ES2346178T3

ES2346178T3 - Nuevas composiciones, procedimientos y usos de unión de la albúmina

Info

Publication number: ES2346178T3
Application number: ES08786222.3T
Authority: ES
Inventors: Lars Abrahmsén; Andreas Jonsson; Jakob Dogan; Per-Åke Nygren
Original assignee: Affibody AB
Current assignee: Affibody AB
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2008-07-17
Publication date: 2015-11-02
Anticipated expiration: 2028-07-17
Also published as: CN101765608B; EP2546261A3; CA2694139C; US20150158916A1; US8937153B2; JP2010534486A; US10118949B2; AU2008281913B2; HK1211040A1; CN104710518A; JP5718638B2; US20100273979A1; CA2694139A1; DK2190863T3; EP2190863B1; WO2009016043A2; DE08786222T1; EP2190863A2; CN101765608A; AU2008281913A1

Abstract

Polipéptido de unión a la albúmina que comprende un motivo de unión a la albúmina, donde el motivo consiste en la secuencia de aminoácidos: GVSDX5YKX8X9I X11X12AX14TVEGVX20 ALX23X24X25I en la que, cada uno independientemente de los otros, X5 es seleccionado de entre Y y F; X8 es seleccionado de entre N, R y S; X9 es seleccionado de entre V, I, L, M, F y Y; X11 es seleccionado de entre N, S, E y D; X12 es seleccionado de entre R, K y N; X14 es seleccionado de entre K y R; X20 es seleccionado de entre D, N, Q, E, H, S, R y K; X23 es seleccionado de entre K, I y T; X24 es seleccionado de entre A, S, T, G, H, L y D; y X25 es seleccionado de entre H, E y D; a condición de que la secuencia de aminoácidos no sea GVSDYYKNLI NNAKTVEGVK ALIDEI; el polipéptido de unión a la albúmina uniéndose a la albúmina de tal manera que el valor KD de la interacción es como máximo de 1 x 10-9 M.

Description

E08786222

09-10-2015

DESCRIPCIÓN

Nuevas composiciones, procedimientos y usos de unión de la albúmina

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una clase de polipéptidos genomanipulados que tienen afinidad de unión por albúmina. Se refiere también a nuevos procedimientos y usos que explotan la unión de estos y otros compuestos a albúmina en diferentes contextos, algunos de los cuales tienen importancia para el tratamiento de enfermedades en mamíferos incluyendo seres humanos.

Antecedentes

Seroalbúmina

La seroalbúmina es la proteína más abundante en los sueros de mamífero (40 g/l; aproximadamente 0,7 mM en seres humanos), y una de sus funciones es unirse a moléculas tales como lípidos y bilirrubina (Peters T, Advances in Protein Chemistry 37: 161, 1985). La semivida de la seroalbúmina es directamente proporcional al tamaño del animal, en que por ejemplo la seroalbúmina humana (HSA) tiene una semivida de 19 días y la seroalbúmina de conejo tiene una semivida de aproximadamente 5 días (McCurdy TR et al., J. Lab. Clin. Med. 143: 115, 2004). La seroalbúmina humana está ampliamente distribuida por el cuerpo, en particular en los compartimentos intestinal y sanguíneo, donde está principalmente implicada en el mantenimiento de la osmolaridad. Estructuralmente, las albúminas son proteínas monocatenarias que comprenden tres dominios homólogos y totalizan 584 o 585 aminoácidos (Dugaiczyk L et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 71, 1982). Las albúminas contienen 17 puentes disulfuro y un solo tiol reactivo, C34, pero carecen de restos carbohidrato N-ligados y O-ligados (Peters, 1985, supra; Nicholson JP et al., Br. J. Anaesth. 85: 599, 2000). La falta de glicosilación simplifica la expresión recombinante de albúmina. Esta propiedad de la albúmina, junto con el hecho de que su estructura tridimensional sea conocida (He XM y Carter DC, Nature 358: 209, 1992), la ha hecho un candidato atractivo para uso en proteínas de fusión recombinantes. Dichas proteínas de fusión combinan generalmente una proteína terapéutica (que se aclararía rápidamente por el cuerpo tras la administración de la proteína como tal) y una proteína plasmática (que exhibe un aclaramiento natural lento) en una sola cadena polipeptídica (Sheffield WP, Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 1: 1, 2001). Dichas proteínas de fusión pueden proporcionar beneficios clínicos al requerir una inyección menos frecuente y mayores niveles de proteína terapéutica in vivo.

La fusión o asociación con HSA da como resultado una semivida un vivo aumentada de las proteínas

La seroalbúmina está desprovista de cualquier función enzimática o inmunológica y, por tanto, no debería exhibir efectos secundarios indeseados tras acoplamiento con un polipéptido bioactivo. Además, la HSA es un portador natural implicado en el transporte y suministro endógenos de numerosas moléculas naturales así como terapéuticas (Sellers EM y Koch-Weser MD, “Albumin Structure, Function and Uses”, eds Rosenoer VM et al., Pergamon, Oxford, pág. 159, 1977). Se han reseñado varias estrategias para acoplar covalentemente proteínas directamente con seroalbúminas o con un péptido o proteína que permitan la asociación in vivo con seroalbúminas. Se han descrito ejemplos del segundo enfoque, por ejemplo, en los documentos WO91/01743, WO01/45746 y en Dennis et al., J. Biol. Chem. 277: 35035-43 (2002). El primer documento describe, entre otros, el uso de péptidos o proteínas de unión a albúmina derivados de la proteína G estreptocócica (SpG) para aumentar la semivida de otras proteínas. La idea es fusionar el péptido/proteína de unión a albúmina derivado de bacteria con un péptido/proteína terapéuticamente interesante que se ha mostrado que tiene un aclaramiento rápido en la sangre. La proteína de fusión así generada se une a seroalbúmina in vivo y se beneficia de su semivida más larga, lo que aumenta la semivida neta del péptido/proteína terapéuticamente interesante fusionado. El documento WO01/45746 y Dennis et al. se refieren al mismo concepto, pero aquí los autores utilizan péptidos relativamente cortos para unirse a seroalbúmina. Los péptidos se seleccionaron a partir de una colección de péptidos presentados en fago. En Dennis et al., se mencionan trabajos anteriores en que se encontró la potenciación de la respuesta inmunológica ante una fusión recombinante del dominio de unión a albúmina de proteína G estreptocócica con receptor de complemento humano de tipo 1. La solicitud de patente de EE.UU. publicada como US2004/0001827 (Dennis) da a conocer también el uso de constructos que comprenden ligandos peptídicos, identificados de nuevo mediante tecnología de presentación en fago, que se unen a seroalbúmina y que se conjugan con compuestos bioactivos para orientación a tumor.

La asociación con HSA da como resultado una inmunogenicidad reducida

Además del efecto sobre la semivida in vivo de una proteína biológicamente activa, se ha propuesto que la asociación no covalente con albúmina de una fusión entre una proteína biológicamente activa y una proteína de unión a albúmina actúa reduciendo la respuesta inmunitaria ante la proteína biológicamente activa. Por tanto, en el documento WO2005/097202 se describe el uso de este principio para reducir o eliminar la respuesta inmunitaria de una proteína biológicamente activa.

E08786222

09-10-2015

Dominios de unión a albúmina de proteínas receptores bacterianos

La proteína G estreptocócica (SpG) es un receptor bifuncional presente sobre la superficie de ciertas cepas de estreptococos y es capaz de unirse tanto a IgG como a seroalbúmina (Björck et al., Mol. Immunol. 24: 1113, 1987). Su estructura es altamente repetitiva, con varios dominios estructural y funcionalmente diferentes (Guss et al., EMBO J. 5: 1567, 1986), más precisamente tres motivos de unión a Ig y tres dominios de unión a seroalbúmina (Olsson et al., Eur. J. Biochem. 168: 319, 1987). Se ha determinado la estructura de uno de los tres dominios de unión a seroalbúmina, mostrando un dominio de haz de tres hélices (Kraulis et al., FEBS Lett. 378: 190, 1996). Este motivo se ha denominado ABD (dominio de unión a albúmina en inglés) y es de 46 residuos aminoacídicos de tamaño. En la bibliografía, se ha designado posteriormente también como G148-GA3.

Se han identificado también otras proteínas de unión a albúmina bacterianas distintas de proteína G de Streptococcus que contienen dominios similares a los dominios de tres hélices de unión a albúmina de la proteína G. Son ejemplos de dichas proteínas las proteínas PAB, PPL, MAG y ZAG. Se han llevado a cabo y se han reseñado estudios de la estructura y función de dichas proteínas de unión a albúmina por Johansson y colaboradores (Johansson et al., J. Mol. Biol. 266: 859-865, 1997; Johansson et al., J. Biol. Chem. 277: 8114-8120, 2002), que introdujeron la denominación “módulo GA” (módulo de unión a albúmina relacionado con la proteína G) para el dominio de proteína de tres hélices responsable de la unión a albúmina. Además, Rozak et al. han reseñado la creación de variantes artificiales del módulo GA, que se seleccionaron y estudiaron con respecto a diferentes especificidad de especie y estabilidad (Rozak et al., Biochemistry 45: 3263-3271, 2006). En la presente divulgación, se seguirá la terminología con respecto a los módulos de GA de diferentes especies bacterianas establecida en los artículos de Johansson et al. y Rozak et al.

Además de las proteínas que contienen tres hélices descritas anteriormente, existen otras proteínas bacterianas que se unen a albúmina. Por ejemplo, la familia de proteínas estreptocócicas designada como “proteínas M” comprende miembros que se unen a albumina (véase, p.ej., la Tabla 2 en Navarre y Schneewind, MMBR 63: 174-229, 1999). Son ejemplos no limitantes las proteínas M1/Emm1, M3/Emm3, M12/Emm12, EmmL55/Emm55, Emm49/EmmL49 y

H.

Transcitosis de HSA mediada por el receptor de Fc neonatal (FcRn)

El receptor de Fc neonatal relacionado con MHC de clase I (FcRn) media el tráfico celular y el reciclaje de albúmina e IgG (Brambell et al., Nature 203: 1352, 1964; Chaudhury et al., J. Exp. Med. 197: 315, 2003). El FcRn, también conocido como receptor Brambell, se une específicamente a albúmina e IgG a bajo pH endosómico y por tanto protege a las proteínas pinocitosadas de la degradación lisosómica mediante transporte a la superficie celular y liberación a pH neutro. El FcRn tiene una buena afinidad tanto por albúmina como IgG a pH 5-6, mientras que muestra baja o ninguna afinidad a pH neutro. De esta manera, se regulan las concentraciones y semividas de albúmina e IgG. Además, el FcRn es responsable del transporte activo de albúmina e IgG por barreras celulares, p.ej., el epitelio de las vías respiratorias y el epitelio que cubre intestinos y placenta.

Como resulta evidente a partir de las diferentes secciones de esta descripción de los antecedentes, la provisión de una selección de moléculas polipeptídicas con alta afinidad por albúmina es un factor clave en el desarrollo de diversas aplicaciones biomédicas, biotecnológicas y otras, y hay por lo tanto la necesidad en la materia de moléculas polipeptídicas adicionales a estas.

Divulgación de la invención

El primer aspecto de la invención satisface la necesidad de polipéptidos novedosos con una afinidad comparablemente alta por albúmina mediante la provisión de un polipéptido de unión a albúmina que comprende un motivo de unión a albúmina, consistiendo dicho motivo en la secuencia aminoacídica:

GVSDX5YKX8X9IX11X12AX14TVEGVX20ALX23X24X25I

en la que, independientemente entre sí,

X5 se selecciona de Y y F;

X8 se selecciona de N, R y S;

X9 se selecciona de V, I, L, M, F e Y;

X11 se selecciona de N, S, E y D;

X12 se selecciona de R y K;

X14 se selecciona de K y R;

X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S y R;

X23 se selecciona de K, I y T;

X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D; y

X25 se selecciona de H, E y D;

uniéndose el polipéptido de unión a albúmina a la albúmina de tal modo que el valor de KD de la interacción sea como máximo de 1 x 10-9 M.

E08786222

09-10-2015

La definición anterior de una clase de polipéptidos de unión a albúmina relacionada con la secuencia según la invención está basada en el análisis estadístico de un gran número de polipéptidos de unión a albúmina identificados y caracterizados como se detalla en la sección experimental a continuación. Se seleccionaron las variantes a partir de un gran conjunto de variantes aleatorias de una secuencia polipeptídica original o “armazón”, estando basada dicha selección en una interacción con albúmina, p.ej., en experimentos de presentación en fago u otros de selección. El motivo de unión a albúmina identificado, o “ABM”, corresponde a la región de unión a albúmina del armazón original, constituyendo dicha región dos hélices  en un dominio de proteína de haz de tres hélices. Aunque los residuos aminoacídicos originales de las dos hélices ABM en el armazón original constituyen ya una superficie de unión para interacción con albúmina, esa superficie de unión está modificada por las sustituciones según la invención para proporcionar una capacidad de unión a albúmina alternativa.

Como se dará cuenta un especialista en la materia, la función de cualquier polipéptido, tal como la capacidad de unión a albúmina de los polipéptidos según la invención, depende de la estructura terciaria del polipéptido. Es por lo tanto posible hacer cambios menores en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido sin afectar a la función del mismo. Por tanto, la invención engloba variantes modificadas del ABM que son tales que se retienen las características de unión a albúmina. Por ejemplo, es posible que pudiera intercambiarse un residuo aminoacídico perteneciente a cierto agrupamiento funcional de residuos aminoacídicos (p.ej., hidrófobo, hidrófilo, polar, etc.) por otro residuo aminoacídico del mismo grupo funcional.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X5 es Y.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X8 se selecciona de N y R, y puede ser en particular R.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X9 es L.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X11 se selecciona de N y S, y puede ser en particular N.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X12 se selecciona de R y K, tal como siendo X12 R o siendo X12 K.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X14 es K.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S y R, y puede ser en particular E.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X23 se selecciona de K e I, y puede ser en particular K.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X24 se selecciona de A, S, T, G, H y L.

En una realización más específica del polipéptido según este aspecto de la invención, X24 es L.

En una realización aún más específica del polipéptido según este aspecto de la invención, X23X24 es KL.

En otra realización aún más específica del polipéptido según este aspecto de la invención, X23X24 es TL.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X24 se selecciona de A, S, T, G y H.

En una realización más específica del polipéptido según este aspecto de la invención, X24 se selecciona de A, S, T, G y H y X23 es I.

En una realización del polipéptido según este aspecto de la invención, X25 es H. Como se describe con detalle en la sección experimental siguiente, la selección de variantes de unión a albúmina ha conducido a la identificación de una cantidad sustancial de secuencias de motivo de unión a albúmina (ABM) individuales. Las secuencias de motivos de unión a albúmina individuales se presentan en la Figura 1 y como SEQ ID NO:1-257.

En una realización específica de este aspecto de la invención, se selecciona la secuencia de ABM de las de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:53 y SEQ ID NO:239.

En realizaciones de la presente invención, el ABM puede formar parte de un dominio de proteína de haz de tres hélices. Por ejemplo, el ABM puede constituir esencialmente, o formar parte de, dos hélices  con un bucle de interconexión en dicho dominio de proteína de haz de tres hélices.

En realizaciones particulares de la invención, dicho dominio de proteína de haz de tres hélices se selecciona del

E08786222

09-10-2015

grupo consistente en dominios de tres hélices de proteínas receptores bacterianos. Los ejemplos no limitantes de dichas proteínas receptores bacterianos pueden seleccionarse del grupo consistente en proteínas receptor de unión a albúmina de especies de Streptococcus, Peptostreptococcus y Finegoldia, tales como por ejemplo seleccionados del grupo consistente en las proteínas G, MAG, ZAG, PPL y PAB. En una realización específica de la invención, el ABM forma parte de la proteína G, tal como por ejemplo proteína G de Streptococcus cepa G148. En diferentes variantes de esta realización, el dominio de proteína de haz de tres hélices del que forma parte el ABM se selecciona del grupo consistente en dominio GA1, dominio GA2 y dominio GA3 de proteína G de Streptococcus cepa G148, en particular el dominio GA3.

En realizaciones alternativas, el ABM forma parte de uno o más de los cinco dominios de tres hélices de la proteína receptor bacteriano proteína A de Staphylococcus aureus; concretamente, el dominio de proteína de haz de tres hélices se selecciona del grupo consistente en los dominios de proteína A A, B, C, D y E. En otras realizaciones similares, el ABM forma parte de la proteína Z derivada del dominio B de proteína A de Staphylococcus aureus.

En realizaciones de la presente invención en las que el ABM "forma parte de” un dominio de proteína de haz de tres hélices, se entiende que esto significa que la secuencia del ABM se "inserta" o “injerta” en la secuencia del dominio de haz de tres hélices de origen natural (o de otro modo original), de tal modo que el ABM reemplaza un motivo estructural similar en el dominio original. Por ejemplo, sin desear ligarse a teoría alguna, se cree que el ABM constituye dos de las tres hélices de un haz de tres hélices, y por lo tanto puede reemplazar dicho motivo de dos hélices en cualquier haz de tres hélices. Como se dará cuenta el especialista en la materia, el reemplazo de dos hélices del dominio de haz de tres hélices por las dos hélices ABM tiene que efectuarse de modo que no afecte a la estructura básica del polipéptido. Es decir, el plegamiento global del esqueleto de Cα del polipéptido según esta realización de la invención será sustancialmente el mismo que el del domino de proteína de haz de tres hélices del que forma parte, p.ej., al tener los mismos elementos de estructura secundaria en el mismo orden, etc. Por tanto, un ABM según la invención “forma parte” de un dominio de haz de tres hélices si el polipéptido según esta realización de la invención tiene el mismo plegamiento que el dominio original, conllevando que se comparten las propiedades estructurales básicas, dando como resultado esas propiedades, p.ej., espectros de DC similares. El especialista en la materia es consciente de otros parámetros que son relevantes.

En una realización de la invención, el polipéptido de unión a albúmina es un dominio de proteína de haz de tres hélices que comprende el motivo de unión a albúmina como se define anteriormente y secuencias adicionales que componen el resto de la configuración de tres hélices. Por tanto, la invención proporciona un polipéptido de unión a albúmina que comprende la secuencia aminoacídica:

LAEAKXaXbAXcXdELXeKY-[ABM]-LAALP

en la que

[ABM] es un motivo de unión a albúmina como se define anteriormente, e, independientemente entre sí,

Xa se selecciona de V y E;

Xb se selecciona de L, E y D;

Xc se selecciona de N, L e I;

Xd se selecciona de R y K; y

Xe se selecciona de D y K.

En una realización de este polipéptido, Xa es V.

En una realización de este polipéptido, Xb es L.

En una realización de este polipéptido, Xc es N.

En una realización de este polipéptido, Xd es R.

En una realización de este polipéptido, Xe es D.

De nuevo, como se describe con detalle en la sección experimental siguiente, la selección y secuenciación de una serie de variantes de unión a albúmina ha conducido a la identificación de secuencias de polipéptidos de unión a albúmina individuales. Las secuencias de estos polipéptidos de unión a albúmina individuales se presentan en la Figura 1. Está también englobada por la presente invención un polipéptido de unión a albúmina que tiene una secuencia aminoacídica con 85 % o más de identidad con una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:260, SEQ ID NO:310 y SEQ ID NO:496.

Como resulta evidente por lo anterior, además de un polipéptido cuya secuencia aminoacídica se selecciona de las SEQ ID NO:260, SEQ ID NO:310 y SEQ ID NO:496, la presente invención engloba también variantes del mismo. Las secuencias aminoacídicas de dichas variantes englobadas exhiben pequeñas diferencias solo en comparación con las SEQ ID NO:260, SEQ ID NO:310 y SEQ ID NO:496. En algunas realizaciones, el polipéptido de la invención

E08786222

09-10-2015

puede tener una secuencia que es al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia seleccionada de las SEQ ID NO:260, SEQ ID NO:310 y SEQ ID NO:496. La comparación puede efectuarse en una ventana correspondiente a la secuencia más corta que se está comparando, o en una ventana correspondiente a un motivo de unión a albúmina en al menos una de las secuencias que se están comparando.

Los términos “unión a albúmina” y “afinidad de unión por albúmina”, como se usan en esta memoria descriptiva, hacen referencia a una propiedad de un polipéptido que puede ensayarse, por ejemplo, mediante el uso de tecnología de resonancia de plasmón de superficie, tal como en un instrumento Biacore. Por ejemplo, como se describe en los ejemplos siguientes, la afinidad de unión por albúmina puede ensayarse en un experimento en el que se inmoviliza albúmina, o un fragmento de la misma, sobre un chip sensor del instrumento, y se pasa por el chip la muestra que contiene el polipéptido para ensayar. Como alternativa, el polipéptido para ensayar se inmoviliza sobre un chip sensor del instrumento, y se pasa por el chip una muestra que contiene albúmina o un fragmento de la misma. La albúmina puede ser, a este respecto, una seroalbúmina de un mamífero, tal como seroalbúmina humana. El especialista en la materia puede interpretar entonces los resultados obtenidos mediante dichos experimentos para establecer al menos una medida cualitativa de la afinidad de unión del polipéptido por albúmina. Si se desea una medida cualitativa, por ejemplo para determinar el valor de KD de la interacción, pueden usarse también procedimientos de resonancia de plasmón de superficie. Los valores de unión pueden definirse, por ejemplo, en un instrumento Biacore2000 (Biacore AB). La albúmina se inmoviliza adecuadamente sobre un chip sensor de medida, se preparan las muestras del polipéptido cuya afinidad se va a determinar mediante dilución en serie y se inyectan en orden aleatorio. Los valores de KD pueden calcularse entonces a partir de los resultados usando, por ejemplo, el modelo de unión Langmuir 1:1 del software de evaluación BIA 4.1 proporcionado por el fabricante del instrumento (Biacore AB).

El polipéptido de unión a albúmina según este primer aspecto de la presente invención se une a albúmina de tal modo que el valor de KD de la interacción sea como máximo de 1 x 10-9 M, concretamente 1 nM. En algunas realizaciones, el valor de KD de la interacción es de como máximo 1 x 10-10 M, tal como como máximo 1 x 10-11 M, por ejemplo como máximo 1 x 10-12 M.

En una realización de la invención, la albúmina a la que se une el polipéptido de unión a albúmina es seroalbúmina humana.

La invención engloba también un polipéptido de unión a albúmina como se describe anteriormente, que comprende adicionalmente uno o más aminoácidos adicionales situados en uno o ambos lados del motivo de unión a albúmina. Estos residuos aminoacídicos adicionales pueden desempeñar un papel en la potenciación de la unión de albúmina por el polipéptido, pero pueden servir igualmente bien con otros fines, relacionados por ejemplo con uno o más de producción, purificación, estabilización in vivo o in vitro, acoplamiento o detección del polipéptido, así como cualquier combinación de los mismos. Dichos residuos aminoacídicos adicionales pueden comprender uno o más residuos aminoacídicos añadidos con fines de acoplamiento químico, p.ej. a una resina cromatográfica para obtener una matriz de afinidad o a un resto quelante para complejar con un radionucleido metálico. Es un ejemplo de esto la adición de un residuo de cisteína en la primera o última posición de la cadena polipeptídica, concretamente en el extremo N o C. Dichos residuos aminoacídicos adicionales pueden comprender también un “marcador” para purificación o detección del polipéptido, tal como un marcador de hexahistidilo (His6) o un marcador "myc" ("c-Myc")

o un marcador "FLAG" para interacción con anticuerpos específicos del marcador. El especialista en la materia es consciente de otras alternativas.

Los “residuos aminoacídicos adicionales” discutidos anteriormente pueden constituir también uno o más dominios polipeptídicos con cualquier función deseada, tal como la misma función de unión que el primer dominio de unión a albúmina, u otra función de unión, o una función terapéutica, o una función enzimática o una función fluorescente o mezclas de las mismas. Las “unidades” polipeptídicas ligadas en dicho polipéptido según la invención pueden conectarse por acoplamiento covalente usando procedimientos de química orgánica conocidos, o expresarse en forma de un polipéptido de fusión o más en un sistema para la expresión recombinante de polipéptidos, o unirse de cualquier otra forma, directamente o mediada por un ligador que comprende una serie de aminoácidos.

Además, este aspecto de la invención engloba también fragmentos de polipéptidos de unión a albúmina que retienen la unión a albúmina. La posibilidad de crear fragmentos de un dominio de tres hélices de tipo silvestre con especificidad de unión retenida se ha mostrado por Braisted AC et al. en Proc. Natl. Acad .Sci. USA 93: 5688-5692 (1996). En los experimentos descritos en ese artículo, usando un diseño basado en la estructura y procedimientos de presentación en fago, se redujo el dominio de unión de un haz de tres hélices de 59 residuos a un derivado resultante de dos hélices de 33 residuos. Esto se consiguió mediante la selección por etapas de mutaciones aleatorias de diferentes regiones, que causaban la mejora reiterativa de la estabilidad y afinidad de unión. Siguiendo el mismo razonamiento con los polipéptidos de la presente invención, el destinatario especialista será capaz de obtener un polipéptido de unión a albúmina “minimizado” con las mismas propiedades de unión que las del polipéptido de unión a albúmina “original”. Por tanto, un polipéptido que constituye un fragmento de un polipéptido según la invención y que se une a seroalbúmina humana de tal modo que el valor de KD de las interacciones sea como máximo de 1 x 10-9 M está dentro del alcance de la invención. Como ejemplo no limitante, el fragmento puede corresponder a un polipéptido de unión a albúmina según la descripción anterior que se ha truncado N

E08786222

09-10-2015

terminalmente. Dicho truncamiento puede ser, por ejemplo, de 1 a 3 aminoácidos.

Como se esboza anteriormente, la invención engloba también multímeros del polipéptido con afinidad por albúmina, concretamente cadenas polipeptídicas que comprenden al menos dos polipéptidos de unión a albúmina o fragmentos de los mismos como unidades monoméricas. Puede ser de interés, p.ej. en un procedimiento de purificación de albúmina o en un procedimiento terapéutico que explota la función de unión a albúmina, obtener una unión aún más fuerte de la albúmina que la posible con un polipéptido según la invención. En este caso, la provisión de un multímero, tal como un dímero, trímero o tetrámero, del polipéptido puede proporcionar los efectos de avidez necesarios. El multímero puede consistir en el número adecuado de polipéptidos según la invención. Estos dominios polipeptídicos según la invención, que forman monómeros en dicho multímero, pueden tener todos la misma secuencia aminoacídica, pero es igualmente posible que tengan diferentes secuencias aminoacídicas. Como se describe anteriormente, las “unidades” polipeptídicas ligadas en un multímero según la invención pueden conectarse por acoplamiento covalente usando procedimientos de química orgánica conocidos, o expresarse en forma de uno o más polipéptidos de fusión en un sistema para la expresión recombinante de polipéptidos, o unirse de cualquier otra forma, directamente o mediada por un ligador que comprende una serie de aminoácidos.

Adicionalmente, están también contemplados polipéptidos o proteínas de fusión o conjugados “heterogénicos” en que un polipéptido de unión a albúmina según la invención, o un fragmento o multímero del mismo, constituye un primer dominio, o primer resto, y el segundo resto y adicionales tienen otras funciones distintas que unirse a albúmina, y entran dentro del ámbito de la presente invención. El segundo resto y adicionales del polipéptido de fusión o conjugado en dicha proteína tienen la actividad biológica deseada. Los ejemplos no limitantes de dicha actividad biológica deseada comprenden una actividad terapéutica, una actividad de unión y una actividad enzimática. En algunas realizaciones de este aspecto de la invención, el segundo resto y cualquier resto adicional se seleccionan del grupo consistente en GLP-1 (péptido 1 similar a glucagón); HGH (hormona de crecimiento humana); G-CSF (factor estimulante de colonia de granulocitos); agonista de receptor de IL-1 (agonista de receptor de interleucina 1); TNF-α (factor de necrosis tumoral ) y los factores de coagulación sanguínea VII, VIII, IX y X. En otras realizaciones, dicho segundo resto y adicionales se seleccionan de restos de unión capaces de interacción selectiva (unión) con una molécula diana, típicamente una molécula diana distinta de albúmina, aunque no se excluye la albúmina. Dicho resto de unión se selecciona adecuadamente del grupo consistente en anticuerpos y fragmentos y dominios de los mismos que retienen sustancialmente la actividad de unión a anticuerpo; microcuerpos, maxicuerpos, avímeros y otras proteínas de unión por disulfuro pequeñas; y proteínas de unión derivadas de un armazón seleccionado del grupo consistente en la proteína A estafilocócica y dominios de la misma, lipocaínas, dominios de repetición de anquirina, dominios de unión a celulosa, cristalinas γ, proteína fluorescente verde, antígeno asociado a linfocito T citotóxico humano 4, inhibidores de proteasa, dominios PDZ, aptámeros peptídicos, nucleasa estafilocócica, tendamistatos, dominio de fibronectina de tipo III, dedos de cinc, conotoxinas y dominios de Kunitz. En algunas realizaciones de la invención, la molécula diana para unir a dicho resto de unión a diana se selecciona del grupo consistente en péptido Aß; otros péptidos amiloides asociados a enfermedad; toxinas tales como toxinas bacterianas y venenos de serpiente; factores de coagulación sanguínea tales como factor de von Willebrand; interleucinas tales como IL-13; miostatina; factores proinflamatorios tales como TNF-α, receptor de TNFα e IL-8; factores de complemento tales como C3a y C5a; mediadores de la hipersensibilidad tales como histamina e IgE; antígenos relacionados con tumores tales como CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD52, CD70, cMet, HER1, HER2, HER3, HER4, CA9, CEA, receptor de IL-2, MUC1, PSMA o TAG-72.

Se contemplan también otras posibilidades para la creación de polipéptidos de fusión o conjugados. Por tanto, un polipéptido de unión a albúmina según el primer aspecto de la invención puede acoplarse covalentemente con un segundo resto o restos adicionales que, además de o en lugar de, unión a diana exhiban otras funciones. Es un ejemplo una fusión entre uno o más polipéptidos de unión a albúmina y un polipéptido enzimáticamente activo que sirve como resto indicador o efector. Los ejemplos de enzimas indicadoras, que pueden acoplarse con el polipéptido de unión a albúmina formando una proteína de fusión, son conocidos por los especialistas en la materia e incluyen enzimas tales como β-galactosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y carboxipeptidasa. Otras opciones para el segundo resto y adicionales de un polipéptido de fusión o conjugado según la invención incluyen, también sin limitación, polipéptidos fluorescentes tales como proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, luciferasa y variantes de las mismas.

Con respecto a la descripción anterior de proteínas de fusión o conjugados que incorporan un polipéptido de unión a albúmina según la invención, ha de observarse que la denominación de restos primero, segundo y adicionales se hace por razones de claridad para distinguir entre el polipéptido o polipéptidos de unión a albúmina según la invención por un lado y los restos que exhiben otras funciones por otro lado. No se pretende que estas denominaciones hagan referencia al orden real de los diferentes dominios en la cadena polipeptídica de la proteína de fusión o conjugado. Por tanto, por ejemplo, dicho primer resto puede aparecer sin restricciones en el extremo Nterminal, en el medio o en el extremo C-terminal de la proteína de fusión o conjugado.

La invención engloba también polipéptidos en que se ha proporcionado a un polipéptido de unión a albúmina como se describe anteriormente un marcador, tal como el seleccionado del grupo consistente en tintes y metales fluorescentes, tintes cromofóricos, compuestos quimioluminiscentes y proteínas bioluminiscentes, enzimas, radionucleidos y partículas, por ejemplo con fines de detección del polipéptido in vitro o in vivo. Un aspecto relacionado de la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido como se describe anteriormente. Se dan a conocer también un vector de expresión que comprende el polinucleótido y una

E08786222

09-10-2015

célula hospedadora que comprende el vector de expresión. Los tres últimos son herramientas para la producción de un polipéptido según la invención, y el especialista en la materia podrá obtenerlos y ponerlos en uso práctico sin excesivos problemas, dada la información de la presente memoria referente al polipéptido que se va a expresar y dado el nivel actual de conocimientos en la técnica de la expresión recombinante de proteínas. Por tanto, se dan a conocer también procedimientos de producción de un polipéptido según el primer aspecto de la invención, que comprenden expresar un polipéptido como se describe en la presente memoria, por ejemplo mediante el cultivo de una célula hospedadora como se define en la presente memoria, en condiciones que permitan la expresión del polipéptido por el vector de expresión, y aislar el polipéptido.

Como se describe en la sección de antecedentes y como es bien conocido por el especialista en la materia, las posibles aplicaciones de una molécula polipeptídica con afinidad de unión por albúmina son variadas. El polipéptido de unión a albúmina, así como un fragmento, multímero y proteína de fusión o conjugado del mismo, de la invención puede encontrar uso en una cualquiera o más de estas aplicaciones. Como ejemplo no limitante de aplicaciones de los polipéptidos de unión a albúmina descritos anteriormente, la presente invención proporciona en otro de sus aspectos una proteína de fusión o conjugado de un polipéptido de unión a albúmina según el primer aspecto de la invención con un polipéptido que tiene la actividad biológica deseada (como se define anteriormente) para uso como medicamento que exhibe una semivida in vivo que es más larga que la semivida in vivo del polipéptido que tiene la actividad biológica deseada como tal. Dicho de otra manera, se da a conocer un procedimiento para prolongar la semivida in vivo de un polipéptido que tiene la actividad biológica deseada mediante la fusión o conjugación de dicho polipéptido con un polipéptido de unión a albúmina según el primer aspecto de la invención. Para los detalles de esta aplicación de las moléculas de unión a albúmina, se hace referencia, p.ej., a las enseñanzas de las solicitudes PCT publicadas como WO91/01743 y WO01/45746.

Como otro ejemplo no limitante de aplicaciones, la presente invención proporciona, en otro de sus aspectos, una proteína de fusión o conjugado de un polipéptido de unión a albúmina según el primer aspecto de la invención con un polipéptido que tiene la actividad biológica deseada (como se define anteriormente) para uso como medicamento que no desencadena una respuesta inmunitaria o solo reducida tras administración al mamífero, en comparación con la respuesta inmunitaria desencadenada tras administración al mamífero del polipéptido que tiene la actividad biológica deseada como tal. Dicho de otra manera, se da a conocer un procedimiento para reducir la inmunogenicidad de un polipéptido que tiene la actividad biológica deseada mediante la fusión o conjugación de dicho polipéptido con un polipéptido de unión a albúmina según el primer aspecto de la invención. Para los detalles de esta aplicación de las moléculas de unión a albúmina, se hace referencia a las enseñanzas de la solicitud PCT publicada como WO2005/097202.

Se ha erigido como una de las barreras biológicas que limitan la eficacia de la terapia mediada por anticuerpo la lenta extravasación de anticuerpos monoclonales de la sangre (Wu y Senter, Nature Biotechnology 23: 1137-46, 2005). De forma interesante, en el equilibrio, aproximadamente un 60 % de la seroalbúmina en un ser humano se encuentra en el espacio intersticial, mientras que solo un 40 % se encuentra en la corriente sanguínea. Por tanto, la asociación con albúmina como se proporciona por la presente invención se considera un medio superior de obtención de una distribución amplia fuera de la corriente sanguínea. La afinidad de la asociación con seroalbúmina se caracteriza adecuadamente por una velocidad de disociación (descomposición del complejo) que es suficientemente lenta, de tal modo que solo una fracción mínima del complejo se disocia durante la transición de la corriente sanguínea al intersticio. Sin embargo, la interacción no tiene que ser covalente, puesto que es posible cierta re-unión durante la transición.

Un posible mecanismo de contribución a la extravasación y amplia distribución es el transporte activo después de la unión de seroalbúmina al receptor FcRn. En consecuencia, hay ciertos requisitos sobre el resto de unión a albúmina en la proteína de fusión de unión a albúmina para obtener una distribución similar. Por ejemplo, la afinidad puede ser muy fuerte también en el entorno ácido encontrado durante el transporte de receptor en la célula, probablemente hasta un pH inferior a 6.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un listado de las secuencias aminoacídicas de los ejemplos de motivos de unión a albúmina comprendidos en los polipéptidos de unión a albúmina de la invención (SEQ ID NO:1-257), los ejemplos de polipéptidos de unión a albúmina según la invención (SEQ ID NO:257-514) y el dominio GA3 de proteína G de Streptococcus cepa G148 (SEQ ID NO:515).

La Figura 2 es una ilustración de los rasgos principales del inserto de codificación en el vector de expresión pAY1075 (A) sin y (B) con un módulo que codifica las hélices 2 y 3 de moléculas de ABD variante.

La Figura 3A muestra la estrategia para la amplificación de fragmentos de ADN que codifican una secuencia ficticia, Zwt y GIII en la preparación del inserto de codificación del vector de expresión pAY1075.

La Figura 3B muestra la superposición de estos fragmentos para la creación del inserto de codificación completo.

La Figura 4 es un mapa vectorial del vector de expresión pAY1075, preparado como se describe en el Ejemplo 1.

E08786222

09-10-2015

La Figura 5 es un mapa vectorial del vector de expresión pAY1075-ABD, preparado como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 6 es una tabla que muestra los valores teóricos (columnas sombreadas) y experimentales (columnas blancas) para la alteración aminoacídica en cada posición alterada de la subcolección de variantes de ABD creada usando la mezcla AFFI-793 de oligonucleótidos como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 7 es una tabla que muestra los valores teóricos (columnas sombreadas) y experimentales (columnas blancas) para la alteración aminoacídica en cada posición alterada de la subcolección de variantes de ABD creada usando la mezcla AFFI-794 de oligonucleótidos como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 8 es una ilustración esquemática de la secuencia aminoacídica de una variante de ABD como se expresa en el vector pAY442 según la descripción del Ejemplo 2.

Las Figuras 9A-9C muestran las curvas de titulación de ELISA para suero obtenido los días 0-45 de primates inyectados con Z00342 como se describe en el Ejemplo 4, cuando se analizan en placas ELISA recubiertas con Z00342.

Las Figuras 10A-10C muestran las curvas de titulación de ELISA para suero obtenido los días 0-45 de primates inyectados con Z00342-ABD00003 como se describe en el Ejemplo 4, cuando se analizan en placas ELISA recubiertas con Z00342-ABD00003.

La Figura 11 muestra la concentración mediana de IgG específica de variantes de Z en suero obtenido los días 0-45 de primates inyectados con Z00342 y Z00342-ABD00003 como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 12 muestra la cantidad de A) Z00342 y B) Z00342-ABD00003 en la circulación sanguínea con el tiempo analizada por ELISA en sándwich como se describe en el Ejemplo 4.

Las Figuras 13A-13B muestran las curvas de titulación de ELISA para suero obtenido los días 0-45 de primates inyectados con (Z01154)2 como se describe en el Ejemplo 5, cuando se analizan en placas ELISA recubiertas con (Z01154)2.

Las Figuras 14A-14B muestran las curvas de titulación de ELISA para suero obtenido los días 0-45 de primates inyectados con (Z01154)2-ABD00239 como se describe en el Ejemplo 5, cuando se analizan en placas ELISA recubiertas con (Z01154)2-ABD00239.

La Figura 15 muestra los valores normalizados de muestras de A) (Z01154)2 y B) (Z01154)2-ABD00239 analizadas en las Figuras 13 y 14, respectivamente. Se normalizaron las absorbancias de muestra frente al control positivo a dilución 16000x.

Se ilustrará ahora la invención adicionalmente mediante la descripción no limitante de experimentos realizados de acuerdo con la misma. A menos que se especifique otra cosa, se usaron procedimientos de química y biología molecular convencionales en todo momento.

Ejemplos

Ejemplo 1

Construcción de una colección de presentación en fago de variantes de un polipéptido de unión a albúmina

Sumario

En este ejemplo, se creó una colección de presentación en fago de variantes de polipéptido mediante la alteración de 16 posiciones en las hélices 2 y 3 del dominio de unión a albúmina GA3 de Streptococcus cepa G148 (al que se hace referencia a continuación como "ABD"). Se proporciona la secuencia de tipo silvestre de ABD ("ABDwt") como la SEQ ID NO:491 en la Figura 1 y en el listado de secuencias adjunto. Se construyó para esta nueva colección un nuevo vector de presentación en fago (pAY1075) basado en el vector Affi1 anteriormente descrito (Grönwall et al., J. Biotechnol. 128: 162-183, 2007). Se clonó el fragmento de ABD alterado (hélices 2-3) en pAY1075 con las enzimas de restricción SacI y NheI. Se purificaron los ligamientos y se electroporaron en células E. coli RR1ΔM15 (Rüther, Nucleic Acids Res. 10: 5765-5772, 1982). Se designó la colección recién construida como LibABDmat2005 y consistía en dos subcolecciones, dependiendo de cuáles oligonucleótidos se hubieran usado para la creación de la secuencia alterada de las hélices 2 y 3. Una se construyó en la molécula ABD y la otra tenía un aminoácido extra insertado entre las posiciones 17 y 18 de ABD que tienen algunas de las proteínas homólogas de ABD (véase, p.ej., Rozak et al., Biochemistry 45: 3263-3271, 2006). El tamaño de LibABDmat2005 era de 1 x 109 miembros (5 x 108 para cada subcolección). La calidad de la nueva colección era satisfactoria, porque la secuenciación de ADN mostraba que aproximadamente un 87 % de los clones eran funcionales y porque los valores medidos de frecuencias relativas de aminoácidos concordaban bien con los valores teóricos.

10

15

20

25

30

35

40

45

E08786222

09-10-2015

Construcción del vector fagómido pAY1075

Se construyó para la nueva colección un nuevo vector de presentación en fago (pAY1075). pAY1075 se basaba en el vector fagómido pAffi1 (Grönwall et al., supra). Para la creación de pAY1075, se digirió pAffi1 con XhoI y XmaI (10 unidades/µl; New England Biolabs) y se creó un nuevo inserto o módulo de clonación y se ligó con el vector. El nuevo inserto contenía ADN que codifica la hélice 1 de ABDwt, una secuencia ficticia, un sitio de trombina, Zwt (un dominio de unión a IgG genomanipulado basado en el dominio B de proteína A estafilocócica, véase Nilsson et al., Prot. Eng. 1: 107-113, 1987), GIII truncado (residuos 249-406), el dominio de terminación TT y algunos sitios de enzima de restricción adicionales. Para una representación esquemática de los elementos codificados por este inserto, véase la Figura 2A. La Figura 2B muestra el inserto del vector de expresión cuando la secuencia ficticia se ha reemplazado por una secuencia que codifica el polipéptido variante de ABD restante (véase a continuación). Se proporcionan a continuación en la Tabla 1 las secuencias de los diversos oligonucleótidos de ADN usados como cebadores y moldes en el experimento de clonación y la construcción de colección.

imagen1

Para crear el nuevo módulo de clonación para pAY1075, se amplificaron por PCR el fragmento ficticio y GIII a partir de pAffi1, y se amplificó Zwt a partir del plásmido pEZZ18 (Löwenadler et al., Gene 58: 87-97, 1987), usando cebadores según la Figura 3A. Los fragmentos recién generados tenían segmentos superpuestos entre sí, como se muestra en la Figura 3B. Se purificaron en gel los fragmentos de PCR con el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante y, después de ello, se ensamblaron conjuntamente con el oligonucleótido AFFI-772 (Figura 3B) en una PCR de ensamblaje. Se efectuó una reacción PCR adicional usando los cebadores externos AFFI-772 y AFFI-40 para amplificar el fragmento completo. Se purificaron los productos de PCR usando el kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante.

Se purificó el plásmido pAffi1 con el kit QIAgen™ midi-prep (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante. Después de ello, se digirieron pAffi1 y el fragmento de PCR amplificado para el módulo de clonación con XhoI y XmaI (10 unidades/µl; New England Biolabs) en tampón NEB4 (Tris acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM, acetato de potasio 50 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9; New England Biolabs) durante 1 hora a 37 ºC y después de ello se desfoforiló el vector usando fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP; Fermentas). Se purificaron las digestiones en un gel de agarosa al 1 % usando el kit de extracción en gel QIAquick según las recomendaciones del fabricante. Se ligó el nuevo fragmento con pAffi1 escindido con XhoI y XmaI durante 1 h a temperatura ambiente usando ADN ligasa T4 (5 unidades/µl; Fermentas). Se electroporó parte de la mezcla de ligamiento en células TG1 de E. coli (Stratagene) usando cubetas de 1 mm. Se sembraron las células en placas basadas en agar sanguíneo con triptosa (placas TBAB; TBAB 30 g/l) suplementadas con ampicilina 200 µg/ml. Se identificaron los clones que tenían un inserto correcto por PCR usando los tres pares cebadores diferentes AFFI-21/AFFI-42, AFFI-47/AFFI-40 y AFFI-21/AFFI-40. Se analizaron los fragmentos de PCR en un gel de agarosa al 1 %, se purificaron por plásmido los clones positivos con el kit QIAprep Miniprep (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante, y después de ello se secuenciaron con los cebadores AFFI-38, 40, 71, 72 y 772 usando el kit ABI PRISM® BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction 3.1 (Applied Biosystems). Se purificaron las reacciones PCR de secuencia en un instrumento Magnatrix 8000 (Magnetic Biosolutions) y se determinó la secuencia nucleotídica con un analizador genético ABI PRISM® 3100 (Applied Biosystems). Se usó Sequencer™ v 4.0.5 (Gene Codes Corporation) para registrar y analizar los datos de secuencia. La secuenciación reveló que se había creado exitosamente el nuevo vector fagómido. Se muestran en la Figura 4 y 5, respectivamente, los mapas vectoriales del vector con secuencia ficticia (pAY1075) o con secuencia que codifica las hélices 2 y 3 de ABD alteradas (pAY1075-ABD).

Diseño de una colección de secuencias de ABD variantes

10

15

20

25

30

35

E08786222

09-10-2015

Se preparó un conjunto de oligonucleótidos que tienen una secuencia aleatorizada para las hélices 2 y 3 de la molécula de ABD como se describe a continuación. Se usaron posteriormente estos oligonucleótidos para reemplazar la secuencia ficticia en pAY1075, creando pAY1075-ABD (Figuras 2B y 5). Se usó posteriormente el vector pAY1075-ABD para expresión de la colección de variantes de ABD sobre la superficie de fagos. El diseño se basó en la información de las mutaciones de alanina de ABD (Linhult et al., Protein Science 11: 206213, 2002), un estudio del complejo ALB8-HSA (Lejon et al., J. Biol. Chem. 279: 42924-42928, 2004), las homologías de secuencia con otros dominios de unión a albúmina conocidos y la facilidad de preparación de oligonucleótido. Se seleccionaron 16 posiciones aminoacídicas en la secuencia de ABDwt representada por la SEQ ID NO:491 para cierto grado de aleatorización, y se agruparon en 4 grupos diferentes dependiendo de las características: (I) núcleo hidrófobo, (II) posiciones conservadas, (III) interacciones electrostáticas y (IV) otros:

(I): Las posiciones Y20, L24, L27 e I41 están implicadas en la creación del núcleo hidrófobo central en la interacción con seroalbúmina. Estas posiciones están altamente conservadas entre dominios homólogos de ABD y la aleatorización en estas posiciones probó si otro residuo aminoacídico hidrófobo podía mejorar la interacción hidrófoba.

(II): Las posiciones 18’, S18, T30, E32 y G33 están muy conservadas entre los dominios de unión a albúmina. Las posiciones S18 y T30 están implicadas en dos enlaces de H intermoleculares, y el fundamento de la aleatorización era que aminoácidos polares similares como treonina (T) y asparagina (N) podían funcionar también. E32 y G33 no interaccionan con la superficie de unión en gran medida. Sin embargo, es probable que sean importantes para la estructura de la proteína, y era interesante ver si podía funcionar otro aminoácido. La secuencia de ABDwt no comprende la posición 18’ (concretamente, 18’ representa un residuo aminoacídico añadido entre las posiciones 17 y 18 en ABDwt), pero los dominios homólogos tienen treonina o serina en esa posición. Era interesante ver si podía mejorarse la unión con este aminoácido adicional.

(III) Las posiciones N23, N27, K29 y E40 están implicadas o podrían estar implicadas en interacciones electrostáticas. La aleatorización en estas posiciones estaba basada en el interés de ver si sería posible o no potenciar o suprimir alguna de las interacciones atractivas o repulsivas de estos residuos aminoacídicos con albúmina.

(IV) Se aleatorizaron las posiciones A36, K35 y D39 debido a otras consideraciones similares.

Para crear la mezcla deseada de residuos aminoacídicos en cada posición, se alteró la secuencia de ABDwt de acuerdo con la Tabla 2. Las alteraciones se clasificaron como “aleatorizadas” o “dopadas”. En las posiciones “aleatorizadas”, todos los aminoácidos elegidos estaban representados en iguales proporciones. En las posiciones “dopadas”, el aminoácido original era más frecuente que los demás, concretamente la posición estaba sesgada hacia el aminoácido original.

imagen2

E08786222

09-10-2015

(Cont.) Tabla 2: Estrategia de diseño para secuencias de ABD variantes

imagen3

Se obtuvieron las mezclas de oligonucleótidos AFFI-793 y AFFI-794 correspondientes a ADN que codifica los residuos 13-46 de la secuencia de ABDwt modificada según la Tabla 2, e incluyendo sitios de restricción, de Scandinavian Gene Synthesis AB. AFFI-794 comprende el aminoácido extra representado por la posición 18’.

imagen4

La Tabla 3 resume la distribución de porcentajes de nucleótidos requerida en las mezclas de oligonucleótidos 15 necesarias para conseguir el diseño de colección descrito en la Tabla 2.

Tabla 3: Distribución de nucleótidos en las mezclas de oligonucleótidos AFFI-793 y AFFI-794

imagen5

20

Construcción de colección

Se usó el siguiente procedimiento para crear la colección genética LibABDmat2005 que codifica variantes de ABD. En una reacción de ensamblaje, se asociaron el oligonucleótido AFFI-791 y la mezcla de oligonucleótidos AFFI-793

25 o AFFI-794 y se propagaron con ADN polimerasa Taq. Se efectuó una reacción PCR usando los cebadores externos AFFI-791 y AFFI-792 para amplificar el fragmento. Se purificaron los productos de PCR usando el kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante.

E08786222

09-10-2015

Se preparó el fagómido pAY1075 a partir de 250 ml de cultivo de una noche (caldo de soja tríptico, 2 % de glucosa, ampicilina 100 µg/ml) usando el kit Qiagen plasmid midi kit (Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se digirió el fagómido con SacI y NheI (10 unidades/µl; New England Biolabs) en tampón NEB4 (Tris acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM, acetato de potasio 50 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9; New England Biolabs) durante 3 h a 37 ºC. Se purificó con fenol/cloroformo la solución, se precipitó con EtOH y se purificó en gel el vector con un gel de agarosa al 1 % usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante.

Se digirieron los fragmentos amplificados por PCR de las reacciones de ensamblaje entre AFFI-791 y AFFI-793 o AFFI-794 con SacI y NheI en tampón NEB4 durante 3 h a 37 ºC. Se purificaron los fragmentos de ADN en un gel de agarosa al 1 % usando el kit de extracción en gel QIAquick según las recomendaciones del fabricante. Se ligaron los fragmentos génicos resultantes que codifican dos subcolecciones de variantes de ABD en pAY1075 escindido con SacI y NheI durante 1 h a temperatura ambiente usando ADN ligasa T4 (5 unidades/µl; Fermentas).

Se extrajeron entonces los ligamientos con fenol/cloroformo, se precipitaron con EtOH y se resolvieron en un volumen menor de Tris 10 mM. Se transformaron células E. coli RR1ΔM15 electrocompetentes (Rüther, 1982, supra) con 60 alícuotas de material ligado de cada una de las dos subcolecciones usando cubetas de 0,2 cm de tamaño de hueco en un equipo ECM 630 (BTX) usando los parámetros 2,5 kV, 125 Ω y 50 mF. Se hicieron crecer las células en medio SOC (47 ml de TSB+YE (caldo de soja tríptico 30 g/l, extracto de levadura 5 g/l) suplementado con 1 % de glucosa, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, NaCl 10 mM y KCl 2,5 mM) durante 50 minutos y se transfirieron a 10 matraces Erlenmayer que contenían cada uno 1 I de TSB + YE (caldo de soja tríptico 30 g/l, extracto de levadura 5 g/l) suplementado con 2 % de glucosa y ampicilina 100 µg/ml, y se hicieron crecer durante una noche a 37 ºC. Se centrifugaron entonces las células a 6000 g y se resuspendieron en solución de PBS/glicerol (PBS: KCl 2,68 mM, KH2PO4 1,47 mM, NaCl 137 mM, Na2HPO4 8,1 mM, pH 7,4) a una concentración final aproximada de 20 % de glicerol. Se tomaron entonces alícuotas de las células y se almacenaron a -80 ºC. Se tituló el número de células después de electroporación, amplificación y transferencia a soluciones madre de glicerol en placas TBAB suplementadas con ampicilina 200 µg/ml.

El tamaño de cada subcolección era de 5 x 108, concretamente el tamaño total de la colección LibABDmat2005 era de 1 x 109. Se amplificó la colección aproximadamente 50.000 veces y las soluciones madre de glicerol tenían una densidad de aproximadamente 1 x 1011 células/ml. En este contexto, el “tamaño” de la colección significa el número total de miembros comprendidos en la colección, sin consideración del número de variantes únicas codificadas por la colección.

Se tomaron 96 colonias de cada una de las dos subcolecciones para secuenciación de ADN para verificar el diseño y frecuencia de clones con un marco de lectura correcto. Se amplificaron por PCR estas colonias tomadas aleatoriamente, cultivadas con disoluciones madre de glicerol y originarias de cada agrupación de la colección, usando los oligonucleótidos AFFI-21 y AFFI-22. Se efectuó la secuenciación de los fragmentos amplificados usando el kit ABI PRISM® dGTP, BigDye™ Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing (Applied Biosystems) según las recomendaciones del fabricante y con el oligonucleótido biotinilado AFFI-72. Se purificaron las reacciones de secuenciación mediante unión a perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina usando un Magnatrix 8000 (Magnetic Biosolutions), y se analizaron en el analizador genético ABI PRISM® 3100 (Applied Biosystems).

En la subcolección creada usando AFFI-793, 3 clones no eran legibles, 11 eran incorrectos y 7 clones eran contaminaciones de la otra subcolección. La distribución aminoacídica en esta subcolección se dedujo a partir de los datos de secuenciación, se comparó con los valores teóricos y los resultados se presentan en la Figura 6.

Con respecto a la subcolección creada usando AFFI-794, 3 clones no eran legibles y 16 eran incorrectos. Se dedujo la distribución de aminoácidos en esta subcolección a partir de los datos de secuenciación, se comparó con los valores teóricos y se presentan los resultados en la Figura 7.

La frecuencia de cada aminoácido concordaba bien con el valor esperado, y aproximadamente un 87 % de los clones tenía un marco de lectura correcto.

Ejemplo 2

Selección por presentación en fago y caracterización de variantes de polipéptido de unión a albúmina

Sumario

Se usó seroalbúmina humana (HSA) biotinilada como diana en selecciones por presentación en fago usando la colección construida en el Ejemplo 1. Se llevaron a cabo las selecciones usando una variedad de condiciones para maximizar la probabilidad de obtener variantes de ABD que tengan una alta afinidad por albúmina. Después de la elución de los fagos seleccionados, se ensayó en las correspondientes proteínas expresadas la afinidad por albúmina en configuración ELISA. Se identificaron y secuenciaron los clones positivos y se dedujeron las secuencias aminoacídicas predichas de los correspondientes polipéptidos y sus motivos de unión a albúmina, lo que procuró un gran número de secuencias de polipéptidos de unión a albúmina. Se enumeran las secuencias aminoacídicas de los motivos de unión a albúmina deducidas en la Figura 1 y en el listado de secuencias como SEQ ID NO:1-257, mientras que las secuencias aminoacídicas de las correspondientes variantes de ABD completas se enumeran en la

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08786222

09-10-2015

Figura 1 y en el listado de secuencias como SEQ ID NO:258-514.

Biotinilación de seroalbúmina humana

Se disolvió seroalbúmina humana liofilizada (Sigma, nº de cat. A3782-5G) en PBS (KCl 2,68 mM, KH2PO4 1,47 mM, NaCl 137 mM, Na2HPO4 8,1 mM, pH 7,4) a una concentración final de 10 mg/ml. Se disolvió EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, nº de cat. 21335) en agua a una concentración final de 1 mg/ml y se añadió un exceso molar de 5 y 10 veces a 500 mg de albúmina en un volumen total de 0,5 ml. Se incubaron las mezclas a temperatura ambiente durante 30 min. Se retiró la biotina no unida dializando frente a PBS usando un módulo de diálisis (Slide-A-Lyser, 10 kDa; Pierce).

Selección por presentación en gago

Se llevaron a cabo en total 5 rondas de selección, usando condiciones cada vez más rigurosas. Después de las tres rondas iniciales, efectuadas principalmente con vistas a establecer un protocolo de selección adecuado, se prepararon las soluciones madre de fago resultantes a partir de la solución madre de glicerol preparada como en el Ejemplo 1. Se llevó a cabo entonces la selección durante dos ciclos más usando las combinaciones de tampón de selección, concentración de diana y soporte sólido que se enumeran en la Tabla 4.

Tabla 4: Condiciones de selección para la selección de HSA

Nombre de muestra: Tampón de selección Conc. diana (pM) Perlas (µg)

Ciclo 4: A Gelatina 1000 100

B: Gelatina 200 100

C: BSA 400 100

D: BSA 100 100

Ciclo 5: A Gelatina 500 50

B: Gelatina 50 50

C: BSA 100 50

D: BSA 10 50

Todos los tubos y perlas usados en el procedimiento de selección se prebloquearon con TPBSB (al 5 %) (0,05 % de Tween 20, 5 % de seroalbúmina bovina (BSA), 0,02 % de azida de Na en PBS) o gelatina (al 0,5 %) durante 30 min bajo agitación suave a temperatura ambiente y posteriormente se dejaron sin agitación durante una noche a 4 ºC.

Las soluciones seleccionadas (1 ml) contenían seroalbúmina humana biotinilada, fagos, azida de Na (0,02 %), Tween 20 (0,05 %) y BSA (3 %) o gelatina (0,1 %) según la Tabla 4, y se prepararon en PBS. Se incubaron los fagos con seroalbúmina humana biotinilada diana a 4 ºC durante 3 días para el ciclo 4 y durante 1 día para el ciclo 5, seguido de 1 h de incubación con agitación a temperatura ambiente. Se transfirieron las muestras de selección a perlas de estreptavidina bloqueadas durante 15 min con agitación a temperatura ambiente. Se lavaron las perlas 10 veces con 1 ml de tampón de selección (concretamente TPBSB (al 3 %) (0,05 % de Tween 20, 3 % de seroalbúmina bovina (BSA), 0,02 % de azida de Na en PBS) o GT (al 0,1 %) (0,1 % de gelatina 0,1 % de Tween 20 y 0,02 % de azida de Na en PBS)), seguido de 10 lavados con PBS en que el segundo al último lavados duraron 2 horas. Se eluyeron los fagos con 1000 ml de glicina-HCl 0,05 M, pH 2,2, durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de neutralización inmediata con 900 ml de PBS suplementado con 100 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0, o se eluyeron con 1000 µl de tripsina (2 mg/ml) durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de la adición de 1000 µl de aprotinina. Se usaron los fagos eluidos (3/4 del volumen) para infectar 50 ml de células E. coli RR1ΔM15 en fase logarítmica (Rüther, 1982, supra) después de cada ciclo de selección. Después de 30 min de incubación con agitación suave y 30 min con agitación vigorosa a 37 ºC, se centrifugaron las células, se disolvió el sedimento en un volumen menor, se extendieron en placas TSB+YE (caldo de soja tríptico 30 g/l, extracto de levadura 5 g/l) y se incubaron finalmente durante una noche a 37 ºC.

Los ciclos de selección dieron como resultado un número satisfactorio de fagos eluidos.

Preparación de solución madre de fago

Se resuspendieron células de las placas en medio TSB (caldo de soja tríptico 30 g/l) y se determinó la concentración celular midiendo la densidad óptica a 600 nm, suponiendo que la DO600= 1 corresponde a 5 x 108 células/ml. Se inocularon las células (aproximadamente 100 veces en exceso de células en comparación con fagos eluidos) en 100 ml de medio TSB+YE suplementado con 2 % de glucosa y ampicilina 100 mg/ml y se hicieron crecer a 37 ºC hasta aproximadamente DO600= 0,5-0,7. Después de ello, se transfirieron 10 ml a un nuevo matraz, se infectaron con un exceso de 25 veces de fago auxiliar M13K07 (1 x 1012 ufc/ml; New England Biolabs, nº de cat. NO315S) y se incubaron durante 30 min con baja agitación. Se centrifugaron las células a 2000 g durante 10 min y se resuspendieron en 100 ml de medio TSB+YE suplementado con β-D-l-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) 100 mM, kanamicina 50 mg/ml y ampicilina 100 mg/ml y se hicieron crecer durante una noche a 100 rpm y 25 ºC. Se almacenó una porción de las células resuspendidas a -80 ºC en forma de solución madre de glicerol.

Se centrifugó el cultivo inducido a 2500 g durante 10 min, se precipitaron los fagos en el sobrenadante añadiendo

E08786222

09-10-2015

1/4 del volumen del tampón de precipitación (PEG/NaCl) y se incubaron en hielo durante 1 hora. Se sedimentaron los fagos precipitados por centrifugación a 10.000 g a 4 ºC durante 30 min, se resuspendieron en 20 ml de PBS y después de ello se filtró la solución de fago a través de un filtro de 0,45 µm. Se repitió el procedimiento de precipitación y se resuspendieron finalmente los fagos en 1 ml de PBS.

Se tituló la solución de selección después de la selección junto con las soluciones de lavado y elución después de cada ronda de selección. Se diluyeron las soluciones de fago en agua estéril en una placa de microvaloración y se añadieron 100 µl de células E. coli RR1ΔM15 en fase logarítmica a cada dilución de fago. Después de 20 min de incubación a temperatura ambiente, se añadieron por goteo 5 µl de cada titulación sobre una placa TYE (15 g de agar, 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 3 g de NaCl suplementado con 2 % de glucosa y ampicilina 100 µg/ml) y se incubaron durante una noche a 37 ºC. Se contaron las colonias resultantes y se calcularon los títulos (ufc/ml).

Análisis ELISA de la unión a albúmina

Se expresaron los clones de cada selección más ABDwt y se cribó la actividad de unión a HSA usando una configuración ELISA que posibilita la detección de compuestos de unión que tienen un valor de KD de 10 nM hasta unos pocos pM frente a seroalbúmina. Se expresaron colonias tomadas aleatoriamente en placas de 96 pocillos profundos inoculando cada colonia en 1 ml de medio TSB+YE suplementado con ampicilina 100 mg/ml e IPTG 1 mM y se hicieron crecer a 37 ºC. Se sedimentaron las células por centrifugación a 3000 g durante 15 min, se resuspendieron en 400 µl de PBS-T (0,5 % de Tween 20 en PBS) y se congelaron a -80 ºC. Se descongelaron las muestras congeladas en un baño de agua y se sedimentó el desecho celular a 3700 g durante 40 min. Se recogieron los sobrenadantes que contenían proteínas de fusión de variante de ABD-Zwt y se almacenaron a 4 ºC hasta usar en ELISA como sigue.

Se recubrieron pocillos de microvaloración (Costar) durante una noche a 4 ºC con 100 µl de HSA y con los controles seroalbúmina de rata (RSA), seroalbúmina humana (HSA) y seroalbúmina de ratón (MSA) en un pocillo cada uno, a una concentración de 0,4 µg/ml en tampón de recubrimiento ELISA (carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,5). Se bloquearon los pocillos con tampón de bloqueo (2 % de leche en PBS) durante 2 h a temperatura ambiente. Se añadió a cada pocillo un volumen de 100 µl de las proteínas de fusión variante de ABD-Zwt preparadas y se incubaron las placas durante 1,5 h a temperatura ambiente. Se añadió IgG biotinilada a una concentración de 0,5 mg/ml en tampón de lavado (0,5 % de Tween 20 en PBS) a los pocillos y se incubó durante 1,5 h, de modo que el resto Zwt de cualquier proteína de fusión de unión a albúmina pudiera unirse a IgG. Se detectaron los complejos unidos con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (Dako, nº de cat. P0397) diluida 1:5000 en tampón de lavado y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Se preparó la solución de revelado mezclando un volumen igual de los sustratos de TMB A y B (ImmunoPure TMB, Pierce), y se añadieron 100 µl a cada pocillo. Después de 30 min de incubación en la oscuridad, se añadieron 100 µl de solución de terminación (H2SO4 2 M). Se leyeron las placas a A450 en un espectrofotómetro ELISA (Basic Sunrise, Tecan). Antes de la adición de cada nuevo reactivo, se hicieron 4 lavados con tampón de lavado.

En total, se tomaron aleatoriamente 372 clones (93 clones de cada selección designada como muestra A-D en la Tabla 4) para análisis de su actividad de unión a HSA usando la configuración ELISA descrita anteriormente. La mayoría de los clones analizados dio una mayor señal ante HSA en comparación con la interacción de ABDwt con seroalbúmina de rata, que es una unión picomolar baja (70 pM; resultados no publicados). Basándose en el resultado de este experimento, se tomaron los clones para secuenciación como se describe a continuación.

Secuenciación de los clones positivos de ELISA

Se amplificaron los fragmentos de PCR de colonias seleccionadas usando los oligonucleótidos AFFI-69 (5’gtgagcggataacaattcccctc-3’) y AFFI-70 (5’-cagcaaaaaacccctcaagaccc-3’). Se efectuó la secuenciación de los fragmentos amplificados usando el kit ABI PRISM® dGTP, BigDye™ Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing (Applied Biosystems) según las recomendaciones del fabricante y con el oligonucleótido biotinilado AFFI-202 (5’-biotina-gtgagcggataacaattcccctc-3’). Se purificaron las reacciones de secuenciación por unión a perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina usando un instrumento Magnatrix 8000 (Magnetic Biosolutions), y se analizaron finalmente en un analizador genético ABI PRISM® 3100 (Applied Biosystems). Se sometieron los clones que exhibían el valor máximo de A450 en el cribado ELISA a secuenciación de su inserto variante de ABD. Se dieron a 257 variantes de ABD identificadas diferentes la denominación ABD#####, en la que ##### es una etiqueta única de cinco dígitos para la variante en cuestión. Se enumeran las secuencias de estas variantes de ABD identificadas en la Figura 1 como SEQ ID NO:258-514. Basándose en el conocimiento existente de las propiedades de unión a albúmina del ABD de tipo silvestre u “original”, se dedujo que los motivos de unión a albúmina de las variantes de ABD identificadas residían en las dos hélices 2 y 3 correspondientes al tramo de la posición aminoacídica G16 a I41. Se dieron a los motivos de unión a albúmina de las variantes de ABD identificadas la denominación ABM#####, en que ##### es una etiqueta única de cinco dígitos para el motivo en cuestión. Se enumeran las secuencias de los motivos de unión a albúmina identificados en la Figura 1 como SEQ ID NO:1-257. De forma interesante, un subconjunto de las secuencias identificadas comprendía una mutación espontánea en la posición correspondiente a la posición 38 en ABDwt, a pesar del hecho de que esta posición no se había aleatorizado en la creación de la colección de variantes.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E08786222

09-10-2015

Subclonación de las variantes de ABD en el plásmido pAY442

Se seleccionaron ADN que codifica ABDwt (SEQ ID NO:515) y 12 clones de la selección para subclonación en el vector de expresión pAY442 (Grönwall et al., supra). Con referencia a la Figura 1, los clones variantes de ABD seleccionados eran ABD00002, ABD00003, ABD00009, ABD00015, ABD00025, ABD00027, ABD00046, ABD00049, ABD00053, ABD00054, ABD00055 y ABD00245. Se purificaron plásmidos que contenían insertos que codificaban estas moléculas variantes de ABD a partir de cultivos de 2 ml de una noche (medio de caldo de soja tríptico (30 g/l) suplementado con 2 % de glucosa y ampicilina 100 µg/ml) de células E. coli RR1ΔM15 (Rüther, 1982, supra) usando el kit Qiagen Mini (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante.

Se subclonó ADN de ABDwt y moléculas variantes de ABD en el vector de expresión pAY442 por clonación de extremos cohesivos de PCR con AccI-NotI (10 unidades/µl de cada enzima; New England Biolabs) usando los pares cebadores AFFI-780, -898 y AFFI-782, -899 como se enumeran en la Tabla 5:

imagen6

Se generaron dos productos de PCR para cada molécula variante de ABD a partir del vector de colección pAY1075, dando como resultado aproximadamente un 25 % de fragmentos correctos con un sitio AccI-NotI. Se digirió el vector de expresión pAY442 en dos etapas a 37 ºC durante 4 h usando AccI y NotI en tampón NEB4 (Tris acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM, acetato de potasio 50 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9; New England Biolabs) y tampón NEB3 (Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9; New England Biolabs), respectivamente, y se desfosforiló con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP; Fermentas) durante 1 h a 37 ºC. Se purificaron el plásmido escindido y fragmentos mediante el kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen) según las recomendaciones del fabricante.

Se hibridaron los productos de PCR y se ligaron en pAY442 digerido con AccI y desfosforilado durante 1 h a temperatura ambiente usando ADN ligasa T4 (5 unidades/µl; Fermentas). Se electroporaron parte de los ligamientos en células E. coli BL21 (DE3) (F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)) usando una cubeta de 1 mm y un equipo ECM 630 (BTX) que usa los parámetros 1700 V, 200 Ω y 25 mF. Se sembraron las células en placas de base de agar sanguíneo con triptosa (TBAB) suplementado con kanamicina 50 µg/ml y se incubaron durante una noche a 37 ºC. Se verificaron en primer ligar los clones positivos en gel de agarosa como productos de PCR bacterianos y finalmente con análisis de secuencia de ADN.

Los clones de pAY442 que contienen una variante de ABD subclonada exitosamente codifican un constructo que se describe esquemáticamente en la Figura 8, concretamente esencialmente una variante de ABD marcada con His6.

Expresión y purificación de variantes de ABD marcadas con His6

Se expresaron ABDwt y las 12 variantes de ABD, todas subclonadas en pAY442 como se describe anteriormente, en E. coli BL21 (DE3) en forma de fusiones con un marcador His6 N-terminal y se purificaron por IMAC. Se usó una colonia de cada variante de ABD para inocular 5 ml de medio TSB suplementado con kanamicina 50 µg/ml. Se hicieron crecer los cultivos durante una noche a 37º C. El día siguiente, se inocularon 50 µl de cada cultivo separadamente en 100 ml de medio TSB+YE suplementado con kanamicina 50 µg/ml en un matraz de 1 l. Se hicieron crecer los cultivos a 100 rpm a 37 ºC hasta una DO600 de 0,7-1, después de lo cual se añadió IPTG a una concentración final de 0,5 mM y se incubaron las células a temperatura ambiente durante una noche a 100 rpm. Se recolectaron los cultivos por centrifugación a 8000 g durante 5 minutos y se almacenaron los sedimentos en un congelador hasta la preparación de proteína.

Se purificaron por IMAC las proteínas marcadas con His6 en condiciones desnaturalizadas usando columnas Ni-NTA Superflow y QIAsoft 4.1 y muestras de proteína/Ni-NTA Superflow 96 desnaturalizante a gran escala 2 Vac4-24 en un Biorobot 3000 (Qiagen). Se intercambió el tampón por PBS usando un módulo de diálisis (Slide-A-Lyser, 3,5 kDa; Pierce nº de cat. 66330) dializando frente a 5 l de PBS durante 2 h seguido de diálisis adicional durante una noche.

Se determinó la concentración de proteína usando la A280 y el kit BCA Protein Assay Reagent (Pierce) como se recomienda por el fabricante. Se analizó la pureza de las proteínas por PAGE-SDS en geles Novex al 4-12 %, se tiñeron con azul de Coomassie R y este análisis mostró que estaban presentes solo cantidades pequeñas de impurezas

10

15

20

25

30

35

40

45

E08786222

09-10-2015

.

Análisis por biosensor de la afinidad de variantes de ABD por HSA y MSA

Se efectuó el análisis por biosensor en un instrumento Biacore2000 (Biacore) con MSA, HSA y RSA inmovilizadas por acoplamiento amina en la capa de dextrano carboxilado sobre las superficies de chips CM-5 (pureza para investigación; Biacore) según las recomendaciones del fabricante. Se activó y desactivó la superficie 1 en el chip y se usó como célula de referencia durante las inyecciones, mientras que la superficie 2 comprendía MSA inmovilizada con 350 UR (unidades de resonancia), la superficie 3 comprendía HSA inmovilizada con 360 UR y la superficie 4 comprendía RSA inmovilizada con 340 UR. Se diluyeron las variantes de ABD y ABDwt expresadas y purificadas como se describe anteriormente en HBS-EP (Biacore) 25 nM y se inyectaron a un caudal constante de 25 µl/min durante 10 minutos, seguido de inyección de HBS-EP durante 30 minutos. Se regeneraron las superficies con dos inyecciones de 20 µl de HCl 15 mM seguidas de SDS al 0,05 % y una o más inyecciones de 20 µl de HCl.

No se llevó a cabo el estudio Biacore con vistas a determinar los parámetros exactos para la afinidad de las variantes para seroalbúmina humana y de ratón, pero los resultados proporcionan una medida cualitativa de las afinidades relativas de estas moléculas por la albúmina. Se presentan en la Tabla 6 los resultados para unión a MSA y HSA.

Tabla 6. Análisis por biosensor de la unión de variantes de ABD a seroalbúmina de ratón y humana

MSA: HSA

KD (M)
KD (M)

ABDwt: 4,9 x 10-9 1,5 x 10-9

ABD00025: 2,2 x 10-9 2,7 x 10-11

ABD00049: 7,9 x 10-10 2,2 x 10-11

ABD00245: 6,5 x 10-10 6,0 x 10-11

ABD00003: 3,3 x 10-9 1,6 x 10-11

ABD00009: 1,9 x 10-9 5,4 x 10-11

ABD00053: 5,9 x 10-9 1,1 x 10-11

ABD00054: 1,3 x 10-9 2,0 x 10-11

ABD00015: 3,2 x 10-9 4,5 x 10-11

ABD00027: 1,5 x 10-9 4,1 x 10-11

ABD00046: 8,9 x 10-9 1,2 x 10-10

ABD00055: 1,1 x 10-9 5,4 x 10-11

Como resulta evidente por esta tabla, todas las variantes de ABD ensayadas tenían una afinidad sustancialmente mayor por seroalbúmina humana que la molécula de ABD de tipo silvestre, como se evidencia por los valores de KD al menos un orden de magnitud menores, aproximándose frecuentemente a dos órdenes de magnitud menores. Además, se exhibieron también por todas las variantes afinidades comparables y/o mayores hacia seroalbúmina de ratón.

Ejemplo 3

Caracterización por biosensor adicional de variantes de ABD seleccionadas

Sumario

En este ejemplo, se subclonaron todas las variantes de ABD seleccionadas ABD00003, ABD00053 y ABD00239 más ABDwt en pAY442 como se describe en el Ejemplo 2 anterior, se expresaron a mayor escala y se purificaron con el kit His Gravitrap™. Se caracterizaron las moléculas expresadas por su afinidad por HSA usando un instrumento Biacore.

Expresión de proteína y purificación de variantes de ABD marcadas con His6

Se expresaron ABD00003, ABD00053, ABD00239 y ABDwt en células E. coli BL21(DE3) en forma de fusiones con un marcador His6 N-terminal usando constructos como se describen en el Ejemplo 2, y se purificaron por IMAC. Se usó una colonia de cada variante de ABD para inocular 10 ml de medio TSB suplementado con kanamicina 50 µg/ml. Se hicieron crecer los cultivos durante una noche a 37 ºC. El día siguiente, se inocularon separadamente 500 µl de cada cultivo en 500 ml de medio TSB+YE suplementado con kanamicina 50 µg/ml en un matraz de 5 l. Se hicieron crecer los cultivos a 100 rpm y a 37 ºC hasta una DO600 de 0,7-1, seguido de la adición de IPTG a una concentración final de 0,5 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante una noche. Se recolectaron los cultivos por centrifugación a 8000 g durante 5 minutos y se almacenaron los sedimentos a -20 ºC hasta la

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E08786222

09-10-2015

preparación de proteína.

Se purificaron por IMAC las proteínas marcadas con His6 en condiciones desnaturalizantes usando el kit His-Gravitrap™ (GE Healthcare). Se resuspendieron los sedimentos (con vórtex) en 20 ml del tampón de desnaturalización B-7M (NaH2PO4 100 mM, Tris-Cl 10 mM, urea 7 M, pH 8) y se añadieron 8 µl de benzonasa. Se incubaron las soluciones durante 30 minutos a temperatura ambiente y 200 rpm. Se añadieron 20 ml de adicionales de tampón B-7M, se transfirieron las soluciones a tubos Falcon de 50 ml y se sometieron a sonicación en hielo como sigue: 3 s de encendido/apagado durante 3 min y con 40 % de amplitud. Se retiró el desecho celular por centrifugación a 25000 g durante 40 min. Se equilibraron las columnas Gravitrap™ con tampón B-7M y se aplicaron las muestras. Se lavaron entonces las columnas con 10 ml de tampón B-7M, 20 ml de tampón de unión (NaPO4 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM) y finalmente con 10 ml de tampón de lavado (NaPO4 20 mN, NaCl 500 mM, imidazol 60 mM). Se eluyeron las moléculas de ABD con 3 ml de tampón de elución (NaPO4 20 mN, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM).

Se realizó un intercambio de tampón con PBS a pH 7,2 usando un módulo de diálisis Slide-A-Lyser (3,5 kDa; Pierce, nº de cat. 66330) dializando frente a 5 l de PBS a pH 7,2 durante 2 horas, seguido de una diálisis adicional durante una noche y finalmente se efectuó un intercambio de tampón con PBS a pH 5 usando columnas PD 10 (GE Healthcare) según las recomendaciones de los fabricantes. Se determinó la concentración de proteína usando la Abs280. Se analizó la pureza de las proteínas por PAGE-SDS en geles Novex al 4-12 % y se tiñeron con azul de Coomassie R.

Se expresaron las proteínas exitosamente y se purificaron con rendimiento aceptable. El análisis con electroforesis en gel mostró que no estaban presentes impurezas (no mostrado).

Análisis por biosensor de la cinética de unión a seroalbúmina humana

Se efectuó el análisis por biosensor en un instrumento Biacore2000 (Biacore) con HSA (SIGMA, nº de cat. A37825G) inmovilizada por acoplamiento amina en la capa de dextrano carboxilado sobre superficies de un chip CM-5 (pureza para investigación; Biacore), según las recomendaciones del fabricante. La inmovilización de HSA daba como resultado una señal de 450 unidades de resonancia. Se activó y desactivó una superficie celular sobre el chip y se usó como célula referencia durante las inyecciones. Se diluyeron las muestras de His6-ABD purificadas en HBS-EP (Biacore) a 4, 10, 40, 100 y 400 nM para ABDwt y a 0,2, 0,8, 2, 5 y 20 nM para las variantes de ABD seleccionadas. Se inyectaron las muestras a un caudal constante de 25 µl/min durante 10 min, seguido de inyección de HBS-EP durante 3 horas. Se regeneraron las superficies con dos inyecciones de 20 µl de HCl 5 y 10 mM. Se estimaron los valores de KD, ka y kd y se dan en la Tabla 7, confirmando el resultado del Ejemplo 2 de que se habían obtenido moléculas que exhiben muy altas afinidades por HSA.

Tabla 7: Parámetros cinéticos (ka, kd y KD) frente a HSA de moléculas de ABD purificadas

ka (Ms-1): kd (s-1) KD (M)

ABDwt: 5,5 x 105 6,5 x 10-4 1,2 x 10-9

ABD00003: 8,0 x 106 3,0 x 10-5 3,8 x 10-12

ABD00053: 3,0 x 106 1,5 x 10-5 5,0 x 10-12

ABD00239: 3,0 x 107 1,5 x 10-5 5,0 x 10-13

Ejemplo 4

Inmunogenicidad y farmacocinética de primate de un polipéptido variante de Z fusionado con una primera variante de ABD

Sumario

Los estudios anteriores en ratón y rata han mostrado que diversas moléculas variantes de Z fusionadas con ABDwt generan una menor respuesta de anticuerpo en comparación con la variante de Z sola. El objetivo de este estudio era 1) confirmar estos resultados en primates y ampliarlos a una variante mutada de ABD que exhibe una afinidad de unión 103 veces mayor por albúmina en comparación con ABDwt, y 2) comparar las semividas séricas de variantes de Z fusionadas con ABD y no solas. Se administró una variante de Z con afinidad por el receptor HER2 a primates con o sin la variante de ABD como copartícipe de fusión. Se procedió a una inmunización y toma de sangre repetidas durante un periodo de 45 días. Se analizaron las respuestas de anticuerpo específico contra, y las semividas séricas de, las moléculas de variante de Z por ensayos ELISA.

Moléculas estudiadas

Z00342: Una variante de la proteína Z, a su vez derivada del dominio B de proteína A estafilocócica, con afinidad por el receptor HER2. Se produjo esta variante mediante tecnología de ADN recombinante. Se efectuó la purificación usando procedimientos de intercambio aniónico y cromatografía en fase inversa seguidos de retirada de endotoxina en una columna preempaquetada Detoxi-Gel™ AffinityPak ™ (Pierce, nº de cat. 2034) según las instrucciones del

E08786222

09-10-2015

fabricante. Se da una descripción detallada de la molécula Z00342 en Orlova et al., Cancer Res. 66: 8, 4339-48 (2006), donde se designa ZHer2:342.

Z00342-ABD00003: Una proteína de fusión entre la variante de Z Z00342 y la molécula de ABD variante ABD00003

5 seleccionada en el Ejemplo 2. Se produjo esta proteína de fusión mediante tecnología de ADN recombinante. Se efectuó la purificación usando captura por afinidad en HSA-Sepharose y cromatografía en fase inversa seguida de retirada de endotoxina como anteriormente.

Procedimientos

10 Esquemas de administración y muestreo: Se efectuó el estudio animal en el SMI (Smittskyddsinsitutet) en Solna, Suecia, con permiso del comité ético animal local (N196/06). Se sedaron los primates antes de la administración de las moléculas de ensayo y el muestreo de sangre mediante la administración intramuscular de ketamina (Ketalar®). Se inyectaron las moléculas de ensayo por vía intravenosa a 10 macacos cangrejeros, Macaca fascicularis, divididos

15 en dos grupos, según el esquema de la Tabla 8.

Tabla 8: Administración de moléculas de ensayo

Grupo: Número de animales Molécula Vía de adm. mg/kg de inyección ml/animal /inyección

1: 9023, 9039, 10025, 10105, 11019 Z00342 i.v. 0,5
1

2: 12031, 12041, 12047, 12061, 12065 Z00342-ABD00003 i.v. 0,5 1

Se resumen los puntos temporales para administración y toma de sangre en la Tabla 9. PK hace referencia a 20 muestras tomadas para el estudio farmacocinético. Se almacenó sangre a 4 ºC durante una noche y se mantuvieron posteriormente los sueros a -20 ºC.

Tabla 9: Puntos temporales para administración de molécula de ensayo y muestreo de sangre

Día: Acción

0: Toma de sangre a 0, 30, 60 minutos, 4 horas (PK) e inyección 1

1: Toma de sangre (PK)

2: Toma de sangre (PK)

3: Toma de sangre (PK)

7: Toma de sangre (PK) e inyección 2

14: Toma de sangre e inyección 3

21: Toma de sangre e inyección 4

28: Toma de sangre e inyección 5

35: Toma de sangre e inyección 6

45: Toma de sangre

25 Procedimiento general ELISA: Se usó en general un volumen de 50 µl por pocillo para todas las etapas de incubación, excepto para el bloqueo en que se usó un volumen de 100 µl. Se recubrieron las placas durante una noche a 4 ºC con tampón de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6) y se lavó con agua corriente. Se realizaron el bloqueo y diluciones en PBS con 0,5 % de caseína. Los tiempos de incubación a temperatura ambiente fueron de 1-2 horas para bloqueo y suero, de 1 hora para anticuerpo secundario y de 10 min para solución

30 de sustrato (ImmunoPure® TMB, Pierce, nº de cat. 34021). Se llevó a cabo el lavado con 4x250 µl de PBS-T (PBS con 0,05 % de Tween 20) por pocillo entre todas las etapas, usando un SkanWasher 300 (Skatron) para ELISA automatizado. Se detuvo la reacción de coloración mediante la adición de 50 µl de H2SO4 2 M y se leyeron las placas a 450 nm usando un lector de placas Ultra384 (Tecan) equipado con el software Magellan v3.11 (Tecan).

35 ELISA específica de IgG anti-Z00342: Se recubrieron las placas con Z00342 0,3 µg/ml diluido en tampón de recubrimiento y se incubaron durante una noche a 4 ºC. Después de lavar, se bloquearon las placas como se describe anteriormente. Se añadieron sueros de primates en series de dilución doble partiendo de 1/100. Se usó suero purificado de un primate hiperinmunizado como control positivo y se añadió en una serie de dilución doble partiendo de 8 µg/ml. Después de la incubación, se lavaron las placas y se añadió un anticuerpo secundario de IgG

40 anti-humano conjugado con HRP (Southern Biotech, nº de cat. 2040-05) (diluido 1/10000). Después de la incubación final, se lavaron las placas y se revelaron como se describe anteriormente.

ELISA específica de Z sérica para análisis PK: Se recubrieron las placas con Ig anti-Z de cabra purificada por afinidad 2 µg/ml (producida en laboratorio propio y específica de un epítopo común a todas las variantes de Z) y se 45 incubaron durante una noche a 4 ºC. Después de lavar, se bloquearon las placas como se describe anteriormente.

E08786222

09-10-2015

Se añadieron sueros de primates inyectados con Z00342 o Z00342-ABD00003 en serie de dilución doble partiendo de 1/40 (para Z00342) o 1/80 (para Z00342-ABD00003). Se añadieron patrones de cada molécula en serie de dilución doble partiendo de 20 ng/ml. Después de la incubación, se lavaron las placas y se añadió el anticuerpo de la segunda etapa (IgG de conejo contra Z 2 µg/ml (producida en laboratorio propio) para Z00342; 1/5000 de una IgG de conejo contra Z-ABD (producida en laboratorio propio) para Z00342-ABD00003). Después de la incubación, se lavaron las placas y se añadió Ig anti-conejo conjugada con HRP (Dako, nº de cat. 0448) diluida 1:5000. Después de la incubación final, se lavaron las placas y se revelaron como se describe anteriormente.

Resultados

IgG específica de Z en primates inyectados con Z00342: Se analizó en el suero de cada muestra de sangre por ELISA la presencia de IgG específicas de variantes de Z (Figuras 9A-9C). Se detectaron bajos niveles de IgG el día 0, excepto para un primate (9039) que tenía niveles moderados de anticuerpos preformados. Después del día 14, aumentó constantemente el título de anticuerpo y alcanzó el máximo el día 28-35 en 3 de los animales (9039, 10025, 11019), mientras que dos mostraron una menor respuesta de anticuerpo (9023 y 10105) a lo largo del periodo de 45 días.

IgG específica de Z en primates inyectados con Z00342-ABD00003: Se analizó en el suero de cada muestra de sangre por ELISA la presencia de IgG específica de la molécula Z-ABD00003 (Figuras 10A-10C). No se observó respuesta de anticuerpo en dos de los primates (12047 y 12065), mientras que dos primates (12041 y 12061) mostraron una alta respuesta. El quinto primate (12031) tenía altos niveles preséricos de anticuerpos que apenas se alteraron durante el periodo de 45 días.

Concentración de anticuerpos específicos de variantes de Z: Se calculó la concentración de IgG específicas de variantes de Z en los sueros mediante regresión lineal usando el control positivo como patrón (Figura 11). Se observaron alteraciones individuales en cada grupo de primates. El día 45, la concentración mediana de IgG específica en los grupos 1 y 2 era de 2 y 0,1 unidades/ml respectivamente, indicando que la fusión con ABD00003 reduce la respuesta contra Z00342.

Farmacocinética de Z00342 en suero: Se compararon los tiempos de circulación de Z00342 y Z00342-ABD00003 en un análisis farmacocinético. Se calcularon las concentraciones de las moléculas con el tiempo a partir de curvas patrón generadas a partir de series de dilución de cantidades conocidas de Z00342 y Z00342-ABD00003, respectivamente. Los resultados muestran que Z00342 fusionado con ABD fusionado con ABD00003 permanece más tiempo en la circulación sanguínea en comparación con Z00342 solo (Figura 12). Z00342 desaparecía de la circulación al cabo de 4 horas, mientras que las moléculas fusionadas con ABD00003 seguían siendo detectables después de 7 días.

Sumario

Los resultados de este estudio indican que la molécula variante de Z fusionada con ABD genera una menor respuesta inmunitaria así como exhibe una semivida de eliminación ampliada en comparación con la molécula variante de Z sin un copartícipe de fusión de unión a albúmina.

Ejemplo 5

Inmunogenicidad en primate de un polipéptido variante de Z fusionado con una segunda variante de ABD

Moléculas estudiadas

En esta extensión del Ejemplo 4, se fusionó una segunda variante de ABD con afinidad aún mayor por albúmina (KD= 10-13 M), con una variante de Z dimérica y se usó para un estudio de inmunogenicidad en primates.

(Z01154)2: Una variante dimérica de la proteína Z, a su vez derivada del dominio B de proteína A estafilocócica. Se produjo esta variante dimérica mediante tecnología de ADN recombinante. Se efectuó la purificación usando procedimientos de intercambio aniónico, cromatografía en fase inversa e intercambio catiónico antes de la retirada de endotoxina en una columna preempaquetada Detoxi-Gel™ AffinityPak™ (Pierce, nº de cat. 2034). Se da una descripción detallada de la molécula Z01154 monomérica en Gunneriusson E et al., Protein Eng. 12: 10, 873-878 (1999), donde se designa ZTaq4:1.

(Z01154)2-ABD00239: Una proteína de fusión entre el dímero (Z01154)2 y la molécula de ABD variante ABD00239 seleccionada en el Ejemplo 2. Se produjo esta proteína de fusión mediante tecnología de ADN recombinante. Se efectuó la purificación usando captura por afinidad en HSA-Sepharose y cromatografía en fase inversa seguida de retirada de endotoxina como anteriormente.

Procedimientos

Esquemas de administración y muestreo: Se efectuó el estudio animal en el SMI (Smittskyddsinsitutet) en Solna, Suecia, con permiso del comité ético animal local (N196/06). Se sedaron los primates antes de la administración de

E08786222

09-10-2015

la molécula de ensayo y la toma de sangre mediante la administración intramuscular de ketamina (Ketalar®). Se inyectaron por vía intravenosa a 7 macacos cangrejeros individuales, Macaca fascicularis, divididos en dos grupos de 3 y 4, respectivamente, las moléculas de ensayo como se esboza en la Tabla 10.

Tabla 10: Administración de moléculas de ensayo

Grupo: Número de animales Molécula Vía de adm. mg/kg/inyección ml/animal/inyección

1: E74, E78, E89 (Z01154)2 i.v. 0,5
1

2: E75, E87, E88, E91 (Z01154)2-ABD00239 i.v. 0,5 1

Se resumen en la Tabla 11 los puntos temporales para administración y muestreo de sangre.

Tabla 11: Puntos temporales para administración de la molécula de ensayo y muestreo de sangre

Día: Acción

0: Toma de sangre 1 e inyección 1

7: Toma de sangre 2

14: Toma de sangre 3 e inyección 2

21: Toma de sangre 4

28: Toma de sangre 5 e inyección 3

35: Toma de sangre 6

45: Toma de sangre 7

10 Análisis de las muestras de sangre por ELISA específica: Se recubrieron las placas con (Z01154)2 o (Z01154)2-ABD00239 diluido en tampón de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6) a una concentración final de 2 µg/ml. Se usaron 50 µl de solución por pocillo y se incubaron las placas a 4 ºC durante una noche. Se efectuó el bloqueo con PBS + 0,5 % de caseína a temperatura ambiente durante 1-2 h. Se añadió suero en una serie de

15 dilución doble partiendo de una dilución 1/100 en tampón de bloqueo. Se usó suero purificado de un primate hiperinmunizado como control positivo. Se efectuó la incubación a temperatura ambiente durante 1-2 horas y se llevó a cabo el lavado con 4x175 µl de PBS-T (PBS con 0,05 % de Tween 20) por pocillo usando un SkanWasher 300 (Skatron) para ELISA automatizado. Se efectuó la incubación con F(ab)2 de IgG de cabra anti-humano conjugado con HRP secundario (Jackson, nº de cat. 109-035-097) diluido 1:5000 en tampón de bloqueo a

20 temperatura ambiente durante 1-2 h. Se llevó a cabo el lavado automatizado como anteriormente. Se posibilitó la detección usando ImmunoPure® TMB (Pierce, nº de cat. 34021), en que se inactivó la reacción después de 12 min mediante la adición de H2SO4 2 M. Se leyeron las placas a 450 nm usando un lector de placas Ultra384 (Tecan) equipado con el software Magellan v3.11 (Tecan).

25 Resultados

Inmunización con (Z01154)2 y (Z01154)2-ABD00239: Se titularon sueros de primates inmunizados con (Z01154)2 solo o fusionado con ABD00239 en placas recubiertas con (Z01154)2 y (Z01154)2-ABD00239 respectivamente, y se muestran las curvas de titulación en las Figuras 13A-13B y las Figuras 14A-14B. Se incluyó el suero de un mono

30 hiperinmunizado en la titulación como control positivo. Se fijó la absorbancia del control positivo a dilución 1600 x en 100 % y se usó para normalización. La Figura 15 muestra los valores normalizados de las respuestas individuales. Los resultados muestran que los tres animales respondieron contra (Z01154)2, aunque la respuesta en un primate (E89) era de menor magnitud. En contraposición, solo uno de los cuatro animales respondía contra (Z01154)2-ABD00239.

35

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido de unión a albúmina que comprende un motivo de unión a albúmina, consistiendo dicho motivo en la secuencia aminoacídica:

GVSDX5YKX8X9IX11X12AX14TVEGVX20ALX23X24X25I

en la que, independientemente entre sí,

X5 se selecciona de Y y F; X8 se selecciona de N, R y S; X9 se selecciona de V, I, L, M, F e Y; X11 se selecciona de N, S, E y D; X12 se selecciona de R y K; X14 se selecciona de K y R; X20 se selecciona de D, N, Q, E, H, S y R; X23 se selecciona de K, I y T; X24 se selecciona de A, S, T, G, H, L y D; y X25 se selecciona de H, E y D;

uniéndose el polipéptido de unión a albúmina a la albúmina de tal modo que el valor de KD de la interacción sea como máximo de 1 x 10-9 M.
2.

Polipéptido de unión a albúmina según la reivindicación 1, en que dicho motivo de unión a albúmina consiste en una secuencia aminoacídica seleccionada de las SEQ ID NO:1-4, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:45-46, SEQ ID NO:49-50, SEQ ID NO:53-59, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:103-10, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:147-148, SEQ ID NO:151-152, SEQ ID NO:155-161, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:200-201, SEQ ID NO:204-205, SEQ ID NO:208-211, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:239-246 y SEQ ID NO:248.
3.

Polipéptido de unión a albúmina según la reivindicación 2, en que dicho motivo de unión a albúmina consiste en una secuencia aminoacídica seleccionada de las SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:53 y SEQ ID NO:239.
4.

Polipéptido de unión a albúmina según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicho motivo de unión a albúmina forma parte de un dominio de proteína de haz de tres hélices.
5.

Polipéptido de unión a albúmina según la reivindicación 4, en que dicho dominio de proteína de haz de tres hélices es el dominio GA3 de la proteína G de Streptococcus cepa G148.
6.

Polipéptido de unión a albúmina según la reivindicación 4, que comprende la secuencia aminoacídica:

LAEAKXaXbAXcXdELXeKY-[ABM]-LAALP

en la que

[ABM] es un motivo de unión a albúmina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, e, independientemente entre sí,

Xa se selecciona de V y E; Xb se selecciona de L, E y D; Xc se selecciona de N, L e I; Xd se selecciona de R y K; y Xe se selecciona de D y K.
7. Polipéptido de unión a albúmina según la reivindicación 6, cuya secuencia aminoacídica comprende una secuencia que satisface una definición de seleccionada de las siguientes:

i) se selecciona de las SEQ ID NO:258-261, SEQ ID NO:272, SEQ ID NO:275, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:290, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:302-303, SEQ ID NO:306-307, SEQ ID NO:310316, SEQ ID NO:325, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:344, SEQ ID NO:346, SEQ ID NO:350, SEQ ID NO:354, SEQ ID NO:357, SEQ ID NO:360-365, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:396, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:404-405, SEQ ID NO:408409, SEQ ID NO:412-418, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:430, SEQ ID NO:433, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:457-458, SEQ ID NO:461-462, SEQ ID NO:465

22

468, SEQ ID NO:478, SEQ ID NO:485, SEQ ID NO:487, SEQ ID NO:491, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:496-503 y SEQ ID NO:505; ii) es una secuencia aminoacídica que tiene un 85 % o más identidad con una secuencia de i).

5 8. Polipéptido de unión a albúmina según la reivindicación 7, cuya secuencia aminoacídica comprende una secuencia que satisface una definición seleccionada de las siguientes:

iii) se selecciona de las SEQ ID NO:260, SEQ ID NO:310 y SEQ ID NO:496; iv) es una secuencia aminoacídica que tiene un 85 % o más identidad con una secuencia de ii). 10
9. Fragmento de un polipéptido de unión a albúmina según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, uniéndose dicho fragmento a seroalbúmina humana de tal modo que el valor de KD de la interacción sea como máximo de 1 x 10-9 M.

15 10. Multímero de polipéptidos de unión a albúmina o fragmentos de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos dos polipéptidos de unión a albúmina o fragmentos de los mismos como unidades monoméricas.
11. Proteína de fusión o conjugado que comprende

20 i) un primer resto que consiste en un polipéptido de unión a albúmina, fragmento o multímero según cualquier reivindicación precedente; y ii) un segundo resto consistente en un polipéptido que tiene la actividad biológica deseada.

25 12. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un marcador.
13.

Polinucleótido que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
14.

Una proteína de fusión o conjugado según la reivindicación 11 para uso como medicamento que exhibe una

30 semivida in vivo que es más larga que la semivida in vivo del polipéptido que tiene la actividad biológica deseada como tal.
15. Una proteína de fusión o conjugado según la reivindicación 11 para uso como medicamento que no desencadena una respuesta inmunitaria o solo reducida tras administración al mamífero, en comparación con la

35 respuesta inmunitaria desencadenada tras la administración al mamífero del polipéptido que tiene la actividad biológica deseada como tal.

23