ES2218860T3

ES2218860T3 - Rantes truncados en el amino terminal como antagonistas de quimioquina.

Info

Publication number: ES2218860T3
Application number: ES98951476T
Authority: ES
Inventors: Paul Proost; Sofie Struyf; Jo Van Damme
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2004-11-16
Anticipated expiration: 2018-09-28
Also published as: EP1439231A3; CN1148447C; ATE368742T1; KR20010024214A; UA73080C2; HUP0003563A2; HUP0003563A3; DE69823218D1; DE69822856T2; KR20010024213A; EA003942B1; PL339559A1; ATE263242T1; SK4512000A3; HUP0003505A3; EP1439231B1; DE69838188D1; DE69823218T2; BG64679B1; US20050220790A1

Abstract

RANTES truncado en el amino terminal, que carece de los aminoácidos NH2 terminales que corresponden a los restos de aminoácidos 1-2 del RANTES natural y que presenta una actividad antagonista de quimioquinas.

Description

Rantes truncados en el amino terminal como antagonistas de quimioquina.

Área de la invención

La presente invención se refiere a RANTES truncados en el amino terminal, que carecen de los aminoácidos NH_{2} terminales que corresponden a los restos de aminoácidos 1-2 del RANTES natural y que presentan actividad antagonista de quimioquina, así como secuencias de ADNc que los codifican, su utilización en la terapia y/o en el diagnóstico de las enfermedades en las que se requiere una actividad antagonista de los efectos de quimioquina y composiciones farmacéuticas que los comprendan.

Antecedentes de la invención

Las quimioquinas constituyen una familia de citoquinas pequeñas proinflamatorias con propiedades quimiotácticas y activadoras de leucocitos. Dependiendo de la posición de las primeras cisteínas, la familia de las quimioquinas puede dividirse en quimioquinas C-C, C-X-C y C-X_{3}-C (Baggiolini M. et al., 1994; Baggiolini M. et al., 1997 y Taub D. et al., 1996).

Muchas quimioquinas C-X-C como la interleuquina 8 (IL-8) son quimiotácticas para neutrófilos, mientras que las quimioquinas C-C, como la proteína quimiotáctica para monocitos 3 (MCP-3), son activas en varios leucocitos incluyendo monocitos, linfocitos, eosinófilos, basófilos, células NK y células dendríticas.

El dominio NH_{2} terminal de las quimioquinas está implicado en la unión al receptor y el procesamiento NH_{2} terminal puede activar a las quimioquinas, reducir su actividad quimioquina o dar lugar a quimioquinas completamente inactivas.

La proteína básica de plaquetas quimioquina C-X-C, resulta un péptido quimiotáctico para neutrófilos (NAP-2) únicamente después de la eliminación de los 24 restos NH_{2} terminales (Walz A. et al., 1989 y Van Damme J. et al., 1990).

La eliminación de hasta 8 restos NH_{2} terminales de IL-8 resulta en una actividad quimiotáctica incrementada, pero una eliminación adicional de la secuencia Glu-Leu-Arg, que está localizada delante de la primera Cys en todas las quimioquinas C-X-C quimiotácticas para neutrófilos, produce una inactivación completa (Clark-Lewis I. et al., 1991).

Una proteolisis NH_{2} terminal similar (hasta 8 aminoácidos) de otra quimioquina C-X-C, la proteína quimiotáctica para granulocitos-2 (GCP-2), no tiene efecto en la actividad quimiotáctica para neutrófilos (Proost P. et al., 1993a).

RANTES (es un acrónimo de "Regulado por Activación, Normalmente Expresado en T, y presumiblemente Secretado") es una quimioquina C-C, cuyo clon de ADNc ha sido aislado de una biblioteca de ADNc enriquecida en secuencias específicas de células T (Schall T.J. et al., 1988).

Las quimioquinas sintéticas MCP-1, MCP-3 y RANTES que no presentan los aminoácidos NH_{2} terminales 8 a 9 son inactivas para monocitos y resultan útiles como antagonistas de receptor (Gong J. et al., 1996; y Gong J. et al., 1995).

La extensión de RANTES con una metionina resulta en la completa inactivación de la molécula y Met-RANTES se comporta como un antagonista del RANTES auténtico (Proudfoot A.E. et al., 1996).

Descripción de la invención

El principal objetivo de la presente invención es RANTES truncado en el amino terminal, que carece de los aminoácidos NH_{2} terminales que corresponden a los restos de aminoácidos 1-2 del RANTES natural y que presenta actividad antagonista de quimioquina.

Un objetivo particular de la presente invención es RANTES (3-68), que es RANTES que carece de los 2 primeros aminoácidos, como se muestra en la Figura 1 y en SEC ID NO: 2.

Los RANTES truncados en el amino terminal de la invención pueden estar en forma glicosilada o no glicosilada.

El término "antagonista de quimioquina" significa "que actúa como antagonista de las quimioquinas naturales maduras de longitud completa".

Otro objetivo de la invención son las moléculas de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican los RANTES truncados en el amino terminal de la invención, incluyendo secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales. La secuencia de ADNc de RANTES intacto se describe en Schall T.J. et al. (1988) y el ADNc de los RANTES truncados puede deducirse fácilmente.

"Las secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales" incluyen todas las secuencias de ácido nucleico que, en virtud de la degeneración del código genético, también codifican las secuencias de aminoácidos dadas.

La invención incluye también vectores de expresión que comprenden los ADNs anteriores, células anfitrionas transformadas con estos vectores y un procedimiento para la preparación de RANTES truncados en el amino terminal de la invención, mediante cultivo de las mencionadas células transformadas en medios de cultivo apropiados.

La secuencia de ADN que codifica las proteínas de la invención puede insertarse y ligarse en un plásmido apropiado. Una vez formado, el vector de expresión se introduce en una célula anfitriona apropiada que expresa entonces el vector para producir la proteína deseada.

La expresión de cualquiera de las proteínas recombinantes de la invención, como se menciona en la presente memoria, puede realizarse en células eucariotas (e.j. levaduras, células de insecto o de mamífero) o células procariotas, utilizando los vectores de expresión apropiados. Puede utilizarse cualquier método conocido en este campo.

Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican las proteínas obtenidas mediante cualquiera de los métodos anteriores se insertan en vectores de expresión construidos de manera apropiada mediante técnicas conocidas en este campo (véase Sambrook et al., 1989). Se une ADNc de doble cadena a vectores de plásmido por adición de colas homopoliméricas o por unión de restricción que implica la utilización de ligandos de ADN sintéticos o técnicas de ligado de extremos romos: se utilizan ADN ligasas para ligar las moléculas de ADN y las uniones no deseadas se evitan mediante tratamiento con fosfatasa alcalina.

Con el fin de ser capaz de expresar la proteína deseada, un vector de expresión debe comprender además secuencias de nucleótidos específicas que contengan información de regulación de la transcripción y la traslación unidas al ADN que codifica la proteína deseada, de manera tal que se permita la expresión génica y la producción de la proteína. En primer lugar, para que el gen se transcriba, debe estar precedido de un promotor que sea reconocible por la ARN polimerasa, al que la polimerasa se una y se inicie de esta manera el proceso de transcripción. Actualmente, se están utilizando varios promotores de estas características que funcionan con diferentes eficacias (promotores fuertes y débiles).

Para anfitrioneses eucariotas, se pueden utilizar diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y la traslación, dependiendo de la naturaleza del anfitrión. Pueden derivar de fuentes víricas, como adenovirus, virus de papiloma bovino, virus de Simio o semejantes, en los que las señales reguladoras están asociadas con un gen particular que presenta un nivel de expresión alto. Como ejemplos están el promotor TK del virus del Herpes, el promotor de SV40, el promotor del gen gal4 de levaduras, etc. Las señales de regulación de la iniciación de la transcripción pueden seleccionarse de forma que permitan represión y activación, de manera que pueda modularse la expresión de los genes.

La molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la invención, se inserta en vectores que presenten las señales reguladoras de la transcripción y la traslación operativas, que sean capaces de integrar las secuencias del gen deseado en la célula anfitriona.

Las células que han sido transformadas de manera estable por el ADN introducido pueden seleccionarse si se introducen también uno o más marcadores que permitan la selección de las células anfitrionas que contengan el vector de expresión. El marcador puede conferir prototrofía a un anfitrión auxotrófico, resistencia a biocidas, e.j. a antibióticos, o metales pesados como el cobre, o semejantes. El gen marcador que permite la selección puede unirse directamente a las secuencias de genes de ADN que se quieren expresar, o puede introducirse en la misma célula mediante cotransfección. Para la síntesis óptima de proteínas de la invención pueden necesitarse también elementos adicionales.

En la selección de un plásmido particular o de un vector vírico, existen factores de importancia, que incluyen: la facilidad con la que las células receptoras, que contienen el vector, pueden ser reconocidas y seleccionadas de las células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un anfitrión particular; y si resulta deseable tener la capacidad de "intercambiar" el vector entre células anfitrionas de diferentes especies.

Una vez que el vector o la secuencia de ADN que contiene la(s) construcción(es) se ha preparado para la expresión, la(s) construcción(es) de ADN pueden introducirse en una célula anfitriona apropiada mediante cualquiera de los diferentes medios adecuados: transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplasto, electroporación, precipitación calcio fosfato, microinyección directa, etc.

Las células anfitrionas pueden ser procariotas o eucariotas. Los anfitriones eucariotas son preferidos, e.j. células de mamífero, como células humanas, de mono, ratón, y células de ovario de hamster chino (CHO), debido a que proporcionan modificaciones post-traslacionales de las moléculas de proteína, incluyendo plegamiento correcto o glicosilación en los sitios correctos. Las células de levadura también pueden llevar a cabo modificaciones post-traslacionales de péptidos incluyendo glicosilación. Existe un número de estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias de promotor fuertes y un número alto de copias de plásmidos que pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas en levaduras. Las levaduras reconocen secuencias líder en productos génicos de mamífero clonados y secretan péptidos que presentan secuencias líder (es decir, prepéptidos).

Después de la introducción del vector, se crecen las células anfitrionas en un medio selectivo que selecciona el crecimiento de las células que contienen el vector. La expresión de las secuencias génicas clonadas resulta en la producción de las proteínas deseadas.

Los RANTES truncados en el amino terminal de la invención, pueden prepararse por cualquier método conocido en el campo, en particular, mediante los procedimientos de síntesis química conocidos, utilizando sintetizadores de péptidos en fase sólida automatizados seguidos de purificación cromatográfica.

Las quimioquinas de la invención pueden ser sintetizadas, por ejemplo, por Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil), tBoc (t-butoxicarbonil) o por cualquier otra síntesis química comparable con o sin grupos de protección apropiados de la cadena lateral en los diferentes aminoácidos. Los aminoácidos con o sin grupos de protección apropiados de la cadena lateral se preactivan - e.j. con HBTU/HOBt [hexafluorofosfato de 2-(1H-Benzotriazol-1il)-1,1,3,3-tetrametiluromio/1-hidroxibenzotriazol) - y se acoplan a la cadena peptídica en crecimiento. Antes de la adición del siguiente resto, el grupo de protección (e.j. Fmoc) se elimina del grupo \alpha-amino. Después de la síntesis, se eliminan todos los grupos de protección, se purifican los péptidos intactos de longitud completa y se pliegan por medios químicos o enzimáticos (incluyendo la formación de puentes disulfuro entre las cisteínas) en las quimioquinas correspondientes de la invención.

La purificación de las proteínas naturales, sintéticas o recombinantes, se lleva a cabo por cualquiera de los métodos conocidos para este fin, e.j. cualquier procedimiento convencional que implique extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis, o semejantes (véase por ejemplo Proost P. et al., 1996). Un procedimiento de purificación adicional que puede utilizarse preferentemente para purificar la proteína de la invención, es la cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos monoclonales, o afinidad por heparina, que unen la proteína diana y que son producidos e inmovilizados en una matriz de gel contenida en una columna. Las preparaciones impuras que contienen las proteínas se pasan a través de la columna. La proteína se unirá a la columna mediante el anticuerpo específico, mientras que las impurezas eluirán. Después de lavar, la proteína se eluye del gel por un cambio en el pH o en la fuerza iónica.

Los RANTES truncados en el amino terminal de la invención son útiles en la terapia y/o diagnóstico de las enfermedades en las que se requiere una actividad antagonista de los efectos de las quimioquinas. Ejemplos de estas enfermedades incluyen: enfermedades inflamatorias, enfermedades relacionadas con angiogénesis y hematopoyesis, tumores, enfermedades infecciosas, incluyendo VIH, enfermedades autoinmunes, aterosclerosis, enfermedades pulmonares y trastornos de la piel. La utilización preferida es en el campo de la infección por VIH.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona la utilización de la proteína de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente.

El medicamento se presenta preferentemente en la forma de una composición farmacéutica que comprende las proteínas de la invención, junto con uno o más vehículos y/o excipientes aceptables desde un punto de vista farmacéutico. Estas composiciones farmacéuticas constituyen un aspecto adicional de la presente invención.

Una realización adicional de la invención es el método de tratamiento de las enfermedades mencionadas más arriba, que comprende la administración de una cantidad activa desde un punto de vista farmacológico de los RANTES truncados en el amino terminal de la invención a sujetos con riesgo de desarrollar estas enfermedades o a sujetos que ya presentan estas patologías.

También se ha demostrado que CD26/DPP IV es capaz de generar RANTES truncados en el NH_{2} terminal in vitro. RANTES es la primera citoquina que se conoce cuya actividad biológica puede modificarse por CD26/DPP IV.

Por lo tanto, CD26/DPP IV puede utilizarse en la terapia y/o diagnóstico de las enfermedades en las que se requiere una actividad antagonista de los efectos de las quimioquinas, con atención particular a enfermedades inflamatorias, inmunes e infecciosas.

Esto representa el primer ejemplo de un mecanismo identificado, regulado de manera endógena, para la modificación de quimioquinas en un antagonista, semejante al procesamiento fisiológico pero mediado por otros factores (proteasas).

La invención se describirá a continuación por medio de los Ejemplos siguientes, que no deben considerarse en ningún modo limitantes de la presente invención. Los Ejemplos se referirán a las Figuras especificadas más abajo.

Descripción de las figuras

Figura 1: muestra las secuencias de aminoácidos de RANTES. Las secuencias señal se muestran en cursiva, mientras que los restos C aparecen en negrita. Las flechas indican los primeros aminoácidos del RANTES truncado en el amino terminal de la invención, también denominado RANTES (3-68).

Figura 2: se compararon las potencias quimiotácticas de formas de RANTES natural o recombinante intacto y truncado en el NH_{2} terminal en células monocíticas THP-1 en el ensayo Boyden con microcámara: RANTES natural (1-68) (\Delta), RANTES natural truncado (3-68) (\Box), RANTES recombinante intacto (1-68) (\blacktriangle) y RANTES recombinante tratado con CD26/DPP IV (3-68) (\blacksquare). Los resultados representan el índice quimiotáctico medio \pm EE de cuatro o más experimentos independientes.

Figura 3: efecto de RANTES natural (3-68) (\Box), RANTES natural (1-68) (\Delta), RANTES recombinante (1-68) (\blacktriangle) y RANTES recombinante tratado con CD26/DPP IV (3-68) (\blacksquare) en la [Ca^{2+}]_{i} en células THP-1. Los resultados representan el incremento medio en [Ca^{2+}]_{i} \pm EE de tres o más experimentos independientes.

Figura 4: muestra la desensibilización de la actividad movilizadora de Ca^{2+} de RANTESrec intacto (1-68) por RANTES (3-68). Las células THP-1 se estimularon en primer lugar con tampón o con diferentes concentraciones de RANTES recombinante (1-68) o con RANTES (3-68). Los resultados representan el incremento medio en

\hbox{[Ca ^{2+} ] _{i} }

\pm EE (tres o más experimentos independientes) en respuesta a 30 ng/ml de RANTES recombinante intacto como segundo estímulo.

Figura 5: comparación de la potencia quimiotáctica de RANTES truncado (3-68) con respecto a la de RANTES intacto (1-68). Se determinó la actividad quimiotáctica para granulocitos eosinofílicos de RANTES natural (nat) y recombinante (rec) truncado, de RANTES intacto y de MCP-3 sintética en el ensayo en microcámara. Los resultados representan el índice quimiotáctico medio (CI) \pm EE de dos o más experimentos independientes (cada uno realizado en triplicado).

Figura 6: desensibilización de la movilización de calcio por RANTES intacto en transfectantes CCR. Los experimentos de movilización de calcio se llevaron a cabo en células HOS transfectadas con CD4 y con los receptores de quimioquina CC, CCR1 o CCR5. Las células se estimularon en primer lugar con diferentes concentraciones de RANTES intacto o truncado, seguido de estimulación con 100 ng/ml de RANTES intacto. Se muestra el porcentaje de inhibición del incremento de [Ca^{2+}]_{i} inducido por el segundo estímulo. Este porcentaje se calculó comparando la respuesta de 100 ng/ml de RANTES intacto después de la adición de RANTES (1-68) o RANTES (3-68), con la respuesta después de la estimulación con tampón (100%). Los resultados representan el porcentaje de inhibición medio \pm EE de dos o más experimentos.

Figura 7: efecto inhibitorio potente de RANTES (3-68) en la infección de células mononucleares por VIH-1. Se infectaron PBMC activadas con PHA con la cepa Ba-L M-trópica de VIH-1 en presencia de diferentes concentraciones de RANTES (1-68) o RANTES (3-68) (0 a 1.000 ng/ml añadidos en el momento de la infección). Después de diez días, se evaluó la producción vírica en el sobrenadante celular mediante un ELISA Ag p-24 (se muestra un experimento representativo de cuatro).

Figura 8: efectos de RANTES (1-68) y RANTES (3-68) en la infección por la cepa SF162 de VIH-1 de PBMC activadas con PHA. Las producciones de virus se evaluaron 10 días después de la infección en el sobrenadante celular mediante un ELISA Ag p24. Se muestran los resultados de un experimento representativo de tres. * Por debajo del límite de detección del ELISA Ag p24 (<5 pg/ml).

Figura 9: expresión de CD26 en células HOS.CD4.CCR5, células U87.CD4.CCR5 y PBMC recién aisladas. El porcentaje (%) de células CD26 positivas se indica en cada histograma.

Figura 10: efectos de RANTES (1-68), RANTES (1-68) más CD26s (50 U/L), y RANTES (3-68) en la infección de células HOS.CD4.CCR5 por la cepa BaL de VIH-1. Las producciones de virus se evaluaron en el sobrenadante celular 8 días después de la infección mediante un ELISA Ag p24. Se muestran los resultados de un experimento representativo de tres.

Ejemplos Ejemplo 1 RANTES truncado en el amino terminal Material y Métodos Reactivos

El RANTES humano natural fue producido por células humanas Malavu de hepatosarcoma, células MG-63 de osteosarcoma o leucocitos de sangre periférica (Centros de transfusión sanguínea de Amberes y Leuven) y se purificó como se ha descrito previamente (Proost P. et al., 1996 y Proost P. et al., 1993). MCP-2, MCP-3 y GCP-2 se sintetizaron por química Fmoc (Proost P. et al., 1995 y Wuyts A. et al., 1997), el RANTES humano recombinante se obtuvo de Peprotech (Rocky Hill, NJ) y MCP-1 recombinante fue una donación del Dr. J.J. Oppenheim (NCI-NIH, Frederick, MD).

Las células de osteosarcoma humano (HOS) transfectadas con CD4 y con uno de los receptores de quimioquina CC, CCR1, CCR3 o CCR5 (Deng H. et al., 1996) se crecieron en DMEM con glutamax. Se añadió al medio puromicina (1 \mug/ml) como agente de selección. Todos los medios de crecimiento (Gibco BRL/Life Technologies, Paisley, UK) se enriquecieron con FCS 10%.

CD26/DPP IV humana se obtuvo de prostasomas, orgánulos derivados de la próstata, que aparecen en forma libre en el plasma seminal. La enzima se purificó a homogeneidad como se ha descrito anteriormente utilizando intercambio iónico seguido de cromatografía de afinidad en adenosina desaminasa (De Meester I. et al., 1996).

Incubación de quimioquinas con CD26/DPP IV y detección del procesamiento proteolítico

Se incubó durante toda la noche un exceso molar de quimioquina de 100 a 1.000 con CD26/DPP IV en Tris/HCl 100 mM pH 7,7. Las quimioquinas se separaron de CD26/DPP IV por SDS-PAGE en un sistema de gel Tris/Tricina como se ha descrito anteriormente (Proost P. et al., 1996).

Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF poli(fluoruro de vinilideno) (Problott, Perkin Elmer, Foster City, CA) por transferencia electroforética y se tiñeron con azul brillante de Coomassie R250. Después de desteñir, las membranas se lavaron al menos 5 veces con agua ultrapura (MilliQ; Millipore, Bedford, MA).

Con el fin de obtener cantidades suficientes de quimioquina pura truncada para los ensayos biológicos, se trataron alrededor de 50 \mug de quimioquina recombinante con CD26/DPP IV y el producto resultante se acidificó con ácido trifluoroacético (TFA) 0,1%. Se añadió Tween 20 (0,01%) para prevenir la adherencia de las quimioquinas a los tubos.

Las quimioquinas se separaron de CD26/DPP IV en un gradiente de acetonitrilo en una columna C-8 Aquapore RP-300 (1 x 50 mm) (Perkin Elmer). Se analizaron las fracciones que contenían proteínas por SDS-PAGE y se tiñeron con plata como se ha descrito.

Las quimioquinas tratadas con CD26/DPP IV, purificadas por RP-HPLC u obtenidas de los blots de PVDF, se secuenciaron por secuenciación NH_{2} terminal por degradación de Edman en un secuenciador de proteínas en fase líquida 477A/120A (Perkin Elmer) utilizando N-metilpiperidina como base de acoplamiento.

Detección de actividad quimiotáctica

Se evaluó la potencia quimiotáctica de las quimioquinas en granulocitos neutrofílicos (10^{6} células/ml) recién aislados de sangre periférica o en células monocíticas cultivadas THP-1 (0,5 x 10^{6} células/ml) en la microcámara Boyden (Proost P. et al., 1996 y Proost P. et al., 1993).

Después de 45 minutos (granulocitos) o de 2 h (células THP-1) de incubación a 37ºC, las células se fijaron y se tiñeron. Las células que migraron a través de las membranas de policarbonato de tamaño de poro 5 \mum se contaron microscópicamente en diez campos de inmersión con aceite.

Se calculó el índice quimiotáctico (C.I.) de una muestra (triplicados en cada cámara) como el número de células que migraron a la muestra de ensayo dividido por el número de células que migraron al medio control. En los experimentos de desensibilización, las células se incubaron con variantes biológicamente inactivas de quimioquinas durante 10 minutos a 37ºC antes de ser transferidas a la cámara.

Se calculó el porcentaje de inhibición del C.I. obtenido por desensibilización con células control tratadas con HBSS para la evaluación de la desensibilización de la quimiotaxis.

Detección de concentraciones de Ca^{2+} intracelulares

Se determinaron las concentraciones de Ca^{2+} intracelulares ([Ca^{2+}]_{i}) como se ha descrito anteriormente (Wuyts A. et al., 1997). Brevemente, se incubaron las células purificadas con el indicador fluorescente fura-2 (2,5 \muM fura-2/AM, Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holanda) y con Pluronic F-127 0,01% (Sigma, St. Louis, MO).

Después de 30 minutos, las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en HBSS con Ca^{2+} 1 mM y se incubaron durante 10 minutos a 37ºC antes de medir la fluorescencia de fura-2 en un espectrofotómetro de luminiscencia LS50B (Perkin Elmer). Tras excitación a 340 y 380 nm, se detectó la fluorescencia a 510 nm. La [Ca^{2+}]_{i} se calculó de la ecuación Grynkiewicz (Grynkiewicz G. et al., 1985).

Con el fin de determinar R_{max}, las células se lisaron con digitonina 50 \muM. Posteriormente, el pH se ajustó a 8,5 con Tris 20 mM y se obtuvo R_{max} por adición a las células lisadas de EGTA 10 mM. La K_{d} utilizada para la calibración fue 224 nM. Para los experimentos de desensibilización, las células se estimularon en primer lugar con tampón o quimioquina a diferentes concentraciones. Como segundo estímulo, se añadieron quimioquinas a una concentración que inducía un incremento significativo de [Ca^{2+}]_{i} después de la preestimulación con tampón. Se calculó el porcentaje de inhibición del incremento de [Ca^{2+}]_{i} en respuesta al segundo estímulo por preestimulación de las células.

Inhibición de la infección por VIH-1

Las cepas de VIH-1 M-trópicas BaL y SF162 se obtuvieron a través del proyecto MRC AIDS (Herts, UK). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos por centrifugación en gradiente de densidad (5,23) y se estimularon con 1 \mug/ml de PHA (Sigma, Bornem, Bélgica) durante 3 días a 37ºC. Se lavaron las células activadas (blastos estimulados con PHA) tres veces con PBS, y se infectaron con un virus como se ha descrito anteriormente (Schols D. et al., 1997). Los blastos estimulados con PHA infectados o no con VIH-1 se cultivaron en presencia de 25 U/ml de IL-2 y de diferentes concentraciones de RANTES (1-68) o RANTES (3-68). Se recogió el sobrenadante celular en el día 10 y se analizó el antígeno principal de VIH-1 en el sobrenadante mediante un kit de ELISA Ag p-24 (DuPont/NEN Life Science Products, Bruselas, Bélgica).

Resultados Identificación y caracterización biológica de RANTES natural, truncado en el NH_{2} terminal

Se ha aislado previamente una forma diferente truncada en el NH_{2} terminal de GCP-2 humana (Proost P. et al., 1993). La forma GCP-2 menos truncada se rompió más allá de la Pro de la penúltima posición [GCP-2(3-75)]. Utilizando un procedimiento estándar de purificación similar, se purificó la quimioquina C-C RANTES de leucocitos de sangre periférica o de células de sarcoma (Proost P. et al., 1996).

En particular, se fraccionaron los medios condicionados de células MG-63 o de células de sarcoma Malavu inducidas con una mezcla de citoquinas con el fin de aislar variantes naturales de las quimioquinas. Las quimioquinas se purificaron por cromatografía de afinidad con anticuerpo o heparina, cromatografía de intercambio catiónico (mono S FPLC) y RP-HPLC, y se detectaron las formas inmunoreactivas por ELISAs específicos de quimioquinas. En la columna de intercambio catiónico, se encontró que IL-8 eluía muy cerca de RANTES (entre 0,7 y 0,75 M de NaCl). No obstante, las dos quimioquinas se separaron por RP-HPLC (eluyendo RANTES e IL-8 a 27,5% y 30% de acetonitrilo, respectivamente). Los análisis de la secuencia de aminoácidos de las proteínas puras, confirmaron que IL-8 aparecía en diferentes formas truncadas en el NH_{2} terminal, que habían sido aisladas previamente en base a su actividad quimiotáctica (Van Damme J. et al., 1989). Sin embargo, sólo se aisló una única forma de RANTES, que no presentaba dos restos NH_{2} terminales respecto al RANTES intacto. En vista de su presencia predominante, se analizó este RANTES (3-68) con más detalle para verificar su actividad quimiotáctica para monocitos y eosinófilos. En particular, se ensayó RANTES (3-68) para determinar su actividad quimiotáctica y/o su actividad de liberación de Ca^{2+} intracelular y se comparó su potencia biológica con la de las quimioquinas intactas respectivas.

La deleción NH_{2} terminal de dos residuos de RANTES, resultó en un descenso considerable de la actividad quimiotáctica para monocitos y de la liberación de Ca^{2+}. Comparado con el RANTES natural intacto (dosis mínima eficaz 3-10 ng/ml), el RANTES natural (3-68) resultó totalmente inactivo cuando se ensayó a concentraciones tan altas como 300 ng/ml en la microcámara Boyden (Figura 2). Además, se necesitaron concentraciones de RANTES natural (3-68) 10 veces mayores en comparación con el RANTES (1-68) para obtener una respuesta de Ca^{2+} similar (Figura 3).

CD26/DPP IV elimina los dipéptidos NH_{2} terminales de las quimioquinas

Con el fin de investigar si la aminopeptidasa CD26/DPP IV puede ser responsable de la truncación NH_{2} terminal de RANTES, se incubó la quimioquina intacta durante toda la noche con CD26/DPP IV, se transfirió a membranas de PVDF, se tiñó con azul de Coomassie y se sometió a degradación de Edman automática. El tratamiento de RANTES con CD26/DPP IV resultó en la eliminación de los dipéptidos NH_{2} terminales. Una incubación paralela de la quimioquina con tampón sin CD26/DPP IV no tuvo efecto.

Como otras quimioquinas contienen la secuencia consenso para la rotura por CD26/DPP IV y como se ha demostrado que el NH_{2} terminal de las MCPs es crucial para la actividad biológica (Gong J. et al., 1996 y Gong J. et al., 1995), también se incubaron con CD26/DPP IV MCP-1, MCP-2 y MCP-3.

Después del tratamiento, las MCPs se transfirieron a membranas de PVDF y se tiñeron con azul de Coomassie para confirmar que se había recuperado una cantidad suficiente de proteína para la degradación de Edman.

Sin embargo, no se detectó ninguna secuencia NH_{2} terminal, lo que indica que CD26/DPP IV no altera el NH_{2} terminal de las MCPs que es bloqueado para la degradación de Edman por un ácido piroglutámico.

Comparación de la actividad biológica de RANTES intacto y RANTES tratado con CD26/DPP IV

De manera similar al RANTES natural (3-68) el RANTES recombinante purificado por C-8 RP-HPLC y tratado con CD26/DPP IV resultó inactivo en experimentos de quimiotaxis en microcámaras Boyden cuando se utilizó en concentraciones de hasta 1 \mug/ml, mientras que se detectó una respuesta quimiotáctica significativa para monocitos con RANTES recombinante intacto de 30 a 100 ng/ml en adelante (Figura 2).

Cuando se ensayó el efecto de la truncación en el ensayo de movilización de Ca^{2+}, RANTES (3-68) indujo un incremento pequeño pero significativo a 100 ng/ml. Sin embargo, el RANTES intacto resultó ya activo a 10 ng/ml (Figura 3). En conclusión, aunque sólo se eliminaron dos restos NH_{2} terminales, la potencia quimiotáctica para monocitos y la potencia de movilización de Ca^{2+} de RANTES disminuyeron de 10 a 100 veces.

RANTES (3-68) es un antagonista quimiotáctico natural para el RANTES intacto

En vista de la falta de actividad de RANTES (3-68) en experimentos de quimiotaxis con monocitos, ensayamos si este RANTES truncado actúa como un antagonista. RANTES (3-68), a una concentración de 1 \mug/ml, desensibiliza casi completamente (82%) para el efecto quimiotáctico de 100 ng/ml de RANTES intacto (Tabla I).

Cuando se añadió al pocillo superior un exceso de 3 veces de RANTES (3-68), se inhibió la quimiotaxis de las células THP-1 para el RANTES intacto aproximadamente un 50-70%. RANTES (3-68) a una concentración de 300 ng/ml inhibió alrededor de un 30% la respuesta quimiotáctica frente a una concentración igual de RANTES intacto.

En experimentos de movilización de Ca^{2+} con células THP-1 (Figura 4), 30 ng/ml de RANTES intacto pudieron desensibilizar para el efecto de 30 ng/ml de RANTES intacto 39 \pm 5%. Resultaron necesarias concentraciones de aproximadamente 10 veces mayores de RANTES (3-68) para obtener la misma cantidad de desensibilización. Sin embargo, a una concentración de 300 ng/ml, RANTES (3-68) produjo por sí mismo una respuesta significativa de Ca^{2+}. Esta respuesta de Ca^{2+} fue comparable a la respuesta obtenida con 30 ng/ml de RANTES intacto.

TABLA I RANTES (3-68) desensibiliza la quimiotaxis para monocitos inducida por RANTES (1-68)^{1}

1

Actividad quimiotáctica disminuida de RANTES (3-68) para monocitos y eosinófilos humanos

En la Tabla II se compara la potencia quimiotáctica de RANTES natural (3-68) con la de la proteína quimiotáctica de monocitos MCP-3 y con la de RANTES intacto (1-68). Se puede observar que MCP-3 y RANTES (1-68) son quimiotácticos para monocitos recién aislados de sangre periférica, a concentraciones de 3 ng/ml y 30 ng/ml, respectivamente, mientras el RANTES natural (3-68) permanece inactivo a 100 ng/ml.

La potencia quimiotáctica reducida de esta variante natural, se confirmó con RANTES recombinante (3-68). Aunque resultó débilmente quimiotáctico para monocitos (a 1 \mug/ml), el RANTES recombinante (3-68) purificado mostró una actividad específica 10 veces menor que la del RANTES recombinante intacto.

Finalmente, se verificó la potencia quimiotáctica de RANTES (3-68) en eosinófilos humanos, que respondieron a 100 ng/ml de RANTES intacto y a 30 ng/ml de MCP-3 (Figura 5). De manera similar a los monocitos, la migración de eosinófilos fue únicamente estimulada por RANTES (3-68) a 1 \mug/ml.

TABLA II Comparación de la actividad quimiotáctica para monocitos de RANTES (3-68) con la de RANTES (1-68) y la de MCP-3

2

RANTES (3-68) señaliza y desensibiliza para RANTES (1-68) a través de CCR5, peor no a través de CCR1 y CCR3

Para explicar la actividad quimiotáctica reducida de RANTES (3-68), se verificó la capacidad de esta variante de quimioquina de unir y señalizar a través de los receptores utilizados por RANTES conocidos.

Se utilizaron células HOS transfectadas con los receptores de quimioquinas CCR1, CCR3 o CCR5 en un ensayo de señalización en el que se determinaron incrementos en la concentración intracelular de calcio. A concentraciones de hasta 300 ng/ml, RANTES (3-68) no incrementó la [Ca^{2+}]i en células HOS transfectadas con CCR1 (Tabla III) o con CCR3 (datos no mostrados), mientras 30 ng/ml y 100 ng/ml de RANTES intacto resultaron suficientes para inducir un incremento en [Ca^{2+}]i en los transfectantes CCR1 y CCR3, respectivamente.

Sin embargo, tanto los RANTES intactos como truncados fueron capaces de inducir un incremento significativo en [Ca^{2+}]i en los transfectantes CCR5 a 30 ng/ml. Aún más, mediante una preincubación de las células transfectadas con CCR5 con un exceso de 3 a 10 veces bien de RANTES (3-68) o de RANTES intacto, se obtuvo una inhibición igual (alrededor del 75%) del incremento en [Ca^{2+}]i por un pulso subsecuente con RANTES intacto (100 ng/ml) (Figura 6).

Por el contrario, una concentración de 300 ng/ml de RANTES (3-68) sólo desensibilizó de manera marginal la respuesta de calcio de las células transfectadas con CCR1 y CCR3 para 100 ng/ml de RANTES intacto, mientras que un exceso de 3 veces de RANTES intacto como primer estímulo inhibió casi completamente el incremento de [Ca^{2+}]i en estas células por RANTES (1-68). Se puede concluir, que la eliminación de dos restos NH_{2} terminales de RANTES tiene un impacto significativo en la transducción de la señal ya que los receptores de quimioquinas CCR1 y CCR3 ya no son reconocidos de manera funcional. Por lo tanto, la potencia quimiotáctica disminuida de RANTES (3-68) puede explicarse por su falta de capacidad de funcionar a través de CCR1 y CCR3. Por el contrario, RANTES (3-68) retiene completamente la característica de señalizar a través de CCR5 del RANTES intacto. RANTES (3-68) puede ser antiinflamatorio por competición con RANTES intacto, pero puede funcionar como un inhibidor de VIH al retener su capacidad de unirse a CCR5.

TABLA III Movilización de calcio por formas de RANTES en transfectantes CCR1 y CCR5

3

Inhibición de la quimiotaxis inducida por quimioquinas CC por RANTES (3-68) en células monocíticas humanas

Para verificar si la inhibición de la señalización de quimioquina CC por RANTES (3-68) también ocurre en células monocíticas, se llevaron a cabo experimentos de inhibición en células THP-1. Resultó claro que RANTES (3-68) mostró una reducción de 10 veces en la potencia de incrementar [Ca^{2+}]i en células monocíticas comparado con RANTES intacto (datos no mostrados). Además, el efecto quimiotáctico del RANTES intacto (30 ng/ml) en células monocíticas resultó inhibido (71%) por incubación de las células del ensayo con 300 ng/ml de RANTES (3-68) como se muestra en la Tabla IV.

Aún más, RANTES (3-68) redujo la respuesta quimiotáctica para otras quimioquinas CC, incluyendo la proteína quimiotáctica para monocitos 3 (MCP-3) (67%), la proteína inflamatoria de macrófagos 1a (MIP-1\alpha) (61%) y MIP-1\beta (80%).

Esto demuestra que RANTES (3-68) funciona como un inhibidor de amplio espectro de la migración de células monocíticas inducida por otras quimioquinas CC.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA IV Inhibición de la quimiotaxis de células monocíticas hacia quimioquinas CC por RANTES (3-68)

5

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{150mm}a) se añadieron como
quimioatrayentes, RANTES, MCP-3,
MIP-1 \alpha ,  MIP-1 \beta  y
tampón a los pocillos inferiores de la
microcámara.\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}[t]{150mm}b) los pocillos superiores de la
microcámara se llenaron con células THP-1 
preincubadas (10 min, 37ºC) con 300 ng/ml de RANTES
(3-68) o con tampón.\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}[t]{150mm}c) CI medio  \pm  EE de cuatro
experimentos independientes.\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}[t]{150mm}d) inhibición de la migración
inducida por quimioquinas intactas en presencia de  RANTES
(3-68) a 300
ng/ml.\end{minipage} \cr}

La truncación de RANTES específica de CD26 es necesaria para su actividad antiviral

Se evaluaron, en primer lugar, los efectos de las diferentes formas de RANTES frente a dos cepas diferentes M-trópicas de VIH-1 (BaL y SF162) en PBMC humanas obtenidas de donantes de sangre sanos. La CI_{50} de RANTES intacto (1-68) frente a la cepa BaL fue 3,4 nM y para RANTES (3-68) la CI_{50} fue 0,39 nM. El valor de CI_{90} para RANTES (1-68) fue 71 nM, que fue aproximadamente 10 veces el valor de CI_{90} para RANTES (3-68). Cuando se evaluó en PBMC frente a la cepa SF162, RANTES (1-68) (CI_{50}: 23 nM; CI_{90}: 95 nM) fue mas de 10 veces menos activo que RANTES (3-68) (CI_{50}: 2 nM; CI_{90}: 8,2 nM) (Tabla V). Los efectos dependientes de la concentración de ambas quimioquinas a concentraciones que varían desde 133 hasta 0,2 nM frente a la replicación de VIH-1 SF162 en PBMC se muestran en la Figura 8. Una concentración de 5,2 nM de RANTES (3-68) resultó claramente efectiva en la reducción de la replicación del virus, mientras RANTES (1-68) resultó inactivo a esta concentración. No se detectó diferencia en la actividad antiviral entre RANTES intacto obtenido de PeproTech o de R&D Systems.

La diferencia acusada en la actividad antiviral entre las dos formas de RANTES resultó todavía más aparente cuando se ensayaron en las células humanas transfectadas con CCR5. En las células U78.CD4.CCR5, las CI_{50}s para RANTES (1-68) y RANTES (3-68) frente a la cepa BaL fueron 21 nM y 0,65 nM, respectivamente. La CI_{90} para RANTES (1-68) fue más de 133 nM, mientras que la CI_{90} para RANTES (3-68) fue 63 nM. En la Tabla V, también se muestra que RANTES (1-68) resultó virtualmente inactivo en las células HOS.CD4.CCR5 (CI_{50}>133nM), mientras que RANTES (3-68) es un potente inhibidor de la replicación de VIH-1 BaL en estas células (CI_{50}: 5,5 nM). Sin embargo, no se alcanzaron valores de CI_{90} para ambas formas de RANTES en estas células.

La actividad antiviral de RANTES depende de la presencia de CD26 unida a membrana o soluble (CD26s)

Se evaluó la expresión de CD26 en las dos líneas celulares diferentes transfectadas con CCR5 y en PBMCrecién aisladas. Los transfectantes HOS resultaron negativos para la expresión de CD26 determinada por análisis de citometría de flujo, mientras que los transfectantes U87 se tiñeron débilmente pero de manera significativamente positiva con el mAc anti-CD26 (Figura 9). Además, se encontró que una subpoblación de PBMC recién aislada fue fuertemente positiva para la expresión de CD26 (Figura 9).

El efecto dependiente de la concentración de RANTES (1-68) y de RANTES (3-68) en la producción viral de Ag p24 por la cepa BaL en células transfectadas HOS.CD4.CCR5 en presencia de CD26s se muestra en la Figura 10. La adición de CD26s junto con RANTES (1-68) al comienzo de la infección por HIV, incrementó de manera significativa la actividad antiviral de RANTES intacto en células HOS.CD4.CCR5. Cuando se añadió CD26s a 50 U/l junto a RANTES, se obtuvo una CI_{50} de 13 nM de RANTES. La adición de CD26s sola no tuvo efecto en la replicación del virus. La adición de CD26s a RANTES (3-68) tampoco cambio la actividad antiviral de RANTES (3-68) (datos no mostrados). Por lo tanto, la presencia de CD26 es esencial para que RANTES intacto tenga actividad antiviral.

La truncación amino terminal del MIP-1\alpha natural no afecta su actividad quimiotáctica anti-VIH -1 ni su actividad movilizadora de Ca^{2+}

Como la mayoría del MIP-1\alpha natural está truncado en su NH_{2} terminal (cuatro aminoácidos), investigamos si este MIP-1\alpha truncado (5-70) presentaba una capacidad inhibitoria de VIH-1 alterada. En contraste con los resultados obtenidos para RANTES, no se detectaron diferencias significativas en los valores de CI_{50} de MIP-1\alpha intacto y de MIP-1\alpha (5-70) en células PMBC o en células transfectadas con CCR5 (Tabla V, Figura 8). Además, se compararon MIP-1\alpha intacto y MIP-1\alpha truncado (5-70) en ensayos de quimiotaxis y de movilización de Ca^{2+} intracelular en células monocíticas THP-1. La Tabla VI demuestra que la dosis mínima eficaz de MIP-1\alpha (5-70) que induce una elevación en la [Ca^{2+}]_{i} fue sólo ligeramente inferior a la de MIP-1\alpha. Aún más, aunque la máxima migración obtenida con 0,13 nM en el ensayo de quimiotaxis fue mayor para el MIP-1\alpha intacto, las concentraciones mínimas eficaces de ambas isoformas de MIP-1\alpha fueron similares. Teniendo en cuenta todos estos datos, se puede concluir que el procesamiento NH_{2} terminal de MIP-1\alpha, en contraste con RANTES, debilita sólo mínimamente su actividad inflamatoria y anti

\hbox{VIH-1.}

TABLA V Actividad anti VIH-1 de RANTES y de MIP-1\alpha en células PMBC estimuladas con PHA y en U87.CD4.CCR5

6

La producción de virus se evaluó en el sobrenadante libre de células 8-12 días después de la infección por ELISA Ag vírico p24. Se muestran las CI_{50}s y CI_{90}s medias (en nM). Los datos representan las medias de dos a cuatro experimentos independientes. El valor marcado por ">130" indica que no se ha alcanzado el 50% o el 90% de inhibición a 130 nM. ND, no realizado.

TABLA VI Ausencia de diferencia en la potencia biológica entre MIP-1\alpha intacto y truncado

7

Referencias

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.

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(B): CALLE: 14 JOHN B. GORSIRAWEG

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(C): CIUDAD: CURACAO

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(E): PAÍS: ANTILLAS HOLANDESAS

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(F): CÓDIGO POSTAL: NINGUNO

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(G): TELÉFONO: 599-9-639300

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(H): TELEFAX: 599-9-614129

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RANTES TRUNCADOS EN EL AMINO TERMINAL COMO ANTAGONISTAS DE QUIMIOQUINAS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): FORMA DE LECTURA PARA ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: DISQUETE

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(B): ORDENADOR: PC COMPATIBLE CON IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: Patentin Release #1.0 Versión #1.30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 91 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): ANTI-SENTIDO: NO

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

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(B): LOCALIZACIÓN: 1..68

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

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8

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 66 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): ANTI-SENTIDO: NO

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

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Claims

1. RANTES truncado en el amino terminal, que carece de los aminoácidos NH_{2} terminales que corresponden a los restos de aminoácidos 1-2 del RANTES natural y que presenta una actividad antagonista de quimioquinas.

2. RANTES truncado en el amino terminal de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.

3. RANTES truncado en el amino terminal de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, en forma glicosilada.

4. Moléculas de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican el RANTES truncado en el amino terminal de la invención de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, incluyendo secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales.

5. Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 4.

6. Una célula anfitriona que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5.

7. Un procedimiento de recombinación para preparar cualquiera de las proteínas de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar las células de la reivindicación 6 en un medio de cultivo apropiado.

8. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para ser utilizada como medicamento.

9. Utilización de una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la fabricación de un medicamento para la terapia y/o diagnóstico de enfermedades, en las que se requiere una actividad antagonista de los efectos de las quimioquinas.

10. Utilización de acuerdo con la reivindicación 9, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, infección por VIH, enfermedades relacionadas con angiogénesis y hematopoyesis, y tumores.

11. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 junto a uno o más vehículos y/o excipientes aceptables desde un punto de vista farmacéutico.