ES2216006T3 - Disposicion de secuencias de acido nucleico y su uso. - Google Patents
Disposicion de secuencias de acido nucleico y su uso.Info
- Publication number
- ES2216006T3 ES2216006T3 ES95904500T ES95904500T ES2216006T3 ES 2216006 T3 ES2216006 T3 ES 2216006T3 ES 95904500 T ES95904500 T ES 95904500T ES 95904500 T ES95904500 T ES 95904500T ES 2216006 T3 ES2216006 T3 ES 2216006T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleic acids
- chromosomes
- dna
- support
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 79
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 76
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 28
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 claims description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 4
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 4
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 claims description 3
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 101150084935 PTER gene Proteins 0.000 claims description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 52
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000055056 N-Myc Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000000132 chromophobic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000579 hyperploidy effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 2
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- 208000031639 Chromosome Deletion Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000007903 genomic in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- -1 proteins Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
LA INVENCION TRATA DE UNA ORDENACION DE SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS Y SU UTILIZACION. EL OBJETO DE LA INVENCION ES FORMAR UNA ORDENACION DE SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS DE TAL MANERA, QUE CON POCOS MEDIOS TECNICOS SE OBTENGA UNA ALTA RESOLUCION EN LA HIBRIDACION GENOMICA COMPARADA. CON TAL FIN, TODOS LOS COMPONENTES DE ESTA ORDENACION DE SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS ESTAN SEPARADOS UNOS DE OTROS.
Description
Disposición de secuencias de ácido nucleico y su
uso.
La invención se refiere a un procedimiento, así
como al uso de una disposición, para la hibridación comparativa de
ácido nucleico.
Con procesos de hibridación genómica comparativa
in situ (comparative genomic hybridization, CGH) sobre
preparados de cromosomas con cariotipo normal, actualmente pueden
registrarse en un ADN genómico de prueba (por ejemplo ADN de un
tumor, ADN genómico de un sujeto sometido a examen en el que se
sospecha una aberración cromosómica) la ganancia y la pérdida de
segmentos del genoma de aproximadamente 10 Mpb. En el caso de las
amplificaciones, también pueden mapearse segmentos de ADN
esencialmente más pequeños por medio de la CGH sobre preparados de
cromosomas de referencia. Estos procesos se conocen a partir de Du
Manoir, S., Speicher, M.R., Joos, S., Schröck, E., Popp, S., Döhner,
H., Kovacs, G., Robert-Nicoud, M., Lichter, P.,
Crewer, T.: Detection of complete and partial chromosome gains and
losses by comparative genomic in situ hybridazation. Hum.
Genet. 90: 590-610, 1993, o Joos, S., Scherthan, H.,
Speicher, M.R., Schlegel, J., Cremer, T., Lichter, P.: Detection of
amplified genomic sequences by reverse chromosome painting using
genomic tumor DNA as probe. Hum. Genet. 90: 584-589,
1993. Como ADN genómico de referencia puede tomarse ADN obtenido, en
caso de estar disponible, de células con un complemento cromosómico
normal de la misma o también de otra persona.
El estado de desarrollo de la CGH alcanzado hoy
en día tiene dos limitaciones esenciales. Por un lado, se desea un
aumento adicional en el poder de resolución. Es de esperar que sean
posibles los análisis de CGH de trisomías y monosomías parciales
sobre cromosomas en prometafase, con un poder de resolución de
aproximadamente \geq 3 Mpb. Esto corresponde al contenido medio de
ADN de una banda cromosómica, en el caso de un bandeo cromosómico
con un alto poder de resolución, con aproximadamente 1000 bandas por
dotación cromosómica haploide. Sin embargo, para muchos usos sería
deseable un ensayo de CGH con la que también pudieran registrarse de
manera segura ganancias y pérdidas de genes individuales o incluso
de segmentos de ADN intragénico. Posiblemente, si los análisis de
CGH se realizan sobre estructuras de cromatina aún más descondensada
pueden conseguirse mejoras adicionales del poder de resolución. Por
otro lado, los ensayos de CGH sobre cromosomas mitóticos de
referencia tienen la desventaja de que la identificación
completamente automática de cromosomas según el bandeo con
fluorescencia, por ejemplo con DAPI
(4',6-diamidino-2-fenilindol
(tinción de ADN de doble cadena), y la medición de los perfiles de
los cocientes de fluorescencia de CGH a lo largo de los cromosomas
individuales, es costosa técnicamente y lleva mucho tiempo.
Ahora, es tarea de la invención proporcionar un
procedimiento, así como el uso de una disposición de secuencias de
ácido nucleico, con el que pueda conseguirse una automatización y
una resolución esencialmente mayor, con un menor coste técnico.
Esta tarea se soluciona por medio de las
características de la reivindicación 1 ó 13. Las reivindicaciones
dependientes describen conformaciones ventajosas de la
disposición.
Una mejora decisiva, tanto considerando el poder
de resolución como también considerando una evaluación completamente
automática, se consigue por medio de un ensayo de matriz de VNH (VNH
= Vergleichende Nukleäure-Hybridisierung =
hibridación comparativa de ácidos nucleicos), en la que, en lugar de
cromosomas mitóticos, se aplican secuencias específicas de ácidos
nucleicos (a continuación denominados ácidos nucleicos objeto, en el
caso de ADN como ADN objeto, en el caso de ARN como ARN objeto)
sobre un material de soporte adecuado (denominado a continuación
matriz). Un ácido nucleico objeto puede estar compuesto por una o
muchas secuencias diferentes de ADN o ARN. A este respecto, la
complejidad de un ácido nucleico objeto se rige según el
planteamiento del problema. El ensayo de matriz de VNH debe
posibilitar un balance completamente automático de ganancia y
pérdida de los desequilibrios genéticos en un ADN genómico de
prueba, en el que el poder de resolución para los segmentos
seleccionados del genoma, por ejemplo genes individuales, puede
encontrarse en el intervalo de los kpb.
Los ácidos nucleicos objeto se inmovilizan sobre
una matriz sólida, que, por ejemplo, está compuesta por papel de
filtro o vidrio. El área de la matriz en la que se aplica un ácido
nucleico objeto se denomina a continuación como Slot. A continuación
tiene lugar la hibridación simultánea del ADN de prueba y el de
referencia con el ácido nucleico objeto. Alternativamente a ello, la
hibridación del ADN de prueba y de referencia con el ácido nucleico
objeto también puede realizarse en disolución. A este respecto, para
cada ácido nucleico objeto debe realizarse una hibridación separada.
Entonces, la evaluación se realiza tras la unión de los productos de
hibridación a una matriz sólida o directamente en disolución.
En contraposición con la disposición fuertemente
variable de los cromosomas individuales en la extensión de metafase,
tal como se utiliza en una hibridación genómica comparativa in
situ, la posición de los segmentos de genoma que han de
comprobarse en cuanto a ganancias y pérdidas en el ADN de prueba
puede fijarse claramente sobre una matriz. Además, el tamaño y la
forma de los cromosomas individuales muestran, de metafase a
metafase, considerables variaciones, mientras que el tamaño y la
geometría de los Slots individuales puede normalizarse. Estas
posibilidades de normalización de la posición, el tamaño y la
geometría de los Slots de ácidos nucleicos objeto facilitan
decisivamente la evaluación completamente automática de una matriz,
en comparación con la CGH sobre cromosomas en metafase. El tamaño y
la separación de los Slots individuales pueden elegirse de manera
que pueda realizarse fácilmente, con suficiente precisión, un manejo
automático de una mesa con la matriz colocada sobre ella o,
alternativamente, de un rayo de luz. En caso necesario, también
pueden determinarse cocientes de fluorescencia dentro de un Slot en
varias zonas separadas y determinar a partir de ello los valores
medios.
A continuación, la invención se describe
detalladamente mediante un ensayo de matriz de VNH para el análisis
de desequilibrios de ADN genómico o ARN expresado en diferentes
tejidos y tipos de células y mediante siete ejemplos.
Para la cuantificación comparativa de la
expresión genética en diferentes tejidos y tipos de células, debe
desarrollarse un ensayo basado en la hibridación comparativa de ARNm
o ADNc marcado de diferentes maneras, de dos tejidos o tipos de
células, sobre una matriz con los clones de ADNc
correspondientes.
El principio del ensayo de matriz de VNH se basa
en la hibridación comparativa de muestras de ácido nucleico de
prueba y de referencia con muestras objeto, que se han aplicado
sobre vidrio o un filtro, y en la determinación cuantitativa de los
cocientes de fluorescencia para las muestras hibridadas. Los pasos
de procedimiento individuales se presentan a continuación.
La selección de los ADN genómicos de prueba y de
referencia se realiza según los mismos criterios que en el caso de
los ensayos de CGH sobre cromosomas en metafase. Además de ADN del
genoma completo, puede utilizarse también ADN genómico amplificado
mediante DOP-PCR (Degenerate oligonucleotide primed
polymerase chain reaction; Reacción en cadena de la polimerasa
usando como cebador oligonucleótidos degenerados). Esto se describe,
por ejemplo, en Speicher, M.R., du Manoir, S., Schröck, E.,
Holtgreve-Grez, H., Schoell, B., Lengauer, C.,
Cremer, T., Ried, T.: Molecular cytogenetic analysis of
formalin-fixed, paraffin-embedded
solid tumors by comparative genomic hybridization after universal
DNA-amplification. Hum. Mol. Genet. 2:
907-1914, 1993. Como muestras de prueba y de
referencia para los ensayos comparativos de la expresión genética
pueden utilizarse preparados de ARNm o librerías de ADNc de células
o tejidos seleccionados, pero también muestras individuales de ADNc
y combinaciones de muestras de ADNc.
Como ácidos nucleicos objeto, que se aplican en
la matriz en la manera descrita posteriormente, se consideran
segmentos genómicos, clonados, de ADN de una especie (por ejemplo,
el hombre), por ejemplo preparados a partir de ADN de clones de
plásmidos, clones de cósmidos, clones de P1, clones de YAC, que
comprenden segmentos de genoma desde pocas kpb hasta varias Mpb. En
lugar de ácidos nucleicos purificados, también pueden aplicarse
directamente sobre la matriz cromosomas o microorganismos
seleccionados, que contengan los ácidos nucleicos
correspondientes.
Debería conocerse el mapeo físico de la muestra
utilizada. Para segmentos de genoma aún más grandes, por ejemplo
determinadas bandas cromosómicas, brazos cromosómicos, cromosomas
enteros, pueden combinarse mezclas del ADN de clones de ADN
genómicos seleccionados o puede utilizarse ADN de librerías de
clones, producidas a partir de cromosomas del hombre o de otras
especies, seleccionados u obtenidos por microdisección. Para los
ensayos comparativos, como ácidos nucleicos objeto de la expresión
genética pueden utilizarse muestras de ADNc, combinaciones de
muestras de ADNc o librerías de ADNc, así como fracciones de
ARNm.
Los ácidos nucleicos necesarios para un ensayo de
matriz de VNH deseado se aplican sobre un filtro en una disposición
geométrica deseada por el experimentador, por ejemplo de manera que
la secuencia de los ácidos nucleicos genómicos objeto sobre la
matriz corresponda, desde arriba hacia abajo, a la secuencia de su
mapeo físico sobre un cromosoma desde pter a qter. Por consiguiente,
cada muestra está asignada a un Slot con una posición definida sobre
el filtro. Como filtro pueden utilizarse filtros de papel habituales
para la unión de ácidos nucleicos. En el caso de procesos de
fluorescencia, los filtros deben seleccionarse de manera que sus
propiedades, como por ejemplo la fluorescencia propia, no
interfieran en la medición de las señales de fluorescencia. De esta
manera, los Slots pueden disponerse uno junto al otro, en filas
paralelas, para diferentes cromosomas, segmentos de cromosomas y
genes. La selección de los ácidos nucleicos objeto depende del
objetivo del diagnóstico y del poder de resolución necesario del
ensayo de matriz de VNH. Una matriz de Slots puede contener ácidos
nucleicos objeto para secuencias expresadas o segmentos genómicos de
genes seleccionados, al igual que ADN objeto para segmentos de
cromosomas, cromosomas individuales o también la dotación completa
de cromosomas. Su cantidad puede variar, según el objetivo del
diagnóstico, desde unos pocos hasta algunos cientos de ácidos
nucleicos objeto. En cuanto a los ácidos nucleicos objeto, puede
tratarse de muestras de cadena simple o de muestras de cadena doble.
En el último caso, los ácidos nucleicos objeto deben transformarse a
cadena simple, por medio de un paso adecuado de desnaturalización,
antes del ensayo de VNH. Los ácidos nucleicos objeto deben unirse al
filtro, por medio del tratamiento adecuado del filtro, de manera que
no puedan desprenderse durante el proceso de VNH.
Para la preparación de la matriz para el ensayo
de VNH sobre vidrio se requieren procedimientos que garanticen la
unión del ADN objeto o el ARN objeto al vidrio. Para ello existen ya
diferentes protocolos, como por ejemplo el revestimiento del
portaobjetos con una película delgada de poliacrilamida y la
inmovilización subsiguiente de las muestras que han de aplicarse
según un procedimiento de Khrapko et al. (Khrapko, K.R.,
Lysov, Y.P., Khorliin, A.A., Ivanov, I.B., Yershov, G.M., Vasilenko,
S.K., Florentiev, V.L., Mirzabekov, A.D.: A method for DNA
sequencing by hybridization with oligonucleotide matrix.
DNA-Sequence-J,
DNA-Sequencing and Mapping 1:
375-388, 1991). Otra posibilidad consiste en la
adición de sustancias de soporte a los ácidos nucleicos objeto, como
por ejemplo proteínas, que conducen a lo sumo a señales de fondo
leves o diferenciables, la aplicación de la mezcla sobre la matriz y
la fijación subsiguiente, como por ejemplo con metanol/ácido acético
glacial o formaldehído. La selección y disposición de las muestras
sobre la matriz de vidrio se realiza como se ha descrito
anteriormente. En lugar de vidrio también pueden considerarse otros
materiales duros. Parecen especialmente adecuadas las microplacas
con cavidades previamente formadas.
Como alternativa a la preparación de una matriz
para VNH sobre vidrio o sobre filtro, la hibridación puede
realizarse también en disolución, para cada ácido nucleico objeto
por separado. En este método debe dársele especial importancia a la
separación cuantitativa de las moléculas de muestra no
hibridadas.
Esto puede realizarse con métodos convencionales,
como por ejemplo filtración en gel, electroforesis en gel,
cromatografía o por degradación enzimática. Las intensidades de
señal de los ADN de prueba y de referencia no se miden hasta después
de esta separación. Esta medición puede realizarse tanto después de
la unión de los productos de hibridación a una matriz sólida o, para
cada ácido nucleico objeto por separado, en disolución. La medición
tras la unión a una matriz sólida se realiza como se explica
posteriormente, la medición en disolución puede realizarse
estacionaria para cada mezcla básica de reacción o en forma
automática, por ejemplo en el espectrofotómetro de flujo. En lo
anterior, las señales de los ácido nucleicos de prueba y de
referencia pueden medirse de manera correspondiente a la
característica de las señales. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de
prueba y de referencia pueden marcarse a través de diferentes
fluorocromos. Entonces, ambos pueden estimularse y medirse por
separado, en la fluorometría según el estado de la técnica, y
estimularse simultáneamente y medirse por separado, en la citometría
de flujo según el estado de la técnica.
El marcaje de las muestras de ácidos nucleicos
con haptenos (por ejemplo biotina o digoxigenina) o directamente con
un fluorocromo, se realiza mediante procedimientos estándar de
genética molecular (por ejemplo nick translation, random priming),
tal como se describe en Lichter, P., Cremer, T.: Chromosome analysis
by non-isotopic in situ hybridization, en:
Human cytogenetics: A practical approach; editado por: Rooney, D.E.,
Czepulkowski, B.H., IRL Press, Oxford: 157-192,
1992, y Raap, A.K., Wiegant, J., Lichter, P.: Multiple Fluorescence
in situ hybridization for molecular cytogenetics, en:
Techniques and Methods in Molecular Biology:
Non-radioactive labeling and detection of
biomolecules; editado por: Kessler, C., Editorial Springer, Berlín,
Heidelberg, Nueva York: 343-354, 1992.
La realización de la hibridación comparativa de
ácidos nucleicos tiene lugar como se describe en Du Manoir, S.,
Speicher, M.R., Joos, S., Schröck, E., Popp, S., Döhner, H., Kovacs,
G., Robert-Nicoud, M., Lichter, P., Cremer, T.:
Detection of complete and partial chromosome gains and losses by
comparative genomic in situ hybridization. Hum. Genet. 90:
592-593, 1993, o Speicher, M.R., du Manoir, S.,
Schröck, E., Holtgreve-Grez, E., Schoell, B.,
Lengauer, C., Cremer, T., Ried, T.: Molecular cytogenetic analysis
of formalin-fixed, paraffin-embedded
solid tumors by comparative genomic hybridization after universal
DNA-amplification. Hum. Mol. Genet. 2:
1913-1914, 1993. La hibridación de muestras de ARN
se realiza de manera análoga y considerando las medidas precautorias
habituales en la hibridación de ARN.
La detección de las secuencias hibridadas de la
muestra se realiza a través de moléculas que producen señales que
pueden registrarse cuantitativamente, que se diferencian lo
suficiente de las señales "de fondo" sobre la matriz. Para ello
se prefieren actualmente las propiedades de fluorescencia. En el
caso de los ácidos nucleicos marcados con fluorocromos, la detección
se lleva a cabo directamente tras la realización de los pasos
habituales de lavado. En el caso de las muestras de ácidos nucleicos
marcados con haptenos, la realización de las reacciones de detección
por fluorescencia tiene lugar según procesos estándar como se
describe, por ejemplo, Lichter, P., Cremer, T.: Chromosome analysis
by non-isotopic in situ hybridization, en:
Human cytogenetics: A practical approach; editado por: Rooney, D.E.,
Czepulkowski, B.H., IRL Press, Oxford: 157-192,
1992. Para la detección directa o indirecta de ácidos nucleicos,
además de la fluorescencia también pueden utilizarse otros procesos
de detección que produzcan señales que puedan cuantificarse bien,
como por ejemplo la quimioluminiscencia, fosforescencia,
radioactividad. También pueden combinarse en un experimento
diferentes tipos de detección para los ácidos nucleicos de prueba y
de referencia.
A continuación del procedimiento de VNH se
determinan cuantitativamente las señales de fluorescencia para cada
Slot de la matriz (por ejemplo con una cámara CCD) y, a partir de
ello, se calcula con un microprocesador el cociente de fluorescencia
(ácido nucleico de prueba)/(ácido nucleico de referencia). La
determinación de los cocientes de fluorescencia se realiza como se
describe en du Manoir et al. (1993) (páginas
592-593) o Speicher et al. (1993) (páginas
1913-1914), con la diferencia de que las mediciones
con ayuda de máscaras no se realizan en los cromosomas individuales
sino dentro de los Slots individuales de ácido nucleico objeto. En
los experimentos de control de VNH con ADN genómico de células con
cariotipo normal, marcado de diferentes maneras, o muestras de ADNc
o ARN idéntico, marcado de diferentes maneras, se determinan las
fluctuaciones de estos cocientes, que normalmente también son de
esperar, a un nivel de confianza indicado. En el caso de probandos
con una duplicación genómica o delección de un cromosoma, de un
segmento de cromosoma de o un gen, registrable por medio del ensayo,
es de esperar un aumento o disminución sistemáticos de los
cocientes, en los Slots que contienen los ácidos nucleicos objeto
correspondientes. Por el contrario, los cocientes de fluorescencia
para los restantes Slots deberían encontrarse en el intervalo de
control.
Debido a que la señal de hibridación que procede
del genoma de prueba en cada Slot se compara con la señal de
hibridación que procede del ADN normal de referencia, el ensayo de
matriz de VNH debería ser insensible frente a las variaciones de la
cantidad de ácido nucleico objeto en los Slots individuales durante
la producción de la matriz. Las variaciones en la proporción de
mezcla de ADN del tumor y ADN de referencia, que se dan entre los
diferentes experimentos, tienen un efecto en igual sentido sobre
todos los cocientes y pueden normalizarse fácilmente.
Un aspecto importante concierne a la selección
del equipo adecuado para el registro cuantitativo de las señales de
hibridación. Generalmente, los instrumentos de detección deben ser
aptos para medir diferencias lineares de las intensidades de señal
en un amplio margen. Actualmente, para detectar señales de
fluorescencia se consideran diferentes configuraciones de
instrumentos, como por ejemplo microscopios de fluorescencia,
equipados con una cámara CCD (charged coupled device) (enfriada); o
dispositivos de barrido de fluorescencia, en los que se realiza una
operación de barrido por medio de un rayo láser controlado
electrónicamente y la detección con un fotomultiplicador sensible.
En la espectrofotometría de flujo, la estimulación también se
realiza a través de una lámpara o de un láser y la detección a
través de un fotomultiplicador.
Según el tipo de señales de detección (véase lo
expuesto anteriormente) también son apropiados otros procedimientos
como, por ejemplo, la densitometría (véase por ejemplo la resonancia
magnética de fósforo).
Todos los datos medidos deben registrarse y
grabarse en forma digital. Las relaciones de intensidad de señal de
los ácidos nucleicos de prueba y de referencia se calculan entonces
con ayuda del software adecuado.
Aplicaciones importantes se encuentran en el
campo de la genética clínica, el diagnóstico de tumores, la
patología clínica, el análisis de modelos animales para enfermedades
genéticas, incluso tumores, así como de la investigación de
cultivos.
La selección de ácidos nucleicos objeto para la
matriz se realiza según los requisitos del diagnóstico. Si se
conocen los posibles desequilibrios cromosómicos para un determinado
planteamiento diagnóstico, entonces puede producirse una matriz con
ácidos nucleicos objeto, que se seleccionan de manera selectiva para
detectar o descartar estos desequilibrios específicos (véase en el
ejemplo 3). Sin embargo, para otro planteamiento es deseable
realizar un análisis lo más detallado posible del genoma en cuanto a
desequilibrios desconocidos. Por ejemplo, esto se realiza mediante
la desintegración del genoma completo en una serie de ácidos
nucleicos. En lo anterior, el poder de resolución y la sensibilidad
de un ensayo de VNH de este tipo están determinados por la cantidad
y la distribución genómica de los ácidos nucleicos objeto (véase en
el ejemplo 2). Por ejemplo, para conseguir un poder de resolución de
un análisis de bandeo citogenético con 400 u 800 bandas cromosómicas
por dotación cromosómica haploide, cada banda debería estar
representada por un ácido nucleico objeto adecuado sobre la matriz,
denominada a continuación "matriz de 400 u 800 bandas" (véase
el ejemplo 2). Con esta matriz podrían determinarse ganancias y
pérdidas de regiones cromosómicas al nivel de resolución así
prefijado, que corresponde al poder de resolución de CGH sobre
cromosomas en metafase que se consigue hoy en día.
En caso de necesidad, puede realizarse una
verificación secuencial de diferentes matrices con diferentes
poderes de resolución. Por ejemplo, si se descubre la ganancia o
pérdida de un segmento cromosómico determinado sobre cromosomas
normales o sobre una matriz de 400 bandas, en un segundo paso puede
utilizarse una matriz, con cuya ayuda se limitan más exactamente los
puntos de rotura de la región desequilibrada. Para esta matriz se
utilizan ácidos nucleicos objeto que caracterizan las subregiones
definidas del segmento cromosómico identificado anteriormente
(ejemplo 3).
Detección de aberraciones cromosómicas numéricas.
Para ello se necesitan 24 ADN objeto, que representan los 24
diferentes cromosomas humanos. Estos se combinan según los
requisitos del diagnóstico (véase lo expuesto posteriormente). Como
ADN objeto se consideran: ADN de cromosomas humanos clasificados;
ADN de células híbridas somáticas, que contienen respectivamente un
cromosoma humano (células híbridas monocromosómicas); productos de
amplificación de ADN de cromosomas humanos clasificados o células
híbridas monocromosómicas; reservas de fragmentos clonados,
específicos en cuanto a los cromosomas, como por ejemplo YAC, clones
P1, cósmidos, o, de manera correspondiente, contigs de estas
muestras. En lugar de ADN, también podrían aplicarse directamente
cromosomas o microorganismos clasificados, que contienen los ácidos
nucleicos correspondientes, sobre la matriz (véase lo expuesto
anteriormente).
a) Detección prenatal de alteraciones numéricas
en células embrionales. Las alteraciones numéricas más importantes
afectan a los cromosomas 13, 18, 21, X e Y. En este caso, la matriz
contiene, de manera correspondiente, los ADN objeto de los 5
cromosomas mencionados. Si debe descartarse una detección en los
cromosomas sexuales debido a consideraciones éticas y legales,
entonces se aplicarían únicamente los ADN objeto de los cromosomas
13, 18, 21.
b) Detección de hiperploidia en pacientes con
leucemia linfática aguda, dado que las hiperploidias con n>50
tienen un pronóstico clínico favorable. En este caso resulta
práctico aplicar ADN objeto para los 24 cromosomas humanos.
c) Detección de tumores, en los que las
aberraciones numéricas desempeñan una función importante, como por
ejemplo carcinoma celular cromófobo de los riñones, carcinoma de la
vejiga. También aquí pueden utilizarse matrices que contienen ADN
objeto de los 24 cromosomas (esto resulta práctico en el caso del
carcinoma de vejiga) o ADN objeto de las aberraciones de
consideración en las entidades de los tumores individuales (por
ejemplo carcinoma celular cromófobo de los riñones).
Detección universal de desequilibrios
cromosómicos parciales, desconocidos. Para ello se necesita ADN
objeto, que represente diferentes segmentos de los cromosomas
humanos. De esta manera pueden utilizarse, de forma análoga a los
métodos actuales de biología molecular para el análisis de pérdidas
genómicas ("loss of heterozygosity, LOH"), matrices con 42 ADN
objeto, para representar todos los brazos cromosómicos de
consideración: 1p, 1q, 2p, 2q, 3p, 3q, 4p, 4q, 5p, 5q, 6p, 6q, 7p,
7q, 8p, 8q, 9p, 9q, 10p, 10q, 11p, 11q, 12p, 12q, 13q, 14q, 15q,
16p, 16q, 17p, 17q, 18p, 18q, 19p, 19q, 20p, 20q, 21q, 22q, Yq.
En el caso necesitarse una mayor resolución
pueden utilizarse matrices más complejas, como las "matrices de
400 u 800 bandas" descritas anteriormente.
a) Revisión de pacientes, en los que se sospecha
una aberración cromosómica estructural desconocida.
b) Detección de desequilibrios cromosómicos
desconocidos en cualquier tumor. Ante todo, este planteamiento tiene
importancia en la investigación biológica de tumores, dado que aún
no se han identificado los desequilibrios genómicos de consideración
en cuanto al diagnóstico y el pronóstico de muchos tumores.
Detección de alta resolución de desequilibrios
genómicos en determinados segmentos cromosómicos. En este caso se
elaboran matrices que tienen ADN objeto únicamente para segmentos
cromosómicos seleccionados y consideran un planteamiento diagnóstico
específico.
a) En el caso del asesoramiento genético a
familias con translocaciones recíprocas es importante saber si en la
zona de los puntos cromosómicos de rotura se produjeron
desequilibrios genéticos. Para un análisis de este tipo puede
prepararse una matriz de alta resolución con ADN objeto, mapeado en
las regiones dudosas de puntos de rotura.
b) En el caso de un diagnóstico de portador de
enfermedades recesivas del cromosoma X, como la distrofia muscular
de Duchenne, puede prepararse una matriz, que contiene ADN objeto
para segmentos del gen correspondiente.
Detección de desequilibrios genómicos en genomas
de consideración para los tumores. Para ello se necesita ADN objeto,
que represente los protooncogenes, genes de supresión tumoral u
otros genes de un tumor, de consideración en cuanto a crecimiento y
metastatización.
a) Detección de la amplificación de oncogenes de
consideración para el pronóstico, por ejemplo amplificación de
N-myc en el caso del neuroblastoma.
b) Detección de la delección de genes de
supresión tumoral de consideración para el diagnóstico, por ejemplo
la delección en lp36 en el caso del neuroblastoma.
Detección de sobre o subexpresión de determinados
genes. Para ellos se necesitan ácidos nucleicos objeto que contengan
secuencias que codifiquen los genes seleccionados. Para ello,
también se consideran, además de las matrices descritas en el
ejemplo 4, matrices con ARN o ADN de los genes. Como ácido nucleico
de prueba se aísla ARN completo de una población celular que ha de
someterse a prueba; como ácido nucleico de referencia sirve el ARN
completo de una población celular de control adecuada, con expresión
normal de los genes de consideración.
En el caso de una amplificación genómica de
N-myc (véase el ejemplo 4a), con este ensayo puede
llevarse a cabo un registro cuantitativo de la sobreexpresión
real.
Los ejemplos descritos anteriormente para
enfermedades humanas pueden ampliarse de manera análoga para modelos
animales de estas enfermedades. Una condición para ello es la
preparación de matrices, cuyos ácidos nucleicos objeto provengan de
las especias correspondientes o presenten una conservación evolutiva
suficiente para el objetivo de un ensayo de VNH.
En el caso de muchos modelos animales para
tumores específicos, en principio no se conoce si el mecanismo
genético en que se basa coincide con el tumor que aparece en el
humano. En este caso, en una verificación de los genes de
consideración en cuanto a tumores (véase el ejemplo 4) o en el
análisis de expresión (véase el ejemplo 5), puede esperarse una
conformidad de los resultados del ensayo de VNH en el tumor humano y
en el animal.
En el caso de la producción de organismos
transgénicos, pueden desarrollarse ensayos de VNH con matrices que
contienen ácidos nucleicos de los genes a transferir. Con estos
ensayos pueden determinarse cuantitativamente los números de copias
de los genes transferidos y la expresión en el organismo
receptor.
a) Análisis de animales transgénicos, con genes
de consideración en cuanto a tumores, mutados de forma
correspondiente.
b) Reproducción de animales y plantas con
propiedades modificadas.
Claims (22)
1. Procedimiento para detectar el número relativo
de copias de secuencias de ácido nucleico en células de prueba,
mediante la hibridación comparativa de ácido nucleico de una mezcla
de ácidos nucleicos marcados de prueba, con una mezcla de diferentes
ácidos nucleicos marcados de células de referencia (ácidos nucleicos
de referencia), con ácidos nucleicos objeto, de manera que pueda
medirse, por separado, con ayuda de los marcajes, el número relativo
de copias de los ácidos nucleicos individuales dentro de los ácidos
nucleicos de prueba, en comparación con los ácidos nucleicos de
referencia, disponiéndose los ácidos nucleicos objeto por separado
sobre un soporte de un material adecuado, de una manera prefijada
claramente, caracterizado porque los ácidos nucleicos objeto
se aplican sobre áreas predeterminadas sobre el soporte.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el ácido nucleico objeto está compuesto
por una o varias secuencias de ADN o ARN diferentes.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque como ácido
nucleico objeto se utilizan cromosomas clasificados o segmentos de
cromosomas obtenidos por microdisección o segmentos genómicos
clonados de ADN de una especie o librerías de ADN de cromosomas o
segmentos de cromosomas o combinaciones de muestras de ADNc o
librerías de ADNc o fracciones de ARNm, solos o en combinaciones
adecuadas.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque como
soporte para los ácidos nucleicos objetos se utiliza vidrio o
material de filtro o geles o plástico o microplacas con cavidades
previamente formadas.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las áreas
para los cromosomas, segmentos de cromosomas y genes están
dispuestas unas junto a otras en filas paralelas.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los ácidos
nucleicos de prueba y de referencia están marcados con moléculas que
producen señales que pueden registrarse cuantitativamente, que se
diferencian lo suficiente de las señales de fondo sobre la
matriz.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque la molécula es un fluorocromo.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque se determinan cuantitativamente los
cocientes de fluorescencia de los fluorocromos.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque el cociente de fluorescencia se
determina dentro de un área en varias zonas separadas y, a partir de
ello, se determina el valor medio.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la detección de
señales de fluorescencia se realiza con un microscopio de
fluorescencia, que está equipado con una cámara CCD.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la detección de
señales de fluorescencia se realiza con un dispositivo de barrido de
fluorescencia, en el que se realiza una operación de barrido por
medio de un rayo láser controlado electrónicamente y la detección
con un fotomultiplicador sensible.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los ácidos
nucleicos de prueba y de referencia se seleccionan de ADN del genoma
completo, ADN genómico amplificado mediante DOP-PCR,
preparados de ARNm o librerías de ADNc de células seleccionadas o
tejido, muestras de ADNc y combinaciones de muestras de ADNc.
13. Uso de una disposición de secuencias de ácido
nucleico objeto sobre un soporte, estando aplicadas las secuencias
de ácido nucleico objeto en áreas predeterminadas sobre el soporte,
para la hibridación comparativa de ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 1 a 12.
14. Uso según la reivindicación 13,
caracterizado porque como soporte para los ácidos nucleicos
objeto se utiliza vidrio o material de filtro o geles o plástico o
microplacas con cavidades previamente formadas.
15. Uso según las reivindicación 13 ó 14,
caracterizado porque como ácidos nucleicos objeto se utilizan
cromosomas clasificados o segmentos de cromosomas obtenidos por
microdisección o segmentos genómicos clonados de ADN de una especie
o librerías de ADN de cromosomas o segmentos de cromosomas o
combinaciones de muestras de ADNc o librerías de ADNc o fracciones
de ARNm, solos o en combinaciones adecuadas.
16. Uso según una de las reivindicaciones 13 a
15, caracterizado porque los ácidos nucleicos objeto están
inmovilizados sobre un portaobjetos revestido con una película
delgada de poliacrilamida.
17. Uso según una de las reivindicaciones 13 a
16, caracterizado porque como ácidos nucleicos objeto se
utilizan ácidos nucleicos genómicos objeto, que se aplican sobre el
soporte de manera que la secuencia de los ácidos nucleicos genómicos
objeto sobre el soporte corresponda desde arriba hacia abajo a la
secuencia de su mapeo físico sobre un cromosoma desde pter a
qter.
18. Uso según una de las reivindicaciones 13 a
16, caracterizado porque las áreas para los cromosomas,
segmentos de cromosomas y genes están dispuestas unas junto a otras
en filas paralelas.
19. Uso según una de las reivindicaciones 13 a
16, caracterizado porque el soporte contiene 24 ácidos
nucleicos objeto, que representan los 24 cromosomas humanos
diferentes.
20. Uso según una de las reivindicaciones 13 a
16, caracterizado porque el soporte contiene los cromosomas
13, 18, 21, X e Y como ácidos nucleicos objeto.
21. Uso según una de las reivindicaciones 13 a
16, caracterizado porque el soporte contiene 42 ácidos
nucleicos objeto, que representan los brazos cromosómicos de
consideración: 1p, 1q, 2p, 2q, 3p, 3q, 4p, 4q, 5p, 5q, 6p, 6q, 7p,
7q, 8p, 8q, 9p, 9q, 10p, 10q, 11p, 11q, 12p, 12q, 13q, 14q, 15q,
16p, 16q, 17p, 17q, 18p, 18q, 19p, 19q, 20p, 20q, 21q, 22q, Yq.
22. Uso según una de las reivindicaciones 13 a
16, caracterizado porque para conseguir el poder de
resolución de un análisis de bandeo citogenético con 400 u 800
bandas cromosómicas por dotación cromosómica haploide, cada banda
está representada por un ácido nucleico objeto adecuado sobre el
soporte.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4344726 | 1993-12-27 | ||
DE4344726A DE4344726C2 (de) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | Verfahren zum Nachweis von nicht balanciertem genetischen Material einer Spezies oder zum Nachweis der Genexpression in Zellen einer Spezies |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2216006T3 true ES2216006T3 (es) | 2004-10-16 |
Family
ID=6506399
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES95904500T Expired - Lifetime ES2216006T3 (es) | 1993-12-27 | 1994-12-17 | Disposicion de secuencias de acido nucleico y su uso. |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6197501B1 (es) |
EP (2) | EP1260594A3 (es) |
AU (1) | AU687493B2 (es) |
CA (1) | CA2179605A1 (es) |
DE (1) | DE4344726C2 (es) |
ES (1) | ES2216006T3 (es) |
WO (1) | WO1995018235A1 (es) |
Families Citing this family (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5830645A (en) * | 1994-12-09 | 1998-11-03 | The Regents Of The University Of California | Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays |
DE19610255B4 (de) * | 1996-03-15 | 2004-11-04 | Universität Heidelberg | Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuresequenzen und Verfahren zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen |
AU8177398A (en) * | 1997-06-30 | 1999-01-19 | Government of the United States of America, as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services and His Successors, The | Spectral cloning-a new technical approach to the cloning and characterization ofevery chromosomal aberration in cancer samples |
US6979728B2 (en) * | 1998-05-04 | 2005-12-27 | Baylor College Of Medicine | Articles of manufacture and methods for array based analysis of biological molecules |
ES2198835T3 (es) * | 1998-11-03 | 2004-02-01 | METASYSTEMS HARD & SOFTWARE GMBH | Procedimiento para la aplicacion selectiva de reactivos sobre material biologico inmovilizado. |
US6861218B2 (en) | 1998-11-03 | 2005-03-01 | Metasystems Hard And Software Gmbh | Method for the targeted application of reagents onto immobilized biological material |
US6861214B1 (en) * | 2000-10-23 | 2005-03-01 | Beckman Coulter, Inc. | Immobilization of biopolymers to aminated substrates by direct adsorption |
US20050032060A1 (en) * | 2001-08-31 | 2005-02-10 | Shishir Shah | Arrays comprising pre-labeled biological molecules and methods for making and using these arrays |
US20030082606A1 (en) * | 2001-09-04 | 2003-05-01 | Lebo Roger V. | Optimizing genome-wide mutation analysis of chromosomes and genes |
AU2002330141B2 (en) * | 2001-09-27 | 2007-11-22 | Perkinelmer Las, Inc. | Methods for detecting genetic mosaicisms using arrays |
US7439346B2 (en) * | 2001-10-12 | 2008-10-21 | Perkinelmer Las Inc. | Nucleic acids arrays and methods of use therefor |
US6916621B2 (en) * | 2002-03-27 | 2005-07-12 | Spectral Genomics, Inc. | Methods for array-based comparitive binding assays |
US20070065830A1 (en) * | 2002-09-04 | 2007-03-22 | Children's Hospital Medical Center Of Akron, Inc. | Cloning multiple control sequences into chromosomes or into artificial centromeres |
US7011949B2 (en) * | 2002-09-30 | 2006-03-14 | Agilent Technologies, Inc. | Methods and compositions for producing labeled probe nucleic acids for use in array based comparative genomic hybridization applications |
ES2246748T1 (es) * | 2002-12-23 | 2006-03-01 | Agilent Technologies, Inc. | Ensayos de hibridacion genomica comparativos que utilizan caracteristicas oligonucleotidicas inmovilizadas y composiciones para ponerlos en practica. |
US7211384B2 (en) | 2003-05-28 | 2007-05-01 | Agilent Technologies, Inc. | Comparative genomic hybridization assays using immobilized oligonucleotide targets with initially small sample sizes and compositions for practicing the same |
JP2007515947A (ja) * | 2003-10-30 | 2007-06-21 | タフツ−ニュー イングランド メディカル センター | 羊水中の無細胞胎児dnaを使用する出生前診断 |
US20070031883A1 (en) * | 2004-03-04 | 2007-02-08 | Kincaid Robert H | Analyzing CGH data to identify aberrations |
US8321138B2 (en) * | 2005-07-29 | 2012-11-27 | Agilent Technologies, Inc. | Method of characterizing quality of hybridized CGH arrays |
US20050233339A1 (en) * | 2004-04-20 | 2005-10-20 | Barrett Michael T | Methods and compositions for determining the relationship between hybridization signal of aCGH probes and target genomic DNA copy number |
US20050233338A1 (en) * | 2004-04-20 | 2005-10-20 | Barrett Michael T | Methods and compositions for assessing chromosome copy number |
WO2005113834A2 (en) * | 2004-05-20 | 2005-12-01 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Single label comparative hybridization |
US20060078899A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Scheffer Alicia F | Methods and compositions for reducing label variation in array-based comparative genome hybridization assays |
US20070099227A1 (en) * | 2004-10-12 | 2007-05-03 | Curry Bo U | Significance analysis using data smoothing with shaped response functions |
US20060080043A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Sampas Nicholas M | Comparative genomic hybridization significance analysis using data smoothing with shaped response functions |
US20060110744A1 (en) | 2004-11-23 | 2006-05-25 | Sampas Nicolas M | Probe design methods and microarrays for comparative genomic hybridization and location analysis |
EP1846760B1 (en) * | 2005-01-27 | 2010-12-15 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Rapid comparative genome hybridization |
US7541144B2 (en) * | 2005-01-31 | 2009-06-02 | Agilent Technologies, Inc. | RNA labeling method |
US20060172314A1 (en) * | 2005-01-31 | 2006-08-03 | Song Min-Sun | Quantification of amplified nucleic acids |
US8058000B2 (en) * | 2005-06-02 | 2011-11-15 | The United States Of America As Represented By The U.S. Environmental Protection Agency | Species-specific primer sets and identification of species-specific DNA sequences using genome fragment enrichment |
US7544471B2 (en) * | 2005-07-30 | 2009-06-09 | Agilent Technologies, Inc. | Preparing RNA from a wax-embedded tissue specimen |
US20070048743A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | Sampas Nicholas M | Methods and compositions for assessing candidate aCGH probe nucleic acids |
US20070087355A1 (en) * | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Barrett Michael T | Comparative genomic hybridization assays and compositions for practicing the same |
US8076074B2 (en) | 2005-11-29 | 2011-12-13 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Balanced translocation in comparative hybridization |
US20070231803A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-04 | Jensen Mark A | Multiplex pcr mixtures and kits containing the same |
US8058055B2 (en) * | 2006-04-07 | 2011-11-15 | Agilent Technologies, Inc. | High resolution chromosomal mapping |
US20070238104A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-10-11 | Agilent Technologies, Inc. | Competitive oligonucleotides |
US20070238106A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-10-11 | Agilent Technologies, Inc. | Systems and methods of determining alleles and/or copy numbers |
US20080058218A1 (en) * | 2006-05-03 | 2008-03-06 | Gordon David B | Arrays of compound probes and methods using the same |
US20070259347A1 (en) * | 2006-05-03 | 2007-11-08 | Agilent Technologies, Inc. | Methods of increasing the effective probe densities of arrays |
US20070259345A1 (en) * | 2006-05-03 | 2007-11-08 | Agilent Technologies, Inc. | Target determination using compound probes |
US20070259346A1 (en) * | 2006-05-03 | 2007-11-08 | Agilent Technologies, Inc. | Analysis of arrays |
US20070259344A1 (en) * | 2006-05-03 | 2007-11-08 | Agilent Technologies, Inc. | Compound probes and methods of increasing the effective probe densities of arrays |
US20080090236A1 (en) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Yakhini Zohar H | Methods and systems for identifying tumor progression in comparative genomic hybridization data |
US20080102453A1 (en) * | 2006-10-31 | 2008-05-01 | Jayati Ghosh | Methods and systems and analysis of CGH data |
US20080241829A1 (en) * | 2007-04-02 | 2008-10-02 | Milligan Stephen B | Methods And Kits For Producing Labeled Target Nucleic Acid For Use In Array Based Hybridization Applications |
US7507539B2 (en) * | 2007-07-30 | 2009-03-24 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Substractive single label comparative hybridization |
US20090088330A1 (en) * | 2007-09-28 | 2009-04-02 | Leproust Emily M | Methods And Kits For Producing Labeled Target Nucleic Acids For Use In Array Based Hybridization Applications |
CN101918597B (zh) | 2008-03-11 | 2013-09-18 | 国立癌中心 | 应用snp阵列测量染色体、基因或特定核苷酸序列拷贝数的方法 |
US20100068701A1 (en) * | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Yamada N Alice | Chromosome labeling method |
CA2641132A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-03 | Richard T. Scott, Jr. | Improvements in in vitro fertilization |
US20100206316A1 (en) * | 2009-01-21 | 2010-08-19 | Scott Jr Richard T | Method for determining chromosomal defects in an ivf embryo |
US20100317916A1 (en) * | 2009-06-12 | 2010-12-16 | Scott Jr Richard T | Method for relative quantitation of chromosomal DNA copy number in single or few cells |
AU2010298000A1 (en) | 2009-09-25 | 2012-04-05 | Signature Genomics Laboratories Llc | Multiplex (+/-) stranded arrays and assays for detecting chromosomal abnormalities associated with cancer and other diseases |
US20120316080A1 (en) | 2009-10-19 | 2012-12-13 | Stichting Het Nederlands Kanker Instiuut | Differentiation between brca2-associated tumours and sporadic tumours via array comparative genomic hybridization |
WO2011048499A1 (en) | 2009-10-19 | 2011-04-28 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Predicting response to anti-cancer therapy via array comparative genomic hybridization |
US20120322677A1 (en) | 2009-10-19 | 2012-12-20 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Predicting benefit of anti-cancer therapy via array comparative genomic hybridization |
WO2012038837A2 (en) | 2010-09-20 | 2012-03-29 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Methods for predicting response to anti-cancer therapy in cancer patients |
WO2013055911A1 (en) | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Znf365/zfp365 biomarker predictive of anti-cancer response |
CN104093890B (zh) | 2012-01-26 | 2016-04-20 | 纽亘技术公司 | 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法 |
WO2013124740A2 (en) | 2012-02-23 | 2013-08-29 | Stichting Vu-Vumc | BRCA DEFICIENCY PROTEIN AND mRNA SIGNATURES USEFUL IN IDENTIFICATION OF PATIENTS WITH BRCA-DEFICIENT TUMORS AND PREDICTING BENEFIT OF ANTI-CANCER THERAPY IN CANCER PATIENTS |
SG11201408478QA (en) | 2012-06-18 | 2015-02-27 | Nugen Technologies Inc | Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences |
US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
US20140274738A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Nugen Technologies, Inc. | Sequential sequencing |
EP3068883B1 (en) | 2013-11-13 | 2020-04-29 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read |
US9745614B2 (en) | 2014-02-28 | 2017-08-29 | Nugen Technologies, Inc. | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors |
WO2015164743A2 (en) | 2014-04-24 | 2015-10-29 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Tumor suppressor and oncogene biomarkers predictive of anti-immune checkpoint inhibitor response |
CA2963091A1 (en) | 2014-10-06 | 2016-04-14 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Angiopoietin-2 biomarkers predictive of anti-immune checkpoint response |
CN107106876B (zh) | 2014-10-09 | 2021-06-11 | 丹娜法伯癌症研究院 | 用于治疗免疫失调的多次-可变il-2剂量方案 |
CA2977532A1 (en) | 2015-03-06 | 2016-09-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Pd-l2 biomarkers predictive of pd-1 pathway inhibitor responses in esophagogastric cancers |
US11136409B2 (en) | 2016-09-20 | 2021-10-05 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of AML using USP10 biomarkers and modulators |
EP3634496A4 (en) | 2017-06-06 | 2021-09-08 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | METHOD FOR RISING AWARENESS IN CANCER CELLS AGAINST T-CELL-MEDIATED KILLING BY MODULATING MOLECULAR SIGNAL PATHS |
US11099202B2 (en) | 2017-10-20 | 2021-08-24 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent delivery system |
WO2020223121A1 (en) | 2019-04-30 | 2020-11-05 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for treating cancer using combinations of anti-cx3cr1 and immune checkpoint blockade agents |
CN113275053A (zh) | 2020-02-03 | 2021-08-20 | 帝肯基因组学公司 | 试剂存储系统 |
AU2022229805A1 (en) | 2021-03-02 | 2023-09-21 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods of treating red blood cell disorders |
WO2022261183A2 (en) | 2021-06-08 | 2022-12-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for treating and/or identifying an agent for treating intestinal cancers |
WO2023097119A2 (en) | 2021-11-29 | 2023-06-01 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions to modulate riok2 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4822736A (en) * | 1984-07-05 | 1989-04-18 | Baylor College Of Medicine | Amplification of adenosine deaminase genes in mammalian cells using adenosine, alanosine, uridine, and deoxycoformycin |
US5082779A (en) * | 1987-08-06 | 1992-01-21 | Edison Animal Biotechnology Center/Ohio University | Method of directing transgenic expression in animals using a prolactin promoter |
FR2622207B1 (fr) * | 1987-10-21 | 1990-03-09 | Agronomique Inst Nat Rech | Vecteurs d'integration et d'expression d'un gene heterologue, cellules infectees avec ces vecteurs et procede de production d'une proteine ou de modification genetique d'animaux |
US5064948A (en) * | 1988-02-12 | 1991-11-12 | The United States Of America As Represented By The Department Of Energy | Chromosome specific repetitive dna sequences |
RU1794088C (ru) * | 1991-03-18 | 1993-02-07 | Институт Молекулярной Биологии Ан@ Ссср | Способ определени нуклеотидной последовательности ДНК и устройство дл его осуществлени |
AU1779092A (en) * | 1991-03-20 | 1992-10-21 | Salk Institute For Biological Studies, The | Analytical methods for identifying chromosomal aberrations |
ATE205542T1 (de) * | 1992-03-04 | 2001-09-15 | Univ California | Vergleichende genomhybridisierung |
WO1993021345A1 (en) * | 1992-04-21 | 1993-10-28 | The Regents Of The University Of California | Multicolor in situ hybridization methods for genetic testing |
US5807522A (en) * | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
US5830645A (en) * | 1994-12-09 | 1998-11-03 | The Regents Of The University Of California | Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays |
US5690894A (en) * | 1995-05-23 | 1997-11-25 | The Regents Of The University Of California | High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor |
-
1993
- 1993-12-27 DE DE4344726A patent/DE4344726C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-12-17 EP EP02008759A patent/EP1260594A3/de not_active Withdrawn
- 1994-12-17 WO PCT/EP1994/004208 patent/WO1995018235A1/de active IP Right Grant
- 1994-12-17 CA CA002179605A patent/CA2179605A1/en not_active Abandoned
- 1994-12-17 ES ES95904500T patent/ES2216006T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-17 EP EP95904500A patent/EP0731849B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-17 AU AU13160/95A patent/AU687493B2/en not_active Expired
-
1996
- 1996-06-24 US US08/669,229 patent/US6197501B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-01-31 US US09/773,647 patent/US20010036633A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-12-30 US US10/334,448 patent/US20030157537A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20030157537A1 (en) | 2003-08-21 |
DE4344726A1 (de) | 1995-06-29 |
DE4344726C2 (de) | 1997-09-25 |
US6197501B1 (en) | 2001-03-06 |
EP1260594A3 (de) | 2003-12-03 |
CA2179605A1 (en) | 1995-07-06 |
AU687493B2 (en) | 1998-02-26 |
EP0731849B1 (de) | 2004-03-03 |
AU1316095A (en) | 1995-07-17 |
EP0731849A1 (de) | 1996-09-18 |
WO1995018235A1 (de) | 1995-07-06 |
EP1260594A2 (de) | 2002-11-27 |
US20010036633A1 (en) | 2001-11-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2216006T3 (es) | Disposicion de secuencias de acido nucleico y su uso. | |
Shakoori | Fluorescence in situ hybridization (FISH) and its applications | |
US6664057B2 (en) | Amplicon in the 20q13 region of human chromosome 20 and uses thereof | |
JP2819830B2 (ja) | インサイチューハイブリダイゼーション法 | |
Corcoran et al. | Dysregulation of cyclin dependent kinase 6 expression in splenic marginal zone lymphoma through chromosome 7q translocations | |
Liehr et al. | Current developments in human molecular cytogenetic techniques | |
Kallioniemi et al. | Gene copy number analysis by fluorescencein situhybridization and comparative genomic hybridization | |
JP2019502386A (ja) | グアニジウムチオシアネートを含むハイブリダイゼーション緩衝液 | |
Lichter et al. | Molecular analysis of chromosome aberrations: in situ hybridization | |
Liehr | Cytogenetics and molecular cytogenetics | |
US20090068667A1 (en) | Methods and assays for screening stem cells | |
Murthy et al. | New approaches to fluorescence in situ hybridization | |
WO1997018326A1 (en) | Ultrahigh resolution comparative nucleic acid hybridization to combed dna fibers | |
Duell et al. | Construction of two near-kilobase resolution restriction maps of the 5’regulatory region of the human apolipoprotein B gene by quantitative DNA fiber mapping (QDFM) | |
Singer et al. | Double labelling in situ hybridization using non-isotopic and isotopic detection | |
Sandberg et al. | FISH analysis | |
CA2105467A1 (en) | Analytical methods for identifying chromosomal aberrations | |
Balázs et al. | Detection of CCND1 locus amplification by fluorescence in situ hybridization | |
Cannizzaro et al. | Fluorescent in situ hybridization (FISH) for DNA probes in the interphase and metaphase stages of the cell cycle | |
ES2305992T3 (es) | Kit diagnostico. | |
O’Brien et al. | ‘Chromosomal Rainbows’ detect oncogenic rearrangements of signaling molecules in thyroid tumors | |
Cannizzaro | Fluorescent in situ hybridization of DNA probes in the interphase and metaphase stages of the cell cycle | |
Pack et al. | Chromosomes: Methods for preparation | |
Harrison et al. | Molecular cytogenetics in childhood leukemia | |
du Sart et al. | The Technique of In Situ Hybridization: Principles and Applications |