ES2370250T3 - Anticuerpo biespecífico que sustituye al factor viii. - Google Patents
Anticuerpo biespecífico que sustituye al factor viii. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2370250T3 ES2370250T3 ES04792180T ES04792180T ES2370250T3 ES 2370250 T3 ES2370250 T3 ES 2370250T3 ES 04792180 T ES04792180 T ES 04792180T ES 04792180 T ES04792180 T ES 04792180T ES 2370250 T3 ES2370250 T3 ES 2370250T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- prt
- seq
- mus musculus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title abstract description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 86
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 76
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 62
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 54
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 53
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 50
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 50
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 49
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 claims description 49
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 49
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 44
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 42
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 37
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 20
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 19
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 17
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 16
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 claims description 13
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 13
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 claims description 12
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 claims description 12
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 12
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 5
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000013633 acquired hemophilia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 abstract description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 11
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 abstract description 6
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 254
- 238000000034 method Methods 0.000 description 97
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 74
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 67
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 66
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 41
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 40
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 40
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 40
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 38
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 28
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 26
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 26
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 24
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 23
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 19
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 18
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 17
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 17
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000011160 research Methods 0.000 description 16
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 15
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 15
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 12
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 101100527115 Picea mariana RPL31 gene Proteins 0.000 description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 10
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 10
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 9
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 9
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 9
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 9
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 8
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 102000050019 Membrane Cofactor Human genes 0.000 description 7
- 101710146216 Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 7
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 7
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 6
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical class CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 5
- 102100040790 Protein Z-dependent protease inhibitor Human genes 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 5
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108090000201 Carboxypeptidase B2 Proteins 0.000 description 4
- 102100035023 Carboxypeptidase B2 Human genes 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 102000016550 Complement Factor H Human genes 0.000 description 3
- 108010053085 Complement Factor H Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 3
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 3
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PJYYBCXMCWDUAZ-YKDQUOQBSA-N Ponasterone A Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@@](O)([C@@H](O)CCC(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 PJYYBCXMCWDUAZ-YKDQUOQBSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 102220080600 rs797046116 Human genes 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- PJYYBCXMCWDUAZ-JJJZTNILSA-N 2,3,14,20,22-pentahydroxy-(2β,3β,5β,22R)-Cholest-7-en-6-one Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 PJYYBCXMCWDUAZ-JJJZTNILSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 2
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 150000002058 ecdysones Chemical class 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 2
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 2
- DTLVBHCSSNJCMJ-JXQFQVJHSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[2-[2-[2-[2-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCOCCOCCOCCOCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O DTLVBHCSSNJCMJ-JXQFQVJHSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- UFFVWIGGYXLXPC-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C1=CC=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O UFFVWIGGYXLXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWVRASTUFJRTHW-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(azetidin-3-yloxy)-4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound O=C(CN1C=C(C(OC2CNC2)=N1)C1=CN=C(NC2CC3=C(C2)C=CC=C3)N=C1)N1CCC2=C(C1)N=NN2 VWVRASTUFJRTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 102100037529 Coagulation factor V Human genes 0.000 description 1
- 102000016917 Complement C1 Human genes 0.000 description 1
- 108010028774 Complement C1 Proteins 0.000 description 1
- 108010028778 Complement C4 Proteins 0.000 description 1
- 102100033777 Complement C4-B Human genes 0.000 description 1
- 108010077762 Complement C4b Proteins 0.000 description 1
- 108700017374 Complement Factor H Deficiency Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical compound [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030386 Granzyme A Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028523 Hereditary Complement Deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001009599 Homo sapiens Granzyme A Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 239000012570 Opti-MEM I medium Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 229930186873 Ponasterone Natural products 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000034527 Retinoid X Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038912 Retinoid X Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000026552 Severe hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001295 alanines Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 201000004995 autoimmune glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 201000002388 complement deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N gold(1+) Chemical compound [Au+] ZBKIUFWVEIBQRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000002085 hemarthrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000031209 hemophilic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000053391 human F Human genes 0.000 description 1
- 108700031895 human F Proteins 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000201 insect hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940047434 kogenate Drugs 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 150000003102 ponasterones Chemical class 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 229960003147 reserpine Drugs 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Anticuerpo que reconoce un enzima proteolítico y un sustrato del mismo, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que puede actuar como cofactor que aumenta la reacción enzimática, en el que el enzima es el factor IX de coagulación sanguínea y/o el factor IX activado de coagulación sanguínea; el sustrato es el factor X de coagulación sanguínea; y el cofactor es factor VIII de coagulación sanguínea y/o factor VIII activado de coagulación sanguínea.
Description
Anticuerpo biespecífico que sustituye al factor VIII.
La presente invención se refiere a los anticuerpos biespecíficos que sustituyen funcionalmente a los cofactores que potencian reacciones enzimáticas, y a las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo como principio activo.
Los anticuerpos han recibido mucha atención como medicina debido a su estabilidad en sangre elevada y su antigenicidad baja. Los anticuerpos biespecíficos pueden reconocer simultáneamente dos tipos de antígeno. Los 15 anticuerpos biespecíficos han sido propuestos durante cierto tiempo; sin embargo, sólo se ha informado de anticuerpos que conectan simplemente dos tipos de antígeno, tales como aquellos para el redireccionamiento de las células NK, macrófagos y células T (ver el documento no de patente nº 7). Por ejemplo, MDX-210, que actualmente se encuentra bajo estudio clínico, es un anticuerpo biespecífico que únicamente redirige los monocitos que expresan FcγRI y similares a células de cáncer que expresan HER-2/neu. De esta manera, no existe ningún ejemplo hasta el
20 momento que utilice un anticuerpo biespecífico como medios alternativos para sustituir funcionalmente el cofactor que potencia las reacciones enzimáticas.
Son ejemplos de factores el factor tisular (TF), el factor V de coagulación sanguínea (F.V), el factor V activado de coagulación sanguínea (F.Va), el factor VIII de coagulación sanguínea (F.VIII), el factor VIII activado de coagulación
25 sanguínea (F.VIIIa), la trombomodulina (TM), la proteína S (PS), la proteína Z (PZ), la heparina, el complemento C4b, el factor H regulador del complemento, la proteína cofactor de membrana (MCP) y el receptor 1 del complemento (CR1).
De ellos, el F.VIII/F.VIIIa es un cofactor necesario para una expresión suficiente de actividad del factor IX activado
30 de coagulación sanguínea (F.IXa). Scheiflinger F. et al. descubrieron que un determinado anticuerpo anti-F.IX/F.IXa actúa estimulando la activación del factor X de coagulación sanguínea (F.X) por parte de F.IXa en un ensayo cromogénico (documento de patente nº 1). Sin embargo, en un ensayo que examina la capacidad de recuperación de la coagulación en plasma deficiente en F.VIII, se observó capacidad de recuperación de la coagulación únicamente al añadir exógenamente F.IXa, pero no en el caso de que se utilizase este anticuerpo por sí solo.
35 Es conocido que F.VIIIa interactúe no sólo con F.IXa sino también con F.X (ver los documentos no de patente nº 5 y 6). A este respecto, el anticuerpo de Scheiflinger F. et al. no puede considerarse un sustituto suficiente para la función de F.VIII/F.VIIIa, y su actividad aparentemente también resulta insuficiente.
40 A partir de la investigación específica, se ha conseguido la producción de anticuerpos biespecíficos que sustituyen funcionalmente los factores que potencian la actividad enzimática, y de esta manera han completado la presente invención.
[Documento de patente 1] WO 01/19992 45 [Documento de patente 2] Patente US nº 4. 474.893
[Documento de patente 3] EP 404 097
50 [Documento de patente 4] WO 93/11161
[Documento de patente 5] Solicitud de patente japonesa: 2002-112369
[Documento de patente 6] Solicitud de patente japonesa: 2003-012648
55 [Documento de patente 7] Solicitud de patente japonesa Kokai Publicación nº (JP-A) H5-304992 (sin examinar, solicitud de patente japonesa publicada)
[Documento de patente 8] JP-A H2-145187 60 [Documento de patente 9] JP-A H5-213775
[Documento de patente 10] JP-A H10-165184
65 [Documento de patente 11] JP-A H11-71288
21-10-2011
[Documento de patente 12] JP-A 2002-518041 [Documento de patente 13] JP-A H11-506310 [Documento de patente 14] JP-A H5-199894 [Documento de patente 15] JP-A H10-511085 [Documento de patente 16] JP-A H5-184383 [Documento no de patente 1] Nilsson IM et al., "J. Intern. Med." 1992, Vol.235, p.25-32 [Documento no de patente 2] Lofqvist T et al,. "J. Intern. Med" 1997, Vol.241, p.395-400 (the "o" of Lofqvist is written
with an umlaut)
[Documento no de patente 3] 24th Meeting of The Japanese Society on Thrombosis and Hematosis, Special
Committee on Examining Hemophilia Standardization, Mini-symposium, 2001, http://www jsth.org
[Documento no de patente 4] Medical Bulletin #193 1994
[Documento no de patente 5] Mertens K et al., "Thromb. Haemost." 1999, Vol.82, p.209-217
[Documento no de patente 6] Lapan KA et al., "Thromb. Haemost." 1998, Vol.80, p.418-422
[Documento no de patente 7] Segal DM et al., "Journal of Immunological Methods" 2001, Vol.248, p.1-6
[Documento no de patente 8] Bos R y Nieuwenhuitzen W, "Hybridoma" 1992, Vol.11, nº 1, p.41-51
[Documento no de patente 9] Brennan M et al., "Science" 1985, Vol.229, nº 1708, p.81-3
[Documento no de patente 10] Karpovsky B et al., "J. Exp. Med." 1984, Vol. 160, nº 6, p.1686-701 1
[Documento no de patente 11] Suresh MR et al., "Methods Enzymol." 1986, Vol.121, p. 210-28
[Documento no de patente 12] Massimo YS et al., "J. Immunol. Methods" 1997, Vol.201, p.57-66
[Documento no de patente 13] Brennan M et al., "Science" 1985, Vol.229, p. 81
[Documento no de patente 14] Shalaby MR et al., "J. Exp. Med." 1992, Vol.175, p.217-25 ’
[Documento no de patente 15] Holliner P et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1993, Vol.90, p. 6444-8
[Documento no de patente 16] Ridgway JB et al., "Protein Eng." 1996, Vol.9, p. 617-21
[Documento no de patente 17] Hammerling U et al., "J. Exp. Med." 1968, Vol.128, p.1461-73
[Documento no de patente 18] Kurokawa T et al., "Bio/Technology" 1989, Vol.7, p.1163
[Documento no de patente 19] Link BK et al., "Blood" 1993, Vol.81, p.3343
[Documento no de patente 20] Nitta T et al., "Lancet" 1990, Vol.335, p.368-71
[Documento no de patente 21] deLeij L et al., "Foundation Nationale de Transfusion Sanguine, Les Ulis France"
1990, p.249-53 [Documento no de patente 22] Le Doussal JM et al., "J. Nucl. Med." 1993, Vol.34, p. 1662-71 1 [Documento no de patente 23] Stickney DR et al., "Cancer Res." 1991, Vol.51, p.6650-5 [Documento no de patente 24] Weiner LM et al., "Cancer Res." 1993, Vol.53, p.94-100 [Documento no de patente 25] Kroesen BJ et al., "Br. J. Cancer" 1994, Vol.70, p.652-61 [Documento no de patente 26] Weiner GJ et al., "J. Immunol." 1994, Vol.152, p.2385 [Documento no de patente 27] Suresh MR et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1986, Vol.83, p.7989-93
21-10-2011
[Documento no de patente 28] Milstein C y Cuello AC, "Nature" 1983, Vol.305, p.537
[Documento no de patente 29] Xiang J et al., "Mol. Immunol." 1990, Vol.27, p.809
5
[Documento no de patente 30] Bebbington CR et al., "Bio/Technology" 1992, Vol.10, p. 169
[Documento no de patente 31] Huse WD et al., "Science" 1989, Vol. 246, p.1275
[Documento no de patente 32] McCafferty J et al., "Nature" 1990, Vol.348, p.552
[Documento no de patente 33] Kang AS et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1991, Vol.88, p. 4363
Ruef et al. (Thromb. Haemost. 82:109-114, 1990) dan a conocer un constructo de anticuerpo biespecífico que 15 consiste de dos Fab que dirigen la uroquinasa a epítopos de fibrina y de plaquetas.
Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar anticuerpos biespecíficos que sustituyan funcionalmente a los cofactores que potencian las reacciones enzimáticas.
A partir de la investigación específica, se han podido descubrir anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente tanto a F.IX/F.IXa como a F.X y sustituyen la función del cofactor F.VIIIa (es decir, una función de estimulación de la activación de F.X por parte de F.IXa). Es decir, se han podido producir anticuerpos biespecíficos
25 que reconocen tanto un enzima como su sustrato y que sustituyen funcionalmente los cofactores del enzima.
La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos que sustituyen funcionalmente los cofactores que potencian las reacciones enzimáticas, y más concretamente a:
[1] un anticuerpo que reconoce tanto un enzima como un sustrato del mismo, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que sustituye funcionalmente un cofactor que potencia las reacciones enzimáticas,
en el que dicho enzima es un enzima proteolítico, y
35 en el que dichos enzima proteolítico y cofactor son factores asociados a la coagulación sanguínea/fibrinolisis y
en el que el enzima de un factor de coagulación sanguínea/fibrinolisis es el factor IX de coagulación sanguínea y/o el factor IX activado de coagulación sanguínea; el sustrato es el factor X de coagulación sanguínea y el cofactor es el factor VIII de coagulación sanguínea y/o el factor VIII activado de coagulación sanguínea.
[2] El anticuerpo según [1], en el que dicho anticuerpo comprende una región determinante de complementariedad que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR3 del anticuerpo anti-factor de coagulación sanguínea IX/IXa de los siguientes (a1) o (a2) o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a la misma, y una región determinante de complementariedad que comprende la secuencia de
45 aminoácidos de la CR3 del anticuerpo anti-factor de coagulación sanguínea X en cualquiera de los siguientes (b1) a (b9) o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a la misma:
(a1) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 16,
(a2) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 20,
(b1) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 24,
(b2) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 28,
(b3) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 32,
(b4) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 3b,
(b5) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 40,
55 (b6) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 44, (b7) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 48, (b8) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 52, (b9) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 56.
[3] El anticuerpo según cualquiera de entre [1] y [2], en el que dicho anticuerpo comprende una región determinante de complementariedad que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR del anticuerpo anti-factor de coagulación sanguínea IX/IXa de los siguientes (a1) o (a2) o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a la misma, y una región determinante de complementariedad que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR del anticuerpo anti-factor de coagulación sanguínea X
65 descrita en cualquiera de los siguientes (b1) a (b9) o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a la misma:
21-10-2011
(a1) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 14, 15 y 16, respectivamente,
5 (a2) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 18, 19 y 20, respectivamente,
(b1) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 22, 23 y 24, respectivamente,
(b2) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 26, 27 y 28, respectivamente,
(b3) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 30, 31 y 32, 15 respectivamente,
(b4) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 34, 35 y 36, respectivamente,
(b5) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 38, 39 y 40, respectivamente,
(b6) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 42, 43 y 44, respectivamente, 25 (b7) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 46, 47 y 48, respectivamente,
(b8) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 50, 51 y 52, respectivamente,
(b9) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 54, 55 y 56,
- respectivamente.
- 35
- [4] Una composición que comprende el anticuerpo según cualquiera de entre [1] y [3] y un portador
- farmacéuticamente aceptable.
- [5]
- La composición según [4], en la que dicha composición es una composición farmacéutica utilizada para
- prevenir y/o tratar el sangrado, un trastorno acompañado de sangrado, o un trastorno provocado por el
- sangrado.
- [6]
- La composición según [5], en la que el sangrado, un trastorno acompañado de sangrado, o un trastorno
- provocado por sangrado es un trastorno que aparece y/o progresa como resultado de una reducción o
- deficiencia de actividad del factor VIII de coagulación sanguínea o del factor VIII activado de coagulación
- 45
- sanguínea.
- [7]
- La composición según [6], en la que el trastorno que aparece y/o progresa como resultado de una reducción o
- deficiencia de actividad del factor VIII de coagulación sanguínea y/o del factor VIII activado de coagulación
- sanguínea es la hemofilia A.
- [8]
- La composición según [6], en la que el trastorno que aparece y/o progresa como resultado de una reducción o
- deficiencia de actividad del factor VIII de coagulación sanguínea y/o del factor VIII activado de coagulación
- sanguínea es un trastorno en el que se genera un inhibidor del factor VIII de coagulación sanguínea y/o del
- factor VIII activado de coagulación sanguínea.
- 55
- [9]
- La composición según [6], en la que el trastorno que aparece y/o progresa como resultado de una reducción o
- deficiencia de actividad del factor VIII de coagulación sanguínea y/o del factor VIII activado de coagulación
- sanguínea es la hemofilia adquirida.
[10] La composición según [6], en la que el trastorno que aparece y/o progresa como resultado de una reducción o deficiencia de actividad del factor VIII de coagulación sanguínea y/o del factor VIII activado de coagulación sanguínea es la enfermedad de von Willebrand.
[11] Un método para la prevención y/o tratamiento del sangrado, de un trastorno acompañado de sangrado, o de un trastorno provocado por el sangrado, en el que dicho método comprende la etapa de administrar el anticuerpo según cualquiera de entre [1] y [3], o la composición según cualquiera de entre [4] y [10].
21-10-2011
[12] Utilización del anticuerpo según cualquiera de entre [1] y [3] para la preparación de la composición según cualquiera de entre [4] y [10].
[13] Kit utilizado en el método de prevención y/o tratamiento de trastornos según [11], en el que dicho kit comprende por lo menos el anticuerpo según cualquiera de entre [1] y [3] o la composición según [4].
[14] Método para prevenir y/o tratar el sangrado, un trastorno acompañado de sangrado, o un trastorno provocado por sangrado, en el que dicho método comprende la etapa de administrar el anticuerpo según cualquiera de entre [1] y [3] o la composición según cualquiera de entre [4] y [10] en combinación con el factor VIII de coagulación sanguínea.
[15] Kit utilizado en el método de prevención y/o tratamiento del sangrado, de un trastorno acompañado de sangrado o de un trastorno provocado por el sangrado, según [14], en el que dicho kit comprende por lo menos el anticuerpo según cualquiera de entre [1] y [3], o la composición según [4], y el factor VIII de coagulación sanguínea.
La figura 1 ilustra la región de inserción de pcDNA4-g4H.
La figura 2 ilustra las regiones de inserción de pcDNA4-g4L y pIND-g4L.
La figura 3 ilustra la región de inserción de pIND-g4H.
La figura 4 ilustra los resultados de la medición de la actividad mimética de F.VIIIa de un anticuerpo biespecífico anti-F.IXa/anti-F.X, generado a partir del anticuerpo XB12 anti-F.IXa y los anticuerpos anti-F.X SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06 o SB34. La concentración de las soluciones de anticuerpos era 10 µg/ml (concentración final: 1 µg/ml). El resultado fueron nueve tipos de anticuerpos biespecíficos que mostraban un incremento de la actividad mimética de F.VIIIa: XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 y XB12/SB34, en orden de intensidad de la actividad.
La figura 5 ilustra los resultados de la medición de la actividad mimética de F.VIIIa de un anticuerpo biespecífico anti-F.IXa/anti-F.X generado a partir del anticuerpo XT04 anti-F.IXa y anticuerpos anti-F.X SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06 o SB34. La concentración de las soluciones de anticuerpo era 10 µg/ml (concentración final: 1 µg/ml). En consecuencia, XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06 y XT04/SB34 mostraron un incremento de la actividad mimética de F.VIIIa.
La figura 6 ilustra los resultados de la medición de la actividad mimética de F.VIIIa de diversas concentraciones de XB12/SB04, que mostraban la actividad más alta en la figura 4. En consecuencia, XB12/SB04 mostró un incremento dependiente de la concentración de la actividad mimética de F.VIIIa.
La figura 7 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación plasmática (APTT) en presencia de XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 o XB12/SB34. La concentración de las soluciones de anticuerpo mezclas con plasma deficiente en F.VIII era de 1,7 µg/ml para XB12/SB06 y de 10 µg/ml para el resto. En consecuencia, XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 y XB12/SB34 mostraron un efecto de acortamiento del tiempo de coagulación en comparación con la ausencia de los anticuerpos.
La figura 8 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación plasmática (APTT) en presencia de XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06 y XT04/SB34. La concentración de las soluciones de anticuerpo mezcladas con plasma deficiente en F.VIII era de 5 µg/ml para XT04/SB34 y de 10 µg/ml para el resto. En consecuencia, XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05 y XT04/SB06 mostraron un efecto de acortamiento del tiempo de coagulación en comparación con la ausencia de los anticuerpos. XT04/SB34 no mostró ningún efecto de acortamiento del tiempo de coagulación.
La figura 9 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación con diversas concentraciones de XB12/SB04, que mostró el efecto de acortamiento del tiempo de coagulación (APTT) más alto en las figuras 7 y 8. En consecuencia, XB12/SB04 mostró un efecto dependiente del tiempo de coagulación dependiente de la concentración. La concentración de anticuerpo en la figura muestra valores de la solución de anticuerpo mezclados con plasma deficiente en F.VIII.
La figura 10 ilustra los resultados de la transferencia western de GST-AP de SB04 o SB06, en donde 1), 2) y 3) son los resultados de hacer reaccionar GST-AP transcrito con SB04, SB06 y una muestra que no contenía anticuerpo, respectivamente. Los resultados muestran la detección de únicamente la reacción de unión de SB04 y GST-AP.
21-10-2011
La figura 11 ilustra un vector pELBGlacI. ColEIori: la región del origen de replicación de la serie de plásmidos ColE1; f1 ori: región del origen de replicación del fago f1; lacI: región codificante de la proteína represora de la lactosa; Plac: promotor lactosa; pelBss: secuencia de señal de la proteína PelB de E. coli; scFv: región codificante de la molécula monocatenaria de anticuerpo; gen III (gen3): región codificante de la proteína del gen III del fago fl; Ampr: gen de resistencia a la ampicilina, y SfiI: sitio de corte del enzima de restricción SfiI.
La figura 12 ilustra los resultados del a medición de la actividad mimética de F.VIIIa utilizando sobrenadantes de cultivo de los anticuerpos biespecíficos expresados, que son combinaciones de un anticuerpo anti-F.IXa (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69 o XB12) y un anticuerpo anti-F.X (B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB04, SB15 o SB27). "+" representa casos en los que la actividad mimética de F.VIIIa es 0,1 o superior.
La figura 13 ilustra los resultados de un ensayo de coagulación plasmática realizado utilizando preparaciones purificadas de anticuerpos biespecíficos expresados, que se combinan a partir de un anticuerpo anti-F.IXa (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69 o XB12) y un anticuerpo anti-F.X (B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB04, SB15 o SB27). El tiempo de coagulación se acortó en 10 a 20 segundos ("+"), en 20 a 40 segundos ("++"), en 40 a 50 segundos ("+++") o en 50 segundos ("++++") o más con la adición del anticuerpo en comparación con la no adición de los anticuerpos.
La figura 14 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación en diversas concentraciones de A44/B26, que presentaba un efecto de acortamiento elevado del tiempo de coagulación (APTT) en la figura 13. El tiempo de coagulación era de 113 segundos en el caso de no adición de anticuerpo. En consecuencia, A44/B26 mostró un efecto dependiente de la concentración de acortamiento del tiempo de coagulación. La concentración de anticuerpo en la figura muestra valores de la solución de anticuerpo mezclada con plasma deficiente en F.VIII.
La figura 15 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación a diversas concentraciones de A69/B26, que presentaba un efecto de acortamiento elevado del tiempo de coagulación (APTT) en la figura 13. El tiempo de coagulación era de 109,6 segundos en el caso de no adición del anticuerpo. En consecuencia, A69/B26 mostró un efecto dependiente de la concentración de acortamiento del tiempo de coagulación. La concentración de anticuerpo en la figura muestra valores de la solución de anticuerpo mezclada con plasma deficiente en F.VIII.
La figura 16 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación (APTT) en la coexistencia de A44/B26 o XB12/SB04 con F.VIII. En consecuencia, en comparación con F.VIII solo, una solución mixta de A44/B26 o XB12/SB04 con F.VIII mostró un efecto de acortamiento del tiempo de coagulación.
La figura 17 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación (APTT) en plasma inhibidor bajo la presencia de A44/B26 o XB12/SB04. En consecuencia, A44/B26 o XB12/SB04 mostraron un efecto de acortamiento del tiempo de coagulación en comparación con la ausencia de anticuerpos.
La figura 18 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación a diversas concentraciones de XB12/SB04 humanizado y de XB12/SB04 humanizado. El tiempo de coagulación era de 111,3 segundos en el caso de no adición de anticuerpo. Como consecuencia de la medición, XB12 humanizado/SB04 humanizado mostró un efecto de acortamiento del tiempo de coagulación similar al de XB12/SB04. La concentración de anticuerpo en la figura muestra los valores de la soluciones de anticuerpo mezclas con plasma deficiente en F.VIII.
Un anticuerpo biespecíficos según la presente invención es una molécula que comprende dos tipos de anticuerpo o de fragmentos de anticuerpo que presentan especificidades para diferentes antígenos. El anticuerpo biespecífico es, sin limitación particular aunque preferentemente, monoclonal.
Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención son preferentemente anticuerpos recombinantes, generados utilizando técnicas de recombinación génica (ver, por ejemplo, Borrebaeck C.A.K. y Larrick J.W., Therapeutic monoclonal antibodies, publicado en el Reino Unido por MacMillan Publishers Ltd., 1990). Puede obtenerse un anticuerpo recombinante mediante clonación de un ADN codificante de anticuerpo a partir de células productoras de anticuerpos, tales como hibridomas o linfocitos sensibilizados, que incorporan el ADN en un vector apropiado, e introducir el vector en un huésped para la producción de anticuerpos.
Además, los anticuerpos de la presente invención pueden ser fragmentos de anticuerpo o anticuerpos modificados. Los fragmentos de anticuerpo comprenden los diacuerpos (Db), los anticuerpos lineales, las moléculas de anticuerpo monocatenario (en adelante también denominados scFv), etc. En la presente memoria, un fragmento "Fv" representa el fragmento de anticuerpo más pequeño que comprende sitios completos de reconocimiento de antígeno y de unión. Un fragmento "Fv" es un dímero (dímero VH-VL) en el que una región variable de cadena pesada (H) (VH) y una región variable de cadena ligera (L) (VL) se encuentran fuertemente conectados mediante un enlace no
21-10-2011
covalente. Tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cada región variable interactúan formando un sitio de unión a antígeno sobre la superficie de un dímero VH-VL. Seis CDR proporcionan un sitio de unión a antígeno sobre un anticuerpo. Sin embargo, incluso una región variable (o la mitad de un Fv que contiene únicamente tres CDR específicos de antígeno) es capaz de reconocer un antígeno y la unión al mismo, aunque su afinidad es inferior a la del sitio de unión completo.
Además, el fragmento Fab (también denominado F(ab)) contiene además una región constante de cadena L y una región constante de cadena H (CH1). Un fragmento Fab' difiere de un fragmento Fab en que el primero contiene varios residuos adicionales derivados del extremo carboxilo-terminal una región CH1 de cadena H, que comprende una o más cisteínas de la región bisagra de un anticuerpo. Fab'-SH se refiere a Fab' que presenta un grupo tiol libre en uno o más residuos cisteína de la región constante. Los fragmentos F(ab') se generan mediante corte del enlace disulfuro en las cisteínas de la parte bisagra de un digerido con pepsina de F(ab')2. El experto en la materia también conocerá otros fragmentos de anticuerpo unidos químicamente.
Diacuerpo se refiere a un fragmento bivalente de anticuerpo construido mediante fusión génica (Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993; documento EP 404 097, documento WO 93/11161, etc.). Un diacuerpo es un dímero que comprende dos cadenas peptídicas; en cada cadena polipeptídica, una región variable de cadena L (VL) se encuentra conectada a una región variable de cadena H (VH) en la misma cadena mediante una molécula conectora que es excesivamente corta para permitir el apareamiento entre las dos regiones (por ejemplo aproximadamente 5 residuos). VL y VH codificados en la misma cadena polipeptídica forman un dímero debido a que no pueden formar un fragmento monocatenario de región variable debido a que la molécula conectora entre ellas es corta. De esta manera, un diacuerpo acaba presentando dos sitios de unión a antígeno.
Un anticuerpo monocatenario o fragmento scFv contiene las regiones VH y VL de un anticuerpo, y estas regiones existen en una única cadena polipeptídica. En general, un polipéptido Fv contiene además un polipéptido conector entre las regiones VH y VL, de manera que scFv puede formar una estructura que resulta necesaria para la unión de antígeno (ver Pluckthun, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113 (Rosenburg y Moore, editores (Springer Verlag, New York), páginas 269 a 315, 1994, para comentarios generales sobre scFv). Las moléculas conectoras de la presente invención no se encuentran particularmente limitadas, con la condición de que no inhiban la expresión de las regiones variables de anticuerpo conectadas a ambos extremos de una molécula conectora.
Un anticuerpo biespecífico de tipo IgG puede ser secretado por un hibridoma híbrido (un cuadroma) formado mediante la fusión de dos tipos de hibridoma que producen anticuerpos IgG (Milstein C. et al., Nature 305:537-540, 1983). También puede ser secretado mediante la introducción en las células de genes de las cadenas L y H que constituyen las dos IgG de interés (un total de cuatro tipos de genes) para la coexpresión.
Sin embargo, en teoría, existen hasta diez combinaciones de cadenas H y L en las IgG producidas mediante estos métodos. Resulta difícil purificar una IgG que comprenda la combinación deseada de cadenas H y L de diez tipos diferentes de IgG. Además, en teoría, se reduce drásticamente la cantidad de la combinación de interés, y de esta manera, resulta necesario el cultivo celular a gran escala, lo que conduce a un incremento adicional del coste de fabricación.
En este caso, mediante la sustitución apropiada del aminoácido o aminoácidos en la región CH3 de una cadena H, resulta posible secretar preferentemente las IgG que presentan una combinación heteróloga de cadenas H (Ridgway
J.B. et al., Protein Engineering 9:617-621, 1996; Merchant A.M. et al., Nature Biotechnology 16:677-681, 1998).
Respecto a las cadenas L, una región variable de cadena L es menos diversa en comparación con una región variable de cadena H; por lo tanto, podría esperarse la adquisición de una cadena L común que proporcione actividades de unión con dos cadenas H. La expresión eficiente de una IgG biespecífica resulta posible al introducir genes de esta cadena L común y ambas cadenas H en una célula para la expresión de IgG (Nature Biotechnology 16:677-681, 1998). Sin embargo, la posibilidad de tipos seleccionados aleatoriamente de anticuerpos que contengan la misma cadena L es baja; de esta manera, resulta difícil poner en práctica la idea mencionada anteriormente. A este respecto, se ha propuesto un método para la selección de una cadena L común adaptadora de cadenas H arbitrariamente diferentes con el fin de mostrar una capacidad de unión elevada (documento WO 2004/065611). Una cadena H que presente la variante de CH3 indicada anteriormente (Nature Biotechnology 16:677-681, 1998) resulta raramente secretada en ausencia de la otra cadena H. Mediante la utilización de esta característica para inducir en primer lugar la expresión de las cadenas L y H del brazo derecho y detener la expresión, y después inducir la expresión de las cadenas L y H del brazo izquierdo, puede incrementarse la proporción de IgG expresadas en la combinación de interés (documento PCT JP2004/008585).
También puede prepararse un anticuerpo biespecífico mediante el entrecruzamiento químico de Fabs. Puede producirse un F(ab')2 biespecífico, por ejemplo, mediante maleimidación de un Fab' preparado a partir de un anticuerpo con o-PDM (orto-fenilendimaleimida) y haciendo reaccionar el producto con un Fab' preparado a partir de otro anticuerpo, de manera que se entrecrucen los Fabs derivados de diferentes anticuerpos (Keler T. et al., Cancer Research 57:4008-4014, 1997). Además, también se conocer un método para conectar químicamente fragmentos de anticuerpo tales como un ácido Fab'-tionitrobenzoico (TNB) y Fab'-tiol (SH) (Brennan M. et al., Science 229:81
21-10-2011
83, 1985).
En lugar del entrecruzamiento, puede utilizarse una cremallera de leucinas derivada de Fos y Jun o similar. Aunque Fos y Jun también forman un homodímero, se utiliza su preferencia de formación del heterodímero. Para la preparación se expresan un Fab' con adición de una cremallera de leucinas Fos y un segundo Fab' con adición de una cremallera de leucinas Jun. Mediante la mezcla y reacción de Fab'-Fos monomérico y Fab' Jun, que han sido reducidos bajo condiciones suaves, puede formarse un F(ab')2 biespecífico (Kostelny S.A. et al., J. of Immunology 148:1547-53, 1992). Este método no se encuentra limitado a Fab' y también puede aplicarse a scFv, Fv, etc.
También puede prepararse un anticuerpo biespecífico en una forma de diacuerpo. Un diacuerpo biespecífico es un heterodímero que comprende dos fragmentos scFv entrecruzados. Es decir, puede prepararse un anticuerpo biespecífico mediante la construcción de un heterodímero utilizando VH(A)-VL(B) y VH(B)-VL(A), que se han formado mediante la conexión de VH y VL derivados de dos tipos de anticuerpo: A y B, con una molécula conectora relativamente corta, de aproximadamente 5 residuos aminoácidos (Holliger P. et al., Proc. of the National Academy of Sciences of the USA 90:6444-6448, 1993).
En este caso, puede estimularse la construcción de un diacuerpo biespecífico de interés llevando a cabo sustituciones apropiadas de aminoácidos (botón-en-ojal: Zhu Z. et al., Protein Science 6:781-788, 1997), de manera que se unan dos tipos de scFv con una molécula conectora flexible y relativamente larga, de aproximadamente 15 residuos aminoácidos (un diacuerpo monocatenario: Kipriyanov S.M. et al., J. of Molecular Biology 293:41-56, 1999).
El fragmento sc(Fv)2, que puede prepararse mediante la unión de dos tipos de scFv con una molécula conectora flexible y relativamente larga, de aproximadamente 15 residuos aminoácidos, también puede convertirse en un anticuerpo biespecífico (Mallender W.D. et al., J. of Biological Chemistry 269:199-206, 1994).
Un anticuerpo modificado puede ser, por ejemplo, un anticuerpo que se una a diversas moléculas, tales como polietilenglicol (PEG). En los anticuerpos modificados de la presente invención, no existe limitación respecto a las sustancias que pueden unirse. Dichos anticuerpos modificados pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos obtenidos. Estos métodos ya se encuentran establecidos en el presente campo.
Entre los anticuerpos de la presente invención se incluyen anticuerpos humanos, de ratón, de rata y similares, sin ninguna limitación respecto a su origen, y pueden ser anticuerpos genéticamente modificados, tales como un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado.
Los métodos para obtener anticuerpos humanos son conocidos, y puede obtenerse un anticuerpo humano de interés, por ejemplo, mediante la inmunización de un animal transgénico que presente todos los repertorios de genes de anticuerpo humano con un antígeno de interés (ver los documentos WO 93/12227, 92/03918, 94/02602, 94/25585, 96/34096 y 96/33735).
Pueden producirse anticuerpos genéticamente modificados mediante métodos conocidos. Específicamente, por ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende regiones variables de las cadenas H y L de un anticuerpo procedentes de animales inmunizados, y regiones constantes de las cadenas H y L de un anticuerpo humano. Puede obtenerse un anticuerpo quimérico mediante unión de un ADN codificante de la región variable de un anticuerpo derivado de animales inmunizados con un ADN codificante de la región constante de un anticuerpo humano, insertando el ADN resultante en un vector de expresión, e introduciendo el vector recombinante en un huésped para la producción.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado también denominado anticuerpo humano reformado. Un anticuerpo humanizado se construye mediante injerto de la región determinante de complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de animales inmunizados en la CDR de un anticuerpo humano. También son conocidas las tecnologías generales de ingeniería genética.
Concretamente, se sintetiza mediante PCR una secuencia de ADN diseñada para unir la CDR de un anticuerpo de ratón a la región marco (FR) de un anticuerpo humano, utilizando varios oligonucleótidos que han sido preparados para que contengan partes solapantes en sus regiones terminales. Tras unir el ADN obtenido a un ADN codificante de la región constante de un anticuerpo humano, el ADN resultante se incorpora en un vector de expresión y se introduce en un huésped para producir un anticuerpo humanizado (ver los documentos EP 239 400 y WO 96/02576). A modo de FR de anticuerpo humano para la unión mediante CDR, se selecciona uno que pueda formar un sitio de unión a antígeno con una buena región determinante de complementariedad. Pueden sustituirse aminoácidos de la región marco en una región variable de anticuerpo según resulte necesario, de manera que la región determinante de complementariedad de un anticuerpo humano reformado forme un sitio de unión a antígeno apropiado (Sato K. et al., Cancer Research 53:851-856, 1993). La región marco puede sustituirse con regiones marco derivadas de diversos anticuerpos humanos (ver el documento WO 99/51743).
La presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos que sustituyen funcionalmente los cofactores que reconocen tanto un enzima como su sustrato.
21-10-2011
Los cofactores de la presente invención no se encuentran particularmente limitados, con la condición de que puedan actuar sobre un enzima potenciando la reacción enzimática. Un cofactor de la presente invención es, por ejemplo, un cofactor de un enzima proteolítico. Son ejemplos específicos de un cofactor de un enzima proteolítico, los cofactores para la coagulación sanguínea y los factores asociados a la fibrinolisis (F.VIII/F.VIIIa, F.V/F.Va, PZ, TM, sistema
5 TM/PS), los cofactores de reacciones del complemento (C4b, MCP, CR1, factor H) y similares.
Las combinaciones siguientes pueden proporcionarse como ejemplos específicos de enzima y sustrato del enzima, así como cofactores enzimáticos.
10 (a) Cofactor de la coagulación sanguínea y factor asociado a la fibrinolisis (ejemplo 1).
Enzima: F.IXa
Sustrato: F.X
Cofactor: F.VIII/F.VIIIa
15 El cofactor F.VIIIa se une tanto a F.IXa como a F.X y potencia la activación del F.X por parte de F.IXa. Entre los anticuerpos biespecíficos que reconocen los mencionados anteriormente enzima F.IXa y sustrato F.X, algunos presentan un efecto potenciador de la activación de F.X. Algunos de estos anticuerpos se cree que presentan un efecto de sustitución de la función del cofactor F.VI-II/F.VIIIa.
(b) Cofactor de la coagulación sanguínea y factor asociado a la fibrinolisis (ejemplo 2).
Enzima : ZPI
Sustrato: F.X/F.Xa
25 Cofactor: PZ
El cofactor PZ se une a ZPI de la familia de la serpina y al factor X activado de coagulación sanguínea (F.Xa) potenciando la actividad inhibidora de F.Xa del ZPI. Concretamente, algunos anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto ZPI como F.X/F.Xa se cree que presentan un efecto de sustitución de la función de PC.
(c) Cofactor de la coagulación sanguínea y factor asociado a la fibrinolisis (ejemplo 3).
Enzima: trombina
Sustrato: TAFI
35 Cofactor: TM
El cofactor TM potencia la activación de TAFI por parte de la trombina. Concretamente, algunos anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto la trombina como TAFI se cree que presentan un efecto de sustitución de la función de TM.
(d) Cofactor de la coagulación sanguínea y factor asociado a la fibrinolisis (ejemplo 4).
Enzima: trombina
Sustrato: PC
45 Cofactores: TM/PS
El sistema TM/PS potencia la activación de PC por parte de la trombina. Concretamente, algunos anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto la trombina como PC se cree que sustituyen funcionalmente al sistema TM/PS.
50 (e) Cofactor de la coagulación sanguínea y factor asociado a la fibrinolisis (ejemplo 5)
Enzima: F.Xa
Sustrato: protrombina
Cofactor: F.V/F.Va
55 El cofactor F.Va se une tanto a F.Xa como a la protrombina, potenciando la activación de la protrombina por parte de F.Xa. Entre los anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto el enzima mencionado anteriormente F.Xa como su sustrato protrombina, algunos presentan efectos potenciadores de la activación de la protrombina. Algunos de estos anticuerpos se cree que presentan una función que sustituye a la función del cofactor F.V/F.Va.
(f) Cofactor de la reacción del complemento (ejemplo 1).
Enzima: C1s
Sustrato: C2
65 Cofactor: C4b
21-10-2011
C4b presenta el efecto estimulador de C1s sobre la descomposición de C2. Concretamente, algunos anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto los C1s como C2 se cree que sustituyen funcionalmente a C4b.
(g) Cofactores de la reacción del complemento (ejemplo 2).
Enzima: factor I regulador del complemento
Sustrato: C3b
Cofactores: factor H regulador del complemento
Proteína cofactor membranal (MCP), y
Receptor 1 del complemento (CR1)
Los factores reguladores del complemento H, MCP y CR1 presentan el efecto estimulador del factor regulador del complemento 1 sobre la degradación de C3b. Concretamente, entre los anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto el factor 1 regulador del complemento y C3b, se cree que algunos sustituyen funcionalmente a los factores reguladores del complemento H, MCP y CR1.
Entre los cofactores mencionados anteriormente, resulta particularmente preferido el F.VIII/F.VIIIa.
Aunque F.VIII/F.VIIIa experimenta una proteolisis limitada por parte de enzimas proteolíticos tales como la trombina, con la condición de que presente actividad de F.VI-II/F.VIIIa, no es importante la forma que presente. Además, las variantes de F.VIII/F.VIIIa y F.VIII/F.VIIIa que han sido modificadas artificialmente mediante técnicas de combinación génica también se incluyen en F.VIII/F.VIIIa, con la condición de que conserven actividad de cofactor F.VIII/F.VIIIa.
Los métodos para obtener anticuerpos biespecíficos que sustituyan funcionalmente a cofactores de la presente invención no se encuentran particularmente limitados y pueden obtenerse mediante cualquier método. Por ejemplo, al obtener un anticuerpo biespecífico que sustituya funcionalmente al enzima A y al sustrato B, son inmunizados en un animal tanto el enzima A como el sustrato B con el fin de obtener anticuerpo antienzima A y anticuerpo antisustrato B. A continuación, se produce un anticuerpo biespecífico que comprende las cadenas H y L del anticuerpo antienzima A y las cadenas H y L del anticuerpo antisustrato B. En la presente memoria resulta deseable obtener varios tipos de cada uno de los anticuerpos antienzima A y antisustrato B, de manera que estos anticuerpos puedan utilizarse preferentemente para producir el máximo número posible de combinaciones de anticuerpos biespecíficos. Tras producir los anticuerpos biespecíficos, se seleccionan los anticuerpos que presentan una actividad que sustituya a la función del cofactor.
Los anticuerpos contra un enzima o un sustrato pueden obtenerse mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos mediante la inmunización de animales con antígenos. Los antígenos para inmunizar animales son, por ejemplo, antígenos completos que presenten inmunogenicidad y antígenos incompletos (que incluyan los haptenos) sin inmunogenicidad. En la presente invención, se utiliza un enzima cuyo cofactor pueda sustituirse funcionalmente por un anticuerpo de la presente invención que actúa como cofactor, o un sustrato del enzima, a modo del antígeno (inmunógeno) mencionado anteriormente. Como animales que deben inmunizarse pueden utilizarse, por ejemplo, el ratón, la rata, el hámster, el cobaya, el conejo, el pollo, el mono rhesus y similares. La inmunización de estos animales con antígenos puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos por el experto en la materia. En la presente invención, las regiones variables de las cadenas L y H de anticuerpo se recogen preferentemente de animales inmunizados o de células de los mismos. Este procedimiento puede ser llevado a cabo por un experto en la materia utilizando métodos generalmente conocidos. Los animales inmunizados con antígenos expresan anticuerpos contra el antígeno, especialmente en las células del bazo. Por lo tanto, puede prepararse, por ejemplo, ARNm a partir de las células del bazo de un animal inmunizado, y recuperarse regiones variables de las cadenas L y H mediante RT-PCR utilizando cebadores de las regiones variables del animal.
Concretamente, se inmunizan animales con un enzima o un sustrato. El enzima y el sustrato utilizados como inmunógeno pueden ser proteínas completas o péptidos parciales de las mismas. Además, dependiendo de las circunstancias, puede utilizarse un antígeno candidato unido a otra molécula para formar un antígeno soluble, o fragmentos del mismo, como inmunógeno para la inmunización de animales
Se aíslan células del bazo de ratones inmunizados, y se fusionan con células de mieloma de ratón con el fin de producir hibridomas. Tras seleccionar los hibridomas que se unen a los antígenos respectivos, se recuperan las regiones variables de las cadenas H y L mediante RT-PCR, utilizando, por ejemplo, cebadores correspondientes a las regiones variables. También pueden utilizarse cebadores de la CDR, cebadores de regiones marco que se encuentran menos diversificadas que la CDR, o cebadores de secuencias de señal y CH1 o región constante de cadena L (CL).
Alternativamente, se extrae el ARNm de las células de bazo de animales inmunizados y los ADNc de las regiones variables de las cadenas L y H se recuperan mediante RT-PCR utilizando cebadores de la región próxima a las regiones variables. Además, también pueden inmunizase linfocitos in vitro y utilizarse para construir bibliotecas que presentan scFv o Fab. Las regiones variables pueden obtenerse concentrando y clonando un clon de anticuerpos
21-10-2011
ligantes de antígeno mediante adsorción (panning). En este caso, también puede llevarse a cabo el cribado utilizando bibliotecas similares construidas a partir de ARNm derivados de monocitos de sangre periférica, bazo, amígdala y similares, procedentes de seres humanos y animales no humanizados.
A continuación, se utilizan las regiones variables para preparar vectores de expresión de anticuerpos. Mediante la introducción de un vector de expresión de anticuerpo antienzima y un vector de expresión de anticuerpo antisustrato en una misma célula y la expresión de los anticuerpos puede obtenerse un anticuerpo biespecífico.
Pueden seleccionarse los anticuerpos que presentan una actividad de sustitución de la función del cofactor, por ejemplo mediante los métodos descritos a continuación.
- (1)
- En un sistema de reacción que comprende el enzima y el sustrato, se lleva a cabo la selección utilizando la elevación de la actividad enzimática (capacidad de degradación del sustrato) como índice, en el que la elevación de la actividad enzimática es un resultado de la adición de anticuerpos.
- (2)
- En un sistema para la medición o simulación de las funciones biológicas en las que se encuentran implicados el enzima, el sustrato y cofactor (por ejemplo un sistema para medir la coagulación plasmática), la selección se lleva a cabo utilizando la actividad de recuperación funcional como índice, en la que la actividad de recuperación funcional es un resultado de la adición del anticuerpo en ausencia del cofactor.
El anticuerpo así obtenido puede purificarse hasta la homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo pueden llevarse a cabo mediante métodos de separación y purificación utilizados para las proteínas generales. Por ejemplo, pueden separarse y purificarse anticuerpos mediante la selección y combinación apropiadas de columnas de cromatografía tal como la cromatografía de afinidad, la filtración, la ultrafiltración, la precipitación salina, la diálisis, la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, la electroforesis isoeléctrica y similares (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), aunque los métodos no se encuentran limitados a los mismos. Una columna utilizada en la cromatografía de afinidad es, por ejemplo, la columna de proteína A, la columna de proteína G y similares.
Por ejemplo, en el caso de que F.VIII/F.VIIIa sea el cofactor sustituto, es decir, en el caso de que la combinación de enzima y sustrato sean los factores de coagulación plasmática y asociado a fibrinolisis F.IXa y F.X, el anticuerpo biespecífico de la presente invención preferentemente presenta una estructura que comprende la región variable de un anticuerpo anti-F.IXa y la región variable de un anticuerpo anti-F.X.
Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención que sustituyen funcionalmente a F.VIII/F.VIIIa se generaron mediante el método siguiente. Se inmunizaron subcutáneamente ratones con F.IXa o F.X comercial. Se aislaron células de bazo a partir de bazos de los ratones inmunizados con un título elevado de anticuerpos, y se fusionaron con células de mieloma de ratón para formar hibridomas. Se seleccionaron los hibridomas que se unían al antígeno F.IXa o F.X, y se recuperaron las regiones variables de las cadenas L y H mediante RT-PCR utilizando cebadores de las regiones variables. Se incorporó la región variable de la cadena L en un vector de expresión de cadena L que contenía CL y se insertó la región variable de cadena H en un vector de expresión de cadena H que contenía una región constante de cadena H. Además, se extrajo el ARNm a partir de los bazos de estos ratones inmunizados y cada ADNc de las regiones variables de las cadenas L y H se recuperó mediante RT-PCR utilizando cebadores de la región variable respectiva. Utilizando estas regiones variables, se construyó una biblioteca fágica que presenta scFv. Se concentraron los clones de anticuerpo ligantes de antígeno y se clonaron mediante adsorción (panning) y se formaron los vectores de expresión de anticuerpos utilizando la región variable de los mismos. Se introdujeron el anticuerpo anti-F.IXa (cadena H, cadena L) y los vectores de expresión del anticuerpo anti-F.X (cadena H, cadena L) en las mismas células para la expresión de anticuerpos y se obtuvieron anticuerpos biespecíficos.
Los anticuerpos biespecíficos así obtenidos se evaluaron para sus efectos de sustitución funcional de F.VIII/F.VIIIa (cofactores para la activación de F.X por parte de F.IXa) en un sistema de ensayo que comprendía F.XIa (enzima activador de F.IX), F.IX, F.X, un sustrato sintético (S-2222) de F.Xa y fosfolípido. En principio, como anticuerpo biespecífico con actividad de sustitución funcional de F.VIII/F.VIIIa, se seleccionaron los anticuerpos biespecíficos que mostraban una actividad mimética de F.VIIIa de 0,1 o superior en este sistema de ensayo basándose en los resultados de ensayo. La actividad mimética de F.VIIIa a la que se hace referencia en la presente memoria es un valor obtenido durante 30 ó 60 minutos restando el valor de cambio de absorbancia de un solvente o sobrenadante de cultivo que no expresa el anticuerpo respecto al valor de cambio de absorbancia de una solución de anticuerpos
o de un sobrenadante de cultivo que expresa el anticuerpo.
Los anticuerpos biespecíficos seleccionados anteriormente o los anticuerpos biespecíficos estrechamente relacionados con los mismos se midieron para su capacidad de restituir la coagulación en un sistema de ensayo de tiempo de coagulación que utiliza plasma deficiente en F.VIII. En consecuencia, se obtuvieron los anticuerpos biespecíficos capaces de acortar el tiempo de coagulación en comparación con el caso de no adición. El tiempo de coagulación al que se hace referencia en la presente memoria es, tal como se muestra en el ejemplo 7, el tiempo activado parcial de tromboplastina medido utilizando plasma humano deficiente en F.VIII. Entre estos anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos biespecíficos preferidos presentan la capacidad de acortar el tiempo de coagulación
21-10-2011
10 segundos o más, más preferentemente 20 segundos o más, todavía más preferentemente 40 segundos o más, y con todavía más preferentemente, 50 segundos o más.
La CDR3 de cadena H de los anticuerpos de la presente invención no se encuentra particularmente limitada, pero específicamente presenta una región determinante de complementariedad que comprende una secuencia de aminoácidos, indicada en cualquiera de entre las secuencias de CDR3 de cadena H (SEC ID nº 16, 20, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92 y 96) de XB12, XT04, A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50 y A69, indicadas en los ejemplos descritos posteriormente o las equivalentes funcionalmente a las mismas, y la región determinante de complementariedad que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en cualquiera de entre las secuencias de CDR3 de cadena H (SEC ID nº 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200 y 204) en SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB15 y SB27, respectivamente, o las equivalentes funcionalmente a las mismas.
Además, un ejemplo específico de los anticuerpos mencionados anteriormente se combina preferentemente a partir de un anticuerpo que presenta una región determinante de complementariedad que comprende cualquiera de entre las secuencias de aminoácidos de la CDR de cadena H de XB12, XT04, A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50 y A69 (SEC ID nº 14-16, 18-20, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 78-80, 82-84, 86-88, 90-92 y 94-96) o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a la misma, y un anticuerpo que presenta una región determinante de complementariedad que comprende cualquiera de entre las secuencias de aminoácidos de la CDR de cadena H (SEC ID nº 22-24, 26-28, 30-32, 34-36, 38-40, 42-44, 46-48, 50-52, 54-56, 98-100, 102-104, 106-108, 110-112, 114-116, 118-120, 122-124, 126-128, 130-132, 134-136, 138-140, 142-144, 146-148, 150-152, 154-156, 158-160, 162-164, 166-168, 170-172, 174-176, 178-180, 182-184, 186-188, 190-192, 194-196, 198-200 y 202-204) en SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB15 y SB27) o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a las mismas.
Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena H de XB12, XT04, A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69, SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB15 y SB27 dados a conocer en la presente invención se muestran como las SEC ID nº 13, 17, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197 y 201.
Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena L de A44, B26, XB12 y SB04 dadas a conocer en la presente invención se muestran como SEC ID nº 205, 209, 213 y 217. Las secuencias de CDR de cadena L de A44, B26, XB12 y SB04 se muestran como las SEC ID nº 206-208, 210-212, 214-216 y 218-220. Las secuencias de nucleótidos de la CDR de cadena H de XB12, SB04, A44 y B26 se muestran como las SEC ID nº 221 (222), 223 (224), 225 (226), 233 (234), 235 (236), 237 (238), 245 (246), 247 (248), 249 (250), 257 (258), 259 (260) y 261 (262) (las secuencias entre paréntesis son secuencias de aminoácidos codificadas por los ácidos nucleicos respectivos) y sus secuencias de nucleótidos de la CDR de cadena L se muestran como SEC ID nº 227 (228), 229 (230), 231 z (240), 241 (242), 243 (244), 251 (252), 253 (254), 255 (256), 263 (264), 265 (266) y 267 (268).
Las SEC ID nº 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258 y 264 representan CDR1.
Las SEC ID nº 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, 143, 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260 y 266 representan CDR2.
Las SEC ID nº 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, 262 y 268 representan CDR3.
Los anticuerpos de la presente invención son preferentemente, aunque sin limitación particular, los anticuerpos biespecíficos combinados a partir de un anticuerpo anti-factor IXa y un anticuerpo anti-factor X, que presentan los mismos epítopos que los anticuerpos mencionados anteriormente o epítopos estrechamente relacionados con los mismos. Los anticuerpos que presentan un epítopo igual o estrechamente relacionado se refieren en la presente invención, por ejemplo, a los que compiten entre sí para la unión a antígenos en una ELISA competitiva, etc. Sin limitación a la misma, en este método de ELISA competitiva, se inmoviliza factor IX/IXa o factor X en una placa MicroWell de 96 pocillos, y se añaden simultáneamente un anticuerpo apropiadamente marcado y un anticuerpo que debe evaluarse, y se detecta el anticuerpo unido mediante la utilización del marcaje. Este marcaje no se encuentra particularmente limitado e incluye marcaje de fosfatasa alcalina, marcaje peroxidasa, enzima de unión a estreptavidina marcada con biotina (fosfatasa alcalina, peroxidasa y similares), FITC y similares. Existe un
21-10-2011
solapamiento de epítopos en el caso de que se observe una competición de por lo menos 50% al encontrarse presente el anticuerpo a una concentración en exceso de hasta 100.000 veces respecto al anticuerpo que debe evaluarse.
Al preparar un anticuerpo de longitud completa utilizando las regiones variables dadas a conocer en la presente invención, las regiones constantes del anticuerpo no se encuentran particularmente limitadas, y pueden utilizarse las conocidas por el experto en la materia, por ejemplo las indicadas en "Sequences of proteins of immunological interest", U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991 y en "An efficient route to human bispecific IgG", Nature Biotechnology 16:677-681, 1998, y similares.
En una forma de realización de los anticuerpos de la presente invención, los anticuerpos presentan el efecto de sustituir funcionalmente los cofactores, y de esta manera se espera que resulten fármacos efectivos para enfermedades causadas por la reducción de la actividad (función) de dichos cofactores. En los casos en los que el cofactor funcionalmente sustituido por un anticuerpo de la presente invención sea un factor de coagulación sanguínea y asociado a la fibrinolisis, las enfermedades mencionadas anteriormente son, por ejemplo, el sangrado, las enfermedades acompañadas de sangrado, las enfermedades causadas por el sangrado, y similares. En particular, es conocido que la reducción y deficiencia funcionales de F.VIII/F.VIIIa, F.IX/F.IXa y F.XI/F.XIa provocan hemorragias anormales conocidas como hemofilia.
De entre las hemofilias, la hemorragia anormal debida a una hipofunción congénita de F.VIII/F.VIIIa o una deficiencia de F.VIII/F.VIIIa se denomina hemofilia A. En el caso de que un paciente de hemofilia A sangre, se lleva a cabo una terapia de sustitución con una formulación de F.VIII. Además, puede llevarse a cabo la administración preventiva de una formulación de F.VIII (ver los documentos no de patente nº 1 y nº 2) los días en que se realicen ejercicios vigorosos o excursiones, cuando con frecuencia se produce sangrado intraarticular o en el caso de que el paciente se encuentre clasificado como de hemofilia severa. Debido a que esta administración preventiva de formulación de
F.VIII reduce notablemente los episodios de hemorragia de los pacientes con hemofilia A, recientemente ha gozado de amplia popularidad. La reducción de los episodios de sangrado no sólo reduce los riesgos de sangrado letal y no letal y los dolores que la acompañan, sino que también previene la artropatía hemofílica causada por las frecuentes hemorragias intraarticulares. En consecuencia, contribuye en gran medida a la mejora de la calidad de vida de los pacientes de hemofilia A.
La vida media de una formulación de F.VIII en el flujo sanguínea es de tan sólo aproximadamente 12 a 16 horas. Por lo tanto, para una prevención continua, resulta necesario administrar una formulación de F.VIII aproximadamente tres veces a la semana. Esto equivale a mantener una actividad de F.VIII de aproximadamente 1% o superior (ver documentos no de patente nº 3 y nº 4). Además, en las terapias de sustitución de los episodios de sangrado resulta necesario administrar periódicamente formulaciones de F.VIII de refuerzo durante un determinado periodo de tiempo, excepto en el caso de que el sangrado sea leve, con el fin de prevenir el nuevo sangrado y establecer una hemostasis completa.
Además, las formulaciones de F.VIII se administran por vía intravenosa. Existen dificultades técnicas durante la realización de la administración intravenosa y resulta todavía más difícil, en particular al realizar la administración en pacientes jóvenes de venas delgadas.
En la administración preventiva mencionada anteriormente de la formulación de F.VIII y en la administración de urgencia de la misma en el caso de un episodio de sangrado, en la mayoría de casos se utiliza el tratamiento en casa y la autoinyección. La necesidad de una administración frecuente y las dificultades técnicas que supone no sólo provocan dolor, sino que también se convierten en un motivo que dificulta la popularización del tratamiento en casa y de la autoinyección.
Por lo tanto, ha existido una demanda fuerte, en comparación con las formulaciones actuales de factor VIII de coagulación sanguínea, de fármacos que presenten intervalos de administración más prolongados y de fármacos que puedan administrarse fácilmente.
Además, en los pacientes de hemofilia A pueden generarse anticuerpos anti-FVIII denominados inhibidores, particularmente en los pacientes de hemofilia A severa. En el caso de que se genere un inhibidor, los efectos de la formulación de F.VIII resultan dificultados por el inhibidor. En consecuencia, resulta muy complicado el control de la hemostasis en estos pacientes.
En el caso de que sangre uno de estos pacientes de hemofilia A con inhibidor, habitualmente se lleva a cabo la terapia de neutralización utilizando una dosis masiva de formulación de F.VIII o la terapia de derivación utilizando un complejo concentrado o formulación de F.VIIa. Sin embargo, en la terapia de neutralización, la administración de una dosis masiva de formulación de F.VIII puede incrementar adversamente el título de inhibidor (el anticuerpo anti-F.VIII). Además, en la terapia de derivación, las vidas medias relativamente cortas (aproximadamente 2 a 8 horas) de los concentrados de complejo y de la formulación de F.VIIa resultan problemáticas. Adicionalmente, debido a que sus mecanismos de acción son independientes de la función de F.VIII/F.VIIIa, es decir, una función que cataliza la activación de F.X por parte de F.IXa, el mecanismo hemostático puede no funcionar bien y perder sensibilidad. Por
21-10-2011
lo tanto, en muchos casos de pacientes de hemofilia A con inhibidor, no se obtienen efectos hemostáticos suficientes en comparación con los pacientes de hemofilia A sin inhibidor.
Por lo tanto, ha existido una fuerte demanda de fármacos que no resulten afectados por la presencia de inhibidores y que puedan sustituir funcionalmente a F.VIII/F.VIIIa.
Además de la hemofilia y hemofilia adquirida causada por un autoanticuerpo anti-F.VIII, la enfermedad de von Willebrand, causada por la anormalidad o deficiencia funcional del vWF se conoce como trastorno de sangrado anormal asociado a F.VIII/F.VIIIa. El vWF resulta necesario no sólo para la adhesión normal de las plaquetas a los tejidos subendoteliales en los sitios de daño a la pared vascular, sino también para la formación de complejos con
F.VIII para mantener un nivel plasmático normal de F.VIII. En los pacientes con enfermedad de von Willebrand, estas funciones caen y se produce la anormalidad funcional de la hemostasis.
En los aspectos mencionados anteriormente, pueden considerarse los métodos que utilizan anticuerpos para la creación de fármacos que: (i) presenten intervalos de administración prolongados, (ii) se administren con facilidad, e
(iii) no resulten afectados por la presencia de inhibidores, y (iv) puedan sustituir funcionalmente a F.VIII/F.VIIIa de modo independiente de F.VIII/F.VIIIa. Generalmente, las vidas medidas de los anticuerpos en el flujo sanguíneo son relativamente largos, de varios días a varias semanas. Además, es conocida la migración de los anticuerpos al flujo sanguíneo tras la administración subcutánea. Es decir, los fármacos anticuerpos en general cumplen los requisitos mencionados anteriormente de (i) e (ii).
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la presente invención como principio activo. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo de la presente invención sea uno de los anticuerpos que reconocen tanto F.IX/F.IXa como F.X, y puedan sustituir funcionalmente a F.VIIIa, se espera que el anticuerpo se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco para prevenir o tratar el sangrado, los trastornos acompañados de sangrado, o los trastornos causados por el sangrado. Además, en el caso de que un anticuerpo de la presente invención sea uno de los anticuerpos que reconocen tanto F.X/F.Xa como la protrombina y pueda sustituir funcionalmente a F.Va, se espera que el anticuerpo se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco que prevenga o trate el sangrado, los trastornos acompañados de sangrado o los trastornos causados por el sangrado.
Simultáneamente, se espera que un anticuerpo que se una a ZPI y F.X y sustituya funcionalmente a PZ se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco con acción antitrombótica, que un anticuerpo que se una a la trombina y a TAFI y sustituya funcionalmente a TM se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco con un efecto estimulante de la hemostasis, y que un anticuerpo que se una a la trombina y a PC y sustituya funcionalmente al sistema PS/TM se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco con un efecto modulador de la coagulación.
Además, debido a que la deficiencia del complemento C4 provoca el lupus eritematoso sistémico (SLE), se espera que un anticuerpo que sustituya funcionalmente a C4b se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco con un efecto que suprima la incidencia de SLE. Debido a que la deficiencia del factor H causa infección supurativa y glomerulonefritis autoinmunológica, un anticuerpo que sustituya funcionalmente al factor H se espera que se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco con un efecto de supresión de la aparición de estas enfermedades.
Para la formulación de los farmacéuticos, las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la presente invención utilizado para el tratamiento o prevención a modo de principio activo pueden mezclarse con un portador farmacéuticamente aceptable apropiado, un medio y similares que sean inertes frente al mismo, en caos necesario. Por ejemplo, pueden mencionarse el agua estéril o la solución salina fisiológica, estabilizador, excipiente, antioxidante (ácido ascórbico, etc.), tampón (ácido fosfórico, ácido cítrico, otros ácidos orgánicos, etc.), antiséptico, surfactante (PEG, Tween, etc.), agente quelante (EDTA, etc.), agente ligante y similares. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener otros polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas tales como albúmina sérica, gelatina e inmunoglobulinas, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina y lisina, azúcares tales como polisacáridos y monosacáridos y carbohidratos, y alcoholes de azúcares, tales como manitol y sorbitol. Durante la preparación de soluciones acuosas para inyección, por ejemplo, entre los agentes solubilizadores se incluyen solución salina fisiológica, soluciones isotónicas que contiene glucosa y otros agentes adyuvantes tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sódico, y pueden utilizarse en combinación con agentes solubilizadores apropiados tales como alcohol (etanol, etc.), polialcohol (propilenglicol, PEG, etc.) y surfactante no iónico (polisorbato 80, HCO-50, etc.).
Además, en caso necesario, pueden encapsularse anticuerpos de la presente invención en microcápsulas (microcápsulas de hidroximetilcelulosa, gelatina, poli(metacrilato de metilo), etc.) o incluirse en un sistema de administración coloidal de fármaco (liposomas, microesferas de albúmina, microemulsión, nanopartículas y nanocápsulas, etc.) (ver "Remington's Pharmaceutical Science", 16ª edición, Oslo, editor, 1980, etc.). También son conocidos métodos para formular fármacos de liberación sostenida, y pueden aplicarse a anticuerpos de la presente invención (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:267-277, 1981; Langer, Chemtech. 12:98-105, 1982; patente US
21-10-2011
nº 3.773.919; solicitud de patente europea (EP) 58 481; Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983; documento EP 133 988).
Los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse en combinación con el factor VIII de coagulación sanguínea. Los anticuerpos o las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse con factor VIII de coagulación sanguínea o simultáneamente o cierto intervalo entre ellos. La administración puede llevarse a cabo en un kit que combine un anticuerpo o composición farmacéutica de la presente invención con factor VIII de coagulación sanguínea. En el caso de que se utilice un anticuerpo o composición farmacéutica de la presente invención en combinación con factor VIII de coagulación sanguínea, si se desea también resulta posible utilizar dosis más bajas que en el caso de que se utilicen separadamente.
Aunque la dosis de las composiciones farmacéuticas de la presente invención se determina apropiadamente considerando el tipo de formulación, método de administración, edad y peso corporal de los pacientes, síntomas de los pacientes, tipo y avance de la enfermedad, etc., y finalmente según el criterio del médico, generalmente las dosis de entre 0,1 y 2.000 mg/día pueden dividirse en una a varias administraciones en el caso de un adulto. La dosis preferentemente es de entre 1 y 1.000 mg/día, más preferentemente de entre 5 y 500 mg/día, y todavía más preferentemente de entre 100 y 300 mg/día. Aunque la dosis varía según el peso corporal y edad de los pacientes, métodos de administración y similares, el experto en la materia podrá seleccionar convenientemente una dosis apropiada. Preferentemente, el periodo de dosificación también se determina apropiadamente según, por ejemplo, el proceso de cicatrización del paciente.
Además, también resulta posible llevar a cabo terapia génica mediante inserción de un gen codificante de un anticuerpo de la presente invención en vectores de terapia génica. Como método de administración aparte de la administración directa de plásmidos desnudos, los genes pueden administrarse mediante empaquetamiento en liposomas y similares, o mediante la inserción en diversos vectores víricos, tales como vectores retrovíricos, vectores adenovíricos, vectores de virus Vaccinia, vectores de poxvirus, vectores de virus adenoasociados y vectores HVJ (ver Adolph, "Virus Genome Method", CRC Press, Florida, 1996), o mediante recubrimiento sobre perlas portadoras tales como partículas coloidales de oro (documento WO 93/17706, etc.). Sin embargo, el gen puede administrarse mediante cualquier método, con la condición de que el anticuerpo pueda expresarse in vivo para ejercer su acción. Preferentemente, se administra una dosis suficiente mediante una vía parenteral apropiada, tal como intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intracutánea, tejido intraadiposo, intramamaria y la inyección intramuscular e infusión, inhalación, método de bombardeo con partículas inducible con gas (con una pistola de electrones y similares) o vía mucosal utilizando gotas nasales. Los genes codificantes de un anticuerpo de la presente invención pueden administrarse mediante la introducción del gen en las células sanguíneas, en células derivadas de la médula ósea y similares, utilizando la transfección ex vivo de liposomas, el método de bombardeo de partículas (patente US nº 4.945.050) o la infección vírica, y la reintroducción de estas células en animales. En la terapia génica, puede utilizarse cualquier gen codificante de un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo genes que comprenden secuencias de nucleótidos de las CDR de los mencionados anteriormente XB12, SB04, A44 y B26.
La presente invención también proporciona métodos para prevenir y/o tratar el sangrado, los trastornos acompañados de sangrado o los trastornos causados por el sangrado, que comprende las etapas que consisten en administrar un anticuerpo o composición de la presente invención. Los anticuerpos o composiciones pueden administrarse, por ejemplo, mediante los métodos mencionados anteriormente.
La presente invención también se refiere a la utilización de los anticuerpos de la presente invención para preparar composiciones (farmacéuticas) de la presente invención.
Además, la presente invención proporciona kits que comprenden por lo menos un anticuerpo o composición de la presente invención que debe utilizarse en los métodos mencionados anteriormente. Las jeringas de vidrio, agujas de inyección, medio farmacéuticamente aceptable, alcohol, algodón, vendajes, manual de instrucciones que describe la utilización, o similares, también pueden empaquetarse opcionalmente en los kits.
Todos los documentos de la técnica anterior en la presente memoria se incorporan como referencia en la presente memoria.
A continuación en la presente memoria se describe en mayor detalle la presente invención haciendo referencia a los ejemplos no limitativos de la misma.
Se inmunizaron ocho ratones BALB/c (macho, de 6 semanas de edad al iniciar la inmunización (Charles River, Japón)) y cinco ratones MRL/lpr (macho, de 6 semanas edad al iniciar la inmunización (Charles River, Japón)) con factor IXaβ humano (Enzyme Research Laboratories, Inc.) tal como se describe a continuación. A modo de inmunización inicial se administró por vía subcutánea factor IXaβ (40 µg/cabeza) emulsionado con FCA (adyuvante
21-10-2011
completo de Freund H37 Ra (Difco Laboratories)). Dos semanas después, se administró por vía subcutánea factor IXaβ (40 µg/cabeza) emulsionado con FIA (adyuvante incompleto de Freund (Difco Laboratories)). A continuación, se llevaron a cabo tres a siete inmunizaciones de refuerzo a intervalos de una semana. Tras confirmar que el título de un anticuerpo plasmático contra el factor IXaβ se encontraba elevado mediante ELISA (ensayo de inmunosorción ligada a enzima), descrita en 1-2, se administró por vía intravenosa como inmunización final factor IXaβ (40 µg/cabeza) diluido en PBS(-) (solución salina tamponada con fosfato libre de iones calcio y magnesio). Tres días después de la inmunización final, se extirparon los bazos de los ratones. Aunque una parte de los mismos se utilizó en el ejemplo 10.2, las células de bazo restantes se fusionaron con células de mieloma de ratón P3X63Ag8U.1 (denominadas P3U1, ATCC nº CRL-1597) mediante un método estándar utilizando PEG1500 (Roche Diagnostics). Se sembraron células fusionadas suspendidas en medio RPMI1640 (Invitrogen) que contenían FBS al 10% (Invitrogen) (en adelante denominado FBS al 10%/RPMI1640) en una placa de cultivo de 96 pocillos y 1, 2, 3 y 5 días después de la fusión se sustituyó el medio por un medio de selección HAT (FBS al 10%/RPMI1640/concentrado 50x de HAT al 2% (Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd)/BM-Condimed H1 al 5% (Roche Diagnostics) para cultivar selectivamente los hibridomas. Utilizando los sobrenadantes recogidos los días 8 ó 9 después de la fusión, se midió la actividad de unión a factor IXa mediante la ELISA descrita en 1-2 para seleccionar los hibridomas que presentaban actividad de unión a factor IXa. A continuación, se midió la actividad enzimática de factor IXa neutralizador mediante el método descrito en 1-3, con el fin de seleccionar los hibridomas que no presentaban actividad neutralizadora del factor IXa. Se clonaron dos veces los hibridomas llevando a cabo diluciones limitantes en las que se sembraba una célula en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos. Se sometieron las células de colonias individuales confirmadas mediante observación microscópica a ELISA y se llevó a cabo un ensayo de actividad de neutralización tal como se describe en 1-2 y 1-3 para la selección de clones. El ascites que contenía el anticuerpo clonado se preparó mediante el método descrito en 1-4, y se purificó el anticuerpo a partir del ascites. El anticuerpo purificado no pudo ampliar el APTT (tiempo de tromboplastina parcial activado) y esto se confirmó mediante el método descrito en 1-5.
Se diluyó factor IXaβ hasta 1 µg/ml con un tampón de recubrimiento (bicarbonato sódico 100 mM, pH 9,6, azida sódica al 0,02%) y se distribuyó en una placa Nunc-Immuno (placas Nunc-ImmunoTM 96 MicroWellTM MaxiSorpTM (Nalge Nunc International)) a razón de 100 µl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a 4ºC durante la noche. Tras lavar la placa con PBS(-) que contenía Tween® 20 tres veces, se bloqueó con un tampón diluyente (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, albúmina de suero bovino al 1%, MgCl2 1 mM, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, azida sódica al 0,02%) a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras eliminar el tampón, se añadió un antisuero de ratón diluido con tampón diluyente o sobrenadante de cultivo de hibridoma hasta 100 µl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar la placa tres veces, se añadió IgG de cabra anti-ratón (H+L) marcado con fosfatasa alcalina (Zymed Laboratories) hasta 1/2.000 con el tampón diluyente hasta 100 µl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar la placa seis veces, se añadió un sustrato colorimétrico de fosfato Blue-PhosTM (Kirkegaad & Perry Laboratories) hasta 100 µl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Tras añadir la solución de parada Blue-PhosTM (Kirkegaad & Perry Laboratories) (100 µl/pocillo), se leyó la absorbancia a 595 nm con un lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories).
Se disolvió fosfolípido (Sigma-Aldrich) en agua destilada para inyección, y se ultrasonicó para preparar una solución de fosfolípido (400 µg/ml). Se mezclaron solución salina tamponada con Tris que contenía albúmina de suero bovino al 0,1% (en adelante abreviada como TBSB) (40 µl), 30 ng/ml de factor IXaβ (Enzyme Research Laboratories) (10 µl), 400 µg/ml de solución de fosfolípido (5 µl), TBSB que contenía CaCl2 100 mM y MgCl2 20 mM (5 µl) y sobrenadante de cultivo de hibridoma (10 µl) en una placa de 96 pocillos, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A esta solución mezclada se le añadieron 50 µg/ml de factor X (Enzyme Research Laboratories) (20 µl) y 3 U/ml de factor VIIIa (American Diagnostica) (10 µl) y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de EDTA 0,5 M (10 µl). Tras la adición de una solución de S2222 (50 µl, Chromogenix) y la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, se midió la absorbancia a una longitud de onda de medición de 405 nm y a una longitud de onda de referencia de 655 nm en un lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories, Inc.).
Se produjo ascites de los hibridomas establecidos, según procedimientos estándares. Es decir, se cultivó el hibridoma in vitro (2x106) y se trasplantó a la cavidad peritoneal de un ratón BALB/c (macho, de 5 a 7 semanas de edad al iniciar el experimento, Japan Charles River) o de un ratón BALB/c desnudo (hembra, de 5 a 6 semanas de edad al iniciar el experimento, Japan Charles River y Japan CLEA), que había sido administrado intraperitonealmente dos veces con pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano, WAKO Pure Chemical Industries) previamente. Una a cuatro semanas después del trasplante se recogió el ascites del ratón con un abdomen hinchado.
Se purificó el anticuerpo a partir del ascites utilizando una columna de proteína G SepharoseTM 4 Fast Flow
21-10-2011
(Amersham Biosciences). Se diluyó el ascites 2 veces con un tampón de unión (acetato sódico 20 mM, pH 5,0) y se aplicó a la columna, que se había lavado con 10 volúmenes de columna del tampón de unión. Se eluyó el anticuerpo con 5 volúmenes de columna de un tampón de elución (glicina-HCl 0,1 M, pH 2,5) y se neutralizó con un tampón neutralizador (Tris-HCl 1 M, pH 9,0). La solución resultante se concentró utilizando CentriprepTM 10 (Millipore) y se sustituyó el solvente con TBS (solución salina tamponada con Tris 50 mM). Se calculó la concentración de anticuerpo a partir de la absorbancia a 280 nm con A (al 1%, 1 cm)=13,5. Se midió la absorbancia con un DU-650 (Beckman Coulter).
Se midió el APTT con un analizador KC10A (Amelung) conectado a CR-A (Amelung). Se calentó una mezcla de la solución de anticuerpo diluida con TBSB (50 µl), plasma humano estándar (Dade Behring) (50 µl) y reactivo de APTT (Dade Behring) (50 µl) a 37ºC durante 3 minutos. A esta mezcla se añadió CaCl2 20 mM (Dade Behring) (50 µl) para iniciar una reacción de coagulación y se midió el tiempo de coagulación.
[Ejemplo 2]. Preparación de anticuerpo no neutralizador de factor X (F.X)
Se inmunizaron ocho ratones BALB/c (macho, 6 semanas de edad al iniciar la inmunización, Japan Charles River) y cinco ratones MRL/lpr (macho, 6 semanas de edad al iniciar la inmunización, Japan Charles River) con factor X humano (Enzyme Research Laboratories) tal como se describe posteriormente. A modo de inmunización inicial, se administró por vía subcutánea factor X (40 µg/cabeza) emulsionado con FCA. Dos semanas después, se administró por vía subcutánea factor X (20 ó 40 µg/cabeza) emulsionado con FIA. Posteriormente, se administraron tres a seis inmunizaciones de refuerzo a intervalos de una semana. Tras confirmar mediante ELISA tal como se describe en 2.2 que el título de un anticuerpo plasmático contra el factor X se encontraba elevado, se administró por vía intravenosa factor X (20 ó 40 µg/cabeza) diluido en PBS(-) a modo de inmunización final. Tres días después de la inmunización final, se extirparon los bazos de ratón. Aunque se utilizó una parte de los mismos en el ejemplo 10-2, las células de bazo restantes se fusionaron con células P3U1 de mieloma de ratón siguiendo un método estándar utilizando PEG1500. Las células fusionadas suspendidas en FBS al 10%/RPMI1640 se sembraron en una placa de cultivo de 96 pocillos y se cultivaron selectivamente los hibridomas mediante sustitución del medio por un medio de selección HAT transcurridos 1, 2, 3 y 5 días de la fusión. Se midió la actividad de unión al factor X mediante la ELISA descrita en 2-2, utilizando el sobrenadante de cultivo recogido el octavo día después de la fusión. Se seleccionaron los hibridomas que presentaban actividad de unión al factor X y se midieron sus actividades de neutralización de la actividad enzimática de factor Xa mediante el método descrito en 2.3. Los hibridomas que no presentaban una actividad de neutralización del factor Xa se clonaron llevando a cabo una dilución limitante dos veces. El ascites que contenía el anticuerpo clonado se preparó mediante el método descrito en 1.4, y se purificó el anticuerpo a partir del ascites. El anticuerpo purificado no podía ampliar el APTT y esto se confirmó mediante el método descrito en 1.5.
Se diluyó factor X hasta 1 µg/ml con un tampón de recubrimiento y se dispersó en una placa inmunológica Nunc a razón de 100 µl/pocillo. A continuación, la placa se incubó a 4ºC durante la noche. Tras lavar la placa con PBS (-) que contenía Tween® 20 tres veces, se bloqueó con un tampón diluyente a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras eliminar el tampón, se añadió a la placa un antisuero de ratón diluido con tampón diluyente o sobrenadante de cultivo de hibridoma, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar la placa tres veces, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H+L) marcado con fosfatasa alcalina que había sido diluido 1/2.000 con tampón diluyente, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar la placa seis veces, se añadió un sustrato colorimétrico de fosfato Blue-PhosTM (Kirkegaad & Perry Laboratories) a razón de 100 µl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Tras añadir la solución de parada Blue-PhosTM (Kirkegaad & Perry Laboratories) (100 µl/pocillo), se midió la absorbancia a 595 nm con un lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories).
Se mezcló el sobrenadante de cultivo de hibridoma diluido a 1/5 con TBSB (10 µl) con 40 µl de TBCP (TBSB que contenía CaCl2 2,78 mM y fosfolípidos 22,2 µM (fosfatidilcolina:fosfatidilserina=75:25, Sigma-Aldrich) que contenía 250 pg/ml de factor Xa (Enzyme Research Laboratories) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. A esta solución mezclada se le añadieron TBCP (50 µl) que contenía protrombina (Enzyme Research Laboratories) (20 µg/ml) y 100 ng/ml de factor V activado de coagulación (factor Va (Haematologic Technologies)), y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se detuvo la reacción mediante adición de EDTA 0,5 M (10 µl). A esta solución de reacción se añadió solución S-2238 1 mM (Chromogenix) (50 µl) y tras la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, se midió la absorbancia a 405 nm con un lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories).
21-10-2011
[Ejemplo 3]. Construcción de vector de expresión de anticuerpo biespecífico quimérico.
A partir de los hibridomas que producían anticuerpo anti-F.IXa o anticuerpo anti-F.X, se extrajo el ARN total utilizando el minikit QIAGEN® RNeasy® (QIAGEN) según el método descrito en el manual de instrucciones. Se disolvió el ARN total en agua estéril (40 µl). Se sintetizó el ADNc monocatenario mediante RT-PCR utilizando el sistema de síntesis de ADNc SuperScript (Invitrogen) con el ARN purificado (1 a 2 µg) como molde, según el método descrito en el manual de instrucciones.
Como cebadores para amplificar el ADNc de la región variable de cadena H (VH) de anticuerpo de ratón, se preparó una mezcla de cebador HB y una mezcla de cebador HF tal como se describe en Krebber et al. (J. Immunol. Methods 201:35-55, 1997). Utilizando 0,5 µl de cada una de las mezclas: mezcla de cebador HB 100 µM y mezcla de cebador HF 100 µM, se preparó una solución de reacción (25 µl) (solución de ADNc preparada en 3.1 (2,5 µl)), tampón KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM y 0,75 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO). Utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer), se llevó a cabo una PCR según la eficiencia de amplificación de los fragmentos de ADNc, bajo las condiciones A (3 minutos de calentamiento a 98ºC seguido de 32 ciclos de reacción (98ºC, 20 s; 58ºC, 20 s, y 72ºC, 30 s cada ciclo) o bajo las condiciones B (3 minutos de calentamiento a 94ºC seguido de 5 ciclos de reacción (94ºC, 20 s; 46ºC, 20 s, y 68ºC, 30 s cada ciclo) y 30 ciclos de reacción (94ºC, 20 s; 58ºC, 20 s, y 72ºC, 30 s cada ciclo). Tras la PCR, se sometió la solución de reacción a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño deseado (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando un kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) siguiendo los métodos descritos en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 µl). Las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN se determinaron utilizando un kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator (Applied Biosystems) en un secuenciador de ADN ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), siguiendo el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Los grupos de secuencia determinados mediante este método se analizaron comparativamente utilizando el programa de análisis GENETYX-SV/RC versión
6.1 (Genetyx) y se seleccionaron los ADN que presentaban secuencias diferentes.
Se llevó a cabo el procedimiento siguiente para añadir los sitios de corte del enzima de restricción SfiI para la clonación a ambos extremos de los fragmentos de amplificación de región variable de anticuerpo.
Para amplificar los fragmentos de VH añadidos con un sitio de corte de SfiI (SfiI-VH), se preparó un cebador (cebador VH-extremo 5') en el que la secuencia conectora de cebador HB (Gly4Ser)2 se sustituyó por una secuencia que contenía el sitio de corte de SfiI (SEC ID nº 5). Utilizando 0,5 µl de cebador específico de secuencia VH-extremo 5' 10 µM y de cebador scfor 10 µM (J. Immunol. Methods 201:35-55, 1997), se preparó una solución de reacción (20 µl) (solución purificada de fragmento de amplificación de ADNc de VH preparada en 3.2 (1 µl), tampón KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM, 0,5 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO)). Utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer), se llevó a cabo una PCR según la eficiencia de amplificación de los fragmentos de ADNc, bajo las condiciones A (3 minutos de calentamiento a 98ºC seguido de 32 ciclos de reacción (98ºC, 20 s; 58ºC, 20 s, y 72C, 30 s cada ciclo) o bajo las condiciones B (3 minutos de calentamiento a 94ºC seguido de 5 ciclos de reacción (94ºC, 20 s; 46ºC, 20 s, y 68ºC, 30 s cada ciclo) y 30 ciclos de reacción (94ºC, 20 s; 58ºC, 20 s, y 72ºC, 30 s cada ciclo)). Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño deseado (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando un kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) siguiendo el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 µl).
Para amplificar los fragmentos de ADNc de la región variable de cadena L (VL) de anticuerpo de ratón, en primer lugar se utilizaron 0,5 µl de cada uno de la mezcla de cebador LB 100 µM y la mezcla de cebador LF 100 µM indicados en Krebber et al. (J. Immunol. Methods 201:35-55, 1997), y se preparó una solución de reacción (25 µl) (solución de ADNc preparada en 3.1 (2,5 µl), tampón KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM y 0,75 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO)). Utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer), se llevó a cabo una PCR según la eficiencia de amplificación de los fragmentos, bajo las condiciones de 3 minutos de calentamiento a 94ºC seguido de 5 ciclos de reacción (94ºC, 20 s; 46ºC, 20 s, y 68ºC, 30 s cada ciclo) y 30 ciclos de reacción (94ºC, 20 s; 58ºC, 20 s, y 72ºC, 30 s cada ciclo). Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño deseado (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 µl). Los fragmentos se encontraban en un estado en el que la secuencia conectora (Gly4Ser)3 derivada del cebador LF se ha añadido a sus extremos C-terminales. Con el fin de añadir un sitio de corte de SfiI a los extremos C-terminales de los fragmentos, se preparó un cebador (cebador VL-extremo 3') en el que se había sustituido la secuencia conectora (Gly4Ser)3 del cebador LF por una secuencia que presentaba el sitio de corte de SfiI (SEC ID nº 6). Para amplificar los fragmentos
21-10-2011
de VL con adición de un sitio de corte de SfiI (SfiI-VL), se utilizaron 0,5 µl de la mezcla de cebador VL-extremo 3' 10 µM y cebador scback 10 µM, y se preparó una mezcla de reacción (20 µl) (solución purificada de fragmento de amplificación de ADNc de VL (1 µl), tampón KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM y 0,5 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO)). Se llevó a cabo la PCR utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer) bajo las condiciones de 3 minutos de calentamiento a 94ºC seguido de 5 ciclos de reacción (94ºC, 20 s; 46ºC, 20 s, y 68ºC, 30 s cada ciclo) y 30 ciclos de reacción (94ºC, 20 s; 58ºC, 20 s, y 72ºC, 30 s cada ciclo). Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño deseado (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel de QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 µl).
Los fragmentos SfiI-VH y SfiI-VL purificados se digirieron con SfiI (Takara Bio) a 50ºC durante la noche en una solución de reacción preparada siguiendo el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. A continuación, se purificó la solución de reacción utilizando un kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con tampón EB (30 µl) incluido en el kit.
Al producir el anticuerpo IgG biespecífico de interés, se hizo referencia a la técnica de botón en ojal de IgG1 (Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-621, 1996) durante la preparación de IgG4 utilizando una porción CH3 con sustitución de aminoácidos para formar heteromoléculas para cada cadena H. Se sustituyó el tipo a (IgG4γa) con Y349C y T366W, y el tipo b (IgG4γb) se sustituyó con E356C, T366S, L368A e Y407V. Además, también se introdujo una sustitución (-ppcpScp-->-ppcpPcp-) en las regiones bisagra de ambos tipos. Prácticamente la totalidad de las cadenas H se convirtieron en heteromoléculas mediante está técnica; sin embargo, esto no es necesariamente aplicable a las cadenas L, y la formación de moléculas de anticuerpo innecesarias podría afectar a mediciones posteriores de la actividad. Por lo tanto, para expresar separadamente los brazos de cada molécula de anticuerpo (denominada molécula HL), que presentan diferentes especificidades, y formar eficientemente el tipo de anticuerpo IgG biespecífico de interés dentro de las células, se utilizaron como vectores de expresión para cada molécula HL las inducibles por diferentes fármacos.
Como vector de expresión para un brazo de la molécula de anticuerpo (denominada molécula brazo derecho de HL por conveniencia), se preparó pcDNA4-g4H o pcDNA4-g4L (figura 1 ó figura 2), en el que la región de la cadena H o L respectiva, es decir, una región variable de anticuerpo de ratón apropiada (VH o VL) y una región constante de IgG4γa humana (SEC ID nº 7) o región constante κ (SEC ID nº 8) se incorporó en el vector pcDNA4 de tipo inducible por tetraciclina (Invitrogen) cadena abajo de la secuencia de señal (IL3ss) para células animales (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1075, 1984). En primer lugar se utilizaron EcoRV y NotI (Takara Bio) para digerir pcDNA4 en los sitios de corte de enzima de restricción presentes en su sitio de clonación múltiple. La unidad de expresión de brazo derecho de cadena H o L (de aproximadamente 1,6 kb o de aproximadamente 1,0 kb, respectivamente) de un anticuerpo biespecífico quimérico que presentaba las regiones variables de anticuerpo apropiadas se digirió con XhoI (Takara Bio). A continuación, se purificó con el kit de purificación por PCR QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se hizo reaccionar con ADN polimerasa KOD (TOYOBO) a 72ºC durante 10 minutos en una composición de solución de reacción descrita en el manual de instrucciones adjunto para crear extremos romos. Los fragmentos de extremo romo se purificaron con el kit de purificación por PCR QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se digirieron con NotI (Takara Bio). Los fragmentos de extremo romo/NotI (de aproximadamente 1,6 ó 1,0 kb, respectivamente) y el pcDNA4 digerido con EcoRV/NotI se sometieron a una reacción de ligación utilizando Ligation High (TOYOBO), según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se transformó una cepa E. coli DH5α (DH5α altamente competente (TOYOBO)) con la solución de reacción mencionada anteriormente. A partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos de esta manera, se aislaron los plásmidos de ADN respectivos utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN).
Como vector de expresión para el otro brazo de la molécula de anticuerpo (denominada molécula de brazo izquierdo de HL por conveniencia) se preparó pIND-g4H o pIND-g4L (figura 2 ó 3) según el método mencionado anteriormente, en el que la región respectiva de la cadena H o L, es decir, una región variable de anticuerpo (VH o VL) de ratón apropiada y una región constante de IgG4γb humana (SEC ID nº 9) o una región constante κ (SEC ID nº 8) se incorporaron en el vector pIND de tipo inducible por análogo de ecdisona (Invitrogen) cadena abajo de la secuencia de señal (IL3ss) para células animales (EMBO. J. 6:2939, 1987) y se aislaron los plásmidos de ADN respectivos.
El plásmido de expresión de tipo inducible por tetraciclina preparado en 3.4 (pcDNA4-g4H o pcDNA4-g4L) se digirió con SfiI y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos (de aproximadamente 5 kb) que no presentaban la parte de región variable intrínseca del anticuerpo (VH o VL (ver la figura 1 ó 2)) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 µl). Los fragmentos, y el fragmento Sfi-I-VH o Sfi-VL correspondiente
21-10-2011
derivado del anticuerpo anti-F.IXa digerido con SfiI preparado en 3.3, se sometieron a una reacción de ligación utilizando el kit Quick Ligation (New England Biolabs) según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se transformó una cepa E. coli DH5α (DH5α altamente competente (TOYOBO)) con la solución de reacción mencionada anteriormente. Además, los fragmentos obtenidos mediante eliminación de la parte de región variable del anticuerpo mediante una técnica similar a la indicada anteriormente (VH o VL (ver la figura 2 ó 3) del plásmido de expresión de tipo inducible por análogo de ecdisona digerido con SfiI (pIND-g4H o pIND-4GL) preparado en 3.4 y el fragmento SfiI-VH o SfiI-VL derivado del anticuerpo anti-F.X digerido con SfiI se incorporaron mediante un método similar.
En cada uno de los transformantes resistentes a ampicilina así obtenidos, se confirmó la inserción del fragmento de interés mediante el método de PCR de colonias utilizando cebadores que circundaban al fragmento insertado. En primer lugar, para el vector de expresión de cadena H o L quimérica del anticuerpo anti-F.IXa, se sintetizaron un cebador CMVF 21-mero (SEC ID nº 10) que se hibridaba con el sitio de cebador directo de CMV situado cadena arriba del sitio de inserción, y un cebador de BGHR 18-mero (SEC ID nº 11) que se hibridaba con el sitio de cebador inverso de BGH situado cadena abajo del sitio de inserción (Sigma Genosys). Para el vector de expresión de cadena H o L quimérica del anticuerpo anti-F.X se sintetizaron un cebador EcdF 24-mero (SEC ID nº 12) que se hibridaba cadena arriba del sitio de inserción y un cebador de BGHR 18-mero (SEC ID nº 11) que se hibridaba con el sitio de cebador inverso de BGH situado cadena abajo del sitio de inserción (Sigma Genosys). Para la PCR de colonias, se preparó una solución de reacción (20 µl) (0,2 µl de cebador (10 µM)), tampón KOD dash (TOYOBO), dNTP 0,2 mM y 0,75 unidades de ADN polimerasa KOD dash) (TOYOBO)). A esta solución de reacción se le añadieron células de la cepa transformante en cantidades apropiadas y se llevó a cabo la PCR. La PCR se llevó a cabo utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer) bajo las condiciones de calentamiento de 1 minuto a 96ºC seguido de 30 ciclos de reacción (96ºC, 10 s; 55ºC, 10 s, y 72ºC, 30 s en cada ciclo). Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1% y se seleccionaron los clones a partir de los que se obtendrían los fragmentos de amplificación del tamaño deseado. El producto de PCR se trató con ExoSAP-IT (Amersham Biosciences) para inactivar el exceso de cebadores y los dNTP, según el manual de instrucciones adjunto. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN utilizando un kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator (Applied Biosystems) en un secuenciador de ADN ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Los grupos de secuencias determinados mediante el presente método se analizaron utilizando el programa de análisis GENETYX-SV/RC versión 6.1 (Genetyx). Para VH, se seleccionaron los clones de interés que no presentaban ninguna inserción, deleción o mutación. Para VL, a partir del pseudogén VL derivado de P3U1 utilizado en hibridomas se seleccionaron los clones de interés que no presentaban ninguna inserción, deleción o mutación.
A partir de los clones de interés, los plásmidos de ADN respectivos se aislaron mediante la utilización de un kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) y después se disolvieron en agua estéril (100 µl). El vector de expresión de cadena H quimérica del anticuerpo anti-F.IXa, el vector de expresión de cadena L quimérica del anticuerpo F.IXa, el vector de expresión de cadena H del anticuerpo anti-F.X y el vector de expresión de cadena L quimérica del anticuerpo anti-F.X se denominaron pcDNA4-g4lXaHn, pcDNA4-g4lXaLn, pIND-g4XHn y pIND-g4XLn, respectivamente. Se almacenó cada solución de plásmidos a 4ºC hasta la utilización.
[Ejemplo 4]. Expresión de anticuerpos biespecíficos quiméricos en células animales
La expresión de los vectores de expresión del brazo derecho de la molécula HL del anticuerpo (pcDNA4-g4lXaHn y pcDNA4-g4lXaLn) se indujo con tetraciclina. En ausencia de tetraciclina, el plásmido codificante de represor Tet denominado pcDNA6/TR (Invitrogen) resultaba necesario para suprimir por completo sus expresiones. Además, la expresión de los vectores de expresión del brazo izquierdo de la molécula HL de anticuerpo (pIND-g4XHn y pINDg4XLn) se indujo con un análogo de la hormona de insecto ecdisona (ponasterona A). Esto requiere el plásmido pVgRXR (Invitrogen) que codifica el receptor de ecdisona y el receptor del retinoide X que reaccionan con la ponasterona A e inducen la expresión. Por lo tanto, para la transfección de células animales, se preparó una mezcla de seis tipos de plásmido de ADN en total. Para 1 ml de cultivo celular, se utilizaron pcDNA4-g4lXaHn, pcDNA4g4IXaLn, pIND-g4XHn y pIND-g4XLn (218,8 ng cada uno), así como pcDNA6/TR y pVgRXR (1.312,5 ng cada uno).
Se suspendió la cepa HEK293H derivada de células de carcinoma renal fetal humano (Invitrogen) en un medio de cultivo DMEM (Invitrogen) que contenía FCS al 10% (MOREGATE), 1 ml del cual se sembró a una densidad celular de 5x105 células/ml en cada pocillo de una placa de 12 pocillos para células adhesivas (CORNING) y se cultivó en un incubador de CO2 (37ºC, 5% de CO2). La mezcla de plásmido de ADN preparada en 4.1 se añadió a una mezcla de reactivos de transfección, lipofectamina 2000 (Invitrogen) (7 µl) y medio Opti-MEM I (Invitrogen) (250 µl) y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla resultante se añadió a las células en cada pocillo y se incubó durante 4 a 5 horas en un incubador de CO2 (37ºC, 5% de CO2).
21-10-2011
Se eliminó el medio de cultivo mediante succión del cultivo celular transfectado indicado anteriormente, y después se añadió 1 ml del medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) que contenía 1 µg/ml de tetraciclina (Wako Pure Chemical Industries). La mezcla resultante se incubó durante un día en un incubador de CO2 (37ºC, 5% de CO2) para inducir la expresión primaria del brazo derecho de la molécula HL de anticuerpo. Posteriormente, tras eliminar el medio mediante succión, lavar con 1 ml de medio CHO-S-SFM-II y añadir 1 ml de un medio CHO-S-SFM-II que contenía ponasterona A 5 µM (Invitrogen), la mezcla se incubó en un incubador de CO2 (37ºC, 5% de CO2) durante 2 a 3 días y se indujo la expresión secundaria del brazo izquierdo de la molécula HL de anticuerpo de manera que el anticuerpo IgG biespecífico se secretase al medio. Se recuperó el sobrenadante de cultivo y se centrifugó (aproximadamente 2.000 g, 5 minutos, temperatura ambiente) para separar las células y se concentró utilizando un Microcon® YM-50 (Millipore), en caso necesario. Se almacenó la muestra a 4ºC hasta la utilización.
Se ajustó la concentración de anticuerpo de cabra purificado por afinidad contra Fc de la IgG humana (Cappel) a 1 µg/ml con un tampón de recubrimiento y se inmovilizó en una placa inmunológica Nunc. Tras bloquear con un tampón diluyente (D.B.), se añadió una muestra del sobrenadante de cultivo convenientemente diluida con D.B. Además, como estándar para el cálculo de la concentración del anticuerpo, se añadió de manera similar IgG4 humana (anticuerpo anti-TF humanizado, ver el documento WO 99/51743) diluida con D.B. en una serie de dilución de dos veces hasta 11 estadios partiendo de 1.000 ng/ml. Tras tres lavados, se hizo reaccionar anti-IgG humana de cabra-fosfatasa alcalina (Biosource International). Tras cinco lavados, se reveló el color de la placa utilizando el sustrato de fosfatasa Sigma 104® (Sigma-Aldrich) como sustrato y se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de absorbancia modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories) con una longitud de onda de referencia de 655 nm. Utilizando el programa Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), se calculó la concentración de IgG humana en el sobrenadante de cultivo a partir de la curva estándar.
Se evaluó la actividad mimética de F.VIIIa de un anticuerpo biespecífico mediante el ensayo enzimático siguiente. Todas las reacciones siguientes se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se incubó una mezcla de 40 µl de factor IX (3,75 µg/ml, Enzyme Research Laboratories) y 10 µl de la solución de anticuerpos en una placa de 96 pocillos durante 1 hora. A continuación, se añadieron 10 µl de factor XIa (10 ng/ml, Enzyme Research Laboratories), 20 µl de factor X (50 µg/ml, Enzyme Research Laboratories), 5 µl de fosfolípido (400 µg/ml, ver los ejemplos 1 a 3) y 15 µl de TBSB que contenía CaCl2 5 mM y MgCl2 1 mM (en adelante abreviado como TBSB-S) para iniciar la reacción enzimática. Tras 30 minutos, se detuvo la reacción mediante la adición de 10 µl de EDTA 0,5 M.
Tras añadir una solución de sustrato colorimétrico (50 µl) a cada pocillo, se midió la absorbancia a 405 nm (longitud de onda de referencia: 655 nm) a los 0 y 30 minutos utilizando un lector de microplacas de modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories). Se presentó la actividad mimética de F.VIIIa como valor obtenido tras restar el valor del cambio de absorbancia en 30 minutos sin adición de anticuerpo de la adición de anticuerpo (ver las figuras 4 y 5).
Se utilizó TBSB como solvente para los fosfolípidos, mientras que se utilizó TBSB-S como solvente para los factores XIa, IX y X. La solución de sustrato colorimétrico era una mezcla 1:1 de sustrato colorimétrico S-2222 "Tesutochimu" (Chromogenix) disuelto según el manual de instrucciones adjunto y una solución de polibreno (0,6 mg/l de bromuro de hexadimetrina (Sigma)).
Además, se midió la dependencia de la concentración de la actividad mimética de F.VIIIa presentada por XB12/SB04, que era la más alta de todas (figura 6).
Con el fin de elucidar si un anticuerpo biespecífico corregía la capacidad de coagulación de la sangre de hemofilia A, se examinaron los efectos del anticuerpo biespecífico sobre el tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) utilizando plasma deficiente en F.VIII. Se calentó a 37ºC durante 3 minutos una solución mixta que comprendía una solución de anticuerpo a diversas concentraciones (50 µl), plasma deficiente en F.VIII (50 µl, Biomerieux) y reactivo de APTT (50 µl, Dade Behring). Se inició la reacción de coagulación mediante la adición de CaCl2 20 mM (50 µl, Dade Behring) a la mezcla mencionada anteriormente. Se midió el tiempo requerido para la coagulación con un analizador KC10A (Amelung) conectado a CR-A (Amelung) (figuras 7 y 8).
Además, se midió la dependencia de la concentración de XB12/SB04, que mostraba la actividad de acortamiento del tiempo de coagulación más elevada (figura 9).
El sobrenadante de cultivo (10 ml) obtenido mediante el método descrito en el ejemplo 4 se concentró a 1 ml utilizando un Centricon® YM-50 (Millipore). A este concentrado se le añadieron BSA al 10% (10 µl), Tween 20 al 1%
21-10-2011
(10 µl) y rProteína A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) (100 µl), y la solución se mezcló mediante agitación vertical a 4ºC durante la noche. La solución se transfirió a una cubeta de filtro de 0,22 µm Ultrafree®-MC (Millipore) y tras el lavado con TBS que contenía Tween® 20 al 0,01% (500 µl) tres veces, se suspendió la resina rProtein A SepharoseTM en 100 µl de HCl 10 mM/Tween® 20 al 0,01% (pH 2,0) y se dejó reposar durante 3 minutos. A continuación, se eluyó el anticuerpo y se neutralizó inmediatamente el eluido con la adición de 5 µl de Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Utilizando el programa Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), se calculó la concentración de IgG humana a partir de la curva estándar. Se cuantificó la concentración de anticuerpo según el ejemplo 5.
Se construyó un E. coli recombinante que expresaba proteína de fusión de péptido F.X. activado (AP) con glutatiónS-transferasa (GST). El ADNc que cubría la región de traducción de longitud completa del F.X humano se amplificó mediante PCR a partir del ADNc hepático humano Marathon-Ready (Clontech). A continuación, se utilizó este ADNc como molde para amplificar la región codificante de la región de AP mediante PCR (Leytus et al., Biochemistry 25:5098, 1986), que se subclonó en un vector pGEM-T (Promega) para obtener pGEX-F10AP codificante de GST-AP. Se cultivó E. coli transformado con este plásmido y a DO=0,8, se añadió IPTG 1 mM para inducir la expresión de GST-AP. Tras centrifugar la solución de cultivo (3.000xg, 30 minutos, 4ºC), se recolectaron las células y se almacenaron a -20ºC hasta la utilización.
Tras resuspender el sedimento celular en 1/20 de volumen de cultivo de PBS, se añadieron 2,4 ml de tampón para muestras SDS-PAGE (IWAKI) por cada 0,1 ml de suspensión, y la mezcla resultante se sometió a ebullición a 95ºC durante 5 minutos. Se añadió esta solución de reacción (10 µl) a cada pocillo de un mini gel de SDS-PAGE al 14% (Asahi Technoglass) y se sometió a electroforesis. El gel después de la electroforesis se transfirió a una membrana de transferencia Immobilon-PTM (MILLIPORE) utilizando un blotter semiseco (BIO-RAD) y se bloqueó con BT-PBS (PBS que contenía BSA al 2% y Tween® 20 al 0,05%). Tras completar el bloqueo, se hizo reaccionar durante 1 hora con anticuerpo SB04 o SB06 anti-F.X de ratón purificado en el ejemplo 1.4 y se diluyó con BT-PBS hasta 2 µg/ml. Tras lavar con PBS que contenía Tween® 20 al 0,05%, la membrana se hizo reaccionar durante 1 hora con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H+L) marcado con fosfatasa alcalina (Zymed Laboratories) diluido 2.000 veces con BT-PBS. Tras lavar con PBS que contenía Tween® 20 al 0,05%, se reveló el color de la membrana con un sustrato colorimétrico, sustrato de fosfatasa BCIP/NBT (Kirkegaad & Perry Laboratories) (ver la figura 10).
Se inmunizaron tres ratones BALB/c (macho, 6 semanas de edad al iniciar la inmunización (Japan Charles River)), 3 ratones MRL/lpr (macho, 6 semanas de edad al iniciar la inmunización (Japan Charles River)) y 3 ratones C57BL/6N (macho, 6 semanas de edad al iniciar la inmunización (Japan Charles River)) con factor antígeno IXαβ (Enzyme Research Laboratories, Inc.) o factor X (Enzyme Research Laboratories, Inc.) tal como se describe posteriormente. A modo de inmunización inicial, se administró por vía subcutánea el antígeno (40 µg/cabeza) emulsionado con FCA (adyuvante completo de Freund H37 Ra, Difco Laboratories). Dos semanas después, se administró por vía subcutánea el antígeno (40 µg/cabeza) emulsionado con FIA (adyuvante incompleto de Freund, Difco Laboratories). Posteriormente, se administraron tres inmunizaciones de refuerzo a intervalos de una semana, y 8 días después de la inmunización final, se extirparon los bazos de los ratones.
Se añadió al reactivo Trizol (Invitrogen) (50 mg de bazo/ml de reactivo) una parte de los bazos extirpados de los ratones inmunizados preparados en los ejemplos 1.1 y 2.1, y se homogenizaron utilizando un homogenizador de vidrio. A continuación, se extrajo el ARN total según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. A partir de la solución de extracto, se extrajo ARN poliA(+) utilizando un kit PolyATract System 1000 (Promega) según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se sintetizó ADNc mediante RT-PCR (sistema de síntesis de primera cadena Superscript III para RT-PCR, Invitrogen) y se almacenó a -20ºC hasta la utilización.
Como cebadores para la amplificación de los ADNc de las regiones variables de cadena pesada (VH) y de cadena ligera (VL) de anticuerpo de ratón, se prepararon mezcla de cebador HB, mezcla de cebador HF, mezcla de cebador LB y mezcla de cebador LF utilizadas en los ejemplos 3.2 y 3.3. Para la amplificación de VH, se preparó una solución de reacción de 50 µl (2,5 µl de solución de ADNc, tampón KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1,5 mM y 3,75 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO)) utilizando 1 µl de mezcla de cebador HB 100 µM y de mezcla de cebador HF 100 µM. Además, para la amplificación de VL, se prepararon 50 µl de solución de reacción de la misma composición indicada anteriormente utilizando 1 µl de mezcla de cebador LB 100 µM y 1 µl de mezcla de cebador LF 100 µM. Se llevó a cabo una PCR utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer) mediante un calentamiento de tres minutos a 98ºC seguido de 32 ciclos de reacción (98ºC, 20 s; 58ºC, 20 s, y 72ºC, 30 s cada ciclo). Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2%. Los fragmentos amplificados del tamaño de interés (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando el kit de
21-10-2011
extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (50 µl). A continuación, para la amplificación de fragmentos scFv, se prepararon diez tubos con 100 µl de solución de reacción (3 µl de solución de fragmento VH, 3 µl de solución de fragmento de VL, tampón KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl2 1 mM y 5 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO)). Tras la 1ª PCR (calentamiento de 3 minutos a 94ºC seguido de 7 ciclos de reacción (94ºC, 1 minuto y 63ºC, 4 minutos en cada ciclo), se añadieron cebador scfor 10 µM y cebador scback 10 µM (2,5 µl de cada uno) a cada tubo, manteniéndolos a 63ºC, y después se llevó a cabo la 2ª PCR (un calentamiento de 35 segundos a 94ºC seguido de 30 ciclos de reacción (94ºC, 2 minutos y 63ºC, 2 minutos en cada ciclo). Tras la pCR, se purificó la solución de reacción utilizando el kit de purificación mediante PCR QIAquick (QIAGEN) y los productos purificados se digirieron con enzima de restricción SfiI (Takara Bio) a 50ºC durante la noche. Tras someter los digeridos a electroforesis en gel de agarosa al 2%, se purificaron los fragmentos amplificados del tamaño de interés (aproximadamente 800 pb) utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con una cantidad apropiada de agua estéril. Para la presentación de scFv sobre la proteína fágica del gen III, se utilizó pELBGlacI (ver la figura 11) como vector fagémido. Tras digerir el vector (10 µg) con el enzima de restricción SfiI (Takara Bio) a 50ºC durante la noche, los fragmentos cortados del tamaño de interés (aproximadamente 5 kb) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con una cantidad apropiada de agua estéril. El producto de PCR purificado y el fragmento de vector purificado se sometieron a una reacción de ligación a 16ºC durante la noche utilizando Ligation High (TOYOBO) según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se transformaron células E. coli XL1 Blue electrocompetentes (Stratagene) o DH12 electromax (Invitrogen) utilizando la solución de reacción mediante un método de electroporación según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se recogieron todos los transformantes resistentes a ampicilina así obtenidos y se almacenaron como la biblioteca recombinante a -20ºC hasta la utilización.
Se inoculó la biblioteca de E. coli (2x109 cfu) en 50 ml de 2x YTAG (2x TY que contenía 100 µg/ml de ampicilina y glucosa al 2%) y se cultivó a 37ºC hasta que la DO 600 alcanzó entre 0,4 y 0,5. Se añadieron 4x1011 fagos ayudantes VCSM13 (Stratagene) al cultivo, que se dejó reposar a 37ºC durante 15 minutos para la infección celular. Las células infectadas se cultivaron a 30ºC durante 10 minutos, tras la adición de 450 ml de 2x YTAK (2x TY que contenía 100 µg/ml de ampicilina y 25 µg/ml de canamicina) y 25 µl de IPTG 1 mol/l. Se recogió el sobrenadante de cultivo mediante centrifugación, se mezcló con 100 ml de solución de PEG-NaCl (polietilenglicol 8000 al 10%, NaCl 2,5 moles/l) y se dejó reposar a 4ºC durante 60 minutos. Se precipitaron los fagos mediante centrifugación a 10.800xg durante 30 minutos y se suspendió el precipitado en 40 ml de agua, se mezcló con 8 ml de solución de PEG-NaCl y se dejó reposar a 4ºC durante 1 hora. Los fagos se precipitaron mediante centrifugación a 10.800xg durante 30 minutos y se suspendieron en 5 ml de PBS para obtener la biblioteca fágica. Se almacenaron los fagos a 4ºC hasta la utilización.
Se marcó factor IXaβ o factor X con biotina utilizando microtubos de NHS-PeO4-biotina premedido sin pesaje (Pierce). Se añadió factor IXaβ o factor X (100 pmoles) marcados con biotina a la solución de biblioteca fágica preparada en 10.2 (600 µl) y se puso en contacto con el antígeno durante 60 minutos. Se añadieron perlas Dynabeads M-280 recubiertas de estreptavidina (600 µl, DYNAL) con M-PBS al 5% (PBS que contenía leche desnatada al 5% p/v) para la unión durante 15 minutos. Los fagos unidos a las perlas se lavaron varias veces con PBST (PBS que contenía Tween-20 al 0,1%, 1 ml) y después con PBS. Las perlas se suspendieron en 0,8 ml de glicina/HCl 0,1 moles/l (pH 2,2) durante 5 minutos para eluir los fagos.
Alternativamente, la biblioteca fágica (80 µl/pocillo x 5), que había sido incubada con leche desnatada al 2,5% p/v durante 15 minutos, se añadió a factor IXaβ o a factor X (10 µg/pocillo x 5) inmovilizado sobre una placa inmunológica (MaxiSorp, Nunc) y se puso en contacto con el antígeno durante 60 minutos. Los fagos unidos a antígenos se lavaron varias veces con PBST (PBS que contenía Tween-20 al 0,1%, 1 ml) y después con PBS. Los fagos unidos se incubaron con 0,8 ml de glicina/HCl 0,1 ml/l (pH 2,2) durante 5 minutos para eluir los fagos.
La solución de fagos recolectada de esta manera se neutralizó mediante la adición de Tris 2 moles/l (45 µl), se añadió a 10 ml de células XL1-Blue en etapa de crecimiento logarítmico (DO600=0,4 a 0,5) y se dejó reposar durante 30 minutos a 37ºC para la infección celular. Se extendió la mezcla sobre una placa 2x YTAG y se cultivó a 30ºC. Se recolectaron las colonias, se inocularon en 2x YTAG y se cultivaron a 37ºC hasta una DO600=0,4 a 0,5. Se añadieron IPTG (1 mol/l, 5 µl) y fago ayudante VCSM13 (1011 pfu) a la solución de cultivo (10 ml) y se dejó reposar la mezcla a 37ºC durante 30 minutos. Se recogieron las células mediante centrifugación, se resuspendieron en 2x YTAK (100 ml) y se cultivaron a 30ºC durante 10 horas. Se recuperó el sobrenadante de cultivo mediante centrifugación, se mezcló con PEG-5 al 10%-solución de NaCl 5 moles/l (20 ml) y se dejó reposar a 4ºC durante 20 minutos. Se precipitaron los fagos mediante centrifugación a 10.800xg durante 30 minutos y se suspendieron en PBS (2 ml) y se proporcionaron para el adsorción (panning) posterior.
La colonia individual mencionada anteriormente se inoculó en 2x YTA (100 µl) y se cultivó a 30ºC durante la noche.
21-10-2011
Tras inocular 5 µl de este cultivo en 2x YTAG (500 µl) y el cultivo a 37ºC durante 5 horas, se añadió fago ayudante (2x108 pfu) y después se dejó reposar el cultivo a 37ºC durante 30 minutos. Además, tras el cultivo durante 30 minutos bajo agitación a 37ºC, se añadió 2x YTAK que contenía IPTG 0,5 mM (120 µl). Tras un cultivo durante la noche a 30ºC, el sobrenadante centrifugado se sometió a ELISA. Para la ELISA de los clones obtenidos mediante adsorción (panning) de los antígenos marcados con biotina, se utilizó una placa de microtitulación de 96 pocillos Strepta (Roche) recubierta con 1,0 µg/ml de antígeno marcado con biotina. Además, para el ELISA de los clones obtenidos mediante adsorción (panning) de los antígenos nativos, se utilizó una placa inmunológica (MaxiSorp, Nunc) inmovilizada con 1,0 µg/ml de antígeno nativo. Tras lavar con PBST para eliminar el antígeno, la reacción se bloqueó con 200 µl de M-PBS al 2% o BSA-PBS al 2% (PBS que contenía BSA al 2% p/v) como tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras eliminar el tampón, se añadió el sobrenadante de cultivo a la placa, y se dejó reposar durante 60 minutos para la unión de fagos. Tras el lavado, se detectó el fago unido con un anticuerpo anti-M13 unido a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) y sustrato TMB (Zymed). Se detuvo la reacción mediante la adición de H2SO4 1 mol/l y se midió el valor de A450 con un lector de placas.
Utilizando el medio de cultivo 2x YTAG del clon de E. coli recombinante positivo en el ELISA, se determinó la secuencia de nucleótidos de la región de scFv mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores PBG3-F1 (5'-CAGCTATGAAATACCTATTGCC-3'/SEC ID nº 1) y PBG3-R1 (5'-CTTTTCATAATCAAAATCACCGG-3'/SEC ID nº 2). Se sometió una solución para PCR de 15 µl que comprendía 1 µl de medio de cultivo, 1,5 µl de 10x tampón KOD Dash, 0,2 µl de cada uno de los cebadores 10 µmoles/l y 0,3 µl de polimerasa KOD Dash (TOYOBO, 2,5 U/µl) a 30 ciclos de amplificación (96ºC, 10 s; 55ºC, 10 s, y 72ºC, 30 s) utilizando el ciclador térmico GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer). Tras la PCR, se añadieron 3 µl de ExoSAP-IT (Amersham) a 5 µl de la solución de reacción, y la mezcla se mantuvo caliente a 37ºC durante 15 minutos y posteriormente a 80ºC durante 15 minutos. De esta manera, la reacción se llevó a cabo utilizando el kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator (Applied Biosystems) con PBG3-F2 (5'-ATTGCCTACGGCAGCCGCT-3'/SEC ID nº 3) o PBG3-R2 (5'-AAATCACCGGAACCAGAGCC-3'/SEC ID nº 4) como cebador, y los productos se sometieron a electroforesis con un secuenciador de ADN Applied Biosystems PRISM 3700. Se seleccionaron así los clones que presentaban diferentes secuencias de aminoácidos de CDR3 predichas a partir de las secuencias de nucleótidos, 52 clones como anti-factor IXa y 33 clones como antifactor X.
Para expresar el anticuerpo scFv en forma de anticuerpo de tipo IgG, se clonaron regiones variables de anticuerpo (VH, VL) en vectores de expresión de tipo inducible, por medios similares a los mostrados en los ejemplos 3.3, 3.4 y
3.5. Se incorporaron individualmente regiones variables de anticuerpo anti-F.IXa (VH y VL) en un vector de tipo inducible por tetraciclina (pcDNA4-g4H y pcDNA4-g4L, respectivamente). Se incorporaron individualmente regiones variables de anticuerpo anti-F.X (VH y VL) en un vector de tipo inducible por análogo de ecdisona (pIND-g4H y pcDNA4-g4L, respectivamente). De los clones de interés, se aislaron los plásmidos de ADN respectivos utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) y se disolvieron en agua estéril (100 µl).
Utilizando la solución de ADN preparada por medios similares a los mostrados en el ejemplo 4.1, se expresó ADN en células animales por medios similares a los mostrados en los ejemplos 4.2 y 4.3, y se recogió el sobrenadante de cultivo. Se almacenaron las muestras a 4ºC hasta la utilización.
A 10 ml del sobrenadante de cultivo obtenido mediante el método descrito en el ejemplo 10.7, se añadieron 100 µl de rProteína A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences) y se le mezclaron mediante agitación vertical a 4ºC durante la noche. Se transfirió la solución a una cubeta de filtro de 0,22 µm Ultrafree®-MC (Millipore) y tras tres lavados con 500 µl de TBS que contenía Tween® 20 al 0,01%, se suspendió resina rProteína A SepharoseTM en 100 µl de HCl 10 mM/Tween® 20 al 0,01% (pH 2,0) y se dejó reposar durante 3 minutos. A continuación, se eluyó el anticuerpo y el eluido se neutralizó inmediatamente mediante la adición de 5 µl de Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Utilizando el programa Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), se calculó la concentración de IgG humana en el sobrenadante de cultivo a partir de la curva estándar de IgG4 humana (anticuerpo anti-TF humanizado, ver el documento WO 99/51743). Se cuantificó la concentración de anticuerpos según el ejemplo 5.
Se evaluó la actividad mimética de F.VIIIa de un anticuerpo biespecífico mediante el ensayo enzimático siguiente. Se llevaron a cabo todas las reacciones indicadas a continuación a temperatura ambiente. Una solución mixta de 10 µl de factor IX (15 µg/ml, Enzyme Research Laboratories), 5 µl de TBSB que contenía CaCl2 100 mM y MgCl2 20 mM, y 50 µl del sobrenadante de cultivo obtenido mediante el método descrito en el ejemplo 10.7 se incubó en una placa de 96 pocillos durante 1 hora. A continuación, se añadieron 10 µl de factor XIa (10 ng/ml, Enzyme Research
21-10-2011
Laboratories), 20 µl de factor X (50 µg/ml, Enzyme Research Laboratories) y 5 µl de fosfolípidos (400 µg/ml) para iniciar la reacción enzimática. Tras 30 minutos, se detuvo la reacción mediante la adición de 10 µl de EDTA 0,5 M.
Tras añadir 50 µl de una solución de sustrato colorimétrico a cada pocillo, se midió la absorbancia a 405 nm (longitud de onda de referencia: 655 nm) a los 0 y 60 minutos con un lector de microplacas modelo 3550 (BioRad Laboratories). Se expresó la actividad mimética de F.VIIIa como un valor obtenido mediante la resta del valor de cambio de la absorbancia en el sobrenadante de cultivo que no expresaba ningún anticuerpo del valor obtenido del sobrenadante de cultivo que expresaba el anticuerpo (ver la figura 12).
Se utilizó TBSB como solvente para el fosfolípido, el factor XIa, el factor IX y el factor X. La solución de sustrato colorimétrico era una mezcla 1:1 de sustrato colorimétrico S-2222 "Tesutochimu" (Chromogenix) disuelto según el manual de instrucciones adjunto y solución de polibreno (bromuro de hexadimetrina 0,6 mg/l, Sigma).
Para elucidar si un anticuerpo biespecífico preparado según el método del ejemplo 11 recuperaba la capacidad de coagulación de la sangre de hemofilia A, se evaluaron los efectos del anticuerpo sobre el tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) utilizando plasma deficiente en F.VIIIa mediante un método similar al mostrado en el ejemplo 7 (ver la figura 13). Además, A44/B26 y A69/B26, que resultan muy efectivos en el acortamiento del tiempo de coagulación, se midieron para su dependencia de la concentración (ver las figuras 14 y 15).
Se evaluó la utilización concomitante de un anticuerpo biespecífico y F.VIII bajo las condiciones de ensayo de coagulación plasmática siguientes. Se incubó una mezcla de 40 µl de solución de anticuerpo (25 µg/ml) y 50 µl de plasma deficiente de F.VIII (Biomerieux) a temperatura ambiente durante 30 minutos. A esta mezcla, se le añadieron 10 µl de la formulación Kogenate® FS (BAYER) de factor VIII recombinante de coagulación sanguínea y 50 µl de reactivo de APTT (Dade Behring), y se calentó a 37ºC durante 3 minutos. Se inició la reacción de coagulación mediante la adición de 50 µl de CaCl2 20 mM (Dade Behring). Se midió el tiempo requerido para la coagulación utilizando un analizador KC10A (Amelung) conectado a CR-A (Amelung) (ver la figura 16).
Se evaluaron los efectos de un anticuerpo IgG biespecífico en el plasma inhibidor bajo las condiciones de ensayo de coagulación plasmática siguientes. Se incubó una mezcla de 50 µl de plasma deficiente en F.VIII (Biomerieux) y 10 µl de anticuerpo neutralizador anti-F.VIII humano (100 µg/ml, número de catálogo MAB3440, CHEMICON) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se utilizó este plasma como plasma inhibidor. A este plasma inhibidor se le añadieron 40 µl de la solución de anticuerpo (25 µg/ml) y 50 µl de reactivo de APTT (Dade Behring) y se calentó a 37ºC durante 3 minutos. Se inició la reacción de coagulación mediante la adición de 50 µl de CaCl2 20 mM (Dade Behring) a la mezcla. Se midió el tiempo requerido para la coagulación utilizando un analizador KC10A (Amelung) conectado a CR-A (Amelung) (ver la figura 17).
De entre los anticuerpos biespecíficos obtenidos en los ejemplos 1 a 7, XB12 (anticuerpo de ratón anti-factor IXa)/SB04 (anticuerpo de ratón anti-factor X), que fue el más efectivo en el acortamiento del tiempo de coagulación sanguínea, se sometió a humanización del modo siguiente.
Se construyó la base de datos basándose en datos de secuencias de aminoácidos de anticuerpos humanos obtenidos de la base de datos Kabat (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/ y de la base de datos IMGT (http://imgt.cines.fr/) disponibles públicamente, y la búsqueda de homologías se llevó a cabo separadamente para la región variable de cadena H de XB12 de ratón, de la región variable de cadena L de XB12 de ratón, de la región variable de cadena H de SB04 de ratón y de la región variable de cadena L de SB04 de ratón. Los resultados confirmaron que presentaban homologías elevadas respecto a las secuencias de anticuerpo humano mostradas posteriormente, y de esta manera se decidió que se utilizarían como la región marco (en adelante abreviada FR) de los anticuerpos humanizados.
- (1)
- región variable de cadena H de XB12: KABATID-020619 (base de datos Kabat)
- (2)
- Región variable de cadena L de XB12: nº de acceso de EMBL X61642 (base de datos IMGT)
(Mariette et al., Arthrities Rheum. 36:1315-1324, 1993)
(Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991)
21-10-2011
- (3)
- región variable de cadena H de SB04: KABATID-025255 (base de datos Kabat)
(Demaison et al., Immunogenetics 42:342-352, 1995)
- (4)
- región variable de cadena L de SB04: nº de acceso de EMBL AB064111 (base de datos IMGT)
(datos no publicados)
Para la preparación de anticuerpos humanizados, se injertaron regiones determinantes de complementariedad (en adelante abreviadas como CDR) de cada anticuerpo de ratón en las FR de anticuerpos humanos (1) a (4).
Además, se utilizó el sitio de internet en NCBI disponible públicamente (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para la búsqueda de secuencias de señal secretoria del anticuerpo humano que eran altamente homólogas a los anticuerpos humanos (1) a (4). Se utilizaron las secuencias de señal secretoria siguientes obtenidas mediante la búsqueda de homologías.
- (1)
- región variable de cadena H de XB12: nº de acceso GenBank AF062120
- (2)
- región variable de cadena L de XB12: nº de acceso GenBank M74019
- (3)
- región variable de cadena H de SB04: nº de acceso GenBank BC019337
- (4)
- región variable de cadena L de SB04: nº de acceso GenBank AY204756
Se prepararon doce oligonucleótidos sintéticos de aproximadamente 50 bases a partir de una secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia de aminoácidos entre la secuencia de señal secretoria y la región variable de anticuerpo, de manera que aproximadamente 20 bases de su extremo 3'-terminal se hibridaban entre sí. Además, se prepararon un cebador que hibridaba con el extremo 5'-terminal de un gen de región variable de anticuerpo y que presentaba una secuencia de corte con XhoI, y un cebador que se hibridaba con el extremo 3'-terminal de un gen de región variable de anticuerpo y que presentaba la secuencia de corte con SfiI.
Se mezclaron los oligonucleótidos sintéticos preparados (2,5 µM, 1 µl de cada uno) y se añadieron 1x tampón TaKaRa Ex Taq, dNTP 0,4 mM y 0,5 unidades de TaKaRa Ex Taq (todos de Takara Shuzo), hasta 48 µl de solución de reacción. Tras calentar la mezcla a 94ºC durante 5 minutos, se llevaron a cabo 2 ciclos de reacción (94ºC, 2 minutos; 55ºC, 2 minutos, y 72ºC, 2 minutos) para ensamblar y alargar cada uno de los oligonucleótidos sintéticos de ADN. A continuación, se añadieron un cebador que se hibridaba con el extremo 5'-terminal y un cebador que se hibridaba con el extremo 3'-terminal del gen de anticuerpo (10 µM, 1 µl cada uno) y se amplificaron los genes de región variable de anticuerpo mediante 35 ciclos de reacción (94ºC, 30 s; 55ºC, 30 s, y 72ºC, 1 minuto) y una reacción de 5 minutos a 75ºC. Tras la PCR, la solución de reacción globalmente se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño esperado (aproximadamente 400 pb) se purificaron con el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 µl). Los fragmentos se clonaron utilizando el sistema de vector pGEM-T Easy (Promega) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN utilizando el kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator (Applied Biosystems) en un secuenciador de ADN ABI PRISM 3700 DNA (Applied Biosystems) según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto.
Tras digerir con XhoI y SfiI un plásmido que se había confirmado que comprendía la secuencia génica correcta de la región variable de anticuerpo humanizado, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos de ADN del tamaño esperado (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto y se eluyeron con agua estéril (30 µl). Además, tras digerir con XhoI y SfiI los plásmidos de expresión de tipo inducible con tetraciclina (pcDNA4-g4H, pcDNA4-g4L) y los plásmidos de expresión de tipo inducible con análogos de ecdisona (pIND-g4H, pIND-g4L) preparados en el ejemplo 3.4, se purificaron fragmentos que comprendían la región constante de anticuerpo (aproximadamente 5 kb) utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 µl). El fragmento génico del anticuerpo XB12 humanizado (región variable de cadena H (en adelante VH) o la región variable de cadena L (en adelante VL)) digerido con XhoI y SfiI, y el plásmido de expresión de tipo inducible por tetraciclina (pcDNA4-g4H, pcDNA4-g4L) digerido con XhoI y SfiI, se sometieron a una reacción de ligación utilizando el kit de ligación rápida de ADN (Roche Diagnostics) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Además, el fragmento génico del anticuerpo SB04 humanizado digerido con XhoI y SfiI (región variable de cadena H o región variable de cadena L) y el plásmido de expresión de tipo inducible por análogos de ecdisona digerido con XhoI y SfiI (pIND-g4H, pIND-g4L) se sometieron a una reacción de ligación utilizando el kit de ligación rápida de ADN (Roche Diagnostics) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se utilizó una parte de cada mezcla de reacción para transformar la cepa E. coli DH5α (TOYOBO).
21-10-2011
Los genes se transfectaron y expresaron en HEK293H mediante los métodos descritos en los ejemplos 4.2 y 4.3, utilizando cuatro tipos de vectores de expresión de anticuerpo humanizado, así como pcDNA6/TR y pVgRXR. 5 Además, se llevaron a cabo la purificación y cuantificación de la concentración de anticuerpos mediante los métodos presentados en los ejemplos 8 y 5.
16.4 Evaluación de la actividad del anticuerpo biespecífico humanizado y modificación de la secuencia del anticuerpo
10 Para evaluar la capacidad de coagulación plasmática de los anticuerpos biespecíficos humanizados preparados de esta manera y del anticuerpo biespecífico quimérico XB12/SB04, se examinaron los efectos de los anticuerpos sobre el APTT utilizando plasma deficiente en F.VIII. Los aminoácidos de la FR del anticuerpo humano se modificaron para incrementar las actividades de los anticuerpos biespecíficos humanizados cuya capacidad de coagulación
15 sanguínea se había reducido. Además, se sustituyeron los residuos cisteína en la CDR3 de la VH del anticuerpo XB12 por alaninas respecto a la posible caída de su termoestabilidad. Concretamente, se introdujeron mutaciones en el vector de expresión de anticuerpo humanizado utilizando el kit de mutagénesis sitio-dirigida QuikChange (Stratagene) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Mediante la repetición de la modificación de aminoácidos de la secuencia de FR y la evaluación de la capacidad de coagulación sanguínea, se
20 obtuvo un anticuerpo biespecífico humanizado (anticuerpo XB12 humanizado (VH:hXB12f-A, VL:hXBVL)/anticuerpo SB04 humanizado (VH:hSB04e, VL:hSBVL-F3f) (figura 18).
25 La presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto un enzima como su sustrato, y que sustituyen funcionalmente a un cofactor que incrementa la actividad enzimática.
Los anticuerpos biespecíficos según la presente invención se cree que presentan una elevada estabilidad en sangre y una baja antigenicidad. De esta manera, existen grandes expectativas de que se convertirán en productos 30 farmacéuticos.
<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA 35
<120> ANTICUERPO BIESPECÍFICO QUE SUSTITUYE A LAS PROTEÍNAS FUNCIONALES
<130> C1-A0313P3
<150> PCT/JP03/13123 <151> 2003-10-14
<160> 268
45 <170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
<211> 22
<212> ADN 50 <213> Artificial
<220>
<223> secuencia de cebador sintetizada artificialmente
55 <400> 1
cagctatgaa atacctattg cc 22
<210> 2 60 <211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 65 <223> secuencia de cebador sintetizada artificialmente
21-10-2011 E04792180
- <400> 2
- cttttcataa tcaaaatcac cgg
- 23
- 5
- <210> 3 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> secuencia de cebador sintetizada artificialmente
- <400> 3
- 15
- attgcctacg gcagccgct 19
- 20
- <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> secuencia de cebador sintetizada artificialmente
- 25
- <400> 4
- aaatcaccgg aaccagagcc
- 20
- 30
- <210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial
- 35
- <220> <223> secuencia de cebador sintetizada artificialmente
- <400> 5
- 40 45
- ttactcgcgg cccagccggc catg <210> 6 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> secuencia de cebador sintetizada artificialmente 24
- 50
- <400> 6 ggaattcggc ccccgaggcc cactcacg 28
- 55
- <210> 7 <211> 1215 <212> ADN <213> Homo sapiens
- <400> 7
21-10-2011
<210> 8
5 <211> 684
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8 10
21-10-2011
<210> 9
<211> 1215
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 9
- 10
- <210> 10 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
- 15
- <220> <223> secuencia de cebador sintetizada artificialmente
- <400> 10
- 20
- cgcaaatggg cggtaggcgt g 21
- 25
- <210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial
- <220> <223> secuencia de cebador sintetizada artificialmente
- 30
- <400> 11
21-10-2011
- tagaaggcac agtcgagg
- 18
- 5
- <210> 12 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> secuencia de cebador sintetizada artificialmente
- <400> 12
- 15 20
- ctctgaatac tttcaacaag ttac <210> 13 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 24
<210> 14
<211> 6
<212> PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 14
- 35
- <210> 15
- <211> 16
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 40
- <400> 15
21-10-2011
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 16
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 17
- 20
- <210> 18
- <211> 5
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 25
- <400> 18
30 <210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 19
<210> 20 40 <211> 10
21-10-2011
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
<210> 21
<211> 123 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 21
<210> 22
<211> 5
<212> PRT 20 <213> Mus musculus
<400> 22
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 23
35 <210> 24
21-10-2011
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
<210> 25 10 <211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 25 15
<210> 26
<211> 5 20 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 26
<210> 27
<211> 17
<212> PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 27
21-10-2011
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 28
<210> 29
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 29
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus 25 <400> 30
<210> 31 30 <211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 31 35
<210> 32
<211> 12
21-10-2011
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 32
<210> 33
- <211>
- 117 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 33
<210> 34
- <211>
- 5 20 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 34
<210> 35
<211> 17
<212> PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 35
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
21-10-2011
<213> Mus musculus
<400> 36
<210> 37
<211> 114
<212> PRT 10 <213> Mus musculus
<400> 37
- 15
- <210> 38
- <211> 5
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 20
- <400> 38
25 <210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
30 <400> 39
<210> 40 35 <211> 4
<212> PRT
<213> Mus musculus
21-10-2011
<400> 40
5 <210> 41
<211> 114
<212> PRT
<213> Mus musculus
10 <400> 41
15 <210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
20 <400> 42
<210> 43 25 <211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 43 30
<210> 44
<211> 4 35 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 44
21-10-2011
<210> 45
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 45
<210> 46
<211> 6
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 46
<210> 47
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 47
30 <210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 48
40 <210> 49
21-10-2011
<211> 114
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 49
<210> 50 10 <211>5.
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 50 15
<210> 51
<211> 17 20 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 51
<210> 52
<211> 4
<212> PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 52
<210> 53
21-10-2011
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 53
10 <210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
15 <400> 54
<210> 55 20 <211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 55 25
<210> 56
<211> 11 30 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 56
<210> 57
<211> 121
<212> PRT
21-10-2011
<213> Mus musculus
<400> 57
<210> 58
<211> 5 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT 20 <213> Mus musculus
<400> 59
- 25
- <210> 60
- <211> 11
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 30
- <400> 60
35 <210> 61
<211> 119
<212> PRT
21-10-2011
<213> Mus musculus
<400> 61
<210> 62
<211> 5 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 62
<210> 63
<211> 17
<212> PRT 20 <213> Mus musculus
<400> 63
- 25
- <210> 64
- <211> 9
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 30
- <400> 64
21-10-2011
<210> 65
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 65
<210> 66
<211> 5
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 66
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 67
30 <210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 68
21-10-2011
<210> 69
<211> 123
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 69
<210> 70
<211> 5 15 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 70
<210> 71
<211> 17
<212> PRT 25 <213> Mus musculus
<400> 71
- 30
- <210> 72
- <211> 13
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 35
- <400> 72
21-10-2011
<210> 73
<211> 123
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 73
<210> 74
<211> 5
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 74
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 75
30 <210> 76
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 76
21-10-2011
<210> 77
<211> 123
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 77
<210> 78
<211> 5
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 78
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 79
30 <210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 80
21-10-2011
<210> 81
<211> 123
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 81
<210> 82
<211> 5
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 82
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 83
30 <210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 84
21-10-2011
<210> 85
5 <211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 85 10
<210> 86 15 <211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 86 20
<210> 87
- <211>
- 17 25 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 87
<210> 88
- <211>
- 9 35 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 88
21-10-2011
<210> 89
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 89
<210> 90
<211> 5 15 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 90
<210> 91
<211> 17
- <212>
- PRT 25 <213> Mus musculus
<400> 91
<210> 92
<211> 9
- <212>
- PRT 35 <213> Mus musculus
<400> 92
21-10-2011
<210> 93
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 93
<210> 94
<211> 5
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 94
<210> 95
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 95
30 <210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 96
21-10-2011
<210> 97
5 <211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 97 10
<210> 98 15 <211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 98 20
<210> 99
<211> 17 25 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 99
<210> 100
<211> 8
<212> PRT 35 <213> Mus musculus
<400> 100
21-10-2011
<210> 101
<211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 101
<210> 102
<211> 5 15 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 102
<210> 103
<211> 17
<212> PRT 25 <213> Mus musculus
<400> 103
- 30
- <210> 104
- <211> 8
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 35
- <400> 104
21-10-2011
<210> 105
<211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 105
<210> 106
<211> 5 15 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 106
<210> 107
<211> 17
<212> PRT 25 <213> Mus musculus
<400> 107
- 30
- <210> 108
- <211> 8
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 35
- <400> 108
21-10-2011
<210> 109
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 109
<210> 110
<211> 6
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 110
<210> 111
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 111
30 <210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 112
21-10-2011
<210> 113
<211> 123
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 113
<210> 114
<211> 5
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 114
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 115
- 30
- <210> 116
- <211> 13
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 35
- <400> 116
40 <210> 117
21-10-2011
<211> 128
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 117
10 <210> 118
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
15 <400> 118
<210> 119 20 <211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 119 25
<210> 120
<211> 18 30 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 120
21-10-2011
<210> 121
<211> 124
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 121
<210> 122
<211> 5
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 122
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 123
30 <210> 124
<211> 14
<212> PRT
<213> Mus musculus
21-10-2011
<400> 124
- 5
- <210> 125
- <211> 124
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 10
- <400> 125
15 <210> 126
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
20 <400> 126
<210> 127 25 <211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 127 30
<210> 128
<211> 14 35 <212> PRT
21-10-2011
<213> Mus musculus
<400> 128
<210> 129
<211> 124
- <212>
- PRT 10 <213> Mus musculus
<400> 129
<210> 130
<211> 5
- <212>
- PRT 20 <213> Mus musculus
<400> 130
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 131
- 35
- <210> 132
- <211> 14
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 40
<400> 132
5 <210> 133
<211> 124
<212> PRT
<213> Mus musculus
10 <400> 133
15 <210> 134
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
20 <400> 134
<210> 135 25 <211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 135 30
<210> 136
<211> 14 35 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 136
- 5
- <210> 137
- <211> 120
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 10
- <400> 137
15 <210> 138
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
20 <400> 138
<210> 139 25 <211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 139 30
<210> 140
<211> 10 35 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 140
<210> 141
<211> 120
- <212>
- PRT 10 <213> Mus musculus
<400> 141
<210> 142
<211> 5
- <212>
- PRT 20 <213> Mus musculus
<400> 142
<210> 143
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 143
35 <210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 144
<210> 145
- <211>
- 120 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 145
<210> 146
- <211>
- 5 20 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 146
<210> 147
<211> 17
<212> PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 147
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 148
<210> 149 10 <211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 149 15
<210> 150 20 <211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 150
<210> 151
<211> 17 30 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 151
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 152
<210> 153 10 <211> 120
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 153 15
<210> 154
<211> 5 20 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 154
<210> 155
<211> 17
<212> PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 155
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 156
- 10
- <210> 157
- <211> 120
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 15
- <400> 157
- 20
- <210> 158
- <211> 5
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 25
- <400> 158
30 <210> 159
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 159
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 160
- 10
- <210> 161
- <211> 120
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 15
- <400> 161
- 20
- <210> 162
- <211> 5
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 25
- <400> 162
30 <210> 163
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 163
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 164
- 10
- <210> 165
- <211> 120
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 15
- <400> 165
20 <210> 166
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
25 <400> 166
<210> 167 30 <211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 167 35
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 168
<210> 169
<211> 122
<212> PRT 15 <213> Mus musculus
<400> 169
- 20
- <210> 170
- <211> 5
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 25
- <400> 170
30 <210> 171
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 171
5 <210> 172
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
10 <400> 172
<210> 173 15 <211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 173 20
<210> 174 25 <211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 174
<210> 175
<211> 17 35 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 175
<210> 176
<211> 8
<212> PRT 10 <213> Mus musculus
<400> 176
<210> 177
<211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 177
- 25
- <210> 178
- <211> 5
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 30
- <400> 178
35 <210> 179
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 179
5 <210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
10 <400> 180
15 <210> 181
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
20 <400> 181
<210> 182 25 <211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 182
<210> 183
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 183
<210> 184
<211> 7 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 184
<210> 185
<211> 115
- <212>
- PRT 20 <213> Mus musculus
<400> 185
<210> 186
<211> 5
- <212>
- PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 186
<210> 187
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 187
- 5
- <210> 188
- <211> 5
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 10
- <400> 188
15 <210> 189
<211> 119
<212> PRT
<213> Mus musculus
20 <400> 189
25 <210> 190
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
30 <400> 190
<210> 191 35 <211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 191
<210> 192
<211> 9
<212> PRT 10 <213> Mus musculus
<400> 192
- 15
- <210> 193
- <211> 120
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 20
- <400> 193
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 195
<210> 196 10 <211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 196 15
<210> 197
<211> 120 20 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 197
<210> 198
<211> 5
<212> PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 198
<210> 199
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 199
- 10
- <210> 200
- <211> 10
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 15
- <400> 200
20 <210> 201
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
25 <400> 201
30 <210> 202
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
35 <400> 202
<210> 203
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 203
<210> 204
<211> 7 15 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 204
<210> 205
<211> 107
- <212>
- PRT 25 <213> Mus musculus
<400> 205
<210> 206
<211> 11
- <212>
- PRT 35 <213> Mus musculus
<400> 206
<210> 207
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 207
<210> 208 10 <211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 208
<210> 209
<211> 108 20 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 209
<210> 210
<211> 11
<212> PRT 30 <213> Mus musculus
<400> 210
- 35
- <210> 211
- <211> 7
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 40
- <400> 211
<210> 212
5 <211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 212 10
<210> 213
- <211>
- 107 15 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 213
<210> 214
- <211>
- 10 25 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 214
<210> 215
<211> 6
<212> PRT 35 <213> Mus musculus
<400> 215
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 216
<210> 217
<211> 114 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 217
<210> 218
<211> 17
<212> PRT 20 <213> Mus musculus
<400> 218
- 25
- <210> 219
- <211> 7
- <212> PRT
- <213> Mus musculus
- 30
- <400> 219
35 <210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 220
<210> 221
<211> 18
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (18)
<223>
<400> 221
<210> 222
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 222
<210> 223
<211> 48
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (48)
<223>
<400> 223
<210> 224
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 224
<210> 225
<211> 18
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (18)
<223>
<400> 225
<210> 226
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 226
<210> 227
<211> 30
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (30)
<223>
<400> 227
<210> 228
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 228
<210> 229
<211> 18
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (18)
<223>
<400> 229 <210> 230
<211> 6
<212> PRT
<213> mums musculus
<400> 230
<210> 231
<211> 27
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (27)
<223>
<400> 231
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 232
<210> 233
<211> 15
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (15)
<223>
<400> 233
<210> 234
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 234
<210> 235
<211> 48
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (48)
<223>
<400> 235
<210> 236
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 236
<210> 237
<211> 39
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (39)
<223>
<400> 237
<210> 238
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 238
<210> 239
<211> 51
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (51)
<223>
<400> 239
<210> 240
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 240
<210> 241
<211> 21
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (21)
<223>
<400> 241
25 <210> 242
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 242
<210> 243 35 <211> 27
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (27)
<223>
<400> 243 45
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 244
<210> 245
<211> 15
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (15)
<223>
<400> 245
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 246
<210> 247 25 <211> 51
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (51)
<223>
<400> 247 35
<210> 248
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 248
<210> 249
<211> 27
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (27)
<223>
<400> 249
<210> 250
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 250
<210> 251
<211> 33
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (33)
<223>
<400> 251
<210> 252
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 252
<210> 253
<211> 21
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (21)
<223>
<400> 253
<210> 254
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 254
<210> 255
<211> 24
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (24)
<223>
<400> 255
<210> 256
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 256
<210> 257
<211> 15
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (15)
<223>
<400> 257
<210> 258
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 258
<210> 259
<211> 51
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (51)
<223>
<400> 259
<210> 260 10 <211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 260 15
<210> 261
<211> 30 20 <212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS 25 <222> (1).. (30)
<223>
<400> 261
<210> 262
<211> 10
<212> PRT 35 <213> Mus musculus
<400> 262
<210> 263
<211> 33
<212> ADN
<213> Mus musculus 45
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (33)
<223> 50
<400> 263
<210> 264
<211> ·11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 264
<210> 265
<211> 21
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (21)
<223>
<400> 265
<210> 266
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 266
<210> 267
<211> 27
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (27)
<223>
<400> 267
<210> 268
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 268
Claims (15)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Anticuerpo que reconoce un enzima proteolítico y un sustrato del mismo, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que puede actuar como cofactor que aumenta la reacción enzimática, en el que el enzima es el factor IX de coagulación sanguínea y/o el factor IX activado de coagulación sanguínea; el sustrato es el factor X de coagulación sanguínea; y el cofactor es factor VIII de coagulación sanguínea y/o factor VIII activado de coagulación sanguínea.
-
- 2.
- Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una región determinante de complementariedad que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR3 del anticuerpo anti-factor IX/IXa de coagulación sanguínea de los (a1) o (a2) siguientes o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a la misma, y una región determinante de complementariedad que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR3 del anticuerpo anti-factor X de coagulación sanguínea descrita en cualquiera de los (b1) a (b9) siguientes, o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a la misma:
(a1) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 16, (a2) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 20, (b1) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 24, (b2) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 28, (b3) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 32, (b4) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 36, (b5) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 40, (b6) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 44, (b7) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 48, (b8) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 52, (b9) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID nº 56. -
- 3.
- Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una región determinante de complementariedad que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR del anticuerpo anti-factor IX/IXa de coagulación sanguínea de los (a1) o (a2) siguientes, o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a la misma, y una región determinante de complementariedad que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR del anticuerpo anti-factor X de coagulación sanguínea descirta en cualquiera de los (b1) a (b9) siguientes o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a la misma:
(a1) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 14, 15 y 16, respectivamente;(a2) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 18, 19 y 20, respectivamente;(b1) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 22, 23 y 24, respectivamente;(b2) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 26, 27 y 28, respectivamente;(b3) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 30, 31 y 32, respectivamente;(b4) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 34, 35 y 36, respectivamente;(b5) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 38, 39 y 40, respectivamente;(b6) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 42, 43 y 44, respectivamente;(b7) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 46, 47 y 48, respectivamente;(b8) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 50, 51 y 52, respectivamente;(b9) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID nº 54, 55 y 56, respectivamente. -
- 4.
- Composición que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un portador farmacéuticamente aceptable.
-
- 5.
- Composición según la reivindicación 4, en la que dicha composición es una composición farmacéutica utilizada para prevenir y/o tratar el sangrado, un trastorno acompañado de sangrado o un trastorno causado por el sangrado.
-
- 6.
- Composición según la reivindicación 5, en la que el sangrado, el trastorno acompañado de sangrado o el trastorno causado por el sangrado es un trastorno que aparece y/o progresa como resultado de una reducción de la actividad o deficiencia del factor VIII de coagulación sanguínea y/o del factor VIII activado de coagulación sanguínea.
-
- 7.
- Composición según la reivindicación 6, en la que el trastorno que aparece y/o progresa como resultado de una reducción de la actividad o deficiencia del factor VIII de coagulación sanguínea y/o del factor VIII activado de coagulación sanguínea es la hemofilia A.
-
- 8.
- Composición según la reivindicación 6, en la que el trastorno que aparece y/o progresa como resultado de una reducción de la actividad o deficiencia del factor VIII de coagulación sanguínea y/o del factor VIII activado de coagulación sanguínea es un trastorno en el que se genera un inhibidor contra el factor VIII de coagulación sanguínea y/o el factor VIII activado de coagulación sanguínea.
-
- 9.
- Composición según la reivindicación 6, en la que el trastorno que aparece y/o progresa como resultado de una reducción de la actividad o deficiencia del factor VIII de coagulación sanguínea y/o del factor VIII activado de coagulación sanguínea es la hemofilia adquirida.
-
- 10.
- Composición según la reivindicación 6, en la que el trastorno que aparece y/o progresa como resultado de una reducción de la actividad del factor VIII de coagulación sanguínea y/o del factor VIII activado de coagulación sanguínea es la enfermedad de von Willebrand.
-
- 11.
- Utilización del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir y/o tratar el sangrado, un trastorno acompañado de sangrado, o un trastorno causado por el sangrado.
-
- 12.
- Utilización del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para preparar la composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10.
-
- 13.
- Kit utilizado en la utilización según la reivindicación 11, en el que dicho kit comprende por lo menos el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición según la reivindicación 5.
-
- 14.
- Utilización del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10 en combinación con factor VIII de coagulación sanguínea para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención y/o el tratamiento del sangrado, de un trastorno acompañado de sangrado o de un trastorno causado por el sangrado.
-
- 15.
- Kit utilizado en la utilización según la reivindicación 14, en el que dicho kit comprende por lo menos el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición según la reivindicación 4, y el factor VIII de coagulación sanguínea.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
WOPCT/JP03/13062 | 2003-10-10 | ||
PCT/JP2003/013062 WO2005035753A1 (ja) | 2003-10-10 | 2003-10-10 | 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体 |
WOPCT/JP03/13123 | 2003-10-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2370250T3 true ES2370250T3 (es) | 2011-12-13 |
Family
ID=34430861
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04792180T Expired - Lifetime ES2370250T3 (es) | 2003-10-10 | 2004-10-08 | Anticuerpo biespecífico que sustituye al factor viii. |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8062635B2 (es) |
EP (3) | EP1688488B9 (es) |
KR (2) | KR101361437B1 (es) |
CN (1) | CN1890369B (es) |
AT (1) | ATE518952T1 (es) |
AU (2) | AU2003271174A1 (es) |
BR (1) | BRPI0415230B1 (es) |
CA (1) | CA2541671C (es) |
DK (2) | DK3085783T3 (es) |
ES (1) | ES2370250T3 (es) |
IL (1) | IL174794A (es) |
MX (1) | MXPA06003831A (es) |
NO (2) | NO345624B1 (es) |
NZ (1) | NZ546509A (es) |
PL (1) | PL3085783T3 (es) |
RU (1) | RU2339696C2 (es) |
SI (1) | SI3085783T1 (es) |
TW (1) | TW200514790A (es) |
UA (1) | UA95438C2 (es) |
WO (2) | WO2005035753A1 (es) |
Families Citing this family (100)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
GB0300571D0 (en) * | 2003-01-10 | 2003-02-12 | Imp College Innovations Ltd | Modification of feeding behaviour |
WO2004111233A1 (ja) * | 2003-06-11 | 2004-12-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 抗体の製造方法 |
AU2003271174A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Double specific antibodies substituting for functional protein |
AU2003271186A1 (en) * | 2003-10-14 | 2005-04-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Double specific antibodies substituting for functional protein |
US8187595B2 (en) | 2004-05-07 | 2012-05-29 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Monoclonal antibodies for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-I |
KR20070073885A (ko) * | 2004-10-05 | 2007-07-10 | 뉴랄랩 리미티드 | 재조합 단백질 생산을 향상시키는 방법 및 조성물 |
AR052051A1 (es) | 2004-12-15 | 2007-02-28 | Neuralab Ltd | Anticuerpos ab humanizados usados en mejorar la cognicion |
AU2006232287B2 (en) | 2005-03-31 | 2011-10-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association |
US20100003254A1 (en) * | 2005-04-08 | 2010-01-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody Substituting for Function of Blood Coagulation Factor VIII |
DK2009101T3 (en) | 2006-03-31 | 2018-01-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antibody modification method for purification of a bispecific antibody |
CA2647846C (en) * | 2006-03-31 | 2016-06-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
JP2009274958A (ja) * | 2006-08-31 | 2009-11-26 | Nara Prefecture | 血液凝固第viii因子の活性化を促進する抗体 |
CA2696263C (en) | 2007-08-15 | 2017-06-13 | Bing Liu | Monospecific and multispecific antibodies and method of use |
EP3127921A1 (en) | 2007-09-26 | 2017-02-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr |
MX342551B (es) | 2007-09-26 | 2016-10-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Region constante de anticuerpo modificada. |
JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
BRPI0821110B8 (pt) * | 2007-12-05 | 2021-05-25 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | anticorpo de neutralização de anti-nr10/il31ra, composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo e uso do mesmo |
TR201808535T4 (tr) * | 2008-04-11 | 2018-07-23 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | İki veya daha fazla sayıda antijen molekülüne tekrar tekrar bağlanabilen antijen bağlanma molekülü. |
PL2328931T3 (pl) * | 2008-08-06 | 2014-01-31 | Lilly Co Eli | Wybiórcze przeciwciała anty-hepcydyna-25 i ich zastosowania |
TWI440469B (zh) * | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
JP5734201B2 (ja) * | 2008-12-19 | 2015-06-17 | マクロジェニクス,インコーポレーテッド | 共有結合型ダイアボディ及びその使用 |
TWI682995B (zh) | 2009-03-19 | 2020-01-21 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗體恆定區域改變體 |
EP2409991B1 (en) | 2009-03-19 | 2017-05-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody constant region variant |
SG176074A1 (en) | 2009-05-15 | 2011-12-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-axl antibody |
LT3023438T (lt) | 2009-09-03 | 2020-05-11 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Anti-gitr antikūnai |
WO2011037158A1 (ja) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
TWI505838B (zh) | 2010-01-20 | 2015-11-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Stabilized antibody solution containing |
JP5889181B2 (ja) | 2010-03-04 | 2016-03-22 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
AR081434A1 (es) * | 2010-06-10 | 2012-08-29 | Lilly Co Eli | Anticuerpo del peptido relacionado con el gen calcitonina (cgrp), composicion farmaceutica que lo comprende, uso de dicho anticuerpo para preparar un medicamento util para tratar dolor de osteoartritis o migranas y fragmento de union a antigeno de dicho anticuerpo |
KR102099580B1 (ko) * | 2010-11-17 | 2020-04-10 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자 |
US20140234340A1 (en) | 2010-11-30 | 2014-08-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly |
WO2012085069A2 (en) * | 2010-12-23 | 2012-06-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Detection of a polypeptide dimer by a bivalent binding agent |
EP2655414B1 (en) | 2010-12-23 | 2018-08-29 | Roche Diagniostics GmbH | Bispecific binding agent |
CA2817928C (en) | 2010-12-23 | 2019-10-01 | Michael Gerg | Detection of a posttranslationally modified polypeptide by a bi-valent binding agent |
EP2655413B1 (en) | 2010-12-23 | 2019-01-16 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery |
WO2012093704A1 (ja) | 2011-01-07 | 2012-07-12 | 中外製薬株式会社 | 抗体の物性を改善させる方法 |
WO2012115241A1 (ja) | 2011-02-25 | 2012-08-30 | 中外製薬株式会社 | FcγRIIb特異的Fc抗体 |
TW201326209A (zh) | 2011-09-30 | 2013-07-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | 具有促進抗原清除之FcRn結合域的治療性抗原結合分子 |
EP2762493B1 (en) | 2011-09-30 | 2021-06-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities |
EP2787078B1 (en) | 2011-10-31 | 2019-05-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain |
CN104144944B (zh) * | 2012-02-29 | 2016-06-29 | 大塚制药株式会社 | 抗-脂阿拉伯甘露聚糖抗体和使用该抗体对抗酸杆菌感染的免疫测定 |
EP2825553B1 (en) | 2012-03-14 | 2018-07-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof |
CN104662044B (zh) | 2012-08-24 | 2018-10-30 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于治疗ror1癌症并抑制转移的抗体和疫苗 |
BR112015004119A2 (pt) * | 2012-08-31 | 2017-08-08 | Univ North Carolina Chapel Hill | anticorpos monoclonais para melhorar ou inibir o fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (igf-1) |
RU2683933C2 (ru) | 2012-09-28 | 2019-04-03 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Способ для оценки реакции коагуляции крови |
WO2015046467A1 (ja) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド異種多量体の製造方法 |
US10035847B2 (en) | 2013-10-02 | 2018-07-31 | The Rockefeller University | Amyloid protofibril antibodies and methods of use thereof |
TW201625299A (zh) | 2014-06-20 | 2016-07-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | 用於因第viii凝血因子及/或活化的第viii凝血因子的活性降低或欠缺而發病及/或進展的疾病之預防及/或治療之醫藥組成物 |
GB201412658D0 (en) | 2014-07-16 | 2014-08-27 | Ucb Biopharma Sprl | Molecules |
TWI701435B (zh) * | 2014-09-26 | 2020-08-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 測定fviii的反應性之方法 |
TWI700300B (zh) * | 2014-09-26 | 2020-08-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 中和具有第viii凝血因子(fviii)機能替代活性的物質之抗體 |
MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
EP3233921B1 (en) | 2014-12-19 | 2021-09-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-c5 antibodies and methods of use |
AU2015365168B2 (en) | 2014-12-19 | 2021-08-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant Fc regions, and methods of use |
CN107108729A (zh) | 2015-02-05 | 2017-08-29 | 中外制药株式会社 | 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体,fc区变体,il‑8‑结合抗体,及其应用 |
SG11201705093UA (en) | 2015-02-27 | 2017-07-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Composition for treating il-6-related diseases |
WO2016159213A1 (ja) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド異種多量体の製造方法 |
JP6698102B2 (ja) * | 2015-04-17 | 2020-05-27 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 凝固因子と多重特異的抗体を用いた併用療法 |
JP2018123055A (ja) * | 2015-04-24 | 2018-08-09 | 公立大学法人奈良県立医科大学 | 血液凝固第viii因子(fviii)の機能を代替する多重特異性抗原結合分子を含有する、血液凝固第xi因子(fxi)異常症の予防および/または治療に用いられる医薬組成物 |
US11191844B2 (en) | 2015-07-06 | 2021-12-07 | Regeneran Pharmaceuticals, Inc. | Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof |
GB201601077D0 (en) | 2016-01-20 | 2016-03-02 | Ucb Biopharma Sprl | Antibody molecule |
GB201601073D0 (en) | 2016-01-20 | 2016-03-02 | Ucb Biopharma Sprl | Antibodies |
PE20181336A1 (es) | 2015-09-18 | 2018-08-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos |
GB201521382D0 (en) | 2015-12-03 | 2016-01-20 | Ucb Biopharma Sprl | Antibodies |
WO2017110980A1 (ja) | 2015-12-25 | 2017-06-29 | 中外製薬株式会社 | 増強された活性を有する抗体及びその改変方法 |
EP3394098A4 (en) | 2015-12-25 | 2019-11-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE |
AU2016381992B2 (en) | 2015-12-28 | 2024-01-04 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide |
US11421028B2 (en) | 2016-02-06 | 2022-08-23 | Epimab Biotherapeutics, Inc. | Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof |
US11072666B2 (en) | 2016-03-14 | 2021-07-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy |
CN108883178B (zh) | 2016-04-28 | 2023-03-14 | 中外制药株式会社 | 含抗体制剂 |
EP3448891A1 (en) | 2016-04-28 | 2019-03-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making multispecific antigen-binding molecules |
MX2018016330A (es) | 2016-06-27 | 2020-02-17 | Univ California | Combinaciones para tratamiento del cáncer. |
CA3027018A1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Bispecific antibody exhibiting increased alternative fviii-cofactor-function activity |
TWI831965B (zh) | 2016-08-05 | 2024-02-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | Il-8相關疾病之治療用或預防用組成物 |
SG11201901961SA (en) | 2016-09-06 | 2019-04-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Methods of using a bispecific antibody that recognizes coagulation factor ix and/or activated coagulation factor ix and coagulation factor x and/or activated coagulation factor x |
MA46893A (fr) | 2016-11-23 | 2019-10-02 | Bioverativ Therapeutics Inc | Anticorps bispécifiques se liant au facteur ix de coagulation et au facteur x de coagulation |
WO2018141863A1 (en) * | 2017-02-01 | 2018-08-09 | Novo Nordisk A/S | Procoagulant antibodies |
US20210107994A1 (en) | 2017-03-31 | 2021-04-15 | Public University Corporation Nara Medical University | Medicinal composition usable for preventing and/or treating blood coagulation factor ix abnormality, comprising multispecific antigen binding molecule replacing function of blood coagulation factor viii |
EP3620531A4 (en) | 2017-05-02 | 2021-03-17 | National Center of Neurology and Psychiatry | METHOD OF PREDICTION AND EVALUATION OF THERAPEUTIC EFFECT IN DISEASES RELATING TO IL-6 AND NEUTROPHILS |
GB201709970D0 (en) | 2017-06-22 | 2017-08-09 | Kymab Ltd | Bispecific antigen-binding molecules |
CR20210381A (es) | 2017-09-29 | 2021-09-09 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | MOLÉCULA DE UNIÓN AL ANTÍGENO MULTIESPECÍFICA QUE TIENE ACTIVIDAD DE SUSTITUCIÓN DE LA FUNCIÓN DE COFACTOR DEL FACTOR VIII DE COAGULACIÓN DE SANGRE (FVIII) Y FORMULACIÓN FARMACÉUTICA QUE CONTIENE TAL MOLÉCULA COMO INGREDIENTE (Divisional Exp. 2020-0158) |
US20200283544A1 (en) | 2017-11-01 | 2020-09-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody variant and isoform with lowered biological activity |
EP3710486A1 (en) * | 2017-11-15 | 2020-09-23 | Novo Nordisk A/S | Factor x binders enhancing fx activation |
CN112074538B (zh) | 2018-04-30 | 2024-10-18 | 瑞泽恩制药公司 | 结合her2和/或aplp2的抗体和双特异性抗原结合分子、其缀合物和用途 |
MX2020011588A (es) | 2018-05-03 | 2020-12-07 | Shanghai Epimab Biotherapeutics Co Ltd | Anticuerpos de alta afinidad a pd-1 y lag-3 y proteinas de union bispecificas preparadas a partir de las mismas. |
US20210231654A1 (en) | 2018-06-04 | 2021-07-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for detecting complex |
FR3082427B1 (fr) | 2018-06-14 | 2020-09-25 | Lab Francais Du Fractionnement | Combinaison de facteur vii et d'un anticorps bispecifique anti-facteurs ix et x |
US11220554B2 (en) * | 2018-09-07 | 2022-01-11 | Novo Nordisk A/S | Procoagulant antibodies |
US11009507B2 (en) | 2018-09-14 | 2021-05-18 | University Of New England | Methods and diagnostics for cancer detection and treatment monitoring |
DK3723858T3 (da) | 2018-12-21 | 2022-01-24 | Kymab Ltd | Fixaxfx bispecifik antistof med fælles let kæde |
PE20212262A1 (es) * | 2019-04-17 | 2021-11-29 | Novo Nordisk As | Anticuerpos biespecificos |
TW202207984A (zh) | 2019-10-11 | 2022-03-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 用於後天性血友病a之預防及/或治療之醫藥組成物、及包含該醫藥組成物之製品 |
MX2022003912A (es) | 2019-10-11 | 2022-04-20 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Composicion farmaceutica que puede usarse para la prevencion y/o el tratamiento de la hemofilia a adquirida, y producto que comprende la composicion farmaceutica. |
JP2023106635A (ja) | 2020-04-17 | 2023-08-02 | 中外製薬株式会社 | 二重特異性抗原結合分子ならびに、それに関連する組成物、組成物の製造のための使用、キット、および方法 |
KR20230014719A (ko) | 2020-05-22 | 2023-01-30 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 응고 제viii 인자(f.viii) 기능 대체 활성을 갖는 물질을 중화하는 항체 |
CN112794903B (zh) * | 2021-04-14 | 2021-06-25 | 广州市雷德生物科技有限公司 | 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用 |
EP4453012A1 (en) | 2021-12-22 | 2024-10-30 | Royal College of Surgeons in Ireland | A conjugate for use in localising a molecule to the vascular endothelium |
Family Cites Families (68)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
US4208479A (en) * | 1977-07-14 | 1980-06-17 | Syva Company | Label modified immunoassays |
IE52535B1 (en) | 1981-02-16 | 1987-12-09 | Ici Plc | Continuous release pharmaceutical compositions |
US4474893A (en) | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
US4444878A (en) | 1981-12-21 | 1984-04-24 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Bispecific antibody determinants |
HUT35524A (en) | 1983-08-02 | 1985-07-29 | Hoechst Ag | Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance |
US4945050A (en) | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US6010902A (en) | 1988-04-04 | 2000-01-04 | Bristol-Meyers Squibb Company | Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity |
IL89491A0 (en) | 1988-11-17 | 1989-09-10 | Hybritech Inc | Bifunctional chimeric antibodies |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
JP3032287B2 (ja) * | 1989-12-11 | 2000-04-10 | イムノメデイツクス・インコーポレイテツド | 診断薬または治療薬の抗体ターゲティング |
TW212184B (es) | 1990-04-02 | 1993-09-01 | Takeda Pharm Industry Co Ltd | |
JPH05184383A (ja) | 1990-06-19 | 1993-07-27 | Dainabotsuto Kk | 二重特異性抗体 |
JPH05199894A (ja) | 1990-08-20 | 1993-08-10 | Takeda Chem Ind Ltd | 二重特異性抗体および抗体含有薬剤 |
WO1993012227A1 (en) | 1991-12-17 | 1993-06-24 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
WO1994025585A1 (en) | 1993-04-26 | 1994-11-10 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
DK0546073T3 (da) | 1990-08-29 | 1998-02-02 | Genpharm Int | Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer |
JPH05304992A (ja) | 1991-06-20 | 1993-11-19 | Takeda Chem Ind Ltd | ハイブリッド・モノクローナル抗体および抗体含有薬剤 |
ES2165851T3 (es) | 1991-11-25 | 2002-04-01 | Enzon Inc | Proteinas multivalentes que se unen a antigenos. |
JPH05203652A (ja) | 1992-01-28 | 1993-08-10 | Fuji Photo Film Co Ltd | 抗体酵素免疫分析法 |
JPH05213775A (ja) | 1992-02-05 | 1993-08-24 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | Bfa抗体 |
DK0584348T3 (da) | 1992-03-11 | 2005-09-19 | Powderject Vaccines Inc | Genetisk vaccine mod immundefektvirusser |
US6129914A (en) | 1992-03-27 | 2000-10-10 | Protein Design Labs, Inc. | Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line |
US5744446A (en) * | 1992-04-07 | 1998-04-28 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
SG48760A1 (en) | 1992-07-24 | 2003-03-18 | Abgenix Inc | Generation of xenogenetic antibodies |
DE4419399C1 (de) | 1994-06-03 | 1995-03-09 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern |
US5945311A (en) | 1994-06-03 | 1999-08-31 | GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit | Method for producing heterologous bi-specific antibodies |
DE69519929T2 (de) | 1994-07-11 | 2001-05-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Verfahren und zusammensetzungen für die spezifische koagulation von tumorgefässen |
HU221385B1 (en) | 1994-07-13 | 2002-09-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Reconstituted human antibody against human interleukin-8 |
JPH10511085A (ja) | 1994-12-02 | 1998-10-27 | カイロン コーポレイション | 二重特異性抗体を用いる免疫応答を促進する方法 |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
AU5632296A (en) | 1995-04-27 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
AU2466895A (en) | 1995-04-28 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
MA24512A1 (fr) * | 1996-01-17 | 1998-12-31 | Univ Vermont And State Agrienl | Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose |
WO1998003546A1 (en) | 1996-07-19 | 1998-01-29 | Amgen Inc. | Analogs of cationic proteins |
JPH10165184A (ja) | 1996-12-16 | 1998-06-23 | Tosoh Corp | 抗体、遺伝子及びキメラ抗体の製法 |
US20030207346A1 (en) | 1997-05-02 | 2003-11-06 | William R. Arathoon | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
US20020062010A1 (en) | 1997-05-02 | 2002-05-23 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
EP0979281B1 (en) | 1997-05-02 | 2005-07-20 | Genentech, Inc. | A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
DE19725586C2 (de) | 1997-06-17 | 1999-06-24 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Verfahren zur Herstellung von Zellpräparaten zur Immunisierung mittels heterologer intakter bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper |
US6207805B1 (en) | 1997-07-18 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Prostate cell surface antigen-specific antibodies |
US6342220B1 (en) | 1997-08-25 | 2002-01-29 | Genentech, Inc. | Agonist antibodies |
US6677436B1 (en) | 1998-04-03 | 2004-01-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Humanized antibody against human tissue factor (TF) and process of production of the humanized antibody |
AU770555B2 (en) | 1998-08-17 | 2004-02-26 | Abgenix, Inc. | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
AT411997B (de) | 1999-09-14 | 2004-08-26 | Baxter Ag | Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate |
JP2002112369A (ja) | 2000-10-03 | 2002-04-12 | Sharp Corp | 端末網制御装置 |
US20030008880A1 (en) | 2001-05-02 | 2003-01-09 | Pfizer Inc. | 4-(2-Pyridyl) piperizines having 5HT7 receptor agonist activity |
NZ532526A (en) | 2001-10-25 | 2007-01-26 | Genentech Inc | Compositions comprising a glycoprotein having a Fc region |
DE10156482A1 (de) | 2001-11-12 | 2003-05-28 | Gundram Jung | Bispezifisches Antikörper-Molekül |
WO2003087163A1 (fr) | 2002-04-15 | 2003-10-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede d'elaboration d'une banque scdb |
JP4518941B2 (ja) | 2002-04-26 | 2010-08-04 | 中外製薬株式会社 | アゴニスト抗体のスクリーニング方法 |
WO2003107218A1 (ja) | 2002-05-31 | 2003-12-24 | セレスター・レキシコ・サイエンシズ株式会社 | 相互作用予測装置 |
WO2004065611A1 (ja) | 2003-01-21 | 2004-08-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 抗体の軽鎖スクリーニング方法 |
AU2003271174A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Double specific antibodies substituting for functional protein |
AU2003271186A1 (en) | 2003-10-14 | 2005-04-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Double specific antibodies substituting for functional protein |
AU2006232287B2 (en) | 2005-03-31 | 2011-10-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association |
JP5057967B2 (ja) | 2005-03-31 | 2012-10-24 | 中外製薬株式会社 | sc(Fv)2構造異性体 |
US20100003254A1 (en) | 2005-04-08 | 2010-01-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody Substituting for Function of Blood Coagulation Factor VIII |
AU2006256041B2 (en) | 2005-06-10 | 2012-03-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof |
CA2647846C (en) | 2006-03-31 | 2016-06-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
DK2009101T3 (en) | 2006-03-31 | 2018-01-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antibody modification method for purification of a bispecific antibody |
MY157796A (en) | 2006-06-08 | 2016-07-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Preventive or remedy for inflammatory disease |
CN101939425B (zh) | 2007-09-26 | 2014-05-14 | 中外制药株式会社 | 抗il-6受体抗体 |
EP3127921A1 (en) | 2007-09-26 | 2017-02-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr |
TR201808535T4 (tr) | 2008-04-11 | 2018-07-23 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | İki veya daha fazla sayıda antijen molekülüne tekrar tekrar bağlanabilen antijen bağlanma molekülü. |
MX2010011717A (es) | 2008-05-01 | 2010-11-30 | Amgen Inc | Anticuerpos anti-hepcidina y metodos de uso. |
TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
-
2003
- 2003-10-10 AU AU2003271174A patent/AU2003271174A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-10 WO PCT/JP2003/013062 patent/WO2005035753A1/ja not_active Application Discontinuation
-
2004
- 2004-10-07 TW TW093130368A patent/TW200514790A/zh unknown
- 2004-10-08 EP EP04792180A patent/EP1688488B9/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-08 AU AU2004280421A patent/AU2004280421B2/en not_active Expired
- 2004-10-08 EP EP10180356A patent/EP2289944A3/en not_active Withdrawn
- 2004-10-08 NO NO20160762A patent/NO345624B1/no unknown
- 2004-10-08 MX MXPA06003831A patent/MXPA06003831A/es active IP Right Grant
- 2004-10-08 ES ES04792180T patent/ES2370250T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-08 BR BRPI0415230-1A patent/BRPI0415230B1/pt active IP Right Grant
- 2004-10-08 DK DK16162353.3T patent/DK3085783T3/da active
- 2004-10-08 US US10/575,193 patent/US8062635B2/en active Active
- 2004-10-08 DK DK04792180.4T patent/DK1688488T3/da active
- 2004-10-08 AT AT04792180T patent/ATE518952T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-10-08 KR KR1020127033128A patent/KR101361437B1/ko active IP Right Grant
- 2004-10-08 CA CA2541671A patent/CA2541671C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-08 WO PCT/JP2004/014911 patent/WO2005035756A1/ja active Application Filing
- 2004-10-08 UA UAA200604899A patent/UA95438C2/ru unknown
- 2004-10-08 EP EP16162353.3A patent/EP3085783B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-08 RU RU2006115614/13A patent/RU2339696C2/ru active
- 2004-10-08 PL PL16162353T patent/PL3085783T3/pl unknown
- 2004-10-08 NZ NZ546509A patent/NZ546509A/en unknown
- 2004-10-08 SI SI200432510T patent/SI3085783T1/sl unknown
- 2004-10-08 CN CN200480036248.8A patent/CN1890369B/zh not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-04-05 IL IL174794A patent/IL174794A/en active IP Right Grant
- 2006-05-08 KR KR1020067008860A patent/KR101471194B1/ko active IP Right Grant
- 2006-05-09 NO NO20062087A patent/NO338686B1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2370250T3 (es) | Anticuerpo biespecífico que sustituye al factor viii. | |
US20220213217A1 (en) | Antibody substituting for function of blood coagulation factor viii | |
JP5490734B2 (ja) | 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 | |
ES2865152T3 (es) | Anticuerpo biespecífico que sustituye a proteínas funcionales | |
JP5438880B2 (ja) | 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 |