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ES2233600T5 - Cepas de virus del herpes. - Google Patents

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ES2233600T5
ES2233600T5 ES01901288T ES01901288T ES2233600T5 ES 2233600 T5 ES2233600 T5 ES 2233600T5 ES 01901288 T ES01901288 T ES 01901288T ES 01901288 T ES01901288 T ES 01901288T ES 2233600 T5 ES2233600 T5 ES 2233600T5
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virus
tumor
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virus according
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Biovex Ltd
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Abstract

Un virus del herpes que comprende un gen que codifica una proteína inmunomoduladora, que carece de un gen que codifica ICP34.5 funcional y un gen que codifica ICP47 funcional y que es competente para la replicación en células tumorales.

Description

Cepas de virus del herpes.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a cepas de virus del herpes con actividad antitumoral mejorada comparada con las cepas previamente conocidas.
Antecedentes de la invención
Los virus han mostrado tener utilidad en una diversidad de aplicaciones en biotecnología y medicina en muchas ocasiones. Cada una se debe a la capacidad única de los virus de entrar en las células con alta eficacia. Esto se continúa en dichas aplicaciones por la expresión y replicación de genes virales y/o la expresión de un gen heterólogo insertado. De esta manera, los virus pueden liberar y expresar genes en las células (virales u otros genes) que pueden ser útiles en, por ejemplo, terapia génica o en el desarrollo de vacunas, o pueden ser útiles en la muerte celular selectiva por replicación lítica o la acción de un gen liberado en, por ejemplo, cáncer.
Se ha sugerido que el virus del herpes simple (HSV) es de utilidad en el tratamiento oncolítico del cáncer. Sin embargo, en este caso el virus debe estar incapacitado de modo que ya no sea patogénico, es decir, no se replique y destruya células no tumorales, pero de tal forma que pueda entrar y destruir células tumorales. Para el tratamiento oncolítico del cáncer, que puede también incluir la liberación de uno o más genes que potencian el efecto terapéutico, se han identificado varias mutaciones de HSV que siguen permitiendo al virus replicarse en cultivo o en células dividiéndose activamente in vivo (por ejemplo, en tumores), pero que previenen la replicación significativa en tejido normal. Tales mutaciones incluyen la ruptura de los genes que codifican ICP34.5, ICP6, y timidina quinasa. De éstos, los virus con mutaciones en ICP34.5, o ICP34.5 junto con mutaciones en, por ejemplo, ICP6 han mostrado hasta ahora el perfil de seguridad más favorable. Los virus delecionados sólo en ICP34.5 han mostrado replicación en muchos tipos de células tumorales in vitro y replicación selectiva en tumores cerebrales inducidos artificialmente en ratones mientras que respetan el tejido circundante. Los ensayos clínicos en fase temprana también han mostrado su seguridad en humanos.
Sin embargo, aunque diversos virus, incluyendo HSV, se han mostrado prometedores para el tratamiento oncolítico del cáncer, la mayoría de este trabajo ha usado cepas de virus que no llevan un gen heterólogo que puede potenciar el efecto antitumoral. Se propone que el uso combinado de HSV con una mutación de inactivación en el gen que codifica ICP34.5, junto con la liberación del gen que codifica una proteína inmunomoduladora tal como el factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) codificado en el genoma viral incapacitado, puede tener propiedades estimuladoras del sistema inmune óptimas contra el tumor a tratar, particularmente si también se han inactivado las funciones en el virus que habitualmente reduce las respuestas inmunes contra células infectadas con HSV. Por ejemplo, la proteína ICP47 de HSV inhibe específicamente la presentación de antígenos en células infectadas por VHS (Hill et al, 1995), y el producto del gen UL43 y la proteína vhs reducen las capacidades de estimulación inmune de células dendríticas infectadas por HSV. Por lo tanto, los genes ICP47 y/o de inactivación de células dendríticas podrían delecionarse de manera útil de un virus mutante HSV oncolítico usado para el tratamiento del cáncer, particularmente si es para potenciar los efectos inmunes por medio del uso de GM-CSF u otro inmunoestimulador, citoquina o quimioquina. Recientemente, GM-CSF ha mostrado dar un efecto inmune anti-tumoral potenciado si se expresa en una célula tumoral en lugar de administrarse de manera sistémica (Shi et al 1999). De este modo, en dicho uso, se podría inocular un mutante de HSV oncolítico en un tumor primario o secundario donde podría suceder la replicación y la destrucción oncolítica del tumor. También se estimularían respuestas inmunes contra las células infectadas por HSV, y también contra células tumorales que se han extendido desde el lugar del tumor primario.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona virus con capacidades mejoradas para la destrucción lítica de células tumorales in vivo. Aquí, se construyen cepas del virus del herpes simple usando una cepa de HSV1 o HSV2, en la que se han inactivado los genes que codifican ICP34.5 e ICP47, de modo que no puede expresarse una proteína ICP34.5 o ICP47 funcional, y que también lleva un gen que codifica GM-CSF. El virus también puede mutarse para incluir cualquier gen o genes adicionales que puedan estar implicados en inhibir la función de las células dendríticas, incluyendo el gen UL43 y/o el gen que codifica vhs. Por lo tanto, la presente invención proporciona virus capaces de realizar la destrucción oncolítica de células tumorales y en los que se han maximizado los efectos inmunes anti-tumorales.
Por consiguiente, la invención proporciona:
- un virus del herpes que comprende un gen que codifica GM-CSF y que carece de los genes que codifican ICP34.5 e ICP47 funcionales y es competente para la replicación en células tumorales.
- un virus del herpes de la invención para uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.
- uso de un virus de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
- una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un virus de acuerdo con la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
- un método para tratar un tumor en un individuo en necesidad del mismo por medio de la administración a dicho individuo de una cantidad eficaz de un virus de acuerdo con la invención.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1
Virus
De arriba a abajo, los diagramas muestran: una cepa HSV1 de laboratorio 17+, una cepa HSV1 clínica JS1, una cepa 17+/ICP34.5-, una cepa JS1/ICP34.5-, una cepa JS1/ICP34.5-/ICP47-/hGMCSF, una cepa JS1/ICP34.5-/
ICP47-/mGMCSF.
Descripción detallada de la invención A. Virus
Un herpes virus de la invención es capaz de infectar eficazmente células tumorales diana, y los genes que codifican ICP34.5 e ICP47 están inactivados en el virus. La mutación de ICP34.5 permite una actividad oncolítica selectiva. Dichas mutaciones se describen en Chou et al, 1990 y Maclean et al, 1991, aunque se puede usar cualquier mutación en la que ICP34.5 sea no funcional. Pueden inactivarse adicionalmente los genes que codifican ICP6 y/o timidina quinasa, así como otros genes, si dicha inactivación reduce de manera significativa el efecto oncolítico, o si dicha deleción potencia las propiedades oncolíticas u otras propiedades deseables del virus. ICP47 habitualmente funciona bloqueando la presentación de antígenos en células infectadas por HSV, de modo que su alteración conduce a un virus que no confiere a las células tumorales infectadas propiedades que puedan protegerlas del sistema inmune del hospedador cuando se infectan por HSV. Los virus de la invención codifican adicionalmente la proteína inmunomoduladora, GM-CSF, pero también pueden codificar otras citoquinas, quimioquinas tales como RANTES, u otras proteínas inmunomoduladoras tales como B7.1, B7.2 o CD40L.
Las regiones virales alteradas para los propósitos descritos anteriormente pueden eliminarse (completa o parcialmente), o hacerse no funcionales, o sustituirse por otras secuencias, en particular, por un gen de una proteína inmunomoduladora tal como GM-CSF.
El virus de la invención puede proceder de una cepa HSV1 o HSV2, o de un derivado de las mismas, preferiblemente HSV1. Los derivados incluyen recombinantes inter-tipo que contienen ADN de cepas HSV1 y HSV2. Tales recombinantes inter-tipo se describen en la técnica, por ejemplo, en Thompson et al, 1998 y Meignier et al, 1998. Los derivados preferiblemente tienen al menos un 70% de homología de secuencia con los genomas de HSV1 o HSV2, más preferiblemente al menos un 80%, incluso más preferiblemente al menos un 90% o un 95%. Más preferiblemente, un derivado tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con el genoma de HSV1 o HSV2, más preferiblemente al menos un 80% de identidad, incluso más preferiblemente al menos un 90%, un 95% o un 98% de identidad.
Por ejemplo, el Paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo, usado en sus parámetros por defecto) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular la homología o alinear las secuencias (típicamente en sus parámetros por defecto), por ejemplo, como se describe en Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.
El software para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema que corresponden o satisfacen alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T se refiere al umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., 1990). Estos aciertos iniciales en palabras vecinas actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar los HSP que los contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda incrementarse la puntuación de alineamiento acumulativa. Las extensiones de los aciertos de palabras en cada dirección se paran cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye en la cantidad X desde su máximo valor conseguido; la puntuación acumulativa llega a cero o a un valor menor, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de las dos cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en la comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menor de aproximadamente 1, preferiblemente menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y más preferiblemente aún menor de aproximadamente 0,001.
Un derivado puede tener la secuencia de un genoma de HSV1 o HSV2 modificado por sustituciones de nucleótidos, por ejemplo, de 1, 2 ó 3 a 10, 25, 50 ó 100 sustituciones. Como alternativa o adicionalmente el genoma de HSV1 o HSV2 puede modificarse por una o más inserciones y/o deleciones y/o por una extensión en cualquier extremo o en ambos extremos.
Las cepas virales de la invención pueden ser cepas "que no son de laboratorio". También pueden denominarse cepas "clínicas". Un especialista en la técnica podrá distinguir fácilmente entre una cepa de laboratorio y una cepa que no es de laboratorio, o clínica. Más adelante se proporcionan pautas sobre las propiedades que probablemente muestran las cepas virales.
La distinción clave entre una cepa de laboratorio y una cepa que no es de laboratorio es que las cepas de laboratorio en uso habitual actualmente se han sometido a cultivo durante largos periodos, muchos años en algunos casos. El cultivo de virus tales como HSV implica una técnica conocida como pase en serie. Para que los virus crezcan y se mantengan, se infectan células apropiadas con el virus, el virus se replica en la célula, después se recoge el virus; y después se reinfectan células nuevas, constituyendo este proceso un ciclo de pase en serie. Cada uno de estos ciclos puede requerir, por ejemplo, unos pocos días en el caso de HSV. Como se dijo anteriormente, tales pases en serie pueden conducir a cambios en las propiedades de la cepa viral, ya que la selección se realiza con respecto a propiedades que favorecen el crecimiento en cultivo (por ejemplo, replicación rápida), en lugar de las propiedades útiles para aplicaciones prácticas, por ejemplo, el mantenimiento de la capacidad para desplazarse a lo largo de los axones en el caso de HSV o de infectar células humanas.
Las cepas virales de la invención pueden ser cepas que no son de laboratorio en el sentido de que son cepas aisladas recientemente a partir de individuos infectados. Las cepas de la invención están modificadas en comparación con los aislados clínicos originales, y pueden haber empleado un tiempo en cultivo, pero cualquier tiempo empleado en cultivo será comparativamente corto. Las cepas de la invención se preparan de manera que se retengan sustancialmente las propiedades deseables de los aislados clínicos originales de los que derivan.
Una cepa viral de la invención procede de una cepa viral parental si la cepa viral parental se ha mutado para producir el virus. Por ejemplo, un virus de la invención puede proceder del aislado clínico JSI. La cepa parental de dicho virus derivado de JSI puede ser JSI u otra cepa HSV1 derivada de JSI. Por lo tanto, un virus de la invención puede ser un virus JSI que comprende un gen que codifica GM-CSF y que carece de un gen que codifica ICP34.5 funcional y un gen que codifica ICP47 funcional. Además, dicho virus puede contener cualquier otra mutación como se menciona en este documento.
Un virus de la invención es capaz de infectar eficazmente células cancerosas humanas diana. Cuando dicho virus es una cepa que no es de laboratorio o cepa clínica, se habrá aislado recientemente a partir de un individuo infectado por HSV, y después se había explorado con respecto a la capacidad deseada de potenciar la replicación, infección o destrucción de células tumorales y/u otras células in vitro y/o in vivo en comparación con cepas de laboratorio convencionales. Después, dichos virus de la invención con propiedades mejoradas en comparación con cepas virales de laboratorio se manipulan, de modo que carezcan de los genes ICP34.5 e ICP47 funcionales y codifiquen uno gen de la proteína inmunomoduladora GM-CSF bajo el control de un promotor apropiado. También se pueden inactivar otros genes que codifican proteínas que interfieren con la función de las células dendríticas tales como UL43 y/o vhs.
Preferiblemente, una cepa viral de la invención que no es de laboratorio se ha sometido a cultivo durante tres años o menos desde que se aisló de su cepa precursora clínica no modificada a partir de su hospedador. Más preferiblemente, la cepa se ha sometido a cultivo durante un año o menos, por ejemplo, nueve meses o menos, seis meses o menos, tres meses o menos, dos meses o menos, un mes o menos, dos semanas o menos, o una semana o menos. Por estas definiciones de tiempo en cultivo, se quiere decir el tiempo empleado realmente en cultivo. De este modo, por ejemplo, es una práctica habitual congelar las cepas virales para conservarlas. Evidentemente, la conservación por congelación o de una manera equivalente no se considera mantenimiento de la cepa en cultivo. De este modo, el tiempo empleado en congelar o conservar de otra manera no se incluye en las definiciones anteriores de tiempo empleado en cultivo. El tiempo empleado en cultivo típicamente es el tiempo realmente empleado en someterlo a pases en serie, es decir, el tiempo durante el cual puede tener lugar la selección de características no deseadas.
Preferiblemente, una cepa viral que no es de laboratorio se ha sometido a 1.000 o menos ciclos o pases en serie desde que se aisló de su cepa precursora clínica no modificada a partir de su hospedador. Más preferiblemente, se ha sometido a 500 o menos, 100 o menos, 90 o menos, 80 o menos, 70 o menos, 60 o menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos, o 10 o menos de dichos ciclos.
Preferiblemente, un virus que no es de laboratorio tiene una mayor capacidad, como se mide por ensayos estadísticos convencionales, que una cepa de laboratorio de referencia con las modificaciones equivalentes, para realizar ciertas funciones útiles en la aplicación disponible. En el caso de un virus oncolítico para el tratamiento de tumores, una cepa viral de la invención que no es de laboratorio tendrá, preferiblemente, una mayor capacidad que una cepa de laboratorio de referencia con modificaciones equivalentes, para infectar o replicarse en células tumorales, para destruir células tumorales o extenderse entre las células del tejido. Más preferiblemente, dicha mayor capacidad es una capacidad mayor de manera estadísticamente significativa. Por ejemplo, de acuerdo con la invención, una cepa de la invención que no es de laboratorio puede tener hasta 1,1 veces, 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, o 100 veces la capacidad de la cepa de referencia con respecto a la propiedad que se está ensayando.
El análisis estadístico de las propiedades descritas en este documento puede realizarse mediante ensayos convencionales, por ejemplo, ensayos-t, ANOVA, o ensayos Chi cuadrado. Típicamente, el significado estadístico se medirá a un nivel de p = 0,05 (5%), más preferiblemente p = 0,01, p = 0,001, p = 0,0001, p = 0,000001.
Los virus de la invención infectan y se replican en células tumorales, y posteriormente destruyen las células tumorales. De este modo, dichos virus son competentes para la replicación. Preferiblemente, son selectivamente competentes para la replicación en células tumorales. Esto significa que se replican en células tumorales y no en células no tumorales, o que se replican más eficazmente en células tumorales que en células no tumorales. Las células en las que los virus son capaces de replicarse son células permisivas. La medida de la competencia de replicación selectiva puede realizarse mediante ensayos descritos en este documento para la medida de la replicación y la capacidad de destruir células tumorales, y también se analiza mediante técnicas estadísticas mencionadas en este documento, si se desea.
Un virus de la invención tiene, preferiblemente, una capacidad mayor que una cepa parental no modificada para infectar o replicarse en una célula tumoral, para destruir células tumorales o para extenderse entre las células del tejido. Preferiblemente, esta capacidad es una capacidad mayor de manera estadísticamente significativa. Por ejemplo, un virus de acuerdo con la invención puede tener hasta 1,1 veces, 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces la capacidad de la cepa parental no modificada con respecto a la propiedad que se está ensayando.
Las propiedades de la cepa viral con respecto a las células tumorales pueden medirse de cualquier manera conocida en la técnica. Por ejemplo, la capacidad de un virus de infectar una célula tumoral puede cuantificarse midiendo la dosis de virus necesaria para medir un porcentaje de células dado, por ejemplo, el 50% o el 80% de células. La capacidad para replicarse en una célula tumoral puede medirse por mediciones de crecimiento tales como las realizadas en los Ejemplos, por ejemplo, midiendo el crecimiento viral en células durante un periodo de 6, 12, 24, 36, 48 o 72 horas o más.
La capacidad de un virus para destruir células tumorales puede cuantificarse de manera aproximada a simple vista o cuantificarse de manera más exacta contando el número de células vivas que permanecen en el tiempo en un momento dado y el valor de MOI en un tipo celular dado. Por ejemplo, se pueden hacer las comparaciones durante 24, 48 o 72 horas y usando cualquier tipo de célula tumoral conocida. En particular, se pueden usar células HT29 de adenocarcinoma colorrectal, células LNCa.FGC de adenocarcinoma de próstata, células MDA-MB-231 de adenocarcinoma de mama, células SK-MEL-28 de melanoma maligno o células U-87 MG de astrocitoma glioblastoma. Se puede usar cualquiera de estos tipos celulares o cualquier combinación de estos tipos celulares, así como otros tipos de células tumorales. Puede ser deseable construir un conjunto patrón de tipos de células tumorales para este propósito. Para contar el número de células vivas que quedan en un momento dado, se puede contar el número de células que excluyen el azul tripán (es decir, células vivas). La cuantificación también puede realizarse por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo MTT. La capacidad de destruir células tumorales también puede medirse in vivo, por ejemplo, midiendo la reducción del volumen del tumor engendrado por un virus particular.
Para determinar las propiedades de los virus de la invención, generalmente será deseable usar una cepa de referencia de laboratorio convencional para comparar. Puede usarse cualquier cepa de referencia de laboratorio convencional adecuada. En el caso de HSV, se prefiere usar una o más cepas 17+ de HSV1, cepas F de HSV1 o cepas KOS de HSV1. La cepa de referencia típicamente tendrá modificaciones equivalentes a la cepa de la invención que se está ensayando. De este modo, la cepa de referencia típicamente tendrá modificaciones equivalentes tales como deleciones génicas e inserciones de genes heterólogos. En el caso de un virus de la invención, cuando los genes que codifican ICP34.5 e ICP47 se han vuelto no funcionales, también se habrán vuelto no funcionales en la cepa de referencia. Las modificaciones hechas en la cepa de referencia pueden ser idénticas a las hechas en la cepa de la invención. Con esto, se quiere decir que las interrupciones génicas en la cepa de referencia estarán en posiciones exactamente equivalentes a las de la cepa de la invención, por ejemplo, las deleciones serán del mismo tamaño y estarán en el mismo lugar. De manera similar, en estas realizaciones, los genes heterólogos se insertarán en el mismo lugar, y se dirigirán por el mismo promotor, etc. Sin embargo, no es esencial que se hagan modificaciones idénticas. Lo que es importante es que el gen de referencia tenga modificaciones funcionalmente equivalentes, por ejemplo, que los mismos genes se vuelvan no funcionales y/o se inserte el mismo gen o genes heterólogos.
B. Métodos de mutación
Los diversos genes a los que se hace mención pueden volverse funcionalmente inactivos por varias técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden volverse funcionalmente inactivos por deleción (o deleciones), sustitución (o sustituciones) o inserción (o inserciones), preferiblemente por deleción. Las deleciones pueden retirar una o más porciones del gen o el gen completo. Por ejemplo, puede hacerse la deleción de un solo nucleótido, obteniéndose un desplazamiento de fase. Sin embargo, preferiblemente se realiza una deleción de mayor tamaño, por ejemplo, al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50% de la secuencia total codificante y no codificante (o, como alternativa, en términos absolutos, al menos 10 nucleótidos, más preferiblemente al menos 100 nucleótidos, y aún más preferiblemente, al menos 1000 nucleótidos). Se prefiere particularmente retirar el gen completo y algunas de las secuencias flanqueantes. Cuando hay dos o más copias del gen en el genoma viral, se prefiere que las dos copias del gen se vuelvan funcionalmente inactivas.
Las mutaciones en los virus del herpes se realizan por métodos de recombinación homóloga bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, el ADN genómico de HSV se transfiere junto con un vector, preferiblemente un vector plasmídico, que comprende la secuencia mutada flanqueada por secuencias de HSV homólogas. La secuencia mutada puede comprender una deleción (o deleciones), inserción (o inserciones) o sustitución (o sustituciones), todas las cuales se pueden construir por técnicas habituales. Las inserciones pueden incluir genes marcadores seleccionables, por ejemplo, lacZ o la proteína verde fluorescente (GFP), para seleccionar los virus recombinantes, por ejemplo, por la actividad \beta-galactosidasa o por fluorescencia.
C. Genes heterólogos y promotores
Los virus de la invención son modificados para llevar un gen heterólogo que codifica una proteína inmunomoduladora. La proteína inmunomoduladora potenciará la actividad anti-tumoral del virus. La proteína es GM-CSF. El gen inmunomodulador puede ser cualquier variante alélica de un gen de tipo silvestre, o puede ser un gen mutante. El gen inmunomodulador derivará de un mamífero, preferiblemente un roedor o primate, más preferiblemente un humano. El gen inmunomodulador preferiblemente está unido de manera operativa a una secuencia de control que permite la expresión de dicho gen en una célula in vivo. Por lo tanto, los virus de la invención pueden usarse para liberar el gen inmunomodulador (o genes) en una célula in vivo donde se expresará.
El gen inmunomodulador puede insertarse en el genoma viral mediante cualquier técnica apropiada tal como recombinación homóloga de cepas de HSV con, por ejemplo, vectores plasmídicos que llevan el gen flanqueado por secuencias de HSV. El gen GM-CSF, puede introducirse en un vector plasmídico apropiado que comprende secuencias del virus del herpes usando técnicas de clonación bien conocidas en la técnica. El gen puede insertarse en el genoma viral en cualquier posición a condición de que se conserven las propiedades oncolíticas. Los genes inmunomoduladores pueden insertarse en múltiples sitios en el genoma viral. Por ejemplo, pueden insertarse de 2 a 5 genes en el genoma.
La secuencia transcrita del gen inmunomodulador está unida preferiblemente a una secuencia de control que permite la expresión del gen en una célula tumoral. La expresión "unido de manera operativa" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Una secuencia de control "unida de manera operativa" a una secuencia codificante está ligada de tal manera que se consigue la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con la secuencia de control.
La secuencia de control comprende un promotor que permite la expresión del gen inmunomodulador y una señal para la terminación de la transcripción. El promotor se selecciona entre promotores que son funcionales en mamíferos, preferiblemente en células tumorales humanas. El promotor puede derivar de secuencias promotoras de genes eucarióticos. Por ejemplo, el promotor puede derivar del genoma de una célula en la que va a tener lugar la expresión del gen heterólogo, preferiblemente de un mamífero, preferiblemente una célula tumoral humana. Con respecto a los promotores eucarióticos, pueden ser promotores que funcionan de manera ubicua (tal como promotores de \beta-actina, tubulina) o, como alternativa, de manera específica de tumor. También pueden ser promotores que responden a estímulos específicos, por ejemplo, promotores que se unen a receptores de hormonas esteroideas. También pueden usarse promotores virales, por ejemplo, el promotor de la repetición larga terminal del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR) u otros promotores retrovirales, el promotor IE de citomegalovirus (CMV) de humano o ratón, o promotores de genes de virus del herpes incluyendo los que dirigen la expresión de los trascritos asociados a la latencia.
Los cassettes de expresión y otras construcciones apropiadas que comprenden el gen inmunomodulador y las secuencias de control, pueden obtenerse usando técnicas de clonación de rutina conocidas por los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).
También puede ser ventajoso que los promotores sean inducibles para poder regular los niveles de expresión del gen o genes inmunomoduladores durante la vida de la célula tumoral. Inducible significa que pueden regularse los niveles de expresión obtenidos usando el promotor. Por ejemplo, un virus de la invención también puede comprender un gen heterólogo que codifica la proteína de fusión represor de tet/activador transcripcional de VP16 bajo el control de un promotor fuerte (por ejemplo, el promotor IE de CMV) y el gen inmunomodulador puede estar bajo el control de un promotor de respuesta a la proteína de fusión represor de tet/activador transcripcional de VP16 de la que se ha informado previamente (Gossen and Bujard, 1992, Gossen et al, 1995). De este modo, en este ejemplo, la expresión del gen inmunomodulador podría depender de la presencia o ausencia de tetraciclina.
En el genoma del virus del herpes pueden acomodarse múltiples genes heterólogos. Por lo tanto, un virus de la invención puede comprender dos o más genes inmunomoduladores, por ejemplo, de 2 a 3, 4 ó 5 genes inmunomoduladores. Uno de los genes que debe codificar el GM-CSF. Se podrían introducir más de un gen y secuencias de control asociadas en una cepa particular de HSV en un solo sitio o en múltiples sitios en el genoma viral. Como alternativa, pueden usarse pares de promotores (promotores iguales o diferentes) enfrentados en orientaciones opuestas entre sí, cada uno de los cuales dirige la expresión de un gen inmunomodulador.
D. Usos terapéuticos
Los virus de la invención pueden usarse en métodos de terapia de cáncer del cuerpo humano y animal. En particular, los virus de la invención pueden usarse en el tratamiento oncolítico del cáncer, con o sin terapia adicional de profármacos o estimulación de una respuesta inmune anti-tumoral. Los virus de la invención pueden usarse en el tratamiento terapéutico de cualquier tumor sólido en un mamífero, preferiblemente en un humano. Por ejemplo, los virus de la invención pueden administrarse a un sujeto con carcinoma de próstata, de mama, de pulmón, de hígado, endometrial, de vejiga, de colon o cervical; adenocarcinoma; melanoma; linfoma; glioma; o sarcomas tales como de tejido blando y sarcomas óseos.
E. Administración
Los virus de la invención pueden usarse en un paciente, preferiblemente un paciente humano, en necesidad de tratamiento. Un paciente en necesidad de tratamiento es un individuo que padece cáncer, preferiblemente un individuo con un tumor sólido. El objetivo de un tratamiento terapéutico es mejorar el estado de un paciente. Típicamente el tratamiento terapéutico que usa un virus de la invención alivia los síntomas del cáncer. Un método de tratamiento del cáncer de acuerdo con la invención comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus de la invención a un paciente que padece cáncer. La administración de un virus oncolítico de la invención a un individuo que padece un tumor, típicamente destruirá las células del tumor, disminuyendo de esta manera el tamaño del tumor y/o previniéndose la propagación de células malignas desde el tumor.
Un método para administrar la terapia implica la combinación del virus con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica. Los vehículos y diluyentes apropiados incluyen soluciones salinas isotónicas, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas con fosfato.
El tratamiento terapéutico puede realizarse por inyección directa de la composición viral en el tejido diana, que puede ser el tumor o un vaso sanguíneo que abastece al tumor. La cantidad de virus administrado está, en el caso de HSV, en el intervalo de 10^{4} a 10^{10} pfu, preferiblemente de 10^{5} a 10^{8} pfu, más preferiblemente de aproximadamente 10^{6} a 10^{8} pfu. Típicamente, podrían usarse para inyección hasta 500 \mul, típicamente de 1 a 200 \mul, preferiblemente de 1 a
10 \mul de una composición farmacéutica que consta esencialmente del virus y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Sin embargo, para algunas aplicaciones de terapia oncolítica, también se pueden usar mayores volúmenes de hasta 10 ml, dependiendo del tumor y el sitio de inoculación.
Las vías de administración y las dosificaciones descritas, sólo deben considerarse una pauta, ya que los médicos especialistas serán capaces de determinar fácilmente la vía de administración y dosificación óptimas. La dosificación puede determinarse de acuerdo con varios parámetros, especialmente de acuerdo con la localización del tumor, el tamaño del tumor, la edad, peso y estado del paciente a tratar y la vía de administración. Preferiblemente, el virus se administra por inyección directa en el tumor. El virus también puede administrarse de manera sistémica o por inyección en un vaso sanguíneo que abastece al tumor. La vía de administración óptima dependerá de la localización y tamaño del tumor.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención.
Previamente se ha demostrado que el virus del herpes simple de tipo-1 (HSV1) en el que el factor de neurovirulencia ICP34.5 está inactivado, dirige la lisis de células tumorales específicas en modelos de tumor tanto in vitro como in vivo. También se ha demostrado que dichos virus son seguros en ensayos clínicos de Fase I por inyección intra-cerebral directa en pacientes con glioma en estado tardío.
El trabajo previo ha usado aislados sometidos a pases en serie de HSV1 (virus derivados de cepas 17+ de HSV1 o cepas F de HSV1) que sería de esperar que estuvieran atenuados en su capacidad lítica en células tumorales humanas comparados con aislados clínicos más recientes.
En el trabajo dirigido a producir HSV con ICP34.5 delecionado, con potencial oncolítico y anti-tumoral potenciado, se ha delecionado ICP47 e ICP34.5 a partir de la cepa JS1 de HSV1 y se ha insertado el gen inmunomodulador de GM-CSF.
Construcción Viral (véase la Figura 1)
Los virus usados estaban basados en la cepa 17+ de HSV1 (una cepa de laboratorio convencional) o un aislado clínico derivado de ampollas de un reactivador frecuente de HSV1. Esta cepa clínica, o "que no es de laboratorio", se denomina JS1. ICP34.5 se había delecionado completamente de la cepa 17+ y JS1 junto con la inserción de un casete de CMV-GFP. Después se modificó adicionalmente JS1 por inserción de GM-CSF humano (hGM-CSF) o GM-CSF de ratón (mGM-CSF) para reemplazar el gen ICP34.5 y por deleción de ICP47. Los derivados de JS1 descritos en este documento también son cepas que no son de laboratorio, es decir, cepas de la invención modificadas que no son de laboratorio.
Capacidades Líticas de los Virus
Las capacidades líticas (de destruir células) se potenciaron con los virus derivados de cepas JS1 que no son de laboratorio en todas las líneas de células tumorales ensayadas comparadas con las cepas derivadas de 17+. Más particularmente, los virus JS1/34.5-, es decir, JS1 con ICP34.5 retirado por deleción, mostraron capacidades líticas potenciadas en células HT29 de adenocarcinoma colorrectal, células LNCa.FGC de adenocarcinoma de próstata, células MDA-MB-231 de adenocarcinoma de mama, células SK-MEL-28 de melanoma maligno y células U-87 MG de astrocitoma glioblastoma.
De este modo, para proporcionar una mayor actividad oncolítica, es probable que el uso de cepas virales clínicas recientes potencie las capacidades anti-tumorales de dichos virus cuando se usan en pacientes humanos para tratamiento del cáncer.
Actividad Anti-tumoral Potenciada Adicionalmente
También puede preverse una actividad potenciada adicionalmente si después estos virus se usan para suministrar genes con actividad anti-tumoral. Dichos genes incluyen los que codifican activadores de profármacos o proteínas inmunoestimuladoras.
El asilado clínico con ICP34.5 delecionado de HSV1 que expresa GM-CSF de humano o ratón, se produjo a partir de JS1. GM-CSF es un potente inmunoestimulador. Estos virus están diseñados para potenciar respuestas inmunes anti-tumorales después de una inyección intra-tumoral. Se demostró que estos virus expresaban GM-CSF de humano o ratón usando kits de ensayo ELISA (Biotrak, Amersham) cuando los virus se producían en células BHK en cultivo. Los pocillos individuales de una placa de 6 pocillos produjeron 0,56 o 0,54 microgramos de GM-CSF de humano o ratón respectivamente 24 horas después de la infección de células BHK confluyentes a MOI = 0,5.
Información del Depósito
La cepa JS1 de HSV1 se ha depositado en la European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Sailsbury, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido, el 2 de enero de 2001 con el número provisional de entrada 01010209.
Referencias
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Gossen M et al. 1995, Science 268: 1766-1769.
Thompson et al. 1998, Virus Genes 1(3); 275-286.
Meignier et al. 1988, Infect. Dis. 159; 602-614.

Claims (14)

1. Un virus del herpes que comprende un gen que codifica GM-CSF, que carece de un gen que codifica ICP34.5 funcional y un gen que codifica ICP47 funcional y que es competente para la replicación en células tumorales.
2. Un virus de acuerdo con la reivindicación 1 que también carece del gen funcional que codifica ICP6, glicoproteína H o timidina quinasa.
3. Un virus de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que también carece de un gen que codifica una copia funcional de una proteína capaz de inhibir la función de las células dendríticas.
4. Un virus de acuerdo con la reivindicación 3 en la que dicha proteína capaz de inhibir la función de las células dendríticas es UL43 o vhs.
5. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es una cepa de virus del herpes simple 1 o 2.
6. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es una cepa viral que no es de laboratorio.
7. Un virus de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha cepa que no es de laboratorio:
(a) se ha sometido a cultivo durante un año o menos desde que se aisló de su cepa precursora no modificada a partir de su hospedador, o
(b) se ha sometido a 100 o menos ciclos de pases en serie desde que se aisló de su cepa precursora no modificada a partir de su hospedador, o
(c) tiene mayor capacidad que una cepa de referencia de laboratorio con modificaciones equivalentes para infectar o replicarse en una célula tumoral, para destruir células tumorales, o para extenderse entre las células del tejido, o
(d) tiene sustancialmente la capacidad de su cepa precursora no modificada con respecto a una o más de las propiedades definidas en (c).
8. Un virus de acuerdo con la reivindicación 7 donde, en (c), dicha mayor capacidad es una capacidad mayor de manera estadísticamente significativa; o donde, en (d), sustancialmente la misma capacidad es la misma capacidad o una capacidad no diferente estadísticamente.
9. Un virus de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, donde la cepa que no es de laboratorio es una cepa de HSV y la cepa de referencia como se define en la reivindicación 7 es una cepa 17+ de HSV1, una cepa F de HSV1 o la cepa KOS de HSV1 con modificaciones equivalentes a la cepa que no es de laboratorio.
10. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que deriva de JS1 de HSV1, depositada en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número provisional de entrada 01010209.
11. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.
12. Uso de un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12 donde dicho medicamento es para inoculación intra-tumoral directa.
14. Una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
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