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ES2367847T3 - Método para la preparación enzimática de citronelal. - Google Patents

Método para la preparación enzimática de citronelal. Download PDF

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Publication number
ES2367847T3
ES2367847T3 ES06841443T ES06841443T ES2367847T3 ES 2367847 T3 ES2367847 T3 ES 2367847T3 ES 06841443 T ES06841443 T ES 06841443T ES 06841443 T ES06841443 T ES 06841443T ES 2367847 T3 ES2367847 T3 ES 2367847T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
reductase
reduction
enoato
polypeptide sequence
Prior art date
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Active
Application number
ES06841443T
Other languages
English (en)
Inventor
Andreas SCHÄDLER
Thomas Friedrich
Rainer STÜRMER
Sabine Rinck-Jahnke
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Publication date
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Active legal-status Critical Current
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)

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Abstract

Método para la producción de aldehídos o alcoholes saturados ópticamente activos de la fórmula (2) a partir de aldehídos αβ- insaturados de la fórmula (1) mediante reducción en presencia de una enoato-reductasa (i) con la secuencia de polipéptidos SEQ ID NO:1 o 2, o (ii) con una secuencia de polipéptidos la cual exhibe por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2. donde R 1 y R 2 significan independientemente uno de otro H, alquilo C1-C4, R 3 significa H, alquilo o alquenilo C1-C6 en forma ramificada y no ramificada.

Description

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La invención se refiere a un método enzimático para la producción de aldehídos o alcoholes saturados ópticamente activos de la fórmula a partir de aldehídos αβ -insaturados, en particular un método para la producción de citronelal. Estado de la técnica El (R)-(+) citronelal es un importante producto químico intermedio, el cual es empleado por ejemplo en la producción
de mentol.
Los métodos químicos para la producción de (R)-(+) citronelal proveniente de citral requieren procedimientos muy costosos (exclusión de oxígeno y agua), lo cual conduce a elevados costos en una síntesis técnica. Definición del objetivo Fue el objetivo de poner a disposición un método para la producción de citronelal mediante reducción
enantioselectiva de citral, el cual suministrara enantiómeros de citronelal tan puros como fuera posible en un elevado rendimiento químico.
Descripción de la invención La presente invención se refiere a un método para la producción de aldehídos o alcoholes saturados ópticamente activos de la fórmula (2) a partir de aldehídos αβ- insaturados de la fórmula (1) mediante reducción en presencia de una enoato-reductasa
(i)
con la secuencia de polipéptidos SEQ ID NO:1 o 2, o
(ii)
con una secuencia de polipéptidos la cual exhibe por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2.
imagen1
donde R1 y R2 significan independientemente uno de otro H, alquilo C1-C4, R3 significa H, alquilo o alquenilo C1-C6 en forma ramificada y no ramificada.
El método acorde con la invención puede ser ejecutado con aldehídos α,β insaturados de la fórmula (1), en los cuales R1 y R2 significan independientemente uno de otro H, alquilo C1-C4 en reforma ramificada y no ramificada, R3 significa H, alquilo o alquenilo C1-C6 en forma ramificada y no ramificada. Los radicales alquilo o alquenilo pueden estar sustituidos también una o varias veces.
Son sustratos particularmente adecuados para el método acorde con la invención los aldehídos α,β -insaturados de la fórmula (1), en los cuales R1 significa H, R2 significa CH3 y R3 significa -CH2-CH2-CH=(CH3)2 (citral en forma cis o trans) y aquellos en los cuales R1 significa CH3, R2 significa H y R3 significa CH3 (2- metil -pent-2-en-1-al).
Las enoato-reductasas acordes con la invención empleadas reducen ocasionalmente en forma parcial, aparte del doble enlace en posición α,β a la función carbonilo, también a la función carbonilo en sí misma, mediante lo que se forma entonces el correspondiente alcohol.
Para el método acorde con la invención son enoato-reductasas adecuadas aquellas enzimas que están en capacidad de reducir 2-metil-pent-2-en-1-al en una reacción dependiente de NADPH hasta (S)-2-metil-pentan-1-al. En lo que sigue, se denomina esta reacción también reacción modelo.
Además las enoato-reductasas adecuadas para el método acorde con la invención poseen una secuencia de polipéptidos según SEQ ID NO:1 o NO:2 o una secuencia de polipéptidos que exhibe por lo menos 80%,
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preferiblemente por lo menos 90%, particularmente preferido por lo menos 95% y en particular por lo menos 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2.
Un polipéptido con la SEQ ID NO:1 es el gen OYE2 de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae Genlocus YHR179W).
Un polipéptido con la SEQ ID NO:2 es el gen OYE3 de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae Genlocus YPL171C).
La investigación de la identidad de secuencia para el propósito aquí descrito, debería ocurrir mediante el programa de computador "GAP" del Grupo de Genética por Computador (GCG) de la Universidad de Wisconsin, donde debería usarse la versión 10.3 empleando los parámetros estándar recomendados por GCG.
Tales enoato-reductasas pueden ser obtenidas provenientes de SEQ ID NO:1 o 2 mediante métodos conocidos por los expertos de mutagénesis dirigida o aleatoria. Sin embargo, de modo alternativo pueden buscarse también enoato-reductasas en microorganismos, preferiblemente en aquellos de los géneros Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Brenneria, Buchnera (aphid P-endosymbionts), Budvicia, Buttiauxella, Candidatus Phlomobacter, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia o Yokenella, reductasas que catalizan la reacción modelo arriba mencionada y cuya secuencia de aminoácidos ya exhibe la identidad de secuencia necesaria hacia SEQ ID NO:1 o 2 o es obtenida mediante métodos de mutagénesis.
La enoato-reductasa puede ser empleada en forma purificada o parcialmente purificada o también en forma del microorganismo en sí mismo. Los métodos para la obtención y purificación de las deshidrogenasas a partir de microorganismo son ampliamente conocidos por los expertos.
La reducción enantioselectiva ocurre preferiblemente con la enoato-reductasa en presencia de un cofactor adecuado (también definido como cosustrato). Como cofactores para la reducción de la cetona sirven comúnmente NADH y/o NADPH. Aparte de ello pueden emplearse también enoato-reductasas como sistemas celulares, los cuales contienen de modo inherente cofactor, o de modo alternativo se añaden mediadores redox (A. Schmidt, F. Hollmann y B. Bühler "Oxidation of Alcohols" en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim).
La reducción enantioselectiva ocurre preferiblemente con la enoato-reductasa además en presencia de un agente reductor adecuado, el cual regenera al cofactor oxidado en el curso de la reducción. Son ejemplos de agentes reductores adecuados los azúcares, en particular hexosas, como glucosa, manosa, fructosa, y/o alcoholes que pueden oxidarse, en particular etanol, propanol o isopropanol, así como formiato, fosfito o hidrógeno molecular. Para la oxidación del agente reductor y unido a ello para la regeneración de la coenzima puede añadirse una segunda deshidrogenasa, como por ejemplo glucosa-deshidrogenasa en el empleo de glucosa como agente reductor, o formiato-deshidrogenasa en el empleo de formiato como agente reductor. Éste puede emplearse como enzima libre
o inmovilizada o en forma de células libres o inmovilizadas. Su producción puede ocurrir tanto separadamente como también mediante coexpresión en una cepa-reductasa (recombinante).
Una forma preferida de operar del método reivindicado es la regeneración de los cofactores mediante un sistema enzimático, en el cual se emplea una segunda deshidrogenasa, particularmente preferido una glucosadeshidrogenasa.
Otro objetivo de la invención es el empleo de la enoato-reductasa para la producción de citronelal.
En esta forma de operar se emplean preferiblemente como cofactores NAD+ o bien NADP+, los cuales pueden ser regenerados nuevamente con el correspondiente cosustrato (agente oxidante). Como cosustrato puede emplearse aquí preferiblemente acetona la cual regenera el cofactor con el ADH ya presente y/o una deshidrogenasa empleada adicionalmente, donde es reducida hasta isopropanol.
En el marco de la presente invención "enantioselectividad" significa que el exceso de enantiómero ee (en %) del enantiómero S, el cual se calcula de forma conocida según:
ee (%)= enantiómero S- enantiómero R / (enantiómero S – enantiómero R) x 100
es por lo menos 80 %, preferiblemente por lo menos 90 %, en particular por lo menos 95 % y especialmente por lo menos 97 %.
Las enoato-reductasas empleadas de acuerdo con la invención pueden emplearse libres o inmovilizadas. Se entiende por enzima inmovilizada una enzima que esta fija sobre un soporte inerte. A partir de las EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 y la DE-OS 100193773 así como de las citas de literatura allí consignadas se conocen materiales de soporte adecuados así como enzimas allí inmovilizadas. A los materiales de soporte adecuados pertenecen por ejemplo arcillas, minerales arcillosos, como caolinita, tierras diatomáceas, perlita, dióxido de silicio, óxido de aluminio, carbonato de sodio, carbonato de calcio, celulosa en polvo, materiales de intercambio aniónico, polímeros sintéticos como poliestireno, resina acrílica, resina de fenol formaldehído, poliuretanos y poliolefinas como polietileno y polipropileno. Los materiales de soporte son empleados para la producción de enzimas soportadas, comúnmente en forma de partículas muy finas, donde se prefieren las formas porosas. Comúnmente, el tamaño de partícula del material de soporte comúnmente es no mayor a 5 mm, en particular no mayor a 2 mm (curva granulométrica). De modo análogo en el empleo de la deshidrogenasa como catalizador de célula completa puede elegirse una forma libre o inmovilizada. Los materiales de soporte son por ejemplo alginato de calcio y carragenina. Las enzimas como también las células pueden entrelazarse también directamente con glutaraldehído (entrelazamiento hasta CLEAs). Métodos de inmovilización correspondiente y adicionales se describen por ejemplo en J. Lalonde y A. Margolin "Immobilization of Enzymes" in K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim.
La reacción puede ocurrir en medios de reacción acuosos o no acuosos o en sistemas de dos fases o (micro-) emulsiones. Los medios acuosos de reacción son preferiblemente soluciones tamponadas, que exhiben por regla general un pH de 4 a 8, preferiblemente de 5 a 8. Los solventes acuosos pueden contener, aparte de agua, por lo menos un alcohol, por ejemplo etanol o isopropanol o dimetilsulfóxido.
Se entiende por medios de reacción no acuosos los medios de reacción que contienen menos de 1 % en peso, preferiblemente menos de 0,5 % en peso de agua, referido al peso total del medio de reacción. Preferiblemente, la reacción es ejecutada en un solvente orgánico.
Son por ejemplo solventes adecuados los hidrocarburos alifáticos, preferiblemente con 5 a 8 átomos de carbono, como pentano, ciclopentano, hexano, ciclohexano, heptano, octano o ciclooctano, hidrocarburos alifáticos halogenados, preferiblemente con uno o dos átomos de carbono, como diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, dicloroetano o tetracloroetano, hidrocarburos aromáticos como benceno, tolueno, los xilenos, clorobenceno
o diclorobenceno, éteres o alcoholes alifáticos acíclicos y cíclicos, preferiblemente con 4 a 8 átomos de carbono, como dietiléter, metil-tert-butiléter, etil-tert-butiléter, dipropiléter, diisopropiléter, dibutiléter, tetrahidrofurano o ésteres como acetato de etilo o acetato de n-butilo o cetonas como metilisobutilcetona o dioxano o mezclas de ellos. De modo particularmente preferido se emplean los éteres antes mencionados, en particular tetrahidrofurano.
Preferiblemente se lleva a cabo la reducción con la enoato-reductasa en un medio de reacción acuoso-orgánico, en particular acuoso.
En la reducción enzimática, el sustrato (1) es empleado preferiblemente en una concentración de 0,1 g/l a 500 g/l, particularmente preferido de 1 g/l a 50 g/l y puede ser alimentado de modo continuo o discontinuo.
Por regla general la reducción enzimática ocurre a una temperatura de reacción por debajo de la temperatura de desactivación de la reductasa empleada y por encima de -10 °C. De modo particularmente preferido ella está en el rango de 0 a 100 °C, en particular de 15 a 60 °C y especialmente de 20 a 40 °C, como por ejemplo a aproximadamente 30°C.
Para la ejecución puede por ejemplo colocarse el sustrato (1) con la enoato-reductasa, el solvente y dado el caso la coenzima, dado el caso una segunda deshidrogenasa para la regeneración de la coenzima y/u otros agentes reductores y mezclar la mezcla, por ejemplo mediante agitación o sacudiendo. Es posible también inmovilizar la reductasa en un reactor, por ejemplo en una columna y conducir a través del reactor una mezcla que contiene el sustrato y dado el caso coenzima y/o cosustrato. Para esto puede conducirse la mezcla en el circuito a través del reactor hasta que se alcanza el rendimiento deseado.
En ello se reduce hasta enlace sencillo el doble enlace en la posición α,β a la función carbonilo; ocasionalmente ocurre también una reducción de la función carbonilo en sí misma hasta la función alcohol. Por regla general se conduce la reducción hasta un rendimiento de por lo menos 70 %, particularmente preferido de por lo menos 85 % y en particular de por lo menos 95%, referido al sustrato presente en la mezcla. En ello, pueden hacerse seguimiento al avance de la reacción, es decir la reducción secuencial del doble enlace, mediante métodos comunes como cromatografía de gases o cromatografía líquida de alta presión.
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En el marco de la presente invención, "equivalentes funcionales" o análogos de la enzima manifestados de modo concreto son polipéptidos diferentes de ella, los cuales poseen además la actividad biológica deseada, como por ejemplo especificidad al sustrato. De este modo se entienden por ejemplo por "equivalentes funcionales" enzimas que catalizan la reacción modelo y exhiben por lo menos 20 %, preferiblemente 50 %, particularmente preferido 75 %, muy particularmente preferido 90 % de la actividad de una enzima, incluyendo una de las secuencias de aminoácidos mencionadas bajo SEQ ID NO:1 o 2. Además los funcionales equivalentes son estables preferiblemente entre pH 4 a 10 y poseen de modo ventajoso pH óptimo entre pH 5 y 8 así como una temperatura óptima en el rango de 20°C a 80°C.
De acuerdo con la invención se entiende por "equivalentes funcionales" en particular también mutantes, los cuales en por lo menos una posición de secuencia de las secuencias de aminoácidos arriba mencionadas exhiben otra diferente a la del de aminoácido mencionado concretamente pero que a pesar de ello poseen una de las actividades biológicas arriba mencionadas. "Equivalentes funcionales" incluyen con ello los mutantes obtenibles mediante una o varias readiciones, sustituciones, borrados y/o inversiones de aminoácidos, donde pueden tener lugar los cambios mencionados en las respectivas posiciones, en tanto ellos conduzcan a un mutante con perfil de propiedades acorde con la invención. En particular se da la equivalencia funcional también cuando el patrón de reactividad entre el mutante y el polipéptido no cambiado coincide cualitativamente, es decir por ejemplo sustratos iguales reaccionan con diferente velocidad.
De la siguiente tabla pueden tomarse ejemplos de sustituciones adecuadas de aminoácidos: En el sentido dado arriba, "equivalentes funcionales" son también "precursores" de los polipéptidos descritos así como "derivados funcionales".
Radical original
Ejemplos de la sustitución
Ala
Ser
Arg
Lys
Asn
Gln; His
Asp
Glu
Cys
Ser
Gln
Asn
Glu
Asp
Gly
Pro
His
Asn ; Gln
Ile
Leu; Val
Leu
Ile; Val
Lys
Arg ; Gin ; Glu
Met
Leu ; Ile
Phe
Met ; Leu ; Tyr
Ser
Thr
Thr
Ser
Trp
Tyr
Tyr
Trp ; Phe
Val
Ile; Leu
En ello son "precursores" los precursores naturales o sintéticos de los polipéptidos con o sin la actividad biológica deseada.
Así mismo, pueden producirse "derivados funcionales" de polipéptidos acordes con la invención en grupos funcionales aminoácido laterales o en sus extremos N- o C-terminales, con ayuda de técnicas conocidas. Tales derivados incluyen por ejemplo ésteres alifáticos de grupos ácido carboxílico, amidas de grupos ácido carboxílico, obtenibles mediante reacción con amoniaco o con una amina primaria o secundaria; N-acilderivados de grupos amino libres producidos mediante reacción con grupos acilo; u O-acilderivados de grupos hidroxi libre, producidos mediante reacción con grupos acilo.
En el caso de una posible glicosilación de proteína, "equivalentes funcionales" acordes con la invención incluyen proteínas del tipo definido arriba en forma desglicosilada o glicosilada así como formas obtenibles modificadas mediante el cambio del patrón de glicosilación.
Naturalmente "equivalentes funcionales" incluyen también polipéptidos que son accesibles a partir de otros organismos, así como variantes que se encuentran de modo natural. Por ejemplo, mediante comparación de secuencias, se fijan rangos de regiones de secuencia homóloga y con base en los requisitos concretos de la invención, se determina la enzima equivalente.
Así mismo "equivalentes funcionales " incluyen fragmentos, preferiblemente dominios individuales o motivos de secuencia de los polipéptidos acordes con la invención, los cuales por ejemplo exhiben la función biológica deseada.
Son además "equivalentes funcionales" las proteínas de fusión , los cuales exhiben una de las secuencias de polipéptidos arriba mencionadas o equivalentes funcionales derivados de ellas y por lo menos otra secuencia heteróloga funcionalmente diferente de ella en unión funcional N- o C-terminal (es decir sin deterioro recíproco funcional esencial de la fracción de fusión de proteína). Son ejemplos no limitantes de tales secuencias heterólogas por ejemplo péptidos de señal o enzimas.
Pueden identificarse homólogos de la proteína acorde con la invención mediante discriminación de bancos combinatorios de mutantes, como por ejemplo mutantes de acortamiento. Por ejemplo puede generarse un variado banco de variantes de proteína mediante mutagénesis combinatoria en planos de ácido nucleico, como por ejemplo mediante ligado enzimático de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos. Existe por ejemplo una multiplicidad de métodos que pueden ser empleados para la producción de bancos de homólogos potenciales de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. La síntesis química de una secuencia contraria degenerada puede ser ejecutada en un equipo de síntesis de ADN y el gen sintético puede entonces ser ligado en un vector adecuado de expresión. El empleo de una frase degenerada de gen hace posible el suministro de secuencias completas en una mezcla que codifica la frase deseada en secuencias potenciales de proteína. Los expertos conocen métodos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados (por ejemplo Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).
En el estado de la técnica se conocen varios métodos para el discriminación de productos de gen de bancos combinatorios, que habían sido producidos mediante mutaciones puntuales o acortamiento, y para el discriminación de bancos cADN en productos de gen con una propiedad elegida. Estas técnicas se adaptan a la discriminación rápida de bancos de gen, los cuales habían sido generados mediante mutagénesis combinatoria de homólogos acordes con la invención. Las técnicas más frecuentemente empleadas para el discriminación de grandes bancos de gen, las cuales están sujetas a un análisis con elevada eficiencia, incluyen la clonación del banco de gen en vectores de expresión que pueden ser replicados, la transformación de células adecuadas con el bancos resultantes de vectores y la expresión de los genes combinatorios, bajo condiciones bajo las cuales la demostración de la actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue demostrado. La RecursiveEnsemble-Mutagenese (REM), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales, puede ser empleada en combinación con las técnicas de discriminación, para identificar homólogos (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).
Son además objetivos de la invención secuencias de ácido nucleico (secuencias de ADN y ARN de cuerda sencilla y cuerda doble, como por ejemplo cADN y mARN) que codifican para una enzima con la actividad de reductasa acorde con la invención. Se prefieren secuencias de ácido nucleico los cuales codifican por ejemplo para secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO:1 o 2 o secuencias parciales características de ellos.
Todas las secuencias de ácidos nucleicos aquí mencionadas pueden ser producidas de manera de por si conocida, mediante síntesis química a partir de las unidades estructurales de nucleótidos, como por ejemplo mediante condensación de fragmentos de elementos constituyentes de ácido nucleico de la doble hélice, que se traslapan de modo individual y son complementarios. La síntesis química de oligonucleótidos puede ocurrir por ejemplo de manera conocida según el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2ª edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La adición de oligonucleótidos sintéticos y el rellenado de brechas con ayuda de fragmento de Klenow de la ADNpolimerasa y reacciones de ligado así como métodos generales de clonación son descritos en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Otras modificaciones para la ejecución del método de reducción enzimática acorde con la invención
Las enoato-reductasas pueden ser empleadas en el método acorde con la invención como enzima libre o inmovilizada.
El método acorde con la invención es ejecutado de modo ventajoso a una temperatura entre 0 °C a 95 °C, preferiblemente entre 10 °C a 85 °C, particularmente preferido entre 15 °C a 75 °C.
El valor de pH en el método acorde con la invención es mantenido ventajosamente entre pH 4 y 12, preferiblemente entre pH 4,5 y 9, particularmente preferido entre pH 5 y 8. En el método acorde con la invención se entiende por productos de enantiómeros puros o bien productos quirales (2) los enantiómeros que muestran un enriquecimiento enantiomérico. Preferiblemente en el método se alcanzan purezas de enantiómero de por lo menos 70 %ee, preferiblemente de por lo menos 80 %ee, particularmente preferido de por lo menos 90 %ee, muy particularmente preferido de por lo menos 98 %ee.
Para el método acorde con la invención pueden emplearse células en crecimiento que contienen los ácidos nucleicos, estructuras de ácidos nucleicos o vectores acordes con la invención. También pueden emplearse células en reposo o células desintegradas. Se entiende por células desintegradas por ejemplo células que mediante un tratamiento con, por ejemplo, solventes habían sido convertidas en porosas, o células que por un tratamiento enzimático, por un tratamiento mecánico (por ejemplo celda de presión o ultrasonido) o por otro método fue abierta. Los extractos crudos así obtenidos son adecuados de modo ventajoso para el método acorde con la invención. Para el método también pueden emplearse enzimas purificadas o no. Así mismo son adecuados microorganismos o enzimas inmovilizados, los cuales pueden encontrar aplicación de modo ventajoso en la reacción.
El método acorde con la invención puede ser operado por lotes, en forma semicontinua o continua.
La ejecución del método puede ocurrir de modo ventajoso en bioreactores, como se describe por ejemplo en Biotechnology, volumen 3, 2ª edición, Rehm et al Hrsg., (1993) en particular capítulo II.
Los siguientes ejemplos deberían ilustrar la invención, sin que ellos sin embargo la limiten. Con esto se hace referencia a cualquier ilustración, que muestra:
Parte experimental
Biotransformación de 2-metil-pent-2-en-1-al con Saccharomyces cerevisiae
Las biotransformaciones fueron ejecutadas en matraces Erlenmeyer de 500 ml con deflectores internos. Estaban presentes 126 ml de solución de transformación. A las cargas se añadieron 21 g de D-glucosa. Se ajustó el valor deseado de pH (entre 6 y 8,5). La cantidad de sustrato era de 200 mg de 2-metil-pent-2-en-1-al por matraz. En el punto inicial de tiempo se añadieron 21 g de levadura de panadería y se ajustaron las cargas a la temperatura deseada (entre 28 y 37°C) en el armario de incubación (agitado con 240 rpm). Se tomaron muestras después de 6, 12, 18, 24, 36, 48 horas y se las analizó por cromatografía de gases.
Se alcanzó la tasa más alta de rendimiento a valores de pH entre 7,5 y 8,5 (40-70%). A un valor de pH= 8,5 y T=37°C se tuvo una pureza óptica de ee=92,1 con un rendimiento de 66,6%.
Biotransformación de citral con Saccharomyces cerevisiae
Se llevaron a cabo las biotransformaciones en matraces Erlenmeyer de 500 ml con deflectores internos. Estaban presentes 126 ml de solución de transformación. A las cargas se añadieron 21 g de D-glucosa. Se ajustó el valor deseado de pH (entre 6 y 8,5). La cantidad de sustrato era de 210 mg de citral por matraz. (El citral era una mezcla cis/trans de 70:30). En el punto inicial de tiempo se le añadieron 21 g de levadura de panadería y se ajustaron las cargas a la temperatura deseada (entre 28 y 37°C) en el armario de incubación (agitando con 240 rpm). Se tomaron muestras después de 6, 12, 18, 24, 36, 48 horas y se las analizó por cromatografía de gases.
Aparte de (R)-(+)-citronelal se obtuvieron también aún (R)-(+)-ß-citronelol así como nerol y geraniol.
Solución de transformación 53,4 g de Na2HPO4 y 21 g de D-glucosa y 126 ml de agua destilada (pH ajustado entre 6 y 8,5). LISTADO DE SECUENCIA
<110> BASF AG. 5 <120> Método para la producción enzimática de citronelal
<130> AE20040629
<160> 2
<170> Patentin versión 3. 1
<210> 1 10 <211> 400
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
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Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método para la producción de aldehídos o alcoholes saturados ópticamente activos de la fórmula (2) a partir de aldehídos αβ- insaturados de la fórmula (1) mediante reducción en presencia de una enoato-reductasa
    (i)
    con la secuencia de polipéptidos SEQ ID NO:1 o 2, o
    (ii)
    con una secuencia de polipéptidos la cual exhibe por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2.
    imagen1
    donde R1 y R2 significan independientemente uno de otro H, alquilo C1-C4, R3 significa H, alquilo o alquenilo C1-C6 en forma ramificada y no ramificada.
    10 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se ejecuta la reducción con NADPH como cofactor.
  2. 3.
    Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el cofactor empleado es regenerado enzimáticamente.
  3. 4.
    Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la regeneración del cofactor ocurre mediante glucosadeshidrogenasa.
  4. 5.
    Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se realiza la reducción en un sistema acuoso.
    15 6. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la enoato-reductasa está presente inmovilizada.
  5. 7. Empleo de una enoato-reductasa
    (i)
    con las secuencias de polipéptidos SEQ ID NO:1 o 2, o
    (ii)
    con una secuencia de polipéptidos que exhibe por lo menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 o 2,
    20 en un método para la producción de (R)-(+) citronelal a partir de citral.
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