ES2368331T3

ES2368331T3 - Moléculas de unión a cd20.

Info

Publication number: ES2368331T3
Application number: ES04752743T
Authority: ES
Inventors: Jeffry D. Watkins; Julian Davies; David M. Marquis; Barrett W. Allan; Brian Ondek
Original assignee: Applied Molecular Evolution Inc
Current assignee: Applied Molecular Evolution Inc
Priority date: 2003-05-20
Filing date: 2004-05-20
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2024-05-20
Also published as: US8153125B2; DOP2004000911A; EP1633396B1; AU2004240659A1; ATE517635T1; WO2004103404A1; JP2011057704A; HK1096578A1; PL1633396T3; AR044388A1; CN1874788A; SV2005001792A; TW200509969A; MXPA05012468A; SI1633396T1; EP1633396A4; PT1633396E; US20050025764A1; CA2525139C; DK1633396T3

Abstract

Una composición que comprende una molécula de unión a CD20, en la que dicha molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) por CD20 humana de 5,0 x 10 -10 M o menos, y una velocidad de disociación (koff) para CD20 humana de 5,0 x 10 -4 s -1 o menos, en la que dicha molécula de unión a CD20 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende: a) una región variable de cadena ligera, en la que dicha región variable de cadena ligera comprende; i) una secuencia de aminoácidos de CDRL1 de la SEC ID Nº 5; ii) una secuencia de aminoácidos de CDRL2 de la SEC ID Nº 13; y iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL3 de la SEC ID Nº 19; y b) una región variable de cadena pesada, en la que dicha región variable de cadena pesada comprende; i) una secuencia de aminoácidos de CDRH1 de la SEC ID Nº 25; ii) una secuencia de aminoácidos de CDRH2 de la SEC ID Nº 39; y iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH3 de la SEC ID Nº 57.

Description

Moléculas de unión a CD20.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de unión a CD20 y secuencias de ácido nucleico que codifican moléculas de unión a CD20. En particular, la presente invención se refiere a moléculas de unión a CD20 con una alta afinidad de unión, y una baja velocidad de disociación, con respecto a CD20 humana. Preferiblemente, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención comprenden regiones variables de cadena ligera y/o pesada con regiones flanqueantes completamente humanas (por ejemplo, regiones flanqueantes de la línea germinal humana).

Antecedentes de la invención

Previamente se ha informado del uso de anticuerpos contra el antígeno CD20 como agentes de diagnóstico y/o terapéuticos para enfermedades tales como linfoma de células B. CD20 es un marcador o diana útil para linfomas de células B ya que este antígeno se expresa en muy altas densidades sobre la superficie de células B malignas, es decir, células B en las que la proliferación no moderada puede conducir a linfomas de células B.

CD20 (también conocido como Bp35) es un antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B que se expresa durante el desarrollo temprano pre-célula B y permanece hasta la diferenciación en células plasmáticas. Algunos creen que la molécula CD20 puede regular una etapa en el proceso de activación de células B que es necesaria para el inicio del ciclo celular y la diferenciación. Además, como se aprecia, CD20 se expresa habitualmente a niveles muy altos en células B neoplásicas ("tumorales"). El antígeno CD20 está solicitando una terapia dirigida, porque no se elimina, modula o internaliza.

Las terapias presentadas previamente que implican anticuerpos anti CD20 han implicado la administración de un anticuerpo anti CD20 terapéutico sólo o junto con un segundo anticuerpo anti CD20 radiomarcado, o un agente quimioterapéutico. La Administración de Alimentos y Fármacos ha aprobado el uso terapéutico de uno de dichos anticuerpos anti CD20, RITUXAN para su uso en linfoma no Hodgkin (NHL) de bajo grado reincidente y previamente tratado. Sin embargo, aunque se ha informado del uso de RITUXAN generalmente como eficaz para tratar linfomas de células B, los pacientes tratados a menudo están sometidos a una recaída de la enfermedad.

Más recientemente, se ensayó RITUXAN para la seguridad, tolerabilidad y eficacia clínica preliminar para el tratamiento de 18 pacientes con lupus sistémico eritematoso (SLE) (que son pacientes no inmunosuprimidos). Parte de los resultados de este estudio se presentaron en octubre de 2002 en la American College of Rheumatology (ACR) 66th Annual Scientific Meeting. De los 18 pacientes tratados, seis pacientes recibieron una infusión de RITUXAN a 100 mg/m2 (dosis baja), seis pacientes recibieron una infusión de RITUXAN a 375 mg/m2 (dosis media), y seis pacientes recibieron cuatro infusiones semanales de RITUXAN a 375 mg/m2 (dosis alta). Tres de los 12 pacientes que recibieron la dosis baja o media (25%) desarrollaron elevados títulos antiquimera humano (HACA) a los dos meses, mientras que los pacientes con dosis alta aun se están evaluando.

Por consiguiente, los que se necesita, son moléculas de unión a CD20 que tengan una alta afinidad de unión y baja constante de disociación de modo que los pacientes con linfoma de células B tratados no recaigan, y moléculas de unión a CD20 que no causen, o tengan un potencial reducido para causar, una reacción HACA cuando se administren a pacientes que no estén inmunosuprimidos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona moléculas de unión a CD20 y secuencias de ácido nucleico que codifican moléculas de unión a CD20. En particular, la presente invención proporciona moléculas de unión a CD20 con una alta afinidad de unión, y una baja velocidad de disociación, con respecto a CD20 humana. Preferiblemente, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención comprenden regiones variables de cadena ligera y/o pesada con regiones flanqueantes completamente humanas (por ejemplo, regiones flanqueantes de la línea germinal humana).

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una molécula de unión a CD20, donde la molécula de unión a CD20 comprende: a) una región variable de cadena ligera, o una parte de una región variable de cadena ligera, donde la región variable de cadena ligera (o la parte) comprende; i) un aminoácido CDRL1 de la SEC ID Nº 5; ii) una secuencia de aminoácidos CDRL2 de la SEC ID Nº 13; iii) una secuencia de aminoácidos CDRL3 de la SEC ID Nº 19, y b) una región variable de cadena pesada, o una parte de una región variable de cadena pesada, donde la región variable de cadena pesada (o la parte) comprende; i) una secuencia de aminoácidos CDRH1 de la SEC ID Nº 25; ii) una secuencia de aminoácidos CDRH2 de la SEC ID Nº 39; y iii) una secuencia de aminoácidos CDRH3 de la SEC ID Nº 57.

En ciertas realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende una parte una región flanqueante (por ejemplo, que contiene 2 ó 3 subregiones, tales como FR2 y FR3). En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende una región flanqueante completamente humana. En otras realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende una región flanqueante de la línea germinal humana. En realizaciones particulares, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 59. En ciertas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una parte de una región flanqueante (por ejemplo, que contiene 2 ó 3 subregiones, tales como FR2 y FR3). En ciertas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una región flanqueante completamente humana. En otras realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una región flanqueante de la línea germinal humana. En realizaciones adicionales, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos 61.

En algunas realizaciones, la molécula de unión a CD20 comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fv, Fab, etc.). En realizaciones particulares, la molécula de unión a CD20 comprende el Fv o Fab AME 33.

En realizaciones particulares, la presente invención proporciona construcciones de fusión que comprenden una molécula de unión a CD20 (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) y un compañero de fusión, tal como una enzima, marcador detectable, molécula de carbohidrato, un lípido, etc. En algunas realizaciones, la construcción de fusión comprende un Fab o Fab'2 que se une a CD20 humano y una enzima para convertir un profármaco en una forma activa.

En ciertas realizaciones, la molécula de unión a CD20 está contenida dentro de una célula huésped (por ejemplo, célula huésped eucariota o procariota). En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera y/o pesada está contenida dentro de un plásmido u otro vector de expresión.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una molécula de unión a CD20 que tiene una afinidad de unión (Kd) para CD20 humano de 5,0 x 10-10 M o menos (por ejemplo, 5,0 x 10-10 M -5,0 x 10-11 M). En otras realizaciones, la presente invención proporciona composiciones que comprenden una molécula de unión a CD20, donde la molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) para CD20 humano de 5,0 x 10-10 M o menos, y una velocidad de disociación (koff) para CD20 humano de 5,0 x 10-4 s-1 o menos.

En realizaciones adiciones, la molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) para CD20 humano de 1,5 x 10-10 M o menos. En algunas realizaciones, la molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) para CD20 humano de 1,0 x 10-10 M o menos. En ciertas realizaciones, la molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de disociación (koff) para CD20 humano de 2,5 x 10-4 s-1 o menos. En realizaciones particulares, la molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de disociación (koff) para CD20 humano de 1,0 x 10-4 s-1 o menos (por ejemplo, 1,0 x 10-4 s-1 -1,0 x 10-5 s-1). En algunas realizaciones, la molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de disociación (koff) para CD20 humano de 8,0 x 10-5 s-1 o menos. En realizaciones adicionales, la molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de asociación (kon) para CD20 humano de 1,0 x 105 M-1 s-1 o mayor (por ejemplo, 1,0 x

M-1 -1 M-1

105 s-1,0 x 106 s-1). En ciertas realizaciones, la molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de asociación (kon) para CD20 humano de 5,0 x 105 M-1 s-1 o mayor.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para tratar el linfoma de células B que comprende: a) proporcionar; i) un sujeto, y ii) una composición, donde la composición comprende una molécula de unión a CD20 de la presente invención; y b) administrar la composición al sujeto. En otras realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para tratar una enfermedad que comprende: a) proporcionar; i) un sujeto con síntomas de la enfermedad, y ii) una composición, donde la composición comprende las moléculas de unión a CD20 de la presente invención; y b) administrar la composición al sujeto de modo que se reduzcan o eliminen los síntomas. En realizaciones particulares, la enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en: enfermedad de Hodgkin reincidente, enfermedad de Hodgkin resistente de elevado grado, linfomas no Hodgkin de grado bajo y grado intermedio (NHL), leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), linfoma linfoplasmacitoide (LPL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfoma difuso de células grandes (DLCL), linfoma de Burkitt (BL), linfomas relacionados con el SIDA, linfoma de células B monocíticas, linfadenopatía angioinmunoblástica; linfoma linfocítico pequeño; de células foliculares grandes difusas; de células escindidas pequeñas difusas; linfoblastoma inmunoblástico de células grandes; linfoma pequeño no escindido; linfoma de Burkitt y no de Burkitt; de células foliculares predominantemente grandes; de células foliculares, predominantemente pequeñas escindidas; y de células foliculares mixtas pequeñas escindidas y grandes.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad (por ejemplo, cáncer) en un animal que requiera dicho tratamiento, comprendiendo dicho procedimiento administrar al animal una cantidad eficaz de las moléculas de unión a CD20 de la presente invención. En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona las moléculas de unión a CD20 de la presente invención para su uso como medicamento. En otras realizaciones, la presente invención proporciona las moléculas de unión a CD20 de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad (por ejemplo, NHL). En realizaciones particulares, la presente invención proporciona un agente farmacéutico para el tratamiento de una enfermedad (por ejemplo, cáncer) caracterizado por que contiene las moléculas de unión a Cd20 de la presente invención como sustancia activa.

En realizaciones preferidas, el sujeto (paciente) está no inmunosuprimido. Por ejemplo, el paciente puede tener una enfermedad tal como lupus sistémico eritematoso (SLE). Preferiblemente, una vez se ha administrado al sujeto no inmunodeprimido las moléculas de unión CD20, no se genera (o es insignificante) una respuesta HACA (respuesta de anticuerpos antiquiméricos humanos). En ciertas realizaciones, la dosificación administrada al sujeto es de aproximadamente 375 mg/m2 por semana durante cuatro semanas (sin generar una respuesta HACA). En algunas realizaciones, la dosificación administrada es de aproximadamente 50-300 mg/m2 por semana, o de aproximadamente 100-200 mg/m2 por semana, durante cuatro semanas (por ejemplo, para tratar leucemia linfocítica crónica (CLL)).

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para tratar el linfoma de células B que comprende: a) proporcionar; i) un sujeto, y ii) una composición, donde la composición comprende moléculas de unión a CD20 que tienen una afinidad de unión (Kd) para CD20 humano de 5,0 x 10-10 M o menos, y una velocidad de disociación (koff) para CD20 humano de 5,0 x 10-4 s-1 o menos; y b) administrar la composición al sujeto.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un procedimiento para eliminar células B periféricas en un sujeto que necesite dicho tratamiento que comprende: a) proporcionar; i) un sujeto, y ii) una composición, donde la composición comprende moléculas de unión a CD20 que tienen una afinidad de unión (Kd) para CD20 humano de 5,0 x 10-10 M o menos, y una velocidad de disociación (koff) para CD20 humano de 5,0 x 10-4 s-1 o menos; y b) administrar la composición al sujeto.

En algunas realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende una región flanqueante completamente humana. En otras realizaciones, la región variable de cadena ligera comprende una región flanqueante de la línea germinal humana. En realizaciones particulares, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 59 y 63. En ciertas realizaciones, la región variable de cadena pesada comprende una región flanqueante completamente humana. En otras realizaciones, la región flanqueante de cadena pesada comprende una región flanqueante de la línea germinal humana. En realizaciones adicionales, la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre 61 y 65.

En otras realizaciones, la molécula de unión a CD20 media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) a aproximadamente el mismo nivel de CE50 que el anticuerpo C2B8. En realizaciones adicionales, la molécula de unión a CD20 media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), con células mononucleares de sangre periférica humana como efectores y células de linfoma B como dianas, a aproximadamente el mismo nivel de CE50 que el anticuerpo C2B8. En algunas realizaciones, la molécula de unión a CD20 media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) a aproximadamente 1,5 a 2,0 veces la del nivel de CE50 del anticuerpo C2B8 (el anticuerpo C2B8 está depositado en la ATCC con el número 69119). En realizaciones adicionales, la molécula de unión a CD20 media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), con células mononucleares de sangre periférica humana como efectores y células de linfoma B como dianas, a aproximadamente 1,5 a 2,0 veces el nivel de CE50 del anticuerpo C2B8. En realizaciones adicionales, la molécula de unión a CD20 media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) a un nivel de CD50 10 veces el del anticuerpo C2B8 o mayor. En realizaciones adicionales, la molécula de unión a CD20 media la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), con células mononucleares de sangre periférica humana como efectores y células de linfoma B como dianas, a un nivel de CE50 10 veces el del anticuerpo C2B8 o mayor.

En algunas realizaciones, las moléculas de unión a CD20 comprenden una región flanqueante de cadena ligera de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, esta región flanqueante de la línea germinal humana de cadena ligera se selecciona entre V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4, y V5-6.

En otras realizaciones, las moléculas de unión a CD20 comprenden una región flanqueante de cadena pesada de la línea germinal humana. En realizaciones particulares, esta región flanqueante de la línea germinal humana de cadena pesada se selecciona entre VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31; VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, y VH7-81.

En algunas realizaciones, la molécula de unión a CD20 es un péptido o polipéptido. En ciertas realizaciones, el péptido de unión a CD20 comprende un anticuerpo anti-Cd20 o un fragmento de anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, Fv, Fab, F(ab')2, etc.). En otras realizaciones, el péptido comprende una región variable de cadena ligera y/o pesada. En realizaciones particulares, la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada comprende una región flanqueante o al menos una parte de una región flanqueante (por ejemplo, que contiene 2 ó 3 subregiones, tales como FR2 y FR3). En ciertas realizaciones, al menos FRL1, FRL2, FRL3, o FRL4 es completamente humana. En otras realizaciones, al menos FRH1, FRH2, FRH3, o FRH4 es completamente humana. En algunas realizaciones, al menos FRL1, FRL2, FRL3, o FRL4 es una secuencia de la línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana). En otras realizaciones, al menos FRH1, FRH2, FRH·, o FRH4 es una secuencia de la línea germinal (por ejemplo, línea germinal humana). En realizaciones preferidas, la región flanqueante es una región flanqueante completamente humana (por ejemplo, las regiones flanqueantes humanas mostradas en las Figuras 4-5 y 8-9). En algunas realizaciones, la región flanqueante comprende las SEC ID Nº 71, 72, 73, 74, 79, 80, 81, 82, o combinaciones de las mismas. En otras realizaciones, la región flanqueante comprende las SEC ID Nº 87, 88, 89, 90, 95, 96, 97, 98, o combinaciones de las mismas.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una media legible al ordenador que codifica una representación de una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos seleccionada entre las SEC ID Nº 1-70, o el complemento de las mismas. En ciertas realizaciones, la representación de estas secuencias, cuando se suministran a un procesador informático, pueden presentarse a un usuario (por ejemplo, mediante Internet).

En ciertas realizaciones, la presente invención proporcionas secuencias de ácido nucleico que hibridan (en condiciones de rigurosidad baja, media o alta) con la secuencia de ácido nucleico encontradas en las SEC ID Nº 170, o las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos encontradas en las SEC ID Nº 1-70.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el complemento de las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento (véase, por ejemplo, las Tablas 1-2, y las Figuras 2, 3, 6, 7, 10, y 11). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona secuencias que hibridan en rigurosidad alta, media o baja con las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento (véanse, por ejemplo, las Tablas 1-2, y las Figuras 2, 3, 6, 7, 10, y 11).

En ciertas realizaciones, la constante de afinidad (Kd) y la velocidad de asociación (Kon) se determinan en un ensayo de unión celular a IgG (es decir, células que expresan CD20 humano en su superficie), usando el software de equilibrio KinExa (por ejemplo, Sapidyne Instruments, Boise, Idaho). En algunas realizaciones, la constante de afinidad y la constante de la velocidad de asociación se determinan por un ensayo de exclusión cinética (véase, por ejemplo, Chiu y col., (2001) Anal. Chem., 73:5477-5484; Blake y col., (1996) Journal of Biological Chemistry, 271:27677-27685; Hongo y col., (2000) Hybridoma, 19:303-315; Khosraviani y col., (2000) Bioconjugate Chemistry, 11:267-277; y Powers y col., (2001) Journal of Immunological Methods, 251:123-135). En realizaciones particulares, el ensayo de exclusión cinética se realiza con un instrumento KinExA (por ejemplo, KinExATM3000 de Sapidyne instruments, Boise, Idaho), o dispositivos similares.

En otras realizaciones, la molécula de unión a CD20 comprende un Fab, y adicionalmente comprende una o más regiones constantes (por ejemplo, CH2 y/o CH3, véanse las Figuras 10-11). En realizaciones particulares, la molécula de unión a CD20 comprende un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región flanqueante completamente humana con secuencias CDR sintéticas). En ciertas realizaciones, el anticuerpo comprende una región Fc alterada (por ejemplo, mutada). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc se ha alterado para reducir o potenciar las funciones efectoras del anticuerpo. En algunas realizaciones, la región Fc es un isotipo seleccionado entre IgM, IgA, IgG, IgE, u otros isotipos.

En algunas realizaciones, la modificación o modificaciones de aminoácidos se introducen en el dominio CH2 de una región Fc de una molécula de unión a CD20. Las posiciones de aminoácidos útiles para la modificación para generar una región Fc de IgG variante con la afinidad de unión o actividad del receptor Fc gamma alterado (FcyR) incluyen uno cualquiera o más de las siguientes posiciones de aminoácidos: : 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300 301, 303, 305, 307, 309, 331,333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419,430, 434, 435, 437, 438 ó 439 de la región Fc de una molécula de unión a CD20. En realizaciones preferidas, la región Fc precursora usada como molde para generar dichas variantes comprende una región Fc de IgG humana. En algunas realizaciones, para generar la región Fc variante con unión reducida al FcγR se puede introducir una modificación de aminoácido en una cualquiera o más de las siguientes posiciones de aminoácidos: 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 ó 439 de la región Fc de una molécula de unión a CD20. En realizaciones particulares, también pueden crearse variantes de la región Fc con unión mejorada a uno o más FcγR. Dichas variantes de la región Fc pueden comprender una modificación de aminoácidos en una cualquiera o más de las siguientes posiciones de aminoácidos: 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 ó 430 de la región Fc de una molécula de unión a CD20. En ciertas realizaciones, la modificación de aminoácido es Y300I.

En otras realizaciones, la modificación de aminoácido es Y300L. En algunas realizaciones, la modificación de aminoácido es Q295K o Q295L. En ciertas realizaciones, la modificación de aminoácido es E294N. En otras realizaciones, la modificación de aminoácido en la posición 296 es Y296P. En algunas realizaciones, la modificación de aminoácido en la posición 298 es S298P. En otras realizaciones, la modificación de aminoácido es S298N, S298P, S298V o S298D.

En ciertas realizaciones, la molécula de unión a CD20 comprende una mutación de la región constante de cadena pesada. En otras realizaciones, la molécula de unión a CD20 comprende una región constante de cadena pesada con una mutación seleccionada entre D280H y K290S.

Como alternativa o adicionalmente, puede ser útil combinar modificaciones de aminoácidos con una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que alteren la unión de CIq y/o la función de citotoxicidad dependiente del complemento de la región Fc de una molécula de unión a CD20. El polipéptido de partida de particular interés puede ser uno que se una a CIq y presente citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Las sustituciones de aminoácidos descritas en este documento pueden servir para alterar la capacidad del polipéptido de partida de unirse a CIq y/o modificar su función de citotoxicidad dependiente del complemento (por ejemplo, para reducir y eliminar preferiblemente estas funciones efectoras). Sin embargo, se contemplan polipéptidos que comprenden sustituciones en una o más de las posiciones descritas con unión a CIq y/o una función de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mejoradas en este documento. Por ejemplo, el polipéptido de partida puede ser incapaz de unirse a CIq y/o mediar la CDC y puede modificarse de acuerdo con los contenidos de este documento de modo que adquiera estas funciones efectoras adicionales. Además, pueden modificarse polipéptidos con actividad de unión a CIq existente, que tengan opcionalmente la capacidad adicional de mediar la CDC de modo que se potencien una o ambas de estas actividades. Las modificaciones de aminoácidos que alteran la función CIq y/o modifican su función de citotoxicidad dependiente de complemento se describen, por ejemplo, en el documento WO0042072.

Como se ha analizado anteriormente, se puede diseñar una región Fc de una molécula de unión a CD20 con función efectora alterada, por ejemplo, modificando la unión a CIq y/o la unión a FyγR y cambiando de este modo la actividad CDC y/o la actividad ADCC. Por ejemplo, se puede generar una región Fc variante de una molécula de unión a CD20 con unión a CIq mejorada y unión a FcγRIII mejorada (por ejemplo, que tenga tanto actividad ADCC mejorada como actividad CDC mejorada). Como alternativa, cuando se desea reducir o eliminar la función efectora, puede diseñarse una región Fc variante con actividad CDC reducida y/o actividad ADCC reducida. En otras realizaciones, se puede aumentar solamente una de estas actividades, y opcionalmente también reducir la otra actividad (por ejemplo, para generar una región Fc variante con actividad ADCC mejorada, pero actividad CDC reducida y viceversa).

Las mutaciones Fc también pueden introducirse en las moléculas de unión a CD20 de la presente invención para alterar su interacción con el receptor Fc neonatal (FcRn) y mejorar sus propiedades farmacocinéticas. Varios experimentos sugieren que la interacción entre la región Fc de un anticuerpo y el FcRn desempeña una tarea en la persistencia de las inmunoglobulinas en suero. Por ejemplo, se observa una vida media en suero inusualmente corta para moléculas IgG en ratones que carecen de un FcRn funcional. Las mutaciones en Fc que mejoran la unión al FcRn parecen prolongar la vida media en suero y, a la inversa, las mutaciones en el FcRn de rata que provocan una mejor unión de IgG también mejoran la vida media en suero. También se ha descrito un conjunto de variantes de Fc humanas con unión mejorada al FcRn (Shields y col., (2001) High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for FcγRI, FcγR11, FcγRIII, and FcRn and desing of IgG1 variants with improved binding to the FcγR, J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Se ha informado de que la afinidad de unión aumentada de las moléculas IgG por el FcRn observado a bajo pH (por ejemplo, durante la pinocitosis o endocitosis en fase fluida de moléculas IgG del suero) impacta en la vida media en suero (Ghetie y col., (1997) Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis, Nat. Biotechnol. 15:637-640; Medesan y col., (1998) Comparative studies of rat IgG to further delineate the Fc:FcRn interaction site. Eur. J. Immunol. 28:2092-2100; Kim y col., (1999) Mapping the site on human IgG for binding of the MHC class I-related receptor, FcRn, Eur. J. Immunol. 29:2819-2825; Dall'Acqua y col., (2002) Increasing the affinity of a human IgGI for the neonatal Fc receptor: biological consequences, J. Immunol. 169:51715180). Sin embargo, mutaciones que aumentan la unión a alto pH parecen afectar de forma adversa a la vida media en suero (Dall'Acqua y col., (2002) Increasing the affinity of a human IgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences, J. Immunol. 169:5171-5180). Por lo tanto, las mutaciones en Fc podrían introducirse en las moléculas de unión a Cd20 de la presente invención para aumentar su afinidad por el FcRn a bajo pH pero mantener

o disminuir su afinidad por el FcRn a mayor pH.

Otro tipo de sustitución de aminoácidos sirve para alterar el patrón de glicosilación de la región Fc de una molécula de unión a CD20. Esto puede conseguirse, por ejemplo, delecionando uno o más sitios de glicosilación hallados en el polipéptido, y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido. La glicosilación de una región Fc está típicamente unida a N o unida a O. Unida a N se refiera a la unión de un resto de carbohidrato a la cadena lateral de un resto asparagina. Las secuencias peptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias peptídicas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glicosilación unida a O se refiera a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más habitualmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación a la región Fc de una molécula de unión a CD20 se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unidos a N). Una variante de glicosilación ejemplar tiene una sustitución de aminoácido del resto Asn 297 de la cadena pesada. La alteración también puede hacerse por la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina en la secuencia del polipéptido original (para sitios de glicosilación unidos a O).

En ciertas realizaciones, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención se expresan en células que expresan beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT III), de modo que GnT III añade GlcNAc a las moléculas de unión a CD20. Los procedimientos para producir moléculas de unión en dicho modo se proporcionan en los documentos WO9954342, WO03011878, la publicación de patente 20020002097A1, y Umana y col., Nature Biotechnology, 17:176-180, Feb. 1999.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona kits que comprenden: a) una molécula de unión a CD20 de la presente invención; y b) instrucciones para usar la molécula de unión a CD20 para tratar una enfermedad en un sujeto o instrucciones para emplear la molécula de unión a CD20 para investigación científica o propósitos de diagnóstico (por ejemplo, para realizar ensayos ELISA, etc.). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona líneas celulares transfectadas de forma estable o transitoria con secuencias de ácido nucleico que codifica las moléculas de unión a CD20 de la presente invención.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una representación esquemática de una molécula IgG con las diversas regiones y secciones marcadas. También están marcadas las CDR y las regiones flanqueantes (FR) de una de las dos cadenas ligeras de región variable, y una de las dos cadenas pesadas de región variable.

La Figura 2A muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de AME 33 (SEC ID Nº 59), y la Figura 2B muestra la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera de AME 33 (SEC ID Nº 60).

La Figura 3A muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de AME 33 (SEC ID Nº 61) y la Figura 3B muestra la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada de AME 33 (SEC ID Nº 62).

La Figura 4A muestra la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante de cadena ligera completamente humana VkIII (A27) (DPK22) con CDR intercaladas. Las cuatro subregiones flanqueantes están marcadas del siguiente modo: FRL1 (SEC ID Nº 71), FRL2 (SEC ID Nº 72), FRL3 (SEC ID Nº 73), y FRL4 (SEC ID Nº 74). La Figura 4B muestra la secuencia de ácido nucleico de la región flanqueante de cadena ligera humana VkIII (A27) (DPK22) con CDR intercaladas. Las cuatro subregiones flanqueantes están marcadas del siguiente modo: FRL1 (SEC ID Nº 75), FRL2 (SEC ID Nº 76), FRL3 (SEC ID Nº 77), y FRL4 (SEC ID Nº 78).

La Figura 5A muestra la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante de cadena pesada humana VH5-51 (DP-73) con CDR intercaladas. Las cuatro subregiones flanqueantes están marcadas del siguiente modo: FRH1 (SEC ID Nº 79), FRH2 (SEC ID Nº 80), FRH3 (SEC ID Nº 81), y FRH4 (SEC ID Nº 82). La Figura 5B muestra la secuencia de ácido nucleico de la región flanqueante de cadena pesada humana V5-51 (DP-73) con CDR intercaladas. Las cuatro subregiones flanqueantes están marcadas del siguiente modo: FRH1 (SEC ID Nº 83), FRH2 (SEC ID Nº 84), FRH3 (SEC ID Nº 85), y FRH4 (SEC ID Nº 86).

La Figura 6A muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de AME 5 (SEC ID Nº 63), y la Figura 6B muestra la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera de AME 5 (SEC ID Nº 64).

La Figura 7A muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de AME 5 (SEC ID Nº 65), y la Figura 7B muestra la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada de AME 5 (SEC ID Nº 66).

La Figura 8A muestra la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante de cadena ligera humana VkI (DPK4) (A20) con CDR intercaladas. Las cuatro subregiones flanqueantes están marcadas del siguiente modo: FRL1 (SEC ID Nº 87), FRL2 (SEC ID Nº 88), FRL3 (SEC ID Nº 89), y FRL4 (SEC ID Nº 90). La Figura 8B muestra la secuencia de ácido nucleico de la región flanqueante de cadena ligera humana Vkl (DPK4) (A20) con CDR intercaladas. Las cuatro subregiones flanqueantes están marcadas del siguiente modo: FRL1 (SEC ID Nº 91), FRL2 (SEC ID Nº 92), FRL3 (SEC ID Nº 93), y FRL4 (SEC ID Nº 94).

La Figura 9A muestra la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante de cadena pesada humana VHI DP7/21-2 con CDR intercaladas. Las cuatro subregiones flanqueantes están marcadas del siguiente modo: FRH1 (SEC ID Nº 95), FRH2 (SEC ID Nº 96), FRH3 (SEC ID Nº 97), y FRH4 (SEC ID Nº 98). La Figura 9B muestra la secuencia de ácido nucleico de la región flanqueante de cadena pesada humana VHI DP7/21-2 con CDR intercaladas. Las cuatro subregiones flanqueantes están marcadas del siguiente modo: FRH1 (SEC ID Nº 99), FRH2 (SEC ID Nº 100), FRH3 (SEC ID Nº 101), y FRH4 (SEC ID Nº 102).

La Figura 10A muestra la secuencia de aminoácidos completa de la cadena ligera de AME 33 (SEC ID Nº 67), y la Figura 10B muestra la secuencia de ácido nucleico completa de la cadena ligera de AME 33 (SEC ID Nº 68).

La Figura 11A muestra la secuencia de aminoácidos completa de la cadena pesada de AME 33 (SEC ID Nº 69), y la Figura 10B muestra la secuencia de ácido nucleico completa de la cadena pesada de AME 33 (SEC ID Nº 70).

Las Figuras 12 y 13 muestran los resultados del ensayo de unión ELISA descrito en el Ejemplo 2.

La Figura 14 muestra los resultados de los ensayos de unión de Fab a linfoma B en vivo descritos en el Ejemplo 3.

La Figura 15 muestra los resultados del ensayo de ADCC descritos en el Ejemplo 5.

La Figura 16 muestra la actividad ADCC de la molécula de unión a CD20 glico-diseñada descrita en el Ejemplo 6.

La Figura 17 muestra los resultados de un ensayo de inhibición tumoral in vivo descrito en el Ejemplo 9 que implica el anticuerpo AME 33 y el anticuerpo C2B8.

Definiciones

Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se definen varios términos.

El término "anticuerpo", como se usa en este documento, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3 (véase la Figura 1). Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en este documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL (véase la Figura 1). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones flanqueantes (FR). Cada región variable (VH o VL) contiene 3 CDR, denominadas CDR1, CDR2 y CDR3 (véanse las Figuras 1, 4, y 5). Cada región variable también contiene 4 subregiones flanqueantes, denominadas FR1, FR2, FR3 y FR4 (véanse las Figuras 1, 4, y 5).

Como se usa en este documento, la expresión "fragmentos de anticuerpos" se refiere a una parte de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, fragmentos Fv, Fab y F(ab')2, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo preferiblemente retienen al menos parte de la región variable de cadena pesada y/o ligera.

Como se usa en este documento, las expresiones "región determinante de complementariedad" y "CDR" se refieren a las regiones que son principalmente responsables de la unión al antígeno. Hay tres CDR en una región variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2, y CDRL3), y tres CDR en una región variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2, y CDRH3). Los restos que componen estas seis CDR se han caracterizado por Kabat y Chothia del siguiente modo: restos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) y 89-97 (CDRL3) en la región variable de cadena ligera y 31-35 (CDRH1), 5065 (CDRH2) y 95-102 (CDRH3) en la región variable de cadena pesada; Kabat y col., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD los restos 26-32 (CDRL1), 50-52 (CDRL2) y 91-96 (CDRL3) en la región variable de cadena ligera y 26-32 (CDRH1), 53-55 (CDRH2) y 96-101 (CDRH3) en la región variable de cadena pesada; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901-907. Salvo que se especifique de otro modo, los términos "región determinante de complementariedad" y "CDR" como se usan en este documento, incluyen los restos que abarcan tanto las definiciones de Kabat y Chothia (es decir, los restos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2), y 89-97 (CDRL3) en la región variable de cadena ligera; y 26-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2), y 95-102 (CDRH3)). Además, salvo que se especifique, como se usa en este documento, la numeración de los restos de las CDR es de acuerdo con Kabat.

Como se usa en este documento, el término "flanqueante" se refiere a los restos de la región variable diferentes a los restos de las CDR como se define en este documento. Hay cuatro subregiones flanqueantes diferentes que componen la región flanqueante: FR1, FR2, FR3, y FR4 (véanse las Figuras 1, 4, y 5). Para indicar si la subregión flanqueante está en la región variable de cadena ligera o pesada, puede añadirse una "L" o "H" a la abreviatura de la subregión (por ejemplo, "FRL1" indica la subregión flanqueante 1 de la región variable de cadena ligera). Salvo que se especifique, la numeración de los restos flanqueantes es de acuerdo con Kabat. Se indica que, en ciertas realizaciones, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención pueden tener menos de una región flanqueante completa (por ejemplo, la molécula de unión a CD20 puede tener una parte de una región flanqueante que solamente contenga una o más de las cuatro subregiones).

Como se usa en este documento, la expresión "región flanqueante completamente humana" significa una región flanqueante con una secuencia de aminoácidos encontrada de forma natural en seres humanos. Los ejemplos de regiones flanqueantes completamente humana incluyen, aunque sin limitación, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (véase, por ejemplo, Kabat y col., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Departamente of Health and Human Services, NIH, USA; y Wu y col., (1970) J. Exp. Med. 132:211-250).

Como se usa en este documento, los términos "sujeto" y "paciente" se refieren a cualquier animal, tal como un mamífero como un perro, gato, pájaro, ganado, y preferiblemente un ser humano.

Como se usa en este documento, el término "codón" o "triplete" se refiera a un grupo de tres monómeros nucleotídicos adyacentes que especifican uno de los aminoácidos de origen natural encontrados en los polipéptidos. El término también incluye codones que no especifican ningún aminoácido. También se aprecia que, debido a la degeneración del código genético, hay muchos codones que codifican el mismo aminoácido. Por tanto, muchas de las bases de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención (véase, por ejemplo, las Tablas 1 y 2) pueden cambiarse sin cambiar la secuencia real de aminoácidos que está codificada. La presente invención pretende abarcar todas estas secuencias de ácido nucleico.

Como se usa en este documento, las expresiones "un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido", "polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido", y "secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido" significan una secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificante de un polipéptido particular. La región codificante puede estar presente en forma de ADNc, ADN genómico, o ARN. Cuando está presente en una forma de ADN, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser monocatenario (es decir, la cadena con sentido) o bicatenario. Pueden colocarse elementos de control adecuados tales como potenciadores/promotores, uniones de corte y empalme, señales de poliadeniltación, etc. en cercana proximidad a la región codificante del gen si se necesita permitir un inicio apropiado de la transcripción y/o corregir el procesamiento del transcrito de ARN primario. Como alternativa, la región codificante utilizada en los vectores de expresión de la presente invención puede contener potenciadores/promotores endógenos, uniones de corte y empalme, secuencias intermedias, señales de poliadenilación, etc., o una combinación de elementos de control tanto endógenos como exógenos.

Además, como se usa en este documento, no existe límite de tamaño o distinción de tamaño entre los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido". Ambos términos simplemente se refieren a moléculas compuestas de nucleótidos. Así mismo, no existe distinción de tamaño entre los términos "péptido" y "polipéptido". Ambos términos simplemente se refieren a moléculas compuestas de restos aminoacídicos.

Como se usa en este documento, los términos "complementario" o "complementariedad" se usan en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las normas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia %5'-A-G-T 3", es complementaria a la secuencia "3-T-C-A-5'". La complementariedad puede ser "parcial", en la que solamente algunas de las bases del ácido nucleico están apareadas de acuerdo con las normas de apareamiento de bases o, puede ser complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas del ácido nucleico tiene efectos significativos sobra la eficacia y fuerza de la hibridación.

Como se usa en este documento, el término "el complemento de" una secuencia dada se usa en referencia a la secuencia que es completamente complementaria a la secuencia sobre su longitud completa. Por ejemplo, la secuencia 5'-A-G-T-A-3' es "el complemento" de la secuencia 3'-T-C-A-T-5'. La presente invención también proporciona el complemento de las secuencias descritas en este documento (por ejemplo, el complemento de la secuencias de ácido nucleico en las SEC ID Nº 1-70).

Como se usa en este documento, el término "hibridación" se usa en referencia al apareamiento de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) está influida por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, la rigurosidad de las condiciones implicadas, la Tm del híbrido formado, y la proporción de G:C dentro de los ácidos nucleicos.

Como se usa en este documento, el término "rigurosidad" se usa en referencia a las condiciones de temperatura, fuerza iónica, y la presencia de otros compuestos tales como disolventes orgánicos, en la que se realiza las hibridaciones de ácido nucleico. Los especialistas en la técnica reconocerán que las condiciones de "rigurosidad" pueden alterarse variando los parámetros recién descritos de forma individual o en concierto. Con condiciones de "alta rigurosidad", el apareamiento de bases de ácido nucleico sucederá solamente entre fragmentos de ácido nucleico que tienen una alta frecuencia de secuencias de bases complementarias (por ejemplo, hibridación en condiciones de "alta rigurosidad" puede suceder entre homólogos con una identidad de aproximadamente el 85100%, preferiblemente una identidad de aproximadamente el 70-100%). Con condiciones de rigurosidad media, el apareamiento de bases del ácido nucleico sucederá entre ácidos nucleicos con una frecuencia intermedia de secuencias de bases complementarias (por ejemplo, la hibridación en condiciones de "rigurosidad media" puede suceder entre homólogos con una identidad de aproximadamente el 50-70%). Con condiciones de rigurosidad media, el apareamiento de bases del ácido nucleico sucederá entre ácidos nucleicos con una frecuencia intermedia de secuencias de bases complementarias (por ejemplo, la hibridación en condiciones de "rigurosidad media" puede suceder entre homólogos con una identidad de aproximadamente el 50-70%). Por tanto, las condiciones de rigurosidad "débil" o "baja" a menudo son necesarias con ácidos nucleicos que se obtiene de organismos que son genéticamente diversos, ya que la frecuencia de secuencias complementarias habitualmente es menor.

Cuando se usa "condiciones de elevada rigurosidad" en referencia a hibridación de ácidos nucleico comprende condiciones equivalentes a unión o hibridación a 42ºC en una solución compuesta por 5X SSPE (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4H2O y 1,85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), SDS al 0,5%, 5X reactivo de Denhardt [Denhardt 50X contiene por 500 ml: 5 g de Ficoll (Type 400, Pharmacia), 5 g de BSA (Fraction V; Sigma)] y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una solución compuesta por 0,1X SSPE, SDS al 1,0% a 42ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

Cuando se usa "condiciones de rigurosidad media" en referencia a hibridación de ácidos nucleicos comprende condiciones equivales a unión o hibridación a 42ºC en una solución compuesta por 5X SSPE, SDS al 0,5%, 5X reactivo de Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido por lavado en una solución que comprende 1,0X SSPE, SDS al 1,0% a 42ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

Las "condiciones de baja rigurosidad" comprende condiciones equivalentes a unión o hibridación a 42ºC en una solución compuesta por 5X SSPE, SDS al 0,1%, 5X reactivo de Denhardt y 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido por lavado en una solución que comprende 5X SSPE, SDS al 0,1% a 42ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.

El término "aislado" cuando se usa en relación a un ácido nucleico, como en "un oligonucleótido aislado" o "polinucleótido aislado" o "secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una molécula de unión a CD20" (véanse, por ejemplo, las Tablas 1-2) se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se identifica y separa de la menos un ácido nucleico contaminante con el que está habitualmente asociado (por ejemplo, proteínas de la célula huésped).

Como se usa en este documento, los términos "parte" cuando se usan en referencia a una secuencia de nucleótidos (como en "una parte de una secuencia de nucleótidos dada") se refieren a fragmentos de esa secuencia. Los fragmentos pueden variar en tamaño de diez nucleótidos a la secuencia de nucleótidos completa menos un nucleótido (por ejemplo, 10 nucleótidos, 20, 30, 40, 50, 100, 200, etc.).

Como se usa en este documento, el término "purificado" o "purificar" se refiere a la eliminación de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para CD20 pueden purificarse eliminando proteínas no inmunoglobulinas contaminantes; también se purifican por la eliminación de inmunoglobulinas que no se unen al mismo antígeno. La eliminación de proteínas no inmunoglobulina y/o la eliminación de inmunoglobulinas que no se unen al antígeno particular provoca un aumento en el porcentaje de inmunoglobulinas específicas de antígeno en la muestra. En otro ejemplo, se expresan polipéptidos específicos de antígeno recombinantes en células huésped bacterianas y los polipéptidos se purifican por la eliminación de las proteínas de la célula huésped; el porcentaje de polipéptidos específicos de antígeno recombinante se aumenta de este modo en la muestra.

Como se usa en este documento, el término "vector" se usa en referencia a moléculas de ácido nucleico que transfieren segmento o segmentos de ADN de una célula a otra. El término "vehículo" a veces se usa de forma intercambiable con "vector".

El término "vector de expresión" como se usa en este documento se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia codificante deseada y se secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida de forma funcional en un organismo huésped particular. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas habitualmente incluyen un promotor, un operador (opcional), y un sitio de unión al ribosoma, a menudo junto con otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores, y señales de terminación y poliadenilación.

Como se usa en este documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier célula eucariota o procariota (por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli, células de levadura, células de mamífero tales como PER.C6TM (Crucell, the Netherlands) y células CHO, células de aves, células de anfibio, células de plantas, células de peces, y células de insectos), estén localizadas in vitro o in vivo. Por ejemplo, las células huésped pueden estar localizadas en un animal transgénico.

Como se usa en este documento, los términos "memoria de ordenador" y "dispositivo de memoria de ordenador" se refiere a cualquier medio de almacenamiento legible por un procesador de ordenador. Los ejemplos de memoria de ordenador incluyen, aunque sin limitación, RAM, ROM, chips de ordenador, discos de vídeo digital (DVD), discos compactos (CD), unidades de disco duro (HDD), y cintas magnéticas.

Como se usa en este documento, la expresión "medio legible en ordenador" se refiere a cualquier dispositivo o sistema para el almacenar y proporcionar información (por ejemplo, datos e instrucciones) a un procesador informático. Los ejemplos de medios legibles en ordenador incluyen, aunque sin limitación, DVD, CD, unidades de disco duro, cintas magnéticas y servidores para distribuir los medios sobre las redes.

Como se usa en este documento, la expresión "medio legible en ordenador que codifica una representación" de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos, se refiere a un medio legible en ordenador que tiene información almacenada en el mismo, que cuando se proporciona a un procesador, permite presentar la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos a un usuario (por ejemplo, impresa o presentada en una pantalla).

Como se usa en este documento, los términos "procesador" y "unidad de procesamiento central" o "CPU" se usan de forma intercambiable y se refieren a un dispositivo que es capaz de leer un programa a partir de una memoria informática (por ejemplo, ROM u otra memoria informática) y realizar una serie de etapas de acuerdo con el programa.

Como se usa en este documento, el término "región Fc" se refiere a una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1). La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante (por ejemplo, con funciones efectoras aumentadas o disminuidas).

Como se usa en este documento, una región Fc puede tener "funciones efectoras" que son responsables de activar

o disminuir una actividad biológica (por ejemplo, en un sujeto). Los ejemplos de funciones efectoras incluyen, aunque sin limitación: unión a CIq; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de los receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras pueden requerir que la función Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable del anticuerpo) y puede evaluarse usando diversos ensayos (por ejemplo, ensayos de unión a Fc, ensayos de ADCC, ensayos de CDC, etc.).

Como se usa en este documento, un péptido, polipéptido, o proteína "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que impedirían los usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden influir encimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En ciertas realizaciones, el polipéptido aislado está purificado (1) a más del 95% en peso de los polipéptidos según se determina por el procedimiento de Lowry, y preferiblemente, más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna por uso de un secuenciador de cubeta en centrifugación, o (3) hasta homogeneidad por SDS-page en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie, o tinzión con plata. Un polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ con células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Habitualmente, sin embargo, un polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

Como se usa en este documento, el término "tratamiento" se refiere al tratamiento tanto terapéutico como a medias profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen un trastorno así como aquellos que tiene que evitarse el trastorno.

La expresión "en condiciones de modo que se reduzcan los síntomas" se refiere a cualquier grado de reducción cualitativa o cuantitativa en síntomas detectables de cualquier enfermedad tratable por moléculas de unión a CD20, incluyendo, aunque sin limitación, un impacto detectable sobre la tasa de recuperación de la enfermedad (por ejemplo, tasa de ganancia de peso), o la reducción de al menos uno de los síntomas habitualmente asociado con la enfermedad particular.

El término "CD20 humana" (abreviado en este documento como hCD20), como se usa en este documento, pretende hacer referencia al antígeno de diferenciación restringido a linfocitos B humanos (también conocido como Bp35). CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de células pre-B y permanece hasta la diferenciación celular en plasma. La molécula CD20 puede regular una etapa en el proceso de activación que es necesario para el inicio del ciclo celular y la diferenciación, y habitualmente se expresa a niveles muy altos en células B neoplásicas. CD20 está presente tanto en células B "normales" así como en células B "malignas" (es decir, aquellas células B cuya proliferación no moderada puede conducir a linfoma de células B).

Los términos "afinidad", "afinidad de unión" y "Kd" se refieren a la constante de disociación en equilibrio (expresada en unidades de concentración) asociada con cada molécula de unión a CD20 = complejo de proteína CD20. La afinidad de unión está directamente relacionada con la proporción de la constante de disociación (generalmente presentada en unidades de tiempo inverso, por ejemplo, segundos-1) a la constante de asociación (generalmente presentada en unidades de concentración por unidad de tiempo, por ejemplo, molar/segundo). La afinidad de unión puede determinarse por, por ejemplo, en ensayo ELISA, ensayo de exclusión cinética o resonancia de plasmón superficial. Se observa que pueden existir ciertos epítopes de forma repetitiva (multivalentes) en una superficie celular y que la constante de disociación (koff) para la unión de un anticuerpo a un epítope repetitivo puede disminuirse enormemente sobre la constante de disociación para la reacción del mismo anticuerpo con el ligando correspondiente en forma univalente. La constante de disociación disminuida se eleva porque cuando un enlace anticuerpo-ligando se disocia, otros enlaces mantienen el anticuerpo ambivalente (o multivalente) con el ligando multivalente, permitiendo que se forme de nuevo el enlace disociado. La constante de disociación para la reacción entre Ab bivalente (o multivalente) y ligando multivalente se ha llamado afinidad funcional para contrastarla con la afinidad intrínseca, que es la constante de asociación para anticuerpos que representan un sitio individual.

Los términos "disociación", "velocidad de disociación" y "koff" como se usan en este documento, pretenden hacer referencia a la constante de disociación para la disociación de una molécula de unión a CD20 del complejo anticuerpo/antígeno.

Los términos "asociación", "velocidad de asociación" y "kon" como se usan en este documento, pretenden hacer referencia a la constante de asociación para la asociación de una molécula de unión a CD20 con un antígeno para formar un complejo anticuerpo/antígeno.

Los términos "concentración eficaz" y "EC50" como se usan en este documento, pretenden hacer referencia a la concentración de una molécula de unión a CD20 capaz de interaccionar con suficientes cantidades de moléculas CD20 para producir un efecto sobre aproximadamente el 50% de las células tratadas.

5 Descripción de la invención

La presente invención proporciona moléculas de unión a CD20 y secuencias de ácido nucleico que codifican moléculas de unión a CD20. En particular, la presente invención proporciona moléculas de unión a CD20 con una elevada afinidad de unión, y una baja velocidad de disociación, con respecto a CD20 humano. Preferiblemente, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención comprenden regiones variables de cadena ligera y/o pesada

10 con regiones flanqueantes completamente humanas (por ejemplo, regiones flanqueantes de la línea germinal humana). La descripción de la invención se divide en las siguientes secciones por conveniencia: I. Moléculas de unión a CD20; II. Generación de moléculas de unión a CD20; III. Formulaciones y usos terapéuticos; y IV. Usos adicionales de la molécula de unión a CD20.

I. Moléculas de unión a CD20

15 La presente invención proporciona moléculas de unión a CD20 con características deseadas. En particular, en algunas realizaciones, las moléculas de unión a CD20 tienen una elevada afinidad de unión (Kd) con respecto a CD20 humano. En ciertas realizaciones, las moléculas de unión a CD20 tienen una baja velocidad de disociación (koff) con respecto a CD20 humano. En realizaciones preferidas, las moléculas de unión a CD20α de la presente invención tienen una elevada afinidad de unión, una baja velocidad de disociación y son eficaces a bajas

20 concentraciones. Aunque no es necesario para poner en práctica o entender la invención, se cree que las moléculas de unión a CD20 de la presente invención, con elevada afinidad de unión, y una baja velocidad de disociación, son particularmente muy adecuadas para uso terapéutico en seres humanos y tienen una menor probabilidad de provocar una respuesta HACA que otras moléculas anti-CD20, tales como RITUXAN (C2B8).

En realizaciones adicionales, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención se unen a CD20 humano. En

25 otras realizaciones, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención se unen a CD20 sobre la superficie de células B de macacos cynomolgus.

En realizaciones preferidas, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención comprenden una región variable de cadena ligera y/o pesada, que tiene preferiblemente una región flanqueante completamente humana. En realizaciones particularmente preferidas, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención comprenden una 30 región variable de cadena ligera y/o pesada, que tiene preferiblemente una región flanqueante de la línea germinal humana. Aunque no es necesario para poner en práctica o entender la invención, se cree que las moléculas de unión a CD20 de la presente invención (véanse, por ejemplo, los siguientes Ejemplos) provocarán una muy pequeña

o ninguna respuesta inmunogénica cuando se administren a un ser humano (por ejemplo, para tratar una enfermedad), ya que las regiones flanqueantes pueden ser completamente humanas.

35 Como se describe a continuación en las Tablas 1 y 2, la presente invención proporciona numerosas CDR útiles para generar moléculas de unión a CD20. Por ejemplo, pueden combinarse una o más de las CDR mostradas con una subregión flanqueante 8por ejemplo, FR1, FR2, FR3, o FR4 completamente humanas) para generar un péptido de unión a CD20, o una secuencia de ácido nucleico que codifique un péptido de unión a CD20. Además, las CDR mostradas en las siguientes tablas pueden combinarse, por ejemplo, de modo que estén presentes tres CDR en una

40 región variable de cadena ligera, y/o estén presentes tres CDR en una región variable de cadena pesada.

Las CDR mostradas a continuación pueden insertarse en una región flanqueante humana (por ejemplo, por técnicas recombinantes) en las regiones flanqueantes de cadena ligera y pesada mostradas en las Figuras 4-5 y 8-9 para generar moléculas de unión a CD20 o secuencias de ácido nucleico que codifiquen moléculas de unión a CD20. Por ejemplo, la CDRL1 mostrada en la Figura 4A (u 8A) podría reemplazarse por las SEC ID Nº 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,

45 17, 19, ó 21 como se muestra en la Tabla 1. Asimismo, la CDRL1 mostrada en la Figura 4B (u 8B) podría reemplazarse por las SEC ID Nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, ó 22 como se muestra en la Tabla 1. Este mismo procedimiento puede usarse con todas las CDR mostradas en las Tablas 1-2. Las Tablas 1 y 2 se muestran inmediatamente a continuación.

TABLA 1 -CDR de cadena ligera

SEC ID Nº: Nombre CDR* Secuencia

SEC ID Nº 1: CDRL1 RASSSVSYIH

SEC ID Nº 2: CDRL1 AGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCAC

SEC ID Nº 3: CDRL1 RASSSVHYIH

(continuación)

SEC ID Nº: Nombre CDR* Secuencia

SEC ID Nº 4: CDRL1 AGGGCCAGCTCAAGTGTACATTACATCCAC

SEC ID Nº 5: CDRL1 RASSSVPYIH

SEC ID Nº 6: CDRL1 AGGGCCAGCTCAAGTGTACCGTACATCCAC

SEC ID Nº 7: CDRL2 ATSNLAS

SEC ID Nº 8: CDRL2 GCCACATCCAACCTGGCTTCT

SEC ID Nº 9: CDRL2 ATTNLAT

SEC ID Nº 10: CDRL2 GCCACAACCAACCTGGCTACG

SEC ID Nº 11: CDRL2 ATSGLAS

SEC ID Nº 12: CDRL2 GCCACATCCGGCCTGGCTTCT

SEC ID Nº 13: CDRL2 ATSALAS

SEC ID Nº 14: CDRL2 GCCACATCCGCTCTGGCTTCT

SEC ID Nº 15: CDRL3 QQWTSNPPT

SEC ID Nº 16: CDRL3 CAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCACG

SEC ID Nº 17: CDRL3 QQWTFNPPT

SEC ID Nº 18: CDRL3 CAGCAGTGGACTTTTAACCCACCCACG

SEC ID Nº 9: CDRL3 QQWLSNPPT

SEC ID Nº 20: CDRL3 CAGCAGTGGCTGAGTAACCCACCCACT

SEC ID Nº 21: CDRL3 QTWTFNPPT

SEC ID Nº 22: CDRL3 CAGACTTGGACTTTTAACCCTCCCACG

*Se usó el trabajo de Kabat para numerar los restos. Las CDR incluyen restos de Kabat y Chotia.

TABLA 2 -CDR de cadena pesada

SEC ID Nº: Nombre CDR* Secuencia

SEC ID Nº 23: CDRH1 GYTFTSYNMH

SEC ID Nº 24: CDRH1 GGATACACCTTCACCAGCTACAATATGCAC

SEC ID Nº 25: CDRH1 GRTFTSYNMH

SEC ID Nº 26: CDRH1 GGCCGTACATTTACCAGTTACAATATGCAC

SEC ID Nº 27: CDRH2 AIYPGNGDTSYNQKFKG

SEC ID Nº 28: CDRH2 GCCATCTATCCTGGAAATGGTGATACAAGC TACAATCAGAAGTTCAAAGGC

SEC ID Nº 29: CDRH2 AIYPGNGDTSYNHKHKG

SEC ID Nº 30: CDRH2 GCCATCTATCCTGGAAATGGTGATACAAGC TACAATCATAAGCATAAAGGG

SEC ID Nº 31: CDRH2 PGNGDTSYNQKFKW

(continuación)

SEC ID Nº: Nombre CDR* Secuencia

SEC ID Nº 32: CDRH2 GCCATCTATCCTGGAAATGGTGATA CAAGCTACAATCAGAAGTTTAAATGG

SEC ID Nº 33: CDRH2 AIYPLNGDTSYNQKFKL

SEC ID Nº 34: CDRH2 GCTATTTATCCCTTGAATGGTGATA CTTCCTACAATCAGAAGTTCAAACTC

SEC ID Nº 35: CDRH2 AIYPLNGDTSYNRKSKL

SEC ID Nº 36: CDRH2 GCTATTTATCCCTTGAATGGTGATA CTTCCTACAATCGTAAGTCGAAACTC

SEC ID Nº 37: CDRH2 AIYPLTGDTSYNQKFKL

SEC ID Nº 38: CDRH2 GCTATTTATCCCTTGACGGGTGATAC TTCCTACAATCAGAAGTTCAAACTC

SEC ID Nº 39: CDRH2 AIYPLTGDTSYNQKSKL

SEC ID Nº 40: CDRH2 GCTATTTATCCCTTGACGGGTGATAC TTCCTACAATCAGAAGTCGAAACTC

SEC ID Nº 41: CDRH3 STYYGGDWYFDV

SEC ID Nº 42: CDRH3 TCGACTTACTACGGCGGTGACTGGTACTTC GATGTC

SEC ID Nº 43: CDRH3 STYYGGDWQFDV

SEC ID Nº 44: CDRH3 TCGACTTACTACGGCGGTGACTGGCAGTTC GACGTC

SEC ID Nº 45: CDRH3 STYYGGDWQFDE

SEC ID Nº 46: CDRH3 TCGACTTATTACGGCGGTGACTGGCAGTTCGACGAG

SEC ID Nº 47: CDRH3 STYYGGDWQFDQ

SEC ID Nº 48: CDRH3 TCGACTTATTACGGCGGTGACTGGCAGTTC GACCAG

SEC ID Nº 49: CDRH3 STYYGGDWSFDV

SEC ID Nº 50: CDRH3 TCGACTTACTACGGCGGTGACTGGAGTTTCGATGTC

SEC ID Nº 51: CDRH3 STYYGGDWTFDV

SEC ID Nº 52: CDRH3 TCGACTTACTACGGCGGTGACTGGACTTTCGATGTC

SEC ID Nº 53: CDRH3 STYVGGDWTFDV

SEC ID Nº 54: CDRH3 TCGACTTACGTGGGCGGTGACTGGACTTTCGATGTC

SEC ID Nº 55: CDRH3 SYYVGGDWTFDV

SEC ID Nº 56: CDRH3 TCGTATTACGTGGGCGGTGACTGGACTTTCGATGTC

SEC ID Nº 57: CDRH3 STYVGGDWQFDV

SEC ID Nº 58: CDRH3 TCGACTTACGTGGGCGGTGACTGGCAGTTCGATGTC

La presente invención también proporciona secuencias que son sustancialmente iguales a las secuencias CDR (tanto de aminoácidos como de ácido nucleico) mostradas en las tablas anteriores. Por ejemplo, puede cambiarse uno o dos aminoácidos en las secuencias mostradas en las tablas.

También por ejemplo, pueden cambiarse varias bases nucleotídicas en las secuencias mostradas en las tablas. Los

5 cambios en las secuencias de aminoácidos pueden generarse cambiando las secuencias de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos. Una secuencia de ácido nucleico que codifique una variante de una CDR dada puede prepararse por métodos conocidos en la técnica usando las directrices de la presente memoria descriptiva para secuencias particulares. Estos procedimientos incluyen, aunque sin limitación, la preparación por mutagénesis dirigida al sitio (o mediada por oligonucleótidos), mutagénesis por PCR y mutagénesis por casete de un ácido nucleico preparado anteriormente que codifique la CDR. La mutagénesis dirigida al sitio es un procedimiento preferido para preparar variantes de sustitución. Esta técnica es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Carter y col., (1985) Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 y Kunkel, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492).

En resumen, al realizar la mutagénesis dirigida al sitio de ADN, el ADN de partida se altera hibridando primero un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con una cadena sencilla de dicho ADN de partida. Después de la

15 hibridación, se usa un ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena completa, usando el oligonucleótido hibridado como cebador, y usando la cadena sencilla del ADN de partida como molde. Por tanto, el oligonucleótido que codifica la mutación deseada se incorpora en el ADN bicatenario resultante.

La mutagénesis por PCR también es adecuada para preparar secuencias de aminoácidos variantes de la CDR de partida (véase, por ejemplo, Vallette y col., (1989) Nucleic Acids Res. 17: 723-733). En resumen, cuando se usan pequeñas cantidades de ADN molde como material de partida en una PCR, pueden usarse cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en un ADN molde para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia molde solamente en las posiciones donde los cebadores difieren del molde.

Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis por casete, se basa en la técnica descrita por Wells y

25 col., (1985) Gene 34: 315-323. El material de partida es el plásmido (u otro vector) que comprende el ADN de la CDR de partida a mutar. Se identifica el codón o codones en el ADN de partida a mutar. Debe haber un sitio único para endonucleasas de restricción en cada lado del sitio o sitios de mutación identificados. Si no existen sitios de restricción, pueden generarse usando el procedimiento de mutagénesis mediado por oligonucleótido descrito anteriormente para introducirlos en localizaciones apropiadas en el ADN polipeptídico de partida. El ADN plasmídico se corta en estos sitios para linealizarlo. Se sintetiza un oligonucleótido bicatenario que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción que contiene la mutación o mutaciones deseadas usando procedimientos convencionales, donde las dos cadenas del oligonucleótido se sintetizan por separado y después se hibridan juntas usando técnicas convencionales. Este oligonucleótido bicatenario se conoce como casete. Este casete se diseña para que tenga extremos 5' y 3' que sean compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de modo que

35 puede ligarse directamente al plásmido. Este plásmido ahora contiene la secuencia de ADN mutada.

Como alternativa, o adicionalmente, puede determinarse la secuencia de aminoácidos deseada que codifica una variante polipeptídica, y puede generarse una secuencia de ácido nucleico que codifique dicha secuencia de aminoácidos de forma sintética. También pueden crearse modificaciones conservativas en las secuencias de aminoácidos de las CDR. Los restos de origen natural se dividen en clases basadas en propiedades comunes de la cadena lateral:

(1): hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2): hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3): acídicos: asp, glu;

(4): básicos: asn, gln, his, lys, arg;

45 (5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. La presente invención también proporciona el complemento de las secuencia de ácido nucleico mostradas en las Tablas 1 y 2, así como secuencias de ácido nucleico que hibridarán con estas secuencias de ácido nucleico en condiciones de rigurosidad baja, media, y elevada.

Las CDR de la presente invención pueden emplearse con cualquier tipo de región flanqueante. Preferiblemente, las CDR se usan con regiones flanqueantes completamente humanas, o subregiones flanqueantes. En realizaciones particularmente preferidas, las regiones flanqueantes son secuencia de la línea germinal humana. Los ejemplos de regiones flanqueantes completamente humanas se muestran en las Figuras 4-5 y 8-9. También pueden emplearse 55 otras regiones flanqueantes o subregiones flanqueantes completamente humanas. Por ejemplo, el sitio Web NCBI

contiene las secuencias para las regiones flanqueantes humanas actualmente conocidas. Los ejemplos de secuencias VH humanas incluyen, aunque sin limitación, VH1-18,VH1-2,VH1-24,VH1-3,VH1-45,VH1-46,VH158,VH1-69,VH1-8, VH2-26, VH2-5,VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, y VH7=81, que se proporcionan en Matsuda y col., (1998) J. Exp. Med. 188:1973-1975, que incluye la secuencia de nucleótidos completa del locus de la región variable de la cadena de inmunoglobulina humana. Los ejemplos de secuencias VK humanas incluyen, aunque sin limitación, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, 018, 02, 04, y 08, que se proporcionan en Kawasaki y col., (2001) Eur. J. Immunol. 31:1017-1028; Schable y Zachau, (1993) Biol. Chem. Hoppe Seyler 374:1001-1022; y Brensing-Kuppers y col., (1997) Gene 191: 173-181. Los ejemplos de secuencias de VL humanas incluyen, aunque sin limitación, VL-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4, y V5-6, que se proporcionan en Kawasaki y col., (1997) Genome Res. 7:250-261. Las regiones flanqueantes completamente humanas pueden seleccionarse entre cualquiera de estos genes de la línea germinal funcional. Generalmente, estas regiones flanqueantes difieren entre sí en una cantidad limitada de cambios de aminoácidos. Estas regiones flanqueantes pueden usarse con las CDR descritas en este documento. Los ejemplos adicionales de regiones flanqueantes humanas que pueden usarse con las CDR de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (véase, por ejemplo, Kabat y col., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health y Human Services, NIH, USA; y Wu y col., (1970), J. Exp. Med. 132:211-250).

De nuevo, aunque no es necesario para poner en práctica o entender la invención, se cree que la razón por la que se espera que el uso de las secuencias de la línea germinal ayude a eliminar respuestas inmunes adversas en la mayoría de los individuos es la siguiente. Habitualmente suceden mutaciones somáticas en la región variable de las inmunoglobulinas como resultado de la etapa de maduración de la afinidad que tiene lugar durante una respuesta inmune normal. Aunque estas mutaciones están predominantemente agrupadas alrededor de las CDR hipervariables, también influyen en restos de las regiones flanqueantes. Estas mutaciones en la región flanqueante no están presentes en los genes de la línea germinal y tienen menor probabilidad de ser inmunogénicas en pacientes. En contraste, la población general se ha expuesto a la inmensa mayoría de secuencias flanqueantes expresadas a partir de genes de la línea germinal y, como resultado de la tolerancia inmunológica, estas regiones flanqueantes de la línea germinal se espera que sean menos, o no inmunogénicas en pacientes. Para maximizar la probabilidad de tolerancia, pueden seleccionarse genes que codifiquen las regiones variables a partir de un conjunto de genes de la línea germinal funcional, que existen de forma habitual, y pueden seleccionarse adicionalmente genes que codifiquen regiones VH y VL para que cumplan las asociaciones conocidas entre cadenas pesadas y ligeras específicas de moléculas de inmunoglobulina.

II. Generación de moléculas de unión a CD20

En realizaciones preferidas, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, que comprenden una o más de las CDR descritas en este documento). Un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, de la presente invención puede prepararse, por ejemplo, por expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula huésped. Por ejemplo, para expresar un anticuerpo de forma recombinante, puede transfectarse una célula huésped con uno o más vectores de expresión recombinante que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo de modo que se expresen las cadenas ligera y pesada en la célula huésped y, preferiblemente, se secreten en el medio en el que se cultiva la célula huésped, medio a partir del cual puede recuperar el anticuerpo.

Pueden usarse metodologías de ADN recombinante convencionales para obtener los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpos, incorporar estos genes en vectores de expresión recombinante e introducir los vectores en células huésped, tales como las descritas en Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. y col. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en la patente de Estados Unidos Nº 4.816.397 de Boss y col..

Para expresar un anticuerpo con una o más de las CDR de la presente invención, primero se obtienen los fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada. Estos ADN pueden obtenerse por amplificación y modificación de secuencias variables de cadena ligera y pesada de la línea germinal usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de ADN de la línea germinal para genes de la región variable de cadena pesada y ligera humana se conocen en la técnica (véase anteriormente).

Una vez se han obtenido los fragmentos VH y VL de la línea germinal, estas secuencias pueden mutarse para que codifiquen una o más de las secuencias de aminoácidos de las CDR descritas en este documento (véanse, por ejemplo, las Tablas 1-2). Las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ADN de VH y VL de la línea germinal pueden compararse con la secuencia o secuencias de las CDR deseadas para identificar los restos aminoacídicos que difieren de las secuencias de la línea germinal. Entonces, se mutan los nucleótidos apropiados de las secuencias de ADN de la línea germinal de modo que la secuencia de la línea germinal mutada codifique las CDR seleccionadas (por ejemplo, las seis CDR que se seleccionan de las Tablas 1-2), usando el código genérico para determinar qué cambios de nucleótidos deben hacerse. La mutagénesis de las secuencias de la línea germinal puede realizarse por procedimientos convencionales, tales como mutagénesis mediada por PCR (en la que los nucleótidos mutados se incorporan en los cebadores de PCR de modo que el producto de PCR contenga las mutaciones) o mutagénesis dirigida al sitio. En otras realizaciones, la región variable se sintetiza de novo (por ejemplo, usando un sintetizador de ácidos nucleicos).

Una vez se han obtenido los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL deseados (por ejemplo, por amplificación y mutagénesis de los genes VH y VL de la línea germinal, o síntesis sintética, como se ha descrito anteriormente), estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente por técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de las cadenas de anticuerpo de longitud completa, en genes del fragmento Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, se une de forma funcional un fragmento de ADN que codifica VL o VH a otro fragmento de ADN que codifica otro polipéptido, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de la cadena pesada de longitud completa uniendo de forma funcional el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3, véanse, por ejemplo, las Figuras 10-11). Las secuencias de los genes de la región constante de cadena pesada humana se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., y col., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH Nº 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación convencional por PCR. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero más preferiblemente es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede unirse de forma funcional a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante CH1 de cadena pesada. En realizaciones preferidas, la región constante de cadena pesada es similar a o idéntica a la región constante mostrada en la Figura 11.

El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de cadena ligera de Fab) uniendo de forma funcional el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de región constante de cadena ligera humana se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., y col., (1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services. Publicación NIH Nº 913242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación convencional por PCR. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero más preferiblemente es una región constante kappa. En realizaciones preferidas, la región constante de cadena ligera es similar o idéntica a la región constante mostrada en la Figura 10.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL puede unirse de forma funcional a otra fragmento que codifique un enlazador flexible, por ejemplo, que codifique la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo que las secuencias VH y VL puedan expresarse como una proteína contigua de una única cadena, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Huston y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y McCafferty y col., (1990) Nature 348:552-554).

Para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de la invención, los ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa (por ejemplo, obtenidas como se ha descrito anteriormente), pueden insertarse en vectores de expresión de modo que los genes estén unidos de forma funcional a secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, el término "unido de forma funcional" pretende indicar que un gen de anticuerpo se liga en un vector de modo que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector cumplen su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión generalmente se eligen para que sean compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores diferentes o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo pueden insertarse en el vector de expresión por procedimientos convencionales (por ejemplo, ligamiento de sitios de restricción complementarios en el fragmento génico del anticuerpo y el vector, o ligamiento de extremos romos si no hay sitios de restricción presentes). Antes de la inserción de las secuencias de cadena ligera o pesada, el vector de expresión ya puede portar las secuencias de región constante del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque para convertir las secuencias VH y VL en genes de anticuerpos de longitud completa es insertarlas en vectores de expresión que ya codifican las regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera, respectivamente, de modo que el segmento VH se una de forma funcional al segmento o segmentos CH dentro del vector y el segmento VL se una de forma funcional al segmento CL dentro del vector. Además o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilite la secreción de la cadena del anticuerpo desde una célula huésped. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de modo que el péptido señal se una en fase al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).

Además de los genes de cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden portar secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena del anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de cadena del anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Los especialistas en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen elevados niveles de expresión proteica en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador CMV), el virus 40 del simio (SV40) (tal como el promotor/potenciador SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y poliomavirus. Para una descripción adicional de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.168.062 de Stinski, la patente de Estados Unidos Nº 4.510.245 de Cousens y col. y la patente de Estados Unidos Nº 4.968.615 de Koszinowski y col..

Además de los genes de cadena del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nº 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel y col.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador de selección confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células huésped dhfr-con selección/amplificación con metotrexato) y el gen de la neomicina (para la selección con G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el vector o vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera puede introducirse por transfección en una célula huésped por técnicas convencionales. Las diversas formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia diversidad de técnicas habitualmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección con DEAE-dextrano y similares.

En ciertas realizaciones, el vector de expresión usado para expresar las moléculas de unión a CD20 de la presente invención son vectores virales, tales como vectores retroviral. Dichos vectores virales pueden emplearse para generar líneas celulares transducidas de forma estable (por ejemplo, para una fuente continua de las moléculas de unión a CD20). En algunas realizaciones, se emplea la tecnología de expresión del producto génico GPEX (de Gala Design, Inc., Middleton, WI) para generar moléculas de unión a CD20 (y líneas celulares estables que expresan las moléculas de unión a CD20). En realizaciones particulares, se emplea la tecnología de expresión descrita en el documento WO0202783 y el documento W00202738 de Bleck y col..

Las células huésped de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células PER.C6™ (Crucell, Países Bajos), células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador de selección DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En otras realizaciones preferidas, las células huésped expresan GnT III como se describe en el documento WO9954342 y la publicación de patente de Estados Unidos 20030003097 de modo que las moléculas de unión a CD20 expresadas tengan una actividad ADCC aumentada. Cuando se introducen los vectores de expresión recombinante que codifican los genes de anticuerpo en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen generalmente cultivando las células huésped durante un periodo de time suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando procedimientos convencionales de purificación de proteínas.

Las células huésped también pueden usarse para producir partes de los anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entenderá que las variaciones sobre el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula huésped con ADN que codifique la cadena ligera o la cadena pesada de un anticuerpo de esta invención. La tecnología de ADN recombinante también puede usarse para retirar algo o todo el ADN que codifica cualquiera o ambas cadenas ligera y pesada que no sea necesario para la unión a hCD20. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de ADN truncadas también están comprendidas por los anticuerpos de la invención. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una cadena ligera sean de un anticuerpo de la invención y la otra cadena pesada y ligera sean específicas para un antígeno diferente a hCD20 (por ejemplo, entrecruzando un anticuerpo de la invención con un segundo anticuerpos por procedimientos convencionales de entrecruzamiento químico).

En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo, o fragmento del mismo, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo en células CHO dhfr-por transfección mediada por fosfato cálcico. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo están cada uno unidos de forma funcional a elementos reguladores potenciadores/promotores (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como el elemento regulador potenciador CMV/promotor AdMLP o un elemento regulador potenciador SV40/promotor AdMLP) para dirigir elevados niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también puede portar un gen DHFR, que permita la selección de células CHO que se hayan transfectado con el vector usando selección/amplificación con metotrexato. Las células huésped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Se usan técnicas convencionales de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar los transformantes, cultivar las células huésped y recupera el anticuerpo del medio de cultivo.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención se producen en animales transgénicos. Por ejemplo, pueden diseñarse ovejas y vacas transgénicas para que produzcan los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en su leche (véase, por ejemplo, Pollock DP, y col., (1999) Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J. Immunol. Methods 231:147-157). Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención también pueden producirse en plantas (véase, por ejemplo Larricky col., (2001) Production of secretory IgA antibodies in plants. Biomol. Eng. 18:87-94). Se proporcionan metodologías y protocolos de purificación adicionales en Humphreys y col., (2001) Therapeutic antibody production technologies: molecules applications, expression and purification, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 4:172-185. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la presente invención se producen por gallinas transgénicas (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos Nº 20020108132 y 20020028488).

III. Formulaciones y usos terapéuticos

Las moléculas de unión a CD20 de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo) son útiles para tratar a un sujeto con una enfermedad. Las moléculas de unión a CD20 también pueden usarse en procedimientos de diagnóstico (por ejemplo, moléculas de unión a CD20 marcadas usadas para la formación de imágenes tisulares). En realizaciones preferidas, las moléculas de unión a CD20 se administran a un paciente con linfoma de células B, que está generalmente caracterizado por una proliferación no moderada de células B.

En algunas realizaciones, las moléculas de unión a CD20 se conjugan con diversos radiomarcadores para propósitos tanto de diagnóstico como terapéuticos. Los radiomarcadores permiten la "formación de imágenes" de tumores y otros tejidos, así como ayudar a dirigir el tratamiento por radiación a los tumores. Los radiomarcadores ejemplares incluyen, aunque sin limitación, 131I, 125I, 123I, 99Tc, 67Ga, 111In, 188Re, 186Re, y preferiblemente, 90Y.

En ciertas realizaciones, la enfermedad tratada es linfoma no Hodgkin (NHL). En algunas realizaciones, la enfermedad se selecciona entre enfermedad de Hodgkin reincidente, enfermedad de Hodgkin de grado elevado resistente, linfomas no Hodgkin de grado bajo y grado intermedio (NHL), leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), linfoma linfoplasmacitoide (LPL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfoma difuso de células grandes (DLCL), linfoma de Burkitt (BL), linfomas relacionados con el SIDA, linfoma de células B monocíticas, linfadenopatía angioinmunoblástico, linfoma linfocítico pequeño; de células foliculares grandes difusas; de células escindidas pequeñas difusas; linfoblastoma inmunoblástico de células grandes; linfoma pequeño no escindido; linfoma de Burkitt y no de Burkitt; de células foliculares predominantemente grandes; de células foliculares predominantemente pequeñas escindidas; de células foliculares mixtas pequeñas escindidas y grandes y lupus sistémico eritematoso (SLE). En realizaciones particulares, la enfermedad tratada es macroglobulinemia de Waldenstrom (WM) o leucemia linfocítica crónica (CLL).

En algunas realizaciones, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención se usan para el tratamiento de enfermedades en las que la eliminación de células CD20+ es terapéuticamente beneficiosa, tal como la macroglobulinemia de Waldenstrom, el mieloma múltiple, discrasias de células plasmáticas, leucemia linfocítica crónica, el tratamiento de transplantes, leucemia de células capilares, ITP, linfomas por virus de Epstein Barr después de transplante de células madre, y transplante de riñón, véase la publicación de patente de Estados Unidos 20030128448. En otras realizaciones, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención se usan para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en linfomas de células B, leucemias, mielomas, enfermedad autoinmune, transplante, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas que implican células B, enfermedades de linfoproliferación, y tratamiento de cualquier enfermedad o afección en la que sea deseable la supresión de la actividad de las células B y/o la inmunidad humoral. En ciertas realizaciones, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención se usan para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en linfomas de células B, leucemia, mieloma, transplante, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad autoinmune, afecciones de linfoproliferación, y el tratamiento de otras enfermedades y afecciones en las que sea terapéuticamente beneficiosa la inhibición de la inmunidad humoral, la función de las células B, y/o su proliferación. En otras realizaciones, las moléculas de unión a CD20 de la presente invención se usan para el tratamiento de B-ALL, leucemia de células capilares, mieloma múltiple, síndrome de Richter, inhibidores adquiridos del Factor VIII, síndrome antifosfolípido, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia autoinmune, penfigoide ampollar, enfermedad por hemaglutinina fría, síndrome de Evan, síndrome de Goodpasture, neuropatía membranosa idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática, polineuropatía asociada a IgM, enfermedad de Castleman multicéntrico (MCD) asociada a herpesvirus asociados con sarcoma de Kaposi (KSHV), miastenia grave, pénfigo vulgar, cirrosis biliar primaria, aplasia pura de glóbulos rojos, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, vasculitis sistémica de complejo inmune, lupus sistémico eritematoso, crioglobulinemia mixta de tipo II, granulomatosis de Wegener, rechazo de aloinjertos, enfermedad linfoproliferativa después de transplante, o purga de células madre para el transplante de médula ósea.

En realizaciones preferidas, el sujeto a tratar no está inmunosuprimido (por ejemplo, un paciente SLE). Aunque sin limitarse a ningún mecanismo, se cree que las moléculas de unión a CD20 de la presente invención tienen menor probabilidad de provocar una respuesta HACA que los anticuerpos anti-CD20 previamente conocidos, especialmente en pacientes no inmunosuprimidos. Por tanto, los pacientes no inmunosuprimidos pueden tratarse sin la preocupación esencial de una reacción HACA adversa. Además, con la capacidad mejorada de unión o las moléculas de unión a CD20 de la presente invención, pueden administrarse dosis inferiores a los pacientes (evitando adicionalmente el riesgo de una respuesta HACA), o pueden administrarse dosis mayores sin el riesgo de una respuesta HACA amenazante de la vida. En otras realizaciones preferidas, el sujeto tiene artritis reumatoide u otra enfermedad autoinmune (véase, por ejemplo, Edwards y col., Rheumatology (Oxford) 2001 Feb; 40(2):205-11).

Las moléculas de unión a CD20 de la presente invención también pueden administrarse en combinación con otros restos terapéuticos. Por ejemplo, las moléculas de unión a CD20 pueden administrarse como parte de un programa quimioterapéutico (por ejemplo, CHOP). Las moléculas de unión a CD20 también pueden administrarse con citoquinas, G-CSF, o IL-2 (véase la patente de Estados Unidos 6.455.043).

Las moléculas de unión a CD20 de la presente invención pueden administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, no parenteral, subcutánea, tópica, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal, e intralesional (por ejemplo, para tratamiento inmunosupresor local). Las infusiones parenterales incluyen, aunque sin limitación administración intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, las moléculas de unión a CD20 se administrar adecuadamente por infusión en pulsos, particularmente con dosis menguantes. Preferiblemente, la dosis se da por inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas en el tiempo o la dosis pueden reducirse o aumentarse proporcionalmente como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para una fácil administración y la uniformidad de la dosificación. Las dosificaciones de las moléculas de unión a CD20 de la presente invención generalmente dependen de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Un intervalo no limitante ejemplar para un cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (u otra molécula de unión a CD20 de la invención) es 0,1-20 mg/kg, más preferiblemente 110 mg/kg. En algunas realizaciones, la dosificación es de 50-600 mg/m2 (por ejemplo, 375 mg/m2). Debe apreciarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección a aliviar. Debe entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse en el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación expuestos en este documento son solamente ejemplares y no pretenden limitar la presente invención.

La dosificación administrada variará, por supuesto, dependiendo de factores conocidos tales como las características farmacodinámicas del agente particular, su modo y vía de administración, la edad, salud, y peso del destinatario, la naturaleza y grado de los síntomas, el tipo de tratamiento concurrente, la frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado. Por ejemplo, una dosificación diaria de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0,01 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Habitualmente puede ser eficaz de 1,0 a 5, y preferiblemente de 1 a 10 miligramos por kilogramo al día dados en dosis divinidades de 1 a 6 veces al día o en forma de liberación sostenida, para obtener los resultados deseados.

Las moléculas de unión a CD20 de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender una molécula de unión a CD20 (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de los siguientes: agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencien la vida útil o eficacia de las moléculas de unión a CD20.

Las composiciones de esta invención pueden estar en una diversidad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos.

Las composiciones terapéuticas típicamente son estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, y otra estructura ordenada adecuada para una elevada concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo) en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de filtración estéril. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios a partir de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, el procedimiento preferido de preparación es secado al vacío y secado por congelación que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de la solución previamente filtrada a esterilidad del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.

En ciertas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que protegerá al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson. ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978).

En ciertas realizaciones, las moléculas de unión a CD20 de la invención pueden administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también pueden incluirse en una cápsula de gelatina cubierta dura o blanda, comprimido en comprimidos, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención por administración diferente a parenteral, puede ser necesario revestir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, edad, sexo, y pero del individuo, y la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o nocivo del anticuerpo o fragmento de anticuerpo está sobrepasado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Típicamente, como se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes o en una fase temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

IV. Usos adicionales de la molécula de unión a CD20

Las moléculas de unión a CD20 de la presente invención, tales como péptidos y/o anticuerpos anti-CD20 son útiles para inmunoensayos que detectan o cuantifican CD20 en una muestra o células B que albergan CD20. Un inmunoensayo para CD20 típicamente comprende incubar una muestra biológica en presencia de un péptido y/o anticuerpo anti-CD20 de alta afinidad marcado de forma detectable de la presente invención capaz de unirse selectivamente a CDC20, y detectar el péptido o anticuerpo marcado que se ha unido en una muestra. Diversos procedimientos de ensayo clínico son bien conocidos en la técnica.

De este modo, puede capturarse un péptido o anticuerpo anti-CD20, en nitrocelulosa, o en cualquier otro soporte sólido que sea capaz de inmovilizar proteínas solubles. Después se añade una muestra que contenga CD20 al soporte que posteriormente se lava con tampones adecuados para retirar las proteínas no unidas. Se añade un segundo péptido o anticuerpo específico para CD20, marcado de forma detectable al soporte en fase sólida que después puede lavarse con el tampón una segunda vez para retirar el péptido o anticuerpo marcado de forma detectable no unido. La cantidad de marcador no unido en el soporte sólido después puede detectarse por procedimientos conocidos.

Por "soporte en fase sólida" o "vehículo" se entiende cualquier soporte capaz de unirse a un péptido, antígeno o anticuerpo. Los soportes o vehículos bien conocidos, incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas, y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble a algún grado o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material de soporte puede tener casi cualquier configuración estructura posible siempre que la molécula acoplada retenga su capacidad de unirse a CD20. Por tanto, la configuración de soporte puede ser esférica, como en una perla, o cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Como alternativa, la superficie puede ser plata tal como una lámina, placa de cultivo, tira de ensayo, placa de microtitulación, etc. Los soportes preferidos incluyen perlas de poliestireno. Los especialistas en la técnica conocerán muchos otros vehículos adecuados para unirse a anticuerpos, péptidos o antígenos, o pueden averiguar los mismos por experimentación rutinaria. Pueden usarse procedimientos bien conocidos para determinar la actividad de unión de un lote dado de péptido y/o anticuerpo anti-CD20. Los especialistas en la técnica pueden determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas por experimentación rutinaria.

El marcaje de forma detectable de una molécula de unión a CD20, tal como un péptido y/o anticuerpo específico de CD20, puede realizarse acoplándolo a una enzima para su uso en un inmunoensayo enzimático (EIA), o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La enzima ligada reacciona con el sustrato expuesto para generar un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que pueden usarse para marcar de forma detectable las moléculas de unión a CD20 de la presente invención incluyen, aunque sin limitación, la malato deshidrogenasa, la nucleasa de estafilococos, la delta-5esteroide isomerasa, la alcohol deshidrogenada de levaduras, la alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, la triosa fosfato isomerasa, la peroxidasa de rábano rusticano, la fosfatasa alcalina, la asparaginasa, la glucosa oxidasa, la betagalactosidasa, la ribonucleasa, la ureasa, la catalasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la glucoamilasa y la acetilcolinesterasa.

Marcando de forma radiactiva las moléculas de unión a CD20, es posible detectar CD20 a través del uso de un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Work, y col., (1978) Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y.). El isótopo radiactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o por autorradiografía.

También es posible marcar las moléculas de unión a CD20 con un compuesto fluorescente. Cuando la molécula marcada de forma fluorescente se expone a luz de la longitud de onda apropiada, su presencia puede entonces detectarse debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcaje fluorescente más habitualmente usados están el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina, el o-ftaldehído y la fluorescamina.

Las moléculas de unión a CD20 también pueden marcarse de forma detectable usando metales que emiten fluorescencia tales como 125Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales pueden unirse a la molécula de unión a CD20 usando grupos quelantes de metales tales como ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminatetraacético (EDTA).

Las moléculas de unión a CD20 también pueden marcarse de forma detectable acoplando un compuesto quimioluminiscente. La presencia de la molécula marcada de forma quimioluminiscente después se determina detectando la presencia de la luminescencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscente particularmente útiles son el luminol, el isoluminol, el éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Asimismo, puede usarse un compuesto bioluminiscente para marcar las moléculas de unión a CD20 de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes para propósitos de marcaje son la luciferina, la luciferasa y aequorina.

La detección de las moléculas de unión a CD20 puede realizarse por un contador de centelleo, por ejemplo, si el marcador detectable es un emisor gamma radiactivo, o por un fluorómetro, por ejemplo, si el marcador es un material fluorescente. En el caso de un marcador enzimático, la detección puede realizarse por procedimientos colorimétricos que emplean un sustrato para la enzima. La detección también puede conseguirse por comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato con patrones preparados de forma similar.

En algunas realizaciones de la presente invención, la CD20 que se detecta por los ensayos anteriores puede estar presente en una muestra biológica. Puede usarse cualquier muestra que contenga CD20. Preferiblemente, la muestra es un fluido biológico tal como, por ejemplo, sangre, suero, linfa, orina, fluido cefalorraquídeo, fluido amniótico, fluid sinovial, un extracto u homogeneizado tisular, y similares. Sin embargo, la invención no está limitada a ensayos que usan solamente estas muestras, ya que es posible para un especialista en la técnica determinar las condiciones adecuadas que permitan el uso de otras muestras.

La detección in situ puede realizarse retirando una muestra histológica de un paciente, y proporcionando la combinación de moléculas de unión a CD20 marcadas de la presente invención a dicha muestra. La molécula de unión a CD20 se proporciona preferiblemente aplicando o superponiendo la molécula de unión a CD20 marcada a una muestra biológica. A través del uso de dicho procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de CD20 sino también la distribución de CD20 en el tejido examinad. Usando la presente invención, los especialistas en la técnica percibirán fácilmente que puede modificarse cualquiera de una amplia diversidad de procedimientos histológicos (tales como procedimientos de tinción) para conseguir dicha detección in situ.

Las moléculas de unión a CD20 de la presente invención pueden adaptarse para su utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como un ensayo de "dos lados" o tipo "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, se une una cantidad de molécula de unión a CD20 no marcada (tal como un anticuerpo anti-CD20) en un soporte sólido que es insoluble en el fluido que se está ensayando y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado de forma detectable para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo en fase sólida, el antígeno, y el anticuerpo marcado.

Los ensayos inmunométricos típicos y preferidos incluyen ensayos "directos" en los que la molécula de unión a CD20 (por ejemplo, anticuerpo) unida a la fase sólida primero se pone en contacto con la muestra que se está ensayando para extraer la CD20 de la muestra por la formación de un complejo binario anticuerpo en fase sólida-CD20. Después de un periodo de incubación adecuado, el soporte sólido se lava para retirar el residuo de la muestra de fluido, incluyendo CD20 sin reaccionar, si hay, y después se pone en contacto con la solución que contiene una cantidad conocida de anticuerpo marcado (que funciona como "molécula informadora"). Después de un segundo periodo de incubación para permitir que el anticuerpo marcado forme el complejo con el CD20 unido al soporte sólido a través del anticuerpo no marcado, el soporte sólido se lava una segunda vez para retirar el anticuerpo marcado sin reaccionar. Este tipo de ensayo tipo sándwich directo puede ser un simple ensayo tipo "sí/no" para determinar, si CD20 está presente o puede hacerse cuantitativo comparando la medición del anticuerpo marcado con la obtenida para una muestra convencional que contenga cantidades conocidas de CD20.

Otros tipos de ensayos tipo "sándwich", que también pueden ser útiles con CD20, son los llamados ensayos "simultáneos" e "inversos". Un ensayo simultáneo implica una única etapa de incubación en la que el anticuerpo unido al soporte sólido y el anticuerpo marcado se añaden ambos a la muestra que se está ensayando al mismo tiempo. Después de completarse la incubación, el soporte sólido se lava para retirar el residuo de muestra de fluido y anticuerpo marcado no en complejo. La presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido después se determina como se haría en un ensayo tipo sándwich "directo" convencional. En el ensayo "inverso", se utiliza primero una adición por etapas de una solución de anticuerpo marcado a la muestra de fluido seguida de la adición de anticuerpo no marcado unido a un soporte sólido después de un periodo de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava de un modo convencional para liberarlo del residuo de la muestra que se está ensayando y la solución de anticuerpo marcado sin reaccionar. La determinación de anticuerpo marcado asociado con un soporte sólido después se determina como en los ensayos "simultáneo" y "directo".

En algunas realizaciones, las moléculas de unión a CD20 de esta invención, unidas a un soporte sólido, pueden usarse para retirar CD20 (o las células B que albergan CD20) de los fluidos o extractos tisulares o celulares. En una realización preferida, se usan para retirar CD20 de la sangre o productos del plasma sanguíneo. En otra realización preferida, las moléculas de unión a CD20 se usan ventajosamente en dispositivos inmunoadsorbentes extracorpóreos, que se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Seminars in Hematology, 26 (2 Supl. 1) (1989)). La sangre del paciente u otro fluido corporal se expone a la molécula de unión a CD20 unida, provocando la eliminación parcial o completa de la CD20 en circulación (libre o en complejos inmunes), después de lo cual el fluido se devuelve al cuerpo. Esta inmunoadsorción puede ponerse en práctica en una disposición de flujo continuo, con o sin interponer una etapa de centrifugación celular. Véase, por ejemplo, Terman, y col., (1976) J. Immunol. 117:19711975.

Parte experimental

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención y no deben entenderse como limitantes del alcance de la misma.

En la siguiente descripción experimental, se aplican las siguientes abreviaturas: M (molar); mM (milimolar); nM (nanomolar); pM (picomolar); mg (miligramos); µg (microgramos); pg (picogramos); ml (mililitro); µl (microlitros); ºC (grados Celsius); DO (densidad óptica); nm (nanometro); BSA (albúmina sérica bovina); y PBS (solución salina tamponada con fosfato).

Ejemplo 1

Moléculas de unión a CD20

Este ejemplo describe cómo pueden construirse ciertas moléculas de unión a CD20 ejemplares. En particular, este ejemplo describe cómo pueden construirse once diferentes moléculas de unión a CD20 (AME 21E1 Hum, AME 6F1, 5 AME 2C2, AME 1D10, AME 15, AME 18, AME 33, AME 5-3, AME 1C2, AME4H5, y AME 5), y expresarse, por ejemplo, como Fab o IgG completas.

Las regiones variables de cadena ligera y pesada de las once diferentes moléculas de unión a CD20 pueden construirse del siguiente modo. El conjunto de las 6 CDR para cada una de las moléculas de unión a CD20 se muestra en la Tabla 3, con el número de ID de secuencia para la secuencia de aminoácidos enumerado primero y el

10 número de ID de secuencia para la secuencia de ácido nucleico enumerada en segundo lugar.

TABLA 3

CDR de cadena ligera y pesada en moléculas de unión a CD20 ejemplares

Molécula anti-CD20: CDRL1 SEC ID Nº CDRL2 SEC ID Nº CDRL3 SEC ID Nº CDRH1 SEC ID Nº CDRH2 SEC ID Nº CDRH3 SEC ID Nº

AME 21E1 Hum: 1 y 2 7 y 8 19 y 20 23 y 24 27 y 28 49 y 50

AME 6F1: 1 y 2 7 y 8 19 y 20 23 y 24 27 y 28 51 y 52

AME 2C2: 1 y 2 7 y 8 19 y 20 23 y 24 33 y 34 53 y 54

AME 1D10: 5 y 6 7 y 8 19 y 20 23 y 24 33 y 34 53 y 54

AME 15: 5 y 6 7 y 8 19 y 20 23 y 24 35 y 36 53 y 54

AME 18: 5 y 6 13 y 14 19 y 20 25 y 26 37 y 38 55 y 56

AME 33: 5 y 6 13 y 14 19 y 20 25 y 26 39 y 40 57 y 58

AME 5-3: 1 y 2 7 y 8 17 y 18 23 y 24 27 y 28 43 y 44

AME 1C2: 3 y 4 9 y 10 17 y 18 23 y 24 29 y 30 45 y 46

AME 4H5: 3 y 4 7 y 8 17 y 18 23 y 24 31 y 32 47 y 48

AME 5: 3 y 4 11 y 12 21 y 22 23 y 24 31 y 32 45 y 46

Las CDR de la Tabla 3 pueden combinarse con cualquier región flanqueante, tal como una región flanqueante de la línea germinal humana, para generar regiones variables (que pueden, por ejemplo, expresarse como Fv). Por

15 ejemplo, para generar las regiones variables para las once moléculas anti-CD20 nombradas en este ejemplo, las CDR de la tabla 3 se combinan con regiones flanqueantes de la línea germinal humana, como se muestra en la Tabla 4. TABLA 4

Regiones flanqueantes de la línea germinal humana usadas para generar las moléculas de unión a CD20 nombradas

Molécula anti-CD20: Región flanqueante VL Región flanqueante VH

AME 5-3: VkI (DPK4) (A20) VHI DP7/21-2

AME 1C2: VkI (DPK4) (A20) VHI DP7/21-2

AME 4H5: VkI (DPK4) (A20) VHI DP7/21-2

AME 5: VkI (DPK4) (A20) VHI DP7/21-2

AME 21E1 Hum: VkIII (A27) (DPK22) VH5-51(DP-73)

AME 6F1: VkIII (A27) (DPK22) VH5-51 (DP-73)

AME 2C2: VkIII (A27) (DPK22) VH5-51 (DP-73)

(continuación)

Molécula anti-CD20: Región flanqueante VL Región flanqueante VH

AME 1D10: VkIII (A27) (DPK22) VH5-51 (DP-73)

AME 15: VkIII (A27) (DPK22) VH5-51 (DP-73)

AME 18: VkIII (A27) (DPK22) VH5-51 (DP-73)

AME 33: VkIII (A27) (DPK22) VH5-51 (DP-73)

Las secuencias para las regiones variables de cadena ligera y pesada completas de dos de las once moléculas de

5 unión a CD20 se proporcionan en las Figuras 2-3 y 6-7. En particular, las Figuras 2 y 3 muestran las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico para las regiones variables de cadena ligera y pesada de AME 33 (que, en conjunto, proporciona la secuencia de Fv completa para AME 33). Las Figuras 6 y 7 muestran las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico para las regiones variables de cadena ligera y pesada de AME 5.

Las regiones variables de cadena ligera y pesada para las once moléculas de unión a CD20 analizadas en este

10 ejemplo pueden combinarse con regiones constantes de cadena ligera y pesada y expresarse como Fab o anticuerpos completos (por ejemplo, IgG). Estas secuencias se unen preferiblemente a una secuencia líder (por ejemplo, una secuencia líder en el inicio de la secuencia de cadena ligera). Un ejemplo de secuencia líder que puede emplearse es METPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEC ID Nº 105). Pueden emplearse otras secuencias líder. Además, puede emplearse cualquier cadena del alotipo de la región constante humana. Por ejemplo, las Figuras 10

15 y 11 muestran las cadenas ligera y pesada completas para AME 33, que incluyen las regiones constantes de cadena ligera y pesada. Estas figuras también pueden ser la fuente de las regiones constantes usadas para crear los Fab y las IgG de las otras moléculas de unión a CD20 nombradas en este ejemplo. Se observa que las regiones constantes están subrayadas en las Figuras 10A y 11A. Además, las moléculas anti-CD20 de este ejemplo pueden emplear como alternativa las regiones constantes de cadena pesada mostradas en las Figuras 10 y 11, excepto que

20 con una sustitución de aminoácido en la región Fc. En particular, la región constante de cadena pesada mostrada en la Figura 11 puede contener una mutación D280H o una mutación K290S (la Figura 11A muestra las posiciones 280 y 290 en negrita, sin las mutaciones). La Figura 11B muestra un "GAC" en negrita y subrayado. Este "GAC" puede cambiarse a "CAT" para que codifique la mutación D280H.

Para expresar las moléculas de unión anti-CD20 en este ejemplo (como Fab o IgG), pueden usarse procedimientos

25 conocidos en la técnica. Por ejemplo, las once moléculas de unión a CD20 de este ejemplo pueden expresarse, como Fab o IgG, en sistemas de expresión de mamíferos (o sistemas de expresión bacterianos, fúngicos y vegetales) usando un único vector o un sistema de doble vector. En un sistema de un único vector se preparan o clonan tanto la cadena pesada como la ligera dentro de un casete de expresión, que contiene todos los elementos reguladores requeridos para la expresión. Un sistema de doble vector simplemente tiene estos dos castotes de

30 expresión en plásmidos diferentes. El plásmido individual o los plásmidos combinados en el sistema de doble vector, pueden introducirse por transfección en una línea celular huésped tal como células de ovario de hámster chino (CHO) o la línea celular retinal PerC6, seleccionada, expandida y cultivada para expresar las proteínas Fab o IgG como se sabe en la técnica (véase Antibody Expression and Engineering: Developed from a Symposium Sponsored by the Division of Biochemical Technology en el 207th National Meeting of the American Chemical Society, San

35 Diego [ACS Symposium Series, 604]).

Los Fab también pueden expresarse en un sistema de expresión bacteriano, ya que éste tarda menos tiempo y es menos caro que los sistemas de mamífero. Aquí los Fab pueden insertarse y expresarse con un sistema de expresión viral M13. Los Fab expresados en bacterias se secretan y también se acumulan dentro del espacio periplásmico entre la pared celular bacteriana y su membrana celular. El Fab puede liberarse de este espacio 40 periplásmico por varias técnicas incluyendo choque hipotónico y procedimientos de congelación-descongelación habituales en la técnica. Los Fab también pueden generarse a partir de IgG intactas por escisión proteolítica usando una proteasa tal como la papaína. La parte Fab del producto de escisión después puede purificarse de la parte Fc del producto de escisión. Los Fab y las IgG pueden purificarse con cualquiera de varias técnicas cromatográficas y de absorción específica que también son conocidas en la técnica (véase Antibodies: A Laboratory Manual, de Ed

45 Harlow (Editor), David Lane (Editor), Cold Spring Harbor Press). Por ejemplo las IgG pueden purificarse fácilmente a partir del sobrenadante celular por unión específica usando cromatografía de afinidad a proteína A seguida de cromatografía por intercambio catiónico con Mono S.

Ejemplo 2

ELISA con células Ramos fijadas

Este ejemplo describe un ensayo de unión ELISA con células Ramos fijadas con moléculas de unión a CD20. En particular, este ejemplo ensayó AME 4H5, AME 15, AME 18, AME 33 y AME 1D10 expresados como Fab e IgG para determinar la unión global, la velocidad de disociación, y la velocidad de asociación. Este ejemplo también ensayó los Fab y el anticuerpo C2B8 del propio laboratorio, así como RITUXAN comercial (Oncology Supply Co.) en el mismo ensayo para propósitos de comparación. El anticuerpo C2B8 está depositado en la ATCC con el número de depósito 69119.

Las células Ramos (ATCC) se cultivaron en RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal inactivado por calor al 10%. Se pipetearon cincuenta microlitros de células Ramos (2-4 x 106/ml), en cada pocillo de una placa de 96 pocillo revestida con poli-D-lisina (BIOCAT Becton Dickinson Labware) y se incubaron a 37ºC, CO2 al 5% durante 18 horas. Se aspiró cuidadosamente el medio y se añadieron 100 ml de formalina de zinc tamponada acuosa (Anatech, Ltd.) a cada pocillo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el Z-fix y la placa se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tween 20 al 0,05%. La placa se bloqueó durante 1 hora con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS. Se incubaron diluciones de Fab o IgG con las células Ramos fijas y bloqueadas durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó 3X con PBS, Tween 20 al 0,05%, y se añadieron 50 ml de anticuerpos monoclonal de ratón anti-His6 con peroxidasa (Roche Diagnostics Corporation) a una dilución 1:500 a los pocillos y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como anteriormente y se reveló con benzidina de tetrametilo, y la reacción se detuvo con H2SO4 5 N. La absorbancia de la placa se leyó a DO 450 nm. Las diluciones de Fab y conjugado fueron en BSA al 1%/PBS.

Los ensayos de IgG se realizaron de forma similar excepto en que la IgG unida se detectó con IgG de cabra antihumano-HRP. Para comparar la velocidad de disociación del anticuerpo, después de la incubación con Fab o IgG, las placas se incubaron durante una noche en PBS/BSA, antes de proceder con la etapa del anticuerpo secundario. Para comparar la velocidad de asociación del anticuerpo, las etapas de incubación para la unión de Fab/IgG y con el anticuerpo secundario fueron ambas de 5 minutos de duración.

Los resultados de este ejemplo se presentan en las Figuras 12 y 13. Como se muestra en estas figuras, la unión global de los Fab AME 4H5, 15, 18, 33 y 1D10 son más eficaces que el Fab C2B8. La curva de respuesta a dosis para los anticuerpos AME está desplazada a la izquierda con relación al anticuerpo C2B8 y el RITUXAN comercial, y la DO máxima obtenida es aproximadamente 1,5 veces la observada con el anticuerpo C2B8. Con respecto a la velocidad de disociación, los Fab de AME 4H5, 15, 18, 33 y 1D10 muestran una velocidad de disociación drásticamente disminuida con relación al Fab C2B8 (Figura 12B). La velocidad de disociación para anticuerpos AME expresados como IgG completas es similar a la del anticuerpo C2B8 y el RITUXAN comercial (Figura 13A). Con respecto a la velocidad de asociación, los Fab de AME 4H5, 15, 18, 33 y 1D10 muestran una velocidad de asociación similar a la del Fab C2B8, con una unión global aumentada (DO máxima obtenida) (Figura 12C). La respuesta a dosis para los anticuerpos AME expresados como IgG completas está desplazada a la izquierda de la del anticuerpo C2B8 completo (Figura 13B).

Ejemplo 3

Ensayos inmunofluorescentes de unión a linfoma B en vivo

Este ejemplo describe ensayos inmunofluorescentes de unión a linfoma B en vivo. En particular, se ensayaron los Fab de AME 33, AME 5 y C2B8 como se describe a continuación.

Tinción con Fab de PBMC para en análisis FACS de CD20

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre humana normal por flotación en Ficol-Hypaque (Sigma-1077). Las células se contaron y se resuspendieron en PBS + BSA al 1% para dar 2-5x106 células/ml. Se distribuyeron cien microlitros de células diluidas en tubos de poliestireno (Falcon nº 2058) y se añadieron anticuerpo Fab anti-CD20 diluidos en PBS + BSA al 1%. Los tubos se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. Se añadieron cuatro mililitros de PBS + BSA al 1% a cada tubo y los tubos se centrifugaron a 300 xG durante 10 minutos. El sobrenadante se retiró y las células se resuspendieron en 100 µl de PBS + BSA al 1%. Se añadió conjugado Anti-Penta-His AlexaPluor 488 (Qiagen nº 35310), 2 µl por tubo, los tubos se mezclaron y se incubaron durante 1 hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron como se ha descrito previamente. El sobrenadante se retiró y las células se resuspendieron en PBS + BSA al 1% + 2 µg/ml de yoduro de propidio. La fluorescencia se analizó en un FACScan Becton Dickinson o citómetro de flujo FACSort y los datos se analizaron usando el software Cell Quest (Becton Dickinson) o WinMDI.

Los resultados se presentan en la Figura 14. Los resultados para células Daudi se muestran en la Figura 14A, los resultados para células Wi 12-S se muestran en la Figura 14B, y los resultados para las células Ramos se muestran en la en Figura 14C. Como se muestra en esta figura, los Fab de AME 5 y 33 son más eficaces en la unión a líneas celulares vivas de linfoma B que C2B8. Se observa que la curva de respuesta a dosis para AME 5 y AME 33 está desplazada a la izquierda con respecto a C2B8.

Ejemplo 4

Unión de IgG medida por KinExA

Este ejemplo describe ensayos para medir la Kd, Kon, y Koff de diversas IgG contra CD20. En particular, este ensayo ensayó AME 33, AME 5, AME 6F1, y el anticuerpo C2B8 para su unión a células de linfoma B SKW 6.4 y 5 determinó la Kd, Kon, y Koff para cada una de estas moléculas con la ayuda del software de equilibrio KinExa. Además, se ensayaron AME 33 y C2B8 para la unión a células B primarias de sangre periférica humana.

Medición de Kd:

Se cultivaron células SKW 6.4 en medio DMEM suplementado con FCS al 10% y se recogieron a 5-10x105 células por ml. Las células se lavaron con 5 volúmenes de PBS y se resuspendieron en PBS con BSA al 1% a aprox. 1x108

10 células por ml. Para células B de sangre periférica humana, se obtuvieron células B frescas clasificadas positivamente por CD19 de Allcells. Estas células se lavaron dos veces en PBS con BSA al 1% y se resuspendieron a una concentración de 8 x107/ml.

Después se hicieron doce diluciones en serie de factor 3 y se colocaron 100 µl de cada dilución en una placa de 96 pocillos. A cada dilución se añadieron 100 ml de anticuerpo a 100 ng/ml y la placa se incubó a 37ºC, CO2 al 5%

15 durante 4 horas. Cada muestra después se filtró con un filtro de 1 micrómetro de 96 pocillos (Millipore) para retirar las células y el anticuerpo unido. Después se cuantificó el anticuerpo libre en solución usando un ELISA. En resumen, se capturó la IgG libre en una placa de 96 pocillos revestida con 1 mg/ml de anticuerpo anti-kappa humana (Southern Biotechnology) y se detectó usando un anticuerpo anti-Fc humano acoplado con HRP (Southern Biotechnology). La placa se reveló usando el sustrato Fast TMB (Pierce) y se leyó a 450 nm.

20 La Kd del anticuerpo después se determinó usando el software de equilibrio KinExA para una concentración desconocida de antígeno. Se ajustó el valor de DO450 para cada dilución en serie con una concentración estimada de antígeno y la concentración real de anticuerpo. Después se calcularon la Kd y la concentración real de antígeno. Los resultados para los ensayos de células SKW 6.4 se muestran en la Tabla 5. Estos resultados muestran que AME 33 y AME 5 tienen una Kd que está 10 veces potenciada en comparación con el anticuerpo C2B8. Los

25 resultados para las células B primarias de sangre periférica humana muestran una Kd para AME 33 de 113 pM y una Kd para C2B8 de 1500 pM. De nuevo, se muestra que AME 33 tiene una Kd más de 10 veces (casi quince veces) la del anticuerpo C2B8.

TABLA 5

AME 33: AME 5 AME 6F1 C2B8

Kd; pM: 97 145 2500 2097

Kon; x 105M-1, s -1: 7,8 5,8 1,0 4,7

Koff; x10-5s -1: 7,7 7,9 25,0 104,5

30 Mediciones cinéticas:

Se cultivaron células SKW 6.4 en medio DMEM suplementado con FCS al 10% y se recogieron a 5-10x105 células por ml. Las células se lavaron con 5 volúmenes de PBS y se resuspendieron en PBS con BSA al 1% a aprox. 1x107 células por ml y se mantuvieron en un baño de agua a 37ºC. Después se añadió un volumen igual de anticuerpo a 100 ng/ml en PBS con BSA al 1% a 37ºC a las células y empezó el cronometraje para el experimento. A intervalos

35 de tiempo de 60 segundos a 10800 segundos, se muestreó una muestra de la solución celular con anticuerpo y se filtró para retirar las células y el anticuerpo unido. Después se cuantificó el anticuerpo libre que quedaba en cada momento puntual usando el ELISA descrito anteriormente.

La cinética para la reacción celular con el anticuerpo se calculó usando el software KinExA de cinética directa: Se ajustó el valor de DO450 para cada momento puntual usando la Kd previamente calculada y la concentración de

40 antígeno y la Kon y Koff para la reacción calculada. Los resultados se muestran en la Tabla 5,

Ejemplo 5

Ensayos de ADCC con moléculas de unión a CD20

En este ejemplo, se ensayaron las IgG AME 5, AME 33, y AME 6F1, así como el anticuerpo C2B8, para su capacidad de mediar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) usando células

45 mononucleares de sangre periférica humana como efectoras y líneas celulares de linfoma B como dianas. Estos ensayos se realizaron como se describe a continuación.

Aislamiento de PBMC (células mononucleares de sangre periférica)

Se diluyó sangre periférica de donantes sanos 1:2 con solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0. Se estratificaron cuidadosamente doce ml de Histopaque-1077 (Sigma Nº Cat. 1077-1) por debajo de la muestra diluida seguido de centrifugación en una centrífuga Sorvall RT6000B con un rotor de cubeta oscilante a 1000 rpm durante 5 10 minutos con el freno apagado. La interfase que contenía las PBMC se recogió y se lavó 3 veces con solución salina equilibrada de Hanks (Gibco). El sedimento celular lavado se suspendió en 20 ml de medio RPM11640 (ATCC) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) (Omega Scientific). Las PBMC resuspendidas se dividieron en dos matraces de cultivo T-175 y se añadieron 30 ml de RPMI/FBS al 10% a cada uno. Los matraces se incubaron durante una noche en un incubador a 37ºC/CO2 al 5%. El siguiente día, se recogieron las PBMC no adherentes, se

10 centrifugaron como anteriormente, se resuspendieron en RPMI que contenía FBS al 1% y se contaron usando un hemocitómetro.

Líneas celulares diana

Se obtuvieron líneas celulares de linfoma B de la ATCC y se cultivaron según se recomienda. El día antes del experimento, las células se dividieron 1:2. El siguiente día, la concentración se ajustó de 0,5 a 1 X 106 células/ml y 15 se añadieron alícuotas de 50 µl (de 25.000 a 50.000 células/pocillo) a una placa de cultivo tisular con fondo en U de 96 pocillos Becton Dickinson.

Titulaciones de IgG

Se prepararon diluciones de IgG diluyendo las muestras en RPMI que contenía FBS al 1%. Se añadieron alícuotas de cincuenta microlitros de IgG a las células diana en una placa de microtitulación de 96 pocillos y se mezclaron por 20 pipeteo suave. Las IgG se incubaron con las células diana durante 15 minutos a 37ºC/CO2 al 5% antes de añadir las células efectoras.

Células efectoras

Se añadieron cien microlitros de las PBMC resuspendidas a cada pocillo de la placa de células diana/IgG. La concentración de las PBMC se ajustó de modo que la proporción de efector:diana estuviera en el intervalo de 1025 20:1. Las placas se incubaron a 37ºC/CO2 al 5% durante 3-4 horas.

Detección de liberación de LDH

Después de la incubación, la placa se centrifugó a 1-2000 rpm durante 5-10 min. Se retiraron cuidadosamente cincuenta µl del sobrenadante evitando las células sedimentadas. Este sobrenadante se añadió directamente a una placa de fondo plano Dynex Immulon 2HB que contenía 50 µl de PBS por pocillo. A esta placa se añadieron 100 µl

30 de reactivo de detección LDH (Roche). La placa después se incubó durante aproximadamente 15-30 minutos y se leyó la DO a 490 nm usando un lector de microplaca Molecular Devices Vmax Kinetic.

Análisis de datos

Los datos se representaron como el log de la concentración de IgG frente a la A490 (véase la Figura 15). La A490 se convirtió en % de citotoxicidad usando la siguiente ecuación: % de citotoxicidad = (A490 experimental -A490

35 basal)/(A490 máxima -A490 basal)X 100, con la A490 máxima determinada añadiendo Triton X-100 al 2% a las células diana y la liberación basal medido para una mezcla de células efectoras y diana en ausencia de IgG sensibilizante. En base a los datos mostrados en la Figura 15, se demuestra que las CE50 de AME 33 con las mutaciones de Fc D280H y K290S eran coherentemente 1,5-2,0 veces inferiores que la de C2B8. Estos datos también se presentan en la siguiente Tabla 6.

40 Tabla 6

CE50 estimadas, ug/ml (células Wil-2 como diana)

C2B8 0,0042 +/-0,0008

AME 33 0,0063 +/-0,0031

AME 33 D280H 0,0031 +/-0,0009

AME 33 K290S 0,0021 +/-0,0005

Ejemplo 6

Glicodiseño de moléculas de unión a CD20

Este ejemplo describe procedimientos de glicodiseño que se aplicaron a ciertas moléculas de unión a CD20. En particular, se coexpresaron IgG AME 1C2 que albergaba regiones Fc de tipo silvestre o mutantes (D280H o K290S) en células CHO junto con la enzima β(1-4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III para aumentar la expresión de oligosacáridos bisegmentados en la región Fc. La combinación del glicodiseño y la región Fc mutante disminuyó la CE50 de 1C2 en ensayos de ADCC con relación al 1C2 no modificado o el anticuerpo RITUXAN comercial. El procedimiento se realizó como se describe a continuación.

El gen de la β(1-4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III se amplificó por PCR a partir de ADNc de riñón de rata (Clontech, Palo Alto, CA). Los cebadores de PCR introdujeron un sitio NheI en el extremo 5' del gen y un sitio EcoRI en el extremo 3' del gen (el cebador directo fue 5'-GGCGGCTAGCATGAGACGCTACAAGCTTTTTCTCATGTTCTG3', SEC ID Nº 103, y el cebador inverso fue 5'-GGCGGAATTCCTAGCCCTCCGTTGTATCCAACTTGC-3', SEC ID Nº 104). Después de la digestión de restricción y la purificación del producto de PCR se ligó en pcDNA3.1 NEO (Invitrogen, Carlsbad, CA) escindido de forma similar. El ADN plasmídico ligado se usó para transformar E. coli por electroporación. Se exploraron las colonias de E. coli resistentes a ampicilina para la presencia del gen de la β(1-4)N-acetilglucosaminiltransferasa III de rata usando PCR de colonias. El ADN plasmídico se aisló de los clones positivos y se secuenció. El ADN plasmídico de secuencia confirmada se linealizó con BspHI y se usaron aproximadamente 10 microgramos del ADN lineal para transfectar células CHO K1 usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Después de la selección con G418, se expandieron las colonias resistentes aisladas en cultivo tisular. El ARNm se aisló y se exploró para la producción cualitativa del ARN mensajero de la β(1-4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III de rata. Cada una de estas líneas celulares produjo un producto de PCR del tamaño anticipado mientras que las células CHOK1 no. El ADN que codifica la IgG anti-CD20 se usó para transfectar líneas celulares estables. Aproximadamente tres días después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se purificó por afinidad la IgG usando cromatografía con proteína

A. Después de la elución de las IgG de la columna de proteína A, las muestras se dializaron y se cuantificó la concentración de proteínas midiendo su absorbancia a 280 nm.

Se ensayaron las muestras de IgG expresadas a partir de diferentes líneas celulares CHOK1 para la capacidad de provocar citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) usando procedimientos descritos en el Ejemplo 5. Se usaron linfocitos de sangre periférica, aislados de sangre humana fresca como células efectoras y se usaron células B WIL.2s como células diana en estos experimentos. La cantidad de lisis de células diana se midió usando un ensayo convencional de liberación de lactato deshidrogenasa. La IgG expresada a partir de las líneas celulares CHOK1 diseñadas se comparó directamente con la IgG expresada a partir de las líneas celulares CHOK1 no diseñadas y el anticuerpo RITUXAN comercial para la capacidad de provocar ADCC. Además, se confirmó la presencia de un resto de azúcar N-acetilglucosamina de bisegmentación por análisis directo de glicosilación. Los resultados de los ensayos de ADCC para AME 1C2 se muestran en la Figura 16.

Ejemplo 7

Ensayos de apoptosis in vitro

Este ejemplo describe ciertos ensayos de apoptosis in vitro realizados con diversas moléculas de unión a CD20. En particular, se ensayaron AME 5, AME 33 y AME 6F1 (todos como anticuerpos completos), así como el anticuerpo C2B8, para su capacidad de inducir la apoptosis de la línea celular de linfoma B Ramos después de entrecruzamiento con IgG anti-humano. Estos ensayos se realizaron como se describe a continuación.

Tinción con anexina V-FITC

Las línea celular de linfoma B Ramos (ATCC) se dividió 1:2 24 horas antes de su uso. En el día del ensayo, las células Ramos se centrifugaron (1.000 rpm durante 5 min.), se lavaron con PBS, y se resuspendieron en RPMI más FBS inactivado por calor al 10% (medio) a una densidad celular de 5 X105 células/ml. Se añadieron un millón de células por pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos. Se añadió anticuerpo primario a las células a las concentraciones indicadas, las placas se agitaron suavemente durante 15 minutos y después se devolvieron a 37ºC durante 45 minutos adicionales. Se añadieron dos ml de anticuerpo de cabra anti-IgG humana precalentado (10 µg/ml) o medio a los pocillos especificados y las placas se incubaron a 37ºC durante 6 horas.

Las células se recogieron por centrifugación (1.000 rpm durante 5 min.) y se resuspendieron en 100 µl de tampón de unión 1X frío (diluido en agua a partir de la solución madre 10X) y 10 µl anexina V-FITC (Southern Biotech). Las muestras se transfirieron a tubos de fondo redondo de poliestireno (Falcon 2058) y se incubaron en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió tampón de unión que contenía yoduro de propidio, 2 µg/ml, y las muestras se analizaron en un citómetro de flujo Becton Dickinson Facscan usando el software CellQuest o WinMDI para el análisis de datos. La muerte celular (% de células apoptóticas más necróticas) midiendo el porcentaje de células que se teñían con anexina V. Los resultados de este ensayo mostraron que AMP 5, 33 y 6F1 inducían muerte celular a niveles similares a los observados con tratamiento con anticuerpo C2B8.

Ejemplo 8

Ensayos de citotoxicidad mediada por el complemento

Este ejemplo describe cómo se ensayó el anticuerpo C2B8, Synagis (control) y los anticuerpos AME 6F1, 2C2, 1D10, 15, 18, y 33 para su capacidad de mediar la citotoxicidad dependiente del complemento usando complemento humano y la línea celular de linfoma B Wil-2 como diana.

Las células de linfoma B Wil2-S (ATCC) se resuspendieron a 5x105/ml en RPMI+FBS inactivado por calor al 10%. Se mezclaron cincuenta microlitros de suspensión celular Wil2-S, 50 µl de IgG (que varía en concentración de 1 ng/ml a 75 µg/ml), y 50 µl de complemento humano diluido [1: 5] en una placa de 96 pocillos (Costar 3917). El anticuerpo y el complemento se diluyeron en RPMI+FBS al 10%. El anticuerpo y el complemento se diluyen en RPMI+FBS al 10%. Las células se incubaron durante 90 minutos a 37ºC en CO2 al 5%. Se añadió azul Alamar, 15 µl por pocillo, y la placa se incubó durante una noche a 37ºC en CO2 al 5%. La fluorescencia (que refleja la cantidad de células vivas) se registró usando excitación a 560 nm y detectando la emisión a 590 nm. Los resultados de estos ensayos muestran que las CE50 de todos los anticuerpos AME ensayados eran similares a la del anticuerpo C2B8.

Ejemplo 9

Administración in vivo de molécula de unión a CD20

Este ejemplo describe ensayos que se usaron para ensayar varias moléculas de unión a CD20 in vivo.

Se ensayaron los anticuerpos AME 45H, 1C2, 5-3, así como el anticuerpo C2B8, en ratones del siguiente modo. Se inyectó s.c. a ratones C.B.17-SCID (Taconic) macho de 6-8 semanas de edad en los costados derecho y izquierdo 5x106 células Raji (ATCC). Los anticuerpos se inyectaron por vía intraperitoneal a 0,01 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg y 0,5 mg/kg aproximadamente 2-3 horas después (día 0). Se midieron la longitud, la anchura y la altura del tumor con un calibre cada lunes, miércoles y viernes y se calculó el volumen del tumor. Los valores de CE50 se determinaron a partir de las curvas de respuesta a dosis. Las CE50 de AME 4H5, 1C2, y 5-3 no fueron coherentemente diferentes de la CE50 para el anticuerpo C2B8.

El anticuerpo AME 33 y el anticuerpo C2B8 también se ensayaron en ratones a los que se había inyectado 5x106 células Raji. Los ratones se trataron en el día tres con 0,5 mg/kg de AME 33 o C2B8. Los ratones de control recibieron solución salina. Los resultados (mostrados en la Figura 17) muestran que AME 33 y C2B8 inhibían el crecimiento de tumores Raji de una manera similar, permitiendo AME 33 menos crecimiento del tumor en el tiempo en comparación con C2B8.

Uso de moléculas de unión a CD20 para tratar enfermedades en seres humanos

Este ejemplo describe el uso de moléculas de unión a CD20 para el tratamiento terapéutico y profiláctico de ciertas enfermedades en un paciente humano incluyendo, aunque sin limitación, un trastorno seleccionado entre linfoma no Hodgkin (NHL) y lupus sistémico eritematoso (SLE).

Por ejemplo, a un paciente con una de las enfermedades enumeradas anteriormente puede administrarse una molécula de unión a CD20 tal como AME 21E1 Hum, AME 6F1, AME 2C2, AME 1D10, AME 15, AME 18, AME 33, AME 5-3, AME 1C2, AME4H5, o AME 5, por vía intravenosa de 0,4 a 20,0 mg/kg de peso corporal. Un programa de dosificación típico puede ser, por ejemplo, de 375 mg/m2 del anticuerpo administrado en forma de una infusión IV lenta una vez a la semana para 4 u 8 dosis. Se proporcionan regímenes de dosificación adicionales en la patente de Estados Unidos 6.399.061 de Anderson. El anticuerpo, o fragmento Fab, también puede radiomarcarse (por ejemplo, con itrio-[90]) para terapia y/o procedimientos de formación de imágenes in vivo (véase la patente de Estados Unidos 6.399.061). La respuesta a la terapia puede controlarse para determinar la necesidad de dosificaciones aumentadas

o reducidas y la necesidad de repetir el tratamiento. Se encuentran directrices adicionales sobre la respuesta a la terapia y programas de dosificación en la patente de Estados Unidos 6.399.061.

Serán evidentes diversas modificaciones y variaciones del procedimiento y sistema descritos de la invención para los especialistas en la técnica. Aunque la invención se ha descrito en relación a realizaciones preferidas específicas, debe entenderse que la invención reivindicada no debe limitarse excesivamente a dichas realizaciones específicas. De hecho, se pretende que diversas modificaciones de los modos descritos para realizar la invención que son obvias para los especialistas en química, medicina, y biología molecular o campos relacionados estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Una composición que comprende una molécula de unión a CD20, en la que dicha molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) por CD20 humana de 5,0 x 10-10 M o menos, y una velocidad de disociación (koff) para CD20 humana de 5,0 x 10-4 s-1 o menos, en la que dicha molécula de unión a CD20 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende:

a) una región variable de cadena ligera, en la que dicha región variable de cadena ligera comprende;

i) una secuencia de aminoácidos de CDRL1 de la SEC ID Nº 5;

ii) una secuencia de aminoácidos de CDRL2 de la SEC ID Nº 13; y

iii) una secuencia de aminoácidos de CDRL3 de la SEC ID Nº 19; y

b) una región variable de cadena pesada, en la que dicha región variable de cadena pesada comprende;

i) una secuencia de aminoácidos de CDRH1 de la SEC ID Nº 25;

ii) una secuencia de aminoácidos de CDRH2 de la SEC ID Nº 39; y

iii) una secuencia de aminoácidos de CDRH3 de la SEC ID Nº 57.
2.-La composición de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de unión a CD20 tiene una afinidad de unión (Kd) por CD20 humana de 1,5 x 10-10 M o menos.
3.-La composición de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la que dicha molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de disociación (koff) para CD20 humana de 2,5 x 10-4 s-1 o menos.
4.-La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha molécula de unión a CD20 tiene una velocidad de asociación (kon) para CD20 humana de 5,0 x 105 M-1 s-1 o mayor.
5.-La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 59.
6.-La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 61.
7.-La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 59 y dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 61.
8.-La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de unión a CD20 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEC ID Nº 67.
9.-La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de unión a CD20 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEC ID Nº 67 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEC ID Nº 69.
10.-La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de unión a CD20 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEC ID Nº 67 y una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 61.
11.-La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha molécula de unión a CD20 comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en la que la secuencia de aminoácidos de cada una de las cadenas ligeras es la que se muestra en la SEC ID Nº 67.
12.-Un anticuerpo que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en el que la secuencia de aminoácidos de las cadenas ligeras es la que se muestra en la SEC ID Nº 67 y la secuencia de aminoácidos de cada una de las cadenas pesadas comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 61.
13.-La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha región variable de cadena ligera comprende una región flanqueante completamente humana.
14.-La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha región variable de cadena ligera comprende una región flanqueante de la línea germinal humana.
15.-La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha región variable de cadena pesada comprende una región flanqueante completamente humana.
16.-La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha región variable de cadena pesada comprende una región flanqueante de la línea germinal humana.
17.-Una composición que comprende una molécula de unión a CD20 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso como medicamento.

5 18.-Uso de una molécula de unión a CD20 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para la preparación de una composición para el tratamiento de linfoma de células B.
19.-El uso de la reivindicación 18, en el que el linfoma de células B se selecciona entre el grupo que consiste en linfoma no Hodgkin y macroglobulinemia de Waldenstrom.
20.-Un sistema de un único vector que codifica una molécula de unión a CD20 de acuerdo con la reivindicación 1,

10 en el que dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de la SEC ID Nº 68 y una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de la SEC ID Nº 70.
21.-Un sistema de doble vector que codifica una molécula de unión a CD20 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho sistema de doble vector comprende un primer casete de expresión en un plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de la SEC ID Nº 68 y un segundo casete de expresión en un segundo

15 plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de la SEC ID Nº 70.