ES2390849T3

ES2390849T3 - Anticuerpos humanos que se unen a IL-12 humana y métodos de producción

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Publication number: ES2390849T3
Application number: ES09175437T
Authority: ES
Inventors: Jochen Salfeld; Michael Roguska; Michael Paskind; Subhashis Banerjee; Daniel E. Tracey; Michael White; Zehra Kaymakcalan; Boris Labkovsky; Paul Sakorafas; Stuart Friedrich; Angela Myles; Geertruida M. Veldman; Amy Venturini; Nicholas W. Warne; Angela Widom; John G. Elvin; Alexander R. Duncan; Elaine J. Derbyshire; Sara Carmen; Stephen Smith
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1999-03-25
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2012-11-19
Anticipated expiration: 2020-03-24
Also published as: NZ596723A; LU92159I2; CA2365281C; IL145134A; PL409839A1; EP1175446A1; TWI280980B; CA2365281A1; NO2014024I1; CA2669512A1; KR20100021669A; KR20120091477A; BG106027A; AR094125A2; EP2319870A3; TR200603997T1; AR063780A2; CN101066997B; CY2013007I1; TWI365193B

Abstract

Un antic uerpo h umano ai slado, o un a p arte de u nión a antíge no d el mismo, que s e un e a IL-12 humana y s e disocia de IL-12 humana con una constante de velocidad koff de 1 x 10-4 s-1 o menos, como se determina por resonancia de plasmón superficial, en el que dicho anticuerpo inhibe la proliferación de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de proliferación de blastos por fitohemaglutinina in vitro (ensayo de PHA) con una CI50 de 1 x 10-9 M o menos.

Description

Anticuerpos humanos que se unen a IL-12 humana y metodos de produccion

Antecedentes de la invenci6n

La interleucina 12 humana (IL-12) se ha caracterizado recientemente como una citocina con una estructura unica y efectos pleiotropicos (Kobayashi, et al. (1989) J. Exp Med. 170: 827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci.

90: 10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp Med. 154: 116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Bioche m. Biophys. 294:230-237). IL-12 desempefa un papel critico en la patologia asociada con varias enfermedades que implican respuestas inmunes e inflamatorias. Puede encontrarse una revision de IL-12, sus actividades biologicas y su papel en enfermedad en Gately et al. (1998) Ann. Rev. Immunol. 16: 495-521. Estructuralmente, IL-12 es u na proteina heterodimerica que comprende una subunidad de 35 kDa (p35) y una subunidad de 40 kDa (p40) que se unen ambas entre si mediante un puente disulfuro (denominada la "subunidad p70"). La proteina heterodimerica se produce principalmente por ce lulas presentadoras de a ntigenos tales com o monocitos, macrofagos y celulas dendriticas. Estos tipos celulares tambien secretan un exceso de la subunidad p40 en relacion con subunidad p70. Las subunidades p40 y p35 no estan relacionadas geneticamente y no se ha indicado que ninguna posea actividad biologica, aunque el homodimero p40 puede actuar como un antagonista de IL-12. Funcionalmente, IL-12 desempefa un papel central en la regulacion del equilibrio entre linfocitos T auxiliares de tipo 1 (Th1) y tipo 2 (Th2) especificos de antigeno. Las celulas Th1 y Th2 gobiernan el inicio y progreso de trastornos autoinmunes, e IL-12 es critica en la regulacion de diferenciacion y maduracion de linfocitos Th1. Las citocinas liberadas por las celulas Th1 son inflamatorias e incluyen interferon y (IFNy), IL-2 y linfotoxina (LT). Las celulas Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 para facilitar inmunidad humoral, reacciones alergicas e inmunosupresion. De forma coherente con la preponderancia de respuestas Th1 en enfermedades autoinmunes y las actividades proinflamatorias de IF Ny, IL-12 p uede desempefar un papel principal en l a patologia asociada con muchas enfermedades autoinmunes e inflamator ias tales com o artritis reumatoide (RA), esclerosis m ultiple (MS) y enfermedad de Crohn. Los pacientes humanos con MS han demostrado un aumento de la expresion de IL-12 como se documenta por los niveles de ARNm de p40 en placas de MS agudas. (Windhagen et al ., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996). Ademas, la estimulacion ex vivo de celulas presentadoras de antigenos con linfocitos T que expresaban CD40L de pacientes con MS dio como resultado aumento de la produccion de IL-12 en comparacion con linfocitos T de control, coherente con la observacion de que las interacciones CD40/CD40L son inductores potentes de IL-12. Se han detectado niveles elevados de p70 de IL-12 en los sinovios de pacientes con RA en comparacion con controles sanos (Morita et a l (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314). El perfil de expresion de acido ribonucleico mensajero (ARNm) de citocinas en los sinov ios de RA identifico citocinas predominantemente Th1. (Buchtet al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 1 03: 347-367). IL-12 tambien parece desempefar un papel critico en la patologia asociada con enfermedad de Crohn (CD). Se ha observado expresion aumentada de IFNy e IL-12 en la mucosa intestinal de pacientes con esta enfermedad (Fais et al. (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Parronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150: 823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology. 112: 1169-1178, y Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152: 667-672). El perfil de secrecion de citocinas de linfocitos T de la lamina propia de pacientes con CD es caracteristico de una respuesta predominantemente de Th1, incluyendo niveles de IFNy muy elevados (Fuss, et al., (1996) J. Immunol. 157: 1261-1270). Ademas, las secciones tisulares de colon de pacientes con CD muestran una abundancia de macrofagos q ue expresan IL-12 y linfocitos T que expresan IFNy (Parronchi et al (1997) Am. J. Path. 150: 823-832). Debido al papel de IL-12 humana en una diversidad de trastornos humanos, se han disefado estrategias terapeuticas para inhibir o contrarrestar la actividad de IL-12. En particular, se han buscado anticuerpos que se unan a, y neutralicen, IL-12 como un medio para inhibir la actividad de IL12. Algunos de los anticuerpos mas tempranos eran anticuerpos monoclonales murinos (mAb) secretados por hibridomas preparados a p artir de linfocitos de ratones inmunizados con IL-12 (vease por ejemplo, Publicacion de Solicitud de Patente Mundial N° WO 97/15327 de Strober et al.; Neurath et al. (1995) J. Exp. Med. 182: 1281-1290; Duchmann et al. (1996) J. Immunol. 26: 934-938). Estos anticuerpos de IL-12 murinos se limitaron con respecto a su uso in vivo debido a problemas asociados con la administracion de anticuerpos de raton a seres humanos, tales como semivida en suero corta, una incapacidad para desencadenar ciertas funciones efectoras humanas e induccion de una respuesta inmune no deseada contra el anticuerpo de raton en un ser humano (la reaccion de "anticuerpo anti-raton humano" (HAMA)). En general, los intentos para superar los problemas asociados con uso de anticuerpos completamente murinos en seres humanos, han implicado modificar por ingenieria genetica los anticuerpos para que sean mas "de tipo humano". Por ejemplo, se han preparado anticuerpos quimericos, en los que las regiones variables de las cadenas

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de anticuerposon derivadas de raton y las regiones constantes de las cadenas de anticuerpo son derivadas de seres humanos (Junghans, et al. (1990) Cancer Res. 50: 1495-1502; Brown et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. 88: 2663-2667; K ettleborough et a l. (1 991) P rotein Eng ineering. 4: 77 3-783). Si n em bargo, debido a q ue estos anticuerpos quimericos y h umanizados a un co nservan algu nas s ecuencias mur inas, aun pueden in ducir un a reaccion inmune no deseada, la reaccion de anticuerpo anti quimerico humano (HACA), especialmente cuando se administran durante periodos prolongados.

Carter, et al . (1997) Hybridoma, vol. 16, n° 4, paginas 363-369 presentan un metodo para producir anticuerpos murinos p ara la s ubunidad p40 d e IL-1 2. La Pu blicacion N° W O 9 6/33735 descr ibe e l us o de l a tecn ologia XenoMouse para producir anticuerpos humanos para la citocina humana IL-8.

Un a gente inhibidor de IL-12 pr eferido para anticuerpos murin os o deriv ados de los mismos (por ej emplo, anticuerpos quimericos o humanizados) seria un anticuerpo anti IL-12 completamente humano, puesto que un agente tal no deberia inducir la reaccion HAMA, incluso si se usa durante periodos prolongados. Sin embargo, tales anticuerpos no se han descrito en la tecnica y, por lo tanto, aun se necesitan.

Sumario de la invenci6n

La presente invencion proporciona un anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, que se disocia de IL-12 humana con una tasa Koff constante de 1 x 10-4 s-1 o menos, e inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-9 M o menos. Mas pref eriblemente, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, se disocia de IL-12 humana con una tasa Koff constante de 1 x 10-5 s-1 o menos, e inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-10 M o menos. Aun mas preferiblemente, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, se disocia de IL-12 humana con una tasa Koff constante de 1 x 10-5 s-1 o menos, e inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-11 M o menos.

En una realizacion, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene las siguientes caracteristicas:

a) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 9; y

b) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 10.

En la realizacion anterior, preferiblemente el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene ademas una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 11; y tiene una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 12. En la realiz acion anterior, preferiblemente el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene ademas una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 13; y tiene una CDR1 de cadena li gera que compre nde l a secue ncia de am inoacidos de S EC ID N°: 14. En la realizacion anterior, preferiblemente el a nticuerpo huma no aislado ti ene una regio n vari able de ca dena pesada q ue c omprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 15; y tiene una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 16.

En otra realizacion, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo,

a) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 404-SEC ID N°: 469; y b) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 534-SEC ID N°: 579.

En la otra realizacion anterior, preferiblemente el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene ademas una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 335-SEC ID N°: 403; y una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 506-SEC ID N°: 533. En la ot ra realizacion anterior, preferiblemente el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene ademas una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 2 88-SEC ID N°: 334; y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 470-SEC ID N°: 505.

En una realizacion adicional, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo,

a) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 25; y

b) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 26.

En la realizacion adicional anterior, preferiblemente el anticuerpo humano aislado, o una parte d e union a antigeno del mismo, tiene ademas una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°:

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27; y una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 28. En la realizacion adicional anterior, preferiblemente el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene ademas una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 29; y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 30. En una realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 31; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32.

En la realizacion preferida anterior, preferiblemente el anticuerpo aislado humano comprende una region constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en regiones constantes de IgG 1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA e IgE. Se analizan variaciones alelicas de las mismas en Kabat et al. (Kabat, E. A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion de NIH N° 91-3242). Mas pref eriblemente, l a regi on c onstante d e cad ena p esada d el anticu erpo es lgG1. En l a realizacion preferida anterior, preferiblemente el anticuerpo humano aislado es un fragmento Fab, o un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv de cadena sencilla.

La invencion tambien proporciona un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo humano, o parte de union a antigeno del mismo, de la i nvencion, comprendiendo el anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 25. Preferiblem ente, el anticuerpo codificado, o parte de union a antigeno del mismo, comprende ademas una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 27. Mas preferiblemente, el anticuerpo codificado, o parte de union a antigeno del mismo, comprende ademas una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 29. Aun mas preferiblemente, el acido nucleico aislado codifica una region variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 31. La invencion tambien proporciona un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo humano, o parte de union a antigeno del mismo, de la invencion, comprendiendo el anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 26. Preferiblemente, el anticuerpo codificado, o parte de union a a ntigeno del mismo, comprende ademas una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 28. Mas pref eriblemente, el anticuerpo codificado, o parte de union a antigeno del mismo, comprende ademas una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°:

30. Aun mas p referiblemente, el acido n ucleico aislado codifica una region variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32.

En otro aspecto, la invencion proporciona vectores de expresion recombinantes que portan los acidos nucleicos que codifican anticuerpo de la invencion, y celulas hospedadoras en las que se han introducido tales vectores tambien estan abarcadas por la invencion, asi como metodos para preparar los anticuerpos de la invencion cultivando las celulas hospedadoras de la invencion.

En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo o una parte de union a antigeno del mismo, de la invencion y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

Preferiblemente la composicion comprende ademas un agente adicional, por ejemplo, un agente terapeutico.

En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para inhibir actividad de IL-12 humana in vitro que comprende poner en contacto IL-12 humana con el anticuerpo de la invencion, por ejemplo, J695, de modo que se inhiba la actividad de IL-12 humana.

En otro as pecto, la inv encion pro porciona un us o d e u n antic uerpo de l a inv encion, por e jemplo, J695, o un fragmento de uni on a antigeno de l mismo, para pre parar un m edicamento p ara tratar o prevenir un trastor no seleccionado del grupo que consiste en artritis reumatoide, osteoartritis, artritis cronica juvenil, artritis de Lyme, artritis ps oriasica, artritis re activa, es pondioartropatia, espondilitis an quilosante, l upus eritemat oso sistemico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, diabetes mellitus insulinodependiente, tiro iditis, asma, enfe rmedades a lergicas, ps oriasis, dermatitis , esclero dermia, tiroi ditis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplante de organos, enfermedad inmune aguda o cronica asociada con trasplante de organos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulacion intravascular diseminada, enfermedad de Ka wasaki, enfermed ad de Grave, sindrome n efrotico, sindrom e de fatig a cronica, poli arteritis nod osa, granulomatosis de W egener, purpur a He nochSchonlein, vascu litis mic roscopica d e l os rifo nes, he patitis activ a cronica, sindr ome d e Sjo gren, uveitis, sepsis, ch oque septico, sind rome de s epsis, sindrome de dific ultad respiratoria d el adulto, ca quexia, enfer medades infe cciosas, enfer medades par asitarias, sindrome de la inmunodeficiencia a dquirida, miel itis trans versa aguda, miastenia grave, core a d e Huntington, en fermedad d e Parkinson enfermedad de Alzheimer, apoplejia, cirrosis biliar primaria, enfermedades fibroticas pulmonares, anemia hemolitica, tumores malignos, insuficiencia cardiaca e infarto de miocardio por administracion al sujeto humano. El trastorno puede ser, por ejemplo, enfermedad de Crohn, esclerosis multiple o artritis reumatoide.

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Breve descripci6n de los dibujos

Las Figuras 1A-1B muestran alineamientos de secuencias de aminoacidos de region variable de cadena pesada de una serie de anticuerpos humanos que se unen a IL-12 humana en comparacion con secuencias de linea germinal C os-3/JH3 y Dpl18 Lv10 42. Se usa la n umeracion de K abat par a id entificar pos iciones de aminoacidos. Para la Joe 9 de tipo silvestre, se muestra la secuencia completa. Para los otros anticuerpos solo se muestran las posiciones de aminoacidos que difieren de Joe 9 de tipo silvestre. Las Figuras 1C-1D muestran los alineamientos de secuencias de aminoacidos de region variable de cadena ligera de una serie de anticuerpos humanos que se unen a IL-12 humana. Se usa la numeracion de Kabat para identificar posiciones de aminoacidos. Para la Joe 9 de ti po silvestre, se muestra la secuencia completa. Para los otros anticuerpos solo se muestran las posiciones de aminoacidos que difieren de Joe 9 de tipo silvestre. Las Figuras 2A-2E muestran las posiciones de CDR en la cadena pesada del anticuerpo Y61 que se mutaron por mutagenesis dirigida y las sustituciones de aminoacidos respectivas en cada posicion. Los graficos a la derecha de las figuras muestran las tasas de disociacion para los anticuerpos sustituidos (barras negras) en comparacion con Y61 no mutado (barra abierta). Las Figuras 2F-2H muestran las posiciones de CDR en la cadena ligera del anticuerpo Y61 que se mutaron por mutagenesis dirigida y las sustituciones de aminoacidos respectivas en cada posicion. Los graficos a la derecha de las fi guras muestra n l as tasas de disociacion p ara l os a nticuerpos s ustituidos (barras n egras) e n comparacion con Y61 no mutado (barra abierta). La Figura 3 demuestra la eficacia in vivo del anticuerpo humano anti-IL-12 J695, en los niveles de neopterina en plasma en monos cynomolgus. La Figura 4 muestra una grafica de puntuacion artritica media frente a dias despues de inmunizacion de ratones con c olageno, qu e demuestra qu e el tr atamiento c on C1 7.15 red uce si gnificativamente los s intomas relacionados con la artritis en comparacion con el tratamiento con IgG de rata.

Descripci6n detallada de la invenci6n

Para que la presente invencion pueda entenderse mas facilmente, se definen en primer lugar ciertos terminos.

La expresion "resto de aminoacido que potencia la actividad" incluye un resto aminoacido que mejora la actividad del anticuerpo. Deberia entenderse que el resto de aminoacido que potencia la actividad puede reemplazar a un resto de aminoacido en una posicion contacto, hipermutacion o de mutagenesis selectiva preferida y, ademas, puede estar presente mas de un resto de aminoacido potenciador de actividad dentro de una o mas CDR. Un resto de aminoacido potenciador de actividad incluye un resto de aminoacido que mejora la especificidad/afinidad de union de un anticuerpo, por ejemplo anticuerpo anti-IL-12 humana que se une a IL-12 humana. El resto de aminoacido potenciador de actividad tambien pretende incluir un resto aminoacido que mejore la potencia de neutralizacion de un anticuerpo, por ejemplo, el anticuerpo de IL-12 humana que inhibe IL-12 humana.

El termino "anticuerpo" incluye una molecula de inmunoglobulina comprendida por cuatro cadenas polipeptidicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada esta comprendida por una region variable de cadena pesada (abreviada eneste documento como HCVR o VH) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada esta comprendida por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta comprendida por una region variable de cadena ligera (abreviada en este documento como LCVR o VL) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera esta comprendida por u n dominio, CL. L as r egiones V H y VL p ueden su bdividirse a dicionalmente e n regi ones d e hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con re giones que estan mas conservadas, denominadas regiones marcoconservadas (FR). Cada VH y VL esta compuesta de tres CDR ycuatro FR, dispuestas de extremo amino terminal a carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

La expresion "parte de union a a ntigeno" de un anticuerpo (o "p arte de anticuerpo") incluye fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse especificamente a un antigeno (por ejemplo, hlL-12). Se ha mostrado que la funcion de union a antigeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud com pleta. Los ejem plos d e fragm entos de u nion abarc ados dentro d e la expresion "p arte de uni on a antigeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH yCH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de una rama sencilla de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al ., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una region determinante de complementariedad aislada (CDR). Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, estos pueden unirse, usando metodos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que les permite prepararse como una cadena proteica sencilla en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv de ca dena sencilla (scFv); vease p or ejemplo, Bird et al . (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Tambien se pretende que tales anticuerpos de cadena sencilla esten abarcados dentro de la expresion "parte de union a antigeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos, tambien estan abarcadas. Los

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diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecificos en los que se expresan dominios VH y VL en una cadena polipeptidica sencilla, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de union a antigeno (vease por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Ademas, un anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo puede ser parte de una molecula de inmunoadhesion mayor, formada por asociacion covalente o no covalente del anticuerpo o parte de anticuerpo con una o mas proteinas o peptidos adicionales. Los ejemplos de tales moleculas de inmunoadhesion incluyen uso de la region nucleo de estreptavidina para realizar una molecula scFv tetramerica (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) y uso de un resto de cisteina, un peptido marcador y un marcador de polihistidina C terminal para preparar moleculas scFV bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Pueden prepararse partes de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, a partir de anticuerpos completos usando tecnicas convencionales, tales como digestion con papaina o p epsina, resp ectivamente, d e a nticuerpos co mpletos. Ad emas, pue den obtenerse anticuerpos, partes de anticuerpo y moleculas de inmunoadhesion usando tecnicas de ADN recombinante convencionales, como se describen en este documento.Las partes de union a antigeno preferidas son dominios completos o pares de dominios completos.

El termino "retromutacion" se refiere a un p roceso en el que algunos o todos los aminoacidos mutados de forma somatica de u n antic uerpo humano se r eemplazan c on los restos d e linea germinal corres pondientes d e un a secuencia de anticuerpo de linea germinal homologa. Las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo humano de la invencion se alinean de forma separada con las secuencias de linea germinal en la base de datos VBASE para identificar las secuencias con la mayor homologia. Las diferencias en el anticuerpo humano de la invencion se devuelven a la secuencia de linea germinal mutando posiciones de nucleotidos definidas que codifican dicho amin oacido d iferente. El pap el de cada ami noacido i dentificado de este modo com o cand idato pa ra retromutacion deberia investigarse con respecto a un p apel directo o indirecto en union de antigenoy cualquier aminoacido que se descubra despues de la mutacion que afecta a cualquier caracteristica deseable del anticuerpo humano no deberia incl uirse en el antic uerpo hum ano final; como e jemplo, los aminoacidos p otenciadores de actividad identificados por el enfoque de mutagenesis selectiva no se someteran a retromutacion. Para minimizar el numero de a minoacido so metidos a retr omutacion las posiciones d e amin oacidos que se desc ubre q ue so n diferentes de la secuencia de linea germinal mas cercana pero identicas al aminoacido correspondiente en una segunda secuencia de linea germinal pueden permanecer, siempre que la segunda secuencia de linea germinal sea identica y colineal a la secuencia del anticuerpo humano de l a invencion para al menos 10, preferiblemente 12 aminoacidos, en ambos lados del aminoacido en cuestion. La retromutacion puede producirse en cualquier etapa de optimizacion d e anticu erpos; preferiblemente, la retromutacio n se pr oduce direct amente antes o d espues del enfoque de mutagenesis selectiva. Mas preferiblemente la retromutacion se produce directamente antes del enfoque de mutagenesis selectiva.

La frase "interleucina humana 12" (abreviada en este documento como hlL-12 o IL-12), como se usa en este documento, incluye una citocina humana que se secreta principalmente por macrofagos y celulas dendriticas. La expresion incluye una proteina heterodimerica que comprende una subunidad de 35 kD (p35) y una subunidad de 40 kD (p40) que se un en am bas entre si co n un p uente disulfuro. La proteina h eterodimerica se d enomina una "subunidad p70". La estructura de IL-12 humana se describe adicionalmente en, por ejemplo, Kobayashi, et al . (1989) J. Exp Med. 170: 827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp Med. 154: 116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294: 230-237. La expresion IL-12 humana pretende i ncluir IL-12 hum ana recom binante (rh IL-12) , que pue de prepar arse por metod os de e xpresion recombinante convencionales.

Las expresiones "n umeracion d e K abat", "defin iciones d e Kabat" y "etiquetado de Kabat" s e usan d e forma intercambiable en este documento. Estas expresiones, que se reconocen en la tecnica, se refieren a un sistema de numeracion d e restos de a minoacidos qu e son mas v ariables (es decir hipervar iables) q ue otro s restos de aminoacidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una parte de union a antigeno del mismo (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-391 y Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion de NIH N° 91-3242). Para la region variable de cadena pesada, la region hipervariable varia de las posiciones de aminoacidos 31 a 35 para CDR1, posiciones de aminoacidos50a65 para CDR2, y posiciones de aminoacidos95 a102 para CDR3. Para la region variable de cadena ligera, la region hipervariable varia de las posiciones de aminoacidos 24 a 34 para CDR1, posiciones de aminoacidos 50 a 56 para CDR2 y posiciones de aminoacidos 89 a 97 para CDR3.

La numeracion de Kabat se usa en este documento para indicar las posiciones de modificaciones de aminoacidos realizadas en anticuerpos de la invencion. Por ejemplo, el anticuerpo Y61 anti IL-12 puede mutarse de serina (S) a acido glutamico (E) en la posicion 31 de la CDR1 de cadena pesada (H31S - E), o la glicina (G) puede mutarse a tirosina (Y) en la posicion 94 de la CDR3 de cadena ligera (L94G -Y).

La expresion "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden a secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana como se d escribe en Kabat et al. (Vease Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human

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Services, Publicacion de NIH N° 91-3242). Los anticuerpos humanos de la inv encion pueden incluir restos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o especifica in vitro o por mutacion somatica in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular CDR3. Las mutaciones se introducen preferiblemente usando el "enfoque de mutagenesis selectiva" descrito en este documento. El anticuerpo humano puede tener al menos una posicion reemplazada con un resto de aminoacido, por ejemplo, un resto de aminoacido potenciador de actividad que no se codifica por la secuencia de inmunoglobulina de linea g erminal h umana. El a nticuerpo humano pue de te ner hasta ve inte posic iones reemplazadas con restos de aminoacidos que no son parte de la secuencia de inmunoglobulina de linea germinal humana. En otras realizaciones, se reemplazan hasta diez, hasta cinco, hasta tres o hasta dos posiciones. En una realizacion preferida, estos reemp lazos estan dentro de l as r egiones CD R com o se describe e n d etalle posteriormente. Sin embargo, la expresion "anticuerpo humano", como se usa en este documento, no pretende incluir anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la linea germinal de otra especie de mamifero, tal como un raton, en secuencias marco conservadas humanas.

La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por med ios re combinantes, t ales com o an ticuerpos e xpresados usa ndo un vector d e e xpresion recomb inante transfectado en una c elula hospedadora (descrito adicionalmente en la Seccion II, posteriormente), anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria, recombinante (descrita adicionalmente en la Seccion III, posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico para genes de inmunoglobulina humana (vease por ejemplo, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique corte y empalme de secuencias de gen es d e i nmunoglobulina huma na en otras secu encias de A DN. Tales anticu erpos h umanos recombinantes tien en r egiones vari ables y consta ntes d erivadas de s ecuencias d e inmu noglobulina de linea germinal humana (Vease Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion,

U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion de NIH N° 91-3242). En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagenesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgenico para secuencias de Ig h umana, mutagenesis somatica in vivo ) y de este modo las secuencias de aminoacidos de las regiones VH yVL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y estan relacionadas con secuencias VH y VL de linea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de linea germinal de anticuerpo humano in vivo. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos recombinantes son el resultado de enfoque de mutagenesis selectiva o retromutacion o ambos.

Un "a nticuerpo ais lado" i ncluye un anticuerpo q ue es ta sustanci almente si n otro s anticu erpos que te ngan especificidades antigenicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especificamente a hIL-12 esta sustancialmente sin anticuerpos q ue s e u nen especificamente a antigenos distintos de hIL-12). Un a nticuerpo aislado que se une especificamente a hIL-12 puede unirse a moleculas de IL-12 de otras especies (analizado en mas detalle posteriormente). Ademas, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente sin otros materiales y/o compuestos quimicos celulares.

Un "anticuerpo neutralizador" (o un "anticuerpo que neutralizo la actividad de hIL-12") incluye un anticuerpo cuya union a hIL-12 da como resultado inhibicion de la actividad biologica de hIL-12. Esta inhibicion de la actividad biologica de hIL-12 puede evaluarse midiendo uno o mas indicadores de actividad biologica de hIL-12, tal como inhibicion de proliferacion deblastos por fitohemaglutinina humana en un ensayo de proliferacion de blastos por fitohemaglutinina (PHA), o in hibicion de union al receptor en un ens ayo de union del receptor de IL-12 humano (vease Ejemplo 3-Ensayo de Induccion de Interferon gamma). Estos indicadores de actividad biologica de hIL-12 puede evaluarse por uno o mas de varios ensayos in vitro o in vivo convencionales conocidos en la tecnica (vease Ejemplo 3).

El termino "actividad" incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de union de un anticuerpo para un antigeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-hIL-12 que se une a un antigeno IL-12 y/o la potencia de neutralizacion de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-hIL-12 cuya union con hIL-12 inhibe la actividad biologica de hIL-12, por ejemplo inhibicion de proliferacion de blastos por PHAo inhibicion de union con el receptor en un ensayo de union con receptor de IL-12 humano (vease Ejemplo 3).

La frase "resonancia de plasmon superficial" incluye un fenomeno optico que permite el analisis de interacciones bioespecificas en tiempo real mediante deteccion de alteraciones en las concentraciones proteicas dentro de una matriz biosensora, por ejemplo usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para des cripciones a dicionales, v ease Ej emplo 5 y Jonss on, U., et al. (19 93) Ann. B iol. Cl in. 51: 19-26; Jonsson, U., et al . (1991) Bi otechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al . (1995) J. Mol. Reco gnit. 8:125-131; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277.

El termino "K off", como se u sa en el presente d ocumento, pret ende r eferirse a l a constante de velocidad d e disociacion para la disociacion de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antigeno.

El termino "Kd", como se usa en este documento, pretende referirse a la constante de disociacion de una interaccion anticuerpo-antigeno particular.

7

La frase "molecula de acido nucleico" incluye moleculas de ADN ymoleculas de ARN. Una molecula de acido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.

La frase "molecula de acido nucleico aislada", como se usa en este documento en referencia a acidos nucleicos que codifican a nticuerpos o part es de a nticuerpo (por e jemplo, VH, VL, CDR3) que s e une n a hIL-12 inc luyendo "anticuerpos a islados"), inc luye un a mo lecula de acido nucleico en la que las s ecuencias d e n ucleotidos que codifican el anticuerpo o parte de anticuerpo estan sin otras secuencias de nucleotidos que codifican anticuerpos o partes de anticuerpo que se unen a antigenos distintos de hIL-12, pudiendo dichas otras secuencias flanquear de forma natural el acido nucleico en ADN genomico humano. Por lo tanto, por ejemplo, un acido nucleico aislado de la invencion que codifica una region VH de un anticuerpo anti IL-12 no contiene otras secuencias que codifiquen otras regiones VH que se unan a antigenos distintos de IL-12. La frase "molecula de acido nucleico aislada" tambien pretende incluir secuencias que codifican anticuerpos bivalentes, biespecificos, tales como diacuerpos en los que las regiones VH y VL no contienen otras secuencias distintas de las secuencias del diacuerpo.

El termino "vector" incluye una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico con el que se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN ad icionales e n e l g enoma vi ral. Ci ertos vectores son ca paces de replicacion auto noma en una cel ula hospedadora en la que se han introducido (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores de mamifero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamifero no episomales) pueden integrarse en el genoma de una celula hospedadora tras su introduccion en la celula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma hospedador. Ademas, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de genes con los que estan unidos operativamente. Varios vectores se denominan en este documento "vectores de expresion recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresion"). En general los vectores de expresion utiles en tecnicas de ADN recombinante estan con frecuencia en forma de plasmidos. En lapresente memoria descriptiva, "plasmido" y "vector" pueden usarse de forma intercambiable puesto que el plasmido es la forma de vector usada mas habitualmente. Sin embargo, se pretende que la invencion incluya tales otras formas de vectores de expresion, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos en replicacion, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.

La frase "celula hospedadora recombinante" (o simplemente "celula hospedadora") incluye una celula en la que se ha introducido un vector de expresion recombinante. Deberia entenderse que tales terminos pretenden referirse no solamente a la celula objeto particular sino a la desc endencia de dicha celula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutacion o influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, no ser identica a la celula parental, pero aun se incluye dentro del alcance de la expresion "celula hospedadora" como se usa en este documento.

El termino "modificar", como se usa en este documento, pretende referirse a cambiar uno o mas aminoacidos en los anticuerpos o partes de union a antigeno de los mismos. El cambio puede producirse afadiendo, sustituyendo o suprimiendo un aminoacido en una o mas posiciones. El cambio puede producirse usando tecnicas conocidas, tales como mutagenesis de PCR.

La frase "posicion de contacto" incluye una posicion de aminoacido en la CDR1, CDR2 o CDR3 de la region variable de cadena pesada o la region variable de cadena ligera de un anticuerpo que esta ocupada por un aminoacido que entra en contacto con antigeno en una de las 26 estructuras de anticuerpo-antigeno conocidas. Si un aminoacido de CDR en cualquiera de las 26 estructuras resueltas conocidas de complejos anticuerpo-antigeno entra en contacto con el antigeno, entonces puede considerarse que ese aminoacido ocupa una posicion de contacto. Las posiciones de contacto tienen una mayor probabilidad de ocuparse por un aminoacido que entra en contacto con un antigeno que posiciones no de contacto. Preferiblemente una posicion de contacto es una posicion de CDR que contiene un aminoacido que entra en co ntacto con antigeno en mas de 3 de las 2 6 estructuras (>11,5%). Mas preferiblemente una posicion de contacto es una posicion de CDR que contiene un aminoacido que entra en contacto con antigeno en mas de 8 de las 25 estructuras (>32%).

La expresion "posicion de hipermutacion" incluye un resto de aminoacido que ocupa la posicion en la region CDR1, CDR2 o CDR3 de la region variable de cadena pesada o la region variable de cadena ligera de un anticuerpo que se considera que tiene una alta frecuencia o probabilidad de hipermutacion somatica durante maduracion de afinidad in vivo de un anticuerpo. "A lta frecu encia o probabilidad de hi permutacion s omatica" i ncluye f recuencias o probabilidades de u na posibilidad d e 5 a a proximadamente 40% d e q ue el rest o e xperimente hi permutacion somatica durante maduracion de afinidad in vivo del anticuerpo. Deberia entenderse que se pretende que todos los intervalos d entro de este intervalo in dicado s ean par te de l a pre sente i nvencion, por ejemplo, d e 5 a aproximadamente 30%, por ejemplo, de 5 a aproximadamente 15%, por ejemplo de 15 a aproximadamente 30%.

La expresion "posicion de mutagenesis selectiva preferida" incluye un resto de aminoacido que ocupa una posicion en la region CDR1, CDR2 o CDR3 de la region variable de cadena pesada o la region variable de cadena ligera que puede considerarse que es una posicion tanto de contacto como de hipermutacion.

La frase " enfoque d e muta genesis se lectiva" inc luye u n metod o p ara mej orar l a actividad d e un a nticuerpo seleccionando y mutando individualmente aminoacidos de CDR en al menos una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de hipermutacion y/o de contacto. Un anticuerpo humano "mutado de forma selectiva" es un anticuerpo que contiene una mutacion en una posicion seleccionada usando un enfoque de mutagenesis selectiva. En otra rea lizacion, se pretende q ue el e nfoque de m utagenesis s electiva pr oporcione un m etodo par a mutar preferentemente restos de aminoacidos individuales seleccionados en la CDR1, CDR2 o CDR3 de la region variable de cadena pesada (en lo sucesivo en este documento H1, H2 y H3, respectivamente), o la CDR1, CDR2 o CDR3 de la region variable de cadena ligera (en lo sucesivo en este documento denominadas L1, L2 y L3, respectivamente) de un a nticuerpo. Los resto s de amin oacidos pu eden s eleccionarse d e posic iones de mutagenes is selectiv a preferida, pos iciones de co ntacto o posic iones d e hi permutacion. Los amino acidos individuales se selecci onan basandose en su posicion en la region variable de cadena ligera o pesada. Deberia entenderse que una posicion de hipermutacion tambien puede ser una posicion de contacto. En una realizacion, el enfoque de mutagenesis selectiva es un "enfoque dirigido". La expresion "enfoque dirigido"pretende incluir un metodo para mutar preferentemente restos de aminoacidos individuales seleccionados en la CDR1, CDR2 o CDR3 de la region variable de cadena pesada o la CDR1, CDR2 o CDR3 de la region variable de cadena ligera de un anticuerpo de una manera dirigida, por ejemplo, un "enfoque dirigido por grupos" o "enfoque dirigido por CDR". En el "enfoque dirigido por grupos", se dirigen a resto s de aminoacidos i ndividuales en gru pos particulares m utaciones s electivas inc luyendo gr upos I (incluyendo L3 y H3), II (incluy endo H2 y L1) y III (incluyendo L2 y H1), enumerandose los grupos en orden de preferencia para direccion. En el "enfoque dirigido por CDR", se dirigen a restos de amin oacidos individuales en CDR particulares mutaciones selectivas con el orden de preferencia para direccion como sigue: H3, L3, H2, L1, H1 y L2. El resto de aminoacido seleccionado se muta, por ejemplo, a al menos otros dos restos de aminoacidos, y se determina el efecto de la mutacion en la actividad del anticuerpo. La actividad se mide como un cambio en la especificidad/afinidad de union del anticuerpo, y/o potencia de neutralizacion del anticuerpo. Deberia entenderse que el enfo que de mutagen esis selectiva pue de usarse para la optimiz acion de cu alquier anticu erpo derivado d e cualquier fuente incluyendo presentacion de fagos, animales transgenicos con genes de linea germinal de IgG humana, antic uerpos hum anos aisl ados d e linfoc itos B humanos. Pref eriblemente, el enfoque de mutage nesis selectiva se usa en anticuerpos que no pueden optimizarse mas usando tecnologia de presentacion de fagos. Deberia e ntenderse qu e los antic uerpos de cua lquier f uente i ncluyendo pr esentacion d e fa gos, an imales transgenicos con genes de linea germinal de IgG humana, anticuerpos humanos aislados de linfocitos B humanos pueden someterse a retromutacion antes de o despues del enfoque de mutagenesis selectiva.

La expresion "resto de aminoacido potenciador de actividad" incluye un resto de aminoacido que mejore la actividad del anticuerpo. Deberia entenderse que el resto de aminoacido potenciador de actividad puede reemplazar un resto de aminoacido en una p osicion de muta genesis s electiva preferida, posicion de c ontacto o u na posic ion d e hipermutacion y, ademas, puede estar presente mas de un resto de aminoacido potenciador de actividad dentro de una o mas CDR. Un resto de aminoacido potenciador de actividad incluye un resto de aminoacido que mejora la especificidad/afinidad de union de un anticuerpo, por ejemplo union de anticuerpo anti IL-12 humana con IL-12 humana. Tambien se pretende que el resto de aminoacido potenciador de actividad incluya un resto de aminoacido que mejore la potencia de neutralizacion de un anticuerpo, por ejemplo, el anticuerpo de IL-12 humana que inhibe IL12 humana.

Se describen diversos aspectos de la invencion en mas detalle en las siguientes subsecciones.

1. Anticuerpos humanos que se unen a IL-12 humana

La presente invencion proporciona anticuerpos humanos aislados, o parte de union a antigeno de los mismos, de acuerdo con la reivindicacion 1. Preferiblemente, los anticuerpos humanos de la invencion son anticuerpos anti hIL12 humanos neutralizadores, recombinantes. Los anticuerpos de la invencion que se unen a IL-12 humana pueden seleccionarse, por ejemplo, explorando una o mas bibliotecas de ADNc de VL y VH humanos con hlL-12, tal como por tecnicas de presentacion de fagos como se describe en el Ejemplo 1. La exploracion de bibliotecas de ADNc de VL y VH humanas identifico inicialmente una serie de anticuerpos anti IL-12 de los que un anticuerpo, denominado en este documento "Joe 9" (o "Joe 9 de tipo silvestre"), se selecciono para desarrollo adicional. Joe 9 es un anticuerpo de IL12 humana de afinidad relativamente baja (por ejemplo, una K off de aproximadamente 0,1 s -1), pero es util par a unirse especificamente a y detectar hIL-12. La afinidad del anticuerpo Joe 9 se mejoro realizando mutagenesis de las CDR de cadena pesada y ligera, produciendo un panel de regiones variables de cadena ligera y pesada que se "mezclaron y emparejaron" y s e m utaron ad icionalmente, con duciendo a num erosos antic uerpos anti hIL-12 adicionales con afinidadaumentada para hIL-12 (vease Ejemplo 1, Tabla 2 (vease Apendice A) y los alineamientos de secuencia de las Figuras 1A-D).

De estos anticuerpos, el anticuerpo anti hlL-12 humano denominado en este documento Y61 demostro una mejora significativa en la afinidad de union (por ejemplo, una Koffde aproximadamente 2 x 10-4 s-1). El anticuerpo Y61 anti hlL-12 se sel ecciono par a madur acion d e afini dad a dicional mutan do indiv idualmente restos de amino acidos especificos dentro de las CDR de cadena pesada y ligera. Los restos de aminoacidos de Y61 se seleccionaron para mutacion especifica de sitio (enfoque de mutagenesis selectiva) basandose en el resto deaminoacido queocupa una posicion de muta genesis sel ectiva pr eferida, conta cto y/o una p osicion d e h ipermutacion. S e muestra un sumario de las sustituciones en posiciones seleccionadas en las CDR de cadena pesada y ligera en las Figuras 2A

9

2H. Un anticuerpo neutralizador recombinante preferido de la inv encion, denominado en este d ocumento J695, resulto de una sustitucion de Gly a Tyr en la posicion 50 de la CDR2 de cadena ligera de Y61, y una sustitucion de Gly a Tyr en la posicion 94 de la CDR3 de cadena ligera de Y61.

5 Se muestran alineamientos de secuencias de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un panel de anticuerpos anti IL-12 de la invencion, en el linaje de Joe 9 de tipo silvestre a J695, en las Figuras 1A1D. Estos ali neamientos de secue ncias posi bilitaron l a identific acion de secue ncias conse nso para re giones variables de cadena pesaday ligera preferidas de anticuerpos de la i nvencion que se unen a hIL-12, asi como secuencias c onsenso par a l as CDR 3, CD R2 y CDR 1, en el linaje d e Joe 9 a J6 95. Adem as, el an alisis d e

10 mutagenesis d e Y6 1 r esumido en las F iguras 2A-2H p osibilito la i dentificacion de secuencias co nsenso para regiones variables de cadena pesada y ligera que se unen a hlL-12, asi como secuencias consenso para las CDR3, CDR2 y CDR1 que se unen a hlL-12 en el linaje de Y61 a J695 que abarca secuencias con modificaciones de Y61 pero que conservan buenas caracteristicas de union a hlL-12. Se resumen a continuacion secuencias de CDR, VH y VL preferidas de la invencion (incluyendo secuencias consenso) como se identifican por identificadores de secuencia

15 en la Lista de Secuencias adjunta.

SEC ID N°:: CADENA DE ANTICUERPO REGION SECUENCIA

1: Joe 9 consenso a J695 CDRH3 (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y)

2: Consenso CDRL3 Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-

Joe 9 a J695: (L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L)(V/I/T/M/L)

3: Joe 9 consenso a J695 CDRH2 F-l-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G

4: Joe 9 consenso a J695 CDRL2 (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S

5: Joe 9 consenso a J695 CDRH1 F-T-F-S-(S/E)-Y-G-M-H

6: Joe 9 consenso a J695 CDRL1 (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-l-(GA/)-(S/A)-(N/GA')-(T/D)-V(K/H)

7: Joe 9 consenso a J695 VH (secuencia de VH completa; vease lista de secuencias)

8: Joe 9 consenso a J695 VL (secuencia de VL completa; vease lista de secuencias)

9: Y61 consenso a J695 CDRH3 H-(G/V/C/H)-(S/T)-(H/TA//R/I)-(D/S)-(N/K/A/T/S/F/W/H)

10: Y61 consenso a J695 CDRL3 Q-S-Y-(D/S)-(Xaa)-(G/D/Q/L/F/R/H/N/Y)-T-H-P-A-L-L

11: Y61 consenso a J695 CDRH2 (F/T/Y)-l-(R/A)-Y-(D/S/E/A)-(G/R)-S-(Xaa)-K-(Y/E)-Y-A-D-S-V-K-G

12: Y61 consenso a J695 CDRL2 (G/Y/S/T/N/Q)-N-D-Q-R-P-S

13: Y61 consenso a J695 CDRH1 F-T-F- (Xaa) - (Xaa) - (Y/H) -(G/M/A/N/S)-M-H

14: Y61 consenso a J695 CDRL1 S-G-G-R-S-N-I-G-(S/C/R/N/D/T)-(N/M/I)-(T/Y/D/H/K/P)-V-K

15: Y61 consenso a J695 VH (secuencia de VH completa; vease lista de secuencias)

16: Y61 consenso a J695 VL (secuencia de VL completa; vease lista de secuencias)

17: Y61 CDRH3 H-G-S-H-D-N

18: Y61 CDRL3 Q-S-Y-D-R-G-T-H-P-A-L-L

19: Y61 CDRH2 F-l-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G

20: Y61 CDRL2 G-N-D-Q-R-P-S

21: Y61 CDRH1 F-T-F-S-S-Y-G-M-H

22: Y61 CDRL1 S-G-G-R-S-N-l-G-S-N-T-V-K

23: Y61 VH (secuencia de VH completa; vease lista de secuencias)

24: Y61 VL (secuencia de VL completa; vease lista de secuencias)

25: J695 CDRH3 H-G-S-H-D-N

26: J695 CDRL3 Q-S-Y-D-R-Y-T-H-P-A-L-L

27: J695 CDRH2 F-l-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G

28: J695 CDRL2 Y-N-D-Q-R-P-S

10

SEC ID N°:: CADENA DE ANTICUERPO REGION SECUENCIA

29: J695 CDRH1 F-T-F-S-S-Y-G-M-H

30: J695 CDRL1 S-G-S-R-S-N-l-G-S-N-T-V-K

31: J695 VH (secuencia de VH completa; vease lista de secuencias)

32: J695 VL (secuencia de VL completa; vease lista de secuencias)

Los antic uerpos prod ucidos a partir de maduracion de afi nidad d e Joe 9 d e ti po si lvestre se caracter izaron funcionalmente por analisis de resonancia de plasmon superficial para determinar la velocidad Kd y Koff. Se produjo una ser ie d e anticu erpos que tenia n una veloci dad K off dentro de l i ntervalo de a proximadamente 0,1 s -1 a

5 aproximadamente 1 x 10-5 s-1, y mas preferiblemente una Koff de aproximadamente 1 x 10-4 s-1 a 1 x 10-5 s-1 o menos. Los anticuerpos tambien se caracterizaron in vitro con respecto a su capacidad para inhibir la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina (PHA), como se describe en el Ejemplo 3. Se produjo una serie de anticuerpos que tenian un valor de CI50 en el intervalo de aproximadamente 1 x 10-6 M a aproximadamente 1 x 10-11 M, mas preferiblemente aproximadamente 1 x 10-10 M a 1 x 10-11 M o menos.

10 En consecuencia, en un aspecto, la presente descripcion proporciona un anticuerpo humano aislado, o parte de union a antigeno del mismo, que se une a IL-12 humanayse disocia de IL-12 humana con una constante de velocidad Koff de 0,1 s -1 o menos, como se determina por resonancia de plasmon superficial, o que inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de proliferacion de blastos por fitohemaglutinina in vitro

15 (ensayoPHA) con una CI50 de 1 x10-6 M omenos. Preferiblemente, el anticuerpo de IL-12 humana aislada, o una parte de union a antigeno del mismo, de la presente descripcion se disocia de IL-12 humana con una constante de velocidad Koff de 1 x 10-2 s-1 o menos, o inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-7 M o menos. Preferiblemente, el anticuerpo de IL-12 humana aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, de la presente descripcion se disocia de IL-12 humana con una constante de velocidad

20 Koff de 1 x 10-3 s-1 o menos, o inhibe proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-8 M o menos. De acuerdo con la invencion, el anticuerpo de IL-12 humana aislado, o una parte de union a antigeno del mismo se disocia de IL-12 humana con una constante de velocidad Koff de 1 x 10-4 s-1 o menos, o inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-9 M o menos. En realizaciones mas preferidas, el anticuerpo de IL-12 humana aislado, o una parte de union a antigeno del

25 mismo, se disocia de IL-12 humana con una tasa Koff constante de 1 x 10-5 s-1 o menos, o inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-10 M o menos. En real izaciones aun mas preferidas, el anticuerpo de IL-12 humana aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, se disocia de IL-12 humana con una constante de velocidad Koff de 1 x 10-5 s-1 o menos, o inhibe proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-11 M o menos.

30 La constante de tasa de disociacion (Koff) de un anticuerpo de IL-12 puede determinarse por resonancia de plasmon superficial (vease Ejemplo 5). Generalmente, el analisis de resonancia de plasmon superficial mide interacciones de union en tiempo real entre ligando (IL-12 humana recombinante inmovilizada en una matriz biosensora) y analito (anticuerpos e n soluci on) p or resona ncia d e plasmo n superficial (SPR) usand o el si stema BIAcore (Pharmacia

35 Biosensor, Pis cataway, NJ). T ambien pu ede re alizarse analisis de p lasmon s uperficial i nmovilizando el a nalito (anticuerpos en una matriz biosensora) y presentando el ligando (IL-12 recombinante en solucion). La actividad de neutralizacion de anticuerpos de IL-12, o partes de union a antigeno de los mismos, puede evaluarse usando uno o mas de varios ensayos in vitro adecuados (vease Ejemplo 3).

40 Se con oce b ien e n la tec nica qu e las CDR de c adena pes ada y ligera de a nticuerpo des empefan un papel importante en la especific idad/afinidad de unio n de un anticuer po p or un antige no. En consec uencia, esta descripcion proporciona anticuerpos humanos que tienen CDR de cadena ligera y pesada de Joe 9, asi como otros anticuerpos que tienen CDR que se han modificado para mejorar la especificidad/afinidad de union del anticuerpo. Como se demuestra en el Ejemplo 1, una serie de modificaciones de las CDR de cadena ligera y pesada da como

45 resultado ma duracion d e afi nidad d e a nticuerpos anti hIL-12 humanos. Los a lineamientos de secuencias de aminoacidos de region variable de cadena ligera y pesada de una serie de anticuerpos humanos que varian de Joe 9 de tipo silvestre a J695 que se unen a IL-12 humana se muestran en las Figuras 1A-1D. Pueden determinarse motivos de secuencia consenso para las CDR de anticuerpos del alineamiento de secuencias (como se resume en la tabla anterior). Por ejemplo, un motivo consenso para la CDR3 de VH del linaje de Joe 9 a J695 comprende la

50 secuencia de aminoacidos: (H/S)-G-S-(H/Y)-D-(N/T/Y) (SEC ID N°: 1), que abarca aminoacidos desde la posicion 95 a la 102 de la HCVR mostrada en SEC ID N°: 7. Un motivo consenso para la CDR de VL comprende la secuencia de aminoacidos: Q-(S/T)-Y-(D/E)-(S/R/K)-(S/G/Y)-(L/F/T/S)-(R/S/T/W/H)-(G/P)-(S/T/A/L)-(R/S/M/T/L-V/l/T/M/L) (SEC ID N°: 2), que abarca aminoacidos de la posicion 89 a 97 de la LCVR consenso mostrada en SEC ID N°: 8.

55 En consecuencia, en otro aspecto, la descripcion proporciona un anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, que tiene las siguientes caracteristicas:

a) inhibe proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-6 M o menos;

11

b) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 1; y

c) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 2.

El anticuerpo comprende adicionalmente una CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoacidos: F-l-R-Y-D-G-S-N-K-Y-Y-A-D-S-V-K-G (SEC ID N°: 3 ) (que abarca amin oacidos desde l a p osicion 50 a 6 5 de l a H CVR consenso que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID N°: 7) y comprende adicionalmente una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoacidos: (G/Y)-N-(D/S)-(Q/N)-R-P-S (SEC ID N°: 4) (que a barca aminoacidos de la posicion 50 a 56 de la LCVR consenso que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID N°: 8).

El anticuerpo comprende adicionalmente una CDR1 de VH que compr ende la secuencia de aminoacidos: F-T-F-S(S/E)-Y-G-M-H (SEC ID N°: 5) (qu e abarca aminoacidos de la posicion 27 a la 35 de la HCVR consenso que comprende l a secuenc ia de amino acidos SEC ID N°: 7 ) y compre nde adici onalmente una C DR1 de VL qu e comprende la secuencia de aminoacidos: (S/T)-G-(G/S)-(R/S)-S-N-I-(G/V)-(S/A)-(N/G/Y)-(T/D)-V-(K/H) (SEC ID N° : 6) (que a barca amin oacidos de la pos icion 24 a 3 4 de la LCVR co nsenso q ue co mprende la s ecuencia d e aminoacidos SEC ID N°: 8).

El anticuerpo de la descripcion comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 7 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 8.

Pueden determinarse motivos consenso adicionales basandose en el analisis mutacional realizado en Y61 q ue condujo al anticuerpo J695 (resumido en las Figuras 2A-2H). Como se demuestra por las graficas mostradas en las Figuras 2A-2H, ciertos restos de las CD R de cadena pesada yligera de Y61 eran susceptibles de sustitucion sin alterar significativamente las propiedades de union de hIL-12 del anticuerpo. Por ejemplo, sustituciones individuales en la posicion 30 en CDR H1 con doce restos de aminoacidos diferentes no redujeron significativamente la velocidad Koff del anticuerpo, lo que indica que su posicion es susceptible de sustitucion con una diversidad de restos de aminoacidos diferentes. Por lo tanto, basandose en el analisis mutacional (es decir, posiciones dentro de Y61 que eran susceptibles de sustitucion por otros restos de aminoacidos) se determinaron motivos consenso. Los motivos consenso para las CDR3 d e cadena pesada yligera se muestran en SEC ID N°: 9 y 10, respectivamente, se muestran motivos consenso para las CDR2 de cadena pesada y ligera en SEC ID N°: 11 y 12, respectivamente, y se muestran motivos consenso para las CDR1 de cadena pesada y ligera en SEC ID N°: 13 y 14, respectivamente. Se muestran motivos consenso para las regiones VH y VL en SEC ID N°: 15 y 16, respectivamente.

En consecuencia, en un aspecto, la invencion presentaun anticuerpo humano aislado, o u na parte de union a antigeno del mismo, que tiene las siguientes caracteristicas:

a) inhibe la proliferacion de blastos de fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-9 M

o menos; b) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 9; y c) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 10.

En una re alizacion preferi da, el anticu erpo comp rende adici onalmente una C DR2 de VH qu e compre nde l a secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 11 ycomprende adicionalmente una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 12.

En otra re alizacion prefer ida, el a nticuerpo com prende adic ionalmente un a CD R1 de VH que c omprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 13 ycomprende adicionalmente una CDR1 de VL que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 14.

En otra realizacion preferida mas, el anticuerpo de la invencion comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 15 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 16.

Un anticuerpo preferido de la invencion, el anticuerpohumano anti hIL-12 Y61, se produjo por maduracion de afinidad de Joe 9 de tipo silvestre por mutagenesis por PCR de la CDR3 (como se describe en el Ejemplo 1). Y61 tuvo una especificidad/afinidad de union mejorada determinada por resonancia de plasmon superficial y por ensayos de neutralizacion in v itro. Las CDR3 de cadena pesada y ligera de Y61 se muestran en las SEC ID N°: 17 y 18, respectivamente, las CDR2 de cadena pesada y ligera de Y61 se muestran en SEC ID N°: 19 y 20, respectivamente, y las CDR1 de cadena pesada y ligera de Y61 se muestran en la SEC ID N°: 21 y 22, respectivamente. La VH de Y61 tiene la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 23 y la VL de Y61 tiene la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 24 (estas secuencias tambien se muestran en las Figuras 1A-1D, alineadas con Joe9).

En consecuencia, en otro aspecto, la invencion presenta un anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, que

a) inhibe proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-9 M o menos; b) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 17; y

12

c) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 18.

En una realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 19 y una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 20.

En otra realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 21 y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 22.

En otra realizacion preferida mas, el anticuerpo humano aislado, o una parte de un ion a antigeno del mismo, que comprende la region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 23, y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 24.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo de longitud completa comprende una region constante de cadena pesada, tal como regiones constantes lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA e IgE, y cualquier variante alotipica de las mismas como se describe en Kabat (Kabat, E.A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion,

U.S. Departm ent of H ealth and Human S ervices, Pu blicacion d e NIH N° 91-3242). Pref eriblemente, la re gion constante de cadena pesada de anticuerpo es una region constante de cadena pesada de lgG1. Como alternativa, la parte de anticuerpo puede ser un fragmento Fab, un fragmento F(ab'2) o un fragmento Fv de cadena sencilla.

Las modificaciones de restos individuales de Y61 condujeron a la produccion de un panel de anticuerpos mostrado en l as F iguras 2A-2H. L a e specificidad/afinidad d e u nion de c ada anticuerpo se d etermino p or re sonancia de plasmon superficial y/o por ensayo de neutralizacion in vitro.

a) inhibe proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-9 M o menos; b) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 404-SEC ID N°; 469; y c) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 534-SEC ID N°: 579.

En una realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 3 35-SEC ID N°: 40 3; y una CD R2 de cad ena l igera que comprende l a secu encia de am inoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 506-SEC ID N°: 533.

En otra realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 2 88-SEC ID N°: 33 4; y una CD R1 de cad ena l igera que comprende l a secu encia de am inoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 470-SEC ID N°: 505.

En ciertas rea lizaciones, el anticu erpo de long itud completa q ue co mprende un a region const ante de cad ena pesada, tal como regiones constantes lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA e IgE, y cualquier variante alotipica de las mismas como se describe en Kabat (Kabat, E.A., et al . (1991) S equences of Prote ins of Immunol ogical Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health a nd Human Services, Publicacion de NIH N° 91-3242). Preferiblemente, la region constante de cadena pesada de anticuerpo es una region constante de cadena pesada lgG1. Como alternativa, la parte de anticuerpo puede ser un fragmento Fab, un fragmento F(ab'2) o un fragmento Fv de cadena sencilla.

Se pr odujo u n a nticuerpo neutralizante, recombinante particularmente pr eferido de l a i nvencion, J69 5, p or mutagenesis dirigida restos de aminoacidos de hipermutacion yde contacto de anticuerpo Y61 (vease Ejemplo 2 y seccion III posteriormente). J695 difiere de Y61 por una s ustitucion de Gly a T yr en Y61 en la pos icion 50 de la CDR2 de cadena ligera y por una sustitucion de Gly a Tyr en la posicion 94 de la CDR3 de cadena ligera. Las CDR3 de cadena pesada y ligera de J695 se muestran en SEC ID N°: 25 y 26, respectivamente, las CDR2 de cadena pesada y ligera de J695 se muestran en SEC ID N°: 27 y 28, respectivamente, y las CDR1 de cadena pesada y ligera d e J69 5 se muestran en SEC ID N °: 29 y 3 0, re spectivamente. La VH d e J6 95 tie ne l a se cuencia d e aminoacidos de SEC ID N°: 31 y la VL de J695 tiene la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32 (estas secuencias tambien se muestran en las Figuras 1A-1D, alineadas con Joe9).

13

a) inhibe proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-9 M o menos; b) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 25; y c) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 26.

En una realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 27 y una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 28.

En otra realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 29 y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 30.

En otra realizacion preferida mas, el anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, tiene una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 31, y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32.

Pueden realizarse mutaciones adicionales en las secuencias consenso preferidas para CDR3, CDR2 y CDR1 de anticuerpos en el linaje de Joe 9 a J695, o del linaje Y61 a J695, para proporcionar anticuerpos anti IL-12 adicionales de la invencion. T ales m etodos de mo dificacion p ueden rea lizarse usa ndo tecn icas d e biologia mol ecular convencionales, tales como por mutagenesis por PCR, direccion de restos de ami noacidos de hipermutacion o contacto individual en las CDR de cadena ligera y/o cadenapesada, seguido de analisis cinetico y funcional de los anticuerpos modificados como se describen en este documento (por ejemplo, ensayos de neutralizacion descritos en el Ejemplo 3, y por analisis de BIAcore, como se describe en el Ejemplo 5).

En consecuencia, la descripcion proporciona un anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, que

a) inhibe proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-6 M o menos; b) comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 1, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 3 y una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 5, o un mutante de las mismas que tiene una o mas sustituciones de aminoacidos en una posicion de mutagenesis selectiva preferida o una posicion de hipermutacion, en la que dicho mutante tiene una velocidad koff no mas de 10 vec es mayor que el anticuerpo que comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 1, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 3, y una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 5; y c) comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 2, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 4 y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 6, o un mutante de las mismas que tiene una

o mas sustituciones de aminoacidos en una posicion de mutagenesis selectiva preferida o una posicion de hipermutacion, en la que dicho mutante tiene una velocidad koff no mas de 10 vec es mayor que el anticuerpo que comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 2, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 4, y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 6.

En otro aspecto la invencion presenta un anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, que

a) inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-9 M o menos; b) comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 9, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 11 y una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 13, o un mutante d e las mismas que tiene una o mas sustituciones de aminoacidos en una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion

14

de contacto o una posicion de hipermutacion, en las que dicho mutante tiene una velocidad koff no mas de 10 veces mayor que el anticuerpo que comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 9, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 11, y una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 13; y c) comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 10, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 12 y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 14, o un mutante de las mismas que tiene una o mas sustituciones de aminoacidos en una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o una posicion de hipermutacion, en las que dicho mutante tiene una velocidad koff no mas de 10 veces mayor q ue el anticu erpo q ue com prende una CDR3 d e cad ena li gera qu e com prende la secu encia de aminoacidos de SEC ID N°: 10, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 12, y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 14.

Un experto habitual en la materia tambien apreciara que pueden realizarse mutaciones adicionales a las regi ones CDR de un anticuerpo de la invencion, por ejemplo en Y61 o en J 695, para proporcionar anticuerpos anti IL-12 adicionales de la invencion. Tales metodos de modificacion pueden realizarse usando tecnicas de biologia molecular convencionales, como se ha descrito anteriormente. El analisis funcionaly cinetico de los anticuerpos modificados puede realizarse como se describe en el Ejemplo 3 y Ejemplo 5, respectivamente. Se muestran modificaciones de restos individuales de Y61 que condujeron a la identificacion de J695 en las Figuras 2A-2H y se describen en el Ejemplo 2.

En consecuencia, en otro aspecto la invencion presenta un anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, que

a) inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-9 M o menos; b) comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 17, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 19 yuna CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 21, o un mutante d e las mismas que tiene una o mas sustituciones de aminoacidos en una posicion de mutagenesis selectiva preferida o una posicion de hipermutacion, en las que dicho mutante tiene una velocidad koff no mas de 10 veces mayor que el anticuerpo que comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 17, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 19, y una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 21; y c) comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 18, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 20 y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 22, o un mutante de las mismas que tiene una o mas sustituciones de aminoacidos en una posicion de mutagenesis selectiva preferida o una posicion de hipermutacion, en las que dicho mutante tiene una tasa koff no mas de 10 veces mayor que el anticuerpo que comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 18, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 20, y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 22.

a) inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-9 M o menos; b) comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 25, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 27 yuna CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 29, o un mutante d e las mismas que tiene una o mas sustituciones de aminoacidos en una posicion de mutagenesis selectiva preferida o una posicion de hipermutacion, en la que dicho mutante tiene una tasa koffno mas de 10 veces m ayor que el anticuerpo que comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 25, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 27, y una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 29; y c) comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 26, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 28 y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 30, o un mutante de las mismas que tiene una o mas sustituciones de aminoacidos en una posicion de mutagenesis selectiva preferida o una posicion de hipermutacion, en la que dicho mutante tiene una velocidad koff no mas de 10 vec es mayor que el anticuerpo que comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 26, una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 28, y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 30.

En otra realizacion mas, la invencion proporciona anticuerpos humanos aislados, o partes de union a antigeno de los mismos, que neutralizan la actividad de IL-12 humana, yal menos una IL-12 de primate adicional seleccionada del grupo que consiste en IL-12 de babuino, IL-12 de titi, IL-12 de chimpance, IL-12 de cynomolgus e IL-12 de rhesus, pero que no neutralizan la actividad de la IL-12 de raton.

II Seleccion de anticuerpos humanos recombinantes

Pueden aislarse a nticuerpos hum anos de la invencion explorando un a bi blioteca d e a nticuerpos combi natoria recombinante, preferiblemente una biblioteca de presentacion de fagos de scFv, preparada usando ADNc de VL y VH humanos preparados a partir de ARNm derivado de linfocitos humanos. Se conocen en la tecnica metodologias para prepara y explorar tales bibliotecas. Ademas de kits disponibles en el mercado para generar bibliotecas de presentacion de fagos (por ejemplo, el Sistema de Anticuerpo de Fago Recombinante de Pharmacia n° de catalogo 27-9400-01; y el kit de presentacion de fagos de Stratagene SurrfApT, n° de catalogo 240612), pueden encontrarse ejemplos de metodos y reactivos particularmente susceptibles de uso en generacion y exploracion de bibliotecas de presentacion d e antic uerpos en, por ej emplo, Kan g et al. Publicacion de PCT N° WO 92/18619; Winter et al. Publicacion de PCT N° WO 92/20791; Breitling et al. Publicacion de PCT N° WO 93/01288; McCafferty et al. Publicacion de PCT N° WO 92/01047; Garrard et al. Publicacion de PCT N° WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al . (1992) PNAS 89: 35763580; Garrad et al. (1991) BiolTechnology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982.

Las bibliotecas de anticuerpo usadas en este metodo son preferiblemente bibliotecas de scFv preparadas a partir de ADNc de VL y VH humanas. Las bibliotecas de anticuerpos scFv se exploran preferiblemente usando IL-12 humana recombinante como el antigeno para seleccionar secuencias decadena pesada y ligera humanas que tienen una actividad de u nion haci a IL-12. Para sel eccionar antic uerpos es pecificos para la s ubunidad p 35 de IL-12 o el heterodimero p70, se realizaron ensayos de exploracion en presencia de exceso de subunidad p40 libre. Las preferencias de subunidad pueden determinarse, por ejemplo, mediante titulacion micro-Friguet, como se describe en le Ejemplo 1.

Una vez que se selecc ionan segme ntos VL y V H hum anos i niciales, se real izan experimentos d e "mezcla y emparejamiento", en los que se exploran diferentes pares de los segmentos VL y VH seleccionados con respecto a union de IL-12, para seleccionar combinaciones de pares VL/VH preferidos (vease Ejemplo 1). Adicionalmente, para mejorar mas la afinidad y/o reducir la constante de velocidad de disociacion para union de hIL-12, los segmentos VL y VH del par o los pares de VL/VH preferidos pueden mutarse de forma aleatoria, preferiblemente dentro de la region CDR3 de VH y/o VL, en un proceso analogo al proceso de mutacion somatica in vivo responsable de maduracion de afinidad d e a nticuerpos dur ante un a resp uesta inmune natural. Esta maduraci on de afin idad in vitro puede conseguirse amplificando regiones VH y VL usando cebadores de PCR complementarios de la CDR3 de VH o CDR3 de VL, respectivamente, habiendose "realizado adiciones" a los cebadores con una mezcla aleatoria de las cuatro bases nucleotidicas en ciertas posiciones de modo que los productos de PCR resultantes codifican segmentos VH y VL en los que se han introducido mutaciones aleatorias en las regiones de CDR3 VH y/o VL. Estos segmentos VH y VL mutados de forma aleatoria pueden volver a seleccionarse y volver a explorarse con respecto a union con hIL-12 y pueden seleccionarse secuencias que muestran alta afinidad y una velocidad de disociacion baja para union de IL

12. La T abla 2 (vease A pendice A) m uestra anticuerpos que pr esentan especificidad/afinidad de union alterada producida como resultado de maduracion de afinidad in vitro.

Despues de seleccion, aislamiento y exploracion de un anticuerpo anti hIL-12 de la invencion a partir de una biblioteca de presentacion de inmunoglobulina recombinante, puede recuperarse el acido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado de la particula o las particulas de fago (por ejemplo, del genoma del fago) y subclonarse en otros vectores de expresion mediante tecnicas de ADN recombinante convencionales. Si se desea, el acido nucleico puede manipularse adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invencion (por ejemplo, unirse a acido nucleico que codifica dominios de inmunoglobulina adicionales, tales como regiones constantes adicionales). Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado explorando una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresion recombinante y se introduce en una celula hospedadora de mamifero, como se describe en mas detalle en la Seccion IV posteriormente.

Se describen en mas detalle metodos para seleccionar anticuerpos de union a IL-12 humana mediante tecnologia de presentacion de fagos, y maduracion de afinidad de anticuerpos seleccionados por mutagenesis aleatoria o dirigida de regiones CDR en el Ejemplo 1.

Como se describe en el Ejemplo 1, la exploracion de bibliotecas de ADNc de VL y VH humanas identifico una serie de anticuerpos anti IL-12, de los que el anticuerpo Joe 9 se selecciono para desarrollo adicional. Una comparacion de la re gion varia ble d e ca dena pes ada de Joe 9 co n las secue ncias de line a g erminal de ca dena pes ada seleccionadas de la base de datos VBASE, revelo que Joe 9 era similar a la secuencia de linea germinal de COS-3. COS-3 pertenece a la familia VH3 de secuencias de linea germinal.

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La familia VH3 es parte del repertorio de linea germinal de VH humana que se agrupa en siete familias, VN1-VH7, basandose en homologia de secuencias de nucleotidos (Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 y Cook et al. (1995) Immunology Today, 16, 237-242). La familia VH3 contiene el mayor numero de miembros y realiza la mayor contribucion al repertorio de linea germinal. Para cualquier secuencia de anticuerpo de linea germinal de VH3 humana dada, la identidad de secuencia de aminoacidos dentro de la familia VH3 completa es alta (Vease por ejemplo, Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798 y Cook et al. (1995) Immunology Today, 16, 237-242). El intervalo de identidad de secuencias de aminoacidos entre dos secuencias VH de linea germinal cualesquiera de la familia VH3 varia de 69 a 98 restos de aproximadamente 100 restos de VH (es dec ir, 69-98% de homologia de secuencia de aminoacidos entre dos secuencias VH de linea germinal cualesquiera). Para la mayoria de los pares de secuencias de linea germinal hay al menos 80 o mas restos de aminoacidos identicos, (es decir, al menos 80% de homologia de secuencias de aminoacidos). El alto grado de homologia de secuencia de aminoacidos entre los miembros de la familia VH3 da como resultado que ciertos restos de aminoacidos esten presentes en sitios clave en las regiones CDR y marco de la cadena de VH. Estos restos de aminoacidos confieren caracteristicas estructurales a las CDR.

Estudios de estructuras de anticuerpos han mostrado que las conformaciones de CDR pueden agruparse en familias de estructuras de CDR canonicas basandose en los restos se aminoacidos clave que ocupan ciertas posiciones en las regiones que ocupa ciertas posiciones en las regiones CDR y marco. En consecuencia, existen conformaciones de CDR locales similares en diferentes anticuerpos que tienen estructuras canonicas con restos de aminoacidos clave identicos (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 y Chothia et al. (1989) Nature, 342, 877-883). Dentro de la familia VH3 hay una conservacion de identidad de restos de aminoacidos en los sitios clave para las estructuras canonicas CDR1 y CDR2 (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 799-817).

El gen de VH de linea germinal de COS-3, es un miembro de la familia VH3 y es una variante del alelo de VH de linea germinal 3-30 (DP-49). COS-3, difie re de l as sec uencias d e a minoacidos de VH Joe9 en solame nte 5 posiciones. El alto grado de homologia de secuencia de aminoacidos entre VH Joe9 y COS-3, y entre VH Joe9 y los otros miembros de la familia de VH3 tambien confiere un alto grado de homologia estructural de CDR (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 22 7, 799-817; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 19 6, 901 -917 y Chothia et al. (1989) Nature, 342, 877-883).

El experto en la materia apreciara que basandose en la alta similitud de secuencia de aminoacidos y de estructura canonica con Joe 9, otros miembros de la familia VH3 tambien podrian usarse para generar anticuerpos que se unen a IL-12 humana. Esto puede realizarse, por ejemplo, seleccionando una VL apropiada por tecnicas de redistribucion de cadenas (Winter et al. (1994) Annual Rev. Immunol., 12,433-55), o mediante el injerto de CDR de un roedor u otro anticuerpo humano incluyendo CDR de anticuerpos de la presente invencion en un armazon de familia VH3.

El rep ertorio de li nea germ inal d e V lambda hum ano se a grupa e n 10 fam ilias b asandose e n homologia d e secuencia de nucleotidos (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol., 264, 220-232). Una comparacion de la region variable de cadena ligera de Joe 9 con las secuencias de linea germinal de cadena ligera seleccionadas de la base de datos VBASE, revelo que Joe 9 era similar a la linea germinal de DPL8 lambda. La VL Joe9 difiere de la secuencia de DPL8 en solamente cuatro posiciones flanqueantes, y es altamente homologa de las secuencias marco conservadas de los otros miembros de la familia VA1. Basandose en la alta homologia de secuencia de aminoacidos y similitud de estructura canonica con Joe 9, tambien pueden usarse otros miembros de la familia VA1 para generar anticuerpos que se unen a IL-12 humana. Esto puede realizarse, por ejemplo, seleccionando una VH apropiada por tecnicas de redistribucion de cadena (Winter et al. mencionado anteriormente, o mediante el injerto de CDR de un roedor u otro anticuerpo humano incluyendo CDR de anticuerpos de la presente invencion en un armazon de familia VA1.

Se pretende que los metodos de la invencion incluyan anticuerpos recombinantes que se unen a hIL-12, que comprende una region variable de cadena pesada derivada de un miembro de la familia VH3 de secuencias de linea germinal, y una region variable de cadena ligera derivada de un miembro de la familia VA1 de las secuencias de linea germinal. Ademas, el experto en la materia apreciara que cualquier miembro de la secuencia de cadena pesada de la familia VH3 puede combinarse con cualquier miembro de la secuencia de cadena ligera de la familia VA1.

Los e xpertos en l a mater ia tambie n a preciaran q ue pueden e xistir p olimorfismos d e secu encia de ADN que conduzcan a cambios en las secuencias de aminoacidos de la linea germinal dentro de una poblacion (por ejemplo, la poblacion humana). Tal polimorfismo genetico en las secuencias de linea germinal puede existir entre individuos dentro de una poblacion debido a variacion alelica natural. Tales variaciones alelicas naturales pueden dar como resultado tipicamente varianza de 1-5% en las secuencia de nucleotidos del gen. Se pretende que todas y cada una de tales variaciones de nucleotidos y polinucleotidos y polimorfismos de aminoacidos resultantes en secuencias de linea germinal que son el resultado de variacion alelica natural esten dentro del alcance de la invencion.

En consecuencia, en un aspecto, la divulgacion proporciona un anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, que tiene las siguientes caracteristicas:

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a) que se une a IL-12 humana y se disociade IL-12 humana con una constante de velocidad Koff de 0,1 s -1 o menos, como se determina por resonancia de plasmon superficial, o que inhibe proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de proliferacion de blastos de fitohemaglutinina in vitr o (ensayo de PHA) con una CI50 de 1 x 10-6M o menos. b) tiene una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de un miembro de la familia de linea germinal VH3, en la q ue la region variable de cadena pesada tiene una mutacion en un contacto o posicion de hipermutacion con un resto de aminoacido potenciador de actividad. c) tiene una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de un miembro de la familia de linea germinal VA1, en la que la region variable de cadena ligera tiene una mutacion en una p osicion de mutag enesis selectiv a pr eferida, c ontacto o posici on de hip ermutacion co n un r esto de aminoacido potenciador de actividad.

En una realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o union de antigeno, tiene mutacion en la CDR3 de cadena pesada.

En otra realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o union a antigeno, tiene mutacion en la CDR3 de cadena ligera.

En otra realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o union a antigeno, tiene mutacion en la CDR2 de cadena pesada.

En otra realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o union a antigeno, tiene mutacion en la CDR2 de cadena ligera.

En otra realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o union a antigeno, tiene mutacion en la CDR1 de cadena pesada.

En otra realizacion preferida, el anticuerpo humano aislado, o union a antigeno, tiene mutacion en la CDR1 de cadena ligera.

Un experto habitual en la materia apreciara que basandose en la alta similitud de secuencia de aminoacidos entre los miembros de la familia de linea germinal VH3, o entre miembros de la familia de linea germinal VA1 de cadena ligera, que las mutaciones de las secuencias de linea germinal pueden proporcionar anticuerpos adicionales que se unen a IL-12 humana. La Tabla 1 (vease Apendice A) muestra las secuencias de linea germinal de los miembros de la familia VH3 y demuestra la homologia de secuencia significativa dentro de los miembros de la familia. Tambien se muestran en la Tabla 1 las secuencias de linea germinal para miembros de la familia VA1. Las secuencias de cadena pesada y ligera de Joe 9 se proporcionan como una comparacion. Pueden realizarse mutaciones de las secuencias de linea germinal de miembros de la familia VH3 o VA1, por ejemplo, en las mismas posiciones de aminoacidos que las realizadas en los anticuerpos de la invencion (por ejemplo mutaciones en Joe 9). Las modificaciones pueden realizarse usando tecnicas de biologia molecular convencionales, tales como por mutagenesis por PCR, direccion de restos de aminoacidos individuales a las secuencias de linea germinal, seguido de analisis cinetico y funcional de los anticuerpos modificados como se describen en este documento (por ejemplo, ensayos de neutralizacion descritos en el Ejemplo 3 y por analisis de BIAcore, como se describe en el Ejemplo 5).

En consecuencia, en un aspecto, la invencion presenta anticuerpo humano aislado o una parte de union a antigeno del mismo, que tiene las siguientes caracteristicas:

a) tiene una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 595-66 7, en la que l a region variable de cadena pesada tiene una mutacion en una posicion de mutagenesis selectiva preferida, contacto o posicion de hipermutacion con un resto de aminoacido potenciador de actividad. b) tiene una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 669-675, en la que la region variable de cadena ligera tiene una mutacion en una p osicion de mutag enesis selectiv a pr eferida, pos icion de co ntacto o hip ermutacion co n un r esto de aminoacido potenciador de actividad.

Un experto habitual en la materia apreciara que basandose en la alta similitud de secuencia de aminoacidos entre secuencia de linea germinal de cadena pesada Joe 9 y COS-3, y entre secuencia de linea germinal lambda Joe 9 y DPL8, que otras mutaciones a las regi ones CDR de est as secuencias de linea germinal pueden proporcionar anticuerpos adicionales que se unen a IL-12 hum ana. Tales metodos de modificacion pueden realizarse usando tecnicas de biologia molecular convencionales como se han descrito anteriormente.

En consecuencia, en un aspecto, la descripcion proporciona anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, que tiene las siguientes caracteristicas:

a) que se une a IL-12 humana y se disocia de IL-12 humana con una velocidad Koffconstante de 0,1 s-1 o

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menos, como se determina por resonancia de plasmon superficial, o que inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de proliferacion de blastos por fitohemaglutinina in vitro (ensayo PHA) con una CI50 de 1 x 10-6M o menos. b) tiene una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de linea germinal COS-3, en la que la region variable de cadena pesada tiene una mutacion en una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion con un resto de aminoacido potenciador de actividad. c) tiene una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de linea germinal DPL8, en la que la region variable de cadena ligera tiene una mutacion en una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion con un resto de aminoacido potenciador de actividad.

Debido a que ciertos restos de aminoacidos ocupan sitios clave en las regiones CDR y marco en la region variable de cadena ligera y pesada, se confieren caracteristicas estructurales en estas regiones. En particular, las regiones CDR2 y CDR1 se someten a clasificaciones estructurales canonicas. Puesto que hay un alto grado de homologia de secuencia de aminoacidos entre miembros de la famili a, estas caracteristicas canonicas estan presentes entre miembros de la familia. El experto en la materia apreciara que modificaciones en los restos de ami noacidos que confieren estas estructuras canonicas producirian anticuerpos adicionales que se unen a IL-12. Las modificaciones pueden realizarse usando tecnicas de biologia molecular convencionales como se ha descrito anteriormente.

En consecuencia, en otro aspecto, la descripcion proporciona un anticuerpo humano aislado o una parte de union a antigeno del mismo, que tiene las siguientes caracteristicas:

a) que se une a IL-12 humana y se disociade IL-12 humana con una constante de velocidad Koff de 0,1 s -1 o menos, como se determina por resonancia de plasmon superficial, o que inhibe proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de proliferacion de blastos por fitohemaglutinina in vitro (ensayo PHA) con una CI50 de 1 x 10-6M o menos. b) tiene una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de un miembro de la familia de linea germinal VH3, en la que la region variable de cadena pesada comprende una CDR2 que es estructuralmente similar a CDR2 de otros miembros de la familia de linea germinal VH3, y una CDR1 que es estructuralmente similar a CDR1 de otros miembros de la familia de linea germinal VH3,y en la que la re gion vari able de cadena pes ada tie ne un a mutacion en una p osicion de m utagenesis se lectiva preferida, contacto o posicion de hipermutacion con un resto de aminoacido potenciador de actividad. c) tiene una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de un miembro de la familia de linea germinal VA1, en la que la region variable de cadena ligera comprende una CDR2 que es estructuralmente similar a CDR2 de otros miembros de la familia de linea germinal VA1, y una CDR1 que es estructuralmente similar a CDR1 de otros miembros de la familia de linea germinal VA1, y en la que la region variable de cadena ligera tiene una mutacion en una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion con un resto de aminoacido potenciador de actividad.

Los anticuerpos humanos recombinantes de la invencion tienen regiones variables y constantes que son homologas de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humanas seleccionadas de la base de datos VBASE. L as mutaciones de los anticuerpos h umanos recomb inantes (por ejemplo, me diante mutage nesis ale atoria o mutagenesis por PCR) dan como resultado aminoacidos que no se codifican por secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. Ademas, bibliotecas de anticuerpos recombinantes que derivaron de donantes humanos contendran secuencias de anticuerpo que diferian de sus secuencias de linea germinal correspondientes debido al proceso normal de mutacion somatica que se produce durante el desarrollo de linfocitos B. Deberia observarse que si las secuencias de "linea germinal" obtenidas por amplificacion por PCR codifican diferencias de aminoacidos en las regiones marco de la verdadera configuracion de linea germinal (es decir, diferencias en la secuencia amplificada en comparacion con la verdadera secuencia de linea germinal), puede ser deseable cambiar estas diferencias de aminoacidos de vu elta a l as verd aderas secue ncias de linea germinal (es decir "retromutac ion" d e restos flanqueantes a la configuracion de linea germinal). Por lo tanto, la presente invencion puede incluir opcionalmente una etapa de retromutacion. Para hacer esto, las secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera codificadas por la linea germinal (como se encuentran por ejemplo en la base de datos VBASE) se compar an en primer lugar con las secuencias de aminoacidos marco de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina mutada para identificar restos de aminoacidos en la secuencia marco de inmunoglobulina mutada que difieren de las secuencias de linea germinal mas cercanas. Despues, los nucleotidos apropiados de la secuencia de inmunoglobulina mutada se mutan de nuevo para corresponder a la secu encia de linea germinal, usando el codigo genetico para determinar que cambios de nucleotidos deberian realizarse. La mutagenesis de la secuencia marco de inmunoglobulina mutada se lleva a cabo por metodos convencionales, tales como mutagenesis mediada por PCR (en la qu e los nucleotidos mutados se incorporan en los cebadores de PCR de modo que el producto de PCR contenga las mutaciones) o mutagenesis dirigida. El pa pel de ca da aminoacido id entificado com o ca ndidato p ara r etromutacion de beria investigarse con respecto a un p apel directo o in directo en u nion de antigenos y cualquier aminoacido que se descubra despues de la mutacion que afecta a cualquiera caracteristica deseable del anticuerpo humano no deberia incluirse en el anticuerpo humano final; como ejemplo, los aminoacidos potenciadores de actividad identificados por enfoque de mutagenesis selectiva no se someteran a retromutacion. Los ensayos para determinar las caracteristicas del anticuerpo resultante de mutagenesis pueden incluirELISA, ELISA competitiva, ensayos de neutralizacion in vitro e in vivo y/o (vease por ejemplo el Ejemplo 3) inmunohistoquimica con secciones tisulares de diversas fuentes

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(incluyendo humana, primate y/u otras especies).

Para minimizar el numero de aminoacidos que se someten a retromutacion las posiciones de aminoacidos que se descubre que son diferentesdelasecuencia de linea germinal mas cercana pero identicas a losaminoacidos correspondientes en u na s egunda sec uencia de linea g erminal p ueden perma necer, siempre que la seg unda secuencia de linea germinal sea identica y colineal a la secuencia del anticuerpo humano de la invencion para al menos 10, preferiblemente 12 aminoacidos, en ambos l ados del aminoacidos en cuestion. Esto aseguraria que cualquier epitopo peptidico presentado al sistema inmune por celulas presentadoras de antigenos profesionales en un sujeto tratado con el anticuerpo humano de la invencion no serian ajenas sino identicas a un autoantigeno, es decir la inm unoglobulina co dificada por esa se gunda s ecuencia d e l inea germinal. La retromuta cion pu ede producirse en cual quier eta pa d e o ptimizacion de anti cuerpos; prefe riblemente, l a retromutaci on se pro duce directamente antes o despues del enfoque de mutagenesis selectiva. Mas preferiblemente, la retromutacion se produce directamente antes del enfoque de mutagenesis selectiva.

III. Modificaciones de posiciones de mutagenesis selectiva preferidas, posiciones de contacto y/o hipermutacion

Tipicamente, puede l levarse a cab o sel eccion de a nticuerpos con af inidades mejoradas usa ndo metodos de presentacion de fagos, como se ha descrito en la seccion II anterior. Esto puede conseguirse mutando de forma aleatoria com binaciones de restos de C DR y generando b ibliotecas gra ndes q ue co ntengan anticuerpos d e diferentes sec uencias. Sin embargo, par a que est os met odos de se leccion funci onen, la re accion antic uerpoantigeno debe tender al equilibrio para permitir, a lo largo del tiempo, union preferente de anticuerpos de mayor afinidad con el antigeno. Las condiciones de seleccion quepermitirian que se estableciera equilibrio no pudieron determinarse (supuestamente debido a interacciones no especificas adicionales entre el antigeno y la particula de fago) cuando se usaron metodos de presentacion de fagos para mejorar la afinidad de anticuerpos anti IL-12 seleccionados, tras obte ner un c ierto nivel d e afi nidad cons eguida (es d ecir, la del antic uerpo Y6 1). E n consecuencia, los anticuerpos con afinidades aun mayores no pudieron seleccionarse por metodos de presentacion de fagos. Por lo tanto, para al menos ciertos anticuerpos o antigenos, los metodos de presentacion de fagos son limitantes en su cap acidad para se leccionar anticuerpos con u na especificidad/afinidad d e un ion alt amente mejorada. E n consecuencia, se est ablecio un m etodo d enominado En foque de Mut agenesis Se lectiva q ue no requiere m aduracion de afinidad de pr esentacion de fa gos d e antic uerpos, p ara s uperar esta l imitacion y s e proporciona por la invencion. Aunque este enfoque de mutagenesis selectiva se desarrollo para superar limitaciones usando el sistema de presentacion de fagos, deberia observarse que este metodo tambien puede usarse con el sistema de presentacion de fagos. Ademas, el enfoque de mutagenesis selectiva puede usarse para mejorar la actividad de cualquier anticuerpo.

Para mejorar la actividad (por ejemplo, afinidad o actividad neutralizadora) de un anticuerpo, idealmente se mutaria cada posicion de CDR en las cadenas tanto pesadas como ligeras a cada otro resto de aminoacido posible. Sin embargo, puesto que hay, de media, 70 posiciones deCDR dentro de un anticuerpo, un enfoque tal consumiria mucho tiempo y requeriria mucho trabajo. En consecuencia, el metodo de la invencion permite mejorar la actividad del anticuerpo mutando solamente ciertos restos seleccionados dentro de las CDR de cadena pesada y/o ligera. Ademas, el metodo de la invencion permite mejorar la actividad del anticuerpo sin afectar a otras propiedades deseables del anticuerpo.

La determinacion de que restos de aminoacidos de una region variable de anticuerpo estan en contacto con un antigeno no puede predecirse de forma precisa basandose en secuencia primaria o sus posiciones dentro de la region variable. Sin embargo, alineamientos de secuencias de anticuerpos con diferentes especificidades realizadas por Kabat et al. han identificado las CDR como regiones locales dentro de las regiones variables que difieren significativamente entre anticuerpos (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-393, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion de NIH N° 91-3242). Estudios estructurales han mostrado que la superficie de union a antigeno se forma por restos de aminoacidos presentes en las CDR. Tambien se sabe que otros restos de aminoacidos fuera de las CDR desempefan papeles estructurales o estan implicadosdirectamente en union de antigenos. Por lo tanto, para cada par de antigeno-anticuerpo, pueden ser importantes restos de aminoacidos dentro y fuera de las CDR.

Los estudios de alineamiento de secuencias por Tomlison et al. identificaron varias posiciones en la CDR1 y CDR2 de cadena pesada y ligera, y en una parte de la C DR3 de cadena kappa que son sitios frecuentes de mutacion somatica (Tomlison et al (1996) J. Mol. Biol. 256: 813-817). En particular, se identificaron las posiciones H31, H31B, H33, H33B, H52B, H56, H58, L30, L31, L31A, L50, L53, L91, L92, L93 y L94 como sitios frecuentesde mutacion somatica. Sin embargo, este analisis excluye las importantes regiones CDR3 de cadena pesada, y secciones de la CDR3 de cadena ligera que se sabe que quedan en el centro de un sitio de union a anticuerpos, y potencialmente proporcionan i nteracciones i mportantes co n un antig eno. Ademas, T omlison et al. proponen qu e la divers idad somatica por sisola no predice necesariamente un papel de unaminoacido especificoen union de antigenos, y sugieren r estos de ami noacidos co nservados q ue e ntran en c ontacto con el antigeno, y d iversos restos d e aminoacidos que no entran en contacto con el antigeno. Esta conclusion se apoya adicionalmente por estudios mutacionales sobre el papel de mutaciones somaticas a la afinidad de anticuerpos (Sharon, (1990), PNAS, 87: 48147). Se reemplazaron simultaneamente diecinueve mutaciones somaticas en un a nticuerpo anti-p-azofenilarsonato

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(Ars) de alta af inidad con sus restos de line a germinal correspondientes, generando una version de linea germinal del anticuerpo anti Ars qu e tenia una p erdida d e d oscientas v eces de la activi dad. La afinidad c ompleta d el anticuerpo a nti Ars p udo re cuperarse r estaurando sol amente tres de las di ecinueve mut aciones somatic as, demostrando que puede permitirse muchas mutacionessomaticas que no contribuyen a la actividad de union a antigenos.

El resultado puede explicarse en parte por la naturaleza de la diversidad de anticuerpos en si misma. Los linfocitos B inmaduros pueden producir inicialmente anticuerpos de baja afinidad que reconocen varios antigenos propios o no. Ademas, los anticuerpos pueden experimentar en el transcurso de maduracion de afinidad variaciones de secuencia que pueden provocar autorreactividad. La hipermutacion de tales anticuerpos de baja afinidad puede servir para suprimir autorreactividad ("seleccion negativa") y aumentar la afinidad por el antigeno ajeno. Por lo tanto, el analisis de datos primarios y estructurales de un gran numero de anticuerpos no proporciona un metodo para predecir (1) el papel de sitios de hipermutacion somatica en el proceso de maduracion de afinidad frente al proceso de reduccion de afinidad para antigenos no deseados, o (2) como contribuye un aminoacido dado a las propiedades de un par de antigeno-anticuerpo especifico.

Otros intentos para abordar el papel de restos de aminoacidos especificos en reconocimiento de antigenos se realizaron analizando varias estructuras cristalinas de complejos antigeno-anticuerpo (MacCallum et al . (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745). Se indico el papel potencial de posiciones localizadas dentro y fuera de las CDR. Las posiciones en CDR implicadas en union de antigenos en mas de 10 de 26 estructuras analizadas incluyeron H31, H33, H50, H52, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98 y H100 en la cadena pesada y L30A, L32, L91, L92, L93, L94, L96 en la cadena ligera. Sin embargo, los autores observaron que la prediccion de contactos de antige no usando estos y otros datos estructurales puede sobre e infrapredecir posiciones de contacto, lo que conduce a la especulacion de que puede tener que aplicarse una estrategia diferente a diferentes antigenos.

Pini et al. describen seleccion aleatoria de multiples restos en secuencias de CDR de anticuerpo en una biblioteca de presentacion de fagos grande para aumentar rapidamente la afinidad de anticuerpos (Pini et al . (1998) J. Biol Chem. 27 3: 21769-21776). Sin embar go, los anticu erpos de a lta afinidad a nalizados por Pi ni et al . T uvieron mutaciones en un total de ocho posiciones, y un analisis reductivo de que cambios se requieren de forma absoluta para mejorar la afinidad del anticuerpo se hace poco practico debido al gran numero de posibles combinaciones para ensayar para el numero mas pequefo de aminoacidos requerido.

Ademas, la seleccion aleatoria de multiples restos puede no conservar necesariamente otras propiedades deseadas del anticuerpo. Las propiedades o caracteristicas deseables de un anticuerpo se reconocen en la tecnica e incluyen por ej emplo, conserv acion de reacti vidad no cruzad a, por ej emplo, con otras prot einas o teji dos human os y conservacion de secuencias de anticuerpo que estan cerca de la mejora de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal hum ana de p otencia d e neutralizacion. Otras pro piedades o car acteristicas d eseables incl uyen l a capacidad de conservar reactividad cruzada de especies, capacidad para conservar especificidad de epitopos y capacidad para co nservar a ltos niv eles d e e xpresion de protein a en celulas de ma mifero. Las pr opiedades o caracteristicas deseables pueden observarse o medirse usando tecnicas reconocidas en la materia incluyendo pero sin limitacion ELISA, ELISA competitivo, ensayo de neutralizacion in vitro e in vivo (vease por ejemplo, Ejemplo 3), inmunohistoquimica con secciones tisulares de diferentes fuentes incluyendo fuentes humanas, de primate u otras segun se requiera, y estudios para expresion en celulas de mamifero usando expresion transitoria o expresion estable.

Ademas, el metodo de Pini et al . puede introducir mas cambios que el numero minimo requerido de hecho para mejorar la afinidad y puede conducir a que los anticuerpos desencadenen formacion de anticuerpo anti humano (HAMA) en sujetos humanos. Ademas, como se analiza en otro lugar, la presentacion de fagos como se demuestra aqui, u otro metodo relacionado incluy endo presentacion de ribosomas puede no actuar de forma apropiada tras alcanzar ciertas afinidades entre anticuerpo yantigeno y las condiciones requeridas para alcanzar el equilibrio pueden no establecerse e n un m arco de tiem po ra zonable debido a i nteracciones a dicionales incl uyendo interacciones con otros componentes de fagos o ribosomas y el antigeno.

El experto habitual en la materia puede encontrar informacion cientifica interesante sobre el origen de la diversidad de anticuerpos a partir de las ensefanzas de las referencias analizadas anteriormente. La presente invencion, sin embargo, pr oporciona un m etodo par a aumentar l a afi nidad d e a nticuerpo de un par de antig eno-anticuerpo especifico conservando a la vez otros elementos relevantes o caracteristicas deseables del anticuerpo. Esto es especialmente imp ortante c uando se c onsidera l a c onveniencia de transmitir una multitud de caracteristic as diferentes en un anticuerpo especifico incluyendo union de antigenos.

Si el anticuerpo de partida tiene propiedades o caracteristicas deseables que necesitan conservarse, un enfoque de mutagenesis selectiva puede ser la mejor estrategia paraconservar estas propiedades deseables mejorando a la vez la actividad del anticuerpo. Por ejemplo, en la mutagenesis de Y61, el objetivo era aumentar la afinidad por hIL12, y m ejorar la pot encia d e ne utralizacion de l antic uerpo co nservando a l a vez propiedades d eseadas. L as propiedades deseadas de Y61 incluian (1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos huma nos, (2) conse rvacion de e specificidad de epitop os fina, es decir reconocer u n epitopo p 40

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preferiblemente en el contexto del heterodimero p70 (p40/p35), evitando de este modo la interferencia de union de p40 soluble libre; y (3) generacion de un anticuerpo con secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera que estaban tan cerca como fuera posible de sus secuencias de inmunoglobulina de linea germinal respectivas.

En una realizacion, el metodo de la invencion proporciona un enfoque de mutagenesis selectiva como una estrategia para c onservar las pro piedades o c aracteristicas dese ables del anticuerpo mej orando a l a vez la afin idad y/o potencia de neutralizacion. La expresion "enfoque de mutagenesis selectiva" es como se ha definido anteriormente e incluye un metodo para mutar individualmente restos de aminoacidos seleccionados. Los restos de aminoacidos para m utar pueden primero sel eccionarse d e p osiciones de muta genesis se lectivas pref eridas, desp ues de posiciones de contacto, y despues de po siciones de hipermutacion. La posic ion seleccionada individual pue de mutarse a al menos otros dos restos d e amin oacidos y s e d etermina el efecto de la mutaci on tanto e n l as propiedades deseadas del anticuerpo como en la mejora de la actividad del anticuerpo.

El enfoque de Mutagenesis Selectiva comprende las etapas de:

seleccionar posiciones candidatas en el orden 1) posiciones de mutagenesis selectiva preferidas; 2) posiciones de contacto; 3) posiciones de hipermutacion y clasificar las posiciones basandose en la localizacion de la posicion dentro de las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo (CDR 3 preferida frente a CDR2 preferida frente a CDR1); mutar individualmente posiciones de mutagenesis selectiva preferidas candidatas, posiciones de hipermutacion y/o contacto en el orden de clasificacion, a todos los otros restos de aminoacidos posibles y analizar el efecto de las mutaci ones indiv iduales en la activ idad de l antic uerpo p ara d eterminar los r estos de am inoacidos potenciadores de actividad; si es necesario, realizar combinaciones por etapas de los restos de aminoacidos potenciadores de actividad individuales y analizar el efecto de las diversas combinaciones sobre la actividad de los anticuerpos; seleccionar anticuerpos m utantes co n r estos de ami noacidos pote nciadores de acti vidad y cl asificar l os a nticuerpos mutantes basandose en la localizacion e identidad delas sustituciones de aminoacidos con respecto a su potencial inmunogenico. Se proporciona la clasificacion mas alta a anticuerpos mutantes que comprenden una secuencia de aminoacidos que es casi identica a una secuencia de region variable que se describe en una base de datos de linea germinal, o tiene una secuenciade aminoacidos que es comparable a otros anticuerpos humanos. Se prop orciona clasificacion in ferior a a nticuerpos mut antes que co ntienen u na sustit ucion d e aminoacidos q ue se encuentra pocas v eces en s ecuencias d e line a germinal o las secue ncias de otros anticuerpos h umanos. L a c lasificacion m as b aja se d a a antic uerpos muta ntes con una susti tucion d e aminoacidos que no se ha encontrado en una secuencia de linea germinal o la secuencia de otro anticuerpo humano. Como se ha expuesto anteriormente, los anticuerpos mutantes que comprenden al menos un resto de aminoacido potenciador de actividad localizadoenCDR3 se prefieren frente a CDR2que se prefiere frente a CDR1. Las CDR de las regiones variables de cadena pesada se prefieren frente a las de la region variable de cadena ligera.

Los anticuerpos mutantes pueden tambien estudiarse con respecto a mejora de la actividad, por ejemplo cuando se comparan con su antic uerpo parental correspondiente. La mejora de la actividad del anticuerpo mutante puede determinarse, por ejemplo, por ensayos de neutralizacion, o especificidad/afinidad de u nion p or ana lisis de resonancia de plasmon superficial (vease Ejemplo 3). Preferiblemente, la mejora de la actividad puede ser al menos 2-20 veces mayor que el anticuerpo parental. La mejora de actividad puede ser al menos "x1" a "x2" veces mayor que el anticuerpo parental en la que "x1" y "x2" son numeros enteros entre e incluyendo de 2 a 20, incluyendo intervalos dentro del intervalo indicado, por ejemplo 2-15, por ejemplo 5-10.

Los anticuerpos mutantes con los restos de aminoacidos potenciadores de actividad tambien pueden estudiarse para determinar si al menos una propiedad deseable se ha conservado despues de la mutacion. Por ejemplo, ensayando anticuerpos anti-hIL-12 con respecto a (1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o t ejidos h umanos, (2) cons ervacion de rec onocimiento de epitopos, es d ecir reconocimiento de un epitopo p40 preferiblemente en el contexto del heterodimero p70 (p40/p35), evitando de este modo interferencia de union de p40 soluble libre; y (3) generacion de anticuerpos con secuencias de aminoacidos de cadena pesada y ligera q ue est aban tan cerc a como fuer a posib le d e s us secue ncias de inm unoglobulina de linea germ inal respectivas, y determinando cual seria menos probableque indujera una respuesta inmune humana basandose en el num ero de diferenc ias d e la secu encia germi nal. L as mismas o bservaciones pue den real izarse sobr e un anticuerpo que tenga mas de un resto de aminoacido potenciado para actividad, por ejemplo al menos dos o al menos tres restos de aminoacidos potenciadores de actividad, para determinar si se ha producido retencion de la propiedad o caracteristica deseable.

Se describe posteriormente un ejemplo del uso de un "enfoque de mutagenesis selectivo", en la mutagenesis de Y61. Las mutaciones individuales H31 S-E, L50-Y, o L94G-Y mejoraron cada una la actividad de neutralizacion del anticuerpo. Sin embargo, cuando se ensayaron clones de combinacion, la actividad del clon combinado H31 S-E + L50-Y + L94G-Y no fue mejor que L50-Y + L94G-Y (J695). Por lo tanto, cambiar el resto de aminoacido de linea germinal Ser a Glu en la posicion 31 de CDR1 fue innecesario para la actividad mejorada de J695 frente a Y61. El enfoque de mutagenesis selectiva por lo tanto identifico el numero minimo de cambios que contribuian a la

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actividad fi nal, red uciendo d e este mo do el potencial inmunogenico del anticu erpo final y conservando otra s propiedades deseadas del anticuerpo.

El ADN aislado que codifica la VH y VL producidas por el enfoque de mutagenesis seleccionada puede convertirse a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento Fab como a un gen scFV, como se describe en la seccio n IV. Para e xpresion d e re giones VH y V L pr oducidas por el e nfoque de mutag enesis seleccionada, los vectores de expresion que codifican lacadena pesada y ligera pueden transfectarse a diversas celulas hospedadoras como se describe en detalle en la seccion IV. Las celulas hospedadoras preferidas incluyen celulas hospedadoras procariotas, por ejemplo, E coli, o celulas hospedadoras eucariotas, por ejemplo, celulas de levadura, por ejemplo, S. cerevisiae. Las celulas hospedadoras eucariotas mas preferidas son celulas hospedadoras de mamifero, descritas en detalle en la seccion IV.

El enfoque de mutagenesis selectiva proporciona un metodo para producir anticuerpos con actividades mejoradas sin maduracion de afinidad anterior del anticuerpo por otro medio. El enfoque de mutagenesis selectiva proporciona un metodo para producir anticuerpos con afinidades mejoradas que se han sometido a retromutaciones. El enfoque de mutagenesis selectiva t ambien proporciona un m etodo para mejorar la activi dad de a nticuerpos de afi nidad madurada.

El e xperto en la m ateria re conocera que el enfoque de muta genesis sel ectiva puede usarse e n tecnic as d e manipulacion de anticuerpos convencionales conocidas en la mater ia. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos con injertos de CDR, anticuerpos quimericos, fragmentos scFV, fragmentos Fab de un anticuerpo de longitud completa y anticuerpos humanos de otras fuentes, por ejemplo, ratones transgenicos.

El anal isis mu tacional a gra n escal a rapi do de antic uerpos incl uye transcri pcion y traduccion in vitro usando tecnologia de presentacion de ribosomas (vease por ejemplo, Hanes et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 49374942; Dall Acqua et al., (1998) Curr. Opin. Struc. Biol. 8: 443-450; He et al., (1997) Nucleic Acid Res. 25: 51325134), y Patentes de Estados Unidos N° 5.643.768 y 5.658.754 expedidas a Kawasaki. El enfoque de mutagenesis selectiva tamb ien pro porciona u n m etodo par a producir anticuerpos con activid ades mejoradas que pueden seleccionarse usando tecnicas de presentacion de ribosomas.

En los meto dos de l a inve ncion, los anti cuerpos o par te de un ion a antigen o de los mismos s e modific an adicionalmente alterando posiciones individuales en las CDR de la H CVR y/o LCVR. Aunque estas modificaciones pueden rea lizarse en anticuerpos pr esentados e n fag os, el meto do es ventaj oso porque puede r ealizarse co n anticuerpos que se expresan en otros tipos de sistemas hospedadores, tales como sistemas de expresion de celulas bacterianas, d e leva dura o de mamifero. Las p osiciones indiv iduales dentro d e la s CDR sel eccionadas para modificacion se basan en que las posiciones son un contacto y/o posicion de hipermutacion.

Se muestran posiciones de hipermutacion y posiciones de contacto preferidas como se definen en este documento en la Tabla 3 (vease Apendice A) y su modificacion de acuerdo con el metodo de la invencion se describe en detalle en el Ejemplo 2. Se seleccionan posiciones de contacto preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H9 8, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96. Se seleccionan posiciones de hipermutacion preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 y L93. Los restos de aminoacidos mas preferidos (denominados "posic iones de muta genesis sel ectiva preferidas") so n posic iones t anto de c ontacto como de hipermutacion y se seleccionan del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Se seleccionan posiciones de contacto particularmente preferidas del grupo que consiste en L50 y L94.

Los restos de aminoacidos potenciadores de actividad preferidos reemplazan restos de aminoacidos localizados en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96. Los restos de aminoacidos potenciadores de actividad mas preferidos reemplazan restos de aminoacidos localizados en las posiciones H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Particularmente, los restos de aminoacidos potenciadores de actividad preferidos reemplazan restos de aminoacidos localizados en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en L50 y L94.

En general, el metodo de la invencion implica seleccionar una posicion de mutagenesis selectiva preferida particular, posicion de contacto y/o hipermutacion dentro de una CDR de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo parental de interes, o parte de union a antigeno del mismo, mutando de forma aleatoria esa posicion individual (por ejemplo, por me dios g eneticos us ando u n oligonucleotido m utagenico p ara generar una "mi nibiblioteca" d e antic uerpos modificados), o mutando una posicion a aminoacidos deseados especificos, para identificar restos de aminoacidos potenciadores de activi dad e xpresando y p urificando l os anticuerpos m odificados (p or ejemp lo, en un sistema hospedador de presentacion no en fagos), midiendo la actividad de los anticuerpos modificados para antigeno (por ejemplo, midiendo las velocidades Koff por analisis de BIAcore) repitiendo estas etapas para otras posiciones de CDR, se gun s ea n ecesario, y c ombinando mutaci ones individuales q ue se ha m ostrado q ue ti enen actividad mejorada y ensayando si la combinacion o las combinaciones generan un anticuerpo con actividad aun mayor (por

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ejemplo, afinidad o potencia de neutralizacion) que el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

En consecuencia, en una realizacion, la invencion proporciona un metodo para mejorar la actividad de un anticuerpo,

o parte de union a antigeno del mismo, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo: b) selecc ionar en orde n un a 1) posic ion de mutag enesis selectiva pr eferida; 2) posicion de cont acto o 3) posicion de hi permutacion dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion, identificando de este modo una posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada, posicion de contacto

o hipermutacion; c) mutar individualmente dicha posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada, posicion de contacto o hipermutacion a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpo mutados, o partes de union a antigeno de los mismos; d) evaluar la actividad el panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; e) opcionalmente, repetir las etapas a) a d) para al menos otra posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion; f) combinar, en el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo, mutaciones individuales que se ha mostrado que tienen actividad mejorada, para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; y g) evaluar la actividad de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo;

hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de uniona antigeno delmismo. Preferiblemente, elanticuerpo o losanticuerpos seleccionados tienen una actividad mejorada sin perdida o con retencion de al menos una caracteristica o propiedad deseable del anticuerpo parental como se ha descrito anteriormente. La caracteristica o propiedad deseable puede medirse u observarse por el experto habitual en la materia usando tecnicas reconocidas en la materia.

Las posiciones de contacto preferidas se selecciona del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96. Las posiciones de hipermutacion preferidas se seleccionan del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. Se seleccionan posiciones de mutagenesis selectiva mas preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 y L93. Se seleccionan posiciones de contacto particularmente preferidas del grupo que consiste en L50 y L94.

En otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para mejorar la actividad de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; b) seleccionar una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion; c) mutar individualmente dicha posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada, posicion de contacto o hipermutacion a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) opcionalmente, repetir las etapas a) a d) para al menos otra posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion; f) combinar, en el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo dos restos de aminoacidos potenciadores de activ idad ind ividuales que s e h a mostrado que ti enen activi dad mejor ada, p ara formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; y g) evaluar la actividad de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, con dos restos de aminoacidos potenciadores de actividad, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo;

hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

Se seleccionan posiciones de contacto preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96. Se seleccionan posiciones de hipermutacion preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 yL93. Se selecciona posiciones de mutagenesis selectiva mas preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 y L94. Se seleccionan posiciones de contacto particularmente preferidas del grupo que consiste en L50 y L94.

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a) proporcionar un anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; b) seleccionar una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion; c) mutar individualmente dicha posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada, posicion de contacto o hipermutacion a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpo mutados, o partes de union a antigeno de los mismos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) opcionalmente, repetir las etapas a) a d) para al menos otra posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion; f) combinar, en el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo, tres restos de aminoacidos potenciadores de activ idad ind ividuales que s e h a mostrado que ti enen activi dad mejor ada, p ara formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; y g) evaluar la actividad de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, con dos restos de aminoacidos potenciadores de actividad, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo;

Preferiblemente, el resto de aminoacido potenciador de actividad reemplaza restos de aminoacidos localizados en posiciones seleccionadas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96.

Despues de mutagenesis de posiciones seleccionadas individuales, pueden secuenciarse clones mutados para identificar qu e restos de a minoacidos se han intro ducido en l a pos icion se leccionada e n cad a clon. Pue de seleccionarse un n umero p equefo de c lones (p or e jemplo, a proximadamente 2 4) para s ecuenciacion, lo que estadisticamente produc iria 10-15 anticu erpos un icos, mientras q ue p uede secue nciarse num eros ma yores de clones (por ejemplo mas de 60) para asegurar que se identifiquen anticuerpos con cada posible sustitucion en la posicion seleccionada.

En una realizacion, las posiciones de contacto y/o hipermutacion dentro de las regiones CDR3 de las cadenas pesada y/o ligera se seleccionan en primer lugar para mutagenesis. Sin embargo, para anticuerpos que ya se han madurado con respecto a afinidad in vitro por mutagenesis aleatoria de las regiones CDR3 mediante seleccion de presentacion de fagos, puede ser preferible seleccionar en primer lugar las posiciones de contacto y/o hipermutacion dentro de CDR1 o CDR2 de la cadena pesada y/o ligera.

En una realizacion mas preferida, las posiciones de mutagenesis selectiva preferidas dentro de las regiones CDR3 de las cadenas pesada y/o ligera se seleccionan en primer lugar para mutagenesis. Sin embargo, para anticuerpos que ya se han madurado con respecto a afinidad in vitro por mutagenesis aleatoria de las regiones CDR3 mediante seleccion de presentacion de fagos, puede ser preferible seleccionar en primer lugar posiciones de mutagenesis selectiva preferidas dentro de CDR1 o CDR2 de la cadena pesada y/o ligera.

En otra realizacion preferida, la optimizacion de un anticuerpo seleccionado por el enfoque de mutagenesis selectiva se realiza secuencialmente como sigue: se mutan posiciones de mutagenesis selectiva preferidas seleccionadas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 en primer lugar a al me nos otros dos a minoacidos cada una (preferiblemente 5-14 aminoacidos distintos) y los anticuerpos resultantes se caracterizan con respecto a afinidad aumentada, potencia de neutralizacion (y posiblemente tambien con respecto a al menos otra caracteristica conservada o propiedad analizada en otro lugar). Si una mutacion de una posicion de mutagenesis selectiva preferida sencilla no aumenta la afinidad o potencia de neutralizacion en absoluto o de forma suficiente y si incluso la combinacion de multiples aminoacidos potenciadores de actividad que reemplazan aminoacidos en posiciones de mutagenesis selectiva preferidos no da como resultado un anticuerpo de combinacion que cumple la actividad diana (incluyendo afinidad y/o potencia de neutralizacion), se seleccionaran restos de aminoacidos adicionales para mutagenesis selectiva del grupo que consiste en H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A y L96, se mutan al menos a otros 2 aminoacidos cada uno (preferiblemente 5-14 aminoacidos distintos) y lo s anticuer pos resultant es se caracteriz an con respec to a afinid ad aumenta da, potencia d e neutralizacion ( y posi blemente tambien con respecto a al me nos otra caracteristica cons ervada o pr opiedad analizada en otro sitio).

Si una mutacion de un resto de aminoacido sencillo seleccionado del grupo que consiste en H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A y L96 no aumenta la actividad (incluyendo afinidad y/o potencia deneutralizacion) en absoluto o no de forma suficiente y si incluso una combinacion de multiples aminoacidos potenciadores de actividad

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que reemplazan aminoacidos en esas posiciones no da como resultado un anticuerpo de combinacion que cumple la actividad diana (incluyendo afinidad y/o potencia de neutralizacion diana), se seleccionaran restos de aminoacidos adicionales para mutagenesis selectiva del grupos que consiste en H33B, H52B, L31A y se mutan al menos a otros 2 aminoacidos cada uno (preferiblemente 5-14 aminoacidos distintos) y los anticuerposresultantes se caracterizan con respecto a afinidad aumentada, potencia de neutralizacion (y posiblemente tambien con respecto a al menos otra caracteristica conservada o propiedad analizada en otro sitio).

Deberia entenderse que el enfoque de mutagenesis selectiva secuencial puede terminar en cualquiera de las etapas perfiladas anteriormente en cuanto se ha identificado un anticuerpo con la actividad deseada (incluyendo afinidad y potencia d e n eutralizacion). Si la muta genesis de l as posiciones p reseleccionadas ha id entificado restos d e aminoacidos potenciadores de actividad pero el anticuerpo de combinacion aun no cumple las dianas establecidas para actividad (incluyendo afinidad y potencia de neutralizacion) y/o si los aminoacidos potenciadores de actividad identificados tambien afectan a otras caracteristicas deseadas y por lo tanto no son aceptables, los restos de CDR restantes pueden someterse a mutagenesis (vease seccion IV).

El metodo de la invencion puede usarse para mejorar la actividad de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, para conseguir una actividad diana predeterminada (por ejemplo una afinidad predeterminada y/o potencia de neutralizacion, y/o una propiedad o caracteristica deseada).

En consecuencia, la invencion proporciona un metodo para mejorar la actividad de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, para conseguir una actividad diana predeterminada, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo: b) seleccionar una posicion de mutagenesisselectiva preferida seleccionada del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94. c) mutar individualmente la posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada a al m enos otros dos restos de aminoacidos para crear un primer panel de anticuerpo mutados, o partes de union a antigeno de los mismos; d) evaluar la actividad del primer panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, para determinar si la mutacion de una posicion de mutagenesis selectiva sencilla produce un anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo con la actividad diana predeterminada o una actividad diana parcial; e) combin ar p or etapas, en el anticuer po parenta l, o parte de uni on a antigeno d el mismo, mutacion es individuales que se ha mostrado que tienen una actividad mejorada, para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; f) evaluar la actividad de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos para determinar si los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, tienen la actividad diana predeterminada o una actividad diana parcial. g) si las etapas d) o f) no dan como resulta do anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo que tenga la actividad diana predeterminada, o dan como resultado un anticuerpo con solamente una actividad parcial, se mutan restos de aminoacidos adicionales seleccionados del grupo que consiste en H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A yL96 a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un segundo panel de anticuerpos mutados o partes de union a antigenos de los mismos; h) evaluar la actividad del segundo panel de anticuerpos mutados o partes de union a antigeno de los mismos, para determinar si la mutacion de un resto de aminoacido sencillo seleccionado del grupo que consiste en H35, H50, H53, H54, H95, H96, H97, H98, L30A y L96 da como resultado un anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo, que tenga la actividad diana predeterminada o una actividad parcial; i) comb inar p or eta pas en el anticuerpo pare ntal, o parte de uni on a antige no del mismo, mutacio nes individuales de la etapa g) que se ha mostrado que tienen una actividad mejorada, para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; j) evaluar la actividad de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, para determinar si los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, tienen la actividad diana predeterminada o una actividad diana parcial. k) si las etapas h) o j) no dan como resultado un anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo que tenga la actividad diana predeterminada, o dan como resultado un anticuerpo con solamente una actividad parcial, se mutan restos de aminoacidos adicionales seleccionadosdel grupo que consiste en H33B, H52B y L31A a al menos otros dos restos de a minoacidos para crear de es te modo un tercer panel de anticuerpos mutados o partes de union a antigeno de los mismos; I) evaluar la actividad del tercer panel de anticuerpos mutados o partes de union a antigeno de los mismos, para determinar si una mutacion de un resto de aminoacido sencillo seleccionado del grupo que consiste en H33B, H52B y L31A dio como resultado un anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo, que tuviera la actividad diana predeterminada o una actividad parcial; m) combinar por etap as en el anticuer po parenta l, o parte de uni on a antigeno d el mismo, mutacion es individuales de la etapa k) que se ha mostrado que tienen una actividad mejorada, para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; n) evaluar la actividad de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, para determinar si los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, tienen la actividad

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diana predeterminada para producir de este modo un anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo con una actividad diana predeterminada.

Pueden usarse varios metodos de mutagenesis, incluyendo ensamblaje de PCR, Kunkel (dut-ung-) y mutagenesis dirigida por oligonucleotido tiofosfato (kit Amersham Sculptor).

Puede us arse una amplia diversidad d e sistemas d e ex presion hospedadores p ara e xpresar los antic uerpos mutados, incluyendo sistem as de expresion b acterianos, de levadura, bac ulovirales y de mamife ro (asi com o sistemas de expresion de presentacion de fagos). Un ejemplo de un vector de expresion bacteriano adecuado es pUC 119(Sfi). Se conocen otros sistemas de expresion de anticuerpos en la tecnica y/o se describen posteriormente en la seccion IV.

Los anticuerpos modificados, o partes de union a antigeno de los mismos, producidos por el metodo de la invencion pueden identificarse sin basarse en metodos de presentacion de fagos para seleccion. En consecuencia, el metodo de la invencion es particularmente ventajoso para mejorar la actividad de un anticuerpo parental recombinante o parte de union a antigeno del mismo, que se obtuvo por seleccion en un sistema de presentacion de fagos pero cuya actividad no puede mejorarse adicionalmente por mutagenesis en el sistema de presentacion de fagos.

En consecuencia, en otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para mejorar la afinidad de un anticuerpo,

o parte de union a antigeno del mismo, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo parental recombinante o parte de union a antigeno del mismo; que se obtuvo por seleccion en un sistema de presentacion de fagos pero cuya actividad no puede mejorarse adicionalmente por mutagenesis en dicho sistema de presentacion de fagos; b) seleccionar una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion, identificando de este modo una posicion de contacto o hipermutacion seleccionada; c) mutar individualmente dicha posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada, posicion de contacto o hipermutacion a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpo mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, y expresar dicho panel en un sistema de presentacion no de fagos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; e) opcionalmente, repetir las etapas b) a d) para al menos otra posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion; f) combinar, en el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo mutaciones individuales que se ha mostrado que tienen actividad mejorada, para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; y g) evaluar la actividad de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con unaactividad mejorada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

Se seleccionan posiciones de contacto preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96. Se seleccionan posiciones de hipermutacion preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 y L93. Se seleccionan posiciones de mutagenesis selectiva mas preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93 y L94. Se seleccionan posiciones de contacto particularmente preferidas del grupo que consiste en L50 y L94.

Con los metodos disponibles no es posible o es extremadamente laborioso derivar un anticuerpo con afinidad de union y potencia de neutralizacion aumentadas conservando a la vez otras propiedades o caracteristicas de los anticuerpos como se ha analizado anteriormente. El metodo de la presente invencion, sin embargo, puede identificar facilmente tal es antic uerpos. Los anticuerpos s ometidos al m etodo d e la pres ente inve ncion pueden ve nir de cualquier fuente.

Por lo tanto, en otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para mejorar la actividad de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo parental recombinante o parte de union a antigeno del mismo; b) seleccionar una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion, identificando de este modo una posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada, posicion de contacto o hipermutacion; c) mutar individualmente dicha posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada, posicion de contacto o hipermutacion a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpo mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, y expresar dicho panel en un sistema de expresion

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apropiado; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo, identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) evaluar el panel de anticuerposmutados, o partes de union a antigeno de los mismos, enrelacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo para al menos otra propiedad o caracteristica, en el que la propiedad o caracteristica es una que se necesita conservar en el anticuerpo;

hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada y al menos una propiedad o caracteristica conservada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

En una realizacion preferida, las posiciones de contacto preferidas se seleccionan del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96 yla otra caracteristica se selecciona de 1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer el epitopo p40 preferiblemente en el contexto del heterodimero p70 p40/p35 evitando la interferencia de union de p40 soluble libre y/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

En otra realizacion preferida, las posiciones de hipermutacion se seleccionan del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32. H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 y L93 y las otras caracteristicas se seleccionan de 1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer epitopo p40 preferiblemente en el cont exto del heterodimero p70 p40/p35 evitando interferencia de union de p40 soluble librey/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

En una re alizacion mas pre ferida, los rest os para muta genesis sel ectiva se selecci onan d e las po siciones de mutagenesis selectiva preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L9 1, L92, L93, L 94 y las otra s caracteristica s se se leccionan de 1) c onservacion de ause ncia d e reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer epitopo p40 preferiblemente en el contexto del heterodimero p70 p40/p35 evitando interferencia de union de p40 soluble libre y/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

En una realizacion mas preferida, las posiciones de contacto se seleccionan del grupo que consiste en L50 y L94 y la otra caracteristica se selecciona de 1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer epitopo p40 preferiblemente en el contexto del heterodimero p70 p40/p35 evitando interferencia de union de p40 soluble libre y/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

Si, por lo tanto, la afinidad de un anticuerpo por un antigeno especifico se mejorara, pero cuando ya no es aplicable el met odo d e pres entacion de fagos (o sistema r elacionado inc luyendo pr esentacion de rib osomas), y se conservaran o tras propi edades o caract eristicas dese ables, podria usarse el m etodo d e la i nvencion. En consecuencia, en otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para mejorar la actividad de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo parental recombinante o parte de union a antigeno del mismo; que se obtuvo por seleccion en un sistema de presentacion de fagos pero cuya actividad no puede mejorarse adicionalmente por mutagenesis en dicho sistema de presentacion de fagos; b) seleccionar una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion, identificando de este modo una posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada, posicion de contacto o hipermutacion; c) mutar individualmente dicha posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada, posicion de contacto o hipermutacion a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, y expresar dicho panel en un sistema de presentacion no de fagos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) evaluar el panel de anticuerposmutados, o partes de union a antigeno de los mismos, enrelacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo para al menos otra propiedad o caracteristica distinta, en el que la propiedad o caracteristica es una que se necesita conservar, hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una activ idad mejorada yal menos una propiedad o caracteristica conservada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo, f) opcionalmente, repetir las etapas a)a e) para al menos otra posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion;

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g) combi nar, en el anticuerpo p arental, o parte de union a a ntigeno del mism o al menos d os r estos de aminoacidos potenciadores de actividad individuales que se ha mostrado que tienen actividad mejorada y al menos una propiedad o caracteristica conservada, para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; y h) evaluar la actividad de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo;

hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada y al menos otra propiedad o caracteristica conservada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

En una realizacion preferida, las posiciones de contacto preferidas se seleccionan del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96 yla otra caracteristica se selecciona de 1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer epitopo p40 preferiblemente en el contexto del heterodimero p70 p40/p35 evitando interferencia de union de p40 soluble libre y/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

En otra realizacion preferida, las posiciones de hipermutacion se seleccionan del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32. H52, H56, H58, L30, L31, L32, L53 y L93 y la otra caracteristica se selecciona de 1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer epitopo p40 preferiblemente en el cont exto del heterodimero p70 p40/p35 evitando interferencia de union de p40 soluble librey/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

En u na rea lizacion mas pr eferida, los re stos de mu tagenesis s electiva s e se leccionan de las posiciones de mutagenesis selectiva preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 y la otra caracteristica se selecciona de 1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer epitopo p40 preferiblemente en el contexto del heterodimero p70 p40/p35 evitando la interferencia de union de p40 soluble libre y/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

a) proporcionar un anticuerpo parental recombinante o parte de union a antigeno del mismo; que se obtuvo por seleccion en un sistema de presentacion de fagos pero cuya actividad no puede mejorarse adicionalmente por mutagenesis en dicho sistema de presentacion de fagos; b) seleccionar una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion, identificando de este modo una posicion de contacto o hipermutacion seleccionada; c) mutar individualmente dicha posicion de mutagenesis selectiva preferida seleccionada, posicion de contacto o hipermutacion a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpo mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, y expresar dicho panel en un sistema de presentacion no de fagos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) evaluar el panel de anticuerposmutados, o partes de union a antigeno de los mismos, enrelacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo para al menos otra propiedad o caracteristica, en el que la propiedad o caracteristica es una que se necesita conservar, hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno d el m ismo, co n u na activi dad mej orada y al m enos un a propiedad o cara cteristica conservada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

En una realizacion preferida, las posiciones de contacto preferidas se selecciona del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96 yla otra caracteristica se selecciona de 1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer epitopo p40 preferiblemente en el co ntexto del heterodimero p70 p40/p35 evitando la interferencia

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de union de p40 soluble libre y/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

En una re alizacion mas pre ferida, los rest os para muta genesis sel ectiva se selecci onan d e las po siciones de mutagenesis selectiva preferidas del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H52, H56, H58, L30, L31, L32, L50, L91, L92, L93, L94 y la otras caracteristica se selecciona de 1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer epitopo p40 preferiblemente en el contexto del heterodimero p70 p40/p35 evitando interferencia de union de p40 soluble libre y/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

a) proporcionar un anticuerpo parental recombinante o parte de union a antigeno del mismo; que se obtuvo por seleccion en un sistema de presentacion de fagos pero cuya actividad no puede mejorarse adicionalmente por mutagenesis en dicho sistema de presentacion de fagos; b) seleccionar una posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion, identificando de este modo una posicion de contacto o hipermutacion seleccionada; c) mutar individualmente dichas posiciones de mutagenesis selectiva preferidas seleccionadas, posiciones de contacto o hipermutacion a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, y expresar dicho panel en un sistema de presentacion no de fagos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) evaluar el panel de anticuerposmutados, o partes de union a antigeno de los mismos, enrelacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo para al menos otra propiedad o caracteristica, en el que la propiedad o caracteristica es una que necesita conservarse, hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a an tigeno del mismo, con un a actividad mejorada y al menos una c aracteristica conservada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo. f) opcionalmente, repetir las etapas a)a e) para al menos otra posicion de mutagenesis selectiva preferida, posicion de contacto o hipermutacion; g) combin ar, en el a nticuerpo par ental, o parte de un ion a antige no del mismo, a l menos dos r estos de aminoacidos potenciadores de actividad individuales que se ha mostrado que tienen actividad mejorada y al menos otra caracteristica conservada, para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; y h) evaluar la actividad de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo;

En una realizacion preferida, las posiciones de contacto se seleccionan del grupo que consiste en H30, H31, H31B, H32, H33, H35,H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98,H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96 y la otra caracteristica se selecciona de 1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer epitopo p40 preferiblemente en el contexto del heterodimero p70 p40/p35 evitando interferencia de union de p40 soluble libre y/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

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IV. Modificaciones de otros restos de CDR

En ultima instancia, todos los restos de CDR en un par de anticuerpo-antigeno dado que se ha identificado por cualquier medio que se requieren como restos de aminoacidos potenciadores de actividad y/o se requieren directa o indirectamente para union con el antigenoy/o para conservar otras propiedades o caracteristicas deseables del anticuerpo. T ales restos d e CDR se de nominan "p osiciones de mu tagenesis se lectiva preferi das". Deberi a observarse que en circunstancias especificas los restos de mutagenesis selectiva preferidos pueden identificarse tambien por otros medios incluyendo cocristalizacion de anticuerpo y antigeno y modelizacion molecular.

Si los intentos preferidos para identificar aminoacidos potenciadores de actividad centrandose en las posiciones de mutagenesis selectiva preferidas, posiciones de contacto o hipermutacion descritas anteriormente se agotan, o si se requieren mejoras adicionales, los restos de CDR restantes pueden modificarse como se describe posteriormente. Deberia entenderse que el anticuerpo ya podria estar modificado en una cualquiera o mas de las posiciones de contacto o hipermutacion de acuerdo con las realizaciones analizadas anteriormente pero puede requerir mejoras adicionales. Por lo tanto, en otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para mejorar la actividad de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; b) seleccionar un resto de a minoacido dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion distinta de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96; c) mutar individualmente dicha posicion seleccionada por ejemplo, a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un anticuerpo mutado, o un panel de anticuerpos mutados, o partes de uni on a antigeno de los mismos; d) evaluar la actividad del anticuerpo mutado o el panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) evaluar el anticuerpo mutado o el panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo, con respecto a cambios en al menos otra propiedad o caracteristica hasta que se obtenga un anticuerpo, oparte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

Preferiblemente, la otra c aracteristica o propiedad se selecciona de 1) conservacion de ausencia de reactividad cruzada con otras proteinas o tejidos humanos, 2) conservacion de reconocimiento de epitopos, es decir reconocer epitopo p40 preferiblemente en el contexto del heterodimero p70 p40/p35 evitando interferencia de union de p40 soluble libre y/o 3) producir un anticuerpo con una secuencia de inmunoglobulina cercana a linea germinal.

Si la mutagenesis de un resto sencillo no es suficiente pueden incluirse otros restos; por lo tanto, en otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para mejorar la actividad de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo parental recombinante o parte de union a antigeno del mismo; b) seleccionar un resto de a minoacido dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion distinta de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96;

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c) mutar individualmente dicha posicion seleccionada a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) repetir las etapas b) a d) para al menos otra posicion de CDR que no es la posicion seleccionada en b) ni una posicion en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96; f) combin ar, e n el antic uerpo par ental, o parte de union a antige no del mismo al menos dos restos de aminoacidos potenciadores de actividad individuales que se ha mostrado que tienen actividad mejorada, para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; y g) evaluar la actividad de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos con dos restos de aminoacidos potenciadores de actividad, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

Si los intentos preferidos para identificar aminoacidos potenciadores de actividad centrandose en las posiciones de contacto o hipermutacion descritas anteriormente se agotan, o si se requieren mejoras adicionales, y el anticuerpo en cuesti on no pue de optimizarse a dicionalmente p or metodos de mutage nesis y presentacion de fagos (o presentacion de ri bosomas relaci onada) los restos de CDR resta ntes pu eden m odificarse com o se d escribe posteriormente. Deberia e ntenderse que el a nticuerpo puede ya est ar mod ificado en una cua lquiera o mas posiciones de mutagen esis selectiva preferidas, posici ones de co ntacto o hiperm utacion d e acu erdo co n la s realizaciones analizadas anteriormente pero puede requerir mejoras adicionales.

a) proporcionar un anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; que se obtuvo por seleccion en un sistema de presentacion de fagos pero cuya actividad no puede mejorarse adicionalmente por mutagenesis en dicho sistema de presentacion de fagos; b) seleccionar un resto de a minoacido dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion distinta de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y; c) mutar individualmente dicha posicion de contacto o hipermutacion seleccionada a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, y expresar dicho panel en un sistema de presentacion no de fagos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) evaluar el panel de anticuerposmutados, o partes de union a antigeno de los mismos, enrelacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo, con respecto a cambios en al menos otra propiedad

o caracteristica, hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

Si una mutagenesis sencilla no es suficiente para aumentar la afinidad del anticuerpo pueden incluirse otros restos en la mutagenesis. Por lo tanto, en otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para mejorar la actividad de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; que se obtuvo por seleccion en un sistema de presentacion de fagos pero cuya actividad no puede mejorarse adicionalmente por mutagenesis en dicho sistema de presentacion de fagos; b) seleccionar un resto de a minoacido dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion distinta de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96; c) mutar individualmente dicha posicion seleccionada a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos y expresion en un sistema de presentacion no de fagos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) repetir las etapas b) a d) para al menos otra posicion que no es la posicion seleccionada en b) ni una posicion

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en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94; g) combin ar, en el a nticuerpo par ental, o parte de un ion a antige no del mismo, a l menos dos r estos de aminoacidos potenciadores de actividad individuales que se ha mostrado que tienen actividad mejorada, para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; y h) evaluar la actividad y otra propiedad o caracteristica de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de l os mismos co n d os rest os de aminoacidos pote nciadores d e activ idad, en rel acion con e l anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo;

Los intentos preferidos para identificar aminoacidos potenciadores de actividad centrandose en las posiciones de mutagenesis selectivas preferidas, posiciones de contacto o hipermutacion descritas pueden agotarse, o pueden requerirse mejoras adicionales, y es importante conservar otras propiedades o caracteristicas del anticuerpo.

Por lo tanto, en otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para mejorar la actividad de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, sin afectar a otras caracteristicas, que comprende:

a) proporcionar un anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; b) seleccionar un resto de a minoacido dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion distinta de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96; c) mutar individualmente dicha posicion seleccionada a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) evaluar el panel de anticuerposmutados, o partes de union a antigeno de los mismos, enrelacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo, con respecto a cambios en al menos otra propiedad

o caracteristica hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada y otra propiedad o caracteristica conservada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

a) proporcionar un anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; b) seleccionar un resto de a minoacido dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion distinta de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96; c) mutar individualmente dicha posicion seleccionada a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) evaluar el panel de anticuerposmutados, o partes de union a antigeno de los mismos, enrelacion con el anticuerpo parental o parte de un ion a a ntigeno del m ismo, con res pecto a cam bios en a l me nos otra caracteristica o propiedad; e) repetir las etapas b) a e) para al menos otra posicion de CDR que no es la posicion seleccionada en b) ni una posicion en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58. H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96; f) combinar, e n el a nticuerpo par ental, o parte d e union a antig eno del mism o, al menos d os r estos d e aminoacidos potenciadores de actividad individuales que se ha mostrado que tienen actividad mejorada y sin afectar al menos a otra propiedad o caracteristica, para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a

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antigeno de los mismos; y g) evaluar la actividad y la conservacion de al menos otra propiedado caracteristica de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, con dos restos de aminoacidos potenciadores de actividad, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada y al menos otra propiedad o caracteristica conservada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

La mutagenesis de la p osicion de mutagenesis selectiva preferida, resto de co ntacto e hipermutacion puede no haber aumentado la afinidad del anticuerpo de forma suficiente, y la mutagenesis y el metodo de presentacion de fagos (o meto do d e pr esentacion d e rib osomas re lacionados) p ueden no ser ya utiles y al m enos deberia conservarse otra caracteristica o propiedad del anticuerpo.

Por lo tanto, en otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para mejorar la afinidad de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, que comprende:

a) proporcionar un antic uerpo parental o parte de union a antige no del mismo; qu e se obtuv o medi ante seleccion en un sistema de presentacion de fagos pero cuya actividad no puede mejorarse adicionalmente por mutagenesis en dicho sistema de presentacion de fagos; b) seleccionar un resto de a minoacido dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion distinta de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96; c) mutar individualmente dicha posicion seleccionada a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos y expresion en un sistema de presentacion no de fagos; d) evaluar la actividad del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) evaluar el panel de anticuerposmutados, o partes de union a antigeno de los mismos, enrelacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo, con respecto a cambios en al menos otra propiedad

o caracteristica hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

a) proporcionar un anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; que se obtuvo por seleccion en un sistema de presentacion de fagos pero cuya actividad no puede mejorarse adicionalmente por mutagenesis en dicho sistema de presentacion de fagos; b) seleccionar un resto de a minoacido dentro de una region determinante de complementariedad (CDR) para mutacion distinta de H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96; c) mutar individualmente dicha posicion seleccionada a al menos otros dos restos de aminoacidos para crear de este modo un panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, y expresion en un sistema de presentacion no de fagos; d) evaluar la actividad yconservacion de al menos otr a propiedad o caracteristica del panel de anticuerpos mutados, o partes de union a antigeno de los mismos, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo; identificando de este modo un resto de aminoacido potenciador de actividad; e) repetir las etapas b) a d) para al menos otra posicion de CDR que no es la posicion seleccionada en b) ni una posicion en H30, H31, H31B, H32, H33, H35, H50, H52, H52A, H53, H54, H56, H58, H95, H96, H97, H98, H101, L30, L31, L32, L34, L50, L52, L53, L55, L91, L92, L93, L94 y L96; f) combinar, e n el a nticuerpo par ental, o parte d e union a antig eno del mism o, al menos d os r estos d e aminoacidos potenciadores de actividad individuales que se ha mostrado que tienen actividad mejorada y que no afectan al menos a otra propiedad o caracteristica para formar anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos; y g) eva luar l a actividad y c onservacion de la m enos un a pro piedad o caracteristica de los anticuerpos de combinacion, o partes de union a antigeno de los mismos, con dos restos de aminoacidos potenciadores de actividad, en relacion con el anticuerpo parental o parte de union a antigeno del mismo hasta que se obtenga un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, con una actividad mejorada y al menos otra caracteristica o propiedad conservada, en relacion con el anticuerpo parental, o parte de union a antigeno del mismo.

V. Expresion de anticuerpos

Un anticuerpo, o parte de anticuerpo, de la invencion puede prepararse por expresion recombinante de genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulinaen una celula hospedadora. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, una celula hospedadora se transfecta con uno o mas vectores de expresion recombinantes que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo de modo que las cadenas ligera y pesada se expresen en la celula hospedadora y, preferiblemente, se secreten al medio en el qu e l as cel ulas ho spedadoras se cu ltivan, de cu yo medi o p ueden recu perarse los anticuerpos. Se usan metodologias de ADN recombinante convencionales para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpos, incorporar estos genes en vectores de expresion recombinantes e introducir los vectores en celulas hospedadoras, tales como las descritas en Sambrook, Fritsch yManiatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989) , Ausubel, F. M. et al . (eds.) Current Protocols in Mo lecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en la Patente de Estados Unidos N° 4.816.397 de Boss et al.

Para obtener un fragmento de ADN codificante de la region variable de cadena pesada de Joe 9 wt o un anticuerpo relacionado con Joe 9 wt, se exploraron anticuerpos especificos para IL-12 humana a partir de bibliotecas humanas y se mutaron, como se describe en la seccion II. Una vez que se obtuvieron fragmentos de ADN que codificaban Joe 9 wto segmentos VH y VL relacionados con Joe 9 wt, se lleva a cabo mutagenesis de estas secuencias por metodos convencionales, tales como mutagenesis dirigida por PCR (la mutagenesis mediada por PCR en la que los nucleotidos m utados se incorporan a l os ceb adores de PCR d e mo do que e l pr oducto de PCR conte nga l as mutaciones) u otros metodos de mutagenesis dirigida. Se manipularon adicionalmente anticuerpos de IL-12 humana que presentaban un nivel de actividad y afinidad/especificidad de union que era deseable, por ejemplo J695, por tecnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo para convertir los genes de region variable a genes de cadena de a nticuerpo de lo ngitud compl eta, a genes de fragme ntos F ab o a un gen de scF v. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteina, tal como una region constante de anticuerpo o un engarce flexible. La expresion "unido operativamente", como se usa en el presente contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de modo que las secuencias de aminoacidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en fase.

El ADN aislado que codifica la region VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN codificante de VH a otra molecul a de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de region constante de cadena pesada humanos se conocen en la tecnica (vease por ejemplo, Kabat, E. A., et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion de NIH N° 91-3242) y pueden obtenerse fragmentos de ADN que abarcan estas regiones por amplificacion por PCR. La region constante de cadena pesada puede ser una region constante lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD y cualquier variante alotipica de ellas como se describe en Kabat (, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion de NIH N° 91-3242), pero mas preferiblemente es una region constante de lgG1 o lgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmentos Fab, el ADN que codifica VH puede unirse operativamente a otra molecula de ADN que codifica solamente la region constante de CH1 de cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la region VL puede convertirse a un gen de cadena ligera de longitud completa, (asi como un gen de cadena ligera Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL con otra molecula de ADN que codifica la region constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de region constante de cadena ligera humana se c onocen e n la tecnica (ve ase por ej emplo, Kabat, E. A., et al . (1991) Seque nces o f Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion de NIH N° 913242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificacion por PCR convencional. La region constante de cadena ligera puede ser una region constante kappa o lambda, pero mas preferiblemente es una region constante lambda.

Para crear un gen scFv los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen operativamente con otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4-Ser)3, de modo que las secuencias VH y VL puedan expresarse como una proteina de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por enlazador flexible (vease por ejemplo Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554).

Para expresar los anticuerpos, o partes de anticuerpos de la invencion, se insertan ADN que codifican cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o parciales, obtenidas como se ha descrito anteriormente, en vectores de expresion de modo que los genes esten unidos operativamente con secuencias de control de la transcripcion y la traduccion. En este contexto, la expresion "unido operativamente" pretende referirse a que un gen de anticuerpos se liga a un vector de modo que las secuencias de control de la traduccion y la transcripcion dentro del vector cumplan su funcion pretendida de regular la transcripcion y traduccion del gen de anticuerpo. El vector de expresion y secuencias de control de la expresion se seleccionan para que sean compatibles con la celula hospedadora de expresion usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, mas tipicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresion. Los genes de

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anticuerpo se insertan en el vector de expresion por metodos convencionales (por ejemplo, ligacion de sitios de restriccion complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y vector, o ligacion de extremos romos si no estan presentes siti os de r estriccion). Antes de la ins ercion del J69 5 o l as secuencias d e cad ena pes ada o li gera relacionadas con J695, el vector de expresion puede ya portar secuencias de region constante de anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque para convertir el J695 o secuencias VH y VL relacionadas con J695 a genes de anticuerpos de longitud completa es insertarlas en vectores de expresion que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes d e caden a lig era, respecti vamente, de mo do qu e el se gmento VH e ste unid o op erativamente al segmento o los segmentos CH dentro del vector y el segmento VL este unido operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o como alternativa, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido sefal que facilita la secrecion de la cadena de anticuerpo de una celula hospedadora. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el peptido sefal se une en fase con el extremo amino terminal del gen de cadena d e a nticuerpo. El p eptido sef al puede ser un pepti do se fal de i nmunoglobulina o u n peptido se fal heterologo (es decir, un peptido sefal de una proteina no de inmunoglobulina).

Ademas de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresion recombinantes de la invencion portan secuencias r eguladoras q ue control an l a expres ion de los g enes de cad ena de anticu erpo en un a cel ula hospedadora. La expresion "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la e xpresion (por ejemplo, sefales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o traduccion de los genes de cadenas de anticuerpos. Para secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Se apreciara por los expertos en la materia que el disefo del vector de expresion, incluyendo la seleccion de secuencias reguladoras puede depender de tales factores como la eleccion de la celula hospedadora para transformar, el nivel de expresion de la proteina deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresion en celula hospedadora de mamifero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresion proteica en celulas de mamifero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador de CMV), Virus de Simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP) ypolioma. Para descripcion adicional de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, vease por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 5.168.062 de Stinski, Patente de Estados Unidos N° 4.510.245 de Bell et al. y Patente de Estados Unidos N° 4.968.615 de Schaffner et al., Patente de Estados Unidos N° 5.464.758 de Bujard et al. y Patente de Estados Unidos N° 5.654.168 de Bujard et al.

Ademas de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes de la invencion pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicacion del vector en c elulas hospedadoras ( por ej emplo, or igenes d e r eplicacion) y genes m arcadores sel eccionables. E l g en marcador seleccionable facilita la seleccion de celulas hospedadoras en las que se h a introducido el vector (vease por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, tipicamente e l ge n marc ador selecc ionable co nfiere re sistencia a far macos, tal es como G4 18, higromicina o metotrexato, en una celula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en celulas hospedadoras dhfr- con seleccion/amplificacion de metotrexato) y el gen neo (para seleccion de G418).

Para expresion de las cadenas ligeras y pesadas, el vector o los v ectores de expresion que codifican las cadenas pesada y ligera se transfecta a una celula hospedadora por tecnicas convencionales. Las diversas formas del termino "trans feccion" pret enden abarc ar una ampl ia diversidad de tecnic as habitualmente us adas p ara la introduccion de ADN exogeno en una celula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporacion, precipitacion c on fosfat o ca lcico, transfecc ion con DEAE -dextrano y si milares. Aun que es teoricamente posi ble expresar l os anticuerpos d e la inv encion en c elulas hospedadoras procari otas o eucar iotas, la expresion de anticuerpos en celulas eucariotas y mas preferiblemente celulas hospedadoras de mamifero, es la mas preferida debido a que tales celulas eucariotas, y en particular celulas de mamifero, tiene mas probabilidades que las celulas procariotas de ensamblarse y secretar un anticuerpo plegado de forma apropiada e inmunologicamente activo. Las celulas hospedadoras de mamifero preferidas para expresion de los anticuerpos recombinantes de la invencion incluyen Ovario de Hamster Chino (celulas CHO) (incluyendo celulas CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601 -621), celulas de mieloma NS0, celulas COS y celulas SP2. Cuando se introducen vectores de expresion recombinante que codifican genes de anticuerpos en celulas hospedadoras de mamifero, los anticuerpos se producen cultivando las celulas hospedadoras durante un periodo de tie mpo sufici ente para p ermitir la e xpresion del antic uerpo en las c elulas hos pedadoras o, mas preferiblemente, secrecion del anticuerpo al medio de cultivo en el que se dejan crecer las celulas hospedadoras. Los antic uerpos pue den re cuperarse de l medio d e cult ivo us ando metodos de purificacion de proteinas convencionales.

Las cel ulas h ospedadoras t ambien p ueden usars e par a prod ucir part es de a nticuerpos intact os, tales como fragmentos Fab o moleculas scFv. Se entendera que variaciones sobre el procedimiento anterior estan dentro del alcance de lapresente invencion. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una celula hospedadora con ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpode la presente invencion. Tambien puede usarse tecnologia de ADN recombinante para retirar parte o todo el ADN que codifica una o ambas

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de las cadenas ligera y pesada que no son necesarias para union a hIL-12. Las moleculas expresadas de tales moleculas d e ADN tru ncadas tambi en est an abarcadas por los a nticuerpos de la i nvencion. Ade mas, pu eden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una ligera son un anticuerpo de la invencion y la otra cadena pesada y ligera son especificas de un antigeno distinto de hIL-12 entrecruzando un anticuerpo de la invencion con un segundo anticuerpo por metodos de entrecruzamiento quimico convencionales.

En un sistema preferido para expresion recombinante de un anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, de la invencion, un vector de expresion recombinante que codifica tanto la cadena pesada de anticuerpo como la cadena ligera de anticuerpos se introduce en celulas CHO dhfr- por transfeccion mediada por fosfato calcico. Dentro del vector de expresion recombinante, los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo estan cada uno unidos operativamente a elem entos regul adores potenci adores/promotores (por ej emplo, deriva dos de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento regulador potenciador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulador potenciador de SV40/promotor de AdMLP) para conducir niveles altos de transcripcion de los genes. El vector de expresion recombinante tambien porta un gen DHFR, que permite la seleccion de celulas CHO que se han transfectado con el vector usando seleccion/amplificacion por metotrexato. Las celulas hospedadoras transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresion de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo y se recupera anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se usan tecnicas de biologia molecular convencionales para preparar el vector de expresion recombinante, transfectar las celulas hospedadoras, seleccionar transformantes, cultivar las celulas hospedadoras yrecuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Pueden expresarse anticuerpos o partes de union a antig eno de los m ismos e n u n animal (p or ej emplo, un r aton) q ue es transg enico p ara ge nes de inmunoglobulina humana (vease por ejemplo, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295). Tambien pueden modificarse celulas vegetales para crear plantas transgenicas que expresan el anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo, de la invencion.

En la vista de lo anterior, otro aspecto de la invencion se refiere a composiciones de acido nucleico, vector y celulas hospedadoras que pueden usarse para expresion recombinante de los anticuerpos y partes de anticuerpo de la invencion. Preferiblemente, la invencion presenta acidos nucleicos aislados que codifican CDR de J695, o la region variable de cadena pesada y/o ligera completa de J695. En consecuencia, en una realizacion, la invencion presenta un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo humano, o parte de union a antigeno del mismo, de la invencion, en el que el anticuerpo, o parte de union a antigeno del mismo, comprende la CDR3 de cadena pesada de J695 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 25.

Preferiblemente, el anticuerpo codificado o parte de union a antigeno del mismo, comprende adicionalmente una CDR2 de ca dena pes ada d e J6 95 que c omprende la secuencia d e amin oacidos de SE C ID N°: 27. Mas preferiblemente, el anticuerpocodificado o parte de union a antigeno del mismo, comprende adicionalmente una CDR1 de cadena pesada de J695 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 29. Aun mas preferiblemente, el acid o n ucleico ais lado codific a una regio n varia ble de ca dena pesad a de a nticuerpo qu e comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 31 (la region VH completa de J695).

En otras realizaciones, la invencion presenta un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo humano, o parte de union a antigeno del mismo, de la i nvencion, en el queel anticuerpo o parte d e union a antigeno del mismo, comprende la CDR3 de cadena ligera de J695 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 26. Preferiblemente, el anticuerpo codificado o parte de union a antigeno del mismo, comprende ademas una CDR2 de cadena ligera de J695 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 28. Mas preferi blemente, el anticuerpo codificado, o parte de union a antigeno del mismo, comprende ademas una CDR1 de cadena ligera de J695 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 30. A un mas preferiblemente, el acido nucleico aislado codifica una region variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32 (la region VL completa de J695).

La invencion tambien proporciona un vector de expresion recombinante que codifica:

a) una cadena pesada de anticuerpo que tiene una region variable que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 31; y b) una cadena ligera de anticuerpo que tiene una region variable que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32.

La invencion tambien proporciona celulas hospedadoras en las que se han introducido uno o mas de los vectores de expresionrecombinantes de la invencion. Preferiblemente, la celula hospedadora es una celula hospedadora de mamifero, mas preferiblemente la celula hospedadora es una celula CHO, una celula NS0 o una celula COS. Ademas la invencion proporciona un metodo para sintetizar un anticuerpo humano recombinante de la invencion cultivando una celula hospedadora de la invencion en un medio de cultivo adecuado hastaque se sintetiza un anticuerpo humano recombinante de la invencion. El metodo puede comprender adicionalmente aislar el anticuerpo humano recombinante del medio de cultivo.

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VI. Composiciones farmaceuticas y administracion farmaceutica

Los anticuerpos ypartes de anticuerpos de la invencion pueden incorporarse en composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion a un su jeto. Tipicamente, la composicion farmaceutica comprende un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invencion y un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Como se usa en este documento, "vehiculo farm aceuticamente ace ptable" i ncluye t odos y ca da u no de los disolventes, medi os de dis persion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, y similares que son fisiologicamente compatibles. Los ejemplos de vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen uno o mas de agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asi como combinaciones de los mismos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sodico en la composicion. Los vehiculos farmaceuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades menores de sustancias adyuvantes tales como agentes humectantes o em ulsionantes, cons ervantes o tamp ones, que p otencian el p eriodo de val idez o eficac ia del anticuerpo o parte de anticuerpo.

Los anticuerposy partes de anticuerpo de la invencion pueden incorporarse en una composicion farmaceutica adecuada para administracion parenteral. Preferiblemente, el anticuerpo o partes de anticuerpo se prepararan como una solucion inyectable que contiene anticuerpo 0,1-250 mg/ml. La solucion inyectable puede componerse de una forma de dosificacion liquida liofilizada en un frasco de silex o ambar, ampolla o jeringa precargada. El tampon puede ser L-histidina (1-50 mM), optimamente 5-10 mM, pH 5,0 a 7,0 (optimament e pH 6,0). Otr os tampones adecuados incluyen pero sin limitacion, succinato sodico, citrato sodico, fosfato sodico o fosfato potasico. Puede usarse cloruro sodico para modificar la toxicidad de la solucion a una concentracion de 0-300 mM (optimamente 150 mM par a una forma de d osificacion liquida). Pu eden i ncluirse cr ioprotectores para un a form a de d osificacion liofilizada, pr incipalmente sa carosa 0-10% (optimam ente 0,5-1,0%). Otros criopr otectores a decuados inc luyen trehalosa y lactosa. Pueden incluirse agentes para aumentar el volumen para una forma de dosificacion liofilizada, principalmente manitol 1-10% (optimamente 2-4%). Pueden utilizarse estabilizadores en formas de dosificacion tanto liquidas c omo liofi lizadas, principalmente L-metionina 1-50 mM ( optimamente 5-1 0 mM). Otros agentes p ara aumentar e l volumen adecuados i ncluyen gl icina, arg inina, pu eden incl uirse co mo po lisorbato 80 0-0,0 5% (optimamente 0,005-0,01%). Los tensioactivos adicionales incluyen pero sin limitacion polisorbato 20 y tensioactivos BRIJ.

En una re alizacion preferi da, la comp osicion farma ceutica i ncluye al antic uerpo a un a d osificacion d e aproximadamente 0,01 mg/k g-10 mg/kg. Las dos ificaciones mas preferidas d el a nticuerpo incl uyen 1 mg/kg administrado cada dos semanas, o 0,3 mg/kg administrado semanalmente.

Las composiciones de la presente invencion pueden estar en una diversidad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificacion liquidas, semisolidas y solidas, tales como soluciones liquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma prefer ida de pende de l mod o pr etendido d e adm inistracion y a plicacion terapeutica. L as co mposiciones preferidas tipicas estan en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para inmunizacion pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo preferido de administracion es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutanea, intraperitoneal, intramuscular). En una rea lizacion preferida, el anticuerpo s e admin istra p or infusi on o in yeccion intravenosa. En ot ra real izacion pref erida, el anticuerpo s e administra por inyeccion intramuscular o subcutanea.

Las composiciones terapeuticas tipicamente deben ser esteriles y estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. Las composiciones pueden formularse como una solucion, microemulsion, dispersion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentracion de farmaco. Pueden prepararse soluciones inyectables esteriles incorporando el compuesto activo (es decir anticuerpo o parte de anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una com binacion de ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion filtrada. Generalmente, se preparan dispersionesincorporando el compuesto activo en un vehiculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles liofilizados, para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado al vacio y secadopor pulverizacion que produce un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada por filtracion del mism o. La fluid ez apr opiada d e un a soluci on p uede mantenerse, por ej emplo, media nte e l uso d e u n recubrimiento tal como leciti na, mediante el mantenimiento de l tama fo de particulas requ erido e n el c aso de dispersion y mediante el u so de tensi oactivos. Puede proporci onarse absorci on p rolongada d e compos iciones inyectables incluyendo en la composicion un agente que retarda la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Los a nticuerpos y p artes de anticu erpo de la pr esente inve ncion pu eden adm inistrarse p or un a diversidad d e metodos co nocidos en l a t ecnica, a unque p ara much as a plicaciones terap euticas, la via/mo do prefer ido d e administracion es inyeccion subcutanea, inyeccion intravenosa o infusion. Como se apreciara por el experto en la materia, la via y/o modo de admi nistracion variara dependiendo de los resu ltados d eseados. En ci ertas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehiculo que protegera el compuesto contra liberacion

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rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes, parchestransdermicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polimeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilenvinil acetato, polianhidridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos metodos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o se conocen en general por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invencion puede administrarse por via oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehiculo comestible asimilable. El compuesto (y otros principios, si se desea) tambien pueden estar incluidos en una capsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos,

o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administracion terapeutica oral, los compuestos pueden incorporarse con e xcipientes y usarse e n forma de comprimid os qu e pue den ing erirse, compri midos b ucales, trociscos, cap sulas, e lixires, suspe nsiones, jarab es, o bleas y s imilares. Para a dministrar un com puesto de la invencion p or una adm inistracion d istinta de l a parenteral, p uede s er nec esario re cubrir el c ompuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivacion.

Tambien pueden incorporarse compuestos activos complementarios a las composiciones. En ciertas realizaciones un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invencion se formula conjuntamente con y/o se coadministra con uno o mas agentes terapeuticos adicionales que son utiles para tratar trastornos en los que la actividad de IL-12 es perjudicial. Po r ejemp lo, un anticuer po anti hIL-1 2 o parte d e antic uerpo de l a i nvencion puede formul arse conjuntamente y/o coadministrarse con uno o mas anticuerpos adicionales que se unen a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citocinas o que se unen a moleculas de superficie celular). Ademas, puede usarse uno o mas anticuerpos de la invencion en combinacion con dos o mas de los agentes terapeuticos anteriores. Tales terapias de c ombinacion pu eden utilizar pr ovechosamente dosificaciones men ores d e los agentes terape uticos administrados, evita ndo d e este m odo posibles to xicidades o com plicaciones as ociadas c on l as d iversas monoterapias. Se apreciara por el experto en la materia que cuando se usan los anticuerpos de la invencion como parte de una terapia de combinacion, puede ser deseable una dosificacion de anticuerpo menor que cuando se administra el anticuerpo solo a un sujeto (por ejemplo, puede conseguirse un efecto terapeutico sinergico a traves del uso de terapia de combinacion que, a su vez, permite el uso de una dosis menor del anticuerpo para conseguir el efecto terapeutico deseado).

La interleucina 12 desempefa un papel critico en la patologia asociada con una diversidad de enfermedades que implican elementos inmunes e inflamatorios. Estas enfermedades incluyen, pero sin limitacion, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis cronica juvenil, artritis de Lyme, artritis psoriasica, artritis reactiva, espondiloartropatia, lupus eritematoso si stemico, enfer medad de Crohn, co litis ul cerosa, e nfermedad infl amatoria d el i ntestino, di abetes mellitus insulinodependiente, tiroiditis, as ma, enferme dades alergicas, psoriasis, esclerodermia de derm atitis, dermatitis atopica, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplante de organos, enfermedad inmune aguda o cr onica asociada con tras plante de or ganos, sa rcoidosis, ateroscl erosis, coagulacion intravasc ular diseminada, e nfermedad d e Ka wasaki, en fermedad de Grave, sindro me nefrotico, sindrome d e fatiga cro nica, granulomatosis de Wegener, purpura de Henoch-Schonlein, vasculitis microscopica de los rifones, hepatitis activa cronica, uveitis, choque se ptico, sindrom e de cho que toxico, sindr ome de se psis, caque xia, enferme dades infecciosas, enfermedades parasitarias, sindrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversa aguda, corea de Hu ntington, enfermed ad de Parki nson, enfermed ad de Alzh eimer, apop lejia, cir rosis bil iar pri maria, an emia hemolitica, tumores mali gnos, insufic iencia card iaca, i nfarto de m iocardio, e nfermedad d e Ad dison, defici encia poliglandular de tipo I esporadica y deficiencia poliglandular de tipo II, sindrome de Schmidt, sindrome de dificultad respiratoria del adulto (aguda), alopecia, alopecia areata, artropatia seronegativa, artropatia, enfermedad de Reiter, artropatia psoriasica, artropatia colitica ulcerosa, sinovitis enteropatica, artropatia asociada con clamidia, yersinia y salmonella, espondiloartropatia, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atopica, enfermedad ampollosa autoinmune, penfigo vulgar, penfigo foliaceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolitica autoinmune, anemia h emolitica positiv a para C oombs, anemi a p erniciosa adquirida, anem ia p erniciosa j uvenil, encefa litis mialgica/Enfermedad d e R oyal F ree, c andidiasis m ucocutanea cro nica, arteritis de cel ulas gi gantes, he patitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogenica, Sindrome de Enfermedad de Inmunodeficiencia Adquirida, Enfermedades Relac ionadas con Inmun odeficiencia Ad quirida, H epatitis C, inmu nodeficiencia v ariada com un (hipogammaglobulinemia comun), cardiomiopatia dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovarica, insuficiencia ovarica prematura, enfermedad pulmonar fibrotica, alveolitis fibrotica criptogenica, enfermedad pulmonar intersticial postinflamatoria, neum onitis intersticia l, e nfermedad p ulmonar i ntersticial as ociada con e nfermedad de tej ido conectivo, enf ermedad p ulmonar asociada con enf ermedad de tej ido conectiv o mi xto, enf ermedad p ulmonar intersticial asociada con esclerosis sistemica, enfermedad pulmonar intersticial asociada con artritis reumatoide, enfermedad pulm onar asociada con lupus erit ematoso sistemico, enferme dad pulmo nar asociada co n dermatomiositis/polimiositis, enferme dad p ulmonar as ociada co n enfer medad de Sj ogren, enferm edad p ulmonar asociada con espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculitica, enfermedad pulmonar asociada con hemosiderosis, enfermed ad pulmo nar int ersticial i nducida por farma cos, fibrosis de rad iacion, bronq uiolitis obliterante, n eumonia e osinofila cro nica, enfermedad p ulmonar de i nfiltracion linfoc itica, enferme dad p ulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, artritis autoinmune de tipo I (hepatitis autoinmune clasica o lupoide), hepatitis autoinmune de tipo 2 (h epatitis de anticuerpo anti LKM), hipoglucemia mediada por autoinmunidad, resistencia a insulina de tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune

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aguda as ociada con trasp lante de org anos, enfermeda d inmune cron ica asoci ada co n traspla ntes de org anos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, leucopenia idiopatica, neutropenia autoinmune, NOS de enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscopica de los rifones, enfermedad de lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopatica o NOS, autoinmunidad de espermatozoides, esclerosis multiple (todos los subtipos), diabetes mellitus insulinodependiente, oftalmia simpatica, hipertension pulmonar secundaria de enfermedad de tejido conectivo, sindrome d e Go odpasture, ma nifestacion p ulmonar d e p oliarteritis no dosa, fibra reum atica a guda, espondilitis r eumatoide, e nfermedad de Still, escl erosis sistem ica, enferme dad de T akayasu/arteritis, trombocitopenia a utoinmune, tromboc itopenia i diopatica, enferm edad tiro idea a utoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune g ofioso (e nfermedad de H ashimoto), hip ertiroidismo auto inmune atrofic o, mixo edema primario, uveitis facogenica, vasculitis primaria yvitiligo. Los anticuerpos humanos, ypartes de anticuerpo de la invencion p ueden usarse para tratar e nfermedades autoinmunes, en particul ar l as asoci adas c on infl amacion, incluyendo espondilitis reumatoide, alergia, diabetes autoinmune, uveitis autoinmune.

Preferiblemente, los anticuerpos de la invencion o partes de union a antigeno de los mismos, se usan para tratar artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esclerosis multiple, diabetes mellitus insulinodependiente y psoriasis, como se describe en mas detalle en la seccion VII.

Un anticuerpo humano, o parte de anticuerpo, de la invencion tambien puede administrarse con uno o mas agentes terapeuticos adicionales utiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias.

Los anticuerpos de la invencion, o partes de union a antigeno de los mismos pueden usarse solos o en combinacion para tratar tales enfermedades. Deberia entenderse que los anticuerpos de la invencion o parte de union a antigeno de los mismos pueden usarse solos o en combinacion con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapeutico, seleccionandose dicho agente adicional por el experto en la materia para su fin pretendido. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapeutico que se ha reconocido en la tecnica que es util para tratar la enfermedad o afeccion que se trata por el a nticuerpo de la presente invencion. El agente adicional tambien puede ser un agente que transmita un atributo beneficioso a la composicion terapeutica, por ejemplo, un agente que efectue la viscosidad de la composicion.

Deberia entenderse adicionalmente que las combinaciones que deben incluirse dentro de la presente invencion son las combinaciones utiles para su fin pretendido. Los agentes expuestos posteriormente son ilustrativos para fines y no se pretende que sean limitantes. Las combinacionesque son parte de la presente invencion pueden ser los anticuerpos de la presente invencion y al menos un agente adicional seleccionado de las listas posteriores. La combinacion tambien puede incluir mas de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinacion es tal que la composicion formada puede realizar su funcion pretendida.

Son combinaciones preferidas farmaco o farmacos antiinflamatorios no esteroideos tambien denominados AINE que incluyen farmacos como ibuprofeno. Otras combinaciones preferidas son corticosteroides incluyendo prednisolona; los efectos secundarios bien conocidos del uso de esteroides pueden reducirse o incluso eliminarse disminuyendo la dosis de esteroides requerida cuando se tratan pacientes en combinacion con los anticuerpos anti-IL-12 de la presente invencion. Los ejemplos no limitantes de agentes terapeuticos para artritis reumatoide con los que puede combinarse un anticuerpo, o parte de anticuerpo, de la invencion incluyen los siguientes: farmaco ofarmacos antiinflamatorios supresores de citocinas (AISC); anticuerpos para o antagonistas de otras citoci nas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, 1-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invencion, o partes de union a antigeno de los mismos, pueden combinarse con anticuerpos para moleculasde superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8,CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, o sus ligandos incluyendo CD154 (gp39 o CD40L).

Las com binaciones preferidas de agentes terap euticos pueden int erferir en puntos difere ntes en la c ascada autoinmune e inflamatoria posterior; los ejemplos preferidos incluyen antagonistas de TNF como anticuerpos de TNF quimericos, h umanizados o humanos, D 2E7, (numero de serie d e solic itud de Estados Unidos 0 8/599.226 presentada el 9 de febrero de 1996), cA2 (Remicade™), CDP571, fragmentos de anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, CDP870) y r eceptores de TNF p55 o p 75 so lubles, derivados de los mism os, (p75T NFR1gG (Enbre l™) o pSSTNFRIgG (Lenercept), receptor de IL-13 soluble (slL-13) y tambien inhibidores de enzima conversora de TNFa (TACE); de forma simi lar los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, inhibidores de enzima conversora de interleucina 1, tales como Vx740, o lL-1 RA etc.) pueden ser eficaces por la misma razon. Otras combinaciones preferidas incluyen interleucina 11, anti-P7 yligando de glicoproteinas p-selectina (PSGL). Otra combinacion preferida mas son otros interactores clave de la respuesta autoinmune que pueden actuar en paralelo a, dependiendo de o en concierto con la funcion de IL-12; se prefieren especialmente antagonistas de IL-18 incluyendo anticuerpos de IL-18 o receptores de IL-18 solubles, o proteinas de union a IL-18. Se ha mostrado que IL-12 e IL-18 tienen funciones solapantes pero distintas y una combinacion de antagonistas para ambos puede ser muy eficaz. Otra combinacion preferida mas son inhibidores anti-CD4 no empobrecedores. Otras combina ciones preferidas mas inclu yen antagonistas de la ruta coestimuladora CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) incluyendo anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonistas.

Los anticuerpos de la invencion, o partes de union de los mismos, tambien pueden combinarse con agentes, tales como metotr exato, 6-MP, azatio prina sulfasa lazina, mesalazina, olsa lazina cloroquinina/hidroxicloroquina,

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pencilamina, aurotiomalato (intramuscular y oral), azatioprina, colchicina, corticosteroides (orales, inhalados y por inyeccion l ocal), agon istas de bet a-2 a drenorreceptor (salb utamol, te rbutalina, sa lmeteral), xanti nas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromilo, quetotifen, ipratropio y o xitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, AINE, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agon istas de a denosina, agentes antitromboticos, inhi bidores de com plemento, age ntes adrenergicos, agentes que interfieren con las sefalizacion por citocinas proinflamatorias tales como TNFa o IL-1 (por ejemplo, inhibidores de MAP quinasa, IRAK, NIK, IKK o p38), inhibidores de enzimas conversoras de IL-1 1 (por ejemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteina p-selectina (PSGL), inhibidores de enzima conversora de TNFa (TACE), inhibi dores d e se falizacion de linfocitos T tales como inhib idores de qu inasa, inhi bidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima conversora de angiotensina, receptores de citocinas solubles y derivados de los mismos (por ejemplo receptores de TNF p55 o p75 solubles y los derivados p75TNFRIgG (Enbrel™) y p55TNFRIgG (Lenercept), slL-1 Rl, slL-1RII, slL-6R, receptor de IL-13 s oluble (slL-13)) y citocinas antiinflamatorias (porejemplo IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF1). Las combinaciones preferidas incluyen metotrexato o leflunomida y en casos de artritis reumatoide moderada o grave, ciclosporina.

Los ejemplos no limitantes de agentes terapeuticos para enfermedad inflamatoria del intestino con los que puede combinarse un anticuerpo, o parte de anticuerpo, de la invencion incluyen los siguientes: budenosida; factor de crecimiento epidermico; corticosteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores d e lip oxigenasa; mesal amina; ol salazina; b alsalazida; an tioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-11; anticuerpos monoclonales antiIL-6; factores de crecimi ento; inhib idores de elasta sa; compuestos de pir imidil-imidazol; anticu erpos par a o antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF. Los anticuerpos de la invencion, o partes de union a antigeno de los mismos, pueden combinarse con anticuerpos para moleculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invencion, o partes de union a antigeno de los mismos, tambien pueden combinarse con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil m icofenolato, leflunomida, AINE, por ejemp lo, ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhi bidores d e fosfodiestera sa, agon istas de ade nosina, agentes a ntitromboticos, i nhibidores de complemento, agentes adrenergicos, agentes que interfieren con la sefalizacion por citocinas proinflamatorias tales como T NFa o IL-1 (p or ej emplo inhibidores de MAP q uinasa, IRAK, NIK, IKK o p38), i nhibidores de enz ima conversora de IL-11 (por e jemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteina p-selectina (PSGL), in hibidores de enzima conv ersora de T NFa, inhibi dores de sef alizacion d e linf ocitos T tales co mo inh ibidores de qu inasa, inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima conversora de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo receptores de TNF p55 o p75 solubles, sIL-IRI, slL-1 Rll, slL-6R, receptor de IL-13 soluble (slL-13)) y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGFp).

Los ejemplos preferidos de agentes terapeuticos para enfermedad de Crohn en los que un anticuerpo o una parte de union a antigeno puede combinarse incluyen los siguientes: antagonistas de TNF, por ejemplo anticuerpos anti-TNF; D2E7, (numero de s erie de solicitud de Estados Unidos 08/599.226, presentada el 9 de febr ero de 1996), cA2 (Remicade™), CDP571, fragmentos de anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, CDP870), construcciones de T NFR-Ig (p75TNFR1gG (Enbrel™) y p55TNFRIgG (Lenercept), anti-P7, ligando de glicoproteina p-selectina (PSGL), receptor de IL-13 soluble (slL-13) e inhibidores de PDE4. Pueden combinarse anticuerpos de la invencion o partes de union a antigeno de los mismos, co n corticosteroides, por ejemplo, budenosida y dexametasona. Los antic uerpos de la invencion o p artes de un ion a antige no de los mismo s, tambien pu eden combi narse con ag entes tales como sulfasalazina, acido 5-aminosalicilico y olsalazina, y agentes que interfieren con sint esis o accion de citocinas proinflamatorias tales como IL-1, por ejemplo, inhibidores de enzima conversora de IL-11 (por ejemplo, Vx740) e IL-1 ra. Tambien pueden usarse anticuerpos de la invencion o parte de union a antigeno de los mismos con inhibidores de sefalizacion de linfocitos T, por ejemplo, inhibidores de tirosina quinasa 6-mercaptopurinas. Los anticuerpos de la invencion o partes de union a antigeno de los mismos, pueden combinarse con IL-11.

Los ejemplos no limitantes de agentes terapeuticos para esclerosis multiple con los que puede combinarse un anticuerpo, o parte d e a nticuerpo, d e l a i nvencion i ncluyen los s iguientes: cort icosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferon 11 a (Avonex; Biogen); interferon 11b (Betaseron; Chiron/Berlex); Copolimero 1 (Cop-1; Copaxona; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxigeno hiperbarico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; anticuerpos para o antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL18, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF. Los anticuerpos de la invencion, o partes de union a antigeno de los mismos, pueden combinarse con anticuerpos para moleculas de superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invencion, o partes de union a antigeno de los mismos, tambien pueden combinarse con agentes, tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofe nolato, lefl unomida, AINE, por ej emplo, ibupr ofeno, corticostero ides tales como prednisolona, inhi bidores d e fosfodiestera sa, agon istas de ade nosina, agentes a ntitromboticos, i nhibidores de complemento, agentes adrenergicos, agentes que interfieren con sefalizacion por citocinas proinflamatorias tales como T NFa o IL-1 (p or ej emplo inhibidores de MAP q uinasa, IRAK, NIK, IKK o p38), i nhibidores de enz ima

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conversora de IL-11 (por e jemplo, Vx740), anti-P7s, ligando de glicoproteina p-selectina (PSGL), in hibidores de TACE, inhibidores de sefalizacion de linfocitos T tales como inhibidores de quinasa inhibidores de metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de enzima conversora de angiotensina, receptores de citocina solubles y derivados de los mismos (por ejemplo receptores deTNF p55 o p75 solubles, sIL-IRI, slL-1 Rll, slL-6R, receptor de IL-13 soluble (slL-13)) y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGFp).

Los ejemplos preferidos de agentes terapeuticos para esclerosis multiple en los que el anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo p ueden com binarse incl uyen i nterferon 1, por ejem plo, IF N11a e IFN11b; Co paxona, corticosteroides, inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF y anticuerpos para ligando de CD40 y CD80.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir una "cantidad terapeuticamente eficaz" o una "cantidad pr ofilacticamente eficaz" de u n anticuer po o parte de a nticuerpo de la invenc ion. U na "canti dad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapeutico deseado. Una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo o parte de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la patologia, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o parte de anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una en la que cualquierefecto toxico o perjudicial del anticuerpo o parte de anticuerpo se compensa por los efectos terape uticamente beneficiosos. Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profilactico deseado. Tipicamente, puesto que se usa dosis profilactica en sujetos antes de o en una etapa mas temprana de enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz.

Los regimenes de dosificacion pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada optima (por ejemplo, una respuesta terapeutica o profilactica). Por ejemplo, puede administrarse una embolada sencilla, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente segun se indique por l as exi gencias de la situ acion terape utica. Es especia lmente venta joso formular c omposiciones parenterales en formas unitarias de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. La forma de dosificacion un itaria como s e u sa en este d ocumento se refiere a u nidades fisicam ente discr etas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamiferos para tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo que se ha calculado que produce el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehiculo farmaceutico requerido. La especificacion de las formas unit arias de dosificacion de la invencion se dicta por y depende directamente de (a) las caracteristicas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico o profilactico particular para conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de la preparacion de compuestos tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Un intervalo no limitante ejemplar de una cantidad terapeutica o profilacticamente eficaz de un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invencion es 0,01-20 mg/kg, mas preferiblemente 1-10 mg/kg, aun mas preferiblemente 0,3-1 mg/kg. Debe observarse que los valores de dosificacion pueden variarcon el tipo y gravedad de la afeccion para aliviar. De be entenderse a dicionalmente que p ara c ualquier s ujeto pr ofesional, los regimenes d e dosific acion especificos deberian ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones, y que los intervalos de dosificacion expuestos en este documento son ejemplares solamente y no se pretende que limiten el alcance o practica de la composicion reivindicada.

VII. Usos de los anticuerpos de la invencion

Dada su capacidad para unirse a hlL-12, los anticuerpos anti-hIL-12, o partes de los mismos, de la invencion pueden usarse para detectar hlL-12 in vitro (por ejemplo, en una muestra biologica, tal como suero o plasma), usando un inmunoensayo conve ncional, tal como un e nsayo inmu noabsorbente ligado a enz ima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquimica tisular. La invencion proporciona un metodo para detectar hIL-12 in vitro en una muestra biologica que comprende poner en contacto una muestra biologica con un anticuerpo, o parte de anticuerpo, de la invencion y detectar el anticuerpo (o parte de anticuerpo) unido a hIL-12 o anticuerpo (o parte de anticuerpo) no unido, para detectar de este modo hIL-12 en la muestra biologica. El anticuerpo se marca directa o indirectamente con u na s ustancia detectable para f acilitar la deteccion de l antic uerpo u nido o no un ido. Las sustancias de tectables adecuadas inc luyen div ersas enzimas, grup os prostetic os, materiales f luorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano rusticano, fosfatasa alcalina, 1-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostaticos ad ecuados incluye estre ptavidina/biotina y a vidina/biotina; los e jemplos de mat eriales fluoresc entes adecuados incluyen um beliferona, fl uoresceina, is otiocianato d e fl uoresceina, ro damina, d iclorotriacinilamina fluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125l, 131l, 35S o 3H.

Como alternativa a marcar el anticuerpo, hIL-12 puede ensayarse en fluidos biologicos por un inmunoensayo de competicion utilizando patrones de rhIL-12 con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-hIL-12 no marcado. En este ensayo, la muestra biologica, los patrones de rhIL-12 marcados y el anticuerpo anti-hIL-12 se combinan y se determina la cantidad de patron de rhIL-12 marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad de hIL-12 en la

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muestra biologica es inversamente proporcional a la cantidad de patron de rhIL-12 marcado unido al anticuerpo antihIL-12.

Los anticuerpos Y61 y J695 de la invencion tambien pueden usarse para detectar IL-12 de especies distintas de seres humanos, en particular IL-12 de pri mates. Por ejemplo, puede usarse Y61 para detectar IL-12 en el mo no cynomolgus y el mono rhesus. J695 puede usarse para detectar IL-12 en el mono cynomolgus, mono rhesus y babuino. Sin embargo, ninguno de los anticuerpos reacciona de forma cruzada con IL-12 de raton o de rata (vease Ejemplo 3, subseccion F).

Los anticuerpos y partes de anticuerpo de la invencion son capaces de neutralizar actividad de hIL-12 in vitro (vease Ejemplo 3) e in vivo (vease Ejemplo 4). En consecuencia, los anticuerpos ypartes de anticuerpo de la invencion pueden usarse para inhibir la actividad de IL-12 in vitro, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene hIL-12.

En una realizacion preferida, la invencion proporciona un anticuerpo humano aislado, o parte de union a antigeno del mismo, que neutraliza la actividad de IL-12 humana, y al menos una IL-12 de primate adicional seleccionada del grupo que consiste en IL-12 de babuino, IL-12 de titi, IL-12 de chimpance, IL-12 de cynomolgus e IL-12 de rhesus, pero que no neutraliza la actividad de la IL-12 de raton. Preferiblemente, la IL-12 es IL-12 humana. Por ejemplo, en un cultivo celular que contiene, o se s ospecha que contiene, hIL-12, un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invencion puede afadirse al medio de cultivo para inhibir la actividad de hIL-12 in vitro en el cultivo.

En otra realizacion, el anticuerpo de la invencion es util en un metodo para inhibir la actividad de IL-12 en un sujeto que padece un trastorno en el que la actividad de IL-12 es perjudicial. IL-12 se ha implicado en la patofisiologia de una amplia diversidad de tra stornos (Windhagen et al ., (1995) J. Exp. Med. 182: 1 985-1996; Morita et al . (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314; Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103: 347-367; Fais et al. (1994) J. Interferon R es. 14:235-238; Parronc hi et al ., (199 7) Am. J. Path. 150:8 23-832; Montel eone et al ., (199 7) Gastroenterology. 112: 1169-1178, y Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 1 52:667-672; Parronchi et al (1997) Am. J. Path. 150:823-832). El anticuerpo de la invencion es util en metodos para inhibir la actividad de IL-12 en un sujeto que padece un trastorno tal, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto un anticuerpo o parte de anticuerpo de la invencion de modo que la actividad de IL-12 en el sujeto se inhiba. Preferiblemente, la IL-12 es IL-12 humana y el sujeto es el sujeto humano. Como alternativa, el sujeto puede ser un mamifero que exprese una IL-12 con la que reacciona de forma cruzada un anticuerpo de la invencion. Ademas el sujeto puede ser un mamifero en el que se ha introducido hIL-12 (por ejemplo, por administracion de hIL-12 o por expresion de un transgen de hIL-12). Puede administrarse un anticuerpo de la invencion a un s ujeto humano para fines terapeuticos (analizado adicionalmente posteriormente). Ademas, un anticuerpo de la invencion puede administrarse a un mamifero no humano que exprese una IL-12 con la que el anticuerpo reacciona de forma cruzada para fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Con respecto al ultimo, tales modelos animales pueden ser utiles para evaluar la eficacia terapeutica d e anticuer pos de la inv encion (por ej emplo, ens ayo d e dosific aciones y cicl os tempor ales d e administracion).

Como se usa en este documento, la frase "un trastorno en el que la actividad de IL-12 es perjudicial" pretende incluir enfermedades y otros trastornos en los que se ha mostrado que la presencia de IL-12 en un sujeto que padece el trastorno es o se sospecha que es responsable de la patofisiologia del trastorno o un factor que contribuye a un empeoramiento del trastorno. En consecuencia, un trastorno en el que la actividad de IL-12 es perjudicial es un trastorno en el que se espera que la inhibicion de la actividad de IL-12 alivie los sintomas y/o progresion del trastorno. Tales trastornos pueden manifestarse, por ejemplo, mediante un aumento en la concentracion de IL-12 en un fluido biologico de un sujeto que padece el trastorno (por ejemplo, un aumento en la concentracion de IL-12 en suero, plasma, fluido sinovial, etc. del sujeto), que puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-IL-12 como se ha descrito anteriormente. Existen numerosos ejemplos de trastornos en los que la actividad de IL-12 es perjudicial. En una real izacion, los anticu erpos o par tes de union a a ntigeno de l os mismos, pue den usarse en terapia para tratar las enfermedades o trastornos descritos en este documento. En otra realizacion, los anticuerpos,

: o partes de union a antigeno de los mismos, pueden usarse para la fabricacion de una medicina para tratar las enfermedades o trastornos descritos e n este documento. El uso de lo s anticuerpos y partes de anticuerpo de la invencion en el tratamie nto de un os po cos trastor nos especificos no limit antes se ana liza adicionalmente posteriormente:

A.: Artritis reumatoide:

Se ha implicado la interleucina 12 en el desempefo de un papel en enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide. Se ha detectado mensaje de 1L-12p40 inducible en sinovios de pacientes con artritis reumatoide y se ha mostrado que IL-12 esta presente en los fluidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide (vease por ejemplo, Morita et al., (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-314). Se ha descubierto que estan presentes celulas positivas para IL-12 en la capa de subrevestimiento del sinovio de artritis reumatoide. Los anticuerpos humanos, y partes de anticuerpo de la invencion, pueden usarse para tratar, por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis de L yme, esp ondilitis reumat oide, osteo artritis y artritis g otosa. T ipicamente, el anticuerpo, o parte d e anticuerpo, se administra por via sistemica, aunque para ciertos trastornos, puede ser beneficiosa la administracion local del anticuerpo o parte de anticuerpo. Un anticuerpo, o parte de a nticuerpo, de la invencion tambien puede

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administrarse con un o o mas age ntes terapeutic os adici onales utiles e n el tratamie nto de enfermed ades autoinmunes.

En el modelo murino de artritis inducida por colageno (CIA) para artritis reumatoide, el tratamiento de ratones con un mAb anti-IL-12 (anticuerpo monoclonal de IL-12 anti-raton de rata, C17.15) antes de artritis suprimio en gran medida la a paricion y redu jo la i ncidencia y gravedad d e e nfermedad. El trat amiento co n e l mAb a nti-IL-12 tempr ano despues de la aparicion de artritis redujo la gravedad, pero el tratamiento posterior de los ratones con el mAb anti-IL12 despues de la aparicion de enfermedad tuvo un efecto minimo en la gravedad de la enfermedad.

B. Enrermedad de Crohn

La interleucina 12 tambien desempefa un papel en la enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn. Se produce expresion aumentada de IFN-y e IL-12 en l a mucosa intestinal de pacientes con enfermedad de Crohn (vease por ejemplo, Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14: 235-238; Parronchi et al., (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832; Monteleone et al ., (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178; Berrebi et al ., (1998) Amer. J. Pathol. 152: 667-672). Se ha mostrado que los anticuerpos anti-IL-12 suprimen la enfermedad en modelos de raton de colitis, por ejemplo, ratones knockout para IL-2 con colitis inducida por TNBS, y recientemente en ratones knockout para IL-10. En consecuencia, los anticuerpos, ypartes de anticuerpo, de la invencion, pueden usarse en el tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino.

C. Esclerosis multiple

Se ha implicado la interleucina 12 como un mediador clave de esclerosis multiple. La expresion del mensaje de p40 de IL-1 2 in ducible o IL-12 en si mismo puede d emostrarse en lesiones de pacientes con escl erosis multi ple (Windhagen et al ., (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996, Drulovic et al., (1997) J. Ne urol. Sci. 14 7: 145-150). Los pacientes progresivos cron icos con esclerosis multi ple tiene n n iveles en circ ulacion e levados de IL-1 2. Las investigaciones con linfocitos T y celulas presentadoras de antigenos (APC) de pacientes con esclerosis multiple revelo una serie que se autoperpetua de interacciones inmunes como la base de esclerosis multiple progresiva que conduce a respuesta inmune de tipo Th1. La secrecion aumentada de IFN-y de los linfocitos T condujo a produccion aumentada de IL-12 por APC, que perpetuo el ciclo que conduce a un estado cronico de una activacion inmune de tipo Th1 y enfermedad (Balashov et al., (1997) Proc. Natl. Acad Sci. 94: 599-603). El papel de IL-12 en esclerosis multiple se ha investigado usando modelos de encefalomielitis alergica experimental (EAE) de raton y de rata de esclerosis multiple. En un modelo de EAE d e recaida-remision de esclerosis multiple en ratones, el p retratamiento con mAb anti-IL-12 retardo la paralisis y redujo las puntuaciones clinicas. El tratamiento con mAb anti-IL-12 en el pico de paralisis o durante el periodo de remision posterior redujo las puntuaciones clinicas. En consecuencia, los anticuerpos o partes d e un ion a a ntigeno de los mism os de l a inv encion pu eden servir par a al iviar sintomas asociados con esclerosis multiple en seres humanos.

D. Diabetes Mellitus insulinodependiente

Se ha implicado la interleucina 12 como un mediador importante de diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM). Se indujo IDDM en ratones NOD mediante administracion de IL-12, y los anticuerpos anti-IL-12 fueron protectores en un modelo de transferencia adoptiva de IDDM. Los pac ientes con IDDM de aparicion temprana con frecuencia experimentan un denominado "periodo de luna de miel" durante el que se mantiene algo de funcion de las celulas de islotes residuales. Estas celulas de islotes residuales producen insulina y regulan los niveles de glucosa en sangre mejor que la insulina administrada. El tratamiento de estos pacientes de aparicion temprana con un anticuerpo antiIL-12 puede evitar destruccion adicional de celulas de islotes, manteniendo de este modo una fuente endogena de insulina.

E. psoriasis

Se ha imp licado la i nterleucina 12 com o un mediador clave en ps oriasis. La psori asis implica lesiones cutaneas agudas y cronicas que se asocian con un perfil de expresion de citocinas de tipo TH1 (Hamid et al. (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1: 225-231; Turka et al. (1995) Mol. Med. 1: 690-699). Se detectaron ARNm de p35 y p40 de IL-12 en muestras de piel humana enferma. En consecuencia, los anticuerpos o partes de union a antigeno de los mismos de la invencion pueden servir para aliviar trastornos cutaneos cronicos tales como psoriasis.

La presente invencion se ilustra ademas por los siguientes ejemplos.

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Tabla 1. Secuencias de aminoacidos de linea germinal de familia VH3. Numeracion de acuerdo con Kabat (VH de Joe9 incluida para comparacion)

SEC: VH de CDR CDR H2

ID: linea H1

N°:: germin

al

5: Tabla 1 Secuencias de aminoacidos de linea germinal de familia VH3 Numeracion de acuerdo con Kabat

SEC: VH de (VH de Joe9 incluida para comparacion) CDR CDR H2

ID: linea H1

N°:: germin al

Tabla 1 Secuencias de aminoacidos de linea germinal de familia VA1

Numeracion de acuerdo con Kabat.

(VL de Joe9 incluida para comparacion)

SEC: Gen VL CDR H1 CDR CDR L3

ID: H2

N°:

Williams, JMB, 1996, 264, 220-232

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_abla E

Clon: H3 SEC ID N°: H3 L3 SEC ID N°: L3 koff CI50 de ensayo RB (M) CI50 de ensayo PHA (M) CI50 de IFN gamma (M)

Joe9 wt: 77 SGSYDY 110 QSYDSSLRGSRV 1,00E-01 1,50E-06 1,00E-06

Joe9 wt IgGI: 77 SGSYDY 110 QSYDSSLRGSRV 5,00E-07

70-1: 78 HGSHDN 110 Joe9 wt 1,34 e-2 2,00E-07

70-1 IgGI: 78 HGSHDN 110 Joe9 wt 2,00E-07

70-2: 79 HGSYDY 110 Joe9 wt 3,30E-02 3-5,0E-7

70-7: 80 RRRSNY 110 Joe9 wt 1,29E-01 3-5,0E-7

70-13: 81 SGSIDY 110 Joe9 wt 7,20E-02 3-5,0E-7

78-34: 77 wt 111 QSYDRGFTGSRV 1,64 e-2 2,00E-07 6,00E-07

78-25: 77 wt 112 QSYDSSLRGSRV 5,00E-02

78-28: 77 wt 112 QSYDSSLRGSRV 4,66E-02

78-35: 77 wt 113 QSYDSSLTGSRV 4,99E-02 4,00E-07

79-1: 77 wt 114 QSYDSSLWGSRV 2,00E-07 6,00E-07

101-14: 79 70-2 111 78-34 1,52E-03

101-9: 79 70-2 113 78-35 8,54E-03

101-19: 81 70-13 111 78-34 4,56E-02

101-8: 81 70-13 111 78-34 1,01 E-02

101-4: 81 70-13 113 78-35 9,76E-03

101-5: 81 70-13 113 78-35 4,45 E-02

101-11 (12): 78 70-1 111 78-34 4,5 e-3 3,00E-08

101-11 lqG1: 78 70-1 111 78-34 1,60E-09

26-1 (2,3): 78 70-1 114 79-1 7,4 e-3 6,00E-08

136-9: 82 HGSHDD 115 QTYDISESGSRV 3,20E-03

136-10: 82 HGSHDD 116 QSYDRGFTGSRV 1,40E-03 2,00E-09

136-14: 83 HGSHDN 117 QTYDRGFTGSRV 1,10E-03 3,00E-10 1,00E-07

136-15: 83 HGSHDN 118 QTYDKGFTGSSV 7,4 e-4 1,00E-10 2,00E-09

136-15 linea germinal: 83 HGSHDN 118 QTYDKGFTGSSV 4.60E-04 6.00E-09

136-16: 83 HGSHDN 119 QSYDRRFTGSRV 6.10E-04 3.00E-10 5.00E-09

136-17: 83 HGSHDN 120 QSYDWNFTGSRV 2.90E-05 2.00E-09 7.00E-09

136-18: 83 HGSHDN 121 QSYDRGFTGSRV 1.10E-03 8.00E-10

136-21: 83 HGSHDN 122 QSYDNGFTGSRV 4.20E-04 2.00E-09

136-24: 83 HGSHDN 123 QSYDNAVTASKV 8.90E-04 1.00E-09

_abla E

101-11: 84 � S�DN� _ 124 _S_DR __ SR_ 4,5x10-3 2X10-9 2,00E-08

136-15M1: 85 AK 124 QSYDRGFTGSRV 4, 00E-10

_abla E

149-4: 86 ........S.. 124 .............. 1,37x10-3 08x10-1 3,00E-09

149-5: 87 ...T.... 125 QSYDSSLWGTRV 0,02x10-3 1,2x10-10 3,00E-09

149-6: 84 ..............,. 124 .............. 2,73x10-3 6x10-10 2,00E-09

149-7: 84 ..............,. 126 ....D.... 13x10-3 9x10-10 3,00E-09

149-8: 88 K........... 2,33x10-3 3x10-9

149-9: 89 K......H. 127 ...E......M 3,54x10-3 1,8x10-10

149-11: 90 ....S.. 128 ....N....A.. 1,43x10-2 2x10-10, 4,00E-09

149-12: 84 ............ 3,73x10-3 neutralizacion

149-13: 84 2,22x10-3 5x10-10

149-14: 91 ...R..N..... 1,5x10-10 6,00E-09

92: __� S�DN 124 _S_DR __ SR_

156-1: 93 ......T 126 .....D...... 5,00E-03

156-2: 93 ......T 129 .....R......

156-3: 93 T 128 ....N....A.. 9,00E-03

156-4: 93 ......T 127 ...E.....SM.

156-5: 93 .......T 130 T..K.....S.

156-6: 92 ..... 126 ....D...... 3.00E-03

156-7: 92 �.. 129 .....R......

156-8: 92 ............ 128 ....N....A..

156-9: 92 ............ 127 ...E.....SM.

156-10: 92 ............ 130 T..K.....S.

156-11: 94 .........K 126 .....D......

156-12: 94 .........K 129 .....R......

156-13: 94 .........K 128 ....N....A..

156-14: 94 .K �� 127 ...E.....SM.

156-15: 94 .......K 130 T..K.....S.

156-16: 93 ............T 124 .........

156-17: 92 ......... 125 ................SSLW.T.. 6.00E-03

156-18: 93 ..............T 125 ....SSLW.T..

_abla E

92: __� S�DN 124 _S_DR __ SR_

103-1: 95 .. Q.R... 124 2,9x10-3

103-2: 96 K. R.R... 130 T..K.....S. 7,3x10-4 7,00E-11 1,00E-09

103-3: 97 .......K 124 ......... 2,5x10-3

_abla E

103-6: 131 .....D...T.. 4,5x10-4

103-7: 98 .......D 131 .....D...T.. 3,7x10-4 1,40E-10 1,00E-09

103-8: 99 K....... 130 T..K.....S. 3,3x10-4 6,00E-11 1,50E-09

103-14 � 9: 100 KTHGSHDN 132 QSYDRGFTGSMV 6,7 e-4 4-00E-11 1,20E-09

103-8�2: 100 KTHGSHDN 133 QTYDKGFTGSSV 5,3 e-4 1,50E-09

103-4: 101 TTHGSHDN 134 QSYDRGFTGARV 1,6 e-4 8,60E-11 9-00E-10

103-152: 101 TTHGSHDN 135 QSYERGFTGARV 8,60E-11

102: __ S S_D_ 136 _R_DR __ SR_E

170-1: 102 ......... 137 .........FK.. 2,35E-03

170-2: 102 ......... 138 VSAY.. 8,80E-04

170-3: 102 ......... 139 ��L.VTK.. 1,11E-03

170-4: 102 ......... 140 ......Y.A.... 8,11E-04

170-7: 102 ......... 141 ..........K.. 5,30E-04

170-11: 102 ......... 142 ......L.F... 4,40E-04

170-13: 102 ......... 143 YK.. 1,59E-03

170-15: 102 ......... 144 ......L.Y.L 4,43 E-03

170-19: 103 .. H..H.N 145 DYK.. 1,00E-03

170-21: 104 .. H..Q.N 146 .........P.L. 3,89E-03

170-22: 102 ........ 147 L... 5,60E-04

170-23: 103 .. H..H.N 148 .........A..W 1,00E-03 2,00E-10

1 70-24: 1.09 .. H..Q.N 149 Y... 2,80E-04 5,00E-10

1 70-35: 105 A. H..Q.N 136 ......... 1,00E-05

1 70-38: 150 .........P... 2,10E-04

1 70-39: 151 ......M.S.... 2,79E-03

1 70-36: 83 HGSHDN 152 QSYDRDSTGSRVF 4,00E-04 2,00E-10

1 70-25: 106 HGSQDT 153 QSYDSSLRGSRVF 5,00E-04 5,00E-11

_abla E

106: SGSYDY 136 _S_DR __ SR__

73-B1: 107 SGSYDY 154 H...SD 3,25E-03 >1E-8

73-B2: 107 SGSYDY 155 H.SES 2,07E-03

73-B6: 107 SGSYDY 156 H...NR 2,51 E-03 >1E-8

73-C1: 107 SGSYDY 157 H...SR....... 2,71 E-03 >1E-8

73-C2: 107 SGSYDY 158 ....SE....... 3,79E-03

73-C6: 107 SGSYDY 159 ...T........ 3,96E-03

73-D1: 107 SGSYDY 160 H...S 3,99E-03

73-D2: 107 SGSYDY 161 ...T 3,56E-03

_abla E

73-D4: 107 SGSYDY 162 H...TK....... 5,36E-03

73-D5: 107 SGSYDY 163 H.S.S........ 3,57E-03

73- E3: 107 SGSYDY 164 ....SD 4,98E-03

73-E6: 107 SGSYDY 165 H..ES........ 4,17E-03

73-F3: 107 SGSYDY 166 ....APWS..... 7,08E-03

73-F5: 107 SGSYDY 167 ...DSD....K.. 3,74E-03

73-G2: 107 SGSYDY 168 HTN.S........ 3,98E-03

73-G3: 107 SGSYDY 169 H...TR....... 3,50E-03

73-G4: 107 SGSYDY 170 ....MR....... 6,58E-03

73-G5: 107 SGSYDY 171 H.S.SDS...... 6,01 E-03

73-G6: 107 SGSYDY 172 ...NTD....... 6,30E-03

73-H2: 107 SGSYDY 173 ....S........ 5,93E-03

73- F6: 107 SGSYDY 174 H...M........ 5,87E-03

73-H3: 107 SGSYDY 175 H...N........ 6,85E-03

73-C5: 107 SGSYDY 176 H.H..D....... 4,84E-03

73-B7: 108 HGSQDN 177 QSYDSSLRGSRV 2,50E-03 7,00E-09

_abla E

136: _S_DRC__ SR__

M2 A2: 83 HGSHDN 178......IH..... 4,00E-02

M2 A4: 83 HGSHDN 179 ....S..P..... 8,49E-03

M2 A5: 83 HGSHDN 180 ....I.S...... 4,01 E-02

M2 B1: 83 HGSHDN 181 ....S.L..... 7,97E-03

M2 B3: 83 HGSHDN 182 ....I.M 4,60E-02

M2 B4: 83 HGSHDN 183 ....I.L...... 4,42 E-02

H2 B5: 83 HGSHDN 184 ....S.V...... 8,38E-03

M2 B6: 83 HGSHDN 185 ......LA.... 2,81 E-02

M2 C2: 83 HGSHDN 181 ....S.L...... 4,85E-02

M2 C3: 83 HGSHDN 186 ...T.L...... 4,62E-02

M2 C4: 83 HGSHDN 181 ....S.L...... 8,16E-03

M2 C5: 83 HGSHDN 187 ...TAL...... 4,71 E-02

M2 D1: 83 HGSHDN 188 ....IR..... 3,71 E-02

M2 D2: 83 HGSHDN 189 ....IRS 3,85E-02

M2 D3: 83 HGSHDN 190 ....NRL...... 3,33E-02

M2 D4: 83 HGSHDN 191 ...ETS....... 5,81 E-02

H2 D5: 83 HGSHDN 192 ....SSS...... 5,18E-02

_abla E

M2 D6: 83 HGSHDN 193 ....S...A.... 5,01 E-02

M2 E1: 83 HGSHDN 194 T..K.....S.. 5,32E-02

M2 E2: 83 HGSHDN 195 ....N........ 4,77E-02

M2 E6: 83 HGSHDN 196 ...T...K.... 9,77E-03

M2 F1: 83 HGSHDN 197 ....SDV...... 6,16E-02

M2 H5: 83 HGSHDN 198 ....A........ 9,90E-03

_abla E

124: _S_DR __ SR_

A5: 83 HGSHDN 199 ......THPSML 1,12E-03

A12: 83 HGSHDN 200 ......TTPRPM 1,43E-03

A4: 83 HGSHDN 201 ......RNPALT 1,47E-03

A6: 83 HGSHDN 202 ......THPWLH 1,87E-03

A10: 83 HGSHDN 203 ......NSPATV 1,87E-03

A11: 83 HGSHDN 204 ......TFPSPQ 2,07E-03

C2: 83 HGSHDN 205 ......LNPSAT 2,23E-03

A8: 83 HGSHDN 206 ......KSNKML 2,37E-03

B8: 83 HGSHDN 207 ......HTAHLY 2,40E-03

C6: 83 HGSHDN 208 ......QTPSIT 2,42E-03

A3: 83 HGSHDN 209 ......YPRNIL 2,51 E-03

B11: 83 HGSHDN 210 ......ITPGLA 2,95E-03

B5: 83 HGSHDN 211 ......QPHAVL 3,04E-03

C10: 83 HGSHDN 212 ......NSPIPT 3,10E-03

C4: 83 HGSHDN 213 ......TPNNSF 3,23E-03

C3: 83 HGSHDN 214 ....S.VDPGPY 3,34E-03

B2: 83 HGSHDN 215 ......RPRHAL 3,61 E-03

A2: 83 HGSHDN 216 PYHPIR 3,80E-03

C5: 83 HGSHDN 217 ......PHTQPT 3,91 E-03

A7: 83 HGSHDN 218 ......HNNFSP 3,95E-03

C9: 83 HGSHDN 219 ......PTHLPH 3,97E-03

83
83: HGSHDN 220 ......TPSYPT 4,12E-03

C8: 83 HGSHDN 221 ....S.TSNLLP 5,36E-03

B7: 83 HGSHDN 222 ......DSNHDL 5,45E-03

Al: 83 HGSHDN 223 ......LPRLTH 5,66E-03

C7: 83 HGSHDN 224 ......IPTSYL 5,83E-03

C12: 83 HGSHDN 225 ......LRVQAP 5,85E-03

B10: 83 HGSHDN 226 LSDSPL 6,04E-03

_abla E

B6: 83 HGSHDN 227 ....S.SLRRIL 7,58E-03

A9: 83 HGSHDN 228 ......PARTSP 7,98E-03

B9: 83 HGSHDN 229 ......RAAHPQ 8,66E-03

_abla E

124: _S_DR E_ SR_

177-D7: 83 HGSHDN 230 ......TQPASI 4,07E-04

177-G6: 83 HGSHDN 231 ......THPTMI 5,50E-04

177-D9: 83 HGSHDN 232 ......RIPABT 6,32E-04

177-C6: 83 HGSHDN 233 ......THPVPA 7,94E-04

177-H5: 83 HGSHDN 234 ......SBPIPA 1,32E-03

177-H9: 83 HGSHDN 235 ......THPVPA 1,58E-03

177-H10: 83 HGSHDN 236 ......THPTMY 3,44E-01

144-F1: 83 HGSHDN 237 ......HHYTTF 5,80E-04

43- E3: 83 HGSHDN 238 ......SHPAAE 8,00E-04

43-E9: 83 HGSHDN 239 ......TIPSIE B-00E-04

43-G2: 83 HGSHDN 240 ......SSPAIM 7,00E-04

43-G3: 83 HGSHDN 241 ...... IWPNLN 9,00E-04

31-A6: 83 HGSHDN 242 ......THPNLN 5,00E-04

31-B5: 83 HGSHDN 243 .....THPSIS 5,00E-04

124: _R_DR __ SE_

Y17: 83 HGSHDN 244 QSYDRGSAPMIN 8,90E-05 4,50E-10 >1E-8

Y19: 83 HGSHDN 245 QSYDRGHHPAMS 2,26E-04 3,00E-11 >1E-8

Y38: 83 HGSHDN 246 ......THPSIT 5,08E-04 5,50E-11 2,60E-09

Y45: 83 HGSHDN 247 ......TDPAIV 6,17E-04 4,00E-11 4,30E-09

Y61: 83 HGSHDN 248 ......THRALL 2,75 e-4 4E-11

Y61 IgG: 83 HGSHDN 248 ......THPALL 1,50E-04 1,60E-11 1,40E-10 1,30E-10

Y61 IgG lineagerminal: 83 HGSHDN 248 ......THPALL 1,50E-04 1,60E-11 1,30E-10

Y139: 83 HGSHDN 249 ......SHPALT 5,92E-04 3E-11 4,50E-10 1,60E-10

Y139 IgGI: 83 HGSHDN 249 .....SHPALT 1,00E-09

Y174: 83 HGSHDN 250 ......TTPAPE 7,55E-04 6E-11 2,00E-09

Y177: 83 HGSHDN 251 ......SHPTLI 6,61 E-04 5E-11 1,00E-09

A5: 83 HGSHDN 252 ......THPSML 4,50E-04 6,60E-11

A12: 83 HGSHDN 253 ......TTPRPM 5,57E-04 2,50E-10

D9: 83 HGSHDN 254 ......RLPAQT 8,21 E-04 3,5E-09 _

_abla E

G6: 83 HGSHDN 255 ......THPLTI 5,08E-04 1E-10 1,00E-09

G6 IgGI: 83 HGSHDN 255 ......THPLTI 1,00E-09

C6: 83 HGSHDN 256 QSYDRGQTPSIT 1,07E-03 3,5E-10 1,00E-08

Y55: 83 HGSHDN 257 QSYDRGTHFQMY 1,06E-03 1,40E-10 >1E-8

_abla E

A4: 83 HGSHDN 258 QSYDRGRNPALT 6,30E-04 2,50E-10

A03: 83 HGSHDN 259 QSYDRGTHPLTM 3,04E-04 3,00E-11 4,00E-10

A03 IgGI: 83 HGSHDN 260 QSYDRGTHPLTH 3,04 e-4 2,90E-11 3,80E-10

A03 IgG lineagerminal: 83 HGSHDN 260 QSYDRGTHPLTM 2,50E-04 3,50E-11 1,75E-10

99-B11: 83 HGSHDN 261 QSYDSGYTGSRV 5,40E-03

99-C11: 83 HGSHDN 262 QSYDSGFTGSRV 5,70E-03

99-H4: 83 HGSHDN 263 QSYDSRFTGSRV 4,80E-03

99-E9: 83 HGSHDN 262 QSYDSGFTGSRV 5,40E-03

99-H7: 83 HGSHDN 264 QSYPDGTPASRV 3,30E-03,

99-H11: 83 HGSHDN 265 QSYSTHMPISRV 4,90E-03

99-F6: 83 HGSHDN 266 QSYDSGSTGSRV 4,90E-03

99-F7: 83 HGSHDN 267 QSYPNSYPISRV 4,80E-03

99-F8: 83 HGSHDN 268 QSYIRAPQQV 3,70E-03

99-F11: 83 HGSHDN 262 QSYDSGFTGSRV 5,40E-03

99-G7: 83 HGSHDN 269 QSYLKSRAFSRV 4,80E-03

99-G11: 83 HGSHDN 270 QSYDSRFTGSRV 4,30E-03

124: _S_DR __ SR_

L3.3R3M-B1: 83 HGSHDN 271 ......FTGSMV 5,46E+00

L3.3R3M-B3: 83 HGSHDN 272 ......FTGSMV 5,51 E+00

L3.3R3M-C6: 83 HGSHDN 273 ...... FTGFDG 6,17E+00

L3.3R3M-F9: 83 HGSHDN 274 TAPALS 4,99E+00

L3.3R3M-G8: 83 HGSHDN 275 SYPALR 5,55E+00

L3.3R3M-H6: 83 HGSHDN 276 ......NWPNSN 5,69E+00

L3.3R3M-H10: 83 HGSHDN 277 ......TAPSLL 5,35E+00

L3.3R3M-A3: 83 HGSHDN 278 ......FTGSMV 5,37E+00

L3.3R3M-F8: 83 HGSHDN 279 ......TTPRIR 4,99E+00

L3.3R3M-G1: 83 HGSHDN 280 ......FTGSMV 4,21 E+00

L3.3R3M-G7: 83 HGSHDN 281 ......FTGSMV 4,24E+00

L3.3R3M-H11: 83 HGSHDN 282 ......MIPALT 3,95E+00

_abla E

_abla E

Y61-L94N: 109 CKT HGSHDN 283 QSYDRNTHPALL 8,00E-11

Y61-L94F: 109 CKT HGSHDN 284 QSYDRFTHPALL 6,00E-11

Y61-L94Y: 109 CKT HGSHDN 285 QSYDRYTHPALL 2,00E-11 2,00E-11

Y61-L94Y IgG: 109 CKT HGSHDN 285 QSYDRYTHPALL 1,27E-04 6,00E-11 5,00E-11 4-00E-11

Y61-L50Y: 109 CKT HGSHDN 286 QSYDRGTHPALL 2-00E-11 2,00E-11

Y61-L50Y IgG: 109 CKT HGSHDN 286 QSYDRGTHPALL 6,98E-05 2,00E-11 3,00E-11

Y61-L50Y-H31 E IgG: 109 CKT HGSHDN 286 QSYDRGTHPALL 2,99E-05 6,00E-11 2,00E-11

Y61-L50Y-H31 E-L94Y IgG: 109 CKT HGSHDN 287 QSYDRYTHPALL 4,64E-05 1-00E-11 1,00E-11

J 695 (Y61-L94Y- L50Y IgG ): 109 CKT HGSHDN 287 QSYDRYTHPALL 5,14E-05 5,00E-11 1,00E-11 5,00E-12

CDR L2: L50G a Y CDR L2: L50G a Y; CDRH1: H31S a E

Tabla 4 Actividad de Neutralizacion en Presencia de p40 de IL-12 Libre en Exceso

SEC ID N°:: Clon CI50 de ensayo de PHA (M) p70: p40 1:0 CI50 de ensayo de PHA (M) p70: p40 1:20 CI50 de ensayo de PHA (M) p70: p40 1:50

VH:47: 136-15 2,00E-09 5,00E-09 4,00E-09

VL48

VH:51: 149-5 6,50E-09 7,00E-09 4,00E-09

VL:52

VH:53: 149-6 9,00E-10 1,00E-09 1,00E-09

VL:54

VH:84: 149-7 3,50E-09 2,50E-09 4,00E-09

VL: 126

VH:23: Y61 IgG 1,80E-10 1,80E-10

VL24

VH:65: A03 IgGI 2,50E-10 2,20E-10

VL66

VH:31: J695 1,00E-11 3,50E-11

VL32

Ejemplos

5 Los anticuerpos descritos en los ejemplos son parte de la invencion en la medida de que cumplan los requisitos de la reivindicacion adjunta 1.

Ejemplo 1: Aislamiento de anticuerpos anti-IL-1E

A. Exploracion para anticuerpos que se unen a IL-12

Se aislaron anticuerpos para hlL-12 mediante exploracion de tres bibliotecas de presentacion de fagos de scFv separadas preparadas usando ADNc de VL y VH humanas de ARNm derivado de amigdalas humanas (denominado

15 scFv 1), linfocitos de sangre periferica y de amigdalas (PBL) (denominado scFv 2), y linfocitos derivados de medula osea (denominados BMDL). Se describen construccion de la biblioteca y metodos para seleccion en Vaughan et al. (1996) Nature Biotech. 14: 309-314.

Las bibliotecas se expl oraron usando los antigenos, subunidad p70 de IL-12 hum ana, subunidad p40 de IL-12

20 humana, IL-12 quimerica (p40 de raton/p35 humana), IL-12 de raton, IL-12 humana biotinilada e IL-12 quimerica biotinilada. Se selecc ionaron antic uerpos especificos de IL-12 usa ndo un antigeno para recu brir inmunotubos usando procedimientos convencionales (Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 5 81-597). La biblioteca de scFv 2 se exploro usando IL-12, o IL-12 biotinilada, y se genero un numero significativo de agentes de union especificos de IL

12. Se seleccionaron cinco clonotipos diferentes, determinados por patrones de digestion enzimatica de BstN1, y se

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confirmaron por secuenciacion de ADN. Los principales clonotipos fueron VHDP58/VLDPL11, VHDP77NLDPK31, VHDP47NL y VHDP77NLDPK31, todos los cuales reconocieron la subunidad p40 de IL-12.

La exploracion de la biblioteca de BMDL con p70 de IL-12 genero 3 clonotipos diferentes. Se descubrio que dos de estos eran clones con reactividad cruzada. El clon dominante se secuencio y consistia en VHDP35NLDP. Este clon reconoce la subunidad p40 de IL-12. La exploracion de la biblioteca de scFv 1, usando p70 de IL-12, no produjo anticuerpos de IL-12 especificos.

Para identificar anticuerpos de IL-12 que se unan preferentemente al heterodimero p70 o la subunidad p35 de IL-12, en lugar de la subunidad p40, se usaron la biblioteca de scFv 1 + 2 combi nada, y la biblioteca de BMDL. Para seleccionar an ticuerpos de IL-12 q ue rec onocieran e l h eterodimero p 70 o la su bunidad p3 5, se preinc ubaron bibliotecas de fagos y se seleccionaron en presencia de p40 libre. La secuenciacion de clones aislados revelo 9 linajes de anticuerpos diferentes. Las preferenc ias de s ubunidades se analizaron adicionalmente por valoracion "micro Friguet". El sobrenadante que contenia scFv se valoro en IL-12 capturada en biotina en un ELISA y se determino la DE50. La concentracion de scFv que producia 50% de DE se preincubo con concentraciones crecientes de p70 o p40 libres (inhibidores). Se midio una reduccion de la sefal de ELISA en placas recubiertas con biotina-IL12 y se represento frente a la concentracion dep70 o p40 libre. Esto proporciono a la CI50 para cada clon con respecto a p70 y p40. Si las valoraciones para ambas subunidades se solapan, entonces el scFv se une tanto a p40 como a p70. Cualquier variacion de esto proporciona el grado de preferencia de p70 frente a p40.

B. Maduracion de afinidad de linaje de anticuerpo especifico para IL-12 (Joe9)

Los clones se ensayaron con respecto a su capacidad para inhibir union de IL-12 consureceptor en un ensayo de union con receptor de IL-12 (denominado RBA), y con respecto a su capacidad para inhibir proliferacion inducida por IL-12 de blastocitos humanos estimulados por PHA (ensayo de PHA), descrito en el Ejemplo 3. El clon Joe9 tuvo el valor de CI50 mas bajo tanto en el ensayo de RBA como en el de PHA, con un valor de CI50 de 1 x 10-6 M en ambos ensayos. Ademas la region variable de cadena pesada (VH) de Joe 9 tuvo el menor numero de cambios en comparacion con la secuencia de linea germinal mas cercana COS-3, identificada de la base de datos VBASE. La tabla 1 (vease Apendice A) muestra la familia VH3 desecuencias de linea germinal, de las que COS-3 es un miembro, asi como miembros de la familia VA1 de secuencias de linea germinal. Por lo tanto, Joe9 se selecciono con respecto a maduracion de afinidad. Las secuencias de aminoacidos de VH y VL del anticuerpo de tipo silvestre Joe9 (Joe9 wt) se muestran en la Figura 1A-1D.

Para aumentar la afi nidad d e Jo e9, se re alizaron divers as m utaciones d e la re gion d eterminante de complementariedad 3 (CDR3) de las cadenas tanto pesadas como ligeras. Las variantes de CDR3 se crearon por mutagenesis de PCR dirigida usando oligonucleotidos degenerados especificos para la CDR3 de cadena pesada (denominada "H3") o la CDR3 de cadena ligera (denominada "L3"), con una media de tres sustituciones de bases en cada CDR3 (denominada "adicion"). Se realizo mutagenesis por PCR de la CDR3 de cadena pesada usando el oligonucleotido de cade na p esada de generado q ue co ntenia un a mez cla al eatoria de los cu atro nucle otidos, 5'TGTCCCTTGGCCCCA(G)(T)(A)(G)(T)(C)(A)(T)(A)(G)(C)(T)(C)(C)(C)(A)(C)(T) GGTCGTA-CAGTAATA 3' (SEC ID N°: 580), y oligonucleotido Marcador Inverso de pUC GAC ACC TCG ATC AGC GGA TAA CAA TTTCAC ACA GG (SEC ID N°: 581) para generar un repertorio de mutantes de CDR3 de cadena pesada. La cadena ligera parental se amplifico usa ndo ol igonucleotido inv erso d e Joe 9 (5'TGG GGC CAA GGG ACA3' (SEC ID N°:582)) y el oligonucleotido fdteteseq 24+21 (5'-ATT CGT CCT ATA CCG TTC TAC TTT GTC GTC TTT CCA GAC G TT AGT-3'(SEC ID N°: 583)).

Se uso la complementariedad entre los dos productos de PCR para conducir la hibridacion de los dos fragmentos en una reaccion de ensamblaje de PCR y se amplifico la biblioteca de scFv recombinada de longitud completa con Marcador Inverso de pUC (SEC ID N°: 581) y Marcador fd 5'-ATT CGT CCT ATA CCG TTC-3' (SEC ID N°: 584). Se realizo mutagenesis por PCR de la cad ena ligera usandoel oligonucleotido de cadena ligera que contenia una mezcla de los cuatro nucl eotidos 5'GGT CCCAGTTCCGAAGACCCTC-GAACC(C)(C)(T)(C)(A)(G)(G)(C)(T) (G)(C)(T)(G)(T)(C)ATATGACTGGCAGTAATAGTCAGC3' (SEC ID N°: 5 85), y oligonucleotido inverso Joe 9 5'TGG GGC CAA GGG ACA3'(SEC ID N°: 586) para pro ducir un repertorio de mutantes de CDR3 de cadena ligera. La cadena pesada parental se amplifico con Marcador Inverso de pUC (SEC ID N°: 581 ) y oligonucleotido HuJH3DIR 5'TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC3' (SEC ID N°: 587). La complementariedad entre los dos productos de PCR se uso para conducir la hibridacion de los dos fragmentos en una region de ensamblaje por PCR y la biblioteca de scFv recombinada de longitud completa se amplifico con Marcador Inverso GAC ACC TCG ATC AGC G (SEC ID N°: 588) y oligonucleotido HuJA, 2-3DIR NOT 5'GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC T AG GAC GGT CAG CTT GGT CCC 3' (SEC ID N°: 589).

Se seleccionaron mutantes de CDR3 de cadena pesada usando IL-12 biotinilada 1 nM, y se lavaron durante una hora a temperatura ambiente en PBS que c ontenia IL-12 o p40 libre a una concentracion de 7 nM. L os clones se analizaron por ELISA de fagos ylos que se unian a IL-12 se ensayaron en estudios de union cinetica de BIAcore usando una microplaca de IL-12 de baja densidad (vease procedimiento para analisis de BIAcore en el Ejemplo 5). En g eneral, el an alisis d e BIAcore mi de inter acciones de un ion e n tiemp o re al entre ligando (IL-12 humana recombinante inmovilizada en una matriz biosensora) y analito (anticuerpos en solucion) por resonancia de plasmon

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superficial (SPR) usando sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). El sistema utiliza las propiedades opticas de SPR para detectar alteraciones en concentraciones de proteinas dentro de una matriz biosensora de dextrano. Las proteinas se unen c ovalentemente a la matriz de de xtrano a co ncentraciones c onocidas. L os anticuerpos se inyectan a traves de la matriz de dextrano y la union especifica entre anticuerpos inyectados y ligando inmovilizado da como resultado una concentracion de proteinas de matriz aumentada y cambio resultante en la sefal de SPR. Estos cambios en la sefal de SPR se registran como unidades de resonancia (UR) y se presentan con respecto al tiempo a lo largo del eje y de un sensograma. Para determinar la velocidad de disociacion (koff), velocidad de asociacion (kon), constantes de velocidad de asociacion (Ka) y de velocidad de disociacion (Kd), se uso software de evaluacion cinetica BIAcore (version 2.1). Los clones que demostraron una mejora en la velocidad koff se analizaron por ensayos de neutralizacion que incluian inhibicion por anticuerpo de union de IL-12 con su receptor (ensayo d e R BA), inhi bicion de pr oliferacion i nducida p or IL-12 en blastocitos h umanos estimulados p or PH A (ensayo de PHA), e inhibicion de produccion de interferon gamma inducida por IL-12 por blastocitos humanos (ensayo de IFN gamma). Se presenta un sumario de las velocidades de disociacion y/o valores de CI50 a partir d e ensayo de neutralizacion de clones con adiciones de CDR3 de cadena pesada 70-1 a 70-13 en la Tabla 2 (vease Apendice A). El clone 70-1 presento una velocidad koff que era mejor que el clon Joe 9 parental, y tenia el valor de CI50 mas bajo de 2,0 x 10-7M. Por lo tanto el clon 70-1 se selecciono para conversion a IgG1 completa.

Los mutantes de CDR3 de cadena ligera se seleccionaron usando biotina-IL-12 1 nM y se lavaron con PBS que contenia p40 libre 7 nM. Los clones se exploraron en ELISA de fagos y los que se unieron a IL-12 se ensayaron en analisis de union de BIAcore usando microplacas de IL-12 de baja densidad. Los clones que presentaron una velocidad de disociacion que era mejor que el clon Joe 9 parental se ensayaron en ensayos de neutralizacion que median inhibicion de union del receptor de IL-12, o inhibicion de proliferacion de blastocitos de PHA. Se presenta un sumario de las velocidades de disociacion y/o valores de CI 50 a partir de los ens ayos de neutralizacion de cl ones mutantes de CDR3 de cadena ligera, 78-34 a 79-1, en la Tabla 2 (vease Apendice A).

Basandose en la velocidad Koff, los clones 78-34 y 78-35 presentaron una velocidad koff mejorada encomparacion con el Joe 9 parental. Ambos de estos cl ones se seleccionaron para analisis de combinacion con mutantes de cadena pesada.

C. Clones de combinacion

Se usaron clones de cadena pesada y ligera mutantes que mostraron las mejores caracteristicas de union para combinacion yensamblaje de scFv. Los clones mutantes con caracteristicas de potencia mejoradas se combinaron por e xtension de sol apamiento de PCR y arrastre de lo s segmentos VH y VL mut ados com o se ha descrito anteriormente. Se produjeron clones 101-14 a 26-1, mostrados en la Tabla 2 (vease Apendice A), a partir de la combinacion de mutantes de cadena pesada (70-2, 70-13 y 70-1) con mutantes de cadena ligera (78-34, 78-35 y 791). Las velocidades koff y/o valores de CI50 a partir de ensayos de neutralizacion para estos clones se presentan en la Tabla 2.

El analisis de union de BIAcore identifico que el clon 101-11, producido a partir de la combinacion del clon mutante de CDR3 de cadena pesada 70-1 con el clon mutante de CDR3 de cadena ligera 78-34, tenia una velocidad de disociacion de 0,0045 s -1. Esta velocidad k off fue una mej ora significativa en comparacion con las velocidades koff para el clon mutante de CDR3 de cadena pesada 70-1 (0,0134 s-1), o para e l clon mutante de CDR3 de cadena ligera 78-34 (0,0164 s-1) solos. Ademas, el clon 101-11 mostro una mejora significativa en ensayos de neutralizacion. En consecuencia, el clon 101-11 se selecciono para maduracion de afinidad como se describe posteriormente.

D. Maduracion de afinidad del clon 101-11

La maduracion de afinidad adicional del clon 101-11 consistio en ciclos de repeticion de mutagenesis por PCR de las CDR3 de cadena tanto pesada como ligera de 10 1-11 usando cebadores oligonucleotidicos con adiciones. Los clones se seleccionaron con concentraciones decrecientes de IL-12 biotinilada (bio-IL-12). Las caracteristicas de union de los clonesmutados se evaluaronpor analisis de union de BIAcore y ensayosde neutralizacion de RBA, PHA. Las velocidades k off y/o valores de CI50 para clones 136-9 a 170-25 se presentan en la Tabla 2 (vease Apendice A). El clon 103-14 demostro un valor de CI50 mejorado tanto en el ensayo de union del receptor como en el ensayo de b lastos de PHA. El clon 10 3-14 tambi en d emostro un a veloci dad k off baja, y en co nsecuencia se selecciono para maduracion de afinidad adicional.

E. Generacion y seleccion de bibliotecas aleatorias de CDR3 ligera de clon 103-14

El CDR3 de cadena ligera de clon 103-14 (QSYDRGFTGSMV (SEC ID N°: 590)) se selecciono aleatoriamente de forma sistematica en 3 segm entos usando 3 bibliotecas diferentes como se representan posteriormente, en las que X se codifica por un codon aleatorio de secuencia NNS, siendo N cualquier nucleotido y siendo S desoxicitosina o desoxiguanina.

L3.1 = XXXXXXFTGSMV (SEC ID N°: 591) L3.2 = QSYXXXXXXSMV (SEC ID N°: 592)

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L3.3 = QSYDRGXXXXXX (SEC ID N°: 593)

Se realizo mutagenesis aleatoria de las tres CDR de cadena ligera (denominadas L3.1, L3.2 y L3.3) del clon 103-14. La CDR3 de cadena pesada (denominada H3) del clon 103-14 no se muto. Se con struyeron cuatro bibliotecas

5 aleatorias basadas en el clon 103-14 (H3 y L3.1, L3.2 y L3.3) y se sometieron a una gran diversidad de condiciones de seleccion que implicaban usar concentracion de antigenos limitantey la presencia o ausencia de antigeno libre en exceso (p40yp70). Los resultados de selecciones (clones 73-B1 a 99-G11) seexploraron principalmente por BIAcore y en ocasiones con RBA y se muestran en la Tabla 2 (vease Apendice A).

10 La mutagenesis aleatoria de la CDR de cadena ligera de 103-14 genero el clon Y61, que mostro una mejora significativa en valor de CI50en comparacion con el clon parental 103-14. Y61 se selecciono para conversion a una IgG1 completa. La Y61-lgG1 co mpleta tiene un valor de CI50 de aproximadamente 130 pM determinado por el ensayo de PHA. El valor de CI50 no se vio afectado por un exceso molar de 50 veces de p40 libre, lo que demuestra que p40 libre no reacciono de forma cruzada con anticuerpo anti-IL-12 Y61 para reducir de este modo la union de

15 anticuerpo con el heterodimero. La secuencia de longitud completa de region variable de cadena pesada yregion variable de cadena ligera de Y61 se muestran posteriormente.

20 Secuencia peptidica de region variable de cadena ligera de Y61

Los restos de CDR se asignan de acuerdo con las definiciones de Kabat.

25 Tipicamente puede ll evarse a cabo s eleccion d e antic uerpos recom binantes co n afin idades mej oradas usa ndo metodos de presentacion de fagos. Esto se consigue mutando aleatoriamente combinaciones de restos de CDR para generar gran des bibliotecas q ue c ontienen antic uerpos d e ca dena se ncilla de diferentes secue ncias. Tipicamente, los anticuerpos con afinidades mejoradas se seleccionan basandose en su capacidad para alcanzar un

30 equilibrio en una reaccion anticuerpo-antigeno. Sin embargo, cuando se expreso scFV de Y61 en la superficie del fago y se incubo con IL-12, no se pudieron encontrar condiciones de seleccion que permitieran al sistema alcanzar equilibrio a nticuerpo-antigeno normal. El fago scF V permanecio un ido a IL-12, su puestamente debido a una interaccion no especifica, puesto que scFv de Y61 purificado muestra cinetica de disociacion normal. Puesto que los metodos habituales de maduracion de afinidad de presentacion de fagos a Y61 (es decir generacion de biblioteca y

35 selecciones por mutagenesis de multiples restos de CDR) no podian utilizarse, se desarrollo una nueva estrategia en la que se mutaban posiciones de CDR individuales.

Esta estrategia implica la seleccion de posiciones de CDR apropiadas para mutacion y se basa en la identificacion y seleccion de aminoacidos que son posiciones de mutagenesis selectiva preferidas, posiciones de contacto y/o 40 posiciones de hipermutacion. Las posiciones de contacto se definen como restos que tienen una alta probabilidad de

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contacto co n un antig eno c uando e l antigen o inter acciona con el a nticuerpo, mie ntras que l as posici ones de hipermutacion se definen como restos que se considera que tienen una alta probabilidad de hipermutacion somatica durante m aduracion d e afinidad in vi vo del anticuerpo. Son pos iciones de mutagenesis se lectiva pr eferidas posiciones de CDR que son posiciones tanto de contacto como de hipermutacion. El anticuerpo Y61 ya se optimizo en l as re giones de CD R3 usando el procedimiento de scrito en el E jemplo 1, por lo ta nto fue dificil me jorar adicionalmente el area que queda en el centro del sitio de union a anticuerpo usando metodos de seleccion de presentacion de fagos. Se obtuvieron mayores mejoras de la actividad por mutacion de posiciones de contacto potenciales fuera de las regiones CDR3 retirando un contacto perjudicial antigeno-anticuerpo u obteniendo por ingenieria genetica un nuevo contacto.

Se muestran restos de aminoacidos de Y61 que se consideraron puntos de contacto con antigeno, y las posiciones de CDR que son sitios de hipermutaciones somaticas durante maduracion de afinidad in vivo, en la Tabla 3 (vease Apendice A). Para ma duracion de afinidad de Y61, se seleccionaron 15 restos fuera de CDR3, 3 restos dentro del bucle L3, y 5 restos en el bucle H3 para mutagenesis por PCR.

Se introdujo por clonacion gen de scFv de Y61 en el vector plasmidico pUC 119 (Sfi) para mutagenesis. Se disefaron y sintetizaron oligonucleotidos con codones aleatorios para mutar cada posicion seleccionada. Despues de muta genesis por P CR, se secu encio un p equefo numero de c lones ( �24) y se expreso en una celula hospedadora, por e jemplo, en u na cel ula hosp edadora bacteriana, d e lev adura o de mamifer o. El antic uerpo expresado se purifico y la koff se midio usando un sistema BIAcore. Se ensayaron despues clones con velocidades de disociacion mejoradas, en comparacion con Y61, en ensayos de neutralizacion. Este procedimiento se repitio para otras posiciones de CDR. Se combinaron mutaciones individuales que se ha mostrado que tienen actividad de neutralizacion mejorada para generar un anticuerpo con potencia de neutralizacion aun mayor.

Las posiciones de CDR de Y61 que se mutaron para mejorar la potencia de neutralizacion, y las sustituciones de aminoacidos respectivas en cada posicion se muestran en las F iguras 2A-2H. Se proporcionan velocidades de disociacion, como se determina por analisis de BIAcore. Estas velocidades de disociacion tambien se muestran en los histogramas a la derecha de cada tabla.

Los resultados de estas sustituciones en las posiciones H30, H32, H33, H50, H53, H54, H58, H95, H97, H101, L50, L92, L93, demostraron que todas las sustituciones de aminoacidos examinadas dieron como resultado anticuerpos con velocidades de disociacion mas bajas que Y61. En las posiciones H52, L32 y L50, se descubrio que solamente una sustitucion de aminoacido mejoraba la velocidad de disociacion de Y61, todos los otros cambios afectaron adversamente a la actividad. Para L50, este cambio se ncillo Gly - Tyr mejoro significativamente (5-10 veces) la potencia de neutralizacion de Y61. Los resultados demostraron la importancia de estas posiciones para actividad de Y61, ysugieren que en la mayoria de los casos la presentacion de fagos fue capaz de seleccionar los restos optimos. Sin embargo, en las posiciones H31, H56, L30 y L94, se descubrio que varias sustituciones mejoraban la velocidad de disociacion de Y61, lo que sugiere que estas posiciones tambien eran importantes para union de antigenos, aunque el enfoque de presentacion de fagos no permitio seleccion de los restos optimos.

La mutacion selectiva de posiciones de contacto e hipermutacion de Y61 identifico el resto de aminoacido L50 en la CDR2 de cadena ligera, y el resto L94 de la CDR3 de cadena ligera, que mejoro la capacidad de neutralizacion de Y61. Una combinacion de estas mutaciones produjo un efecto aditivo, generando un anticuerpo, J695, que mostro un aumento significativo en la capacidad de neutralizacion. La secuencia de longitud completa de secuencias de region variable de cadena pesada y ligera de J695 se muestra posteriormente.

50 Secuencia peptidica de region variable de cadena ligera de J695

Los restos de CDR se asignan de acuerdo con las definiciones de Kabat.

Se muestra un sumario de los alineamientos de secuencia de region variable de cadena pesada y ligera que muestran el desarrollo de linaje de clones que estaban en la ruta de Joe9 a J695 en las Figuras 1A-1D. Las CDR y numeracion de restos son de acuerdo con Kabat.

Ejemplo 3: Actividad funcional de anticuerpos anti-hlL-1E

Para examinar la actividad funcional de los anticuerpos humanos anti-IL-12 humana de la invencion, los anticuerpos se usaron en varios ensayos que miden la capacidad de un anticuerpo para inhibir la actividad de IL-12.

A. Preparacion de linfoblastos activados por PHA humanos

Se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica humana (PBMC) de un leukopac recogido de un donante sano por centrifugacion en gradiente de Ficoll-Hypaque durante 45 minutos a 1500 rpm como se describe en Current Protocols in Immunology, Unidad 7.1. Se recogieron PBMC en la interfaz de la solucion de sangre acuosa y el medio de separac ion de linfocitos y se lavaron tres vece s con solucion s alina tampona da con fosfat o (PBS) por centrifugacion durante 15 minutos a 1500 rpm para retirar particulas Ficoll-Paque.

Las PBMC se activaron despues para formar linfoblastos como se describe en Current Protocols in Immunology, Unidad 6.16. Las PBMC lavadas se resuspendieron a 0,5-1 x 106 celulas/ml en medio completo de RPMI (medio RPMI 1640, suero bovino fetal 10% (FBS), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 !g/ml), complementado con PHA-P 0,2% (v/v) (Difco, Detroit, Ml) y se cultivaron durante cuatro dias a 37 °C en una atmosfera de CO2 5%. Despues de cuatro dias, los cultivos celulares se dividieron 1:1 en volumen en medio completo de RPMI, mas PHA-P 0,2% (v/v) e IL-2 humana recombinante 50 U/ml. Se produjo IL-2 humana recombinante por transfeccion de un vector de expresion que portaba el ADNc de IL-2 humana a celulas COS (vease Kaufman et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19, 4484-4490), y se purifico como se describe en el documento PCT/US96/01382. Los cultivos celulares se incubaron despues durante de uno a tres dias adicionales. Se recogieron blastocitos de PHA, se lavaron dos veces con medio completo de RPMI y se congelaron en FBS 95%, DMSO 5% a 10 x 106 celulas/ml.

Se recogieron blastocitos de PHA para us ar para el e nsayo de union del receptor de IL-12 (vease seccion B) despues de un dia de cultivo en presencia de IL-2, mientras que se recogieron blastocitos de PHA para usar para el ensayo de proliferacion de blastos de PHA (vease seccion C) y el ensayo de induccion de interferon gamma (vease seccion D) despues de cultivo de tres dias en presencia de IL-2.

B. Ensayo de union del receptor de IL-12

La capacidad de los anticuerpos anti-IL-12 para inhibir la union de IL-12 radiomarcada con receptores de IL-12 en blastos de PHA se analizo como sigue. Se preincubaron diversas concentraciones de anticuerpo anti-IL-12 durante una hora a 37 °C con 125l-hlL-12 50-100 pM (hlL-12 yodado se preparo usando el metodo de marcaje de Bolton-Hunter para una actividad especifica de 20-40 mCi/mg de NEN-Dupont) en tampon de union (RPMI 1640, FBS 5%, Hepes 25 mM pH 7,4). Los blastocitos de PHA aislados como se ha descrito anteriormente, se lavaron una vez y se resuspendieron en tampon de union a una densidad celular de 2 x 107 celulas/ml. Se afadieron blastos de PHA (1 x 106 celulas) a la mezcla de 125l-hlL-12 de anticuerpo y se incubo durante dos horas a temperatura ambiente. La radiactividad unida a celula se separo de 125l-hlL-12 libre por centrifugacion de la mezcla de ensayo durante 30 segundos a temperatura ambiente, aspiracion del liquido y un lavado con 0,1 ml de tampon de union, seguido de centrifugacion a 4 °C durante 4 minutos a 10.000 x g. El sedimento celular se examino con respecto a radiactividad unida a celula usando un contador gamma. La union total se determino en ausencia deanticuerpo y se determino union no especifica por inclusion de IL-12 no marcada 25 nM en el e nsayo. Se llevaron a cabo incubaciones por duplicado.

El ensayo de union al receptor de IL-12 usando los anticuerpos humanos anti-IL-12 Y61 y J695, ambos anticuerpos demostraron una inhibicion comparable de union con el receptor de IL-12. Y61 inhibio la union de receptor de IL-12 con un val or de CI 50 de apro ximadamente 1,6 x 10 -11 M, mientra s qu e J 695 t enia un val or de CI 50 de aproximadamente 1,1 x 10-11 M.

C. Ensayo de proliferacion de blastos de PHA humanos

Los anticuerpos anti-IL-12 se evaluaron con respecto a su capacidad para inhibir la proliferacion de blastos por PHA (cuya proliferacion se estimula por IL-12). Se preincubaron varias diluciones de anticuerpo anti-IL-12 durante 1 hora a 37 °C, CO2 5% con hIL-12 230 pg/ml en 100 ml de medio completo de RPMI en una placa de microtitulacion (fondo en U, 96 pocillos, Costar, Cambridge, MA). Los blastocitos de PHA aislados como se ha descrito anteriormente, se lavaron una vez y se resuspendieron en medio completo RPMI a una densidad celular de 3 x 1 05 celulas/ml. Se afadieron blastos de PHA (100 ml, 3 x 10 4celulas) a la mezcla de anticuerpo/hIL-12, se incubaron durante 3 dias a 37 °C, CO2 5% y se marcaron durante 4-6 horas con 0,5 mCi/pocillo de (3H)-Timidina (Amersham, Arlington Heights, IL). Los contenidos de cultivo se recogieron en filtros de fibra de vidrio por medio de un recolector celular (Tomtec, Orange, CT) y se mi dio la incorporacion de (3H)-Timidina a ADN celular por conteo de centelleo liquido. Todas las muestras se ensayaron por duplicado.

Los resultados de neutralizacion en pres encia de divers as concentraciones de p70:p40 (es decir la relacion de heterodimero de IL-12 y subunidad p40 libre) se muestra en la Tabla 4 (vease Apendice A).

El analisis del anticuerpo humano anti-IL-12 Y61 en el ensayo de proliferacion de blastos de PHA demostro que el anticuerpo inhibia la proliferacion de blastos por PHA con un valor de CI50 de aproximadamente 1,8 x 10-10 M en presencia de IL-12 p70 solamente, sin ningun exceso de p40 (relacion de p70:p40 de 1:0). En pr esencia de un exceso de 50 veces de p40 libre (p70:p40 a una relacion de 1:50), el anticuerpo Y61 inhibio la proliferacion de blastos por PHA con un valor de CI50 de aproximadamente 1,8 x 10-10M. Este resultado demuestra que la capacidad de Y61 para inhibir la proliferacion de blastos no esta comprometida por la presencia de p40 en exceso.

El a nticuerpo hum ano a nti-IL-12, J6 95 i nhibio pr oliferacion d e blastos por PHA con u n v alor de CI 50 de aproximadamente 1,0 x 10 -11 M en presencia de p70:p40 a una relacion de 1:0. En presencia de una relacion p70:p40 de 1:50, este a nticuerpo in hibio la pr oliferacion d e b lastos por PHA c on u n val or de CI 50 de aproximadamente 5,8 ± 2,8 x 10-12 M (n=2), lo que demuestra que el exceso de p40 tuvo solamente un ligero efecto inhibidor en el anticuerpo. Los resultados globales demuestran actividad de neutralizacion mejorada de J695 en comparacion con Y61 debido a las mutaciones en L50 y L94.

D. Ensayo de induccion de interferon gamma

La capacidad de los anticuerpos anti-IL-12 para inhibir la produccion de IFNy por blastos de PHA (cuya produccion se estimula por IL-12) se analizo como sigue. Se preincubaron diversas concentraciones de anticuerpo anti-IL-12 durante una hora a 37 °C, CO2 5% con hIL-12 200-400 pg/ml en 100 ml de medio completo RPMI en una placa de microtitulacion (fondo en U, 96 pocillos, Costar). Los blastocitos de PHA aislados como se ha descrito anteriormente, se lavaron una vez y se resuspendieron en medio completo RPMI a una densidad celular de 1 x 107 celulas/ml. Se afadieron blastos de PHA (100 !l, 1 x 106 celulas) a la mezcla de anticuerpo/hIL-12 y se incubaron durante 18 horas a 37 °C y CO2 5%. Despues de incubacion, se retiraron 150 !l de sobrenadante sin celulas de cada pocillo y el nivel de IFNy humano producido se midio por ELISA (ELISA de interferon gamma Endogen, Endogen, Cambridge, MA). Cada sobrenadante se ensayo por duplicado.

El analisis de anticuerpo humano anti-hIL-12, Y61, en este ensayo demostro que Y61 inhibia la produccion de IFNy humano con un valor de CI50 de aproximadamente 1,6 x 10 -10 M, mientras que el a nticuerpo humano anti-IL-12, J695, inhibia la produccion de IFNy humano con un valor de CI50 de aproximadamente 5,0 ± 2,3 x 10-12 M (n=3). El resultado demuestra la mejora sustancial en la afinidad de J695 como resultado de las modificaciones en L50 y L94.

E. Induccion de IL-12 no humana de PBMC aisladas

Para examinar la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-hIL-12 humanos con IL-12 de otras especies, se produjo IL-12 no humana como sigue. Se separaron PBMC de sangre heparinizada fresca por centrifugacion de gradiente de densidad como se ha descrito anteriormente usando linfoprep (Nycomed, Oslo, Noruega) para PBMC de mono cynomolgus, babuino yperro, Accu-paque (Accurate Chemical � Sci. Corp., Westbury, NY) para PBMC de perro o Lympholyte-rata (Accurate Chemical � Sci. Corp., Westbury, NY) para PBMC de rata.

Las PBMC se indujeron despues para producir IL-12 como se ha descrito (D'Andrea et al., (1992) J. Exp. Med 176, 1387-1398, Villinger et al ., (1995) J. Immun ol. 155, 3946-3954, Buettner et al ., (1998) Cytokine 10, 2 41-248). Las PBMC lavadas se resuspendieron a 1 x 106 celulas/ml en medio completo de RPMI, complementado con SAC 0,0075% (p/v) (Pansorbin; Calbiochem-Behring Co., La Jolla, CA) o ConA 1-5 mg/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mas SAC 0,0075% y se incubo durante 18 horas a 37 °C en una atmosfera de CO2 5%. Se recogio medio sin

61

celulas y sin SAC por centrifugacion y se filtro a traves de filtros de 0,2 mm.

Se obtuvo IL-12 del mono rhesus como IL-12 de rhesus recombinante de la Escuela Universitaria de M edicina Emory, Atlanta, GA. 5

F. Ensayo de proliferacion de celulas 2D6 murinas

El clon de linfocitos T murinos 2D6 prolifera en respuesta a IL-2, IL-4, IL-7 e IL-12 (Maruo et al., (1997) J. Leukocyte Biol. 61, 346-352). Tambien se detecto una proliferacion significativa en respuesta a sobrenadantes de PBMC de

10 rata que contenian IL-12 de rata. Las celulas no responden a IL-12 de perro, cynomolgus, babuino o ser humano. Las celulas 2D6 murinas se propagaron en medio completo de RPMI complementado con betamercaptoetanol (1ME) 50 mM e IL-12 murina 30 ng/ml. Un dia antes del ensayo, la IL-12 murina se retiro por lavado y las celulas se incubaron durante una noche en medio completo de RPMI mas 1ME.

15 Se preincubaron diluciones en serie de anticuerpo anti-IL-12 durante 1 hora a 37 °C, CO2 5% con IL-12 murina 40 pg/ml en 100 ml de medio completo de RPMI mas 1ME en una placa de microtitulacion (fondo en U, 96 pocillos, Costar). Se lavaron celulas2D6 una vez y se resuspendieron en medio completo RPMI que contenia 1ME a una densidad cel ular de 1 x 10 5 celul as/ml. Se afa dieron c elulas 2D 6 (1 00 !l, 1 x 10 4 celulas) a la mezcla de anticuerpo/hIL-12, se incubaron durante 3 dias a 37 °C, CO2 5% y se marcaron durante 4-6 horas con (3H)-Timidina

20 0,5 mCi/pocillo. Los contenidos del cultivo se recogieron y contaron por conteo de centelleo liquido.Todas las muestras se ensayaron por duplicado.

G. Reactividad cruzada de especie de J695 con IL-12 no humana

25 Se analizo la reactividad cruzada de especie de J695 con IL-12 no humana usando PBMC aisladas de varias especies no humanas. La presencia de actividad de IL-12 no humana en sobrenadantes de PBMC de rata, perro, cynomolgusybabuino se confirmo usando varios bioensayos descritos anteriormente, tales como el ensayo de proliferacion de celulas 2D6 murinas, el ensayo de proliferacion de blastos por PHA humanos y el ensayo de induccion de i nterferon g ama blo queando las respu estas ind ucidas por PBMC no human as co n anticu erpos

30 policlonales de conejo y/u oveja a IL-12 murina y/o humana. La reactividad cruzada de los anticuerpos humanos anti-IL-12 Y61 y J695 con IL-12 no humana en sobrenadantes de PBMC o IL-12 murina yde rhesus purificada se evaluo despues en el mismo bioensayo o bioensayos determinando la concentracion de anticuerpo J695 a la que se observo 50% de inhibicion de la respuesta. Los resultados de reactividad cruzada de especie se resumen en la Tabla 5. Los resultados demuestran que Y61 y J695 son cada una capaz de reconocer IL-12 de monos (por ejemplo

35 IL-12 de cynomolgus y rhesus para Y61, y cynomolgus, rhesus y ba buino pa ra J695) y q ue J695 es aproximadamente 35 veces menos activo en IL-12 de perro; ni Y61 ni J695 reaccionan de forma cruzada con IL-12 de raton o de rata.

H. Especificidad de citocinas humanas de J695

40 La especificidad de J695 se ensayo en un ELISA d e competicion en el que se ensayo un panel de citocinas humanas con respecto a su capacidad para interferir con la union de J695 soluble con IL-12 humana inmovilizada. El panel de citocinas humanas incluyo IL-1a e IL-11 (Genzyme, Boston, MA), IL-2 (Endogen), IL-4, IL-10, IL-17, IFNgamma, y TGF-11 (R�D, Minneapolis, MN) IL-8 (Calbiochem), PDGF, IGF-I, y IGF-II (Boehringer Mannheim Corp.,

45 Indianapolis, IN), TNFa y linfotoxina, IL-6, receptor de IL-6 soluble, IL-11, IL-12 p70, IL-12 p40, M-CSF y LIF. EBI-3, una proteina relacionada con p40 de IL-12 que se induce por infeccion por virus de Epstein-Barr en linfocitos B (Devergne et al ., (1996) J. Virol. 70,1143-1153) se expreso como una quimera de IgG-Fc humana (EBI-3/Fc). Tambien se ensayo ADN de esperma de salmon monocatenario (Sigma).

50 _abla 5 Datos de Reactividad Cruzada de Especies

CI50 (M)

Anticuerpo: IL-1E de rat6n IL-1E de rata IL-1E de perro IL-1E de cyno IL-1E de rhesus IL-1E de babuino IL-1E humana

Nombre: Especificidad Purificada PBMC sup PBMC PBMC Purificada PBMC sup Purificada

sup
sup

C17.15: amulL12 de 3,0 x 1011

rata

R03B03: amulL12 de conejo 1,5 x 10-10 6,0 x 10-10

C8.6.2: ahulL12 de raton 1,2 x 1010 1,0 x 10-10 2,0 x 10-1° 5,0 x 10-11

CI50 (M)

Nombre: Especificidad Purificada PBMC sup PBMC sup PBMC sup Purificada PBMC sup Purificada

Y61: ahulL12 humana No neutralizadora 2,2 x 1010 1,0 x 1010 1,7 x 10-10

J695: ahulL12 humana No neutralizadora No neutralizadora 3,5 x 1010 1,0 x 1011 1,0 x 10-11 1,5 x 10-11 5,0 x 10-12

Se recubrieron placas de microtitulacion de inmunoensayo de ELISA de fondo plano (96 pocillos, alta union, Costar) durante una noche a 4 °C con 0,1 ml de IL-12 hum ana (2 !g/ml en tampon de recubrimiento de carbonato 0,1 M (4 volumenes de NaHCO3 0,1 M mas 8,5 volumenes de NaHCO3 0,1 M)). Las placas se lavarondos veces con PBS

5 que contenia Tween 20 (PBS-T) 0,05%, se bloquearon con 200 !l de albumina de suero bovino 1 mg/ml (BSA, Sigma) en PBS-T durante 1 hora a te mperatura ambiente, y se levaron de nuevo dos veces con PBS-T. Las muestras (100 !l) que contenian anticuerpo de IL-12 J695 (100 ng/ml) y cada citocina (2nM) en PBS-T que contenia BSA 50 !g/ml (PBS-T/BSA) se afadieron y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 4 veces y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 !l de HRP lambda anti-humano de

10 raton (1:500 en PBS-T/BSA, Southern Biotech. Ass. Inc., Birmingham, AL). Las placas se lavaron 4 veces yse revelaron con ABTS (Kirkegaard� Perry Lab., Gaithersburg, MD) durante 20-30 minutos en oscuridad. La DO450 nm se leyo usando un lector de microplacas (Molecular Devices, Menlo Park, CA). El porcentaje de union se determino en relacion con union de J695 con la placa recubierta con IL-12 en ausencia de cualquier citocina soluble.

15 Los resultados demostraron que la union de J695 con IL-12 humana inmovilizada se bloqueo solamente por p70 de IL-12 humana y en menor grado, por p40 de IL-12 humana y no por cualquiera de las otras citocinas ensayadas.

I. Union con una molecula de IL-12 nueva

20 Se ha descrito un heterodimero de IL-12 alternativo, en el que la subunidad p35 se reemplaza por una molecula p19 nueva. P19 se identifico usando busqueda de homologia 3D de miembros de la familia IL-6/IL-12, y se sintetiza por celulas dendriticas activadas. P19 se une a p40 para formar un dimero p19/p40, que tiene actividad de tipo IL-12, pero no es tan potente como el heterodimero p35/p40 en induccion de IFNy. Se espe ra que los anticuerpos que reconocen p40 solo, pero preferiblemente en el contexto de una molecula p70 (por ejemplo, J695 e Y61, vease

25 Ejemplo 3H) tambien neutralicen tanto las moleculas p35/p40 como las moleculas p19/p40.

Ejemplo 4: Actividad in vivo de anticuerpo anti-hlL-1E

Los efectos in vivo de a nticuerpos de IL-12 e n resp uestas induc idas por IL-12 s e examin aron en u n mod elo

30 modificado del usado por Bree et al. para estudiar el efecto de IL-12 humana en hematologia periferica en mono cynomolgus, Bree et al ., (1994) Biochem Biophys Res. Comm. 204: 1150-1157. En esos estudios anteriores, la administracion de IL-12 humana a 1 !g/kg/dia durante un periodo de 5 dias dio como resultado una reduccion del recuento de globulos blancos (WBC), especialmente en los subconjuntos de linfocitos y monocitos despues de 24 horas. Se observo una reduccion en el recuento de plaquetas a las 72 horas. Los niveles de neopterina en plasma,

35 un marcador de activacion de monocitos en respuesta a IFN-y, comenzaron a elevarse a las 24 horas y fueron mas altos a las 72 horas.

En el primer estudio con anticuerpos humanos anti-hIL-12, quince monos cynomolgus sanos con un peso medio de 5 kg, se sedaron ydividieron en 5 grupos (n=3). El grupo 1 recibio una administracion intravenosa (IV) de 10 mg/kg

40 de inmunoglobulina intravenosa hum ana (IVIG, Miles, Eckhart, IN, purif icada usando proteina A Sepharose). El grupo 2 recibio una administracion intravenosa de 1 mg/kg de C8.6.2 (anticuerpo de raton neutralizador monoclonal anti-IL-12 humana). El grupo 3 recibio una administracion intravenosa de 10 mg/kg de C8.6.2. El grupo 4 recibio una administracion intravenosa de 1 mg/kg de Y61 (anticuerpo humano anti-IL-12 humana, purificado a partir de medio acondicionado para celulas CHO). El grupo 5 recibio una administracion intravenosa de 10 mg/kg de Y61.

45 Una hora despues de la administracion de anticuerpo todos los animales recibieron una inyeccion subcutanea sencilla (SC) de IL-12 humana (1 !g/kg). Se tomaron muestras sanguineas en los siguientes puntos temporales: linea basal, 8, 24, 48, 96 y 216 horas, y se analizaron con respecto a recuentos de celulas sanguineas completas con diferenciales y quimica de suero. Tambien se midieron los niveles de IL-12 humana en suero, anticuerpo C8.6.2,

50 anticuerpo Y61, IFN-gamma de mono, IL-10 de mono, IL-6 de mono y neopterina en plasma.

Los animales tratados con I L-12 mas anticuerpo de control IVIG (Grupo 1) mostraron muchos de los cambios hematologicos espera dos, i ncluyendo red ucciones d e WBC, plaqu etas, recuent o de linfocitos y recuento de monocitos. Estas reducciones no se vieron o fueron menos pronunciadas en los animales tratados con el anticuerpo

55 C8.6.2 o Y61 a 1 o 10 mg/kg (Grupos 2-5).

Se an alizaron muestras de suero o plasma por EL ISA especifico d e IF N-gamma de mon o e IL -10 de m ono (Biosource International, Camarillo, CA), IL-6 de mo no (Endogen) yneopterina en plasma (ICN Pharmaceuticals, Orangeburg. NY). No se d etectaron IF N-gamma, IL-10 o IL-6 en ni nguno d e los animales trata dos con IL-12 incluyendo los animales de control tratados con IL-12 mas IVIG. Esto se debio probablemente al bajo nivel de

5 exposicion a IL-12 (solamente una dosis de 1 !g/kg). No obstante, los niveles de neopterina en plasma aumentaron aproximadamente tres veces en los animales tratados con IL-12 mas IVIG pero no cambiaron en todos los animales tratados con C8.6.2 o Y61, incluyendo los animales tratados con dosis menor (1 mg/kg) de Y61, lo que indica que Y61 fue eficaz in vivo en el bloqueo de esta respuesta sensible a IL-12.

10 En un segundo estudio, se estudio la actividad in vivo y farmacodinamica (PD) de J695 en monos cynomolgus administrando rhl L-12 e xogena y determinando si J 695 pudo b loquear o r educir las r espuestas norm almente asociadas con administracion de rhlL-12. Se administro a monos cynomolgus macho (n=3 por grupo) una dosis sencilla de 0,05, 0,2 o 1,0 mg/kg de J695 o 1 mg/kg deinmunoglobulina intravenosa (IVIG) como una inyeccion intravenosa de embolada (IV) a traves d e una vena safena o por via subcutanea (SC) en la piel dorsal. Una hora

15 despues de la administracion de J695 o IVIG todos los animales recibieron una dosis SC sencilla de 1 !g/kg de rhIL12 en la pi el dorsal. Se recogieron muestras sanguineas a traves de la vena femoral hasta 28 dias despues de la administracion de J695. Se adquirio suero de cada muestra sanguinea y se ensayo con respecto a IL-12, J695, IFNy y anticuerpos anti-J695 por ELISA. Se ensayo neopterina por cromatografia liquida de alto rendimiento de fase inversa.

20 Los niveles de neopterina, normalizados con respecto a los niveles de neopterina que se midieron antes de la administracion de J695 o rh IL-12, se muestran en la Figura 3. Para comparar la supresion de neopterina entre grupos, el area bajo la curva (AUC) normalizado para niveles de neopterina se calculo para cada animal (Tabla 6). La exposicion a neopterina (AUC) se suprimio de unamanera dependiente de dosis entre aproximadamente 71 y

25 93% en los grupos IV y entre 71 y100% en los grupos SC, en relacion con los grupos de control IVIG. Es tos resultados sugieren que la dosis de J695 necesaria para inhibicion al 50% de la respuesta a neopterina (DE50) fue menor de 0,05 mg/kg cuando se administro por la via IV o SC.

Tabla 6: Supresion Dependiente de Dosis de Neopterina Inducida por IL-12 por J695 en Monos Cynomolgus 30

_ia de dosificaci6n de I_I o J695 y rhlL-1E: Dosis de J695 (mg/kg) Dosis de I_I (mg/kg) AUC de Niveles de Neopterina Normalizados % Reducci6n de AUC de Neopterina en Comparaci6n con Control

Inyeccion IV sencilla seguida 1 hor a despues d e una dosis de 1 !g/kg de IL-12 hu mana proporcionada SC: - 1,0 1745 ± 845 0

0,05: - 502 ± 135 71,3

0,2: - 199 ± 316 88,6

1,0: - 128 ± 292 92,7

Inyeccion SC sencilla s eguida 1 hora d espues de una dosis de 1 !g/kg de IL -12 hu mana proporcionada SC: - 1,0 1480 ± 604 0

0,05: - 426 ± 108 71,2

0,2: - 395 ± 45,9 73,3

1,0: - 0 ± 109 100

El tratami ento con J6 95 ta mbien ev ito o re dujo los cambi os en hemato logia normalmente a sociada con administracion de rhlL-12 (leucopenia y trombocitopenia). A las 24 horas despues de administracion de rhlL-12 los recuentos de linfocitos se redujeron en aproximadamente 50% en comparacion con los valores de linea basal en los

35 grupos tratados con IVIG SC e IV de control. La administracion de J695 bien SC o bien IV a los tres niveles de dosis evitaron esta reduccion, dando como resultado recuentos de linfocitos a las 24 horas aproximadamente iguales que los valores de linea basal. A las 48 horas despues de administracion de IL-12, los recuentos de plaquetas ylos grupos tratados con IVIG SC e IV s e redujeron en aproximadamente 25% en comparacion con los valores de linea basal.

40 Un programa de dosis ej emplar dirigido a mantener los niveles en suero por encima del nivel del 90% de efecto serian 1 m g/kg IV y S C pr oporcionados aproximadamente cad a d os seman as, o 0,3 mg/kg pr oporcionados aproximadamente cad a se mana, as umiendo acumulacion ligera durante d osificacion re petida. Este estudi o demuestra que el anticuerpo puede proporcionarse de forma segura a monos a tales dosificaciones. En estudios de

45 toxicidad independientes, se descubrio ademas que pueden proporcionarse de forma segura a monos hasta 100 mg/kg del anticuerpo.

64

J695 tambien fue eficaz en la prevencion de produccion de IFN-y en ratones tratados co n una IL-12 quimerica, una molecula que combina la subunidad p35 murina con la subunidad p40 de IL-12 humana. A d iferencia de IL-12 humana que es biologicamente inactiva en ratones, esta IL-12 quimerica conserva funcion biologica en ratones, incluyendo induccion de IFN-y. Ademas, la subunidad p40 humana permite a la molecula unirse y neutralizarse por 5 J695. Se a dministro IL-1 2 quimeric a a una d osis d e 0, 05 mg/kg i .p. a ratones C3H/HeJ h embra (10/gr upo experimental) en cinco dosis diarias los dias 0, 1, 2, 3 y 4. Se proporciono J695 los dias 0, 2 y 4 a las dosis de 0,05, 0,01, 0,002, 0,0004, 0,00008 y 0,000016 mg/kg i.p., 30 minutos antes de las inyecciones de IL-12. Se proporciono el hulgG1y de control IP a una dosis de 0,05 mg/kg los dias 0, 2 y 4. Se tomaron muestras sanguineas de los ratones el dia 5, y se determinaron los niveles de IFN-y en suero por ELISA. Los resultados demostraron que J695 provoco

10 inhibicion dependiente de dosis de produccion de IFN-y con una DE50 de aproximadamente 0,001 mg/kg. De forma colectiva, estos resultados demuestran que J695 es un potente inhibidor de actividad de IL-12 in vivo.

Ejemplo 5: Analisis cinetico de uni6n de anticuerpos humanos con IL-1E humana recombinante (rhIL-1E)

15 Se midieron interacciones de union en tiempo real entre ligando capturado (anticuerpo humano anti-rhIL12 J695, capturado en una matriz biosensora) y analito (rhIL12 en solucion) por resonancia de plasmon superficial (SPR) usando el sistema BIAcore ( Biacore AB, Uppsala, Suecia). El sistema utiliz a las propiedades opticas de SPR par a detectar alteraciones en la concentracion de proteinas dentro de una matriz biosensora de dextrano. Las proteinas se unen covalentemente a la matriz de dextrano a concentraciones conocidas. Los anticuerpos se inyectan a traves

20 de la matriz de dextrano y la union especifica entre anticuerpos inyectados y ligando inmovilizado da como resultado una concentracion de proteina de matriz aumentada y cambio resultante en la sefal de SPR. Estos cambios en sefal de SPR se registran como unidades de resonancia (UR) y se representan con respecto al tiempo a lo largo del eje y de un sensograma.

25 Para facilitar la inmovilizacion de IgG anti-humano de cabra (Southern Biotechnology Associates, Cat. N° 2040-01, Birmingham, AL) en la matriz biosensora, IgG anti-humano de cabra se une covalentemente mediante grupos de amina libr e c on la m atriz de de xtrano activando e n primer lu gar grupos c arboxilo en l a matriz con N hidroxisuccinimida (NHS) 100 mM y clorhidrato de N-Etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) 400 mM. A continuacion, se inyecta IgG anti-humano de cabra a traves de la matriz activada. Se inyectan treinta y cinco

30 microlitros de IgG anti-humano de cabra (25 !g/ml), diluido en acetato sodico, pH 4,5, a traves del biosensor activado y las aminas libres en la proteina se unen directamente a los grupos carboxilo activados. Los esteres de EDC de matriz que no han reaccionado se desactivan por una inyeccion de etanolamina 1 M. Estan disponibles en el mercado kits de acoplamiento de amina convencionales (Biacore AB, Cat. N° BR-1000-50, Uppsala, Suecia).

35 J695 se diluyo en tampon de ejecucion HBS (Biacore AB, Cat. N° BR-1001-88, Uppsala, Suecia) para capturarse en la matriz mediante IgG anti-humano de cabra. Para determinar la capacidad de anticuerpos especificos de rhIL-12 para unir IgG anti-humano de cabra inmovilizada, se realizo un ensayo de union como sigue. Se inyectaron alicuotas de J695 (25 !g/ml; alicuotas de 25 !l) a traves de l a matriz de dextrano acoplada con anticuerpo policlonal de IgG anti-humano de cabra a un caudal de 5 !l/minuto. Antes de la inyeccion de la proteina e inmediatamente despues,

40 se hizo fluir tampon HBS a traves de cada celda de flujo. Se interpreto que la diferencia neta de sefal entre la linea basal yel punto correspondiente a aproximadamente 30 segundos despues de la complecion de inyeccion de J695 representaba l a cantid ad de IgG1 J695 u nido (apr oximadamente 1 200 UR). Se mi dio l a un ion d e anticu erpo especifica de rhIL-12 directa con rhIL-12 soluble. Las citocinas se diluyeron en tampon de ejecucion HBS y se inyectaron alicuotas de 50 !l a traves de las matrices de proteina inmovilizada a un caudal de 5 !l/minuto. Las

45 concentraciones de rhIL-12 empleadas fueron 10, 20, 25, 40, 50, 80, 100, 150 y200 nM. Antes de la inyeccion de rhIL-12, e inmediatamente despues, el tampon HBS solo fluyo a traves de cada celda de flujo. Se interpreto que la diferencia neta de sefal de linea basal y sefal despues de la complecion de inyeccion de citocinas representaba el valor de union de la muestr a particular. Se regeneraron matrices biosensoras usando HCl 100 mM antes de la inyeccion de la siguiente muestra. Para determinar la constante de disociacion (velocidad de disociacion), constante

50 de asociacion (velocidad de asociacion), se uso software de evaluacion cinetica BIAcore (version 2.1).

Se muestras resultados representativos de union de J695 derivado de CHO con rhIL-12 en comparacion con J695 derivado de COS, en la Tabla 7.

55 Tabla 7: Union de J695 derivado de CHO o COS con rhIL-12.

Fuente: rhlL12, nM rhlL12 unido, UR Ab, unido, UR rhlL12/AB

CHO: 200 1112 1613 1,48

CHO: 150 1033 1525 1,45

CHO: 100 994 1490 1,43

CHO: 80 955 1457 1,40

CHO: 50 912 1434 1,36

CHO: 40 877 1413 1,33

CHO: 25 818 1398 1,25

65

Fuente: rhlL12, nM rhlL12 unido, UR Ab, unido, UR rhlL12/AB

CHO: 20 773 1382 1,20

CHO: 10 627 1371 0,98

COS: 200 1172 1690 1,49

COS: 150 1084 1586 1,46

COS: 100 1024 1524 1,44

COS: 80 985 1489 1,42

COS: 50 932 1457 1,37

COS: 40 894 1431 1,34

COS: 25 833 1409 1,27

COS: 20 783 1394 1,20

COS: 10 642 1377 1,00

Se analizaron cuantitativamente interacciones cineticas moleculares entre J695 capturado y rhIL-12 soluble usando tecnologia BIAcore. Se realizaron varios experimentos independientes y los resultados se analizaron por el software de analisis matematico de BIAcore para derivar constantes de velocidades cineticas, como se muestra en la Tabla 8.

Tabla 8: Velocidad cinetica aparente y constantes de afinidad de J695 para rhlL-12.

Anticuerpo: Fuente Velocidad de asociacion ( M-1s-1), Media Velocidad d e disociacion ( s-1), Media Kd (M), Media

J695: CHO 3,52E+05 4,72E-05 1,34E-10

J695: COS 3,40E+05 2,61 E-05 9,74E-11

Hubo una pequefa diferencia entre la constante aparente calculada (Kd) para la interaccion entre anticuerpos J695

10 derivados deCHO (Kd = 1,34-10M-1) y J695 derivados de COS (Kd = 9,74 x 10-11M-1). La constante de disociacion aparente (Kd) entre J695 y rhlL12 se estimo a partir de las constantes de velocidad observadas por la formula: Kd = velocidad de disociacion/velocidad de asociacion.

Para determinar la constante de velocidad de asociacion y disociacion aparente para la interaccion entre J695 y rhIL

15 12, se realizaron varias reacciones de union usando una cantidad fija de J695 (2 !g/ml) y diversas concentraciones de rhI L-12. Los senso gramas de interaccion d e union en tiempo r eal entre J69 5 c apturado y rhIL-12 s oluble mostraron que ambas forma s de anticuerpo er an m uy simil ares p ara la fase ta nto de asoc iacion com o d e disociacion.

20 Para evaluar adicionalmente la capacidad de mAb IgG1 J695 capturado para unir citocina recombinante soluble, se uso un metodo de BIAcore directo. En este metodo, se recubrio una superficie de sensor de carboximetil dextrano acoplado a Ig G anti-huma no de cabr a (25 !g/ml) con IgG1 J695 (2 !g/ml) y s e afa dio des pues citoc ina recombinante. Cuando se inyecto rhIL-12 soluble a traves de una superficie biosensora capturada con IgG1 J695 derivado de CHO o COS, la cantidad de sefal aumento a medida que aumentaba la concentracion de citocinas en la

25 solucion. No se observo union con rmIL-12 (R�D Systems, Cat. N° 419-ML, Minneapolis, MN) o rhIL12 a cualquier concentracion ensayada hasta 1000 nM. Estos resultados apoyan la conclusion de que los anticuerpos IgG1 J695 reconocen un determinante definido en rhlL-12.

La tabla 9 muestra los resultados de un experimento usando BIAcore para demostrar la union de mAb IgG1 J695 30 humano con rhIL12 solamente soluble y ninguna de las otras citocinas recombinantes.

Tabla 9: Mapeo de epitopos de J695 usando tecnologia BIAcore.

J695 de COS con ligando capturado: J695 de CHO con ligando capturado

Analito soluble

IL12 hum ano rec.: Positivo Positivo

IL12 murino rec.: Negativo Negativo

35 Ejemplo 6: Estudios adicionales de afinidad de J695 por IL-1E

Se analizaron de forma cuantitativa las interacciones cineticas moleculares entre anticuerpo J695 e IL-12 humana usando tecnologia de resonancia de plasmon de BIAcore, yse derivaron las constantes de velocidades cineticas aparentes.

Se uso tecnologia BIAcore para medir la union de rhIL-12 soluble con J695 capturado en fase solida. Se inmovilizo un anticuerpo IgG anti-humano de cabra en las microplacas biosensoras, despues se inyecto una cantidad fija de J695 y se capturo en la superficie. Se aplicaron diversas concentraciones de rhIL-12, y se midio la union de IL-12 a diferentes con centraciones de J69 5 en f uncion d el tie mpo. Se calc ularon las c onstantes d e veloci dades d e disociacion y asociacion aparentes, asumiendo disociacion de orden cero y cinetica de asociacion de primer orden, asi como int eraccion m olecular un o a uno se ncilla entre J 695 e IL-12. S e r ealizaron tres e xperimentos independientes, y l os val ores mostrados s on med ias d e los tres expe rimentos. A p artir de estas medidas, se derivaron las constantes de velocidad de disociacion (kd) y asociacion (ka) aparentes y se usaron para calcular un valor de Kd para la interaccion (vease Tabla 10). Los resultados indicaron que J695 tiene una alta afinidad por rhlL

12.

Tabla 10: Parametros Cineticos para Interaccion entre J695 e IL-12 Humana

Parametro cinetico: Valor

kd: 3,71 ± 0,40 x 10-5 s-1

ka: 3,81 ± 0,48 x 105 M-1 s-1

Kd: 9,74 x 1011 M (14 ng/ml)

15 Ejemplo 7: Caracteristicas y actividad de neutralizaci6n de C17.15, un anticuerpo monoclonal de rata para interleucina-1E murina

Para evaluar la relevancia de estudios de tratamiento de IL-12 en modelos de raton de inflamacion y autoinmunidad usando anticuerpo monoclonales especificos para IL-12 murina para enfoques similares en enfermedad humana, se examino la interaccion de C17.15, un anticuerpo monoclonal anti-IL-12 murina de rata con IL-12 murina. Se evaluo la capacidad de C17.15 para neutralizar la actividad de IL-12 murina en un ensayo de proliferacion de blastos por PHA, y para bloquear la union de IL-12 murina con receptores de superficie celular, asi como la cinetica de la interaccion de union de C 17.15-IL-12 murina.

25 En un ensayode proliferacion de blastos por PHA humano (Vease Ejemplo 3), se preincubaron diluciones en serie de C17.15 o lgG2a de rata (un anticuerpo de control) con IL-12 murina 230 pg/ml durante 1 hora a 37 °C. Se afadieron blastocitos estimulados por PHA a las mezclas de IL-12-anticuerpo y se incubaron durante 3 dias a 37 °C. Las celulas se marcaron posteriormente durante 6 horas con [3H1-timidina 1 !Ci/pocillo. Los cultivos se recogieron y se midio la incorporacion de [3H1-timidina. Se midio la proliferacion no especifica de fondo en ausencia de IL-12 murina afadida. Todas las muestras se ensayaron por duplicado. Se descubrio que la CI50 (M) de C17.15 para IL-12 murina recombinante en este ensayo era 1,4 x 10-11, en comparacion con el valor de CI50 de 5,8 x 10-12 observada para J695 para IL-12 recombinante en las mismas condiciones (vease Tabla 11).

Tabla 11: Comparacion de las propiedades de anticuerpo monoclonal anti-IL-12 humana J695 y el anticuerpo 35 monoclonal de rata anti-IL-12 de raton C17.15

Anticuerpo: Epitopo Ensayo de Interacci6n Biomolecular Ensayo de Uni6n del Receptor Ensayo de blastos de P� A

ka, velocidad de asociacion (M-1 s-1): Kd, velocidad de disociacion (s-1) Kd(M) CI50 (M) CI50 (M)

J695: Hu p40 3,81 x 105 3,71 x 10-5 9,74 x10-11 1,1 x 10-11 5,8 x 10-12

C17.15: Mu p40 3,80 x 105 1,84 x 10-4 4,80 x10-10 1,5 x 10-10 1,4 x 10-11

La capacidad de C17.15 para inhibir la union de IL-12 murina con receptores celulares tambien se midio. Se preincubaron diluciones en serie de C17.15 durante 1 hora a 37 °C co n[125l1-IL-12 murina 100 pM en tampon de union. Las celulas 2D6 (2 x 106) se afadieron a la mezcla de anticuerpo/[125l1-IL-12 murina y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. La radiactividad unida a celula se separo de [ 125I1-IL-12 libre, y se determino la radiactividad unida a celula restante. La union total de la IL-12 murina marcada con receptores en celulas 2D6 se determino en ausencia de anticuerpo, y se determino la union no especifica mediante la inclusion de IL-12 murina no marcada 25 mM en el ensayo. La union especifica se calculo como la union total menos la union no especifica. Las

45 incubaciones se llevaron a cabo por duplicado. Los resultados mostraron que C17.15 tiene una CI50 (M) de 1,5 x 1010 para inhibicion de IL-12 murina con receptores celulares.

La afinidad de C17.15 por IL-12 murina recombinante se evaluo mediante analisis de interaccion biomolecular. Se inmovilizo un anticuerpo de cabra anti-IgG de rata en las microplacas biosensoras, seguido de una inyeccion de una cantidad fija del anticuerpo C17.15, dando como resultado captura de C17.1 en la superficie de la microplaca. Se aplicaron diversas concentraciones de IL-12 murina recombinante a la superficie de C17.15, y la unionde IL-12 murina con el C17.15 inmovilizado se midio en funcion del tiempo. Se calcularon las constantes de velocidad de disociacion yasociacion aparentes, asumiendo una disociacion de orden cero ycinetica de asociacion de primer

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orden asi como una interaccion molecular uno a uno sencilla entre el C17.15 inmovilizado e IL-12 murina. A partir de estas me diciones, se c alcularon las c onstantes d e ve locidad de disociacion (k d, veloci dad d e disociacion) y asociacion (ka, velocidad de asociacion) aparentes. Estos resultados se usaron para calcular un valor de Kd para la interaccion. Se observo una tasa de asociacion de 3,8 x 105 M-1s-1, una velocidad de disociacion de 1,84 x 10-4 s-1, y una Kd de 4,8 x 10-10 para la interaccion IL-12 murina recombinante-C17.15.

Las actividades observadas de C 17.1 en actividad de IL-12 murina neutralizadora y union con receptores de superficie celular, asi como la cinetica de union de C17.15 con IL-12 murina se correlacionan con mediciones similares para la interaccion J695-rhlL-12. Esto indica que los modos de accion del anticuerpo de rata anti-IL-12 de raton C17. 15 y antic uerpo a nti-IL-12 humana J695 son casi ide nticos basa ndose en velocidad de asociacion, velocidad de disociacion, Kd, CI50, y el ensayo de blastos de PHA. Por lo tanto, se uso C17.15 como un anticuerpo homologo a J695 en modelos murinos de inflamacion y enfermedad autoinmune para estudiar los efectos del bloqueo de IL-12 en el inicio o progresion de enfermedad en estos modelos animales (vease Ejemplo 8).

Ejemplo 8: _ratamiento d e en fermedades au toinmunes o b asadas en in flamaci6n en rato nes p or administraci6n de anticuerpo a-IL-1E murina

A. Supresion de artritis inducida por colageno en ratones por el anticuerpo a-IL-12 C17.15

Se h a d emostrado un a c orrelacion e ntre l os n iveles d e IL -12 y artriti s reum atoide (AR). Por ejemplo, s e h an detectado niveles elevados de p70 de IL-12 en los sinovios de pacientes con AR en comparacion con controles sanos (Morita et al (1998) Arthritis and Rheumatism. 41: 306-314). Por lo tanto, se evaluo la capacidad de C17.15, un anticuerpo de rata anti-IL-12 de raton para suprimir artritis inducida por colageno en ratones.

Se inmunizaron ratones macho DBA/1 (10/grupo) con colageno de tipo II el Dia 0 y se trataron con C 17.15, o IgG de rata de control a 10 mg/kg p or via intraperitoneal en dias alternos del Dia -1 (1 dia antes de inmunizacion por colageno) al Dia 12. Los animales se supervisaron clinicamente con respecto al desarrollo de artritis en las patas hasta el Dia 90. La artritis se clasifico como: 0-normal; 1-artritis localizada en una articulacion; 2-mas de una articulacion implicada pero no la pata completa; 3-pata completa implicada; 4-deformidad de la pata; 5-anquilosis de las articulaciones implicadas. La puntuacion artritica de un raton fue la suma de las clasificaciones artriticas en cada pata individual del raton (maximo = 20). Los resultados se expresan como media ± ETM en cada grupo.

Los resultados, como se muestran en la Figura 4, indican que una puntuacion artritica fue medible en los ratones tratados con C17.15 solamente despues del dia 50 postratamiento, y que la puntuacion artritica media pico obtenida con los ratones tratados con C17.15 fue al menos 5 veces menor que la medida en los ratones tratados con IgG. Esto demostro que el anticuerpo de rata anti-IL-12 de raton C17.15 evito el desarrollo de artritis inducida por colageno en ratones.

B. Supresion de colitis en ratones por el anticuerpo de rata a-IL-12 murina C17.15

Se ha demostrado tambien que IL-12 desempefa un papel en el desarrollo/patologia de colitis. Por ejemplo, se ha mostrado que anticuerpos anti-IL-12 suprimen la enfermedad en modelos de raton de colitis, por ejemplo, ratones knockout para IL-2 con colitis inducida por TNBS (Simpson et al. (1998) J. Exp. Med. 187(8): 1225-34). De forma similar, se ha demostrado que anticuerpos anti-IL-2 suprimen formacion de colitis en ratones knockout para IL-10. La capacidad del anticuerpo de rata anti-IL-12 de raton, C17.15, para suprimir colitis TNBS en ratones se evaluo en dos estudios (Davidson et al. (1998) J. Immunol. 161 (6): 3143-9).

En el primer estudio, la colitis se indujo en ratones SJL sin patogenos mediante la administracion de 150 !l de solucion de etanol al 50% que contenia 2,0 mg de TNBS suministrados mediante un cateter de arteria um bilical pediatrica al recto. Los animalesde control se trataron con 150 !l de solucion de etanol al 50% solamente. Se proporciono una dosis sencilla de 0,75, 0,5, 0,25 o 0,1 mg de C17.15 o 0,75 mg de IgG2a de rata de control por via intravenosa a traves de la vena de la cola el dia 11, y el efecto terapeutico del tratamiento se evaluo pesando los animales los dias 11 y17, y por puntuacion histologica el dia 17. El p eso de los ratones tratados con C17.15 aumento en un periodo de 48 horas del tratamiento de anticuerpo y se normalizo el dia 6 despues de tratamiento. El efecto del tratamiento con C17.15 se confirmo de forma histologica. Ademas, tambien se realizaron evaluaciones de secrecion de IFN-y por linfocitos T CD4+ a partir de bazo y colon de los ratones tratados, asi como niveles de IL-12 de macrofagos derivados de colon o bazo de los ratones tratados (vease Tabla 12).

En el segundo estudio, la dosificacion se optimizo y los ratones se trataron con una dosis total de 0,1 mg o 0,5 mg de C17.15 o 0,1 mg de IgG2a de contro l, respectivamente, dividido entre los dias 12 y 14. Se descubrio que la administracion de C17.15 en una dosis sencilla a la dosificacion de 0,1 mg/raton o 0,25 mg/raton condujo solamente a mejora parcial en colitis inducida por TNBS y no dio como resultado una reduccion significativa de la produccion por linfocitos T CD4+ de IFN-y in vitro, pero si dio como resultado una reduccion significativa de la secrecion de IL12, e n c omparacion co n c ontroles no tratados. A u na dosis senc illa de 0,5 mg/rat on o mas se observo u na respuesta. Tomando la dosis mas baja de anticuerpo ensayado y administrandola en dos inyecciones divididas (los

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dias 12 y 14) mejoro el regimen de dosificacion, lo que indica que multiples dosis bajas pueden ser mas eficaces que una dosis de embolada sencilla. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12: mAb anti-IL-12 de raton C17.15 Suprime Colitis Establecida en Ratones

Dia de Inducci6n de Enfermedad 0: Dia de _ratamiento 11 Peso (g) Celulas CD4+ de bazo con I_N-y (U/ml) Macr6fagos de bazo con IL-1E (pg/ml)

Dia 11: Dia 17

_NBS + Etanol: lgG2a de control 0,75 mg 16,0 15,26 3326 300

_NBS + Etanol: C17.15 0,75 mg 16,0 20,21 1732 0

_NBS + Etanol: C17.15 0,5 mg 16,36 19,94 1723 0

_NBS + Etanol: C17.15 0,25 mg 16,28 17,7 3618 7

_NBS + Etanol: C17.15 0,1 mg 16,2 17,98 3489 22

Control de etanol: - 20,76 21,16 1135 0

La administracion de anti-IL-12 monoclonal C17.15 en dos dosis divididas separadas por un dia sumando un total de 0,1 mg/raton o 0,5 mg/raton condujo a inversion completa de colitis como se evaluo por debilitamiento y apariencia macroscopica del colon. Ademas, este programa de dosis condujo a regulacion negativa significativa de produccion

10 por linfocitos T de la lamina propia de IFN-y y produccion por macrofagos de IL-12, de modo que la ultima fue comparable a nivel es visto s en rato nes tratados co n etanol de c ontrol sin co litis de T NBS. Por lo ta nto, la administracion de C17.15 a modelos de raton para colitis de TNBS invirtio la progresionde la enfermedad de una manera dependiente de dosis.

15 C. Supresion de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones por anticuerpos a-IL-12

Se cree h abitualmente q ue IL-12 des empefa un p apel en la patogenesis d e escl erosis multiple (MS). Se ha mostrado que el mensaje de p40 de IL-12 inducible se expresa en placas agudas de pacientes con MS peronoen lesiones de infarto cerebral inflamatorias (Windhagen, A. et al. (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996). Los linfocitos T

20 de p acientes con MS (per o no li nfocitos T de control) estimula n la producc ion d e IL-12 a partir de cel ulas presentadoras de antigenosatraves de expresion de CD40L desregulada(Balashov, K. E. et al. (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94: 599-603). Los pacientes con MS tienen secrecion de IFN-y potenciada que puede bloquearse con anticuerpos a-IL-12 in vitro (Balashov, K. E. et al . (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94: 599-603). Se detectan niveles elevados de IL-12 en suero en pacientes con MS, pero no en otras enfermedades neurologicas (Nicoletti, F.

25 et al. (1996) J. Neuroimmunol. 70: 87-90). Se ha mostrado que el aumento de la produccion de IL-12 se correlaciona con actividad de enfermedad en pacientes con MS (Cormabella, M. et al. (1998) J. Clin. Invest. 102: 671-678). Se ha estudiado e l papel de IL-1 2 e n la pato genesis d e un mo delo mur ino de escl erosis multiple, e ncefalomielitis autoinmune experimental (EAE) (Leonard, J. P. et al. (1995) J. Exp. Med . 181: 281-386; Banerjee, S. et al. (1998) Arthritis Rheum. (1998) 41: S33; y Segal, B. M. et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 537-546). Se sabe que la enfermedad

30 en este modelo se induce por linfocitos T del subconjunto TH1. Por lo tanto, se evaluo la capacidad de anticuerpos aIL-12 para evitar la aparicion de EAE aguda.

Se descubrio que un anticuerpo a-IL-12 era capaz de inhibir la aparicion de EAE aguda, de suprimir la enfermedad despues de aparicion, yde reducir la gravedad de recaias en ratones inmunizados con el autoantigeno, proteina

35 basica de m ielina (B anerjee, S. et al . (19 98) Arthritis R heum. (1 998) 41: S33). L os efectos be neficiosos d e tratamiento con anticuerpo a-IL-12 en los ratones persistieron durante mas de dos meses despues de detener el tratamiento. Tambien se ha demostrado que los anticuerpos anti-IL-12 suprimen la enfermedad en ratones que son receptores de linfocitos T encefalitogenicos por transferencia adoptiva (Leonard, J. P. et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 281-386).

Ejemplo 9: _armacologia clinica de J695

En un estudio de cruce, de doble ciego, se administro a 64 sujetos humanosmasculinos sanos dosiscrecientes de J695 o p lacebo. La medic ion de C3 a de fragmento de l complemento antes de y 0,25 hor as de spues d e l a

45 dosificacion no demostro activacion del sistema de complemento. Los niveles de CRP y fibrinogeno solo aumentaron en sujetos en los que se observaron sintomas de infecciones simultaneas.

Todos los sujetos sobrevivieron y la tolerabilidad global de J695 fue muy buena. En ningun caso tuvo que detenerse el tratamiento debido a acontecimientos adversos (AA). Los AA observ ados mas habitualmente fueron cefalea y

50 resfriado comun/bronquitis, ninguno de los cuales se categorizo como grave.

Uno de los sujetos de estudio, un hombre soltero de 33 afos de ed ad,padecia psoriasis guttata al comienzo del estudio. De a cuerdo con el disef o de estudio a leatorio, este sujeto por casua lidad recibio J6 95 5 mg/kg por administracion SC. Diez dia s antes d e la admin istracion del anticuerpo, el su jeto mostro solam ente l esiones

papulares discretas pequefas en los br azos y las piernas. En el momento de la administracion del anticuerpo, el sujeto presento enrojecimiento aumentado, grosor de las placas eritematosas yaumento de hipercaratosis. Una semana despues de la administracion de J695, el sujeto informo de una mejora en la afeccion cutanea, incluyendo aplanamiento de l as l esiones y una re duccion de la f ormacion d e escamas. Poc o des pues d e la se gunda administracion de J695 (IV 5 mg/kg), la piel del sujeto estaba totalmente limpia de lesiones psoriasicas, en ausencia de ningun tratamiento local. Las placaseritematosas cubiertas con escamas blancas reaparecieron junto con la eliminacion esperada de J695 despues de la segunda administracion de anticuerpo.

Ejemplo 10: Comparaci6n de J695 producido por dos lineas celulares C�_

Para expresion recombinante de J695, se introdujo un vector de expresion recombinante que codificaba tanto la cadena pesada de anticuerpo como la cadena ligera de anticuerpo en celulas CHO dhfr- (Urlaub, G. y Chasin, LA. (1980) Proc. Natl. Acas. Sci. USA 77: 4 216-4220) mediante transfeccion mediada por fosfato calcico. Dentro del vector de e xpresion recom binante, los genes d e ca dena pes ada y l igera de anticuerpo se unen cad a u no operativamente a elem entos regul adores potenci adores/promotores (por ej emplo, deriva dos de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento regulador promotor de AdMLP/potenciador de CMV o un elemento regulador promotor de AdMLP/potenciador de SV40) para conducir niveles altos de transcripcion de los genes. El vector de expresion recombinante tambien porta un gen DHFR, que posibilita la seleccion de celulas CHO que se han transfectado con el vector usando seleccion/amplificacion de metotrexato.

Se disolvieron ciento cincuenta microgramos de un vector de expresion que codifica las secuencias peptidicas del anticuerpo humano J695 en 2,7 ml de agua en un tubo conico de 50 ml. Se afadieron trescientos !l de CaCl2 2,5 M y esta mezcla de ADN se afadio en gotas a 3 ml de solucion salina tamponada con HEPES 2 x en un tubo conico de 50 ml. Despues de agitar en vortex durante 5 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, se distribuyo 1 ml uniformemente sobre cada placa (aun en medio F12), y las placas se incubaron a 37 °C durante 4 horas. Se retiro el liquido por aspiracion y se afadieron 2 ml de DMSO 10% en F12 a cada placa. El choque con DMSO continuo durante 1 minuto, despues de lo cual se diluyo DMSO mediante la adicion de 5 ml de PBS a cada placa. Las placas se lavaron dos veces en PBS, seguido de la adicion de 10 ml de alfa MEM, complementado con H/T y 5% de FBS (selectivo para celulas que expresaban DHFR) e incubacion durante una noche a 37 °C. Las celulas se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 100 celulas por pocillo, y las placas se incubaron a 37 °C, CO2 5% durante dos semanas, con un cambio de medio por semana.

Cinco dias despues del cambio de medio final, se diluyeron sobrenadantes de cultivo 1:50 y se ensayaron usando un ELISA especifico para cadena de IgG gamma humana. Los clones que producian la sefal de ELISA mas alta se transfirieron de las placas de 96 pocillos a placas de 12 pocillos en Alfa MEM 1,5 ml/pocillo mas suero dializado 5%. Despues de 3 dias, se realizo otro ELISA especifico para cadena IgG gamma humana, y los 12 clones con la mayor actividad se dividieron en el alfa MEM mas suero dializado al 5% y MTX 20 nM. La linea celular 031898 218 que crecio en presencia de MTX 20 nM sin n inguna muerte celular aparente ni reduccion en la tasa d e crecimiento, produjo hIgG 1,8 !g/ml en un ensayo de tres dias. Los cultivos de T-25 de 031898 218, que crecian en medio que contenia MTX, produjeron una media de 11,9 !g/ml de J695. La linea, designada ALP903, se adapto a crecimiento en suspension en condiciones sin suero, en las que produjo 7,5 pg de J695/celula/24 horas.

Se pasaron celulas ALP903, despues de la seleccion inicial en medio alfa MEM/FBS 5%/MTX 20 nM, de nuevo en MTX 20 nM. Las celulas se cultivaron en seleccion de MTX 100 nM, seguido de pase en MTX 500 nM dos veces en los siguientes 30 dias. En ese momento, el cultivo estaba produciendo 32 !g de J 695/ml/24 horas. El cultivo se subclono limitando la dilucion. El subclon 218-22 produjo 16,5 !g/ml en una placa de 96 pocillos en 2 dias y 50,3 !g/ml de J695 en una placa de 12 pocillos en 2 dias. El clon 218-22 se cultivo en alfa MEM/FBS dializado 5%/MTX 500 nM durante 3 8 dias, seguido d e a daptacion a c ultivo en ag itacion sin suero, como anteriormente. L a productividad especifica de celu la m edia del c ultivo d e susp ension sin su ero, d esignado ALP 905, fu e 58 pg/celula/24 horas.

La prim era lin ea cel ular us ada par a prod ucir J695 (ALP 903) di o com o resulta do re ndimientos ma s bajos d el anticuerpo de cultivo que una segunda linea celular, ALP 905. Para asegurar que el J695 producido por ALP 905 era funcionalmente identico al producido a partir de ALP 903, ambos lotes de anticuerpos se evaluaron con respecto a afinidad de IL-12, con respecto a la capacidad para bloquear union de IL-12 con receptores celulares, con respecto a la capacidad para inhibir la induccion de IFN-y por IL-12, y con respecto a la capacidad para inhibir la proliferacion de blastos por PHA mediada por IL-12.

Las afinidades de los lotes de J695 ALP 903 yALP 905 por IL-12 se determinaron midiendo las constantes de velocidad cinetica de union con IL-12 mediante estudios de resonancia de plasmon superficial (analisis de BIAcore). La constante de velocidad de disoc iacion (kd) y la con stante d e v elocidad d e asociacion (k a) de los lotes d e anticuerpo ALP903 y ALP905 para union con rhlL-12 se determinaron en tres experimentos (como se ha descrito en el Ejemplo 3). La afinidad, Kd, de union con IL-12 se calculo dividiendo la constante de velocidad de disociacion por la constante de velocidad de asociacion. Kd se calculo para cada experimento separado y despues se promedio. Los resultados mo straron q ue l os paramet ros cinetic os deter minados y afi nidad d e un ion con rhIL-12 fueron m uy

70

similares para lotes de J695 ALP 903 y ALP 905; la Kd calculada fue 1,19 ± 0,22 x 10-10 M para el lote ALP 903 y 1,49 ± 0,47 x 10-10 M para el lote ALP 905 (vease Tabla 13).

Se evaluo la capacidad de J695 derivada tanto de ALP 903 como de ALP 905 para bloquear union de rhIL-12 con

5 receptores de IL-12 en linfoblastos T activados por PHAhumanos (vease Ejemplo 3). Cada muestra de J695 se ensayoauna concentracion de partida de 1 x 10 -8 con diluciones en serie 10 veces. El anticuerpose preincubo durante 1 hora a 37 °C con [125l1-IL-12 humano 50 pM en tampon de union. Se afadieron blastocitos de PHA a la mezcla de anticuerpo/[125l1-IL-12 humana y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. La radiactividad unida a celula se separo d e[125I1-IL-12 libre por etapas de centrifugacion ylavado, y se calculo el porcentaje de inhibicion. Los valores de CI50 para J695 se determinaron a partir de las curvas de inhibicion usando ajuste de curva de 4 parametros yse confirmaron por dos experimentos independientes. Se llevaron a cabo incubaciones por duplicado. Los resultados de los dos lotes de J695 fueron muy similares (vease Tabla 13).

Se evaluo la capacidad de J695 de celulas tanto ALP 903 como ALP 905 para inhibir produccion de IFN-y inducida

15 por rhlL-12 por linfoblastos activados por PHA humanos in vitro. Se preincubaron diluciones en serie de J695 con rhIL-12 200 pg/ml durante 1 hora a 37 °C. Se afadieron celulas de linfoblastos de PHA y se incubaron durante 18 horas a 37 °C. Despues de incubacion, se retiro sobrenadante sin celulas y se determino el nivel de IFN-y humano por ELISA. Los valores de CI50 de las curvas de inhibicion se representaron frente a la concentracion de anticuerpo usando ajuste de curva de 4 parametros. Los resultadosdemuestran que la capacidadde los dos lotes para inhibir produccion de IFN-y es muy similar.

El ensayo de proliferacion de blastocitos por PHA in vitro se uso para medir la capacidad de neutralizacion de J695 ALP 903 y ALP 905 para rhIL-12. Se preincubaron diluciones en serie de J695 de cada tipo con IL-12 humano 230 pg/ml durante 1 hora a 37 °C. A continuacion se afadieron blastocitos de PHA y se incubaron durante 3 dias a 37

25 °C. Las celulas se marcaron despues durante 6 horas con [3H1-timidina 1 !Ci/pocillo. Los cultivos se recogieron y se midio la incorporacion de [ 3H1-timidina. Se midio la proliferacion no especifica (fondo) en ausencia de rhIL-12. Se descubrio que los valores de CI50 para J695 ALP 903 y ALP 905 eran muy similares y se exponen en la Tabla 13.

La actividad de los anticuerpos J695 en la neutralizacion de actividad de rhIL-12, en el bloque de union de IL-12 con receptores de superficie celular, y en la union con rhIL-12 no disminuyo significativamente del lote ALP 903 al lote ALP 905, y por lo tanto los anticuerpos producidos a partir de estos dos tipos celulares diferentes eran equivalentes.

Tabla 13: Comparacion de las Propiedades de los lotes de J695 ALP 903 y ALP 905

Anticuerpo: ka, velocidad de as ociacion (M-1,s-1) kd, velocidad de dis ociacion (s-1) Kd (M) CI50 del ensayo de RB (M) CI50 del ensayo de blastos de PHA(M) CI50 del ensayo de IFN-y (M)

J695ALP903: 3,75 x 105 4,46 x 10-5 1,19 x 10-10 3,4 x 10-11 5,5 x 10-12 5,8 x 10-12

J695ALP905: 3,91 x 105 5,59 x 105 1,49 x 10-10 3,0 x 10-11 4,4 x 10-12 4,3 x 10-12

35 Listado de secuencias

<110> Jochen, Salfeld et al.

<120> Anticuerpos humanos que se unen a IL-12 y metodos de produccion

<130> BBI-093CPPC

<140> 45 <141>

<150> 60/126.603

<151> 25 de marzo de 1999

<160> 675

<170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 55 <211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 1 podria ser His o Ser

<220>

<223> Xaa en la posicion 4 podria ser Tyr o His

<220>

<223> Xaa en la posicion 6 podria ser Tyr, Asn o Thr

<400> 1

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 2 podria ser Ser o Thr

<220>

<223> Xaa en la posicion 4 podria ser Asp o Glu

<220>

<223> Xaa en la posicion 5 podria ser Ser, Arg o Lys

<220>

<223> Xaa en la posicion 6 podria ser Ser, Gly o Tyr

<220>

<223> Xaa en la posicion 7 podria ser Leu, Phe, Thr o Ser

<220>

<223> Xaa en la posicion 8 podria ser Arg, Ser, Thr, Trp o His

<220>

<223> Xaa en la posicion 9 podria ser Gly o Pro

<220>

<223> Xaa en la posicion 10 podria ser Ser, Thr, Ala o Leu

<220>

<223> Xaa en la posicion 11 podria ser Arg, Ser, Met, Thr o Leu

<220>

<223> Xaa en la posicion 12 podria ser Val, Ile, Thr, Met o Leu

<400> 2

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

72

<223> Xaa en la posicion 1 podria ser Gly o Tyr

<220>

<223> Xaa en la posicion 3 podria ser Asp o Ser

<220>

<223> Xaa en la posicion 4 podria ser Gln o Asn

<400> 4

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa representa Ser o Glu

<400> 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 1 podria ser Ser o Thr

<220>

<223> Xaa en la posicion 3 podria ser Ser o Gly

<220>

<223> Xaa en la posicion 4 podria ser Arg o Ser

<220>

<223> Xaa en la posicion 8 podria ser Gly o Val

<220>

<223> Xaa en la posicion 9 podria ser Ser o Ala

<220>

<223> Xaa en la posicion 10 podria ser Asn, Gly o Tyr

<220>

<223> Xaa en la posicion 11 podria ser Thr o Asp

<220>

<223> Xaa en la posicion 13 podria ser Lys o His

<400> 6

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 6 podria ser Gln o Glu

<220>

<223> Xaa en la posicion 16 podria ser Arg o Gly

73

<220>

<223> Xaa en la posicion 31 podria ser Ser o Glu

<220> 5 <223> Xaa en la posicion 84 podria ser Lys o Asn

<220>

<223> Xaa en la posicion 97 podria ser Thr, Ala o Lys

10 <220>

<223> Xaa en la posicion 98 podria ser Thr o Lys

<220>

<223> Xaa en la posicion 99 podria ser Ser o His 15

<220>

<223> Xaa en la posicion 102 podria ser Tyr o His

<220> 20 <223> Xaa en la posicion 104 podria ser Tyr, Asn o Thr

<400> 7

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30

<220>

<223> Xaa en la posicion 1 podria ser Ser o Gln

<220> 35 <223> Xaa en la posicion 2 podria ser Tyr o Ser

<220>

<223> Xaa en la posicion 13 podria ser Thr o Ala

40 <220>

<223> Xaa en la posicion 23 y 91 podria ser Ser o Thr

<220>

<223> Xaa en la posicion 25 podria ser Gly o Ser 45

<220>

<223> Xaa en la posicion 26 podria ser Arg o Ser

74

<220>

<223> Xaa en la posicion 30 podria ser Gly o Val

<220>

<223> Xaa en la posicion 31 podria ser Ser o Ala

<220>

<223> Xaa en la posicion 35 podria ser Lys o His

<220>

<223> Xaa en la posicion 51 podria ser Gly o Lys

<220>

<223> Xaa en la posicion 54 podria ser Gln o Asn

<220>

<223> Xaa en la posicion 79 podria ser Val o Leu

<220>

<223> Xaa en la posicion 93 podria ser Asp o Glu

<220>

<223> Xaa en la posicion 94 podria ser Ser, Arg o Lys

<220>

<223> Xaa en la posicion 95 podria ser Ser, Gly o Tyr

<220>

<223> Xaa en la posicion 96 podria ser Leu, Phe, Thr o Ser

<220>

<223> Xaa en la posicion 97 podria ser Arg, Ser, Thr, Trp o His

<220>

<223> Xaa en la posicion 98 podria ser Gly o Pro

<220>

<223> Xaa en la posicion 99 podria ser Ser, Thr, Ala o Leu

<220>

<223> Xaa en la posicion 100 podria ser Arg, Ser, Met, Thr o Leu

<220>

<223> Xaa en la posicion 101 podria ser Val, Ile, Thr, Met o Leu

<220>

<223> Xaa en la posicion 32 podria ser Asn, Gly o Tyr

<220>

<223> Xaa en la posicion 33 podria ser Thr o Asp

<220>

<223> Xaa en la posicion 53 podria ser Asp o Ser

<400> 8

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 2 podria ser Gly, Val, Cys o His

<220>

<223> Xaa en la posicion 3 podria ser Ser o Thr

<220>

<223> Xaa en la posicion 4 podria ser His, Thr, Val, Arg, o Ile

<220>

<223> Xaa en la posicion 5 podria ser Asp o Ser

<220>

<223> Xaa en la posicion 6 podria ser Asn, Lys, Ala, Thr, Ser, Phe, Trp, o His

<400> 9

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 4 podria ser Asp o Ser

<220>

<223> Xaa en la posicion 5 representa cualquier aminoacido

<220>

<223> Xaa en la posicion 6 podria ser Gly, Asp, Gln, Leu, Phe, Arg, His, Asn o Tyr

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

76

<220>

<223> Xaa en la posicion 1 podria ser Phe, Thr o Tyr

<220> 5 <223> Xaa en la posicion 3 podria ser Arg o Ala

<220>

<223> Xaa en la posicion 5 podria ser Asp, Ser, Glu o Ala

<220>

<223> Xaa en la posicion 6 podria ser Gly o Arg

<220>

<223> Xaa en la posicion 8 representa cualquier aminoacido 15

<220>

<223> Xaa en la posicion 10 podria ser Tyr o Glu

<400> 11

<210> 12

<211> 7 25 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 1 podria ser Gly, Tyr, Ser, Thr, Asn o Gln

<400> 12

<210> 13 35 <211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 4 y 5 representa cualquier aminoacido

<220>

<223> Xaa en la posicion 6 podria ser Tyr o His

45 <220>

<223> Xaa en la posicion 7 podria ser Gly, Met, Ala, Asn o Ser

<400> 13

<210> 14

<211> 13

<212> PRT 55 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 9 podria ser Ser, Cys, Arg, Asn, Asp o Thr

<220>

77

<223> Xaa en la posicion 10 podria ser Asn, Met o Ile

<220>

<223> Xaa en la posicion 11 podria ser Thr, Tyr, Asp, His, Lys o Pro

<400> 14

10 <210> 15

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <220>

<223> Xaa en la posicion 30 podria ser Ser o Glu

<220>

<223> Xaa en la posicion 83 podria ser Lys o Asn

20 <220>

<223> Xaa en la posicion 5 podria ser Gln o Glu

<400> 15

<210> 16

<211> 112

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 1 podria ser Ser o Gln

35 <220>

<223> Xaa en la posicion 2 podria ser Tyr o Ser

<220>

<223> Xaa en la posicion 13 podria ser Thr o Ala 40

<220>

<223> Xaa en la posicion 25 podria ser Gly o Ser

<220> 45 <223> Xaa en la posicion 51 y 95 podria ser Gly o Tyr

78

<220>

<223> Xaa en la posicion 79 podria ser Val o Leu

<400> 16

10: <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 17

15

20: <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 18

25 30: <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19

35 <210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

40 <400> 20 30 <210> 24

5: <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 21

10

15: <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 22

20 25: <210> 23 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 24 <210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

5

<400> 29

10: <210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15: <400> 30

<210> 31

20: <211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

25

<210> 32

<211>: 112 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211>: 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 112

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 112

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa en la posicion 32 representa Gly o Tyr

20 <400> 36 <210> 37

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 38 <210> 39

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 40 <210> 41

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 42 <210> 43

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 44 <210> 45

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 46 <210> 47

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 48 <210> 49

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 50 <210> 51

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 52 <210> 53

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 54 <210> 55

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 56 <210> 57

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 60

96

<210> 61

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 62

97

<210> 63

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 69

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 64

<210> 65

<211> 115 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 112

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 66

99

<210> 67

<211> 115 5 <212> PRT

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 563

<210> 564

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 564

<210> 565

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 565

<210> 566

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 566

<210> 567

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 567

<210> 568

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 568 <210> 569

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 569

<210> 570

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 570

<210> 571

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 571

<210> 572

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 572

<210> 573

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 573

<210> 574

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 574

<210> 575

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 575

<210> 576

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 576

<210> 577

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 577

<210> 578

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 578

<210> 579

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 579

<210> 580

<211> 48

<212> ADN

<213> construccion sintetica

<223> los nucleotidos de las posiciones 16 a 34 pueden sustituirse con cualquier nucleotido de modo que los nucleotidos aleatorios representen el 12% de la secuencia

<400> 580 tgtcccttgg ccccagtagt catagctccc actggtcgta cagtaata 48

<210> 581

<211> 35

186

<212> ADN

<213> construccion sintetica

<400> 581 gacacctcga tcagcggata acaatttcac acagg 35

<210> 582

<211> 15

<212> ADN

<213> construccion sintetica

<400> 582 tggggccaag ggaca 15

<210> 583

<211> 45

<212> ADN

<213> construccion sintetica

<400> 583 attcgtccta taccgttcta ctttgtcgtc tttccagacg ttagt 45

<210> 584

<211> 18

<212> ADN

<213> construccion sintetica

<400> 584 attcgtccta taccgttc 18

<210> 585

<211> 66

<212> ADN

<213> construccion sintetica

<223> los nucleotidos de las posiciones 28 a 42 pueden sustituirse con cualquier nucleotido de modo que los nucleotidos aleatorios representen el 12% de la secuencia

<400> 585

<210> 586

<211> 15

<212> ADN

<213> construccion sintetica

<400> 586 tggggccaag ggaca 15

<210> 587

<211> 24

<212> ADN

<213> construccion sintetica

<400> 587 tgaagagacg gtgaccattg tccc 24

<210> 588

<211> 16

<212> ADN

<213> construccion sintetica

<400> 588 gacacctcga tcagcg 16

187

<210> 589

<211> 48

<212> ADN

<213> construccion sintetica

<400> 589 gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtcagc ttggtccc 48

<210> 590

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 590

<210> 591

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Xaa se codifica por un codon aleatorio de secuencia NNS siendo N cualquier nucleotido y siendo S desoxicitosina o desoxiguanidina

<400> 591

<210> 592

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 592

<210> 593

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 593

<210> 594

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

188

<400> 594

<210> 595

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10

<400> 595

15 <210> 596

<211> 100

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 596 <210> 597

<211> 100 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 597

<210> 598

<211> 98

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 598 <210> 599

<211> 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 599

<210> 600

<211> 98

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 600

<210> 601

<211> 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 601

<210> 602

<211> 98

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 602

192

<210> 603

<211> 100 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 603

<210> 604

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 604

193

<210> 605

<211> 100 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 605

<210> 606

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 606 <210> 607

<211> 100 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 607

<210> 608

<211> 100

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 608 <210> 609

<211>: 100 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 609

<210> 610

<211>: 98 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 610

<210> 611

<211>: 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 611

<210> 612

<211>: 98 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 612

197

<210> 613

<211>: 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 613

<210> 614

<211> 98

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 614 <210> 615

<211> 97 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 615

<210> 616

<211> 97

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 616

<210> 617

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 617

<210> 618

<211> 97

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 618

<210> 619

<211> 98

<212> PRT

200

<213> Homo sapiens

<400> 619

<210> 620

<211> 98

<212>: PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 620

<210> 621

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<400> 621 <210> 622

<211> 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 622

<210> 623 211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 623

<210> 624

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 624

<210> 625

<211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 625

<210> 626

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

203

<400> 626

5 <210> 627

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 627

<210> 628 15 <211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 628 20

204

<210> 629

<211> 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 629

<210> 630

<211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 630

<210> 631

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 631

<210> 632

<211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

205

<400> 632

<210> 633

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 633

<210> 634

<211> 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 634

<210> 635

<211> 98

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 635

207

<210> 636

<211> 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 636

<210> 637

<211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 637

<210> 638

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 638

<210> 639

<211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 639

<210> 640

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 640

<210> 641

<211> 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 641

<210> 642

<211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 642

210

<210> 643

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 643

<210> 644

<211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 644

<210> 645

<211> 98

<212>: PRT 25 <213> Homo sapiens

211

<400> 645

5 <210> 646

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 646

15 <210> 647

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 647

<210> 648

<211> 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 648

<210> 649

<211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 649

213

<210> 650

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 650

<210> 651

<211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 651

<210> 652

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

214

<400> 652

5 <210> 653

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 653

<210> 654 15 <211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 654 20

215

<210> 655

<211> 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 655

<210> 656

<211> 98

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 656

<210> 657

<211> 90

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 657

10 <210> 658

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 658

<210> 659 20 <211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 659 25

217

<210> 660 5 <211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 660 10

<210> 661

<211> 97 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 661

218

<210> 662

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 662

<210> 663

<211> 98

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 663

219

<210> 664 211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 664

10 <210> 665

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 665

<210> 666 20 <211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 666 25

220

<210> 667

<211> 98 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 667

<210> 668 211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 668

221

<210> 669

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 669

<210> 670

<211> 98

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 670

<210> 671

<211> 98

222

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 671

<210> 672

<211> 98 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 672

<210> 673

<211> 99

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 673 <210> 674

<211> 99 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 674

<210> 675

<211> 98

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 675

225

Claims

REIvINDICACIoNES

1.

Un anticuerpo humano aislado, o una parte de union a antigeno del mismo, que se une a IL-12 humana y se disocia de IL-12 humana con una constante de velocidad koff de 1 x 10-4 s-1 o menos, como se determina por resonancia de plasmon superficial, en el que dicho anticuerpo inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de proliferacion de blastos por fitohemaglutinina in vitro (ensayo de PHA) con una CI50 de 1 x 10-9 M o menos.
2.

El anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 1, o una parte de union a antigeno del mismo, que comprende una region constante de cadena pesada de IgG1.
3.

El anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 1, o una parte de union a antigeno del mismo, que se disocia de IL-12 humana con una constante de velocidad koff de 1 x 10-5 s-1 o menos e inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-10 M o menos.
4.

El anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 1, o una parte de union a antigeno del mismo, que se disocia de IL-12 humana con una constante de velocidad koff de 1 x 10-5 s-1 o menos e inhibe la proliferacion de blastos por fitohemaglutinina en un ensayo de PHA in vitro con una CI50 de 1 x 10-11 M o menos.
5.

El anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 1, o una parte de union a antigeno del mismo, que tiene las siguientes caracteristicas:

a) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 9; y b) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 10.
6.

El anticu erpo humano aislado de la reivindicacion 5, o una p arte de union a a ntigeno del mismo, que tie ne ademas una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 11; y tiene una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 12.
7.

El anticu erpo humano aislado de la reivindicacion 5, o una p arte de union a a ntigeno del mismo, que tie ne ademas una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 13; y tiene una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 14.
8.

El anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 5, o una parte de union a antigeno del mismo, que tiene una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 15; y tiene una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 16.
9.

El anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 1, o una parte de union a antigeno del mismo, que

a) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 404-SEC ID N°: 469; o b) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 534-SEC ID N°: 579.
10.

El anticuerpo humano aislado, o una parte de unionaantigeno del mismo, de la reivindicacion 9 que tiene ademas una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 335-SEC ID N°: 403; o una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 506-SEC ID N°: 533.
11.

El anticuerpo humano aislado, o una parte de unionaantigeno del mismo, de la reivindicacion 9 que tiene ademas una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 288-SEC ID N°: 334; o una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 470-SEC ID N°: 505.
12.

El anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 1, o una parte de union a antigeno del mismo, que

a) tiene una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 25; y b) tiene una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 26.
13.

El anticuerpo humano aislado, o una parte de uniona antigeno del mismo, de la reivindicacion 12 que tiene ademas una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 27; y una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 28.
14.

El anticuerpo humano aislado, o una parte de uniona antigeno del mismo, de la reivindicacion 12 que tiene ademas una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 29; y una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 30.
15.

El anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 1, o una parte de union a antigeno del mismo, que tiene una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 31; y una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32.
16.

El anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 15, que comprende una region constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las regiones constantes de IgG 1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA e IgE.
17.

El anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 16, en el que la region constante de cadena pesada del anticuerpo es lgG1.
18.

La parte de anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 15, que es un fragmento Fab.
19.

La parte de anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 15, que es un fragmento F(ab')2.
20.

La parte de anticuerpo humano aislado de la reivindicacion 15, que es un fragmento Fv de cadena sencilla.
21.

Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o una parte de union a antigeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20 y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
22.

La composicion farmaceutica de la reivindicacion 21, que comprende ademas un agente adicional.
23.

La composicion farmaceutica de la reivindicacion 22, en la que el agente adicional es un agente terapeutico.
24.

La composicion farmaceutica de la reivindicacion 23, en la que el agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en budenosida, factor de cr ecimiento ep idermico, cortic osteroides, ci closporina, sulfasa lazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de lipoxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagonistas del receptor de IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-11, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de pirimidil-imidazol, anticuerpos o agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF, anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos, met otrexato, cic losporina, FK506, rap amicina, mofetil mic ofenolato, lefluno mida, AINE, ibuprofeno, corticosteroides, pred nisolona, in hibidores de fosf odiesterasa, a gonistas de a denosina, age ntes antitromboticos, inhibidores de complemento, agentes adrenergicos, inhibidores de MAP quinasa, IRAK, NIK, IKK, p38, inhib idores de enzima conversora de IL-11, inhibidores de enzima conversora de TNFa, inhibidores de sefalizacion de linfocitos T, inhibi dores de metal oproteinasa, sulf asalazina, az atioprina, 6-m ercaptopurinas, inhib idores de la enzima conversora de angiotensina, receptores de citocina soluble, receptor deTNF p55 soluble, receptor de TNF p75 soluble, sIL-IRI, slL-1 Rll, slL-6R, citocinas antiinflamatorias, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF1.
25.

La composicion farmaceutica de la reivindicacion 23, en la que el agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos anti-TNF y fragmentos de anticuerpos de los mismos, construcciones TNFR-Ig, inhibidores de TACE, inhibidores de PDE4, corticosteroides, budenosida, dexametasona, sulfasalazina, acido 5-aminosalicilico, olsalazina, inhibidores de enzima conversora de IL-11, IL-1 ra, inhibidores de tirosina quinasa, 6-mercaptopurinas e IL-11.
26.

La composicion farmaceutica de la reivindicacion 23, en la que el agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en corticosteroides, prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanid ina; interferon 11, interferon 11b, Copo limero 1, oxige no hiperbarico, in munoglobulina intravenosa, clabribina, anticuerpos o agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, PDGF, anticuerpos para CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, AINE, ibuprofeno, corticosteroides, pred nisolona, in hibidores de fosf odiesterasa, a gonistas de a denosina, age ntes antitromboticos, inhibidores de complemento, agentes adrenergicos, inhibidores de MAP quinasa, IRAK, NIK, IKK o p38, inhibidores de enzima conversora de IL-11 inhibidores de T ACE, inhibidores de sefalizacion de linfocitos T, inhibidores de quinasa, i nhibidores d e met aloproteinasa, sulfasal azina, azat ioprina, 6-merca ptopurinas, in hibidores de enz ima conversora de angiotensina, receptores de citocina soluble, receptor deTNF p55 soluble, receptor de TNF p75 soluble, sIL-1RI, slL-1R ll, slL-6R, s lL-13R, anti-P 7s, l igando d e g licoproteina p-selectina (PS GL), citocin as antiinflamatorias, IL-4, IL-10, IL-13 y TGF1.
27.

Un metodo para inhibir la actividad de IL-12 humana in vitro que comprende poner en contacto IL-12 humana con el anticuerpo, o una parte de union a antigeno del mismo, de una c ualquiera de las reivindicaciones 1-20 de modo que se inhiba la actividad de IL-12 humana.
28.

Uso del anticuerpo, o un fragmento de union a antigeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, para fabricar un medicamento para tratar o prevenir un trastorno seleccionado del grupo que consiste en artritis reumatoide, osteoartritis, artritis cronica juvenil, artritis de Lyme, artritis psoriasica, artritis reactiva,

226

227

espondiloartropatia, espondilitis anquilosante, lupus eritematoso sistemico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, diabetes mellitus insulinodependiente, tiroiditis, asma, enfermedades alergicas, psoriasis, dermatitis esclerodermia, tiroiditis, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de traspl ante d e o rganos, enfer medad inmu ne agu da o cr onica asoci ada con traspl ante de org anos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulacion intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, sindrome nefrotico, sindrome de fatiga cronica, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, purpura de Henoch Schonlein, vasculitis microscopica de los rifones, hepatitis activa cronica, sindrome de Sjogren, uveitis, sepsis, choque s eptico, sindrome de se psis, si ndrome de di ficultad r espiratoria del ad ulto, caqu exia, enferme dades infecciosas, e nfermedades parasitarias, s indrome de i nmunodeficiencia adquirida, miel itis tra nsversa aguda, miastenia grave, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson enfermedad de Alzheimer, apoplejia, cirrosis biliar primaria, enfermedades fibroticas pulmonares, anemia hemolitica, tumores malignos, insuficiencia cardiaca e infarto de miocardio por administracion al sujeto humano.
29.

El uso de la reivindicacion 28, en el que el trastorno es psoriasis.
30.

El uso de la reivindicacion 28, en el que el trastorno es enfermedad de Crohn.
31.

El uso de la reivindicacion 28, en el que el trastorno es esclerosis multiple.
32.

El uso de la reivindicacion 28, en el que el trastorno es artritis reumatoide.
33.

Un meto do para detectar IL-12 h umana qu e comprende po ner e n contacto IL-12 hum ana in vitro con e l anticuerpo, o una parte de union a antigeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20 de modo que se detecte IL-12 humana.
34.

El metodo de la reivindicacion 33, en el que IL-12 humana se detecta en una muestra biologica para fines de diagnostico.
35.

Una molecula de acido nucleico aislada quecodifica el anticuerpo humano, o parte de union a antigeno del mismo, de la reivindicacion 1, en la que el anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo, comprende una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 25.
36.

La molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 35, en la que el anticuerpo humano o parte de union a antigeno del mismo, comprende ademas una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 27.
37.

La molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 36, en la que el anticuerpo humano, o parte de union a antigeno del mismo, comprende ademas una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 29.
38.

La molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 37, que codifica una region variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 31.
39.

Una molecula de acido nucleico aislada quecodifica el anticuerpo humano, o parte de union a antigeno del mismo, de la reivindicacion 1, en la que el anticuerpo o parte de union a antigeno del mismo, comprende una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 26.
40.

La molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 39, en la que el anticuerpo humano o parte de union a antigeno del mismo, comprende ademas una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 28.
41.

La molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 40, en la que el anticuerpo humano, o parte de union a antigeno del mismo, comprende ademas una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 30.
42.

La molecula de acido nucleico aislada de la reivindicacion 41, que codifica una region variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32.
43.

Un vector de expresion recombinante que comprende la molecula de acido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 35-42.
44.

Una celula hospedadora en la que se ha introducido el vector de expresion recombinante de la reivindicacion 43.
45.

El vector de expresion recombinante de la reivindicacion 43 que codifica:

228

a) una cadena pesada de anticuerpo que tiene una region variable que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 31; y b) una cadena ligera de anticuerpo que tiene una region variable que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32.
46.

La celula hospedadora de la reivindicacion 43 en la que se ha introducido el vector de expresion recombinante de la reivindicacion 44.
47.

U n meto do p ara s intetizar u n a nticuerpo hum ano, o una p arte de un ion a antigeno del mismo, d e l a

10 reivindicacion 1, que comprende cultivar la celula hospedadora de la reivindicacion 44 o 46 en un medio de cultivo hasta que se sintetice el anticuerpo humano, o parte de union a antigeno del mismo por la celula.

229

Figura 1A. Secuencias de region variable de cadena pesada

Figura 1B Secuencias de region variable de cadena pesada

Figura 1C Secuencias de region variable de cadena ligera

Figura 1D Secuencias de region variable de cadena ligera