil genómico perioperatorio incluye 100 o más
marcadores. Sin embargo, la utilidad del ensayo se determina
principalmente mediante el resultado predictivo de los marcadores
individuales o la combinación de marcadores, no mediante la cantidad
de marcadores incluidos.
En realizaciones particularmente preferidas, se
seleccionan marcadores que proporcionan información que puede
usarse para alterar el ciclo de tratamiento (es decir, los
marcadores tienen utilidad clínica). Por ejemplo, si un sujeto se
encuentra que está predispuesto para hacerse reaccionar mal con uno
de los diversos fármacos proporcionados comúnmente durante un
procedimiento quirúrgico, el médico puede elegir un fármaco
alternativo. De utilidad particular son los marcadores para
predisposiciones para las que un tratamiento alternativo,
equivalente en coste o de fácil administración, puede sustituirse,
salvando así vidas y disminuyendo el número de traumatismos
potencialmente mortales caros (es decir, la inclusión de un marcador
dado tiene la ventaja añadida de tener valor comercial). Además, se
seleccionan marcadores para los que un resultado negativo (por
ejemplo, la ausencia de una condición subyacente) tiene utilidad
clínica (por ejemplo, adyuvantes en el diagnóstico diferencial de
una enfermedad).
En algunas realizaciones, la adición o
sustracción de marcadores del perfil genómico se determina
experimentalmente. Por ejemplo, si se determina que un marcador no
se correlaciona bien con la respuesta de un sujeto a un componente
dado del tratamiento, se sustrae el marcador. La inclusión de
marcadores nuevos también puede determinarse empíricamente. Por
ejemplo, si se encuentra que un marcador nuevo tiene buena capacidad
predictiva, solo o en combinación con otros marcadores, ese marcador
se añade al perfil genómico.
En algunas realizaciones preferidas, se incluyen
marcadores que miden el riesgo farmacogenético de un sujeto
(respuesta a compuesto farmacológico). En algunas realizaciones, se
incluyen marcadores para el riesgo farmacodinámico de un sujeto
(una respuesta de magnitud anómala provocada por un agente
farmacológico; por ejemplo, hipertermia maligna en respuesta a
anestésico o broncoespasmo no aliviado mediante una respuesta de
receptor adrenérgico \beta1 anómala a un agonista de \beta1) en
el perfil genómico perioperatorio. Todavía en otras realizaciones
preferidas, se incluyen marcadores que predicen la respuesta
farmacocinética de un sujeto (adsorción anómala, distribución,
metabolismo y excreción de un fármaco, dando como resultado
sobredosis o falta de eficacia de un fármaco; por ejemplo,
mutaciones de citocromo P450 que efectúa el metabolismo de una
variedad de fármacos) en el perfil genómico perioperatorio.
En algunas realizaciones preferidas, se incluyen
marcadores con utilidad de diagnóstico en el perfil genómico
perioperatorio. En algunas realizaciones preferidas, se incluyen
marcadores que identifican afecciones preexistentes pero no
sintomáticas que son relevantes para el procedimiento quirúrgico
(por ejemplo, rasgo de drepanocito o síndrome de QT largo que
pueden manifestarse en respuesta a cirugía) en el perfil genómico
perioperatorio.
En realizaciones preferidas adicionales, se
incluyen marcadores que establecen el diagnóstico diferencial de
trastornos sintomáticos que pueden parecerse entre sí en apariencia,
pero que requieren intervenciones diferentes durante la cirugía.
Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, clases de parálisis
periódica o tipos de porfiria.
En algunas realizaciones, el ensayo de
exploración perioperatoria incluye marcadores adaptados al
procedimiento quirúrgico específico que esté realizándose (por
ejemplo, receptores de trasplante, cirugía cardíaca o cirugía
ambulatoria sistemática). En algunas realizaciones, el perfil
genómico perioperatorio incluye marcadores únicos para un sujeto en
un cierto grupo (por ejemplo, edad, origen étnico, sexo).
En algunas realizaciones, los marcadores
incluidos en el perfil genómico son haplotipos o la variación
natural dentro de un gen único a un grupo dado de sujetos (por
ejemplo, una familia de parientes consanguíneos). Algunos
haplotipos predicen la respuesta a un agente farmacéutico dado (por
ejemplo, falta de respuesta a un fármaco dado).
En algunas realizaciones, se incluyen marcadores
adicionales que no son específicos para el procedimiento quirúrgico
que esté realizándose, pero que predicen el resultado general de
cirugía y procedimientos relacionados. Los ejemplos incluyen, pero
no se limitan a, marcadores para ototoxicidad aminoglucósida,
APO\varepsilon4, citocinas de heridas, riesgo de septicemia
(TNF\alpha), grupos sanguíneos, factores de coagulación y riesgo
de trombosis. En algunas realizaciones, el ensayo de exploración
perioperatoria incluye otras pruebas no relacionadas con el perfil
genómico para la aplicación quirúrgica principal, pero relevante en
el caso de una complicación que requiere intervención de emergencia
(por ejemplo, determinación del grupo sanguíneo). En algunas
realizaciones, el perfil genómico perioperatorio incluye un
identificador genómico único (por ejemplo, una serie de SNP no
codificantes polimórficos), que por tanto proporciona una referencia
segura, exacta interna para archivar y rastrear los datos genéticos
específicos para el sujeto particular.
En algunas realizaciones de la presente
invención, se genera un perfil genómico para exploración
perioperatoria de una respuesta de un sujeto a la anestesia
(general, regional o local). En realizaciones preferidas, se eligen
marcadores que son predictivos de no sólo una respuesta de un sujeto
a una anestesia particular, sino también para afecciones
preexistentes conocidas o desconocidas que pueden influenciar en una
respuesta de un sujeto a una anestesia particular o medicación dada
junto con la anestesia. En algunas realizaciones preferidas, el
perfil genómico incluye adicionalmente marcadores adaptados hacia el
procedimiento quirúrgico específico que va a realizarse.
En realizaciones preferidas que implican
exploración perioperatoria para las respuestas a anestesia, se
seleccionan marcadores para respuestas a anestesia específica o
fármacos proporcionados comúnmente junto con anestesia (por
ejemplo, relajantes musculares o medicaciones para el dolor). En
algunas realizaciones, los marcadores para mutaciones en el gen
BChE se incluyen en el perfil genómico perioperatorio. Se conocen
marcadores que son predictivos de deficiencias de BChE (véase por
ejemplo, La Du et al., Cell. and Molec. Neurobiol., 11:79
[1991]). El único ensayo disponible para BChE es un ensayo
bioquímico que consume demasiado tiempo y es demasiado caro para
incluirse en una exploración perioperatoria rutinaria. Además, si se
encuentra que un sujeto contiene un marcador predictivo de
deficiencia de BChE, pueden sustituirse fácilmente fármacos
alternativos sin coste adicional o inconveniencia.
En algunas realizaciones, se incluyen marcadores
para defectos de metabolismo de debrisoquina (es decir, citocromo
P450) en el perfil genómico perioperatorio. Se han descrito defectos
en el gen CYP2D6 conocido por afectar la farmacocinética de ciertos
fármacos (véase por ejemplo, Sachse et al., Am. J. Hum.
Genet., 60:284 [1997]). Los ensayos bioquímicos actuales para
mutaciones de CYP2D6 son demasiado caros e inconvenientes para
incluirse en exploración perioperatoria. Si se conoce una
predisposición de un sujeto a metabolismo P450 perjudicado o
acelerado, pueden evitarse fácilmente reacciones adversas al fármaco
sustituyendo otras medicaciones o ajustando las dosificaciones.
Además, en algunas realizaciones, los marcadores
para defectos adicionales relacionados a metabolismo de fármaco,
incluyendo, pero sin limitarse a susceptibilidad a toxicidad de
óxido nitroso u homocisteinemia asociada a óxido nitroso (por
ejemplo, mutaciones en los genes cistationa \beta sintasa, MTHFR y
metionina sintasa) también se incluyen en perfiles genómicos
perioperatorios. En algunas realizaciones, también se incluyen
marcadores que identifican sujetos con afecciones subyacentes que
los hace probables de responder mal a la anestesia en el perfil
genómico perioperatorio. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se
incluyen marcadores para hipertermia maligna (HM) en el perfil
genómico. Se conocen en la técnica mutaciones predictivas de HM
(véanse por ejemplo, Vladutiu et al., Am J. Hum. Genet.,
29:A5 [1998]; Monnier et al., Am. J. Hum. Genet., 60:1316
[1997]). Además, la única prueba diagnóstica disponible para HM es
una prueba de contractura in vitro cara que requiere una
muestra de músculo (véase por ejemplo, Brandt et al., Hum.
Mol. Genet., 8:2055 [1999]). Además, están disponibles tratamientos
alternativos efectivos para prevenir HM. Si se encuentra que un
sujeto tiene un marcador predictivo de riesgo aumentado para HM, se
evitan los anestésicos conocidos por provocar HM. Además, puede
darse al sujeto dantroleno para prevenir HM.
En algunas realizaciones, también se incluyen
marcadores para enfermedades genéticas que pueden no ser
sintomáticos, pero que, sin embargo, pueden afectar la respuesta a
la anestesia. Por ejemplo, se incluyen marcadores para trastornos
arritmogénicos hereditarios (véase por ejemplo, Priori et
al., Circulation, 99:518 [1999]). Un trastorno arritmogénico
hereditario es el síndrome de QT largo, caracterizado por
repolarización ventricular prolongada anómala y un riesgo alto de
taquiarritmias ventriculares malignas. Los períodos de estrés físico
alto (por ejemplo, cirugía y anestesia) pueden provocar una crisis
en individuos susceptibles. La identificación de individuos con un
marcador predictivo de síndrome de QT largo permite al médico
controlar más de cerca al individuo para determinar señales de
anormalidades cardiacas, evitar fármacos agravantes y tratar antes
de que surjan ritmos refractarios.
En algunas realizaciones, los perfiles genómicos
perioperatorios incluyen marcadores para deficiencias en plaquetas
o proteínas de coagulación sanguínea (por ejemplo,
metilenotetrahidrofolato reductasa, metionina sintasa, cistationa
\beta sintasa, factor V Leiden y protrombina) conocidos por
aumentar o disminuir el riesgo de trombosis (coágulos sanguíneos).
Muchas incidencias de trombosis venosas están asociadas a cirugía u
otros traumatismos y dan como resultado terapias caras y morbosidad.
Aproximadamente el 50% de todas la trombosis son hereditarias
(Brick, Seminars in Thrombosis and Hemostatis, 25:251 [1999]). Se
han identificado mutaciones y polimorfismos en estos genes
conocidos por aumentar el riesgo de trombosis (véanse por ejemplo,
Frosst et al., Nature Genet., 10:111 [1995]; Harmon et
al., Genet. Epidemiol., 17:298 [1999]; Tsai et al., Am.
J. Hum. Genet., 59:1262 [1996]; Simoni et al., New Eng. J.
Med., 336:399 [1997]; DeStefano et al., New Eng. J. Med.,
341:801 [1999]). Si se identifica un sujeto como que está en riesgo
para trombosis, puede elegirse una anestesia o medicación
alternativa. El tratamiento profiláctico (por ejemplo, medicaciones
anticoagulación, posicionamiento y dispositivos de compresión) y el
control de cerca pueden reducir la incidencia y gravedad del
trombo.
En algunas realizaciones, se incluyen marcadores
específicos para defectos de coagulación (predictivos de un riesgo
aumentado de hemorragia y accidente cerebrovascular asociado) en el
perfil genómico perioperatorio. Ejemplos incluyen, pero no se
limitan a polimorfismos en activador de plasminógeno tisular (TPA),
PAI-1 y fibrinógeno. Si se encuentra que un
paciente está en riesgo aumentado de hemorragia, puede implementarse
el control específico posquirúrgico para tener en cuenta la
intervención temprana. Adicionalmente, pueden utilizarse agentes
farmacéuticos con un riesgo disminuido de agravar una posible
hemorragia.
En algunas realizaciones, se incluyen marcadores
para polimorfismos en moléculas de adhesión a superficie de
plaquetas (por ejemplo, sitio de adhesión de fibrinógeno GP
IIb/IIIa), función endotelial e inflamación (citocinas) en el
perfil genómico perioperatorio. Los polimorfismos en estos factores
pueden ser indicativos de un riesgo aumentado para infarto de
miocardio (IM; ataque al corazón). Si se encuentra que un sujeto
tiene un marcador indicativo de un riesgo aumentado de un IM,
pueden elegirse agentes farmacéuticos apropiados para la prevención
o intervención y puede controlarse específicamente el paciente para
determinar señales de un IM.
En algunas realizaciones, se incluyen marcadores
para afecciones subyacentes adicionales que pueden influenciar la
elección de la anestesia u otro tratamiento. Ejemplos y ciclos de
acción alterados incluyen, pero no se limitan a estenosis
subaórtica hipertrófica idiopática (por ejemplo, evitar inotropos
positivos), cardiomiopatía dilatada (por ejemplo, evitar inotropos
negativos), deficiencia antitripsina (por ejemplo, controlar de
cerca para determinar complicaciones pulmonarias), hemocromatosis
(por ejemplo, evitar transfusiones), atrofia óptica de Leber (por
ejemplo, evitar nitroprussiato de sodio), rasgo depranocítico y
talasemia (por ejemplo, controlar de cerca para anemia) se incluyen
en el perfil genómico perioperatorio. En algunas realizaciones, se
incluyen marcadores para enfermedades coexistentes que pueden
afectar una respuesta de individuo a una cierta anestesia (por
ejemplo, clase de parálisis periódica [afecta a la decisión de
evitar o administrar potasio] o tipo de porfiria [afecta a la
decisión de evitar o administrar tiopental de sodio]).
En algunas realizaciones preferidas, el perfil
genómico perioperatorio incluye además marcadores específicos para
la selección de un procedimiento quirúrgico dado. Por ejemplo, se
someten a prueba sujetos que experimentan a derivación
cardiopulmonar para alelos de apolipoproteína E. Si se encuentra que
un paciente tiene el alelo E-\beta4 (indicativo
de un riesgo aumentado de descenso posoperatorio en la función
cognitiva), puede implementarse un procedimiento diferente de
derivación (por ejemplo, cirugía con corazón latiendo, minimamente
invasiva e injerto de derivación de arteria coronaria sin bomba
usando minitoracotomía o miniesternotomía y estabilizador de tipo
placa de presión).
Además, en algunas otras realizaciones, también
se incluyen pruebas para marcadores que implican además variables
quirúrgicas generales incluyendo, pero sin limitarse a factores de
cura de heridas, citocinas y predisposición a toxicidad de
antibiótico. En algunas realizaciones, se incluyen marcadores para
variables genómicas generales, incluyendo pero sin limitarse a
serotipo sanguíneo (véase por ejemplo, Yamamoto et al.,
Nature, 345:229 para marcadores específicos) y predisposición a
alergia (por ejemplo, a antibióticos o látex). En algunas
realizaciones, se incluyen marcadores que afectan al ciclo de
intervención de emergencia (por ejemplo, falta de respuesta a
broncodilatadores \beta-adrenérgicos o serotipo
sanguíneo) en el perfil genómico perioperatorio. En algunas
realizaciones, se incluyen marcadores para infecciones patogénicas
que puede afectar la respuesta a la cirugía (por ejemplo, virus de
Hepatitis B y virus de Hepatitis C).
Todavía en otras realizaciones, se incluyen
marcadores predictivos de posibles complicaciones durante la
recuperación de la cirugía, incluyendo, pero sin limitarse a,
marcadores para una predisposición a septicemia (por ejemplo, alelo
TNF). El alelo TNF2 de TNF\alpha está asociado a una gravedad
aumentada de septicemia. Si se encuentra que un sujeto tiene el
alelo TNF2, puede aumentarse el control de cuidado intensivo tras la
cirugía, disminuyendo la posibilidad de muerte por septicemia.
Además, el médico puede usar la presencia del alelo TNF2 como un
factor en la elección de un tratamiento no quirúrgico con un riesgo
menor de septicemia. En algunas realizaciones, se incluyen
marcadores para patógenos conocidos por ser responsables de provocar
infecciones sépticas (por ejemplo, ADN bacteriano presente en el
torrente sanguíneo) en el perfil genómico perioperatorio. Un experto
en la técnica relevante entiende que pueden incluirse marcadores
adicionales de utilidad para tratamiento perioperatorio en los
perfiles genómicos perioperatorios mencionados anteriormente.
\newpage
Una vez que se han determinado los SNP y las
mutaciones particulares para un panel genómico perioperatorio dado,
se genera un perfil. Se generan perfiles genómicos a través de la
detección de los SNP y las mutaciones en una muestra de ADN (por
ejemplo, una muestra de tejido o muestra de información genética) de
un sujeto. Los ensayos para detecciones de polimorfismos o
mutaciones entran en varias categorías, incluyendo, pero sin
limitarse a ensayos de secuenciación directa, ensayos de
polimorfismo de fragmento, ensayos de hibridación y análisis de
datos basados en ordenador. Están disponibles protocolos y kits
comercialmente disponibles o servicios para realizar variaciones
múltiples de estos ensayos. En algunas realizaciones, se realizan
los ensayos en combinación o en híbrido (por ejemplo, se combinan
reactivos diferentes o tecnologías de varios ensayos para dar un
ensayo).
En algunas realizaciones de la presente
invención, se generan los perfiles genómicos usando una técnica de
secuenciación directa. En estos ensayos, en primer lugar se aíslan
muestras de ADN de un sujeto usando cualquier procedimiento
adecuado. En algunas realizaciones, se clona la región de interés en
un vector adecuado y se amplifica mediante crecimiento en una
célula huésped (por ejemplo, una bacteria). En otras realizaciones,
se amplifica el ADN en la región de interés usando PCR.
Siguiendo la amplificación, se secuencia el ADN
en la región de interés (por ejemplo, la región que contiene el SNP
o la mutación de interés) usando cualquier procedimiento adecuado,
incluyendo pero sin limitarse a secuenciación manual usando
nucleótidos de marcador radiactivo o secuenciación automática. Se
presentan los resultados de la secuenciación usando cualquier
procedimiento adecuado. Se examina la secuencia y se determina la
presencia o ausencia de un SNP o una mutación dada.
En algunas realizaciones de la presente
invención, se generan los perfiles genómicos usando un ensayo de
polimorfismo de longitud de fragmento. En un ensayo de polimorfismo
de longitud de fragmento, se genera un patrón de bandas de ADN
único basándose en romper el ADN en una serie de posiciones usando
una enzima (por ejemplo, una enzima de restricción o una enzima
CLEAVASE I [Third Wave Technologies, Madison, WI]). Los fragmentos
de ADN de una muestra que contiene un SNP o una mutación tendrán un
patrón de bandas diferente que un tipo natural.
En algunas realizaciones de la presente
invención, se genera un perfil genómico usando un ensayo
polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP). En
primer lugar se aísla la región de interés usando PCR. Luego se
rompen los productos de PCR con enzimas de restricción conocidas
dando un fragmento de longitud única para un dado polimorfismo. Se
separan los productos de PCR digeridos con enzima de restricción
mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizan mediante
tinción con bromuro de etidio. La longitud de los fragmentos se
compara a marcadores de peso molecular y fragmentos generados a
partir de controles natural y mutante.
En otras realizaciones, se genera un perfil
genómico usando un ensayo de polimorfismo de longitud de fragmento
de CLEAVASE (CFLP; Third Wave Technologies, Madison, WI; véase por
ejemplo, las patentes estadounidenses número 5.843.654; 5.843.669;
5.719.208; y 5.888.780; cada una de las cuales se incorpora en el
presente documento como referencia). Este ensayo se basa en la
observación que cuando hebras únicas de ADN se doblan en sí mismas,
asumen estructuras de orden superior que son altamente individuales
a la secuencia precisa de la molécula de ADN. Estas estructuras
secundarias implican regiones parcialmente duplexadas de ADN de
manera que regiones monocatenarias están yuxtapuestas con
horquillas de ADN bicatenario. La enzima CLEAVASE I, es una nucleasa
de estructura específica, termoestable que reconoce y rompe las
uniones entre estas regiones monocatenarias y bicatenarias.
En primer lugar se aísla la región de interés,
por ejemplo, usando PCR. Luego, se separan las hebras de ADN
mediante calentamiento. A continuación, se enfrían las reacciones
para permitir formar la estructura intrahebra secundaria. Luego se
tratan los productos de PCR con la enzima CLEAVASE I para generar
una serie de fragmentos que son únicos para un SNP o una mutación
dada. Se separan los productos de PCR tratados con enzima CLEAVASE
y se detectan (por ejemplo, mediante electroforesis en gel de
agarosa) y se visualizan (por ejemplo, mediante tinción con bromuro
de etidio). Se compara la longitud de los fragmentos con los
marcadores de peso molecular y fragmentos generados a partir de
controles de tipo natural y mutante.
En realizaciones preferidas de la presente
invención, se generan los perfiles genómicos usando un ensayo de
hibridación. En un ensayo de hibridación, se determina la presencia
o ausencia de un SNP o una mutación dada basándose en la capacidad
del ADN de la muestra de hibridar a una molécula de ADN
complementaria (por ejemplo, una sonda de oligonucleótido). Está
disponible una variedad de ensayos de hibridación usando una
variedad de tecnologías para hibridación y detección. A
continuación se proporciona una descripción de una selección de
ensayos.
En algunas realizaciones, se detecta una
hibridación de una sonda a la secuencia de interés (por ejemplo, un
SNP o una mutación) directamente visualizando una sonda unida (por
ejemplo, un ensayo de tipo Northern o de tipo Southern; véase por
ejemplo, Ausabel et al. (eds.), Actual Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, NY [1991]). En estos ensayos, se
aísla ADN (Southern) o ARN (Northern) genómico de un sujeto. Luego
se rompe el ADN o ARN con una serie de enzimas de restricción que
rompen de manera poco frecuente en el genoma y no cerca de
cualquiera de los marcadores que van a someterse a ensayo. Luego se
separa el ADN o ARN (por ejemplo, sobre un gel de agarosa) y se
transfiere a una membrana. Se permite que una sonda o sondas
marcada(s) (por ejemplo, incorporando un radionucleótido)
específica(s) para el SNP o la mutación que va a detectarse
se ponga(n) en contacto con la membrana en una condición o
condiciones de rigurosidad baja, media o alta. Se elimina la sonda
no unida y se detecta la presencia de unión visualizando la sonda
marcada.
En algunas realizaciones de la presente
invención, se generan los perfiles genómicos usando un ensayo de
hibridación de chip de ADN. En este ensayo, se fija una serie de
sondas de oligonucleótido a un soporte sólido. Se diseñan las
sondas de oligonucleótido para ser únicas para un SNP o una mutación
dada. Se pone en contacto la muestra de ADN de interés con el
"chip" de ADN y se detecta la hibridación.
En algunas realizaciones, el ensayo de chip de
ADN es un ensayo GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA; véanse por
ejemplo, las patentes estadounidenses número 6.045.996; 5.925.525 y
5.858.659; cada una de las cuales se incorpora en el presente
documento como referencia). La tecnología GeneChip usa series de
alta densidad miniaturizadas de sondas de oligonucleótido fijadas a
un "chip". Las series de sonda se fabrican mediante
procedimiento de síntesis química dirigida por luz de Affymetrix,
que combina síntesis química de fase sólida con técnicas de
fabricación fotolitográficas empleadas en la industria de
semiconductores. Usando una serie de máscaras fotolitográficas para
definir los sitios de exposición del chip, seguido por etapas de
síntesis química específica, el procedimiento construye series de
alta densidad de oligonucleótidos, con cada sonda en una posición
predefinida en la serie. Se sintetizan series de sondas múltiples
simultáneamente en una oblea de vidrio grande. Luego se cortan en
cubos las obleas y se envasan las series de sonda individuales en
cartuchos plásticos moldeados por inyección, que los protege del
entorno y sirven como cámaras para hibridación.
Se aísla el ácido nucleico que va a analizarse,
se amplifica mediante PCR y se marca con un grupo indicador
fluorescente. Luego se incuba el ADN marcado con la serie usando una
estación fluídica. Luego se inserta la serie en el escáner, en el
que se detectan patrones de hibridación. Se recogen los datos de
hibridación como luz emitida a partir de los grupos indicadores
fluorescentes ya incorporados en la diana, que se une a la serie de
sonda. Sondas que se ajustan perfectamente a la diana normalmente
producen señales más fuertes que aquellos que no se ajustan. Dado
que se conocen la secuencia y posición de cada sonda en la serie,
por complementariedad, puede determinarse la identidad del ácido
nucleico diana aplicado a la serie de sonda.
En otras realizaciones, se utiliza un microchip
de ADN que contiene sondas capturadas electrónicamente (Nanogen,
San Diego, CA) (véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses
número 6.017.696; 6.068.818; y 6.051.380; cada una de las cuales se
incorpora en el presente documento como referencia). A través del
uso de microelectrónicos, la tecnología de Nanogen posibilita el
movimiento activo y la concentración de moléculas cargadas a y a
partir de sitios de prueba designados en su microchip
semiconductor. Se colocan electrónicamente sondas de captura ADN
únicas para un SNP o una mutación dada en, o "dirigido" a,
sitios específicos en el microchip. Dado que el ADN tiene una carga
negativa fuerte, puede moverse electrónicamente hasta un área de
carga positiva.
En primer lugar, se activa electrónicamente un
sitio de prueba o una fila de sitios de prueba en el microchip con
una carga positiva. A continuación, se introduce una disolución que
contiene las sondas de ADN en el microchip. Las sondas cargadas
negativamente se mueven rápidamente hasta los sitios cargados
positivamente, en los que se concentran y se unen químicamente a un
sitio en el microchip. Luego se lava el microchip y se añade otra
disolución de sondas de ADN distintas hasta que se complete la serie
de sondas de ADN específicamente unida.
Luego se analiza una muestra de prueba para
determinar la presencia de moléculas de ADN diana determinando cual
de las sondas de captura de ADN hibrida, con ADN complementario en
la muestra de prueba (por ejemplo, un gen de interés amplificado
mediante PCR). También se usa una carga electrónica para mover y
concentrar moléculas diana hasta uno o más sitios de prueba en el
microchip. La concentración electrónica del ADN de muestra en cada
sitio de prueba promueve la rápida hibridación del ADN de muestra
con sondas de captura complementarias (la hibridación puede
producirse en minutos). Para eliminar cualquier ADN no unido o unido
de forma inespecífica de cada sitio, se revierte la polaridad o
carga del sitio a negativa, forzando de este modo cualquier ADN no
unido o unido de forma inespecífica de vuelta a la disolución de las
sondas de captura. Se usa un escáner de fluorescencia basado en
láser para detectar unión.
Todavía en realizaciones adicionales, se utiliza
una tecnología de serie basada en la segregación de fluido en una
superficie plana (chip) mediante diferencias en la tensión
superficial (ProtoGene, Palo Alto, CA) (véanse por ejemplo, las
patentes estadounidenses número 6.001.311; 5.985.551 y 5.474.796;
cada una de las cuales se incorpora en el presente documento como
referencia). La tecnología de Protogene se basa en el hecho de que
pueden segregarse fluidos en una superficie plana mediante
diferencias en la tensión superficial que se han conferido mediante
recubrimientos químicos. Una vez segregadas de este modo, se
sintetizan sondas de oligonucleótido directamente en el chip
mediante impresión por inyección de tinta de reactivos. La serie con
sus sitios de reacción definidos por tensión superficial se monta
en un fase de traducción X/Y en un conjunto de cuatro agujas
piezoeléctricas, una para cada una de las cuatro bases de ADN
patrón. La fase de traducción se mueve a lo largo de cada una de
las filas de la serie y se administra el reactivo apropiado para
cada uno de los sitios de reacción. Por ejemplo, se administra la A
amidita sólo a los sitios en los que amidita A va a acoplarse
durante aquellas etapa de síntesis y etcétera. Se administran
reactivos comunes y lavados inundando toda la superficie y luego
eliminándolos mediante centrifugación.
Se fijan las sondas de ADN únicas para el SNP o
la mutación de interés al chip usando tecnología Protogene. Luego
se pone en contacto el chip con los genes de interés amplificados
mediante PCR. Tras la hibridación, se elimina el ADN no unido y se
detecta la hibridación usando cualquier procedimiento adecuado (por
ejemplo, mediante eliminación de la extinción de la fluorescencia
de un grupo fluorescente incorporado).
Aún en otras realizaciones, se usa una "serie
de perla" para la generación de perfiles genómicos (Illumina,
San Diego, CA; véanse por ejemplo, las publicaciones PCT WO 99/67641
y WO 00/39587, cada una de las cuales se incorpora en el presente
documento como referencia). Illumina usa una tecnología serie de
perla que combina haces de fibra óptica y perlas que se
autoensamblan en una serie. Cada haz de fibra óptica contiene de
miles a millones de fibras individuales dependiendo del diámetro
del haz. Se recubren las perlas con un oligonucleótido específico
para la detección de un SNP o una mutación dada. Se combinan lotes
de perlas para formar una reserva específica para la serie. Para
realizar un ensayo, se pone en contacto la serie de perla con una
muestra de sujeto preparada (por ejemplo, ADN). Se detecta la
hibridación usando cualquier procedimiento adecuado.
En algunas realizaciones de la presente
invención, se generan los perfiles genómicos usando un ensayo que
detecta hibridación mediante rotura enzimática de estructuras
específicas (ensayo INVADER, Third Wave Technologies; véanse por
ejemplo, las patentes estadounidenses número 5.846.717; 6.001.567;
5.985.557; y 5.994.069; cada una de las cuales se incorpora en el
presente documento como referencia). El ensayo INVADER detecta
secuencias de ADN y ARN específicas usando enzimas específicas para
estructura para romper un complejo formado mediante la hibridación
de sondas de oligonucleótido que solapan. Una temperatura elevada y
un exceso de una de las sondas posibilitan que se rompan sondas
múltiples para cada secuencia diana presente sin ciclación de
temperatura. Luego estas sondas rotas se rompen de una segunda
sonda marcada. El oligonucleótido de sonda secundaria puede
marcarse en el extremo 5' con fluoresceína que se extingue mediante
un colorante interno. En la rotura, el producto marcado con
fluoresceína con extinción eliminada puede detectarse usando un
lector de placa de fluorescencia habitual.
El ensayo INVADER detecta mutaciones y SNP
específicos en ADN genómico no amplificado. Se pone en contacto la
muestra de ADN aislado con la primera sonda específica para un
SNP/mutación o bien secuencia de tipo natural y se permite
hibridar. Luego se hibrida una sonda secundaria, específica para la
primera sonda, y que contiene el marcador de fluoresceína, y se
añade la enzima. Se detecta la unión usando un lector de placas de
fluorescencia y comparando la señal de la muestra de prueba con
controles positivo y negativo.
En algunas realizaciones, la hibridación de una
sonda unida se detecta usando un ensayo TaqMan (PE Biosystems,
Foster City, CA; véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses
número 5.962.233 y 5.538.848, cada una de las cuales se incorpora
al presente documento por referencia). Se realiza el ensayo durante
una reacción de PCR. El ensayo TaqMan se aprovecha de la actividad
5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa AMPLITAQ
GOLD. Una sonda, específica para un alelo o mutación dado, se
incluye en la reacción de PCR. La sonda consiste en un
oligonucleótido con un colorante indicador en 5' (por ejemplo, un
colorante fluorescente) y un colorante extintor en 3'. Durante la
PCR, si la sonda se une a su diana, la actividad nucleolítica
5'-3' de la polimerasa AMPLITAQ GOLD rompe la sonda
entre el colorante indicador y extintor. La separación del colorante
indicador del colorante extintor da como resultado un aumento de la
fluorescencia. La señal se acumula con cada ciclo de PCR y puede
controlarse con un fluorímetro.
Todavía en otras realizaciones, se generan
perfiles genómicos usando el ensayo de extensión de cebadores
SNP-IT (Orchid Biosciences, Princeton, NJ; véanse
por ejemplo, las patentes estadounidenses número 5.952.174 y
5.919.626, cada una de las cuales se incorpora al presente
documento por referencia). En este ensayo, se identifican los SNP
usando un cebador de ADN especialmente sintetizado y una ADN
polimerasa para extender selectivamente la cadena ADN en una base
en la ubicación de SNP sospechado. Se amplifica el ADN en la región
de interés y se desnaturaliza. Luego se realizan las reacciones de
la polimerasa usando sistemas miniaturizados denominados
microfluídicos. Se logra la detección añadiendo un marcador al
nucleótido sospechoso de estar en la ubicación del SNP o mutación.
Puede detectarse la incorporación del marcador en el ADN mediante
cualquier procedimiento adecuado (por ejemplo, si el nucleótido
contiene un marcador de biotina, la detección es mediante un
anticuerpo marcado de manera fluorescente específico para
biotina).
En algunas realizaciones, se usa un sistema
MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA.) para generar un perfil genómico
(véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses número 6.043.031;
5.777.324; y 5.605.798; cada una de las cuales se incorpora al
presente documento por referencia). Se aísla ADN de muestras de
sangre usando procedimientos habituales. A continuación, se
amplifican regiones de ADN específicas que contienen la mutación o
SNP de interés, de aproximadamente 200 pares de bases de longitud,
mediante PCR. Luego se unen los fragmentos amplificados por una
hebra a una superficie sólida y se eliminan las hebras no
inmovilizadas mediante desnaturalización y lavado habituales. La
hebra individual inmovilizada restante luego sirve como molde para
reacciones enzimáticas automáticas que producen productos de
diagnóstico específicos del genotipo.
Luego se transfieren cantidades muy pequeñas de
los productos enzimáticos, normalmente de cinco a diez nanolitros,
a una serie SpectroCHIP para análisis automático posterior con el
espectrómetro de masas SpectroREADER. Se carga previamente cada
mancha con cristales absorbentes de luz que forman una matriz con el
producto de diagnóstico dispensado. El sistema MassARRAY usa
espectrometría de masa MALDI-TOF (Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization - Time of Flight -
desorción/ionización mediante láser asistida por matriz - tiempo de
vuelo). En un procedimiento conocido como desorción, se golpea la
matriz con un pulso de un haz de láser. Se transfiere la energía
del haz de láser a la matriz y se vaporiza dando como resultado una
pequeña cantidad de producto de diagnóstico que va a expelerse en
un tubo de vuelo. Como el producto de diagnóstico se carga cuando se
aplica posteriormente un pulso de campo eléctrico al tubo, se
lanzan hacia abajo del tubo de vuelo hacia un detector. El tiempo
entre la aplicación del pulso de campo eléctrico y la colisión del
producto de diagnóstico con el detector se denomina como el tiempo
de vuelo. Esto es una medida muy precisa del peso molecular del
producto, dado que la masa de una molécula se correlaciona
directamente con el tiempo de vuelo con las moléculas más pequeñas
volando más rápido que las moléculas más grandes. Todo el ensayo se
completa en menos de una milésima de segundo, posibilitando que se
analicen las muestras en un total de 3-5 segundos
incluyendo la recogida repetitiva de datos. El programa
SpectroTYPER luego calcula, registra, compara e informa sobre los
genotipos a una tasa de tres segundos por muestra.
En algunas realizaciones de la presente
invención, se generan perfiles genómicos perioperatorios usando
análisis de datos basados en ordenador de una muestra de
información genética (por ejemplo, información de secuencia de
ácido nucleico almacenada). Se recoge una muestra de un sujeto en
cualquier momento (por ejemplo, en el nacimiento), se genera
información de secuencia (por ejemplo, a través de secuenciación de
ADN), y se almacena la información (por ejemplo, como información
digital en un chip portátil). Durante el periodo perioperatorio, se
explora la información de secuencia del sujeto mediante un programa
informático para los marcadores preseleccionados. Se genera un
informe (por ejemplo, un perfil genómico perioperatorio).
En algunas realizaciones preferidas de la
presente invención, la información generada mediante determinación
del perfil genómico perioperatorio se distribuye en un modo
coordenado y automático. En la figura 1, se muestra un diagrama que
representa esquemáticamente el flujo de información en algunas
realizaciones de la presente invención. La figura 1 muestra que
ciertos criterios pueden considerarse al decidir si, y cómo, generar
un perfil genómico perioperatorio. Específicamente, se hace una
determinación de si un sujeto programado para cirugía es un
candidato para la determinación del perfil genómico (por ejemplo, se
someterá a procedimientos que podrían alterarse dependiendo del
contenido en información de un perfil genómico). También se evalúa
la validez analítica. En particular, el procedimiento usado para
generar el perfil genómico se selecciona basándose en su capacidad
para proporcionar información útil para una aplicación particular y
su practicidad (por ejemplo, seguridad para el técnico operario,
rentabilidad, eficacia). Por último, la validez del ensayo de
determinación del perfil particular se evalúa por su utilidad
clínica (por ejemplo, la capacidad de proporcionar una predicción
de un fenotipo relacionado a un genotipo). Una vez que se
seleccionan un sujeto candidato, técnicas de ensayo y ensayo
adecuados, se genera un perfil genómico sometiendo un espécimen
genómico (por ejemplo, muestra de tejido o información genética
determinada previamente) del sujeto a la técnica de ensayo usando
los marcadores genéticos particulares seleccionados. Por ejemplo,
un sujeto puede proporcionar una muestra (por ejemplo, sangre,
tejido o información genética) de manera perioperatoria (por
ejemplo, varias semanas antes de la cirugía en un consultorio
médico o en una sala de emergencia) y se usa la muestra para generar
un perfil genómico usando el ensayo apropiado. En algunas
realizaciones de la presente invención, se generan los datos, se
procesan y/o se gestionan usando sistemas de comunicaciones
electrónicos (por ejemplo, procedimientos basados en Internet).
En algunas realizaciones, se usa un programa de
análisis basado en ordenador para traducir los datos sin tratar
generados por el perfil genómico (por ejemplo, la presencia o
ausencia de un SNP o mutación dado) en datos de valor predictivo
para el médico (por ejemplo, probabilidad de respuesta farmacológica
anómala, presencia de enfermedad subyacente o diagnóstico
diferencial de enfermedad conocida). El médico (por ejemplo,
cirujano o anestesista) puede evaluar los datos predictivos usando
cualquier medio adecuado. Por tanto, en algunas realizaciones
preferidas, la presente invención proporciona el beneficio adicional
que el médico, que probablemente no está formado en genética o
biología molecular, no necesita entender los datos sin tratar del
perfil genómico. Se presentan los datos directamente al médico en
su forma más útil. Luego el médico es capaz de utilizar
inmediatamente la información con el fin de optimizar el cuidado
perioperatorio del sujeto.
La presente invención contempla cualquier
procedimiento que puede recibir, procesar y transmitir la
información hasta y desde el personal médico y el sujeto. La figura
2 ilustra la transformación de una muestra (por ejemplo, muestra de
tejido o información genética) en datos útiles para el médico,
sujeto o investigador. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la
presente invención, se obtiene una muestra de un sujeto y se envía a
un servicio de determinación del perfil genómico (por ejemplo,
laboratorio clínico en una instalación médica, empresa de
determinación del perfil genómico, etc.) para generar datos sin
tratar. Si la muestra comprende un tejido u otra muestra biológica,
el sujeto puede visitar un centro médico para que se obtenga la
muestra y enviársela al centro de determinación del perfil
genómico, o los sujetos pueden recoger la muestra ellos mismos y
enviarla directamente a un centro de determinación del perfil
genómico. Si la muestra comprende información genética determinada
previamente (por ejemplo, información de secuencia, información de
SNP o mutación, etc.), puede enviarse la información directamente
al servicio de determinación del perfil genómico por el sujeto (por
ejemplo, puede explorarse una tarjeta de información que contiene
la información genética mediante un ordenador y transmitirse los
datos hasta un ordenador del centro de determinación del perfil
genómico usando sistemas de comunicación electrónicos). Una vez
que se recibe por el servicio de determinación del perfil genómico,
se procesa la muestra y se produce un perfil genómico (es decir,
datos genómicos), específico para el procedimiento médico o
quirúrgico a que se someterá el sujeto.
Luego se preparan los datos del perfil genómico
en un formato adecuado para interpretación por un médico
responsable. Por ejemplo, en lugar de proporcionar datos de
secuencia sin tratar, el formato preparado puede representar una
evaluación de riesgo para diversas opciones de tratamiento que el
médico pude usar o como recomendaciones para opciones de
tratamiento particulares. Pueden mostrarse los datos al médico
mediante cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, en algunas
realizaciones, el servicio de determinación del perfil genómico
genera un informe que puede imprimirse para el médico (por ejemplo,
en el punto de cuidado) o mostrarse al médico en un monitor de
ordenador.
Una realización ejemplar de un sistema de este
tipo encuentra uso en condiciones cirugía de emergencia. Por
ejemplo, puede tomarse una muestra de un sujeto inmediatamente en el
primer contacto del personal médico con el sujeto en necesidad de
tratamiento emergencia (por ejemplo, tomado por un equipo de
respuesta de emergencia en el sitio de un accidente). Puede
procesarse la muestra usando la técnica de detección apropiada en un
vehículo de respuesta de emergencia mientras que se transporta el
sujeto hasta una sala de emergencia de un centro médico. Los datos
generados por el ensayo pueden convertirse en un perfil genómico en
un sistema informático del vehículo de emergencia o pueden
transmitirse al sistema informático remoto para su procesamiento.
Una vez que se genera el perfil genómico, se envía un informe al
médico responsable de manera que puede realizarse la preparación
pre-quirúrgica (por ejemplo, selección de fármacos
apropiados) antes de la llegada del sujeto a la sala de emergencia
o de manera que pueden cambiarse los procedimientos durante la
cirugía si la información llega después de empezar el
tratamiento.
En algunas realizaciones, en primer lugar se
analiza la información genómica (por ejemplo, muestra de tejido o
información genética) en el punto de cuidado o en la instalación
regional. Luego se envían los datos sin tratar a una instalación de
procesamiento central para análisis adicional en los datos genómicos
y datos médico o del paciente. La instalación de procesamiento
central proporciona la ventaja de privacidad (se almacenan todos
los datos genómicos en una instalación central con protocolos de
seguridad uniformes), velocidad y uniformidad de análisis de datos.
La instalación de procesamiento central entonces puede controlar el
destino de los datos tras la cirugía. Por ejemplo, usando un
sistema de comunicación electrónico, la instalación central puede
proporcionar datos al médico, el sujeto o los investigadores.
Tras el procedimiento quirúrgico o médico, la
muestra del sujeto y los datos generados mediante el perfil
genómico puede seguir una de varias rutas. El sujeto dirige el
destino de la muestra y los datos genómicos, al que se le da un
menú de elecciones (por ejemplo, electrónicamente). La muestra puede
destruirse, archivarse o donarse para su uso en investigación. Los
datos genómicos pueden destruirse sin que otra persona distinta del
médico los vea (o que el médico los vea de manera limitada). Tal
destrucción puede desearse para mantener la privacidad del sujeto.
En el caso de un sujeto humano, el sujeto puede solicitar acceso a
los datos para su uso futuro. En el caso de un sujeto no humano, la
persona encargada del cuidado del sujeto (por ejemplo, el dueño)
puede acceder a los datos para su uso futuro. En algunas
realizaciones, el sujeto puede acceder directamente a los datos
usando el sistema de comunicación electrónico. El sujeto puede
elegir intervención u orientación adicional basándose en los
resultados. En algunas realizaciones, los datos se usan para su uso
en investigación. Por ejemplo, los datos pueden usarse para
optimizar adicionalmente la inclusión o eliminación de marcadores en
el perfil genómico.
La presente invención proporciona un sistema
único para controlar y seguir la pista específicamente de resultados
empíricos. Por ejemplo, el éxito o el fracaso de opciones de
tratamiento particulares, seleccionadas usando los perfiles
genómicos de la presente invención, puede recopilarse en una base de
datos para determinar empíricamente sistemas más precisos para
generar y notificar perfiles. Tales datos pueden indicar que ciertos
marcadores usados en un ensayo son particularmente predictivos de
un resultado o que otros marcadores, considerados predictivos
previamente, tienen valor limitado. Usando este sistema de control y
seguimiento de la pista, los perfiles genómicos de la presente
invención evolucionan continuamente para mejorar los resultados. El
uso de tales sistemas por instalaciones médicas mejora las normas
asistenciales, mientras se crea más eficacia y predictibilidad en
la gestión de empresas médicas. Por tanto, la presente invención
proporciona un sistema coordinado, oportuno y rentable para
obtener, analizar y distribuir la información para salvar vidas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el
fin de demostrar e ilustrar adicionalmente determinadas
realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención y no
han de interpretarse como limitantes del alcance de la misma.
En la descripción experimental que sigue, se
aplican las siguientes abreviaturas: \muM (micromolar); mol
(moles); mmol (milimoles); \mumol (micromoles); nmol (nanomoles);
g (gramos); mg (miligramos); \mug (microgramos); ng (nanogramos);
1 o L (litros); ml (mililitros); \mul (microlitros); cm
(centímetros); mm (milímetros); \mum (micrómetros); nm
(nanometros); ºC (grados centígrados); U (unidades), mU
(miliunidades); min. (minutos); % (porcentaje); PEG
(polietilenglicol); kb (kilobase); pb (par de bases); PCR (reacción
en cadena de la polimerasa); Third Wave Technologies (Third Wave
Technologies, Madison, WI); Beckman (Beckman Coulter, Fullerton,
CA); Gentra Systems (Gentra Systems, Minneapolis, MN); MJ Research
(MJ Research, Watertown, MA); y NEB (New England Biolabs, Beverly,
MA).
Este ejemplo ilustra la generación de un perfil
para la exploración genómica perioperatoria para determinar la
respuesta de un paciente a la anestesia y medicaciones relacionadas.
Los adultos que dan el consentimiento, que se presentan para
realizar una cirugía ambulatoria, se someten a exploración para
determinar las variables presentadas en las tablas
1-4. La tabla 1 enumera los marcadores para
determinar la deficiencia en butirilcolinesterasa (mutaciones en el
gen de la butirilcolinesterasa (BChE)). La tabla 2 enumera los
marcadores indicativos del metabolismo lento de la debrisoquina. La
tabla 3 enumera los marcadores indicativos del aumento de riesgo de
formación de trombos. Las mutaciones están en el gen de la
metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR), el gen de la metionina
sintasa (MS), el gen de la cistationina
\beta-sintasa (CBS), el gen del factor 5 de
Leiden (F 5 Leiden) y el gen de la protrombina. La tabla 4 enumera
los marcadores indicativos de aumento de riesgo de hipertermia
maligna.
Los pacientes proporcionan una muestra de sangre
de 10 ml. Se extrae el ADN de leucocitos de la capa leucocítica de
sangre anticoagulada con citrato usando el kit de aislamiento Gentra
Systems Puregene según las instrucciones del fabricante. Se
cuantifican las muestras de ADN mediante espectroscopia UV usando un
espectrofotómetro Beckman DU06.
Se explora el ADN para determinar las mutaciones
y los polimorfismos descritos anteriormente usando un ensayo de
polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción por PCR (RFLP)
usando procedimientos habituales. Se amplifica el ADN en la región
de interés usando PCR. Las reacciones de PCR se realizan en un
termociclador MJ Research PTC-200. A continuación
se cortan los fragmentos con enzimas de restricción (NEB) que se
sabe que dan un fragmento de longitud única para un polimorfismo
dado. Se separan los productos de PCR digeridos mediante las
enzimas de restricción mediante electroforesis en gel de agarosa y
se visualizan mediante tinción con bromuro de etidio. Se compara la
longitud de los fragmentos con los marcadores de peso molecular
(NEB).
Además del análisis de RFLP, se analizan las
muestras de ADN usando un ensayo de endonucleasas flap
(INVADER, Third Wave Technologies; véase por ejemplo, Kwiatkowski
et al., Molecular Diagnóstico, 4:353 [1999]). Se realizan
las reacciones por separado para alelos mutantes y de tipo natural.
Cada reacción se realiza por triplicado. Para cada alelo, se
introducen alícuotas de 8 \mul de mezcla de reacción primaria (5
\mul de PEG al 16%, 2 \mul de MOPS 100 mM, y 1 \mul de
oligonucleótido específico primario 0,5 \muM) en microplacas de
reacción de 96 pocillos (MJ Research). También se realizaron
reacciones control, incluyendo muestras control de ADN
heterocigótico, mutante y de tipo natural y diana distinta de ADN
obtenidas a partir de controles genómicos conocidos amplificados
por PCR. Se incuban las muestras durante 5 min. a 95ºC en un
termociclador (MJ Research PTC-200). Entonces, se
reduce la temperatura hasta 63ºC y se añaden a cada pocillo 5 \mul
de la mezcla de reacción con sonda apropiada. Entonces se incuban
las muestras a 63ºC durante 120 min.
A continuación se realizan reacciones
secundarias usando reactivos comunes para ambos ensayos, mutantes y
de tipo natural. Se enfrían las reacciones incubadas hasta 56ºC y se
añaden 5 \mul de la mezcla de reacción secundaria (1 \mul de
H_{2}O, 0,5 \mul de MOPS 100 mM, 0,5 \mul de MgCl_{2} 75 mM,
1 \mul de 30 \mul de agente de detención, 1 \mul de ADN diana
secundario y 1 \mul de sonda FRET). Se incuban las reacciones a
56ºC durante 120 min. Se detienen las reacciones mediante la adición
de 175 \mul de EDTA 10 mM y se transfieren 180 \mul de cada
reacción a una placa de microtitulación que va a leerse en un lector
de placas de múltiples pocillos de fluorescencia CytoFluor Series
4000 con una longitud de onda de excitación de 485 nM y una longitud
de onda de emisión de 530 nM.
Se resuelven las disparidades entre los ensayos
de RFLP y endonucleasas flap mediante secuenciación directa
usando un secuenciador automático modelo 377 de ABI usando
terminadores de colorantes fluorescentes apropiados.
Los resultados del perfil genómico se usan para
tomar decisiones apropiadas acerca del cuidado del paciente,
incluyendo la elección de analgésicos y anestésicos, control
posquirúrgico y tratamientos y medicaciones adicionales.
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Claims (26)
1. Un procedimiento que comprende:
a) proporcionar:
- i)
- una muestra obtenida de un sujeto perioperatorio; y
- ii)
- un ensayo para detectar dos o más marcadores genéticos, en el que dichos marcadores comprenden una mutación en dos o más genes seleccionados del grupo constituido por HBB, APOE, TNFa, TNFb, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5, de sexo, de grupos sanguíneos ABO y Rh, LQT1, LQT3, KCNH2, KCNE1, SCNA5, KCNQ1, HMBS, ABRb2, PI, PLAT y PAI; y
b) someter dicha muestra a dicho ensayo para
generar un perfil genómico para su uso en la selección de
condiciones para la anestesia durante un procedimiento
quirúrgico.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicha anestesia es una anestesia general.
3. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicha anestesia es una anestesia regional.
4. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho procedimiento quirúrgico es cirugía no invasiva.
5. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho procedimiento quirúrgico es cirugía invasiva.
6. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho perfil genómico comprende información que está
relacionada con el riesgo farmacodinámico.
7. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho perfil genómico comprende información que está
relacionada con el riesgo farmacocinético.
8. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho perfil genómico comprende un diagnóstico
presintomático.
9. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicho perfil genómico comprende información que está
relacionada con el diagnóstico diferencial de enfermedad
coexistente.
10. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dichas condiciones para dicho procedimiento es la elección
del anestésico.
11. Un procedimiento que comprende:
a) proporcionar una muestra obtenida de un
sujeto perioperatorio;
b) enviar dicha muestra a un laboratorio
clínico;
c) aislar ADN a partir de dicha muestra en dicho
laboratorio clínico;
d) someter dicho ADN a un ensayo en dicho
laboratorio clínico para detectar dos o más marcadores genéticos de
ácido nucleico que comprenden una mutación en dos o más genes
asociados a dos o más condiciones perioperatorias seleccionados del
grupo constituido por HBB, APOE, TNFa, TNFb, CYP2C9, CYP2C19,
CYP3A4, CYP3A5, de sexo, de grupos sanguíneos ABO y Rh, LQT1, LQT3,
KCNH2, KCNE1, SCNA5, KCNQ1, HMBS, ABRb2, PI, PLAT y PAI para generar
un perfil genómico;
e) distribuir los resultados de dicho perfil
genómico de dicho sujeto perioperatorio según la preferencia de
dicho sujeto perioperatorio; y
f) distribuir dicha muestra de dicho sujeto
perioperatorio según la preferencia de dicho sujeto
perioperatorio.
12. El procedimiento según la reivindicación 11,
que comprende además obtener el consentimiento de dicho sujeto
perioperatorio para obtener y someter dicha muestra a dicho ensayo
para determinar dichos marcadores genéticos.
13. El procedimiento según la reivindicación 11,
que comprende además proporcionar un programa informático que
comprende las instrucciones que dirigen un procesador para analizar
dichos resultados de dicho perfil genómico.
14. El procedimiento según la reivindicación 13,
en el que dichas instrucciones generan un informe para la
presentación visual.
15. El procedimiento según la reivindicación 14,
en el que dicha presentación visual está en forma de un informe que
puede imprimirse.
16. El procedimiento según la reivindicación 14,
en el que dicha presentación visual está en forma de un informe en
un monitor de ordenador.
17. El procedimiento según la reivindicación 13,
en el que dichas instrucciones son suficientes para recibir,
procesar y transmitir dichos resultados de dicho perfil genómico a y
desde dicho sujeto perioperatorio y dicho laboratorio.
18. El procedimiento según la reivindicación 17,
en el que dicha transmisión de dichos resultados usa un sistema de
comunicación electrónico.
19. El procedimiento según la reivindicación 18,
en el que dicho sistema de comunicación electrónico transmite dichos
resultados a un sistema de ordenadores remoto para su
procesamiento.
20. El procedimiento según la reivindicación 11,
en el que dicha distribución de dichos resultados de dicho perfil
genómico de dicho sujeto perioperatorio está organizada mediante un
sistema electrónico integrado.
21. El procedimiento según la reivindicación 11,
que comprende además la etapa de seleccionar dichos marcadores
genéticos del grupo constituido por marcadores genéticos de riesgo
farmacogenético, marcadores genéticos de afecciones sintomáticas
coexistentes, marcadores genéticos de afecciones no sintomáticas
coexistentes, marcadores genéticos de resultados de un procedimiento
quirúrgico, marcadores genéticos de un sujeto perioperatorio en un
grupo específico, marcadores genéticos que predicen resultados
posoperatorios y marcadores genéticos constituidos por
identificadores genómicos únicos.
22. El procedimiento según la reivindicación 11,
que comprende además la etapa de seleccionar dichos marcadores
genéticos mediante criterios que comprenden validez analítica,
validez clínica y utilidad clínica.
23. El procedimiento según la reivindicación 11,
que comprende además la etapa de codificar dichos resultados de
dicho perfil genómico.
24. El procedimiento según la reivindicación 11,
que comprende además la etapa de descodificar dichos resultados de
dicho perfil genómico.
25. El procedimiento según la reivindicación 11,
en el que dichos dos o más marcadores genéticos de ácido nucleico
comprenden 5 o más mutaciones en dos o más genes.
26. El procedimiento según la reivindicación 11,
en el que dichos dos o más marcadores genéticos de ácido nucleico
comprenden 10 o más mutaciones en dos o más genes.
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