ES2227580T3 - Marcadores de quimioluminiscencia electrogenerada para labores de analisis y/o referencia. - Google Patents

Abstract

ANALISIS DE BIOMOLECULAS QUE EMPLEA OXIDACION ANODICA DE 9, 10-DIFENILANTRACEN-2-SULFONATO DE SODIO ACUOSO (DPAS) Y ACIDO 1- Y 2-TIANTRENOCARBOXILICO (1-THCOOH Y 2-THCOOH) EN PRESENCIA DE TRIN-PROPILAMINA (TPRA) COMO CORREACTIVO EN SOLUCION ACUOSA QUE PRODUCE QUIMILUMINISCENCIA ELECTROGENERADA (ECL). ADEMAS, LA REDUCCION CATODICA DE DPAS EN PRESENCIA DE PEROXIDISULFATO (S2O8-2) COMO CORREACTIVO PRODUCE TAMBIEN ECL EN UNA SOLUCION ACUOSA DE ACETONITRILO (MECN) (1:1 EN VOLUMEN). LA OXIDACION DE CLOROPROMAZINA (CPZ) PRODUCE UNA EMISION ECL EN AUSENCIA DE UN CORREACTIVO AÑADIDO SIGUIENDO UN MECANISMO "AUTOANIQUILACION" SIN PRECEDENTES.

Description

Marcadores de quimioluminiscencia electrogerenada para labores de análisis y/o referencia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de quimioluminiscencia electrogenerada y composiciones de hidrocarbonos modificados y compuestos heterocíclicos aromáticos que aparecen en una solución acuosas con correactivos como tri-n-propilamina (TPrA) y peroxidisulfato (S_{2}O_{8}^{2-}) y en particular, los que proporcionan el análisis simultáneo y procedimientos de referencia interna. Más específicamente, la presente invención proporciona compuestos luminescentes orgánicos policíclicos sustituidos que presentan unos anillos de carbono opcionalmente reemplazados al menos con un heteroátomo seleccionado de entre N y S, como difenilantraceno, triantreno y promazina sustituidos, para aplicaciones de quimioluminiscencia electrogenerada.

Antecedentes de la invención

Los marcadores luminescentes se han utilizado para marcar varios bioanalitos, como enzimas, anticuerpos, antígenos, péptidos, nucleótidos, sacáridos o células cumplimentadoras del analito de interés, en inmunoensayos, procedimientos con sondas de ADN y procedimientos de fluorescencia y de separación. Resultan particularmente interesantes los marcadores que pueden convertirse en luminescentes mediante procedimientos de reacción electroquímica. Los marcadores que se convierten en luminescentes como consecuencia de la excitación electroquímica resultan útiles por sus propiedades de sensibilidad y ausencia de peligrosidad.

Una técnica analítica que explota los beneficios de esos marcadores es la quimioluminiscencia electrogenerada (ECL). La ECL surge de una reacción energética de transferencia de electrones entre especies redox electrogeneradas representadas por A^{-} y D+, habitualmente iones radicales, para dar lugar a un estado excitado (A^{\bullet} o D^{\bullet}) que emite en la región visible:

(1)A + e^{-} \rightarrow A^{-} \ E_{A}

(2)D - e^{-} \rightarrow D^{+} \ E_{D}

(3)A^{-} + D^{+} \rightarrow A+D^{\bullet}(o \ A+D)

\hskip6,7cm

D^{\bullet}\rightarrow D - - hu

\hskip6,6cm

(4)

Faulkner y Bard en Electroanalytical Chemistry, Vol. 10, p. 1, 1977, proporcionan varios ejemplos de sistemas no acuosos de este tipo.

A.W. Knight y G.M. Greenway en Analyst, 1994, 119, 879, comentan los precursores de la ECL que se pueden generar en una solución acuosa incluso con un intervalo de potencial limitado impuesto por la oxidación y reducción de agua. La ECL se puede conseguir mediante la oxidación simultánea de tris (2,2'-bipiridina) rutenio (II) (Ru(bpy)_{3}^{2+})
y un correactivo (XY^{z}) capaz de generar un reductor adecuado al oxidarse, mediante un mecanismo de oxidación-reducción como:

(5)Ru(bpy)_{3}{}^{2+} - e^{-} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{3+}

(6)XY^{Z} . \ e^{-} \rightarrow XY^{Z+1}

(6a)Ru(bpy)_{3}{}^{3+} + XY^{Z} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{2+} + XY^{Z+1}

(7)XY^{Z+1} \rightarrow X^{X} + Y^{Y} (x+y = z+1)

(8)Ru(bpy)_{3}{}^{3+} + X^{X} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{2+\bullet} + X^{X+1}

(9)Ru(bpy)_{3}{}^{2+\bullet} Ru(bpy)_{3}{}^{2+} + h\upsilon

Ru(bpy)_{3}^{2+} es un precursor típico (D) de dichas reacciones y se ha utilizado en las reacciones de quimioluminiscencia (CL) con aminas y también en investigaciones sobre ECL utilizando varios correactivos diferentes, como oxalato (donde XY^{Z} es C_{2}O_{4}^{2-} y X^{X} es CO_{2}^{+\bullet}) y aminas alifáticas como tri-n-propilamina (TPrA; donde XY^{Z} es Pr_{3}N y X^{Z} es el radical que se obtiene por la desprotonación de Pr_{3}N^{+}). En estas reacciones de ECL el correactivo se puede oxidar bien en el electrodo mediante la ecuación (6) o en solución mediante el emisor vía la ecuación (6a). Como alternativa a la reacción reflejada en la ecuación (8), el estado excitado puede generarse también mediante la secuencia de ecuaciones (10) y (11), que se muestran a continuación, tal como se ha comentado anteriormente para oxalato y TPrA.

(10)Ru(bpy)_{3}{}^{2+} + X^{X} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{+} + X^{X+1}

(11)RU(bpy)_{3}{}^{+} + + \ Ru(bpy)_{3}{}^{3+} - Ru(bpy)_{3}{}^{2+\bullet} + Ru(bpy)_{3}{}^{2+}

En el caso del correactivo oxalato, la reacción que se expone en la ecuación (7) implica la escisión del enlace carbono-carbono mientras que se cree que el correactivo TPrA en este paso implica la pérdida de un protón del carbono \alpha. Estas reacciones de ECL se han utilizado para determinar tanto Ru(bpy)_{3}^{2+} como oxalato.

Para complementar estos ejemplos de oxidación-reducción, peroxidisulfato y Ru(bpy)_{3}^{2+} sufren una inversión análoga de la reacción (un mecanismo de reducción-oxidación, ecuaciones (12)-(14) seguidas por (9)) cuando se reducen los reactivos iniciales, en lugar de oxidarse, en soluciones de acetonitrilo (MeCN)-agua (relación de volumen 1:1). En este caso, la reducción de S_{2}O_{8}^{2-} da lugar a la formación del agente fuertemente oxidante SO_{4}^{-\bullet}:

(12)Ru(bpy)_{3}{}^{2+} + e^{-} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{+}

(13)S_{2}O_{8}{}^{2-} + e^{-} \rightarrow SO_{4}{}^{-\bullet} + SO_{4}{}^{2-}

(13a)Ru(bpy)_{3}{}^{+} + S_{2}O_{8}{}^{2-} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{2+} +SO_{4}{}^{-2} + SO_{4}{}^{-2-}

(14)Ru(bpy)_{3}{}^{+} + SO_{4}{}^{-\bullet}\rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{2+\bullet} + SO_{4}{}^{2-}

Por analogía con las ecuaciones (10) y (11) para oxalato y TPrA, una alternativa a la ecuación (14) para generar el estado excitado con peroxidisulfato es:

(15)Ru(bpy)_{3}{}^{2+} + SO_{4}{}^{-\bullet} \rightarrow Ru(bpy)_{3}{}^{2\bullet} + SO_{4}{}^{2-}

Seguida por la ecuación (11) anterior.

La sensibilidad y selectividad de estos análisis de correactivos ha dado lugar a la reciente aplicación comercial del sistema Ru(bpy)_{3}^{2+}/TPrA. Por ejemplo, los marcadores de quimioluminiscencia electrogenerada que contienen rutenio y osmio se han usado en procedimientos para detectar y cuantificar analitos de interés en medios líquidos, patentes US nº 5.310.687; nº 5.238.808; y nº 5.221.605. Además, se ha descrito la aplicación de mediciones de quimioluminiscencia electrogeneradas (ECL) para la detección de una fase de solución de ADN intercalado con marcadores que contienen rutenio (Carter, M. T. et al. (1990) Bioconjugate Chem 2:257-263). Aunque dichas aplicaciones constituyen una técnica de análisis aceptable, a menudo es necesario proporcionar un sistema que permita el análisis simultáneo y procedimientos de referencia interna. La presente invención proporciona sistemas de quimioluminiscenia electrogenerada que pueden usarse en lugar de los sistemas existentes, o junto a ellos.

Becker et al. (J. Electroanal. Chem. 167 (1984) págs. 127-140) describen un estudio de la ECL de sistemas hidrocarbono aromático/peroxidisulfato en soluciones de acetonitrilo-benceno.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a marcadores de quimioluminiscencia electrogenerada en los cuales: 1) el emisor es soluble en una solución acuosa; 2) la longitud de onda de la emisión es distinta a la de Ru(bpy)_{3}^{2+}; 3) la electroquímica oxidativa o reductora continúa dentro del intervalo potencial relativamente estrecho impuesto por la oxidación o reducción del agua; y 4) el producto intermedio oxidado o reducido reacciona con el producto intermedio correactivo electrogenerado, permitiendo la formación del estado excitado.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar compuestos luminescentes orgánicos policíclicos sustituidos, como, por ejemplo, compuestos policíclicos aromáticos, que pueden presentar sustituciones en el anillo de carbono seleccionado de entre al menos un heteroátomo N ó S que tiene estas cuatro (4) propiedades. Difenilantraceno, triantreno y promazina sustituidos son ejemplos de dichos sistemas de reactivos para aplicaciones de quimioluminiscencia electrogeneradas.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar compuestos luminescentes orgánicos policíclicos sustituidos, como, por ejemplo, aromáticos policíclico, que pueden tener sustituciones en el anillo de carbono, que ofrecen un marcador complementario a Ru(bpy)_{3}^{2+} en aplicaciones bioanalíticas.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar composiciones de marcador-correactivo que permitan el análisis simultáneo.

Es otro objetivo más de la presente invención proporcionar un procedimiento de detección de varios analitos (1) proporcionando al menos una primera biomolécula con un marcador luminiscente que tiene una longitud de onda de emisión distinta de la de Ru(bpy)_{3}^{2+\bullet}; (2) proporcionando un segundo analito biomolecular con un marcador que contiene rutenio u osmio; (3) añadiendo al menos un correactivo; y (4) exponiendo los analitos biomoleculares y correactivos marcados a la reacción electroquímica o a la excitación y medir la luminiscencia resultante para detectar los distintos analitos biomoleculares presentes.

Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar una composición que implica la oxidación anódica de 9,10-difenilantraceno-2-sulfonato sódico acuoso (DPAS) en presencia de tri-n-propilamina y la reducción catódica de DPAS en presencia de peroxidisulfato (S_{2}O_{8}^{2-}) como un correactivo en una solución de acetonitrilo (MeCN)-agua (1:1 en volumen) para el análisis ECL de biomoléculas (es decir, inmunoensayos o sondas de ADN). Cuando el sodio 9,10-difenilantraceno-2-sulfonato se oxida en presencia de TPrA o se reduce con S_{2}O_{8}^{2-}, se produce una emisión de ECL azul que es característica de la fluorescencia del DPAS. La separación espectral entre esta emisión y la de Ru(bpy)_{3}^{2+} hace que el DPAS sea un marcador complementario de Ru(bpy)_{3}^{2+} en aplicaciones bioanalíticas.

Otro objetivo adicional consiste en proporcionar los ácidos 1- y 2-triantrenocarboxílico (1-THCOOH y 2-THCOOH) en presencia de tri-n- propilamina (TPrA) como correactivo en una solución acuosa para la quimioluminiscencia electrogenerada (ECL) para análisis mediante ECL de biomoléculas (es decir, inmunoensayos o sondas de ADN).

Otro objetivo adicional consiste en proporcionar una reacción de ECL para oxidar clorpromazina sin un correactivo añadido (TPrA) para producir una emisión de ECL mediante una reacción de autoaniquilación que no tiene precedentes.

Estos y otros objetivos, ventajas y características más destacados de la presente invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, ejemplos no limitativos y dibujos anexos.

Breve descripción de los dibujos

En la Figura 1 se muestra el voltamograma cíclico de la oxidación de fondo del agua en presencia de DPAS 1 x 10^{-5} M en tampón fosfato sódico pH 7,5 en un electrodo de gasa de Pt de 6 x 9 mm (malla 52). Velocidad de barrido, 100 mV/s.

En la Figura 2a y 2c se muestra la emisión (a) durante la voltametría cíclica (b) de DPAS 1 x 10^{-5} M y TPrA 0,15 M en tampón fosfato sódico pH 7,5 en un electrodo de gasa de Pt de 6 x 9 mm Pt (malla 52). Velocidad de barrido, 100 mV/s. (c) Voltamograma cíclico de TPrA 0,05 M en un tampón fosfato sódico pH 7,5 en un electrodo de Pt de 1,5 mm de diámetro. Velocidad de barrido, 200 mV/s.

En la Figura 3 se muestra el voltamograma cíclico de DPAS 0,92 mM en MeCN en un electrodo de Pt de 1,5 mm de diámetro. Electrolito de soporte, TBABF_{4} 0,1 M; velocidad de barrido, 200mV/s.

En la Figura 4 se muestra un trazado "log-log" de la intensidad de la ECL de DPAS frente a la concentración de soluciones que contienen TPrA 0,15 M en tampón fosfato sódico pH 7,5.

En la Figura 5 se muestra la fluorescencia y espectro de la ECL de una solución de DPAS 1 x 10^{-5} M y TPrA 0,15 M en tampón fosfato sódico pH 7,5. La emisión de ECL se generó por la provocación repetitiva de impulsos en un electrodo de gasa de Pt de 6 x 9 mm (malla 52) entre 0,0 V (frente al SCE, 8 s) y +1,2 V (2 s) hasta -1,4 V (2 s) y volviendo a 0,0 V. La luz se generó con el impulso positivo en esta secuencia (el impulso negativo se utilizó para limpiar el electrodo) y se integró durante 2 minutos para producir el espectro. Ambas intensidades de los máximos se miden a 430 nm.

En la Figura 6 se muestra el voltamograma cíclico de (NH_{4})_{2}S_{2}O_{8} 11 mM en una solución de MeCN-agua (relación de volumen, 1:1) en un electro de Pt de 1,5 mm de diámetro. Electrolito de soporte, TEAP 0,2 M; velocidad de barrido, 100 mV/s.

En la Figura 7 se muestra el voltamograma cíclico de DPAS 0,93 mM en MeCN en un electrodo de Pt de 1,5 mm de diámetro. Electrolito de soporte, TBABF_{4} 0,1 M; velocidad de barrido, 200 mV/s.

En la Figura 8 se muestra la emisión de la ECL para la reducción de DPAS 1,1 mM y (NH_{4})_{2}S_{2}O_{8} 25 mM en una solución de MeCN-agua (relación de volumen, 1:1) en un electrodo de Pt de 2,0 mm de diámetro. Electrolito de soporte, TEAP 0,2 M; velocidad de barrido, 100 mV/s.

En la Figura 9 se muestra la fluorescencia y espectro de la ECL de la misma solución que en la Figura 8. La emisión de la ECL se generó mediante impulsos en un electrodo de Pt de 2,0 mm de diámetro a -2,2 V (frente al SCE) e integrando la emisión durante 5 s. Ambas intensidades máximas se miden a 430 nm.

En las Figuras 10a y 10c se muestran (a) el voltamograma cíclico de 2-THCOOH 2,0 mM en tampón fosfato sódico a pH 8,5 con un electrodo de Pt de 1,5 mm de diámetro y una velocidad de barrido de 200 mV/s; (b) el voltamograma cíclico 2-THCOOH 1,4 mM en las mismas condiciones de (a) excepto que el barrido se hizo con un ciclo desde + 0,15 V en lugar de -0,35 V; y (c) el voltamograma cíclico de 2-THCOOH 2,0 mM con un electrodo de Pt de 1,5 mm de diámetro en MeCN, TBABF_{4} 0,1 M y una velocidad de barrido de 200 mV/s. Los barridos acuosos (a) y (b) se hacen con respecto al SCE. El barrido no acuoso (c) se hace con respecto a ferro-
ceno.

En las Figuras 11a y 11b se muestran (a) un voltamograma cíclico (parte inferior) y (b) la emisión simultánea de 2-THCOOH 5,2 mM y TPrA 0,15 M en tampón fosfato sódico a pH 7,5 y un electrodo de Pt de 6 mm de diámetro con una velocidad de barrido de 100 mV/s.

En las Figuras 12a y 12b se muestran (a) un voltamograma cíclico y (b) la emisión simultánea de 2-THCOOH 0,26 mM y TPrA 0,15 M en las mismas condiciones que en la Figura 11.

En la Figura 13 se muestra un voltamograma cíclico de 2-THCOOH 2,0 mM en presencia de TPrA 0,05 M. Las demás condiciones son las mismas que en la Figura 10a.

En la Figura 14 se muestra la intensidad máxima de la ECL frente al pH de 2-THCOOH 1 x 10^{-5} M y TPrA 0,15 M en tampón fosfato sódico.

En la Figura 15 se muestra un trazado "log-log" de la intensidad máxima de la ECL frente a la concentración de 2-THCOOH en tampón fosfato sódico de pH 7,5 que contiene TPrA 0,15 M.

En las Figuras 16a y 16b se muestran la fluorescencia y espectro de la ECL 1-THCOOH 9,1 nM (a) y 2-THCOOH 20 mM (b) tomados en un tampón fosfato sódico de pH 8,5 que contiene TPrA 0,15 M. Las emisiones de la ECL se generaron con impulsos alternativos en un electrodo de gasa de Pt de 6 x 9 mm (malla 52) entre +1,4 V (0,5 s) y -0,5 V(2 s) frente al SCE y una duración de 40 minutos para 1-THCOOH y 20 minutos para 2-THCOOH con una solución agitada. La intensidad de fluorescencia máxima se encuentra a 480 nm para 2-THCOOH y a 505 nm para 1-THCOOH. Las intensidades máximas de la ECL se miden a 570 nm para ambos isómeros. Las intensidades se han representado a escala con fines comparativos. En concentraciones de THCOOH (20 mM) y tiempos de adquisición iguales, la intensidad de las emisiones de 2-THCOOH son aproximadamente 6-7 veces las de 1-THCOOH.

En las Figuras 17a y 17b se muestran (a) el voltamograma cíclico de CPZ 0,98 mM en HCl 0,01 M y NaCl 0,2 M con un electrodo de HOPG de 6 mm de diámetro y una velocidad de barrido de 50 mV/s y (b) el voltamograma cíclico para el mismo sistema y condiciones que en (a) con un barrido inverso tras la primera oxidación.

En las Figuras 18a y 18b se muestran (a) el voltamograma cíclico y (b) la emisión simultánea de CPZ 1,0 mM tomados con un electrodo HOPG de 6 mm de diámetro en tampón fosfato sódico a pH 7,5 y una velocidad de barrido de 200 mV/s.

En la Figura 19 se muestra el espectro de emisión de DPAS y Ru(bpy)_{3}^{2+}.

En la Figura 20 se muestra un dispositivo para medir las dos emisiones de la ECL.

En las Figuras 21a y 21c se muestran el voltaje de excitación y las pendientes de la intensidad.

Por tanto en un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento de detección de un analito que comprende:

(a)

poner en contacto una muestra con una biomolécula unida a un compuesto marcador orgánico que es soluble en una solución acuosa, en el que dicho compuesto marcador es capaz de generar electroquimioluminiscencia;

(b)

aplicar un potencial oxidante usando un electrodo a dicho compuesto marcador en presencia de un correactivo amina en condiciones acuosas; y

(c)

medir la electroquimioluminiscencia emitida, en el que dicho procedimiento es un inmunoensayo, y dicha biomolécula es un anticuerpo o un antígeno o en el que dicho procedimiento es un procedimiento de hibridación de ADN y dicha biomolécula es una sonda de ADN.

En otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento destinado a generar electroquimioluminiscencia que consiste en aplicar un potencial oxidante usando un electrodo a un marcador orgánico soluble formado por una amina terciaria con lo que se genera electroquimioluminiscencia en condiciones subacuosas, en el que dicho marcador orgánico soluble está unido a una biomolécula seleccionada de entre el grupo formado por un anticuerpo, un antígeno y una sonda de ADN.

La invención proporciona además una composición marcadora electroquimioluminescente que comprende:

un compuesto orgánico hidrosoluble; y

una amina correactivo, en la que dicho compuesto está unido a una biomolécula seleccionada de entre un anticuerpo, un antígeno y una sonda de ADN.

La invención proporciona asimismo el uso de un compuesto marcador orgánico hidrosoluble electroquimioluminescente unido a una biomolécula seleccionada de entre un antígeno, un anticuerpo y una sonda de ADN, en combinación con un correactivo amina, en la fabricación de un marcador electroquimioluminescente para la detección de un analito.

Descripción detallada de la invención

En la presente invención, la composición de quimioluminiscencia electrogenerada requiere que: 1) el emisor sea soluble en una solución acuosa; 2) la longitud de onda de la emisión sea distinta a la de Ru(bpy)_{3}^{2+\bullet}, 3) la electroquímica oxidativa o reductora continúe dentro de un intervalo potencial relativamente estrecho impuesto por la oxidación y reducción del agua; y 4) el producto intermedio oxidado o reducido reaccione con el producto intermedio correactivo electrogenerado, permitiendo la formación del estado excitado. Al satisfacer estos criterios, se permite el uso de las nuevas composiciones independientemente de los sistemas Ru(bpy)_{3}^{2+} existentes, o junto a ellos. Los marcadores que se pueden usar con los marcadores rutenio son compuestos luminescentes orgánicos policíclicos sustituidos, como, por ejemplo, compuestos policíclicos aromáticos, que pueden tener sustituciones en el anillo de carbono de al menos un heteroátomo, N y/o S, sus isómeros y sus sales. Los policíclicos preferidos son, entre otros, difenilantraceno, triantreno y promazina sustituidos y se usan en aplicaciones de quimioluminiscencia electrogeneradas.

Un marcador preferido según la presente invención es DPAS, que es un aceptor de energía en el estado excitado

1

procedente de cetonas simples en un medio acuoso que presenta una eficiencia fluorescente alta y una emisión de longitud de onda corta (emisión máxima, \phiF = 0,87 a 428 mm) comparado con Ru(bpy)_{3}^{2+} (\phiF = aproximadamente a 0,05, emisión máxima a 0,05 a 620 nm). Por lo tanto, el DPAS satisface los criterios anteriores y produce una emisión azul de la ECL resultante de una reacción de oxidación-reducción que incluye DPAS como el emisor y TPrA como el correactivo en el medio acuoso. Además, la ECL de DPAS en una reacción de reducción-oxidación usando peroxidisulfato (S_{2}O_{8}^{2-}) como un correactivo en una solución de MeCN-agua (relación de volumen, 1:1) también satisface los criterios mencionados.

Otra realización preferida implica dos derivados del ácido carboxílico de triantreno (TH), a saber, los ácidos 1- y 2-triantrenocarboxílicos (1-THCOOH y 2-THCOOH) y sus isómeros.

2

Es conocido que el triantreno produce ECL (intensidad máxima a 434 nm) en una reacción de aniquilación iónica no acuosa según las ecuaciones (1)-(4) anteriores. La derivación de TH a sus derivados del ácido carboxílico

3

4

consiguió la solubilidad necesaria en una solución acuosa y estos derivados produjeron las emisiones de la ECL en una reacción de oxidación-reducción con TPrA como correactivo. No obstante, a diferencia del triantreno, que tiene una emisión de ECL azul, el espectro de ECL de estos compuestos está desviado significativamente al rojo, con respecto a su espectro de fluorescencia.

Otra realización preferida según la presente invención implica la ECL acuosa con clorpromazina (CPZ), que está relacionada estructuralmente con TH. Aunque se ha estudiado la fluorescencia, quimioluminiscencia y electroquímica de CPZ, no así su uso en aplicaciones de ECL. McCreery estudió la oxidación de CPZ y varias reacciones del radical catión que se describen en (Cheng, H. Y; Sackett, PH.; McCreery, R.L. J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 962), y más recientemente amplió el trabajo para tener en cuenta la reacción del catión clorpromazina con dopamina que se describe en (Deputy, A.; Wu, H.P; McCreery, R.L. J. Phys. Chem. 1990, 94, 3620) y (Deputy, A.L.; McCreery, R.L. J. Electroanal. Chem. 1989, 285, 1), metoxipromazina (Deputy, A.L.; McCreery, R.L. J. Electroanal. Chem. 1989, 285, 1) e hidroquinona (Deputy, A.L,; McCreery, R.L. J. Electroanal. Che. 1989, 285, 1). Además, se ha investigado la fluorescencia descrita en (Mellinger, T.J; Keeler, C.E. Anal Chem. 1964, 36; 1840; Mellinger, T.J; Keeler, C.E. Anal. Chem. 1963, 35, 554; Ragland, JB.; Kinross-Wright, V.J. Anal. Chem. 1964, 36, 1356; y Udenfriend, S.; Duggan, D.E.; Vasta, B.M.; Brodie, B.B. J. Pharmacol. Expt Thera. 1957 120, 26)

5

incluidos las aplicaciones analíticas (Takahashi, D.M. J. Pharm. Sci. 1980, 69, 184.) y (Clark, B.J.; Fell, A.F.; Milne, K. T.; Pattie, D.M.G.; Williams, M.H. Anal. Chim. Acta. 1985, 170,35.) y la quimioluminiscencia que se describe en (Nakano, M.; Sugioka, K.; Hakano, H.; Takyu, C.; Inaba, H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985, 130, 952) y (Trush, M. A.; Reasor, M.J.; Wilson, M.E.; Van Dyke, K. Chem.-Biol. Interact. 1979, 28, 71.) de clorpromazina. Además de la luz emisora en una reacción de oxidación-reducción con TPrA, CPZ también emite cuando se oxida en ausencia de un correactivo añadido. Presumiblemente, la amina terciaria de la cadena lateral de CPZ actúa como un correactivo interno, y se cree que proporciona el primer ejemplo de reacción de ECL de autoaniquilación.

Reactivos

Se transfirió MeCN sin abrir a una caja con guantes en atmósfera de vacío bajo atmósfera de helio, que se usó como receptor. Para los experimentos efectuados con MeCN, se cargó una celda sellada en la caja de guantes antes de cada experimento. El tetrafluoroborato de tetrabutilamonio (TBABF_{4}, calidad electrométrica) se purificó mediante recristalización a partir de acetato de etilo:pentano (2 veces; relación de volumen, 1:1) o de acetato de etilo:dietiléter (3 veces; relación de volumen, 9:1) seguido por el secado al vacío a 100ºC. Como receptores se usaron perclorato tetraetilamonio, (TEAP, calidad electrométrica con un 8% de agua, tri-n-propilamina (TPrA, 98%), triantreno (97%), clorhidrato de clorpromazina (98%), fosfato sódico monobásico monohidrato (NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O, 99%), fosfato sódico dibásico heptahidrato (Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O, 99%) y peroxidisulfato amónico [(NH_{4})_{2}S_{2}O_{8}, 99%].

Tampón

Las soluciones de tampón fosfato sódico 0,15 M preparadas con agua Milli-Q (Millipore Corp., Bedfore, WA) fueron 0,10 M en Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O y 0,05 M en NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O. Las soluciones tampón que contenían TPrA se prepararon de forma similar, excepto que se usó NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O 0,15 M para compensar la alcalinidad de la TPrA. El pH de estas soluciones tampón se ajustó con ácido fosfórico (H_{3}PO_{4}) concentrado o con NaOH 4 M.

Instrumental

La voltametría cíclica sin detección de fotones se obtuvo usando un equipo BAS 100A Electrochemical Analyzer (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) o un equipo potentiostat/programador universal Applied Research (PAR) modelo 173/175 (Princeton, NJ) y una registradora Omnigraphic 20000 X-Y (Bausch and Lomb-Houston Instrument, Division, Austin, TX). Los voltamogramas cíclicos con detección simultánea de fotones se registraron usando el equipo PAR 173/175 junto a un contador de fotones Hamamatsu C1230 (Bridgewater, NJ) equipado con un tubo fotomultiplicador Hamamatsu R928-P. El tubo fotomultiplicador se alojó en una cámara refrigerada con camisa de agua de Products For Research, Inc., modelo TE308TSRF mantenida a -10ºC. El enfriamiento primario de la camisa de agua hasta 10ºC se consiguió usando una unidad de refrigeración MGW Lauda model RMS6 (vendida por Brinkmann Instruments Co., Westbury, NY). Para los trazados de intensidad de la ECL frente al potencial se introdujo el resultado del recuento de fotones en el eje Y de la registradora X-Y durante los barridos del potencial.

Los datos de la intensidad de la ECL frente a la concentración y de la intensidad de la ECL frente al pH se adquirieron usando un analizador prototipo para ECL de Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT; modelo QPCR System 5000; similar al equipo descrito en Leland, J.K.; Powell, M.J. J. Electrochem. Soc. 1990, 137, 3127). Este instrumento se conecta con un ordenador personal Digital DEC 316SX.

Los espectros de fluorescencia y ECL se registraron usando un dispositivo consistente en una cámara de carga (CCD) acoplada al espectrómetro (hendidura de entrada, 1 mm) conectado a un ordenador personal Dell System 200 (Austin, TX), como se ha descrito previamente. Se siguieron los mismos procedimientos (calibración espectral, etc.) excepto que se usaron secuencias de impulso diferentes y que el detector CCD se mantuvo a -110ºC para los experimentos con TPrA/THCOOH y TPrA/DPAS y a -100ºC para los experimentos con S2O82-/DPAS. La excitación del espectro de fluorescencia se consiguió manteniendo una lámpara UV con una longitud de onda (366 nm) (UVP, Inc., San Gabriel, CA; modelo UVGL-25; vendida por Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) cerca de la celda y con ángulos hacia la derecha con respecto a la hendidura de la entrada del espectrómetro.

Celdas y electrodos

Excepto cuando se mencione lo contrario, en todos los experimentos electroquímicos y de ECL se utilizó una configuración convencional de la celda con 3 electrodos. Los electrodos funcionales con disco de Pt se pulieron con una almohadilla de fieltro (Buehler, Ltd., Lake Bluff, IL) antes de cada experimento efectuado, con 0,05 \mum de alumina (Buehler; Ltd.) suspendida en agua.

La celda del equipo Perkin-Elmer se modificó de manera que: 1) la celda de flujo en capa fina utiliza un electrodo funcional (Au) y dos electrodos contadores cuadrados (5 x 5 mm) (ambos de Au); 2) los dos electrodos contadores se colocan por encima y a los lados del electrodo funcional, en línea directa con el tubo fotomultiplicador; y 3) el electrodo de referencia de Ag/AgCl se sitúa en un compartimento al lado de la celda, en lugar de incorporarse en el trayecto del flujo distalmente a ella. Los electrodos de este equipo se limpian electroquímicamente antes de cada análisis, usando una solución de limpieza comercializada (IGEN Inc., Rockville, MD) en combinación con una secuencia programada de impulsos potenciales.

En el caso de los análisis de voltametría cíclica, sin detección de fotones, en la realización de CPZ se utilizó un electrodo funcional grafito pirolítico de orientación alta (HOPG; Union Carbide, Cleveland, OH) (disco de 6 mm de diámetro con material recién expuesto en cada experimento), un electrodo contador de alambre de Pt y un electrodo de cuasi-referencia de Ag (AgQRE) en una configuración descrita recientemente. Ver Xu, X.; Bard, A.J. Langmuir, 1994, 10, 2409. En los análisis similares de todos los demás compuestos utilizados se usó un electrodo de trabajo con un disco de Pt de 1,5 mm sellado en vidrio, en combinación con un electrodo contador de alambre de Pt y un AgQRE.

Para obtener el espectro de la ECL y los barridos de emisión frente al potencial de DPAS/TPrA frente a los barridos de potencial se utilizó un electrodo funcional marcador de gasa de Pt de 6 x 9 mm (gasa de malla 52; Aldrich), un AgQRE y un electrodo contador redondo (de 9 mm de diámetro, de un grosor de 0,5 mm) de lámina de Au. Para obtener el espectro de la ECL de 2-THCOOH también se utilizó esta distribución. El electrodo funcional de gasa se limpió antes de cada experimento por inmersión en ácido nítrico concentrado, aclarándose después en agua destilada y calentando en un mechero de llama bunsen.

Para obtener el espectro de la ECL y el barrido de emisión frente al potencial de DPAS/S_{2}O_{8}^{2-} se utilizó un electro funcional de un disco de Pt de 2,0 mm de diámetro sellado en vidrio en combinación con un electrodo contador de alambre de Pt y un AgQRE.

Para el barrido de emisión de la ECL frente al potencial de CPZ se utilizaron los mismos electrodos y configuración descritos anteriormente para CPZ sin detección de fotones. Para obtener la emisión frente al potencial de la ECL para 2-THCOOH se utilizó la misma disposición, excepto que el electrodo funcional era un disco de Pt de 6 mm de diámetro.

El potencial no acuoso en referencia a ferroceno se consiguió añadiendo el estándar directamente a las soluciones. La obtención del potencial en referencia a las soluciones acuosas del electrodo de calomelano saturado (SCE) se consiguió adquiriendo los datos frente a un AgQRE para el cual se conocía el potencial frente al SCE. Para la comparación cualitativa, el Eº frente al SCE de ferroceno varía (debido, principalmente, a las diferencias en los potenciales de unión de líquidos) entre + 0,307 y +0,56 V dependiendo del sistema de soporte de disolvente/electrolito.

Ejemplo 1

El DPAS se sintetizó según variaciones en el procedimiento de Catalani y cols. descrito en Catalani, L.H.; Wilson, T: Bechara, E.J. H. Photochem. Photobiol, 1987, 45,273. En consecuencia, se suspendió 1 g de 9,10-difenilantraceno (DPA, 98%) en 7 ml de nitrobenceno (99%) y la suspensión amarilla resultante se enfrió hasta 10ºC en un baño de hielo bajo un flujo constante de nitrógeno. Mediante la aplicación de una agitación enérgica se añadieron gota a gota 0,25 ml de ácido sulfúrico fumante (27%-33% de SO_{3} libre) para producir una suspensión de color verde oscuro, que se agitó inicialmente a 50ºC durante 4 horas seguido por una agitación durante toda la noche a temperatura ambiente. La solución de color verde oscuro se neutralizó a continuación con NaOH 10 M en un baño de hielo para producir un residuo oleoso de color amarillo claro. Cuando se humedeció un papel de pH con esta solución primero cambió a un color naranja-rojo en lugar del color inicial de color rojo oscuro, se añadieron 50 ml de agua a la mezcla antes de la adición final de NaOH para llevar el pH a 7,0. A continuación, se añadió más agua para llevar el volumen total aproximadamente hasta 250 ml y se extrajo el nitrobenceno por destilación con vapor (que se afecta por la ebullición de la suspensión). La mayoría del nitrobenceno se extrajo con los primeros 75 ml del destilado y la destilación continuó hasta que el volumen de la suspensión fue de aproximadamente 50 ml. La suspensión amarilla se transfirió a continuación a un vaso y se llevó a ebullición sobre una placa caliente con agitación para reducir el volumen total hasta aproximadamente 10 ml. El lodo amarillo se filtró sobre un embudo de buchner (con un filtro de papel) y el sólido resultante se dejó secar al aire para producir 0,94 g del producto amarillo crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía de intercambio iónico en columna usando una resina de intercambio iónico Dowex 1 x 2-100 (mezcla seca 50-100; 3 x 1 cm) y elución con un gradiente de HCl 0-0,5 M (mezclado a partir de HCl al 36,5%; en metanol anhidro (calidad espectrofotométrica). Por tanto, se disolvió aproximadamente 0,35 g de producto amarillo crudo en 10 ml de metanol con agitación y sonicación. El DPA que no había reaccionado en el producto en crudo sólo es ligeramente soluble en metanol y se separó por centrifugación. El sobrenadante se aplicó a la columna y el producto se eluyó con aproximadamente 5 ml de metanol seguidos por aproximadamente 5 ml de HCl 0,25 M en metanol, seguido por HCl 0,5 M en metanol. Se recogieron 9 fracciones de 20 ml y se añadieron 60 ml de agua a cada una de ellas. Las fracciones 1 a 5 se mostraron turbias o con formación de precipitado y se enfriaron en la nevera toda la noche. El producto sólido se separó después por centrifugación y filtración sobre una frita de cristal sinterizado. Cuando el flujo del líquido a través de la frita se interrumpió debido a la obstrucción, el lodo gelatinoso verdoso se transfirió a una placa de petri de vidrio, se cubrió con papel de filtro y se dejó secar al aire durante varios días en condiciones ambiente. Cuando estuvo seco se arañaron 110 mg de DPAS.5H_{2}O de color verde claro o amarillo de la placa de petri con una cuchilla y se identificó el producto mediante ^{1}H NMR y espectrometría de masa.

Se prepararon soluciones acuosas de DPAS.5H_{2}O disolviendo la cantidad requerida de sólido en unas gotas de metanol antes de transferirlo a la solución acuosa. La solubilidad máxima de DPAS acuoso en tampón fosfato sódico 0,15 M (pH 7,5) es aproximadamente de 1 x 10^{-5} M. Con esta concentración tan baja no se puede observar corriente anódica para DPAS por encima de la oxidación de agua de fondo, como se ve en la Figura 1. No obstante, si se oxida 1 x 10^{-5} M de DPAS en presencia de M TPrA 0,15 M se produce una emisión que coincide con una onda de oxidación que se superpone a la oxidación de TPrA y a la oxidación de fondo de agua, como se muestra en las Figuras 2a-2b. Como comparación, en la Figura 2c se muestra la oxidación de TPrA 0,05 M en ausencia de DPAS. El hecho de que se observe una corriente de oxidación con 1 x 10^{-5} M DPAS sólo en presencia de TPrA implica una potenciación de la corriente catalítica debido a la regeneración de DPAS mediante la reducción de DPAS^{+} mediante TPrA o un producto intermedio. Para esta catálisis, la secuencia cíclica de las reacciones es análoga a la que se muestra con las reacciones (5), (6a), (7), (8) o (10) y (11), y (9) anterior, es donde Ru(bpy)_{3}^{3+/2+/+} se remplaza, respectivamente por DPAS^{+/0/-}, XY^{z} es TPrA, XX es Pr_{2}NCH\cdotEt e Y^{Y} es H^{+}. A pesar de la concentración baja de DPAS, 1 x 10^{-5} M, esta emisión es visiblemente azul cuando se contempla en una sala oscura y no se observa emisión en ausencia de TPrA o de DPAS.

Con respecto a la intensidad de la ECL en función del pH, en ocasiones se registraron emisiones más intensas con pH más bajos pero no se encontraron condiciones en las que esas diferencias quedaran fuera de la dispersión experimental. En cuanto al sistema DPAS/TPrA se produce la pasivación del electrodo después de un barrido y se impide así observar las emisiones posteriores si no se limpia el electrodo. Este comportamiento indica que los productos que participan en las reacciones químicas después de la oxidación de DPAS pasivizan el electrodo. El electrodo se puede limpiar mediante procedimientos mecánicos o empujándolo hacia la reducción de fondo del agua (-1,4 V frente al SCE) durante unos segundos, después de lo cual se puede observar de nuevo la ECL durante la oxidación.

La oxidación de DPAS se complica por las siguientes reacciones químicas, como se demuestra por la ausencia de reversibilidad química que se ve en la Figura 3. Este comportamiento, que persiste con velocidades de barrido tan altas como 10 V/s, se debe, probablemente, al ataque del DPAS^{+} por agua o por OH^{-} para formar los productos. Aunque se tomaron precauciones especiales para excluir las trazas de agua de estas soluciones, es probable que las cinco moléculas de agua de hidratación que se asocian a DPAS proporcionan una fuente suficiente para el ataque nucleofílico sobre el DPAS^{+}. La adición de alúmina neutra a estas soluciones en un intento de eliminar el agua no dio lugar a cambios profundos de la electroquímica. Los intentos de aumentar la intensidad de la emisión de la ECL mediante la estabilización del DPAS^{+} usando surfactante o mediante la polisulfonación del DPA no tuvieron éxito.

En la Figura 4 se muestra una curva de calibración de la intensidad de la ECL frente a la concentración en todo el intervalo de sensibilidad del analizador de Perkin-Elmer para DPAS con una concentración tan baja como 3,2 x 10^{-8} M. En condiciones optimizadas, se puede detectar el Ru(bpy)_{3}^{2+} en concentraciones aproximadamente 60 veces más diluidas en intensidades de emisión similares. Con concentraciones mayores de 5 x 10^{-6} M usando la cámara CCD (y corrigiendo según la sensibilidad del detector) la emisión del Ru(bpy)_{3}^{2+} es aproximadamente 100 veces más intensa que la emisión del DPAS. Como se espera que la emisión de la ECL para DPAS sea más intensa que para Ru(bpy)_{3}^{2+}
basada en las eficiencias de fluorescencia (FF = 0,87 para DPAS y aproximadamente 0,05 para Ru(bpy)_{3}^{2+\bullet}) la intensidad más baja de la ECL para DPAS indica la presencia de reacciones químicas competitivas (como el ataque nucleofílico) que consume DPAS^{+}.

En la Figura 5 se muestra la ECL y el espectro de fluorescencia de DPAS 1 x 10^{-5} M. La similitud entre la fluorescencia y el espectro de la ECL indica que la emisión de la ECL procede del DPAS^{+}. La ligera discrepancia entre los espectros en longitudes de onda largas puede deberse a la emisión de otros productos formados por reacciones químicas competitivas durante la ECL.

Ejemplo 2

Previamente, se ha valorado la electroquímica y la ECL del sistema Ru(bpy)_{3}^{2+}/S_{2}O_{8}^{2-} en MECN-agua y el CV reductor de S_{2}O_{8}^{2-} se muestra en la Figura 6. En este caso, la irreversibilidad de la reacción se debe al proceso representado en la ecuación (13) anterior. En estas condiciones, el inicio de la reducción de fondo del agua (no se muestra) que produce H_{2} gaseoso ocurre aproximadamente a -1,0 V.

En la presente invención, la reducción catódica DPAS se produce en presencia de S_{2}O_{8}^{2-} como correactivo y produce la ECL. La reducción de DPAS en MeCN se muestra en la Figura 7 y la reversibilidad de esta pareja (DPAS^{0/-}) comparada con la oxidación de DPAS que se muestra en la Figura 3 indica que DPAS^{-} es significativamente más estable en MeCN que en DPAS^{+}. La pequeña preonda de la Figura 7 parece deberse al DPAS absorbido porque la corriente de esta onda aumenta linealmente con la velocidad de barrido (v) mientras que para una pareja más negativa aumenta con v^{y2} en un intervalo de 0,1 a 1,0 V/s. Como esta reducción se produce en el seno de la reducción de fondo del agua, no hay una corriente catódica evidente por encima del fondo en las soluciones de MeCN-agua (1:1 en volumen). No obstante, si el potencial se escanea dentro de la reducción de fondo del agua en presencia de S_{2}O_{8}^{2-} se observa una emisión de color azul brillante con un potencial que se corresponde a la reducción del DPAS (después de hacer la conversión aproximada por el ferroceno a los potenciales del SCE) como se muestra en la Figura 8. No se observa emisión en ausencia de S_{2}O_{8}^{2-} o de DPAS, resultado que es compatible con los datos previos con el sistema Ru(bpy)_{3}^{2+}/ S_{2}O_{8}^{2-}, en el cual no se observa ninguna emisión hasta que el potencial se escanea en una zona suficientemente negativa como para reducir Ru(bpy)_{3}^{2+} y permite la generación del estado excitado mediante la secuencia de reacciones que se muestra en las ecuaciones (12)-(15) anteriores. Este esquema se puede modificar para describir la reacción de la ECL del DPAS al sustituir DPAS^{+/0/-} respectivamente para Ru(bpy)_{3}^{3+/2+/+}.

Como se muestra en la Figura 9, el espectro azul de la ECL para la emisión del DPAS coincide con el espectro de fluorescencia y también coincide con la ECL y el espectro de fluorescencia para la oxidación-reducción de DPAS con TPrA que se muestran en la Figura 5. La menor contribución de la emisión de los productos colaterales de la Figura 9 confirma la mejor estabilidad del DPAS^{-}, incluso durante la reducción del fondo. Al considerar el balance energético de un sistema ECL se observan los potenciales estándar de las semirreacciones relevantes (dando una energía libre de la reacción de transferencia de electrones) y la energía del estado emisor. Para la oxidación de DPAS y TPrA son estas:

DPAS^{+\bullet} + e^{-} \rightarrow DPAS

\hskip0,5cm

Eº \sim +1,3 V frente al SCE

Pr_{2}NC^{+}HEt + ^{e-} \rightarrow Pr_{2}NC^{\bullet} HEt

\hskip0,5cm

Eº \sim -1,1 V frente al SCE^{30}

DPAS^{\bullet} (singlete) \rightarrow DPAS + hu

\hskip0,5cm

E_{S} = 2,9 eV

La entalpía de la reacción de transferencia de electrones entre DPAS^{-} y Pr_{2}NC\cdotHEt, corregida según una entropía aproximadamente de 0,1 eV, es -2,3 eV, muy por debajo de la que se necesita para producir el singlete DPAS^{-}, por lo que se clasificaría como una reacción "deficiente en energía". Como con otras reacciones de este tipo, los singletes excitados se forman, probablemente, mediante una aniquilación triplete-triplete (una vía T). Aunque el sistema oxidativo DPAS/oxalato sería "suficiente en energía" no se observó ninguna emisión en los análisis que usaron oxalato como correactivo.

El balance energético de la vía reductora corresponde a las semirreacciones:

DPAS + e^{-} \leftarrow \rightarrow DPAS^{-}

\hskip0,5cm

Eº \sim 1,9 V frente al SCE

SO_{4}^{-} + e^{-} \leftarrow \rightarrow SO_{4}^{2-}

\hskip0,5cm

Eº \sim +3,2 V frente al SCE

En este caso, la reacción de transferencia de electrones entre DPAS^{-} y SO_{4}^{-} es suficiente para producir un singlete DPAS^{\bullet} directamente (una vía S). La intensidad de la emisión de DPAS 1 x 10^{-5} M es aproximadamente la misma que para la oxidación de DPAS/TPrA y para la reducción de DPAS/S_{2}O_{8}^{2-}.

Ejemplos 3 y 4

Se sintetizaron 1-THCOOH y 2-THCOOH siguiendo los procedimientos de Gilman y Swayampati descritos en Gilman, H.; Swayampati, D.R. J. Am. Chem. Soc. 1957, 79, 208. Con la excepción de que se sustituyó n-butillitio 1,6 M en hexano por sus soluciones de n-butillitio en éter.

La oxidación de 2-THCOOH en una solución acuosa se produce cerca de + 1,0 V como se muestra en la Figura 10a. El proceso anódico ancho entre 0,0 V y +0,5 V y también el proceso catódico más prominente a -0,2 V son características de la formación de óxido y la reducción de un electrodo de Pt en una solución acuosa de este pH y aparece en los barridos en ausencia de 2-THCOOH. Estos procesos se pueden eliminar si se establecen ciclos de potencial que no lleguen más allá en el polo negativo de -0,15 V como se muestra en la Figura 10b. La irreversibilidad química que se muestra en las Figuras 10a y 10b (y que se observa en los barridos similares hasta 50 V/s) indica la inestabilidad de 2-THCOOH oxidado en una solución acuosa y su conversión rápida a algún producto. Por el contrario, procesos similares en MeCN seco (Figura 10c) demuestran que el producto oxidado es estable. Así se demuestra que la descomposición del ácido oxidado se debe a la reacción con agua frente a otras posibilidades, como la descarboxilación con pérdida de CO_{2}.

La oxidación de triantreno (TH) a McCN produce un radical catiónico estable que se describe en Kexzthelyi, C.P.; Tachikawa, H.; Bard, A.J. J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 1522, por lo que es probable que la oxidación de THCOOH se efectúe de una forma similar:

6

Es conocido que los nucleófilos como H_{2}O y OH^{-} atacan el TH^{+} del azufre, lo que es muy probable en una solución acuosa, produciendo, por ejemplo, el sulfóxido:

7

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

Tanto 1-THCOOH como 2-THCOOH producen emisiones de ECL cuando se oxidan en una solución acuosa de tampón fosfato sódico en presencia de TPrA como correactivo, como se ve en las Figuras 11 y 12 para 2-THCOOH. (La conducta de 1-THCOOH es similar excepto que la intensidad de la emisión máxima es 6-7 veces menor que la de 2-THCOOH). En ausencia de TPrA o de ácido no se observa emisión. Aunque la corriente anódica está dominada por la oxidación del ácido desprotonado, la electroquímica se complica por la coincidencia de este proceso tanto con el inicio de una onda ancha de oxidación irreversible de TPrA (Figura 2c) como por la oxidación de fondo del agua (Figura 1). Los dos picos de emisión distintos en función del potencial de la Figura 11 indican las contribuciones de los dos procesos en los electrodos diferentes. Se cree que el primer pico se debe a las reacciones asociadas con la oxidación homogénea de TPrA según la ecuación (6a) anterior (remplazando 2-TH^{+}COO^{-} por Ru(bpy)_{3}^{3+}) y el segundo pico es consecuencia de la oxidación heterogénea directa de TPrA en el electrodo según la ecuación (6). Esta hipótesis se confirma con los resultados de la Figura 12 registrada con la concentración más baja de 2-THCOOH, donde la reacción de segundo orden de (6a) será más lenta y menos importante. Según las condiciones de la Figura 12, la emisión del proceso homogéneo aparece en una pequeña joroba en la emisión dominante emitida por la oxidación heterogénea de TPrA. El desplazamiento negativo del segundo pico de emisión puede racionalizarse según la mayor concentración de TPrA en el electrodo con potenciales más negativos debido a la inactividad de la reacción de oxidación que depleciona la TPrA (6a).

Cuando el 2-THCOOH se oxida en presencia de TPrA, la corriente anódica casi es el doble frente a la que crea la misma concentración de 2-THCOOH en ausencia de TPrA, (comparar las Figuras 10a y 13). Este resultado es compatible con la regeneración catalítica de THCOOH (o algún producto) a través de su reducción homogénea mediante TPrA o un producto intermedio (según la analogía con (6a) o (8)-(9) para este sistema) y confirma la hipótesis de que el primer pico de emisión de la Figura 11 se debe a la generación de precursores del correactivo mediante la oxidación homogénea de TPrA.

En la Figura 14 la intensidad de la emisión del pico de 2-THCOOH 1 x 10^{-5} M aumenta con el pH. La diferencia entre la tendencia que aquí se observa y la del sistema Ru(bpy)_{3}^{2+}/TPrA, que muestra un pico cerca del pH 7,5, indica que el H^{+} participa no sólo en las reacciones de descomposición de TPrA sino también en las reacciones asociadas a la emisión de un producto de 2-THCOOH. La intensidad de la emisión del pico de 2-THCOOH varía linealmente con la concentración en 4 órdenes de magnitud a pH 7,5, como se demuestra en la Figura 15.

La fluorescencia y espectro de HCL de 1-THCOOH y 2-THCOOH se muestran en la Figura 16. La fluorescencia máxima de 1-THCOOH y 2-THCOOH es de 505 nm y 480 nm, respectivamente. Como comparación, la emisión máxima de la fluorescencia de triantreno en MeCN se produce a 434 nm. La ECL máxima de cada ácido se produce a 570 nm mostrando un desplazamiento importante hacia una longitud de onda más potente frente al espectro de fluorescencia respectivo. En estas condiciones optimizadas, la emisión de 2-THCOOH es apenas visible con el ojo adaptado a la oscuridad.

Las diferencias entre la fluorescencia y el espectro de la ECL de los ácidos THCOOH indican que al menos parte de la emisión de la ECL procede de algunas especies distintas de un estado oxidado de ácido intacto. Una posibilidad es que el ácido se descarboxila con la oxidación, pero esto es improbable por varias razones: 1) si se produjo la descarboxilación, se esperaría que el espectro de emisión fuese característico de TH o de THCOOH, y no lo es, 2) si se produjera TH mediante la descarboxilación, precipitaría en el electrodo debido a su baja solubilidad en soluciones acuosas y no se observan signos de que estos suceda, 3) en condiciones no acuosas (MeCN seco), el ácido oxidado es estable en una escala de tiempo voltamétrica, como se demuestra por la onda de retorno que se muestra en la Figura 10c. Si se tienen en cuenta los estudios electroquímicos que demuestran el ataque nucleofílico por agua en la posición del azufre por el radical catiónico TH, se deduce que pueden producirse reacciones similares con los ácidos THCOOH. También existe un paralelismo entre los resultados de la ECL de THCOOH y los observados con antraceno. En el caso de este último, se observa una emisión de la ECL similar desplazada al rojo tras la generación del radical catión, que se atribuye a la emisión del antranol (la forma enol de la antrona cetona) formada por la reacción del radical catiónico antraceno con trazas de agua que queden en el disolvente McCN. Presumiblemente, la emisión observada desde 1- y 2-THCOOH se produce a partir de productos intermedios similares formados por la reacción del ácido oxidado con agua. El espectro de la ECL de ambos ácidos tiene el mismo pico de longitud de onda, mientras que los picos son distintos para el espectro de fluorescencia. La energía del producto intermedio emisor se ve más afectada por el nucleófilo añadido que por la posición del ácido carboxílico funcional.

Ejemplo 5

Unos voltamogramas cíclicos de la oxidación de clorpromazina (Figura 17) demuestran que la oxidación se produce como dos procesos discretos. El primero de ellos es casi reversible y el segundo es irreversible. El pico anormalmente ancho de la primera onda anódica que se muestra en las Figuras 17a y 17b se ha atribuido a la absorción de CPZ. Asimismo, la joroba de la onda de retorno catódica de la Figura 17b es un proceso de adsorción. Cuando el barrido se invierte tras la primera oxidación, como se ve en la Figura 17b, el aumento de reversibilidad (comparado con la Figura 17a) indica que un producto de la segunda oxidación reacciona con la forma oxidada de CPZ.

La oxidación de CPZ a un pH más alto en una solución de tampón fosfato sódico altera la electroquímica, como se muestra en la Figura 18a. La primera oxidación es ahora irreversible y la electroquímica es, en general, más compleja que la de la Figura 17, como se demuestra por una joroba que aparece en la primera onda de oxidación, el aumento de corriente y el ensanchamiento de la segunda onda. Como sucede con la oxidación de TPrA, el análisis del segundo proceso de oxidación se complica por su coincidencia con la oxidación de fondo de agua. No obstante, (en ausencia de un correactivo añadido) como se observa en la Figura 18, se obtiene inesperadamente una emisión de ECL. Las verificaciones del espectro de la ECL para este proceso para comparar con el espectro de fotoluminescencia estaban dificultadas por intensidades de emisión bajas y la contaminación del electrodo. Además, no se tuvo éxito cuando se intentó determinar la longitud de onda de emisión del pico usando filtros de interferencia para los intervalos estrechos de longitud de onda específica entre 450 y 600 nm. No se observó emisión en las condiciones de la Figura 17 (con o sin adición de TPrA 50 mM), en la cual la electroquímica es menos compleja y no se produce la contaminación del electrodo.

El trabajo mecánico anterior de McCreery ha demostrado que las formas monooxidadas de CPZ se convierten en sulfóxidos en una solución acuosa mediante el ataque nucleofílico del agua en la posición del azufre. Por tanto, la primera oxidación de CPZ se asocia al sistema de anillo tricíclico y la segunda oxidación involucra a la amina terciaria de la cadena lateral (de forma análoga a la oxidación de THCOOH y TPrA). Presumiblemente, la amina sufre entonces una reacción similar a la que se observa con TPrA en la ecuación (6) y (7) anterior, para producir un fuerte agente reductor que reacciona con el sistema de anillo para generar un estado excitado luminiscente. Este proceso de "autoaniquilación" probablemente se desarrolla como se muestra en las ecuaciones (5)-(8), donde la porción tricíclica de CPZ remplaza a Ru(bpy)_{3}^{2+} y se une covalentemente al correactivo X (la amina terciaria de la cadena lateral). La autoaniquilación podría producirse mediante un proceso intramolecular o intermolecular. La emisión de CPZ procede de un producto formado por la reacción de CPZ oxidada con agua. En el caso de CPZ 0,11 mM en tampón fosfato sódico de pH 7,5, se registró una intensidad de emisión del pico de 80 c/s por encima del ruido de fondo. En caso de CPZ 1,1 mM, la intensidad del pico fue de 850 c/s.

Ejemplo 6

Para eliminar las variancias de las mediciones de la detección de la ECL de una muestra se usa la técnica estándar interna. En el procedimiento estándar interno se añade a la muestra una cantidad fija de un patrón. Durante la excitación se miden simultáneamente la intensidad de la ECL de la muestra y la de referencia. La relación entre las intensidades de la ECL no se afectará por las variaciones normales en la técnica de medición. El estándar interno resulta útil para corregir los efectos de la matriz, las fluctuaciones de la temperatura, las variancias del voltaje de excitación, etc. El estándar interno sólo es válido si la matriz afecta por igual a la señal de referencia y a la de la muestra. El uso de este procedimiento de evaluación se limita a los diseños del instrumento y al procedimiento de ECL capaz de determinar dos emisiones del luminóforo. La selección de un luminóforo apropiado de referencia es fundamental para el rendimiento de la técnica. La elección del luminóforo de referencia depende de las posiciones relativas del espectro de emisión de la muestra y la de referencia. En el ejemplo que se presenta, el DPAS es un candidato ideal para el luminóforo de referencia porque su emisión está bien separada de la del luminóforo de la muestra Ru(bpy)_{3}^{2+-}. En la Figura 19 se muestra el espectro de emisión. La emisión de DPAS centrada en la longitud de onda de 430 nM se separa bien de la emisión de Ru(bpy)_{3}^{2+} centrada en la longitud de onda de 620 nM.

Las dos emisiones de la ECL se pueden resolver mediante la longitud de onda con el uso de filtros ópticos. La distribución óptica es la que se muestra en la Figura 20. Se construye una rueda con dos filtros ópticos colocados entre la célula electroquímica y el PMT. La rueda presenta un filtro de paso largo para la observación de la emisión de Ru(bpy)_{3}^{2+} y un filtro de paso corto para la observación de la emisión del DPAS. La rotación de la rueda óptica se sincroniza con el voltaje de la excitación, durante la cual se observan dos emisiones de ECL. La rampa del voltaje de excitación se divide en dos periodos, ver las Figuras 21a y 21c. Durante el primer periodo, la rueda óptica se coloca con el filtro de paso largo por encima del electrodo. Se mide la emisión de la muestra y se filtra la emisión de la muestra de referencia. Durante el segundo periodo, la rueda óptica se coloca con el filtro de paso corto por encima del electrodo. Se mide la emisión de la muestra de referencia, se filtra la muestra y después se obtiene su señal integrando el área de la emisión de la ECL bajo el primer periodo. La muestra de referencia se obtiene a partir del área del segundo periodo. La estandarización interna se realiza obteniendo el cociente entre la señal de la muestra y la señal de referencia. Cualquier variancia no relacionada con los cambios de concentración se observa tanto en la muestra como en la de referencia. La señal del cociente se usa entonces para medir la concentración de la muestra.

Ejemplo 7

La metodología de detección de la ECL es adecuada para la cuantificación de los procedimientos de hibridación de ADN. La intensidad de la ECL es proporcional a la concentración del analito de interés de ADN en particular. Las variancias de la amplificación del ADN antes de la detección de la ECL también se pueden eliminar usando un estándar interno.

Claims (20)

1. Procedimiento de detección de un analito que comprende:

(a)

poner en contacto una muestra con una biomolécula unida a un compuesto marcador orgánico que es soluble en una solución acuosa, en el que dicho compuesto marcador es capaz de generar electroquimioluminiscencia;

(b)

aplicar un potencial oxidante usando un electrodo a dicho compuesto marcador en presencia de un correactivo amina en condiciones acuosas; y

(c)

medir la electroquimioluminiscencia emitida, en el que dicho procedimiento es un inmunoensayo, y dicha biomolécula es un anticuerpo o un antígeno o en el que dicho procedimiento es un ensayo de hibridación de ADN y dicha biomolécula es una sonda de ADN.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto marcador es un compuesto orgánico marcador policíclico sustituido.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que dicho correactivo es una amina terciaria.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho correactivo es una amina tripropilo (TPA).

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho marcador comprende dicho correactivo.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho marcador es clorpromazina.

7. Procedimiento de generación de electroquimioluminiscencia que comprende aplicar un potencial oxidante utilizando un electrodo a un marcador orgánico soluble que comprende una amina terciaria con el cual se genera electroquimioluminiscencia en condiciones subacuosas, en el que dicho marcador orgánico soluble está unido a una biomolécula seleccionada de entre el grupo consistente en un anticuerpo, un antígeno y una sonda de ADN.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho procedimiento se realiza en presencia de un correactivo interno.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, que comprende además medir la electroquimioluminiscencia generada.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dicha biomolécula es un anticuerpo.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha biomolécula está unida específicamente a un analito.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el compuesto marcador orgánico es difenilantraceno sustituido o un triantreno.

13. Composición marcadora electroquimioluminescente, que comprende:

un compuesto marcador orgánico hidrosoluble capaz de generar electroquimioluminiscencia; y

un correactivo amina, en el que dicho compuesto está unido a una biomolécula seleccionada de entre un anticuerpo, un antígeno y una sonda de ADN.

14. Composición según la reivindicación 13, en la que el compuesto es un compuesto orgánico policíclico sustituido.

15. Composición según la reivindicación 14, en la que el compuesto es un compuesto aromático policíclico que presenta una sustitución en el anillo de carbono de por lo menos un heteroátomo seleccionado de entre N y/o S.

16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que el correactivo amina es una amina terciaria.

17. Uso de un compuesto orgánico hidrosoluble electroquimioluminescente unido a una biomolécula seleccionada de entre un antígeno, un anticuerpo y una sonda de ADN, en combinación con un correactivo amina, en la fabricación de un marcador electroquimioluminescente para la detección de un analito.

18. Uso según la reivindicación 17, en el que el marcador orgánico es un compuesto orgánico policíclico sustituido.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que el compuesto es un compuesto aromático policíclico que presenta una sustitución en el anillo de carbono de por lo menos un heteroátomo seleccionado de entre N y/o S.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el correactivo amina es una amina terciaria.