ES2376734B1

ES2376734B1 - IMPROVEMENTS INTRODUCED IN THE OBJECT OF THE MAIN PATENT No. P201000499 FOR "PROCEDURE TO ALTER THE DEVELOPMENT PATTERN, INCREASE THE GROWTH AND ACCUMULATION OF ALMIDÓN AND ALTER THE STRUCTURE OF THE ALMIDÓN IN PLANTS".

Info

Publication number: ES2376734B1
Application number: ES201001068A
Authority: ES
Inventors: Miren Edurne Baroja Fernández; Jun Li; Francisco José Muñoz Pérez; Miroslav Ovecka; Javier Pozueta Romero; Ignacio Ezquer Garín; Bahaji Abdellatif
Original assignee: Iden Biotechnology SL
Current assignee: TIMAC AGRO ESPANA SA
Priority date: 2010-08-13
Filing date: 2010-08-13
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2030-08-13
Also published as: ES2376734A1

Abstract

Mejoras introducidas en el objeto de la patente principal n° P201000499 por ?Procedimiento para alterar el patrón de desarrollo y aumentar el crecimiento en plantas".#La mejora consiste en la identificación de los ácidos fórmico, acético, propiónico y butírico y del acetaldehído como volátiles capaces de incrementar el crecimiento e inducir la floración en plantas cultivadas en atmósferas con al menos uno de dichos compuestos, posibilitando un método de incrementar el crecimiento y la floración en plantas consistente en cultivarlas en atmósferas con uno o más de dichos volátiles, sin necesidad producir los volátiles mediante un cultivo microbiano.Improvements introduced in the object of the main patent No. P201000499 by "Procedure for altering the pattern of development and increasing growth in plants". # The improvement consists in the identification of formic, acetic, propionic and butyric acids and acetaldehyde as volatiles capable of increasing growth and inducing flowering in plants grown in atmospheres with at least one of said compounds, enabling a method of increasing growth and flowering in plants consisting of growing them in atmospheres with one or more of these volatiles, without the need produce the volatiles by a microbial culture.

Description

Mejoras introducidas en el objeto de la patente principal nº P 201000499 por: “Procedimiento para alterar el patrón de desarrollo, y aumentar el crecimiento en plantas”. Improvements introduced in the object of the main patent nº P 201000499 for: "Procedure to alter the pattern of development, and increase the growth in plants".

Campo técnico Technical field

La presente solicitud de adición a la patente principal introduce mejoras en el procedimiento de la invención descrito en la solicitud de patente principal P201000499, perfeccionando la puesta en práctica del procedimiento de la invención referido al incremento del crecimiento de las plantas por acción de volátiles microbianos. Se delimitan los volátiles implicados en el aumento del crecimiento y en la inducción de la ﬂoración, mejorando la puesta en práctica del procedimiento de la invención referido al cultivo de plantas en presencia de una atmósfera en la que están presentes compuestos volátiles. The present application for addition to the main patent introduces improvements in the process of the invention described in the main patent application P201000499, improving the implementation of the process of the invention referred to the increase in plant growth by the action of microbial volatiles. The volatiles involved in increasing growth and in inducing ﬂ ow are delimited, improving the implementation of the process of the invention relating to the cultivation of plants in the presence of an atmosphere in which volatile compounds are present.

Antecedentes de la técnica Prior art

Hasta la divulgación de las enseñanzas de la solicitud de patente principal P201000499, se conocía poco sobre cómo pueden afectar las emisiones de volátiles microbianos a la ﬁsiología de las plantas en ausencia de contacto físico. Se conocía, por una parte, que microorganismos tales como Pseudomonas spp., Streptomyces spp., Botrytis cinerea y distintas trufas producen etileno (Splivallo et al., 2007b; New Phytologist 175, 417-424), una hormona gaseosa de plantas que juega importantes papeles en múltiples aspectos del crecimiento y desarrollo de las plantas, incluidos la germinación de semillas, alargamiento del hipocótilo, iniciación de las pilosidades radiculares, la senescencia de hojas y ﬂores, la maduración de los frutos, la acumulación de almidón. Además, recientemente, Splivallo et al. (Splivallo et al. 2009: Plant Physiol. 150, 2018-2029) aportaron evidencias de que el etileno producido por las trufas induce alteraciones en el desarrollo de plantas de Arabidopsis, que presumiblemente van acompañadas por importantes cambios en el metabolismo. Until the dissemination of the teachings of main patent application P201000499, little was known about how microbial volatile emissions can affect plant physiology in the absence of physical contact. It was known, on the one hand, that microorganisms such as Pseudomonas spp., Streptomyces spp., Botrytis cinerea and various truffles produce ethylene (Splivallo et al., 2007b; New Phytologist 175, 417-424), a gaseous plant hormone that plays important roles in multiple aspects of plant growth and development, including seed germination, hypocotyl lengthening, initiation of root hairs, senescence of leaves and flowers, fruit ripening, starch accumulation. In addition, recently, Splivallo et al. (Splivallo et al. 2009: Plant Physiol. 150, 2018-2029) provided evidence that the ethylene produced by truffles induces alterations in the development of Arabidopsis plants, which are presumably accompanied by significant changes in metabolism.

En lo que se reﬁere a las bacterias, los escasos trabajos en los que se describía el efecto de volátiles microbianos sobre el crecimiento de plantas giran en torno a un número limitado de cepas especializadas de rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR: plant growth promoting rhizobacteria). Se denomina rizobacterias a ciertas bacterias simbiontes que existen en el suelo y que colonizan las raíces de las plantas. La mayor parte de las cepas cuyo cultivo da lugar a un efecto positivo sobre el crecimiento de las plantas cultivadas en su presencia, sin necesidad de contacto físico, pertenecen al género Bacillus o un género estrechamente relacionado con éste, Paenibacillus, al cual pertenecen bacterias que en el pasado fueron clasiﬁcadas como pertenecientes al género Bacillus. Así, por ejemplo, se ha demostrado que volátiles emitidos por rizobacterias de cepas pertenecientes a las especies Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus cepacia promueven el crecimiento de plantas de Arabidopsis, facilitando la toma de nutrientes, la fotosíntesis y la respuesta de defensa, y disminuyendo la sensibilidad a la glucosa y los niveles de ácido abscísico (Ryu et al. 2003: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927-4932; Ryu et al. 2004: Plant Phylio 134, 1017-1026; Vespermann et al. 2007; Appl. Environ. Microbiol. 73, 5639-5641, Xie et al. 2009: Plant Signal. Behav. 10, 948-953). En concreto, Ryu et al. (Ryu et al. 2003:: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927-4932) describen que los volátiles orgánicos liberados por cepas especíﬁcas de PGPR, concretamente Bacillus subtilis GB03 y Bacillus amyloliquefaciens IN937a, son capaces de provocar un incremento del crecimiento de plántulas de Arabidopsis thaliana. El efecto se observa cuando las citadas cepas de bacterias son cultivadas en el medio rico en aminoácidos agar con tripticasa de soja, en esas condiciones, ambas bacterias liberan 3-hidroxi-2-butanona (acetoína) y 2,3-butanediol. Dichos compuestos parecen ser los responsables del efecto observado, porque no son emitidos por las otras PGPR ensayadas que no mostraban efectos sobre el crecimiento de las plantas, pero, sin embargo, sí son liberados por otras cepas bacterianas con capacidad de incrementar la germinación y el crecimiento de plantas. Tal es el caso de la cepa de Bacillus subtilis WG6-14, objeto de la solicitud de patente US 2008/0152684 A1, que produce los mismos volátiles y es capaz de incrementar el crecimiento y la germinación de plantas como Brassica oleraceo sin existir contacto físico entre planta y bacteria. Sin embargo, existen muchas bacterias liberadoras de estas mismas sustancias (algunas pertenecientes al género Bacillus) que no promueven el crecimiento de la planta. As far as bacteria are concerned, the few works that described the effect of microbial volatiles on plant growth revolve around a limited number of specialized strains of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR: plant growth promoting rhizobacteria). Rhizobacteria are called certain symbiont bacteria that exist in the soil and colonize the roots of plants. Most of the strains whose cultivation gives rise to a positive effect on the growth of plants grown in their presence, without the need for physical contact, belong to the genus Bacillus or a genus closely related to it, Paenibacillus, to which bacteria belong. in the past they were classified as belonging to the genus Bacillus. Thus, for example, it has been shown that volatiles emitted by rhizobacteria from strains belonging to the species Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens or Bacillus cepacia promote the growth of Arabidopsis plants, facilitating nutrient intake, photosynthesis and defense response, and decreasing glucose sensitivity and abscisic acid levels (Ryu et al. 2003: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927-4932; Ryu et al. 2004: Plant Phylio 134, 1017-1026; Vespermann et al. 2007; Appl. Environ. Microbiol. 73, 5639-5641, Xie et al. 2009: Plant Signal. Behav. 10, 948-953). Specifically, Ryu et al. (Ryu et al. 2003 :: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927-4932) describe that organic volatiles released by specific PGPR strains, namely Bacillus subtilis GB03 and Bacillus amyloliquefaciens IN937a, are capable of causing an increase of the growth of Arabidopsis thaliana seedlings. The effect is observed when the aforementioned bacterial strains are grown in the medium rich in agar amino acids with soy tripticase, under these conditions, both bacteria release 3-hydroxy-2-butanone (acetoin) and 2,3-butanediol. These compounds seem to be responsible for the observed effect, because they are not emitted by the other PGPRs tested that showed no effects on plant growth, but, nevertheless, they are released by other bacterial strains capable of increasing germination and plant growth Such is the case of the Bacillus subtilis strain WG6-14, object of the patent application US 2008/0152684 A1, which produces the same volatiles and is capable of increasing the growth and germination of plants such as Brassica oleraceo without physical contact between plant and bacteria. However, there are many bacteria that release these same substances (some belonging to the genus Bacillus) that do not promote plant growth.

Se han descrito también otras cepas de los géneros Bacillus o Paenibacillus que emiten volátiles capaces de promover el crecimiento de distintas plantas pero, en estos casos, el efecto parece estar ligado principalmente a la capacidad de controlar el crecimiento de patógenos que están afectando a la planta. Tal es el caso, por ejemplo, del bacilo Kyu-W63 descrito en la patente japonesa JP10033064, cuyos volátiles son capaces de controlar la patopoyesis debida a la presencia de hongos del género Cercospora en hojas de pepino, facilitando con ello el crecimiento de la planta. La descripción sugiere que el efecto podría ser similar utilizando otras bacterias ﬁlamentosas, siempre y cuando el cultivo se produzca en un medio rico en azúcares tal como el agar PDA, medio que no se deﬁne con más detalle; tampoco se dan pruebas que demuestren la inﬂuencia del medio sugerido o la aplicabilidad del método para cualquier otra bacteria ﬁlamentosa. Other strains of the genera Bacillus or Paenibacillus that emit volatile capable of promoting the growth of different plants have been described but, in these cases, the effect seems to be mainly linked to the ability to control the growth of pathogens that are affecting the plant . Such is the case, for example, of the bacillus Kyu-W63 described in Japanese patent JP10033064, whose volatiles are capable of controlling pathopoiesis due to the presence of fungi of the Cercospora genus in cucumber leaves, thereby facilitating plant growth . The description suggests that the effect could be similar using other fibrous bacteria, as long as the culture is produced in a medium rich in sugars such as PDA agar, medium that is not defined in more detail; There is also no evidence to prove the influence of the suggested medium or the applicability of the method to any other bacterial bacteria.

También el método para incrementar el crecimiento de plantas, basado en composiciones que comprenden un metabolito volátil producido por una bacteria, que se reivindica en la solicitud de patente coreana KR20090066412, alude de forma combinada a la inducción de protección contra enfermedades y el ataque de insectosyala promoción del crecimiento de distintas plantas, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Como ejemplos de posibles metabolitos útiles se citan 3-acetil-1-propanol, 3-metil-1-butanol, indol, acetato de isoamilo y acetato de butilo. El resumen menciona que los posibles microorganismos que dan lugar a un metabolito volátil con el efecto buscado comprenden bacterias pertenecientes a los géneros Bacillus o Paenibacillus, siendo una cepa de la especie Paenibacillus polymyxa el microorganismo preferido. Also the method for increasing plant growth, based on compositions comprising a volatile metabolite produced by a bacterium, which is claimed in the Korean patent application KR20090066412, alludes in combination to the induction of disease protection and the attack of insects. growth promotion of different monocotyledonous and dicotyledonous plants. Examples of possible useful metabolites are 3-acetyl-1-propanol, 3-methyl-1-butanol, indole, isoamyl acetate and butyl acetate. The summary mentions that the possible microorganisms that give rise to a volatile metabolite with the desired effect include bacteria belonging to the Bacillus or Paenibacillus genera, with a strain of the species Paenibacillus polymyxa being the preferred microorganism.

En la solicitud de patente principal P201000499, se divulgaba el descubrimiento de que, al crecer plantas en presencia de cualquier tipo de microorganismo (bacterias Gram-positivas o Gram-negativas, levaduras u hongos), los volátiles emitidos por el microorganismo dan lugar a que se produzca una alteración el patrón de desarrollo y un aumento en el crecimiento, la fertilidad y el peso seco de las plantas, que iba acompañado de un incremento en la acumulación de almidón en las mismas. Estos efectos se observan tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas (Arabidopsis, maíz, cebada, tabaco, patata...), y son independientes de que el microorganismo sea o no patógeno para la planta y de que pertenezca o no a una especie que no convive con la planta en condiciones naturales. Estos efectos se observan tanto si las plantas se cultivan in vitro como en tierra, siempre y cuando la planta se cultive en presencia de un cultivo de un microorganismo que emita volátiles o bien en presencia de los volátiles microbianos emitidos por el microorganismo y, preferiblemente, cuando el microorganismo se hacía crecer en un medio que carezca de compuestos orgánicos que presenten grupos amino, especialmente si el medio carece de aminoácidos, tal como los medios mínimos suplementados con al menos un compuesto orgánico como fuente de carbono. Dado que la aparición de los efectos descritos no requería de contacto físico entre la planta y el microorganismo, se concluía que los volátiles eran los responsables de los efectos observados. In the main patent application P201000499, the discovery was disclosed that, when growing plants in the presence of any type of microorganism (Gram-positive or Gram-negative bacteria, yeasts or fungi), the volatiles emitted by the microorganism give rise to there is an alteration in the development pattern and an increase in the growth, fertility and dry weight of the plants, which was accompanied by an increase in the accumulation of starch in them. These effects are observed in both monocotyledonous and dicotyledonous plants (Arabidopsis, corn, barley, tobacco, potatoes ...), and are independent of whether or not the microorganism is pathogenic for the plant and whether or not it belongs to a species that does not coexists with the plant in natural conditions. These effects are observed whether the plants are grown in vitro or on land, as long as the plant is grown in the presence of a microorganism culture that emits volatile or in the presence of microbial volatiles emitted by the microorganism and, preferably, when the microorganism was grown in a medium that lacks organic compounds that have amino groups, especially if the medium lacks amino acids, such as the minimum media supplemented with at least one organic compound as a carbon source. Since the appearance of the described effects did not require physical contact between the plant and the microorganism, it was concluded that volatiles were responsible for the observed effects.

Por ello, entre otros aspectos, la solicitud P201000499 divulgaba un método para incrementar la biomasa de una planta caracterizado por que la planta se cultiva en una atmósfera en la que están presentes los compuestos volátiles emitidos por un microorganismo, microorganismo que podía haber sido cultivado en un lugar diferente al lugar de cultivo de la planta, recogiéndose la mezcla de volátiles emitidos por el mismo y cultivándose la planta en una atmósfera en la que estuvieran presentes esos volátiles. Sin embargo, la solicitud de patente principal P201000499 no mencionaba si, entre todos los volátiles emitidos por los distintos microorganismos, existían volátiles que fueran responsables del efecto de aumento del crecimiento de las plantas y otros que fueran responsables del efecto de incremento del almidón acumulado por las mismas, o si ambos efectos eran debidos a los mismos volátiles. El cultivo de plantas en atmósferas en las que estén presentes volátiles producidos por microorganismos, en ausencia de dichos microorganismos, podría verse facilitado si se dilucidara si ambos efectos se deben o no a los mismos compuestos y cuáles son los compuestos concretos responsables de cada uno de los efectos. La presente solicitud de adición supone una mejora con respecto a la solicitud de patente principal, pues da una respuesta a este problema. Therefore, among other aspects, the application P201000499 disclosed a method for increasing the biomass of a plant characterized by the fact that the plant is grown in an atmosphere in which volatile compounds emitted by a microorganism, a microorganism that could have been cultivated in a different place to the place of cultivation of the plant, collecting the mixture of volatiles emitted by it and cultivating the plant in an atmosphere in which those volatiles were present. However, the main patent application P201000499 did not mention whether, among all the volatiles emitted by the different microorganisms, there were volatiles that were responsible for the effect of increasing the growth of the plants and others that were responsible for the effect of increased starch accumulated by the same, or if both effects were due to the same volatiles. The cultivation of plants in atmospheres in which volatile produced by microorganisms are present, in the absence of said microorganisms, could be facilitated if it is elucidated whether or not both effects are due to the same compounds and which are the specific compounds responsible for each of the effects. The present application for addition represents an improvement with respect to the main patent application, as it gives an answer to this problem.

La solicitud P201000499, además, divulgaba cuáles eran las modiﬁcaciones en el metabolismo de las plantas mediante las cuales los volátiles microbianos provocan el incremento de la acumulación de almidón. Aprovechando ese conocimiento, la solicitud P201000499 divulga un método alternativo para incrementar la acumulación de almidón en plantas, consistente en provocar la acumulación mediante el uso de plantas transgénicas, en las que el transgén o transgenes expresado(s) en sentido da(n) lugar a la sobreexpresión de alguna de las enzimas reguladas al alza por la exposición a los volátiles o en las que el transgén o transgenes expresado(s) en antisentido da(n) lugar a la reducción de la expresión de alguna de las enzimas reguladas a la baja por la exposición de los volátiles o en las que el transgén o trangenes consiste(n) en uno o más inhibidores de la actividad o de la expresión de alguna de las enzimas reguladas a la baja. Así, otro aspecto alternativo de la invención expuesta en la solicitud P201000499 es un método para incrementar incrementar la producción de almidón de una planta, caracterizado porque la planta es una planta transgénica en la que está presente al menos un transgén cuya expresión da lugar a un producto seleccionado del grupo de: un| inhibidor de proteasas de plantas (tal como, por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank DQ16832), la enzima ramiﬁcante del almidón, un inhibidor de la invertasa ácida (tal como por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank FN691928), un RNA antisentido dirigido contra la cisteína sintasa (que puede deducirse, por ejemplo, a partir de la secuencia correspondiente a la cisteína sintasa de la planta de patata, con número de acceso en GenBank AB029512), un RNA antisentido dirigido contra la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa plastidial (tal como por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank FN691929), un RNA antisentido dirigido contra la glucosa6-fosfato deshidrogenasa plastidial (que puede deducirse, por ejemplo, a partir de la secuencia correspondiente a la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de patata, con número de acceso en GenBank X83923) o un RNA antisentido dirigido contra la nitrito reductasa (tal como por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank FN691930). Son realizaciones preferidas aquéllas en las que la planta expresa al menos un transgén cuya expresión da lugar a un producto seleccionado de grupo de: inhibidor de proteasas de plantas, un RNA antisentido dirigido contra la cisteína sintasa o un RNA antisentido dirigido contra la nitrito reductasa. Aunque se identiﬁcan perfectamente los genes preferidos para llevar a cabo ese aspecto de la invención, la solicitud de patente principal P201000499 no proporcionaba ejemplos de vectores con los que generar las plantas transgénicas. La presente solicitud de patente de adición aporta también una mejora en ese aspecto, pues proporciona plásmidos válidos para generar las plantas transgénicas indicadas. The application P201000499, in addition, disclosed what were the modifications in the metabolism of plants by means of which the microbial volatiles caused the increase in starch accumulation. Taking advantage of this knowledge, the application P201000499 discloses an alternative method to increase the accumulation of starch in plants, consisting in causing the accumulation through the use of transgenic plants, in which the transgene or transgenes expressed (s) in the sense gives place to the overexpression of some of the enzymes regulated upwards by exposure to volatiles or in which the transgene or transgenes (s) expressed in antisense results in the reduction of the expression of some of the enzymes regulated to the low by exposure of volatiles or in which the transgene or trangenes (n) consists of one or more inhibitors of the activity or expression of any of the enzymes regulated down. Thus, another alternative aspect of the invention set forth in application P201000499 is a method for increasing the production of starch in a plant, characterized in that the plant is a transgenic plant in which at least one transgene is present whose expression gives rise to a product selected from the group of: a | plant protease inhibitor (such as, for example, the one with the accession number in GenBank DQ16832), the starch branching enzyme, an acid invertase inhibitor (such as, for example, the one with the access number in GenBank FN691928), an antisense RNA directed against cysteine synthase (which can be deduced, for example, from the sequence corresponding to the cysteine synthase of the potato plant, with access number in GenBank AB029512), an antisense RNA directed against Plastidial glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (such as the one with GenBank accession number FN691929), an antisense RNA directed against glucose 6-plastidial phosphate dehydrogenase (which can be deduced, for example, from the sequence corresponding to potato glucose-6-phosphate dehydrogenase, with accession number in GenBank X83923) or an antisense RNA directed against nitrite reductase (such as, for example, that presents the access number in GenBank FN691930). Preferred embodiments are those in which the plant expresses at least one transgene whose expression results in a product selected from the group of: plant protease inhibitor, an antisense RNA directed against cysteine synthase or an antisense RNA directed against nitrite reductase. Although the preferred genes for carrying out that aspect of the invention are perfectly identified, the main patent application P201000499 did not provide examples of vectors with which to generate the transgenic plants. The present patent application also provides an improvement in that aspect, as it provides valid plasmids to generate the indicated transgenic plants.

Descripción de las mejoras de la invención Description of the improvements of the invention

Las mejoras de la presente solicitud de adición están relacionadas, en un primer aspecto, con el descubrimiento de que no todos los volátiles producidos por los microorganismos tienen capacidad de inﬂuir sobre el incremento de la biomasa y la acumulación de almidón observada en las plantas que crecen en atmósferas en las que estén presentes dichos volátiles. En la presente solicitud de adición, se describe, además, que algunos volátiles que eran conocidos en el estado de la técnica como compuestos capaces de promover el crecimiento de las plantas, no afectan al contenido de almidón acumulado por las mismas. Sin embargo, se identiﬁcan otros compuestos volátiles, tales como el ácido propiónico, el ácido acético, el acetaldehído, el ácido fórmico y el ácido butírico, que tienen un efecto positivo sobre la acumulación de almidón, y que parecen tenerlo igualmente sobre el crecimiento, la biomasa y la inducción de la ﬂoración: ése es el caso, por ejemplo, del ácido fórmico, para el cual se muestran ensayos que demuestran su capacidad de incrementar la acumulación de almidón y, también, el crecimiento de la planta. Además, se aportan datos que indican que su efecto es dependiente de dosis. Esto permite perfeccionar el método de incremento de la cantidad de almidón acumulada por una planta al crecerla en presencia de volátiles microbianos, identiﬁcando volátiles concretos que son capaces de producir ese efecto, así como el método para incrementar el crecimiento de una planta y/o alterar su patrón de desarrollo en el que la planta se cultiva en presencia de volátiles emitidos por un microorganismo, creando igualmente ejemplos de compuestos volátiles que puedan dar lugar a ese efecto, compuestos que son los mismos que los compuestos volátiles válidos para dar lugar al aumento de la acumulación de almidón en una planta completa. De esta manera, la aplicación de cualquiera de estos métodos de la invención no necesita la presencia de un cultivo de un microorganismo en el lugar de cultivo de la planta, sino que es posible elegir uno o más compuestos volátiles que no necesariamente tienen que haber sido emitidos por un microorganismo, sino que puede tener otro origen y puede hacerse presente en la atmósfera de cultivo de la planta por otros diversos medios, desde la presencia en el lugar de cultivo de una disolución desde la cual se evapora el compuesto o por insuﬂarse al lugar de cultivo la atmósfera desde el exterior de dicho lugar de cultivo, conteniendo ya el compuesto volátil como parte de la atmósfera insuﬂada, o porque el propio compuesto volátil se administre a la atmósfera del lugar de cultivo de la planta desde el exterior. The improvements of the present application for addition are related, in a first aspect, to the discovery that not all volatiles produced by microorganisms have the capacity to influence the increase in biomass and the accumulation of starch observed in growing plants in atmospheres in which these volatiles are present. In the present application for addition, it is further described that some volatiles that were known in the state of the art as compounds capable of promoting plant growth do not affect the starch content accumulated by them. However, other volatile compounds are identified, such as propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid and butyric acid, which have a positive effect on the accumulation of starch, and which also seem to have an effect on growth, the biomass and the induction of the ﬂ ow: that is the case, for example, of formic acid, for which tests are shown that demonstrate its ability to increase the accumulation of starch and also the growth of the plant. In addition, data are provided indicating that its effect is dose dependent. This makes it possible to improve the method of increasing the amount of starch accumulated by a plant by growing it in the presence of microbial volatiles, identifying specific volatiles that are capable of producing that effect, as well as the method to increase the growth of a plant and / or alter its development pattern in which the plant is grown in the presence of volatile emitted by a microorganism, also creating examples of volatile compounds that can give rise to that effect, compounds that are the same as the volatile compounds valid to give rise to the increase in Starch accumulation in a complete plant. Thus, the application of any of these methods of the invention does not require the presence of a culture of a microorganism at the plant's cultivation site, but it is possible to choose one or more volatile compounds that do not necessarily have to have been emitted by a microorganism, but may have another origin and may be present in the plant's culture atmosphere by various other means, from the presence at the place of cultivation of a solution from which the compound evaporates or by insufflation at place of cultivation the atmosphere from the outside of said place of cultivation, already containing the volatile compound as part of the insufflated atmosphere, or because the volatile compound itself is administered to the atmosphere of the plant cultivation place from the outside.

Así, en un primer aspecto, las mejoras de la presente solicitud de adición se reﬁeren a un método para incrementar el crecimiento de una planta y/o alterar su patrón de desarrollo caracterizado por que la planta se cultiva en una atmósfera en la que está presente al menos un compuesto volátil que se selecciona entre ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído, ácido fórmico y ácido butírico. De entre ellos, se tiene especial preferencia por el ácido fórmico. En una posible realización de este aspecto de las mejoras de la invención, el compuesto volátil está presente en la atmósfera por evaporación de una disolución que lo contiene que se encuentra en el lugar de cultivo de la planta. En otra posible realización, el compuesto volátil se suministra a la atmósfera de cultivo. En cualquiera de los casos, como se describía en la solicitud de patente principal P201000499, el incremento del crecimiento puede manifestarse en aumento de la longitud de la planta y/o en aumento del tamaño de las hojas, y la alteración del patrón de crecimiento puede manifestarse en incremento del número de hojas, incremento del número de ramas y/o del número de ﬂores y semillas de plantas angiospermas, en la inducción de la ﬂoración, o en combinaciones de los anteriores. Thus, in a first aspect, the improvements of the present application for addition refer to a method for increasing the growth of a plant and / or altering its development pattern characterized in that the plant is grown in an atmosphere in which it is present. at least one volatile compound that is selected from propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid and butyric acid. Among them, special preference is given to formic acid. In a possible embodiment of this aspect of the improvements of the invention, the volatile compound is present in the atmosphere by evaporation of a solution containing it that is at the plant's cultivation site. In another possible embodiment, the volatile compound is supplied to the culture atmosphere. In either case, as described in the main patent application P201000499, the increase in growth can be manifested in an increase in the length of the plant and / or in an increase in the size of the leaves, and the alteration of the growth pattern can manifest itself in an increase in the number of leaves, increase in the number of branches and / or in the number of flowers and seeds of angiosperm plants, in the induction of flowering, or in combinations of the above.

En un segundo aspecto, las mejoras se reﬁeren a un método para incrementar la cantidad de almidón acumulado en una planta, caracterizado porque la planta se cultiva en una atmósfera en la que está presente al menos un compuesto volátil que se selecciona entre ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído, ácido fórmico y ácido butírico. Como en el caso anterior, en una posible realización de este aspecto de las mejoras de la invención, el compuesto volátil está presente en la atmósfera por evaporación de una disolución que lo contiene que se encuentra en el lugar de cultivo de la planta. En otra posible realización, el compuesto volátil se suministra a la atmósfera de cultivo. In a second aspect, the improvements refer to a method for increasing the amount of starch accumulated in a plant, characterized in that the plant is grown in an atmosphere in which at least one volatile compound is selected which is selected from propionic acid, acid acetic, acetaldehyde, formic acid and butyric acid. As in the previous case, in a possible embodiment of this aspect of the improvements of the invention, the volatile compound is present in the atmosphere by evaporation of a solution containing it that is in the plant's place of cultivation. In another possible embodiment, the volatile compound is supplied to the culture atmosphere.

Por otra parte, la presente solicitud de adición a patente principal proporciona plásmidos adecuados para generar las plantas transgénicas propuestas en la solicitud de patente principal P201000499. Así, en un aspecto más, las mejoras de la invención se reﬁeren a un método para incrementar la producción de almidón en una planta, caracterizado por que el método incluye una etapa en el que se introduce un transgén en una planta mediante un plásmido que comprende al menos una secuencia que se selecciona entre las representadas por SEQ ID NO:1 (secuencia codiﬁcante del inhibidor de proteinasas, secuencia que debe ir unida operativamente a un promotor de forma que su expresión se produzca en el sentido que da lugar a la proteína natural), SEQ ID NO:3 (secuencia codiﬁcante de la nitrito reductasa, secuencia que debe ir unida operativamente a un promotor de tal forma que su expresión se produzca en antisentido) y SEQ ID NO: 5 (secuencia codiﬁcante de la cisteína sintasa, secuencia que debe ir unida operativamente a un promotor de tal forma que su expresión se produzca en antisentido). El plásmido puede ser utilizado para transformación biolística de las plantas o mediante Agrobacterium tumefaciens. Se preﬁere particularmente que el plásmido contenga secuencias Tnos. En otra posible realización del método de incremento de la acumulación de almidón mediante el uso de plantas transgénicas, la secuencia codiﬁcante representada por SEQ ID NO:1, la secuencia antisentido a la representada por SEQ ID NO:3 o la secuencia antisentido a la representada por SEQ ID NO:5 está unida operativamente al promotor constitutivo S35 del virus del mosaico de la colifor (CaMV). Se preﬁere que el plásmido comprenda al menos un marcador de selección, que puede ser un gen de resistencia a un antibiótico, tal como kanamicina, cloranfenicol, ampiclina, zeomicina o higromicina y, más preferiblemente, que comprende al menos dos marcadores de selección, tales como, por ejemplo, un gen que conﬁere resistencia a kanacimina y un gen que conﬁere resistencia a higromicina. Una posible realización del método de incremento de la producción mediante el uso de plantas transgénicas consistiría en utilizar al menos uno de los plásmidos cuyo proceso de obtención se describe en el Ejemplo 4 de la presente invención, es decir, un plásmido que comprende la secuencia representada por SEQ ID NO:1, la secuencia antisentido a la representada por SEQ ID NO:3 ó la secuencia antisentido a la representada por SEQ ID NO:5, operativamente unida al promotor 35S de CaMV, que adicionalmente comprende secuencias Tnos de Agrobacterium tumefaciens,un gen de resistencia a kanamicina y un gen de resistencia a higromicina. On the other hand, the present application for addition to the main patent provides suitable plasmids to generate the transgenic plants proposed in the main patent application P201000499. Thus, in a further aspect, the improvements of the invention refer to a method for increasing the production of starch in a plant, characterized in that the method includes a stage in which a transgene is introduced into a plant by means of a plasmid comprising at least one sequence that is selected from those represented by SEQ ID NO: 1 (coding sequence of the proteinase inhibitor, sequence that must be operatively linked to a promoter so that its expression occurs in the sense that gives rise to the natural protein ), SEQ ID NO: 3 (coding sequence of nitrite reductase, sequence that must be operatively linked to a promoter such that its expression occurs in antisense) and SEQ ID NO: 5 (coding sequence of cysteine synthase, sequence which must be operatively linked to a promoter so that its expression occurs in antisense). The plasmid can be used for biolistic transformation of plants or by Agrobacterium tumefaciens. It is particularly preferred that the plasmid contains Tnos sequences. In another possible embodiment of the method of increasing starch accumulation through the use of transgenic plants, the coding sequence represented by SEQ ID NO: 1, the antisense sequence to that represented by SEQ ID NO: 3 or the antisense sequence to that represented by SEQ ID NO: 5 is operatively linked to the constitutive promoter S35 of the cauliflower mosaic virus (CaMV). It is preferred that the plasmid comprises at least one selection marker, which may be an antibiotic resistance gene, such as kanamycin, chloramphenicol, ampicline, zeomycin or hygromycin and, more preferably, comprising at least two selection markers, such as, for example, a gene that confers resistance to kanacimine and a gene that confers resistance to hygromycin. A possible embodiment of the method of increasing production through the use of transgenic plants would be to use at least one of the plasmids whose production process is described in Example 4 of the present invention, that is, a plasmid comprising the sequence represented by SEQ ID NO: 1, the antisense sequence to that represented by SEQ ID NO: 3 or the antisense sequence to that represented by SEQ ID NO: 5, operably linked to the 35S promoter of CaMV, which additionally comprises Tnos sequences of Agrobacterium tumefaciens, a kanamycin resistance gene and a hygromycin resistance gene.

Por último, merece mencionarse que la presente solicitud de adición a patente principal divulga ensayos en los que se demuestra que el amonio, cuando las plantas se cultivan en una atmósfera en la que dicho compuesto está presente, es responsable de la despigmentación de las plantas y de la inhibición de su crecimiento. Este resultado refuerza la idea, expuesta en la solicitud de patente principal P201000499, de que los microorganismos cultivados en medios ricos en aminoácidos (y, en general, de compuestos orgánicos que presenten grupos amino), producen volátiles (amonio) que inhiben el crecimiento; tales compuestos, sin embargo, no se producen cuando los microorganismos son cultivados en medios mínimos tales como el M9 o MOPS, que carecen de aminoácidos. Este hallazgo refuerza la utilidad de ciertas realizaciones del método de la invención para incrementar el crecimiento de una planta y/o alterar su patrón de desarrollo en el que la planta se cultiva en presencia de un cultivo de un microorganismo que produce compuestos volátiles, sin que exista contacto entre la planta y el microorganismo: aquellas realizaciones en las que el crecimiento del microorganismo se produce en un medio que carece compuestos orgánicos que presenten grupos amino, particularmente aminoácidos y/o proteínas, especialmente cuando el crecimiento del microorganismo se produce en un medio mínimo suplementado con un compuesto orgánico como fuente de carbono. Finally, it is worth mentioning that the present application for addition to the main patent discloses tests in which it is shown that ammonium, when plants are grown in an atmosphere in which said compound is present, is responsible for depigmentation of plants and of the inhibition of its growth. This result reinforces the idea, set forth in the main patent application P201000499, that microorganisms grown in media rich in amino acids (and, in general, organic compounds that have amino groups), produce volatile (ammonium) that inhibit growth; Such compounds, however, do not occur when microorganisms are grown in minimal media such as M9 or MOPS, which lack amino acids. This finding reinforces the usefulness of certain embodiments of the method of the invention to increase the growth of a plant and / or alter its development pattern in which the plant is grown in the presence of a culture of a microorganism that produces volatile compounds, without there is contact between the plant and the microorganism: those embodiments in which the growth of the microorganism occurs in a medium that lacks organic compounds that have amino groups, particularly amino acids and / or proteins, especially when the growth of the microorganism occurs in a medium minimum supplemented with an organic compound as a carbon source.

Las mejoras de la invención se describen ahora con más detalle por medio de las Figuras y Ejemplos que se presentan a continuación. The improvements of the invention are now described in more detail by means of the Figures and Examples presented below.

Breve descripción de las ﬁguras Brief description of the ﬁ gures

Fig. 1: Cuantiﬁcación del almidón obtenido de plantas de Arabidopsis thaliana incubadas en presencia de distintos compuestos volátiles: Fig. 1: Quantification of starch obtained from Arabidopsis thaliana plants incubated in the presence of different volatile compounds:

--: Panel A: cuantiﬁcación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis, cultivadas en atmósfera en la que están presentes los compuestos volátiles que se indican bajo cada una de las barras (indol, DTT (ditiotreitol), NAA (ácido 1-naftalenoacético), β-mercaptoetanol, ácido salicílico, ácido jasmónico, cisteína, acetoína, etileno, etanol, metanol, β-hidroxibutirato, butanediol, ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído, ácido fórmico o ácido butírico), por evaporación de una disolución que los contiene. Panel A: quantification of starch content in leaves of Arabidopsis plants, grown in an atmosphere in which volatile compounds indicated under each of the bars (indole, DTT (dithiothreitol), NAA (1-naphthalenoacetic acid) are present , β-mercaptoethanol, salicylic acid, jasmonic acid, cysteine, acetoin, ethylene, ethanol, methanol, β-hydroxybutyrate, butanediol, propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid or butyric acid), by evaporation of a solution containing them .

--: Panel B: cuantiﬁcación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis, cultivadas en una atmósfera en la que están presentes los compuestos volátiles que se indican bajo cada grupo de barras (ácido propiónico, ácido acético, ácido fórmico, ácido butírico), por evaporación de una disolución que los contiene en el porcentaje, expresado en volumen/volumen, que se indica mediante un número bajo cada una de las barras. Panel B: quantification of starch content in leaves of Arabidopsis plants, grown in an atmosphere in which the volatile compounds indicated under each group of bars (propionic acid, acetic acid, formic acid, butyric acid) are present, by evaporation of a solution containing them in the percentage, expressed in volume / volume, indicated by a number under each of the bars.

En ambos casos, el almidón se expresa como micromoles (μmol) de glucosa por gramo de peso fresco (FW). In both cases, the starch is expressed as micromoles (μmol) of glucose per gram of fresh weight (FW).

Fig. 2: Fotografía de plantas de Arabidopsis control y plantas cultivadas durante 4 días en MS sólido dentro de una caja de plástico de 500 centímetros cúbicos junto a una disolución de 2 centímetros cúbicos al 0,2% de ácido fórmico. Claramente, la presencia de ácido fórmico promueve el crecimiento de la planta y la ﬂoración. Fig. 2: Photograph of control Arabidopsis plants and plants grown for 4 days in solid MS inside a 500 cubic centimeter plastic box next to a solution of 2 cubic centimeters at 0.2% formic acid. Clearly, the presence of formic acid promotes plant growth and flowering.

Fig. 3: cuantiﬁcación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis, cultivadas en una atmósfera en la que están presentes o ausentes (control) los compuestos volátiles producidos por un cultivo de Escherichia coli existente en la misma caja sellada, sin que exista contacto físico con la planta, dependiendo de si el cultivo de Escherichia coli es de tipo silvestre (barras con la leyenda WT) o un mutante con una deleción en el gen de la piruvato quinasa F (barras con la leyenda ΔpykF). El almidón se expresa como micromoles (μmol) de glucosa por gramo de peso fresco (FW). Fig. 3: quantification of starch content in leaves of Arabidopsis plants, grown in an atmosphere in which volatile compounds produced by an existing Escherichia coli culture in the same sealed box are present or absent (control) without existing physical contact with the plant, depending on whether the culture of Escherichia coli is wild type (bars with the WT legend) or a mutant with a deletion in the pyruvate kinase F gene (bars with the ΔpykF legend). Starch is expressed as micromoles (μmol) of glucose per gram of fresh weight (FW).

Fig. 4: Cinética de la acumulación de almidón y del balance entre la concentración de ácido 3-fosfoglicérico (3PGA) y ortofosfato (Pi) en plantas de Arabidopsis thaliana. Fig. 4: Kinetics of starch accumulation and balance between the concentration of 3-phosphoglyceric acid (3PGA) and orthophosphate (Pi) in Arabidopsis thaliana plants.

--: Panel A: cuantiﬁcación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis thaliana según el tiempo transcurrido, expresado en horas en abscisas, de exposición a la luz o a la oscuridad y ausencia o presencia de volátiles fúngicos. La barra blanca bajo el gráﬁco indica período de luz (16 primeras horas), mientras que la barra con relleno oscuro indica período de oscuridad (6 horas siguientes). El almidón se expresa como micromoles (μmol) de glucosa por gramo de peso fresco (FW). Panel A: quantification of starch content in leaves of Arabidopsis thaliana plants according to the elapsed time, expressed in hours in abscissa, exposure to light or darkness and absence or presence of fungal volatiles. The white bar below the graph indicates light period (first 16 hours), while the dark filled bar indicates darkness period (next 6 hours). Starch is expressed as micromoles (μmol) of glucose per gram of fresh weight (FW).

--: Panel B: relación entre la concentración de ácido 3-fosfoglicérico (3PGA) y ácido fosfórico (Pi) según las horas de cultivo transcurridas. Panel B: relationship between the concentration of 3-phosphoglyceric acid (3PGA) and phosphoric acid (Pi) according to the hours of cultivation elapsed.

En ambos paneles, los símbolos situados sobre cada una de las curvas indican las condiciones de cultivo, de la siguiente manera: Círculos negros: cultivo en presencia de volátiles fúngicos durante todo el día (las 16 horas de luz y las 8 horas de oscuridad); círculos sin relleno: cultivo en presencia de volátiles fúngicos durante las 16 horas de luz; ausencia de volátiles fúngicos durante las 8 horas de oscuridad; cuadrados con relleno oscuro: cultivo sin volátiles, incluso durante el período de luz; triángulos con relleno oscuro: cultivo con volátiles, en ausencia de luz durante las 24 horas de cultivo. On both panels, the symbols located on each of the curves indicate the growing conditions, as follows: Black circles: cultivation in the presence of fungal volatiles throughout the day (16 hours of light and 8 hours of darkness) ; unfilled circles: culture in the presence of fungal volatiles during the 16 hours of light; absence of fungal volatiles during the 8 hours of darkness; squares with dark fill: crop without volatiles, even during the light period; dark filled triangles: volatile culture, in the absence of light during the 24 hours of cultivation.

Fig. 5: Cinética de la acumulación de almidón y de la actividad de la enzima sacarosa sintasa (SuSy) en plantas de patata. Fig. 5: Kinetics of starch accumulation and sucrose synthase enzyme (SuSy) activity in potato plants.

--: Panel A: cuantiﬁcación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis thaliana según el tiempo transcurrido, expresado en horas en abscisas, de exposición a la luz y a volátiles fúngicos producidos por un cultivo de Alternaria alternata. El almidón se expresa como micromoles (μmol) de glucosa por gramo de peso fresco (FW). Panel A: quantification of starch content in leaves of Arabidopsis thaliana plants according to the elapsed time, expressed in hours in abscissa, exposure to light and fungal volatiles produced by a culture of Alternaria alternata. Starch is expressed as micromoles (μmol) of glucose per gram of fresh weight (FW).

--: Panel B: cuantiﬁcación de la actividad de la enzima sacarosa sintasa (SuSy), expresada en miliunidades (mU) por gramo de peso fresco (FW), detectada en hojas de plantas de Arabidopsis thaliana según el tiempo transcurrido, expresado en horas en abscisas, de exposición a la luzyavolátiles fúngicos producidos por un cultivo de Alternaria alternata. Panel B: quantification of the activity of sucrose synthase enzyme (SuSy), expressed in milliunits (mU) per gram of fresh weight (FW), detected in leaves of Arabidopsis thaliana plants according to the elapsed time, expressed in hours in abscissa, of exposure to fungal light and volatile produced by a culture of Alternaria alternata.

Fig. 6: Cinética de acumulación de almidón en hojas cortadas de Arabidopsis incubadas en placas de Petri con MS sólido con 90 mM sacarosa y en presencia o ausencia de 50 μM de cicloheximida (Sigma) o 200 μM de cordicepina (Sigma). Las placas fueron depositadas en una caja de 500 centímetros cúbicos en la que previamente se había introducido un cultivo de A. alternata. Fig. 6: Starch accumulation kinetics in cut Arabidopsis leaves incubated in Petri dishes with solid MS with 90 mM sucrose and in the presence or absence of 50 μM cycloheximide (Sigma) or 200 μM cordicepine (Sigma). The plates were deposited in a box of 500 cubic centimeters in which a culture of A. alternata had previously been introduced.

Fig. 7: Proceso de obtención de plásmidos útiles para la transformación de plantas mediante la tecnología Gateway, que contienen las secuencias codiﬁcantes que se indican en la parte superior izquierda de los esquemas, a partir de productos de PCR que incorporan las secuencias de reconocimiento de recombinasa attB1 y attB2. Panel A: inhibidor de proteasas; Panel B: nitrito reductasa en antisentido; Panel C: cisteína sintasa en antisentido. Fig. 7: Process of obtaining plasmids useful for the transformation of plants using Gateway technology, which contain the coding sequences indicated in the upper left part of the schemes, from PCR products incorporating the recognition sequences of attB1 and attB2 recombinase. Panel A: protease inhibitor; Panel B: nitrite reductase in antisense; Panel C: cysteine synthase in antisense.

Fig. 8: Fotografías de plantas de Arabidopsis cultivadas durante 4 días en MS sólido dentro de una caja de plástico de 500 centímetros cúbicos junto a 2 centímetros cúbicos de agua (fotografía superior, marcada como 0%) o 2 centímetros cúbicos de una disolución acuosa de amoníaco al 2% (fotografía intermedia) o al 5% (fotografía inferior), v/v.. Claramente, la presencia de amoníaco conlleva a una despigmentación de las hojas e inhibe el crecimiento de las plantas. Fig. 8: Photographs of Arabidopsis plants grown for 4 days in solid MS in a plastic box of 500 cubic centimeters next to 2 cubic centimeters of water (top photograph, marked 0%) or 2 cubic centimeters of an aqueous solution 2% ammonia (intermediate photo) or 5% (lower photo), v / v .. Clearly, the presence of ammonia leads to depigmentation of the leaves and inhibits plant growth.

Ejemplos Examples

--: Ejemplo 1 Example 1

Identiﬁcación de compuestos volátiles implicados en el incremento de la acumulación de almidón Identification of volatile compounds involved in increasing starch accumulation

1.1. Identification of substances capable of increasing starch accumulation

Con el ﬁn de dilucidar si las mezclas de volátiles producidos por microorganismos contenían compuestos especíﬁcos responsables del aumento del crecimiento y compuestos responsables del incremento de la acumulación de almidón, o si existían compuestos capaces de producir ambos efectos, se llevaron a cabo ensayos de cultivos de plantas de Arabidopsis thaliana (cv. Columbia) similares a los que se llevaron a cabo en la solicitud de patente principal, aunque sustituyendo los cultivos microbianos por disoluciones de los volátiles a ensayar. Para ello, las plantas se cultivaron en placas Petri que contenían medio MS sólido con sacarosa 90 mM. Las plantas germinaron y se hicieron crecer durante dos semanas en cámaras de crecimiento con un fotoperíodo de 16 h de luz (300 μmol fotones s−1m−2) y a una temperatura constante de 24ºC. In order to elucidate whether the volatile mixtures produced by microorganisms contained specific compounds responsible for the growth growth and compounds responsible for the increase in starch accumulation, or if there were compounds capable of producing both effects, tests of cultures of Arabidopsis thaliana (cv. Columbia) plants similar to those carried out in the main patent application, although replacing microbial cultures with solutions of the volatiles to be tested. For this, the plants were grown in Petri dishes containing solid MS medium with 90 mM sucrose. The plants germinated and were grown for two weeks in growth chambers with a photoperiod of 16 h of light (300 μmol photons s − 1m − 2) and at a constant temperature of 24 ° C.

Las placas Petri que contenían plantas completamente desarrolladas se colocaron en cajas de cultivo de 500 centímetro cúbicos idénticas a las utilizadas en la solicitud de patente principal, con la diferencia de que en dichas cajas, en lugar de cultivos microbianos, se introdujeron, en cada caso, placas de petri que contenían 2 centímetros cúbicos de disoluciones acuosas al 5% de uno de los siguientes compuestos: indol, DTT (ditiotreitol), NAA (ácido 1-naftalenoacético), β-mercaptoetanol, ácido salicílico, ácido jasmónico, cisteína, acetoína, etanol, metanol, β-hidroxibutirato, butanediol, ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído, ácido fórmico o ácido butírico, sin que existiera contacto físico entre la planta y la disolución. El etileno se aportó en forma de polvos de etefón. Las cajas se sellaron y las hojas se recogieron tras dos días de incubación para realizar el análisis del contenido de almidón. Las hojas se recogieron al ﬁnal de período de luz. Como control negativo, las placas Petri que contenían plantas completamente desarrolladas se cultivaron durante dos días en cajas de plástico selladas junto con una placa de Petri que contenía 2 centímetros cúbicos de agua en ausencia de cualquiera de los compuestos volátiles ensayados. Petri dishes containing fully developed plants were placed in culture boxes of 500 cubic centimeters identical to those used in the main patent application, with the difference that in these boxes, instead of microbial cultures, they were introduced, in each case , petri dishes containing 2 cubic centimeters of 5% aqueous solutions of one of the following compounds: indole, DTT (dithiothreitol), NAA (1-naphthalenoacetic acid), β-mercaptoethanol, salicylic acid, jasmonic acid, cysteine, acetoin , ethanol, methanol, β-hydroxybutyrate, butanediol, propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid or butyric acid, without physical contact between the plant and the solution. Ethylene was supplied as ethephon powders. The boxes were sealed and the leaves were collected after two days of incubation to perform the analysis of the starch content. The leaves were collected at the end of the light period. As a negative control, Petri dishes containing fully developed plants were grown for two days in sealed plastic boxes together with a Petri dish containing 2 cubic centimeters of water in the absence of any of the volatile compounds tested.

El almidón se midió utilizando un kit de ensayo basado en la amiloglucosidasa (Boehringer Mannheim, Alemania). Starch was measured using a test kit based on amyloglucosidase (Boehringer Mannheim, Germany).

Los resultados obtenido se muestran en la Fig. 1A. The results obtained are shown in Fig. 1A.

Tal como se ilustra en la misma, ni la acetoína ni el butanediol, compuestos previamente implicados en aumento del crecimiento de las plantas, están implicados en MIVOISAP (microbial volátiles induced starch accumulation process: proceso de acumulación de almidón inducido por volátiles microbianos). Como se comentó previamente, ambas sustancias volátiles son emitidas por algunos aislados del género Bacillus y ambas están implicadas en la promoción del crecimiento de las plantas ejercido por estos microorganismos. Esto demuestra que MIVOISAP no tiene nada que ver con la promoción del crecimiento por productos neutros, tales como la acetoína y el butanediol, que son producidos por algunos microorganismos a partir del ácido pirúvico como alternativa a las vías de metabolización de este compuesto, sino que está determinado por algunas sustancias ácidas procedentes también de la metabolización del ácido pirúvico siguiendo rutas metabólicas diferentes tales como acetato, ácido fórmico, etc. As illustrated therein, neither acetoin nor butanediol, compounds previously implicated in plant growth, are involved in MIVOISAP (induced starch accumulation process volatile microbial: process of starch accumulation induced by microbial volatiles). As previously mentioned, both volatile substances are emitted by some isolates of the genus Bacillus and both are involved in promoting the growth of plants exerted by these microorganisms. This shows that MIVOISAP has nothing to do with the promotion of growth by neutral products, such as acetoin and butanediol, which are produced by some microorganisms from pyruvic acid as an alternative to the metabolic pathways of this compound, but that It is determined by some acidic substances also from the metabolism of pyruvic acid following different metabolic pathways such as acetate, formic acid, etc.

De todas las sustancias volátiles analizadas, sólo el ácido propiónico, el ácido acético, el acetaldehído, el ácido fórmico y el ácido butírico promueven la sobreacumulación del almidón. Además, disoluciones al 0.2% de ácido fórmico promueven el crecimiento y ﬂoración de la planta (Fig. 2), lo cual indica fuertemente que el efecto MIVOISAP divulgado en la patente principal P201000499 (consistente en el incremento de la acumulación de almidón, incremento del crecimiento y modiﬁcaciones en el patrón de crecimiento entre las que se incluye la inducción de la ﬂoración) es debido la liberación de pequeñas cantidades de estas sustancias ácidas por parte de los microorganismos. Of all the volatile substances analyzed, only propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid and butyric acid promote starch over-accumulation. In addition, 0.2% solutions of formic acid promote plant growth and ﬂ ow (Fig. 2), which strongly indicates that the MIVOISAP effect disclosed in main patent P201000499 (consisting of increased starch accumulation, increased growth and modi ﬁ cations in the growth pattern, including the induction of ﬂ ow) is due to the release of small amounts of these acidic substances by microorganisms.

1.2. Effect of volatile concentration on starch accumulation

Para demostrar si este efecto era dependiente de la dosis del compuesto, se repitió el ensayo del apartado anterior, creciendo las plantas en presencia de disoluciones acuosas de 2 centímetros cúbicos de ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído o ácido butírico, ensayando para cada uno de ellos tres concentraciones diferentes, cada uno en distintas cajas: al 1%, 2% ó 5% (v/v). To demonstrate whether this effect was dose dependent on the compound, the test of the previous section was repeated, growing the plants in the presence of aqueous solutions of 2 cubic centimeters of propionic acid, acetic acid, acetaldehyde or butyric acid, testing for each of they three different concentrations, each in different boxes: 1%, 2% or 5% (v / v).

Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 1B. El ensayo corrobora el efecto positivo sobre la acumulación de almidón de estos compuestos y, además, demuestra que el efecto es dependiente de la dosis del compuesto volátil presente. The results obtained are shown in Fig. 1B. The test corroborates the positive effect on starch accumulation of these compounds and, in addition, demonstrates that the effect is dose dependent on the volatile compound present.

--: Ejemplo 2 Example 2

Inﬂuencia de los defectos en la síntesis de ácido pirúvico sobre la acumulación de almidón producida por mezclas de volátiles emitidas por microorganismos In ﬂ uence of defects in pyruvic acid synthesis on starch accumulation produced by volatile mixtures emitted by microorganisms

Tal como se divulga en la solicitud de patente principal P201000499, el incremento en la acumulación de almidón se observa cuando las plantas se cultivan en presencia de distintos microorganismos capaces de producir volátiles: bacterias, levaduras y mohos. Entre ellos, el cultivo de plantas de Arabidopsis thaliana en presencia de un cultivo de la bacteria Escherichia coli BW25113 mostraba igualmente el efecto de incremento de acumulación del almidón, cuando dicha bacteria se cultivó en placas Petri que contenían medio mínimo M9 sólido (95 mM Na2HPO4/44 mM KH2PO4/17 mM NaCl/37 mM NH4Cl/0,1 mM CaCl2/2 mM MgSO4, agar bacteriológico al 1,5%) suplementado con glucosa 50 mM. As disclosed in the main patent application P201000499, the increase in starch accumulation is observed when plants are grown in the presence of different microorganisms capable of producing volatiles: bacteria, yeasts and molds. Among them, the cultivation of Arabidopsis thaliana plants in the presence of a culture of the Escherichia coli BW25113 bacterium also showed the effect of increasing starch accumulation, when said bacterium was cultured in Petri dishes containing minimum medium M9 solid (95 mM Na2HPO4 / 44 mM KH2PO4 / 17 mM NaCl / 37 mM NH4Cl / 0.1 mM CaCl2 / 2 mM MgSO4, 1.5% bacteriological agar) supplemented with 50 mM glucose.

Para corroborar los resultados obtenidos en el Ejemplo 1 de la presente solicitud de adición a la patente principal P201000499, se procedió a repetir el ensayo de medida de la acumulación de almidón por mezclas de volátiles producidos por microorganismos, utilizando una cepa mutante de Escherichia coli, E. coli ΔpykF (Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, K. A., Tomita, M., Wanner, B. L. and Mori, In order to corroborate the results obtained in Example 1 of the present application for addition to the main patent P201000499, the test for measuring the accumulation of starch by mixtures of volatiles produced by microorganisms was repeated, using a mutant strain of Escherichia coli, E. coli ΔpykF (Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL and Mori,

H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. doi; 10.1038/msb4100050), que es mutante en el gen pykF que codiﬁca para la piruvato quinasa y que, debido a ello, produce menos cantidades de piruvato y, en consecuencia, también menor cantidad de sustancias tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido láctico y acetaldehído que las cepas silvestres de H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst Biol. Doi; 10.1038 / msb4100050), which is a mutant in the pykF gene that codes for pyruvate kinase and, as a result, produces less amounts of pyruvate and, consequently, also a smaller amount of substances such as formic acid, acetic acid, propionic acid , lactic acid and acetaldehyde that the wild strains of

E. coli. E. coli.

Así, se repitió el ensayo del Ejemplo 1 anterior, aunque en este caso las plantas se colocaron en cajas de plástico estériles de 500 centímetros cúbicos que contenían cultivos microbianos de Escherichia coli BW25113 (control de cepa silvestre) o bien de Escherichia coli ΔpykF. Thus, the test of Example 1 above was repeated, although in this case the plants were placed in sterile 500 cubic centimeter plastic boxes containing microbial cultures of Escherichia coli BW25113 (wild strain control) or Escherichia coli ΔpykF.

Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 3. En la misma se demuestra que este mutante, con defectos en la síntesis de ácido pirúvico y compuestos derivados de su metabolismo tales como el ácido acético, el ácido fórmico, el ácido propiónico o el acetaldehído, ejerce un efecto parcial en MIVOISAP. The results obtained are shown in Fig. 3. It shows that this mutant, with defects in the synthesis of pyruvic acid and compounds derived from its metabolism such as acetic acid, formic acid, propionic acid or acetaldehyde , exerts a partial effect on MIVOISAP.

--: Ejemplo 3 Example 3

Cinética de la acumulación de almidón Kinetics of starch accumulation

Para investigar (a) cómo se producía la acumulación de almidón a lo largo del tiempo desde el momento de exposición a los volátiles microbianos, (b) la posible implicación de mecanismos de regulación a nivel transcripcional y post-transcripcional del proceso y (c) la inﬂuencia que la luz pudiera tener en la acumulación, se realizaron ensayos de cinética de acumulación de almidón en dos plantas diferentes: Arabidopsis thaliana (cv. Columbia) y patata (Solanum tuberosum L. cv Desirée). Como en el Ejemplo 1, las plantas se cultivaron en placas Petri que contenían medio MS sólido con sacarosa 90 mM, Las plantas se hicieron crecer en cámaras de crecimiento con un fotoperíodo de 16 h de luz (300 μmol fotones s−1m−2), 8 horas de oscuridad y a una temperatura constante de 24ºC. Tras aproximadamente 2 semanas de crecimiento después del momento de la germinación, las plantas se colocaron en cajas de plástico de 500 centímetros cúbicos en las que previamente se había introducido cultivos de Alternaria alternata en placas Petri que contenían medio MS sólido suplementado con sacarosa 90 mM. A los tiempos indicados en las Figs.4y5se recolectaron las hojas para posteriores análisis del contenido de almidón, 3PGA, Pi y actividad SuSy. To investigate (a) how starch accumulation occurred over time from the time of exposure to microbial volatiles, (b) the possible involvement of regulatory mechanisms at the transcriptional and post-transcriptional level of the process and (c) In ﬂ uence that light might have on the accumulation, tests of starch accumulation kinetics were carried out in two different plants: Arabidopsis thaliana (cv. Columbia) and potato (Solanum tuberosum L. cv Desirée). As in Example 1, the plants were grown on Petri dishes containing solid MS medium with 90 mM sucrose. The plants were grown in growth chambers with a 16 h photoperiod of light (300 μmol photons s − 1m − 2) , 8 hours of darkness and at a constant temperature of 24ºC. After approximately 2 weeks of growth after germination, the plants were placed in plastic boxes of 500 cubic centimeters in which previously Alternaria alternata cultures had been introduced in Petri dishes containing solid MS medium supplemented with 90 mM sucrose. At the times indicated in Figs. 4 and 5, the leaves were collected for subsequent analysis of starch content, 3PGA, Pi and SuSy activity.

3.1. Kinetics of Arabidopsis thaliana

Se llevó a cabo la incubación de las plantas de Arabidopsis thaliana como se ha comentado en la introducción, con 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad (salvo en uno de los ensayos en los que el paso de la luz fue evitado envolviendo la caja de plástico con papel de aluminio), utilizando varias condiciones de presencia o ausencia de cultivo Alternaria alternata y, por tanto, de presencia o ausencia de volátiles microbianos, dando lugar a los gráﬁcos que se representan en la Fig. 4. Las condiciones fueron las siguientes: The incubation of Arabidopsis thaliana plants was carried out as mentioned in the introduction, with 16 hours of light and 8 hours of darkness (except in one of the trials in which the passage of light was avoided by wrapping the box of plastic with aluminum foil), using various conditions of presence or absence of Alternaria alternata culture and, therefore, of presence or absence of microbial volatiles, giving rise to the graphs depicted in Fig. 4. The conditions were following:

--: Cultivo en presencia de volátiles fúngico durante todo el día (las 16 horas de luz y las 8 horas de oscuridad) (curva con círculos negros en el gráﬁco). Cultivation in the presence of fungal volatiles throughout the day (16 hours of light and 8 hours of darkness) (curve with black circles on the graph).

--: Cultivo en presencia de volátiles fúngicos durante las 16 horas de luz; ausencia de volátiles fúngicos durante las 8 horas de oscuridad (curva con círculos sin relleno en el gráﬁco). Cultivation in the presence of fungal volatiles during the 16 hours of light; absence of fungal volatiles during the 8 hours of darkness (curve with unfilled circles on the graph).

--: Cultivo sin volátiles, incluso durante el período de luz (curva con cuadrados rellenos en el gráﬁco). Cultivation without volatiles, even during the light period (curve with filled squares in the graph).

--: Cultivo con volátiles, en ausencia de luz durante las 16 primeras horas de cultivo. Aunque el cultivo tuvo lugar durante el período de 16 horas de iluminación, la caja de plástico fue envuelta en papel de aluminio, evitando así el contacto con la luz. Cultivation with volatiles, in the absence of light during the first 16 hours of cultivation. Although the cultivation took place during the period of 16 hours of lighting, the plastic box was wrapped in aluminum foil, thus avoiding contact with light.

Los resultados obtenidos al evaluar el almidón acumulado (Fig. 4A) muestran que en ausencia de luz, incluso en presencia de volátiles y sacarosa en el medio de cultivo de la planta, no hay síntesis de almidón. En presencia de luz sin volátiles microbianos la tasa de acumulación de almidón es de aproximadamente 8 nanomoles de glucosa transferida al almidón por gramo de peso fresco y minuto. En presencia de luz y volátiles microbianos, durante las 2 primeras horas de cultivo la tasa de acumulación de almidón es de aproximadamente 100 nanomoles de glucosa transferida al almidón por gramo de peso fresco y minuto. Tras 2 horas de incubación de las hojas en presencia de volátiles microbianos, la tasa de acumulación de almidón es de aproximadamente 500 nanomoles de glucosa transferida al almidón por gramo de peso fresco y minuto. Concluidas las 16 horas de luz, la ausencia de la misma hace disminuir el almidón acumulado. The results obtained when evaluating the accumulated starch (Fig. 4A) show that in the absence of light, even in the presence of volatiles and sucrose in the plant's culture medium, there is no starch synthesis. In the presence of light without microbial volatiles, the starch accumulation rate is approximately 8 nanomoles of glucose transferred to the starch per gram of fresh weight and minute. In the presence of light and volatile microbials, during the first 2 hours of cultivation the starch accumulation rate is approximately 100 nanomoles of glucose transferred to the starch per gram of fresh weight and minute. After 2 hours of incubation of the leaves in the presence of microbial volatiles, the starch accumulation rate is approximately 500 nanomoles of glucose transferred to the starch per gram of fresh weight and minute. Concluded the 16 hours of light, the absence of it reduces the accumulated starch.

Los resultados demuestran la conexión existente entre los procesos metabólicos implicados en MIVOISAP y la luz. The results demonstrate the connection between the metabolic processes involved in MIVOISAP and light.

Adicionalmente, haciendo uso de las plantas cultivadas en las mismas condiciones, se comprobó el balance 3PGA/ Pi según se describe en Muñoz et al., 2005: Plant Cell Physiol. 46: 1366-1376. 3-PGA (ácido 3-fosfoglicérico) es un activador alostérico de la ADPglucosa pirofosforilasa, mientras que el ortofosfato (Pi) es un regulador negativo de esta enzima implicada en la producción plastidial de ADPglucosa. Los resultados se muestran en la Fig. 4B, en la que puede observarse que la relación 3PGA/Pi se incrementa en el caso de plantas cultivadas en presencia de luz con volátiles fúngicos; la curva parece indicar, además, una relación entre el incremento de almidón y el incremento con el tiempo del valor obtenido de esta relación. En cambio, en ausencia de volátiles y presencia de luz, o en presencia de volátiles y ausencia de luz, los valores obtenidos a lo largo de tiempo vienen a ser similares para los dos tipos de condiciones de cultivo, con pequeñas oscilaciones a lo largo del tiempo. Los resultados presentados en la Fig. 4B parecen indicar que MIVOISAP es debido, al menos en parte, a mecanismos de regulación post-transcripcional tales como la activación alostérica de la ADPglucosa pirofosforilasa. Additionally, using plants grown under the same conditions, the 3PGA / Pi balance was tested as described in Muñoz et al., 2005: Plant Cell Physiol. 46: 1366-1376. 3-PGA (3-phosphoglyceric acid) is an allosteric activator of ADPglucose pyrophosphorylase, while orthophosphate (Pi) is a negative regulator of this enzyme involved in the plastidial production of ADPglucose. The results are shown in Fig. 4B, in which it can be seen that the 3PGA / Pi ratio is increased in the case of plants grown in the presence of light with fungal volatiles; The curve also seems to indicate a relationship between the increase in starch and the increase in time of the value obtained from this relationship. In contrast, in the absence of volatiles and presence of light, or in the presence of volatiles and absence of light, the values obtained over time become similar for the two types of growing conditions, with small oscillations along the weather. The results presented in Fig. 4B seem to indicate that MIVOISAP is due, at least in part, to post-transcriptional regulation mechanisms such as the allosteric activation of ADPglucose pyrophosphorylase.

3.2. Kinetics in potato plants

Se repitió el experimento del apartado 3.1., utilizando en este caso plantas de patata. En este caso, se midió la acumulación de almidón durante las 16 horas de luz y, adicionalmente, se comprobó también la actividad de la enzima sacarosa sintasa (Susy). The experiment in section 3.1 was repeated, using in this case potato plants. In this case, the accumulation of starch was measured during the 16 hours of light and, in addition, the activity of the sucrose synthase enzyme (Susy) was also checked.

La medida de la actividad de la enzima SuSy se realizó de forma idéntica a la descrita en la solicitud de patente principal. Brevemente, 1 g de polvo congelado de hoja se resuspendió a 4ºC en 5 ml de HEPES 100 mM (pH 7,5) y EDTA 2 mM. La suspensión se desaló y se ensayó en ella la actividad enzimática, tal como ha sido descrito por Baroja-Fernández et al. (Baroja Fernández et al., 2009: Plant Cell Physiol. 50: 1651-1662). The measurement of the activity of the SuSy enzyme was performed identically to that described in the main patent application. Briefly, 1 g of frozen leaf powder was resuspended at 4 ° C in 5 ml of 100 mM HEPES (pH 7.5) and 2 mM EDTA. The suspension was desalted and enzyme activity was tested therein, as described by Baroja-Fernández et al. (Baroja Fernández et al., 2009: Plant Cell Physiol. 50: 1651-1662).

Los resultados se representan en la Fig. 5, en la que aparecen sólo los datos correspondientes a plantas incubadas en presencia de luz y de volátiles fúngicos. El panel A corresponde a la acumulación de almidón y el panel B a la actividad de SuSy. The results are represented in Fig. 5, in which only the data corresponding to plants incubated in the presence of light and fungal volatiles appear. Panel A corresponds to the accumulation of starch and panel B to the activity of SuSy.

Los datos obtenidos demuestran que existen mecanismos transcripcionales (incremento de la expresión de SuSy) que regulan MIVOISAP. The data obtained demonstrate that there are transcriptional mechanisms (increased expression of SuSy) that regulate MIVOISAP.

3.3 Kinetics of starch accumulation in the presence or absence of transcriptional and translational inhibitors

Se repitió el experimento del apartado 3.1, utilizando en este caso hojas cortadas de Arabidopsis incubadas en placas de Petri con medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa y, en su caso, con 50 micromolar (μM) del inhibidor de traducción cicloheximida (Sigma) y 200 micromolar (μM) del inhibidor de transcripción cordicepina (Sigma) (Fritz, C.C. et al., 1991: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4458-4462; Hayashi, T. and Takagi, S., 2003; Plant Cell Physiol. 44: 1027-1036; Dhonukshe et al., 2006: Developmental Cell 10: 137-150). Las placas fueron depositadas en cajas de 500 centímetros cúbicos en las que previamente se habían depositado cultivos de Alternaria alternata. Los resultados presentados en la Fig. 6 según los cuales ambas sustancias inhiben fuertemente la acumulación de almidón a partir de las 2 horas de incubación en presencia de volátiles fúngicos emitidos por Alternaria alternata sugieren aún más que MIVOISAP está regulado, al menos en parte, transcripcionalmente. The experiment in section 3.1 was repeated, using in this case cut sheets of Arabidopsis incubated in Petri dishes with solid MS medium supplemented with 90 mM sucrose and, where appropriate, with 50 micromolar (μM) of the cycloheximide translation inhibitor (Sigma) and 200 micromolar (μM) of cordicepine transcription inhibitor (Sigma) (Fritz, CC et al., 1991: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4458-4462; Hayashi, T. and Takagi, S., 2003 ; Plant Cell Physiol. 44: 1027-1036; Dhonukshe et al., 2006: Developmental Cell 10: 137-150). The plates were deposited in boxes of 500 cubic centimeters in which previously Alternaria alternata cultures had been deposited. The results presented in Fig. 6 according to which both substances strongly inhibit the accumulation of starch after 2 hours of incubation in the presence of fungal volatiles emitted by Alternaria alternata further suggest that MIVOISAP is regulated, at least in part, transcriptionally .

--: Ejemplo 4 Example 4

Plásmidos útiles para la preparación de plantas transgénicas con capacidad incrementada de acumulación de almidón Useful plasmids for the preparation of transgenic plants with increased starch accumulation capacity

MIVOISAP está regulado transcripcionalmente. Por lo tanto, tal como se ha comentado previamente, la reproducción mediante transgénesis de los cambios metabólicos inducidos por MIVOISAP debería dar lugar a plantas transgénicas en las que la acumulación de almidón se incrementara con respecto a las plantas de tipo silvestre de la misma especie. Para producir esas plantas, ese necesario contar con vectores adecuados. MIVOISAP is transcriptionally regulated. Therefore, as previously mentioned, the reproduction by transgenesis of the metabolic changes induced by MIVOISAP should lead to transgenic plants in which the accumulation of starch is increased with respect to wild-type plants of the same species. To produce these plants, it is necessary to have adequate vectors.

Para ello, se recurrió al protocolo Gateway de construcciones de vectores para la transformación de plantas (Nakagawa et al., 2007: Journal of Bioscience and Bioingeneering 104: 34-41), que se basa en la inserción de fragmentos de secuencias de ADN bicatenario en sitios especíﬁcos de vectores, aprovechando las propiedades especíﬁcas de sitio del bacteriófago lambda, el uso de recombinasas y en la presencia de secuencias de reconocimiento para las mismas tanto en el fragmento a insertar, como en los vectores en los que desea insertarse. El proceso requiere la presencia de secuencias de recombinación de ADN del fago lambda (sitios att) ﬂanqueando, por una parte, el fragmento que se quiere insertar, y por otra, la presencia de las secuencias att complementarias en el vector en el que se desee insertar dicho fragmento de ADN. El proceso requiere, necesaria, la presencia de la recombinasa capaz de reconocer las secuencias att del fragmento que se quiere insertar (attB: attB1 y attB2, equivalentes a los sitios que se encuentran de manera natural en el genoma de E. coli) y las correspondientes secuencias en el vector en el que se desean insertar (attP: attP1 y attP2, respectivamente, correspondientes a las secuencias presentes en el bacteriófago lambda). La recombinasa reconocerá ambos pares de secuencias y producirá la inserción del fragmento de ADN en el vector, entre las secuencias attP1 y attP2; el empalme se produce de tal forma que desaparecen en las secuencias attB y attP, generándose en el vector recombinante secuencias attL (attL1 y attL2); este paso sería el equivalente a la inserción del bacteriófago lambda en el genoma de la bacteria. Si estas secuencias, a su vez, son reconocidas por una segunda recombinasa, una segunda reacción de recombinación en presencia de un vector que poseyera la pareja complementaria de sitios att reconocidos por esa segunda recombinasa (attR: attR1 y attR2), permitiría un segundo evento de recombinación. For this, the Gateway protocol of vector constructs for plant transformation was used (Nakagawa et al., 2007: Journal of Bioscience and Bioingeneering 104: 34-41), which is based on the insertion of double stranded DNA sequence fragments at specific sites of vectors, taking advantage of the specific site properties of the bacteriophage lambda, the use of recombinases and in the presence of recognition sequences for them both in the fragment to be inserted, and in the vectors in which it wishes to be inserted. The process requires the presence of recombination sequences of the lambda phage DNA (att sites) ﬂ anking, on the one hand, the fragment to be inserted, and on the other, the presence of complementary att sequences in the vector in which it is desired insert said DNA fragment. The process requires, necessarily, the presence of the recombinase capable of recognizing the att sequences of the fragment to be inserted (attB: attB1 and attB2, equivalent to the sites that are naturally found in the E. coli genome) and corresponding sequences in the vector in which they wish to be inserted (attP: attP1 and attP2, respectively, corresponding to the sequences present in the bacteriophage lambda). The recombinase will recognize both pairs of sequences and will produce the insertion of the DNA fragment into the vector, between the attP1 and attP2 sequences; splicing occurs in such a way that they disappear in the attB and attP sequences, generating attL sequences (attL1 and attL2) in the recombinant vector; This step would be the equivalent to the insertion of the bacteriophage lambda into the genome of the bacterium. If these sequences, in turn, are recognized by a second recombinase, a second recombination reaction in the presence of a vector possessing the complementary pair of att sites recognized by that second recombinase (attR: attR1 and attR2), would allow a second event of recombination.

En el presente ejemplo, se recurrió al uso de la tecnología Gateway, de Invitrogen, siguiendo las instrucciones del fabricante (protocolo de Gateway® Technology: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-andServices/Applications/Cloning/Gateway-Cloning/GatewayC-Misc/Protocols.html#bp). Para producir las construcciones necesarias para expresar en antisentido la nitrito reductasa y la cisteína sintasa plastidial, se partió del vector comercial pDONR/Zeo, de Invitrogen, que posee las secuencias de recombinación attP1 y attP2, y de productos de PCR que poseían, en 5’, una secuencia attB2 y en 3’ una secuencia attB1, tal como puede observarse en las Fig. 7B (nitrito reductasa en antisentido) y 7C (cisteína sintasa en antisentido). En el caso de la construcción necesaria para expresar el inhibidor de la proteasa, el producto de PCR poseía en el extremo 5’ una secuencia attB1 y en el extremo 3’ una secuencia attB2 (Fig. 7A). Estos productos de PCR se obtienen realizando las reacciones de PCR con cebadores attB: Los cebadores attB se diseñan con la siguiente disposición: In the present example, the use of Invitrogen Gateway technology was used, following the manufacturer's instructions (Gateway® Technology protocol: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-andServices /Applications/Cloning/Gateway-Cloning/GatewayC-Misc/Protocols.html#bp). In order to produce the constructions necessary to express nitrite reductase and plastidial cysteine synthase in antisense, the commercial vector pDONR / Zeo, from Invitrogen, which possesses the attP1 and attP2 recombination sequences, and PCR products that possessed, in 5 ', an attB2 sequence and in 3' an attB1 sequence, as can be seen in Fig. 7B (antisense nitrite reductase) and 7C (antisense cysteine synthase). In the case of the construction necessary to express the protease inhibitor, the PCR product possessed at the 5 ′ end an attB1 sequence and at the 3 ′ end an attB2 sequence (Fig. 7A). These PCR products are obtained by performing the PCR reactions with attB primers: The attB primers are designed with the following arrangement:

Cebador para la inserción de la secuencia attB1: Primer for insertion of the attB1 sequence:

5’-GGG-ACA-AGT-TTG-TAC-AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-(secuencia especíﬁca para el molde de ADN a ampliﬁcar)-3’ 5’-GGG-ACA-AGT-TTG-TAC-AAA-AAA-GCA-GGC-TNN- (specific sequence for the DNA template to be amplified) -3 ’

Cebador para la inserción de la secuencia attB2: Primer for insertion of the attB2 sequence:

5’-GGGG-AC-CAC-TTT-GTA-CAA-GAA-AGC-TGG-GTN-(secuencia especíﬁca para el molde de ADN a ampliﬁcar)-3’ 5’-GGGG-AC-CAC-TTT-GTA-CAA-GAA-AGC-TGG-GTN- (specific sequence for the DNA template to be amplified) -3 ’

En ambos casos, el fragmento subrayado representa a las secuencias attB1 y attB2 propiamente dichas y N representa cualquier nucleótido. In both cases, the underlined fragment represents the attB1 and attB2 sequences themselves and N represents any nucleotide.

Esta misma estrategia se siguió para la ampliﬁcación de los fragmentos de ADN codiﬁcantes correspondientes a los genes de la planta de patata (Solanum tuberosum) del inhibidor de proteasas (SEQ ID NO:1), nitrito reductasa en antisentido (SEQ ID NO:3) y cisteína sintasa en antisentido (SEQ ID NO:5). Los cebadores especíﬁcos utilizados en cada caso fueron los siguientes: This same strategy was followed for the amplification of the coding DNA fragments corresponding to the genes of the potato plant (Solanum tuberosum) of the protease inhibitor (SEQ ID NO: 1), nitrite reductase in antisense (SEQ ID NO: 3) and cysteine synthase in antisense (SEQ ID NO: 5). The specific primers used in each case were the following:

Los fragmentos de las secuencias en negrita son los correspondientes a los genes ampliﬁcados, mientras que las partes subrayadas corresponden a las secuencias attB1 (secuencias con número de orden impar) o a las secuencias attB2 (secuencias con número de orden par). The fragments of the sequences in bold are those corresponding to the ampli ﬁ ed genes, while the underlined parts correspond to the attB1 sequences (sequences with odd order number) or the attB2 sequences (sequences with even order number).

De esta forma, se ampliﬁcaron las secuencias bicatenarias representadas por SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5. Las secuencias que codiﬁcan para la nitrito reductasa y la cisteína sintasa (SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5, respectivamente), presentaban en su extremo 5’ una secuencia attB2 y en su extremo 3’ una secuencia attB1, mientras que la secuencia que codiﬁca para al inhibidor de proteasas presentaba en su extremo 5’ una secuencia attB1 y en su extremo 3’ una secuencia attB2. In this way, the double-stranded sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5 were amplified. The sequences coding for nitrite reductase and cysteine synthase (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5, respectively), presented at their 5 'end an attB2 sequence and at their 3' end an attB1 sequence, while the The sequence coding for the protease inhibitor had an attB1 sequence at its 5 'end and an attB2 sequence at its 3' end.

El protocolo de inserción de estos fragmentos en plásmidos Gateway se basa en llevar a cabo dos reacciones de recombinación sucesivas; reacciónBP (para producir el vector de introducción) y reacción LR (que da lugar al vector de expresión) siguiendo las instrucciones del fabricante, Invitrogen). Para ello, se partió en todos los casos del vector comercial pDON/Zeo (Invitrogen; estructura. Pág. 50 del Protocolo de Gateway® Technology), que contiene entre los sitios de recombinación attP un gen de resistencia a cloranfenicol (CmR) y la secuencia del gen ccdB. Fuera de la región de recombinación presenta un gen de resistencia a zeocina (ZeoR), bajo el control del promotor de EM7 que permite la selección de las bacterias transformadas con este vector. La incubación de las secuencias bicatenarias representadas por SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 ó SEQ ID NO:5, ﬂanqueadas por las correspondientes secuencias attB, con dicho factor pDON/Zeo, en presencia de la BP Clonasa® de Invitrogen, siguiendo las indicaciones del fabricante (pág. 22 del Protocolo de Gateway® Technology) dio lugar a un vector de recombinación en el que el fragmento de ADN bicatenario deseado había quedado insertado entre las secuencias attP1 y attP2 del plásmido, generando secuencias attL1 y attL2 y haciendo desaparecer el fragmento en el que se encontraban los genes de resistencia a cloranfenicol y el gen ccdB (plásmidos: pDONR Prot-Inhb, pDONR NR y pDONR Cys-Synth, respectivamente). Cada uno de estos plásmidos se ampliﬁcó tras su transformación en células competentes E. coli TOP 10, seleccionando las transformantes mediante el uso de la resistencia a zeocina conferida por el plásmido. The protocol for inserting these fragments into Gateway plasmids is based on carrying out two successive recombination reactions; BP reaction (to produce the introduction vector) and LR reaction (which gives rise to the expression vector) following the manufacturer's instructions, Invitrogen). To do this, the commercial vector pDON / Zeo (Invitrogen; structure. Page 50 of the Gateway® Technology Protocol) was split in all cases, which contains a chloramphenicol resistance (CmR) gene between the attP recombination sites and the ccdB gene sequence. Outside the recombination region it has a zeocin resistance gene (ZeoR), under the control of the EM7 promoter that allows the selection of bacteria transformed with this vector. The incubation of the double stranded sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, floated by the corresponding attB sequences, with said pDON / Zeo factor, in the presence of Invitrogen BP Clonasa®, Following the manufacturer's instructions (page 22 of the Gateway® Technology Protocol) it resulted in a recombination vector in which the desired double stranded DNA fragment had been inserted between the attP1 and attP2 sequences of the plasmid, generating attL1 and attL2 sequences and disappearing the fragment in which the chloramphenicol resistance genes and the ccdB gene were found (plasmids: pDONR Prot-Inhb, pDONR NR and pDONR Cys-Synth, respectively). Each of these plasmids was amplified after transformation into competent E. coli TOP 10 cells, selecting the transformants by using the zeocin resistance conferred by the plasmid.

Una vez ampliﬁcado el plásmido recombinante, se llevó a cabo su inserción en el plásmido pGWB2 (Nakagawa T, Kurose T, Hiño T, Tanaka K, Kawamukai M, Niwa Y, Toyooka K, Matsuoka K, Jinbo T, Kimura T. 2007 Development of series of gateway binary vectors, pGWBs, for realizing efﬁcient construction of fusión genes for plant transformation. J. Biosci. Bioeng. 104(1): 34-41), que contiene las secuencias de recombinación attR1 y attR2, que permiten la inserción entre las mismas de un fragmento ﬂanqueado por secuencias attL1 y attL2 en presencia de la recombinasa LR Clonase® (Invitrogen). Este vector permite la expresión constitutiva de secuencias codiﬁcantes mediante el promotor 35S del virus del mosaico de la coliﬂor (CaMV). Este vector posee dos marcadores de selección de plantas transformadas: el gen de la higromicina fosfotransferasa (Hyg) bajo el control del promotor 35S de CaMV, y un gen de resistencia a kanamicina (Kan) bajo el control del promotor Nos. Las secuencias attR1 y attR2 ﬂanquean un fragmento del vector en el que se encuentran los genes ccdB y cat, que serán reemplazados por los genes de interés después de la reacción de recombinación llevada a cabo por la recombinasa LR. La reacción de recombinación da lugar a la inserción del gen de interés entre las secuencias attR1 y attR2, regenerándose las secuencias attB1 y attB2 ﬂanqueando los extremos del gen de interés y perdiéndose los genes ccdB y cat, pero manteniendo el plásmido ﬁnal el gen de resistencia a kanamicina (Kan) y el gen de la higromicina fosfotransferasa (Hyg). Cuando Agrobacterium tumefaciens transforma una célula vegetal va a transferir al genoma de la planta un fragmento de ADN del plásmido pGBW2 comprendido entre las secuencias denominadas LB (left border) y RB (right border), el cual incluye los genes de resistencia a kanamicina e higromicina y el gen de interés. Once the recombinant plasmid was amplified, its insertion into plasmid pGWB2 (Nakagawa T, Kurose T, Hi T, Tanaka K, Kawamukai M, Niwa Y, Toyooka K, Matsuoka K, Jinbo T, Kimura T. 2007 Development was carried out) of series of gateway binary vectors, pGWBs, for realizing ef ﬁ cient construction of fusion genes for plant transformation. J. Biosci. Bioeng. 104 (1): 34-41), which contains the attR1 and attR2 recombination sequences, which allow insertion between them of a fragment ﬂ anched by attL1 and attL2 sequences in the presence of the LR Clonase® recombinase (Invitrogen). This vector allows constitutive expression of coding sequences by the 35S promoter of the coli ﬂ ow mosaic virus (CaMV). This vector has two selection markers for transformed plants: the hygromycin phosphotransferase (Hyg) gene under the control of the CaMV 35S promoter, and a kanamycin resistance (Kan) gene under the control of the Nos. Promoter. The attR1 and attR2 ﬂ anch a fragment of the vector in which the ccdB and cat genes are found, which will be replaced by the genes of interest after the recombination reaction carried out by the LR recombinase. The recombination reaction results in the insertion of the gene of interest between the attR1 and attR2 sequences, the attB1 and attB2 sequences being regenerated by anchoring the ends of the gene of interest and losing the ccdB and cat genes, but maintaining the final plasmid the resistance gene to kanamycin (Kan) and the hygromycin phosphotransferase (Hyg) gene. When Agrobacterium tumefaciens transforms a plant cell, it will transfer to the plant genome a DNA fragment of plasmid pGBW2 between the sequences called LB (left border) and RB (right border), which includes the kanamycin and hygromycin resistance genes and the gene of interest.

Estos plásmidos serían adecuados para la generación de plantas transgénicas que expresaran al menos una secuencia nucleotídica seleccionada entre el gen que codiﬁca para un inhibidor de proteasas y los antisentidos de los genes que codiﬁcan para la nitrito reductasa plastidial y la cisteína sintasa, lo que permitiría utilizar dichas plantas para obtener un incremento en la acumulación de almidón. These plasmids would be suitable for the generation of transgenic plants that express at least one nucleotide sequence selected between the gene that codes for a protease inhibitor and the antisense of the genes that code for plastidial nitrite reductase and cysteine synthase, which would allow use said plants to obtain an increase in the accumulation of starch.

--: Ejemplo 5 Example 5

Inﬂuencia del amoníaco en el crecimiento y color de las plantas In ﬂ uence of ammonia in plant growth and color

Con el ﬁn de obtener más información sobre la teoría, expuesta en la solicitud de patente principal, de que los microorganismos que crecen en medios ricos en compuestos que presentan grupos amino, especialmente si son medios ricos en aminoácidos, producen volátiles que afectan negativamente al crecimiento y el desarrollo de las plantas, volátiles que no se producen cuando los microorganismos se hacen crecer en medios mínimos que carecen de aminoácidos, se repitió el ensayo de los apartados 1.1 y 1.2. del Ejemplo 1, creciendo las plantas en presencia de disoluciones acuosas de 2 centímetros cúbicos de amoníaco, ensayando dos concentraciones diferentes, cada una en distintas cajas: al 2% ó 5% (v/v). Se incluyó también un control en el que las plantas crecieron en presencia de agua a la que no se le había añadido otro compuesto. In order to obtain more information about the theory, set forth in the main patent application, that microorganisms that grow in media rich in compounds that have amino groups, especially if they are rich in amino acids, produce volatiles that negatively affect growth and the development of volatile plants that do not occur when microorganisms are grown in minimal media lacking amino acids, the test of sections 1.1 and 1.2 was repeated. of Example 1, the plants growing in the presence of aqueous solutions of 2 cubic centimeters of ammonia, testing two different concentrations, each in different boxes: 2% or 5% (v / v). A control was also included in which the plants grew in the presence of water to which no other compound had been added.

Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 8. Se observa que la presencia de amoníaco en la atmósfera de crecimiento da lugar a despigmentación de las plantas e inhibición del crecimiento, efectos que son más acusados en el caso de las plantas que se crecieron en presencia de mayor concentración de amoníaco y que no se observan en ausencia de este compuesto (fotografías marcadas con la leyenda “0%”), pues las plantas control presentaban color verde y mayor tamaño que las crecidas en presencia de amonio. The results obtained are shown in Fig. 8. It is observed that the presence of ammonia in the growth atmosphere results in depigmentation of plants and growth inhibition, effects that are more pronounced in the case of plants that grew in presence of a higher concentration of ammonia and that are not observed in the absence of this compound (photographs marked with the legend "0%"), as the control plants had a green color and larger than those grown in the presence of ammonia.

Este resultado, como se comentó previamente, constituye una prueba importante de que los microorganismos cultivados en medios ricos en aminoácidos producen volátiles, tales como el amoníaco, que inhiben el crecimiento y afectan negativamente el color; tales compuestos, sin embargo, no se producen cuando los microorganismos son cultivados en medios mínimos que carecen de aminoácidos. This result, as previously mentioned, is an important proof that microorganisms grown in amino acid-rich media produce volatiles, such as ammonia, that inhibit growth and negatively affect color; Such compounds, however, do not occur when microorganisms are grown in minimal media that lack amino acids.

Claims

1. one.: Un método para incrementar el crecimiento de una planta y/o alterar su patrón de desarrollo caracterizado por que la planta se cultiva en una atmósfera en la que está presente al menos un compuesto volátil que se selecciona entre ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído, ácido fórmico y ácido butírico. A method for increasing the growth of a plant and / or altering its development pattern characterized in that the plant is grown in an atmosphere in which at least one volatile compound is selected which is selected from propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, acid formic and butyric acid.

2. 2.: Método según la reivindicación 1, en el que la planta se cultiva en una atmósfera en la que está presente al menos ácido fórmico. Method according to claim 1, wherein the plant is grown in an atmosphere in which at least formic acid is present.

3. 3.: Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto volátil está presente en la atmósfera por evaporación de una disolución que lo contiene que se encuentra en el lugar de cultivo de la planta. Method according to claim 1 or 2, wherein the volatile compound is present in the atmosphere by evaporation of a solution containing it that is in the plant's cultivation site.

4. Four.: Método según al reivindicación 1 ó 2, en el que el compuesto volátil se suministra a la atmósfera de cultivo desde el exterior al lugar de cultivo de la planta. Method according to claim 1 or 2, wherein the volatile compound is supplied to the culture atmosphere from outside to the plant's place of cultivation.

5. 5.: Método según una cualquiera de las reivindicaciones1a4,enelque el incremento del crecimiento se maniﬁesta en aumento de la longitud de la planta y/o en aumento del tamaño de las hojas, tallos y raíces. Method according to any one of claims 1 to 4, in which the increase in growth is shown by increasing the length of the plant and / or increasing the size of the leaves, stems and roots.

6. 6.: Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la alteración del patrón de crecimiento se maniﬁesta en incremento del número de hojas, incremento del número de ramas y/o del número de ﬂores y semillas de plantas angiospermas, en la inducción de la ﬂoración, o en combinaciones de los anteriores. A method according to any one of claims 1 to 4, wherein the alteration of the growth pattern is manifested by increasing the number of leaves, increasing the number of branches and / or the number of flowers and seeds of angiosperm plants, in induction of the ﬂ ow, or in combinations of the above.

SEQUENCE LIST

<110> IDEN BIOTECHNOLOGY, S.L.

<120> IMPROVEMENTS INTRODUCED IN THE OBJECT OF THE MAIN PATENT No. P2010004 99 PRO-

ASSIGNMENT TO ALTER THE DEVELOPMENT PATTERN, INCREASE THE GROWTH AND ACCUMULATION OF ALMIDÓN AND ALTER THE STRUCTURE OF ALMIDÓN IN PLANTS

<130> CO-32622

<160> 12

<210> 1

<211> 324

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (324)

<223> Coding sequence of Potato Protease Inhibitor

<400> 1

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 2

<210> 3

<211> 1764

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1764)

<223> Coding sequence of potato nitrite reductase

<400> 3

ES 2 376 734 A1

<210> 4

<211> 587

ES 2 376 734 A1

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 4

ES 2 376 734 A1

<210> 5

<211> 1161

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1161)

<223> Coding sequence of potato cysteine synthase

<400> 5

ES 2 376 734 A1

<210> 6

<211> 386

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 6

ES 2 376 734 A1

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer for potato protease inhibitor

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (29)

<223> sequence attB1

<220>

<221> misc_feature

<222> (32) .. (55)

<223> sequence complementary to the potato protease inhibitor gene

<400> 7

<200> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer for potato protease inhibitor

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (29)

<223> sequence attB2

<220>

<221> misc_feature

<222> (31) .. (54)

<223> sequence complementary to the potato protease inhibitor gene

<400> 8

<200> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer for potato nitrite reductase

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (29)

<223> sequence attB1

<220>

<221> misc_feature

<222> (32) .. (57)

<223> sequence complementary to the potato nitrite reductase gene

<400> 9

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer for potato nitrite reductase

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (29)

<223> sequence attB2

<220>

<221> misc_feature

<222> (31) .. (57)

<223> sequence complementary to the potato nitrite reductase gene

<400> 10

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer for potato cysteine synthase

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (29)

<223> sequence attB1

<220>

<221> misc_feature <222> (32) .. (55)

<223> sequence complementary to the potato synthase cysteine gene

<400> 11

<210> 12

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> PCR primer for potato nitrite reductase

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (29)

<223> sequence attB2

<220>

<221> misc_feature

<222> (31) .. (53)

<223> sequence complementary to the potato cysteine synthase gene

<400> 12

SPANISH OFFICE OF THE PATENTS AND BRAND

Application no .: 201001068

SPAIN

Date of submission of the application: 13.08.2010

Priority Date:

REPORT ON THE STATE OF THE TECHNIQUE

51 Int. Cl.: A01N31 / 02 (2006.01)

RELEVANT DOCUMENTS

Categoría Category: 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas 56 Documents cited Claims Affected

X X: JP 2004256508 A (TAKAHASHI TATESHI) 16.09.2004, (resumen) (en línea) (recuperado el 04.11.2011). Recuperado de: EPOQUENET. 1-4 JP 2004256508 A (TAKAHASHI TATESHI) 16.09.2004, (summary) (online) (retrieved 04.11.2011). Recovered from: EPOQUENET. 1-4

A TO: WALLACE, J.M., et al. Adverse synergistic effects between acetic, propionic, butyric and valeric acids on the growth of wheat seedling roots. 1980. Soil Biol. Biochem., páginas 445 y 446. 1-6 WALLACE, J.M., et al. Adverse synergistic effects between acetic, propionic, butyric and valeric acids on the growth of wheat seedling roots. 1980. Soil Biol. Biochem., Pages 445 and 446. 1-6

A TO: CN 101167452 A (YONG HUANG) 30.04.2008, (resumen) (en línea) (recuperado el 04.11.2011). Recuperado de: EPOQUENET. 1-6 CN 101167452 A (YONG HUANG) 04/30/2008, (summary) (online) (retrieved 04.11.2011). Recovered from: EPOQUENET. 1-6

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:

Fecha de realización del informe 05.03.2012 Date of realization of the report 05.03.2012: Examinador I. Rueda Molíns Página 1/4 Examiner I. Rueda Molíns Page 1/4

REPORT OF THE STATE OF THE TECHNIQUE

Application number: 201001068

Minimum documentation sought (classification system followed by classification symbols) A01N Electronic databases consulted during the search (name of the database and, if possible, terms of

search used) INVENES, EPODOC, WPI, TXT

State of the Art Report Page 2/4

WRITTEN OPINION

Application number: 201001068

Date of Completion of Written Opinion: 05.03.2012

Statement

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986): Reivindicaciones Reivindicaciones 5, 6 1-4 SI NO Claims Claims 5, 6 1-4 IF NOT

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986): Reivindicaciones Reivindicaciones 5, 6 1-4 SI NO Claims Claims 5, 6 1-4 IF NOT

The application is considered to comply with the industrial application requirement. This requirement was evaluated during the formal and technical examination phase of the application (Article 31.2 Law 11/1986).

Opinion Base.-

This opinion has been made on the basis of the patent application as published.

State of the Art Report Page 3/4

WRITTEN OPINION

Application number: 201001068

1. Documents considered.-

The documents belonging to the state of the art taken into consideration for the realization of this opinion are listed below.

Documento Document: Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date

D01 D01: JP 2004256508 A (TAKAHASHI TATESHI) (resumen) (en línea) (recuperado el 04.11.2011). Recuperado de: EPOQUENET. 2004 JP 2004256508 A (TAKAHASHI TATESHI) (summary) (online) (retrieved 04.11.2011). Recovered from: EPOQUENET. 2004

D02 D02: WALLACE, J.M., ET AL. Adverse synergistic effects between acetic, propionic, butyric and valeric acids on the growth of wheat seedling roots. Soil Biol. Biochem., páginas 445 y 446. 1980 WALLACE, J.M., ET AL. Adverse synergistic effects between acetic, propionic, butyric and valeric acids on the growth of wheat seedling roots. Soil Biol. Biochem., Pages 445 and 446. 1980

D03 D03: CN101167452 A (YONG HUANG) (resumen) (en línea) (recuperado el 04.11.2011). Recuperado de: EPOQUENET. 2008 CN101167452 A (YONG HUANG) (summary) (online) (retrieved 04.11.2011). Recovered from: EPOQUENET. 2008

2. Statement motivated according to articles 29.6 and 29.7 of the Regulations for the execution of Law 11/1986, of March 20, on Patents on novelty and inventive activity; quotes and explanations in support of this statement

In the patent application reference is made to a method to increase the growth of a plant and / or alter its development pattern characterized in that the plant is grown in an atmosphere in which at least one volatile compound is selected which is selected from propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid and butyric acid.

Document D01 shows a composition for increasing the growth of a plant containing acetic acid, formic acid and propionic acid.

Document D02 discloses the effects produced by propionic acid, acetic acid and butyric acid on the growth of wheat roots.

NEW AND INVENTIVE ACTIVITY (Articles 6 and 8 LP11 / 86)

In claims 1-4 a method is claimed to increase the growth of a plant and / or alter its development pattern characterized in that the plant is grown in an atmosphere in which at least one volatile compound that is selected from acid is present propionic, acetic acid, acetaldehyde, formic acid and butyric acid. Said volatile compound is present in said atmosphere by evaporation of a solution containing it.

Document D01 discloses a composition to increase the growth of a plant species that comprises different elements including acetic acid, formic acid and propionic acid. It is indicated herein as the components of said composition can be dissolved in water. Therefore, taking into account the information disclosed in document D01, claims 1-4 do not present novelty or inventive activity as set forth in Articles 6 and 8 LP11 / 1986.

State of the Art Report Page 4/4