ES2215991T3

ES2215991T3 - Procedimiento para la proliferacion (in vitro) de precursores de celulas dendriticas y su uso para producir inmunogenos.

Info

Publication number: ES2215991T3
Application number: ES93911581T
Authority: ES
Inventors: Ralph M. Steinman; Kayo Inaba; Gerold Schuler
Original assignee: Rockefeller University; Merix Bioscience Inc
Current assignee: Rockefeller University; Merix Bioscience Inc
Priority date: 1992-04-01
Filing date: 1993-04-01
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2013-04-01
Also published as: CA2133409C; US7923247B2; US20090029469A1; DE69333433T2; US20030134419A1; JP2002507881A; DK0633929T3; CA2133409A1; ATE260971T1; DE69333433D1; JP3649335B2; US5994126A; PT633929E; EP0633929A1; US5851756A; EP0633929B1; US6475483B1

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA PRODUCIR CULTIVOS PROLIFERATIVOS DE PRECURSORES DE CELULAS DENDRITICAS. TAMBIEN SE SUMINISTRA UN METODO PARA PRODUCIR CELULAS DENDRITICAS MADURAS EN UN CULTIVO A PARTIR DE LOS PRECURSORES DE CELULAS DENDRITICAS PROLIFERANTES. LOS CULTIVOS DE CELULAS DENDRITICAS MADURAS SUMINISTRAN UN MEDIO EFECTIVO PARA PRODUCIR NUEVOS ANTIGENOS DEPENDIENTES DE LAS CELULAS T COMPRENDIDOS DE ANTIGENOS MODIFICADOS DE CELULAS DENDRITICAS O DE CELULAS DENDRITICAS IMPULSADAS CON ANTIGENO, DICHO ANTIGENO SE PROCESA Y SE EXPRESA SOBRE LA CELULA DENDRITICA ACTIVADA CON EL ANTIGENO. LOS NUEVOS ANTIGENOS DE LA INVENCION PUEDE UTILIZARSE COMO INMUNOGENOS PARA VACUNAS O PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES. ESTOS ANTIGENOS PUEDEN UTILIZARSE TAMBIEN PARA TRATAR ENFERMEDADES AUTOINMUNES TALES COMO LA DIABETES JUVENIL Y LA ESCLEROSIS MULTIPLE.

Description

Procedimiento para la proliferación (in vitro) de precursores de células dendríticas y su uso para producir inmunógenos.

Esta invención se realizó con el apoyo del Gobierno de los Estados Unidos bajo la subvención NIH AI13013 concedida por el National Institutes of Health. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención. La realización de esta invención estuvo también apoyada por el Gobierno Austríaco a través de las subvenciones NB 4370 (Austrian National Bank) y P 8549M (Austrian Science Foundation).

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento de cultivo de células del sistema inmune. En particular se proporciona un procedimiento para el cultivo de precursores de células dendríticas proliferantes y para su maduración in vitro para dar lugar a células dendríticas maduras. Esta invención se refiere también a antígenos modificados de células dendríticas que son dependientes de linfocitos T, al procedimiento de preparación de los mismos, y a su uso como inmunógenos. Se describen también vacunas, procedimientos para inmunizar animales y seres humanos usando las células dendríticas maduras de la invención y los antígenos modificados.

Antecedentes de la invención

El sistema inmune contiene un sistema de células dendríticas que está especializado en presentar antígenos e iniciar varias respuestas inmunes dependientes de linfocitos T. Las células dendríticas se distribuyen ampliamente a lo largo del cuerpo en diversos tejidos. La distribución de las células dendríticas ha sido revisada en (1). Las células dendríticas se encuentran en órganos no linfoides cerca de las superficies corporales, como en la piel y vías respiratorias, o en regiones intersticiales de órganos como el corazón y el hígado. Las células dendríticas, posiblemente bajo el control del factor estimulante de colonias de macrófagos/granulocitos de citoquina, (en lo sucesivo denominado GM-CSF en la presente memoria), pueden experimentar un proceso de maduración que no asegura la proliferación celular (2, 3). Inicialmente, las células dendríticas procesan y presentan antígenos con mayor probabilidad sobre abundantes moléculas MHC de clase II recién sintetizadas, y después se adquieren funciones fuertes de adhesión célula-célula y accesorias (4, 7). Las células dendríticas pueden migrar a través de la sangre y la linfa hasta órganos linfoides (8-10). Allí, presumiblemente como las células "interdigitantes" (abreviadamente en inglés IDC) del área T (8, 11-13), pueden presentarse los antígenos a los linfocitos T en el acúmulo recirculante (14). Sin embargo, se sabe poco acerca de los precursores de las células dendríticas en los diferentes compartimentos señalados anteriormente.

Es ampliamente conocida la eficacia de las células dendríticas en la liberación de antígenos de un modo que tenga lugar una fuerte respuesta inmune, es decir "inmunogenicidad", pero el uso de estas células se ve perjudicado por el hecho de que existen muy pocas en cualquier órgano dado. En la sangre humana, por ejemplo, aproximadamente el 0,1% de los leucocitos son células dendríticas (25) y hasta este momento no se ha inducido su crecimiento. De manera similar, no se ha reseñado en los estudios previos (20, 21) el desarrollo, en cultivo, de un gran número de células dendríticas de la médula ósea. Un informe más reciente describía el desarrollo de células dendríticas en cultivos de médula suplementada con GM-CSF, sin embargo, no se observó ninguna documentación acerca del origen de las células dendríticas o del uso de agregados proliferantes como fuente enriquecida de células dendríticas. Scheicher y col. J. Immunol. Method. 154:253-264 (1992). Además, Markowiecz y col., J. Clin. Invest. 85:955-961 (1990) reseñó el uso de GM-CSF para promover la diferenciación y supervivencia de células dendríticas sanguíneas periféricas humanas in vitro. Esta referencia, sin embargo, indica que el GM-CSF no promueve la división y proliferación de las células dendríticas. Aunque las células dendríticas pueden procesar antígenos extraños en péptidos que deben reconocer los linfocitos T inmunológicamente activos (4, 6, 7, 14), es decir, las células dendríticas llevan a cabo el fenómeno de "presentación de antígenos", el reducido número de células dendríticas prohíbe su uso en la identificación de péptidos inmunogénicos.

Las células dendríticas en el bazo (15) y linfa aferente (16, 17) no están en el ciclo celular pero se originan a partir de un precursor proliferante. Últimamente, células dendríticas derivan de la médula ósea (15, 16, 18, 19), sin embargo hasta ahora ha sido difícil generar estas células en cultivo con excepción de dos informes que describen su formación en pequeños números (20, 21). Aunque se ha reseñado una célula precursora de la médula ósea, no se han reseñado las condiciones que dirigen su proliferación en cultivo. Steinman, R. "The Dendritic Cell System and Its Role In Immunogenicity", Ann. Rev. Immunol., 9:271-96 (1991). La identificación de células dendríticas proliferantes en la médula ósea, en contraste con la sangre, es difícil porque existen numerosos granulocitos que se desarrollan en respuesta al GM-CSF y estos se amontonan en los cultivos de células dendríticas inmaduras, evitando la maduración de los precursores dendríticos. Se ha reseñado el uso de marcadores de la superficie celular para enriquecer los precursores de células dendríticas de la médula ósea y dar como resultado aumentos sólo modestos porque los marcadores son expresados también por numerosas células de la médula ósea no dendríticas. Bowers, W.E. y Goodell, "Dendritic Cell Oncogeny" Res. Immunol. 140:880-883 (1989).

Se han aislado también de la sangre cantidades de células dendríticas relativamente pequeñas. Vakkila J. y col. "Human Peripheral blood-derived dendritic cells do not produce interleukin 1\alpha, interleukin 1\beta, or interleukin 6" Scand. J. Immunol. 31:345-352 (1990); Van Voorhis W.C. y col., "Human Dendritic Cells", J.Exp. Med., 1172-1187 (1982). Sin embargo, no se ha reseñado la presencia en sangre de precursores de células dendríticas y hasta 1989 la relación entre células dendríticas sanguíneas y células dendríticas maduras en otros tejidos era incierta. Además, se reconoció que las células dendríticas eran "raras y difíciles de aislar y hasta ahora no se ha demostrado que den lugar a DC (células dendríticas) en tejidos periféricos". MacPherson G.G. "Lymphoid Dendritic Cells: Their life history and roles in immune responses", Res. Immunol. 140:877-926 (1989).

El factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) es un factor que modula la maduración y función de las células dendríticas. Witmer- Pack y col., "Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is essential for the viability and function of cultured murine epidermal Langerhans cells". J. Exp. Med. 166:1484-1498 (1987). Heufler C. y col., "Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and interleukin 1 mediate the maturation of murine epidermal Langerhans cells into potent immunostimulatory dendritic cells", J. Exp. Med. 167:700-705 (1988). La maduración de células dendríticas estimulada por el factor GM-CSF in vitro sugiere que la presencia del factor GM-CSF en un cultivo de precursores de células dendríticas mediaría en la maduración para dar lugar a células inmunológicamente activas, pero todavía queda por resolver el reto importante de conseguir el crecimiento extensivo de células dendríticas.

Las respuestas inmunes dependientes de T se caracterizan por la activación de linfocitos T auxiliares en la producción de anticuerpos mediante células B. Una ventaja de las respuestas inmunes dependientes de T respecto de las independientes de T es que las respuestas dependientes de T tienen memoria, es decir, las células permanecen cebadas para responder al antígeno con una rápida producción de anticuerpos incluso en ausencia de antígeno y la respuesta inmune es por lo tanto "susceptible de reinmunización". Las respuestas inmunes independientes de T son, por el contrario, relativamente pobres en niños y carecen de una respuesta reinmunizante cuando se administra repetidamente un antígeno independiente de T. La memoria inmunológica de los linfocitos T probablemente refleja dos consecuencias del primer segmento "primario" o "sensibilizador" de la respuesta inmune: (a) un número expandido de linfocitos T específicos de antígeno que se desarrollan como respuesta a las células dendríticas que soportan antígenos, y (b) las propiedades funcionales potenciadas de los linfocitos T individuales que tiene lugar después del cebado de las células dendríticas [Inaba y col., "Resting and sensitized T lymphocytes exhibit distinct stimulatory (antigen presenting cell) requirements for growth and lymphokine release"; J. Exp. Med. 160:868-876 (1984); Inaba and Steinman, "Protein-specific helper T lymphocyte formation initiated by dendritic cells", Science 229: 475-479 (1985); Inaba y col., "Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction", Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7686-7690 (1985)].

Ciertos tipos de antígenos provocan de forma característica respuestas de anticuerpos dependientes de linfocitos T mientras que otros provocan una respuesta independiente de linfocitos T. Por ejemplo, los polisacáridos generalmente provocan una respuesta inmune independiente de linfocitos T. No hay una respuesta de recuerdo y por lo tanto no se da una protección a una infección posterior con el antígeno polisacárido. Las proteínas, sin embargo, provocan una respuesta dependiente de linfocitos T en los niños. El desarrollo de vacunas conjugadas que contienen un polisacárido acoplado covalentemente a una proteína convierte la respuesta independiente de linfocitos T del polisacárido en una respuesta dependiente de linfocitos T. Por desgracia, se sabe poco acerca de los sitios de las proteínas que les confieren su carácter dependiente de linfocitos T, esto por lo tanto dificulta el diseño de agentes inmunógenos más específicos.

Como se mencionó anteriormente, las células dendríticas desempeñan un papel crucial en el inicio de respuestas dependientes de linfocitos T. Las células dendríticas se unen y modifican a los antígenos de forma que el antígeno modificado cuando se presenta en la superficie de la célula dendrítica puede activar a los linfocitos T para que participen en la producción eventual de anticuerpos. La modificación de antígenos por las células dendríticas puede, por ejemplo, incluir la fragmentación de una proteína para producir péptidos que presenten regiones que son capaces específicamente de activar a los linfocitos T.

Los acontecimientos por los que las células fragmentan a los antígenos en péptidos, y después presentan estos péptidos en asociación con productos del complejo de histocompatibilidad principal, (MHC), se denominan "presentación de antígeno". El MHC es una región de genes altamente polimórficos cuyos productos se expresan sobre las superficies de una diversidad de células. Los antígenos de MHC son los principales determinantes del rechazo a los trasplantes. Se han identificado dos tipos diferentes de productos génicos de MHC, moléculas de MHC de clase I y de clase II. Los linfocitos T reconocen antígenos extraños unidos a una sola molécula de MHC de clase I o de clase II específica. Los patrones de asociación de antígenos con moléculas de MHC de clase I o de clase II determinan qué linfocitos T están estimulados. Por ejemplo, los fragmentos de péptidos derivados de proteínas extracelulares normalmente se unen a moléculas de MHC de clase II, mientras que las proteínas que se transcriben de forma endógena en células dendríticas generalmente se asocian con moléculas de MHC de clase I sintetizadas recientemente. Como consecuencia, las proteínas sintetizadas de forma exógena y endógena son reconocidas típicamente por poblaciones diferentes de linfocitos T.

Las células dendríticas son células especializadas en la presentación de antígenos en la respuesta inmune de la totalidad de los animales (14,31). De nuevo, sin embargo, la capacidad de usar las células dendríticas en la identificación y extracción de los péptidos inmunogénicos está dificultada por el escaso número de estas células especializadas en la presentación de antígenos.

La captación de partículas es una actividad especializada de fagocitos mononucleares y polimorfonucleares. Las células muertas, complejos inmunes, y microorganismos son todos ávidamente internados. Después de la fusión con lisosomas ricos en hidrolasa, las partículas ingeridas se degradan (60, 61). Esta degradación debe ser al nivel de aminoácidos (62, 63) y sacáridos permeables, de lo contrario el aparato vacuolar se hincharía con materiales indigeribles (64, 65). Tales funciones digestivas y de depuración de fagocitos contribuyen a la curación de las heridas, remodelación de los tejidos y a la defensa del huésped.

Otra consecuencia de la endocitosis, el procesamiento de antígenos mediante células que presentan antígenos (APC), difiere en muchos aspectos de la función depuradora de la fagocitosis. En primer lugar, el procesamiento requiere la generación de péptidos de al menos 8-18 aminoácidos de longitud (66, 67), mientras que la depuración provoca la digestión de los aminoácidos (62, 62). En segundo lugar, la presentación requiere la unión de péptidos a los productos de MHC de clase II (6, 68), mientras que la depuración no requiere productos de MHC. En tercer lugar, la presentación de antígenos puede funcionar a una baja capacidad, ya que sólo necesitan generarse unos pocos cientos de moléculas de ligando para una estimulación exitosa de ciertos híbridos T-T (69, 70) y poblaciones de linfocitos T primarios (71). Durante la depuración, los fagocitos eliminan y destruyen fácilmente cientos de miles de moléculas proteicas cada hora (63). Por último, la presentación de antígenos se lleva a cabo mejor por células ricas en MHC de clase II pero muestran poca actividad fagocítica y pocos lisosomas, es decir, células dendríticas y células de tipo B, mientras que los fagocitos (macrófagos y neutrófilos) a menudo presentan bajos niveles de clase II y abundantes lisosomas. Estas observaciones, junto con la identificación de especializaciones antigénicas dentro del sistema endocítico de células dendríticas y células de tipo B, han llevado a la insinuación de que la maquinaria requerida para la presentación antigénica puede diferir de la requerida para la depuración, tanto cuantitativamente como cualitativamente (31).

En el caso de las células dendríticas, han existido indicaciones de que estas APC son en algún momento de su vida capaces de actividad fagocítica. Pugh y col., reseñaron inclusiones tintadas con coloración de Feulgen en algunas células dendríticas de la linfa aferente y sugirieron que había tenido lugar la fagocitosis de otras células antes de la entrada en la linfa (16). Fossum reseñó inclusiones fagocíticas en las células dendríticas interdigitantes de las áreas de linfocitos T en ratones que rechazaban leucocitos alogénicos (71). Reis e Sousa y col. (74) encontraron que células Langerhans epidérmicas aisladas recientemente, que son células dendríticas inmaduras pero no proliferantes, internan pequeñas cantidades de ciertos particulados. Ningún informe, sin embargo, demuestra o sugiere la aparición de fagocitosis cuando se administran partículas a cultivos de células dendríticas proliferantes.

La inyección de células dendríticas pulsadas con linfocitos patogénicos en mamíferos para provocar una respuesta inmune activa frente al linfoma es el asunto de la solicitud de patente PCT WO 91/13632. Además, Francotte y Urbain, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 82:8149 (1985) reseñaron que células dendríticas de ratón, pulsadas in vitro con virus e inyectadas de nuevo en ratones, potencian la respuesta primaria y la respuesta secundaria al virus. Ni el informe de Francotte y Urbain ni la solicitud de patente WO 91/13632 proporcionan un procedimiento práctico para usar las células dendríticas como un adyuvante para activar la respuesta inmune porque ambos procedimientos dependen de células dendríticas obtenidas del bazo, una fuente impracticable de células para la mayoría de terapias o procedimientos de inmunización. Además, ningún informe proporciona un procedimiento para obtener células dendríticas en cantidades suficientes para ser clínicamente útiles.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona

(1) un procedimiento para producir una población de precursores de células dendríticas comprendiendo este procedimiento (a) proporcionar una fuente tisular que comprende precursores de células dendríticas; (b) tratar la fuente tisular de (a) para aumentar la proporción de precursores de células dendríticas para obtener una población de células adecuada para un cultivo in vitro; (c) cultivar la fuente tisular sobre un sustrato en un medio de cultivo que comprende GM-CSF para obtener células no adherentes proliferantes y agrupaciones de células; (d) subcultivar las células no adherentes y las agrupaciones de células para producir agregados celulares que comprenden precursores de células dendríticas proliferantes; y (e) subcultivar en serie los agregados celulares una o más veces para enriquecer la proporción de precursores de células dendríticas; y

(2) un procedimiento de producción de una población de células dendríticas maduras a partir de cultivos celulares proliferantes, comprendiendo el procedimiento (a) proporcionar una fuente tisular que comprende precursores de células dendríticas; (b) tratar la fuente tisular de (a) para aumentar la proporción de precursores de células dendríticas con el fin de obtener una población de células adecuada para un cultivo in vitro; (c) cultivar la fuente tisular sobre un sustrato en un medio de cultivo que comprende GM-CSF para obtener células no adherentes y agrupaciones de células; (d) subcultivar las células no adherentes y las agrupaciones de células para producir agregados celulares que comprenden precursores de células dendríticas proliferantes; y (e) subcultivar en serie los agregados celulares una o más veces para enriquecer la proporción de precursores de células dendríticas; y (f) continuar el cultivo de precursores de células dendríticas durante un periodo de tiempo suficiente para permitirles madurar hasta células dendríticas maduras.

Para reducir la proporción de células precursoras no dendríticas, la fuente tisular puede tratarse previamente antes de cultivar la fuente tisular sobre un sustrato para obtener las células no adherentes o durante las etapas tempranas del cultivo. Las fuentes tisulares preferidas para la práctica de la invención son la médula ósea y, en particular, la sangre. Los procedimientos (1) y (2) de la invención pueden incluir la etapa de incrementar la proporción de células dendríticas presentes en la fuente tisular tratando previamente al individuo con una sustancia para estimular la hematopoyesis.

Cuando se usa la médula ósea como fuente tisular el tratamiento previo comprende la matanza de células que expresan antígenos que no se expresan sobre células precursoras dendríticas poniendo en contacto la médula ósea con anticuerpos específicos de antígenos no presentes sobre las células precursoras dendríticas en un medio que comprende complemento. La retirada de precursores de células no dendríticas no deseadas puede llevarse a cabo también adsorbiendo las células no dendríticas no deseadas o sus células precursoras sobre un soporte sólido.

Los precursores de células dendríticas y las células dendríticas que se obtienen mediante los procedimientos (1) y (2) pueden usarse terapéuticamente y pueden también usarse para preparar nuevos antígenos terapéuticos.

Los procedimientos (1) y (2) de la invención pueden usarse para preparar células dendríticas activadas por antígeno. En dichos procedimientos las células dendríticas activadas por antígeno han sido expuestas a antígeno y expresan antígenos modificados para su presentación a y activación de linfocitos T.

Los procedimientos (1) y (2) de la invención son también adecuados para proporcionar antígenos novedosos. Dichos antígenos se producen exponiendo un antígeno a cultivos de células dendríticas preparadas de acuerdo con el procedimiento de la invención en el que el antígeno es modificado por las células dendríticas para producir antígenos modificados que son fragmentos inmunogénicos del antígeno nativo o no modificado y dichos fragmentos activan a los linfocitos T.

Estos antígenos pueden usarse para inmunizar animales y seres humanos y prevenir o tratar enfermedades.

Los precursores de células dendríticas son también adecuados para preparar antígenos, por ejemplo proporcionando células dendríticas precursoras a partir de una población de células precursoras capaces de proliferar, poniendo en contacto las células precursoras con un antígeno durante un periodo de tiempo suficiente para permitir a los precursores de células dendríticas fagocitar el antígeno y obtener precursores de células dendríticas que contienen el antígeno; cultivando los precursores de células dendríticas que contienen el antígeno en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para que el antígeno sea procesado y presentado por los precursores de células
dendríticas.

Los antígenos procesados por los precursores de células dendríticas como resultado de la fagocitosis pueden por ellos mismos usarse solos o en combinación con adyuvantes que incluyen precursores de células dendríticas para provocar una respuesta inmune en un individuo frente al antígeno.

La producción de precursores de células dendríticas se aumenta cultivando los precursores en una cantidad suficiente del factor GM-CSF y otras citoquinas para promover la proliferación de los precursores de células dendríticas. Otras citoquinas incluyen, pero no se limitan a, G-CSF, M-CSF, TNF-\alpha, Interleuquina-3, e Interleuquina-1\alpha, Interleuquina-1\beta, Interleuquina 6 y el factor de célula troncal (abreviadamente en inglés SCF).

Además, los antígenos auto-péptidos pueden producirse pulsando las células dendríticas obtenidas mediante el procedimiento de la invención con una proteína frente a la que un individuo ha generado una respuesta inmune y extrayendo el auto-péptido o autoantígeno relevante.

Dicho antígeno auto-péptido puede usarse para tratar enfermedades autoinmunes, por ejemplo tratando un individuo con cantidades terapeúticamente eficaces de auto-péptidos producidos de acuerdo con el procedimiento de la invención para inducir tolerancia a las auto-proteínas.

Se proporciona también dicho tratamiento de enfermedades autoinmunes que comprende administrar a un individuo en necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de células dendríticas activadas por antígeno donde el antígeno es una auto-proteína o un autoantígeno.

Las enfermedades autoinmunes que pueden tratarse incluyen diabetes juvenil, miastenia grave, y esclerosis múltiple.

De forma similar, pueden tratarse también las enfermedades inflamatorias en las que la patogénesis implica respuestas inmunes mediadas por linfocitos T exageradas tales como las presentes en dermatitis atópica y dermatitis por contacto.

Las células dendríticas preparadas de acuerdo con el procedimiento de la invención son también adecuadas para proporcionar un antígeno a un huésped, por ejemplo exponiendo un antígeno a un cultivo de células dendríticas preparadas de acuerdo con el procedimiento de esta invención para producir células dendríticas activadas por antígeno seguido de la inoculación del huésped con las células dendríticas activadas por antígeno.

Además, los linfocitos T pueden activarse usando las células dendríticas proliferantes para capturar antígenos proteicos, virales y microbianos en una forma inmunogénica in situ y después presentar estos antígenos de manera potente a los linfocitos T in vitro o in situ.

Las células dendríticas precursoras y maduras pueden usarse para presentar productos de MHC de clase I y de clase II con péptidos de antígeno.

Las células dendríticas o los precursores dendríticos pueden usarse como vehículos para la inmunización activa y la inmunoterapia in situ. Los antígenos o las células dendríticas activadas por antígeno descritas anteriormente puede usarse como vacunas.

Un objeto de esta invención es proporcionar un procedimiento para cultivar precursores de células dendríticas in vitro de forma que estos evolucionen hasta células dendríticas maduras adecuadas para uso como inmunógenos o adyuvantes cuando se combinan con un antígeno.

Es también un objetivo de esta invención proporcionar precursores de células dendríticas capaces de fagocitar material antigénico para ser procesado y presentado por los precursores de células dendríticas.

Otro objeto de esta invención es proporcionar una fuente conveniente y práctica de cantidades suficientes de células dendríticas y precursores de células dendríticas para que sean útiles en el tratamiento o prevención de enfermedades.

Leyendas de las figuras

Fig. 1. Plan de flujo para inducir "colonias" de células dendríticas.

Fig. 2. Análisis FACS de células dendríticas liberadas de agregados proliferantes. Se muestran varios anticuerpos monoclonales (mAb) que reconocen diversos determinantes de superficie celular sobre precursores de células dendríticas (23, 24, 28). Excepto los productos de MHC de clase I y de clase II, el fenotipo de las células liberadas es homogéneo. La coloración con mAb no primario fue idéntica a RB6 y RA3.

Fig. 3. Análisis FACS de precursores de células dendríticas que podrían desalojarse mediante el uso de una pipeta Pasteur de los agregados proliferantes, y de las células dendríticas liberadas espontáneamente en cultivo. Los mAb son: anti-MHC de clase I M1/42 [ATCC (American Type Culture Collection) nº TIB 126]; anti-célula interdigitante NLDC145 (13); anti-MHC de clase II M5/114 [ATCC nº TIB 120]; anti-célula dendrítica 33D1 [ATCC nº TIB 227]; anti-thy-1 B5-5. La coloración con mAb anti-MHC es bimodal, pero la fracción de células liberadas de las células dendríticas es la más rica en expresión de MHC de clase I y de clase II.

Fig. 4. Actividad estimulante de MLR de poblaciones aisladas de los cultivos de sangre de ratón estimulada con GM-CSF [véase texto].

Fig. 5. Desarrollo progresivo de la actividad estimulante de MLR en médula ósea cultivada en presencia de GM-CSF.

Se cultivaron en GM-CSF células de la médula ósea exentas de precursores Ia-negativos, linfocitos T y células de tipo B, reemplazándose cada dos días los ¾ del medio. En cada punto temporal, se desalojaron las células pipeteando suavemente. Después de la irradiación, se aplicaron dosis medidas de células de la médula a 3 x 10^{5} linfocitos T alogénicos [C57BL/6, izquierda] o singénicos [BALB/C x DBA/2 F1] y se cultivaron durante 4 días en la MLR. La captación de ^{3}H-TdR se midió a las 80-94 horas [los valores son medias de valores triplicados con barra para el error típico].

Fig. 6. Propiedades físicas de las células estimulantes de MLR que se desarrollan en cultivos de médula ósea suplementada con GM-CSF [véase texto].

A. Cultivos similares a los de la Fig. 5 se separaron en fracciones no adherentes [símbolos vacíos] y fracciones adherentes de forma holgada [símbolos rellenos], siendo estas últimas células que podrían desalojarse mediante pipeteo suave sobre la monocapa. Para las separaciones del día 4, se retiran por aclarado el día 2 células adherentes de forma holgada [principalmente granulocitos], y para la separación del día 6, se retiran por aclarado los granulocitos en el día 2 y día 4. Las células se irradiaron y se aplicaron en dosis medidas a los linfocitos T alogénicos como en la Fig. 5.

B. En los puntos temporales indicados, se desalojaron células libres y agregados celulares de la monocapa estromal y se separaron por sedimentación 1g (en condiciones de gravedad normal). Los agregados se cultivaron durante un día para proporcionar células liberadas. Estas células se irradiaron y se ensayaron como estimuladores de MLR, como lo fueron las células firmemente adherentes que se desalojaron en presencia de EDTA 10 mM [cuadrados vacíos].

Fig. 7. Citofluorometría celular del desarrollo de células Ia-positivas a partir de agregados dentro de cultivos de médula ósea suplementada con GM-CSF.

Se compararon cultivos de médula ósea estimulada con GM-CSF [izquierda, no fraccionados] con agregados celulares unidos de forma holgada [centro] y células liberadas de los agregados después del cultivo durante toda la noche [derecha]. Las células se recogieron el día 4 o el día 6, de forma que las células liberadas se analizaron el día 5 y el día 7. Las células se colorearon con mAb no primario [no 1ario], o con mAb de granulocitos [RB-6] o productos de MHC de clase II [B21-2] seguido de Ig de FITC-ratón anti-rata.

Fig. 8. Análisis citofluorométrico del fenotipo celular detallado de las células Ia-positivas liberadas a partir de los agregados de células dendríticas en crecimiento. Los granulocitos Ia-negativos contaminantes se excluyeron basándose en la inferior dispersión de luz hacia delante, de forma que uno podría examinar la expresión de muchos antígenos de superficie sobre las células mayores usando mAb anti-ratón de rata y hámster (7, 17) tal y como se indicó.

Fig. 9. Cuantificación de las células en desarrollo que soportan los antígenos gránulos restringidos a células dendríticas 2A1 y M342.

Las células dendríticas contienen gránulos intracelulares que reaccionan con los mAb tales como M342 y 2A1 (34). Se cultivaron en GM-CSF no-linfocitos Ia-negativos procedentes de médula de ratón, y los granulocitos adherentes de forma holgada se retiraron por aclarado en el día 2 y en el día 4. Los datos del día 2 y del día 4 representan células que podrían ser desalojadas por pipeteo, mientras que los datos del día 3 y de los días 5-8 eran células liberadas de la monocapa. En cada uno de los puntos temporales indicados, se contaron al menos 500 células en citoespines preparados y coloreados. [véase texto]. Cuando comienzan los cultivos a 5 x 10^{5} células/cm^{2} y se alimentan cada 2 días reemplazando los ¾ del volumen con medio recién preparado, la producción de células totales y células Ia^{+} fue en el día 2, 1,05 x 10^{6} y 2,1 x 10^{4}, en el día 4 1,81 x 10^{6} y 2,12 x 10^{5}, y en el día 6, 1,54 x 10^{6} y 3,21 x 10^{5}.

Fig. 10. Relaciones progenitor-progenie en células dendríticas en crecimiento. Se separaron agregados en crecimiento en el día 4 de cultivos de médula ósea y se pulsaron con ^{3}H-TdR a 0,1 \muCi/ml, 3 x 10^{5} células/pocillo, durante 12 horas. Todos los pocillos se reemplazaron con medio recién preparado y se volvieron a cultivar durante 1, 2 ó 3 días de persecución. La producción de células liberadas durante la persecución fue 2,0, 2,9, y 3,0 x 10^{5} respectivamente por pocillo. El contenido de células Ia^{+} fue del 28% después del pulso, y 47%, 55%, y 62% en los días 1, 2, y 3 respectivamente. Los datos se muestran como porcentaje de células radiomarcadas, donde el relleno de barras representa las células que expresan el antígeno de la célula gránulo 2A1 de células dendríticas maduras.

Fig. 11. Diagrama de la ruta propuesta de desarrollo de las células dendríticas en cultivos de médula suplementada con GM-CSF. Se forma un agregado proliferante a partir de un precursor que se une al estroma celular o es adherente por sí mismo. Durante la diferenciación de células dendríticas, que es evidente en la periferia del agregado y en células liberadas de la misma, existe un aumento progresivo en las prolongaciones celulares, MHC de clase II, antígeno de superficie NLDC-145, y antígeno intracelular M342 y 2A1 [véase texto] y una disminución progresiva en la adherencia al plástico.

Fig. 12. Coloraciones Diff-Quick en células dendríticas en desarrollo que han sido expuestas a látex y carbono.

A. Un agregado de células dendríticas en desarrollo se citocentrifugó después de 20 horas de exposición a esferas de látex 2u. Muchas células en el agregado se marcan con las partículas de látex uniformes [flechas].

B. De igual forma que en A, pero a los cultivos se les sometió a persecución durante un día para permitir la producción de células dendríticas individuales maduras. Muchas de las células dendríticas liberadas contienen las esferas de látex uniformes y translúcidas dispuestas alrededor de una centroesfera de corte claro [flechas].

C. De igual forma que en A y B, pero los agregados se pulsaron con carbono coloidal y después se sometieron a persecución durante un día en medio exento de carbono. La centroesfera de alguna de las células dendríticas maduras que se liberan del agregado contiene gránulos endocíticos pequeños pero de corte claro de trazador fagocítico indigerible negro [flechas].

D. Se expusieron células dendríticas maduras frente a carbono después de haberse producido a partir de agregados proliferantes. No se evidencian depósitos de carbono.

Fig. 13. Captación de BCG (preparación a base de bacterias vivas) en células dendríticas en desarrollo usando marcadores de dos colores para bacilos y antígenos de células dendríticas resistentes a ácidos. Se expusieron agrupaciones de células dendríticas en desarrollo [cultivos de médula de 6 días inducidos con GM-CSF] durante 20 horas a BCG. Se lavaron las monocapas y se sometieron a persecución en medio con GM-CSF durante 2 días. Las células se disociaron, se marcaron con mAb FITC (isotiocianato de fluoresceína)-anti-I-A, y las células enriquecidas con clase II se aislaron por aislamiento de células en FACS (fluorescence activated cell sorting) [la mayoría de las células en el cultivo están enriquecidas con clase II como se mostró previamente (16)]. Las células aisladas se citocentrifugaron, se colorearon con auramina-rodamina para visualizar BCG asociado a célula, y se marcaron doblemente con un mAb diferente e inmunoperoxidasa. Los paneles de la izquierda y derecha de cada par son la vista del contraste de fase y la vista resistente a ácido respectivamente. Las flechas de la izquierda indican la localización de los bacilos de la derecha. La marca para la clase II, [I-A y I-E, M5/114] esboza las prolongaciones celulares mejor que el anticuerpo NLDC-145 restringido a célula dendrítica.

Fig. 14. Microscopía electrónica de BCG en células dendríticas.

Como en la Fig. 2, se añadió BCG a cultivos de médula ósea del día 6 estimuladas con GM-CSF durante un día. Después del lavado y de dos días más de cultivo, las células liberadas se procesaron por microscopía electrónica.

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A, B. Vistas de baja potencia para mostrar las células dendríticas típicas con numerosas prolongaciones y varios BCG fagocitados [flechas].

C, D. Vistas de mayor potencia para mostrar membranas fagosomales frente a BCG, así como organelas de la centroesfera de célula dendrítica incluyendo vacuolas endocíticas [E], aparato de Golgi [GA], y pequeñas vesículas con un núcleo denso[*].

Fig. 15. Presentación de antígeno a linfocitos T cebados con CFA/ cebados con IFA.

Los linfocitos T se purificaron a partir de ganglios linfáticos drenantes de las patas que se habían cebado con adyuvante de Freund [CFA] completo o [IFA] incompleto. Se enumeran las diferentes células APC. Las células dendríticas maduras son cultivos de médula ósea de día 8, y células dendríticas inmaduras proceden de cultivos de los días 5-6.

Fig. 16. Presentación de antígeno a linfocitos T de ganglios linfáticos no atacados por inmunógeno in situ.

Se pulsaron con BCG cultivos en crecimiento de células dendríticas de la médula ósea en los días 5-6, y se usaron inmediatamente o después de un cultivo de persecución de dos días para activar los linfocitos T. Las poblaciones se inyectaron en las patas de ratones preinmunes sin adyuvantes artificiales. Cinco días después los ganglios linfáticos drenantes se recogieron y se estimularon in vitro con dosis medidas de PPD o BSA (las células dendríticas habían crecido con suero de ternera fetal), el BSA servía como un antígeno no particulado. Los datos son medias y errores típicos para grupos de 5 ratones, cada uno estudiado separadamente. Los ganglios linfáticos de control no expuestos a células dendríticas pulsadas con BCG no respondieron a PPD o a BSA (< 2000 cpm).

Fig. 17. Presentación de antígeno a células de bazo no atacadas por inmunógeno in situ.

Se pulsaron con BCG cultivos en crecimiento de células dendríticas de médula ósea en los días 5-6, (inmaduras), en los días 7-8 (maduras), o en los días 5-6 seguido de una persecución de dos días. Se inyectaron 10^{6} células de cada grupo por vía i.v. en grupos de ratones. Cinco o diez días más tarde, las células del bazo se cultivaron in vitro con dosis medidas de PPD o BSA como antígeno. Como las células dendríticas se cultivaron en FCS (suero de ternera fetal), el uso de BSA sirve como control para asegurar que todas las poblaciones de células dendríticas eran inmunogénicas de forma comparable in vivo. El bazo no cebado no respondió a BSA o a PPD.

Figs. 18A, B y C: Ensayo de reacción con leucocitos mezclados (MLR) de células dendríticas humanas producidas de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 6. Se añadieron dosis medidas de células irradiadas (30 a 30.000 en diluciones seriadas de orden 3) a 2 x 10^{5} linfocitos T exentos de células accesorias. La respuesta de linfocitos T de las células que habían sido cultivadas en ausencia de citoquina añadida (X); y en presencia de GM-CSF (\medcirc); GM-CSF + IL-1\alpha (\medbullet);GM-CSF + TNF-\alpha (\Box); GM-CSF + TNF-\alpha + IL-1\alpha (\blacksquare); GM-CSF + IL-3 (\Delta); y GM-CSF + IL-3 + IL-1 (\blacktriangle) se midió con un pulso de 16 horas de 3H-timidina en el día 5. La respuesta de las células no dendríticas se muestra también en C, (\blacklozenge). Se presentan tres experimentos diferentes A, B y C. Los pacientes que proporcionaron las células para los experimentos A y B se trataron previamente con G-CSF; el paciente del experimento C se trató previamente con GM-CSF. Se usaron citoquinas con las siguientes concentraciones: rhu GM-CSF, 400 ó 800 U/ml; rhu IL-1\alpha, 50 unidades de LAF (factor activador linfocitario)/ml (IL-1\alpha estaba presente en los cultivos sólo durante las últimas 24 horas antes de la recogida de las células); rhu TNF-\alpha 50 U/ml; y rhu IL-3 100 U/ml. Los valores del eje X representan el número de células dendríticas excepto el valor X donde las células dendríticas estaban ausentes y el número es equivalente al número de células totales. Las desviaciones típicas de los cultivos triplicados fueron <10% de la media, y no se muestran.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para la producción de cultivos de precursores de células dendríticas proliferantes que maduran in vitro para dar células dendríticas maduras. Las células dendríticas y los precursores de células dendríticas producidos de acuerdo con el procedimiento de la invención pueden producirse en cantidades adecuadas para diversas intervenciones inmunológicas para la prevención y tratamiento de enfermedades.

El material de partida para el procedimiento de producción de precursores de células dendríticas y células dendríticas maduras es una fuente tisular que comprende precursores de células dendríticas cuyas células precursoras son capaces de proliferar y madurar in vitro en células dendríticas cuando se tratan de acuerdo con el procedimiento de la invención. Dichas células precursoras son no adherentes y típicamente no se marcan con marcadores mAb encontrados en células dendríticas maduras tales como antígenos Ia, antígenos 2A1 y M342 (34, 44) y el antígeno fuente de célula interdigitante NLDC145 (13). Preferiblemente dichas fuentes tisulares son el bazo, linfa aferente, médula ósea y sangre. Las fuentes tisulares más preferidas son la médula ósea y la sangre. La sangre es también una fuente tisular preferida de células precursoras porque es fácilmente accesible y podría obtenerse en cantidades relativamente grandes.

Para aumentar el número de células precursoras dendríticas en animales, incluyendo seres humanos, es preferible tratar dichos individuos con sustancias que estimulan la hematopoyesis. Dichas sustancias incluyen G-CSF, GM-CSF y pueden incluir otros factores que promueven la hematopoyesis. Un experto en la técnica puede determinar la cantidad de factor hematopoyético a administrar controlando el diferencial celular de los individuos a los que se les va a administrar el factor. Típicamente, las dosificaciones de factores tales como G-CSF y GM-CSF serán similares a la dosificación usada para tratar individuos que se recuperan de un tratamiento con agentes citotóxicos. Preferiblemente, GM-CSF o G-CSF se administran durante de 4 a 7 días a dosis convencionales antes de la retirada del tejido fuente para aumentar la proporción de precursores de células dendríticas. (Editorial, Lancet, 339: 14 de Marzo, 1992, 648-649). Por ejemplo, los autores han determinado que dosificaciones de G-CSF de 300 microgramos diariamente durante de 5 a 13 días y dosificaciones de GM-CSF de 400 microgramos diariamente durante de 4 a 19 días dan como resultado rendimientos significativos de células dendríticas.

Sangre del cordón umbilical o fetal, que es también rica en factores de crecimiento es también una fuente preferida de sangre para obtener células dendríticas precursoras.

De acuerdo con un procedimiento de la invención, la fuente tisular puede tratarse antes del cultivo para enriquecer la proporción de células precursoras dendríticas respecto a otros tipos celulares. Dicho tratamiento previo puede también retirar células que pueden competir con la proliferación de células precursoras dendríticas o inhibir su proliferación o supervivencia. Puede usarse también un pretratamiento para hacer la fuente tisular más adecuada para el cultivo in vitro. El procedimiento de tratamiento probablemente será específico del tejido dependiendo de la fuente tisular particular. Por ejemplo, si se usan el bazo o la médula ósea como una fuente tisular se trataría en primer lugar de forma que obtengan células individuales seguido de técnicas de separación celular adecuadas para separar leucocitos de otros tipos de células. El tratamiento de la sangre implicaría técnicas de separación celular para separar leucocitos de otros tipos celulares incluyendo los eritrocitos (RBC) que son tóxicos. La retirada de RBC puede llevarse a cabo mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Además, pueden usarse antitoxinas tales como el anticuerpo VIE-64 monoclonal anti-eritroide que se unen a RBC para facilitar la unión de RBC a un sustrato para su retirada usando un a técnica de "panning".

De acuerdo con un procedimiento preferido de esta invención, cuando se usa médula ósea como fuente tisular, se retiran las células de tipo B antes del cultivo de la médula ósea en GM-CSF. Aunque las células de tipo B y las pre-células de tipo B no crecen en respuesta a GM-CSF, representan aproximadamente el 50% de la suspensión medular inicial y por lo tanto excluyen el uso de coloración con anticuerpos monoclonales anti-Ia para enumerar de un modo rápido las células dendríticas. De forma adicional, los granulocitos son sensibles a GM-CSF y proliferan fácilmente en presencia de GM-CSF. Como tal, las células de tipo B y granulocitos enmascaran la presencia de precursores de células dendríticas. Las células B pueden expresar los antígenos granulares M342 y 2A1 que son marcadores útiles para distinguir las células dendríticas de los macrófagos y granulocitos. Además, los granulocitos tienen tendencia a hacer crecer en exceso los cultivos y competir por el GM-CSF disponible. El procedimiento más preferido de esta invención es retirar la mayor parte de los granulocitos no adherentes recién formados de los cultivos de médula ósea mediante lavados suaves durante los primeros 2-4 días en cultivo.

Preferiblemente, en una forma de pretratamiento se matan las células que compiten y enmascaran la proliferación de las células dendríticas precursoras. Dicho pretratamiento comprende matar a las células que expresan antígenos que no se expresan sobre las células precursoras dendríticas poniendo en contacto la médula ósea con anticuerpos específicos de los antígenos no presentes sobre las células precursoras dendríticas en un medio que comprende complemento. Otra forma de pretratamiento para retirar las células no deseadas adecuada para el uso con esta invención es absorber las células precursoras no deseadas o sus precursores sobre un soporte sólido usando anticuerpos específicos de antígenos expresados sobre las células no deseadas. Los expertos en la técnica conocen varios procedimientos de adsorción de células sobre soportes sólidos de varios tipos y son adecuados para su uso con esta invención. Por ejemplo, las células no deseadas pueden retirarse mediante "panning" usando una superficie plástica tal como una placa petri. De forma alternativa, otros procedimientos que están entre aquellos adecuados incluyen la adsorción de células sobre cabezas magnéticas para separarlas mediante una fuerza magnética; o inmunoesferas para separarlas por gravedad. Las células no adsorbidas que contienen una proporción aumentada de precursores de células dendríticas pueden separarse después de las células absorbidas sobre el soporte sólido mediante medios conocidos incluyendo "panning". Esta etapa del pretratamiento sirve para un doble propósito: destruyen o renuevan los precursores de células no dendríticas en el cultivo mientras que aumentan la proporción de precursores de células dendríticas que compiten por GM-CSF en el cultivo.

Además, las células Ia-positivas, es decir, células de tipo B y macrófagos se matan preferiblemente cultivando las células en presencia de una mezcla de anticuerpos anti-Ia, preferiblemente anticuerpos monoclonales, y complemento. Las células dendríticas maduras que están también presentes en la médula ósea se matan también cuando las células de la médula ósea se cultivan en presencia de anticuerpos anti-Ia, sin embargo, estas células dendríticas maduras aparecen en cantidades tan bajas en la sangre y médula ósea y posee marcadores antigénicos tan distintos procedentes de precursores de células dendríticas que la matanza de estas células dendríticas maduras no producirá significativamente la proliferación y rendimiento de los precursores de células dendríticas. Las células B y los linfocitos T así como los monocitos que pueden estar también presentes en la médula ósea pueden matarse incluyendo anticuerpos dirigidos contra antígenos de linfocitos T y células B y monocitos. Dichos antígenos incluyen pero no se limitan a CD3, CD4, el antígeno de la célula B B220, thy-1, CD8 y antígenos de monocito. Las células viables restantes de la médula ósea se cultivan después en medio suplementado con aproximadamente 500-1000 U/ml de GM-CSF y se cultivan como se describió anteriormente. Debe señalarse que los antígenos CD4 y CD8 pueden estar presentes sobre precursores de células dendríticas jóvenes, por lo tanto, los anticuerpos dirigidos a estos antígenos pueden menoscabar las poblaciones de precursores de células dendríticas.

Cuando se usa sangre como fuente tisular, pueden obtenerse leucocitos sanguíneos usando procedimientos convencionales que mantienen su viabilidad. De acuerdo con el procedimiento preferido de la invención, se diluye sangre en medio (preferiblemente RPMI) que contiene heparina (aproximadamente 100 U/ml) u otro anticoagulante adecuado. El volumen de sangre respecto del medio es de aproximadamente 1 a 1. Las células se sedimentan y se lavan por centrifugación de la sangre en medio a aproximadamente 1000 rpm (150 g) a 4ºC. Las plaquetas y eritrocitos se eliminan suspendiendo el sedimento celular en una mezcla de medio y cloruro de amonio. Preferiblemente la mezcla de medio a cloruro de amonio (concentración final del 0,839%) es de aproximadamente 1:1 en volumen. Las células se sedimentan por centrifugación y se lavan aproximadamente dos veces más en la mezcla de medio-cloruro amónico, o hasta que se obtenga una población de leucocitos, sustancialmente libre de plaquetas y eritrocitos.

Cualquier solución isotónica usada de forma habitual en cultivos tisulares puede usarse como el medio para separar leucocitos de plaquetas y eritrocitos en la sangre. Ejemplos de dichas soluciones isotónicas son solución salina tamponada con fosfato, solución salina equilibrada de Hanks, o medios de crecimiento completos incluyendo por ejemplo RPMI 1640. Se prefiere RPMI 1640.

Las células obtenidas a partir del tratamiento de la fuente tisular se cultivan para formar un cultivo primario sobre un sustrato adecuado en un medio de cultivo suplementado con GM-CSF o una proteína o péptido derivado de GM-CSF que presente una secuencia de aminoácidos manteniendo dicha secuencia la actividad biológica típica de GM-CSF. El sustrato apropiado puede ser cualquier superficie compatible con el cultivo tisular a la que las células puedan adherirse. Preferiblemente, el sustrato es plástico comercial tratado para uso en cultivo tisular. Entre los ejemplos se incluyen diversos matraces, botellas cilíndricas, placas petri y placas que contengan múltiples pocillos preparadas para uso en cultivo tisular. Pueden usarse también superficies tratadas con una sustancia, por ejemplo colágeno o poli-L-lisina, o anticuerpos específicos para un tipo de célula particular para promover la adhesión celular con la condición de que estas permitan la unión diferencial de las células tal y como se describe posteriormente. Las células se disponen preferiblemente en placas a una densidad celular inicial de aproximadamente 7,5 x 10^{5} células por cm^{2}. A esta dosis, la superficie no está cubierta totalmente por células, pero no existen grandes espacios libres (2-3 diámetros celulares) tampoco.

Cuando se cultiva la médula ósea que ha sido tratada para reducir la proporción de precursores de células no dendríticas, se forman agregados que comprenden precursores de células dendríticas proliferantes. Los no-linfocitos de la médula Ia-negativos que comprenden precursores de células dendríticas se cultivan preferiblemente en grandes cantidades, aproximadamente 10^{6}/pocillo (5 x 10^{5} células/cm^{2}). Los cultivos de médula líquidos que se preparan con propósitos diferentes al cultivo de precursores de células dendríticas se siembran típicamente al 1/10 de esta dosis, pero después es difícil identificar y aislar los agregados de las células dendríticas en desarrollo.

El medio de crecimiento para las células en cada etapa del procedimiento de la invención debería permitir la supervivencia y proliferación de las células dendríticas precursoras. Cualquier medio de crecimiento usado típicamente para cultivar células puede usarse de acuerdo con el procedimiento de la invención siempre que el medio esté suplementado con GM-CSF. Los medios preferidos incluyen RPMI 1640, DMEM y \alpha-MEM, con aminoácidos y vitaminas añadidos suplementados con una cantidad apropiada de suero o un grupo definido de hormonas y una cantidad de GM-CSF suficiente para promover la proliferación de células precursoras dendríticas. Es también adecuado para el cultivo de precursores de células dendríticas medio exento de suero suplementado con hormonas. Se prefiere RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal al 5% (FCS) y GM-CSF. Las células se pueden seleccionar o adaptar para crecer en otros sueros y con concentraciones de suero diferentes. Las células del tejido humano pueden también cultivarse en medio suplementado con suero humano en lugar de con FCS. Los medios pueden contener antibióticos para minimizar la infección bacteriana de los cultivos. Se prefieren penicilina, estreptomicina o gentamicina o combinaciones que las contengan. El medio, o una parte del medio, en el que las células se cultivan debería rellenarse periódicamente para proporcionar nutrientes nuevos incluyendo GM-CSF.

Se ha encontrado de forma sorprendente que GM-CSF promueve la proliferación in vitro de las células dendríticas precursoras. Las células se cultivan en presencia de GM-CSF a una concentración suficiente para promover la supervivencia y proliferación de los precursores de las células dendríticas. La dosis depende de la cantidad de competición de otras células (especialmente macrófagos y granulocitos) por el GM-CSF, o a la presencia de inactivadores de GM-CSF en la población celular. Preferiblemente, las células se cultivan en presencia de entre aproximadamente 1 a 1000 U/ml de GM-CSF. Mas preferiblemente las células procedentes de la sangre se cultivan en presencia de GM-CSF a una concentración de entre aproximadamente 30 y 100 U/ml. Se ha encontrado que esta dosis es necesaria y suficiente para dar respuestas máximas por parte de las células obtenidas a partir de sangre de ratón. Lo más preferible es que las células se cultiven en presencia de GM-CSF a una concentración de aproximadamente 30 U/ml. Se ha encontrado que una concentración de GM-CSF de entre aproximadamente 400-800 U/ml es óptima para el cultivo de células dendríticas humanas proliferantes de la sangre. Las células procedentes de la médula ósea requieren concentraciones mayores de GM-CSF debido a la presencia de grandes cantidades de granulocitos proliferantes que compiten por el GM-CSF disponible, por lo tanto, se prefieren dosis entre aproximadamente 500-1000 U/ml para cultivos de células obtenidas a partir de la médula.

Cuando se cultivan suspensiones de médula ósea de ratón en presencia de GM-CSF, aumentan en número tres tipos de células mieloides. (1) Predominan los neutrófilos pero no se adhieren a la superficie del cultivo. Los neutrófilos presentan una morfología nuclear característica, expresan el antígeno RB-6, y carecen de productos de MHC de clase II. (2) Los macrófagos se adhieren firmemente al vaso de cultivo, expresan niveles sustanciales del antígeno F4/80, y la mayoría expresan poco o nada de MHC de clase II [pero véase más adelante].

Cuando se cultivan leucocitos de sangre de ratón o de ser humano en GM-CSF a 30 U/ml o 400-800 U/ml, respectivamente, los cultivos desarrollan un gran número de agregados o bolas celulares de los que se liberan eventualmente células dendríticas típicas. En ausencia de GM-CSF, no se desarrollan colonias. Pueden usarse criterios citológicos para detectar inicialmente las células dendríticas que de forma característica extienden grandes velos o prolongaciones celulares de tipo lámina (25, 27).

GM-CSF puede aislarse a partir de fuentes naturales, producirse usando técnicas de ADN recombinante o prepararse mediante síntesis química. Tal y como se usa en la presente memoria, GM-CSF incluye GM-CSF producido mediante cualquier procedimiento y a partir de cualquier especie. "GM-CSF" se define en la presente memoria como cualquier análogo, fragmento o derivado bioactivo del GM-CSF de origen natural (nativo). Dichos fragmentos o formas derivadas de GM-CSF deberían promover también la proliferación en cultivo de los precursores de células dendríticas. Además, los péptidos de GM-CSF que presentan actividad biológica pueden identificarse por su capacidad de unión a receptores de GM-CSF sobre tipos de células apropiadas.

Puede ser deseable incluir citoquinas adicionales en el medio de cultivo además de GM-CSF para aumentar adicionalmente el rendimiento de las células dendríticas. Dichas citoquinas incluyen el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), interleuquinas 1\alpha y 1\beta, 3 y 6 (IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-3 y IL-6, respectivamente), el factor \alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha), y el factor de la célula troncal (SCF). Las citoquinas se usan en cantidades que son eficaces a la hora de aumentar la proporción de células dendríticas presentes en el cultivo potenciando la proliferación o la supervivencia de los precursores de las células dendríticas. Preferiblemente, las citoquinas se presentan en las siguientes concentraciones: IL-1\alpha y 1\beta, de 1 a 100 unidades LAF/ml; TNF-\alpha, 5-500 U/ml; IL-3, 25-500 U/ml; M-CSF, 100-1000 U/ml; G-CSF, 25-300 U/ml; SCF, 10-100 ng/ml; y IL-6, 10-100 ng/ml. Las concentraciones de citoquinas más preferidas son: IL-1\alpha, 50 unidades LAF/ml; TNF-\alpha, 50 U/ml; IL-3, 100 U/ml; M-CSF, 300 U/ml; y G-CSF, 100 U/ml. Las proteínas humanas son las citoquinas preferidas. Las citoquinas más preferidas se producen a partir de gen humano usando técnicas recombinantes (rhu). Puede usarse

\hbox{TNF- \alpha }

a concentraciones desde aproximadamente 10-50 U/ml para aumentar varias veces los rendimientos de las células dendríticas.

Los cultivos primarios a partir de la fuente tisular se dejan incubar aproximadamente a 37ºC en condiciones de humedad y pH del cultivo tisular convencionales hasta que una población de células se haya adherido al sustrato de una forma suficiente para permitir la separación de las células no adherentes. Inicialmente el precursor de las células dendríticas en la sangre no es adherente al plástico, en contraste con los monocitos, de forma que los precursores pueden separarse después del cultivo durante toda una noche. Se cree que los monocitos y fibroblastos comprenden la mayoría de células adherentes y normalmente se adhieren al sustrato en aproximadamente 6 a aproximadamente 24 horas. Preferiblemente las células no adherentes se separan de las células adherentes en aproximadamente entre 8 y 16 horas. Lo más preferible es que las células no adherentes se separen en aproximadamente 12 horas. Cualquier procedimiento que no desaloje cantidades significativas de células adherentes puede usarse para separar las células adherentes de las no adherentes. Preferiblemente, las células se desalojan por simple agitación o pipeteo. Pipetear es lo más preferido.

Para cultivar células precursoras de sangre humana a partir de este cultivo primario, se cultivan sobre un sustrato las células que han sido desprovistas de células que no son precursoras de células dendríticas a una densidad de preferiblemente aproximadamente 5 x 10^{5} células por cm^{2}. Después de 5 días, con alimentación cada dos días, aparecen agregados celulares (denominados también "bolas"). Estos agregados pueden tratarse después tal y como se describe más adelante.

Las células no adherentes del cultivo primario se subcultivan transfiriéndolas a nuevos matraces de cultivo a una densidad suficiente para permitir la supervivencia de las células y que da como resultado el desarrollo con el tiempo de agrupaciones de células en desarrollo que están unidas de manera holgada a la superficie del cultivo o a las células firmemente adherentes sobre la superficie. Estas agrupaciones son el nido de precursores de células dendríticas proliferantes. Como se usa en la presente memoria, "matraces de cultivo" se refiere a cualquier vaso adecuado para cultivar células. Es deseable subcultivar todas las células no adherentes del cultivo primario a una densidad de entre aproximadamente 2 x 10^{5} células y 5 x 10^{5} células por cm^{2}. Preferiblemente a aproximadamente 2,5 x 10^{5} células por cm^{2}. Las células se incuban durante un tiempo suficiente para permitir que la superficie de la placa de cultivo quede cubierta con una monocapa de células estrechamente adherentes incluyendo macrófagos y fibroblastos a los que se fijan agregados de células no adherentes. En este momento, cualquier célula no adherente se retira de los pocillos, y los agregados celulares se desalojan para el subcultivo. Preferiblemente las células de los agregados se subcultivan después de aproximadamente 10 días o cuando el número de células agregadas por cm^{2} alcance la cantidad de aproximadamente 3 a 4 x 10^{5}.

Para realizar un subcultivo en serie de las células agregadas, se desalojan las células agregadas de las células adherentes y las células agregadas se subcultivan sobre un área superficial total de preferiblemente entre aproximadamente 2 a 5 veces el área superficial del cultivo precursor. Más preferiblemente, las células se subcultivan sobre un área superficial que es aproximadamente 3 veces el área superficial del cultivo precursor. Las células que presentan prolongaciones celulares de tipo lámina típicas de células dendríticas aparecen en el cultivo aproximadamente a los 4-7 días. Entre aproximadamente el día 10 y el día 17 del cultivo, el número de células individuales que pueden recuperarse a partir de un área superficial dada se duplica. Tanto los precursores de las células dendríticas como las células dendríticas maduras se encuentran presentes en los agregados.

Para producir células dendríticas a partir de la médula ósea, se separan del estroma preferiblemente los agregados distintivos de células dendríticas proliferantes menos maduras aproximadamente después de aproximadamente 4-6 días de cultivo. Se liberan grandes cantidades de células dendríticas y es esta población liberada la que expresa los rasgos fundamentales de las células dendríticas maduras. Como la médula ósea contiene inicialmente una proporción mayor de precursores de células dendríticas que la sangre, sólo se necesitan aproximadamente 4-6 días de cultivo de las células obtenidas a partir de la médula ósea para conseguir aproximadamente el mismo número de células que se obtienen después de aproximadamente 10 a 25 días de cultivo de células obtenidas a partir de la sangre.

Para expandir adicionalmente la población de células dendríticas derivadas de la sangre, los agregados celulares pueden subcultivarse en serie múltiples veces a intervalos que proporcionan la proliferación continuada de precursores de células dendríticas. Los agregados se subcultivan preferiblemente antes de la liberación en el medio de una mayoría de células que presentan la morfología de las células dendríticas, por ejemplo entre aproximadamente 3 y 30 días. De forma más preferible, los agregados celulares se subcultivan entre aproximadamente 10 y 25 días en cultivo, y lo más preferiblemente a 20 días. El número de veces en que las células se subcultivan en serie depende del número de células deseadas, la viabilidad de las células, y la capacidad de los cultivos de continuar produciendo agregados celulares de los que se liberan células dendríticas. Preferiblemente, las células se pueden subcultivar en serie durante entre aproximadamente 1 a 2 meses desde cuando se subcultivaron las células no adherentes o entre aproximadamente de una a cinco veces. De forma más preferible, las células se subcultivan en serie aproximadamente de dos a tres veces. Lo más preferible es que las células se subcultiven en serie dos veces.

De acuerdo con un procedimiento preferido, para subcultivar en serie las células de los cultivos primario y posteriores, se desalojan las células por pipeteo de la mayor parte de los agregados de células dendríticas en crecimiento así como de algunas células en la monocapa de macrófagos y fibroblastos en crecimiento. Pipetear normalmente rompe los agregados, particularmente las células periféricas de los agregados que son más maduras. Con el tiempo, por ejemplo a las dos semanas, los agregados de las células dendríticas en crecimiento en el cultivo se vuelven más estables y es posible desalojar los agregados por separación mediante sedimentación 1g.

Pueden emplearse enfoques alternativos para aislar las células dendríticas maduras a partir de cultivos en crecimiento. Uno es retirar las células que son no adherentes y separar los agregados de las células unidas a sustrato y células individuales por sedimentación 1g. Entonces las células dendríticas se liberan en grandes cantidades de los agregados durante 1-2 días adicionales de cultivo, mientras que cualquier célula dendrítica madura puede aislarse de otras células individuales por flotación sobre metrizamida densa como se describe en (Freudenthal y Steinman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:7698-7702, 1990). El segundo procedimiento, que es más simple pero termina esencialmente la fase de crecimiento del procedimiento, es recoger todas las células no adherentes cuando los agregados son muy grandes, dejar las células sobre hielo durante aproximadamente 20 minutos, resuspender enérgicamente con una pipeta para desagregar los agregados y hacer flotar las células dendríticas maduras sobre columnas de metrizamida.

Típicamente los contenidos de cinco pocillos de 16 mm se aplican a una columna de 6 ml de FCS-RPMI 1640 al 50% en un tubo cónico de 15 ml [Sarstedt, 62.553.002 PS]. Después de al menos 20 minutos, el medio aplicado y 1 ml de la parte superior de la columna se retiran. Se añade RPMI, los agregados se sedimentan a 1000 rpm a 4ºC durante 5 minutos, y las células se suspenden suavemente para subcultivar en medio recién preparado.

Pueden usarse diversas técnicas para identificar las células presentes en los cultivos. Estas técnicas pueden incluir el análisis de morfología, la detección de antígenos específicos del tipo de célula con anticuerpos monoclonales, la identificación de células proliferantes usando autorradiografía con timidina tritiada, el ensayo de las reacciones con leucocitos mezclados, y la demostración del retorno de las células dendríticas.

Además de ser identificadas por su forma estrellada las células dendríticas pueden identificarse también detectando su expresión de antígenos específicos usando anticuerpos monoclonales.

Puede usarse un panel de anticuerpos monoclonales para identificar y caracterizar las células en los cultivos expandidos por GM-CSF. Los anticuerpos monoclonales se revisan en otra parte (23, 24 que se incorporan en la presente memoria como referencia).

Entre los anticuerpos monoclonales específicos adecuados para la identificación de células dendríticas maduras están: 1) aquellos que se unen al antígeno de MHC de clase I (anti-MHC de clase I M1/42 [ATCC nº TIB 126]); 2) aquellos que se unen al antígeno de MHC de clase II (anti-MHC de clase II B21-2 [ATCC nº TIB 229]); anti-MHC de clase II M5/114 [ATCC nº TIB 120]); 3) aquellos que se unen a antígeno estable al calor (anti-antígeno estable al calor M1/69 [HSA, ATCC nº TIB 125]); 4) anticuerpos anti-célula dendrítica 33D1 [ATCC nº TIB 227]; 5) aquellos que se unen al antígeno de célula interdigitante (NLDC145 anti-célula interdigitante (13); y 6) aquellos que se unen a antígenos en gránulos en la región perinuclear de células dendríticas maduras (anticuerpos monoclonales 2A1 y M342, (23) Agger y col.). Otros antígenos que son expresados por las células dendríticas de la invención y que pueden usarse para identificar células dendríticas maduras son CD44 (identificado con anticuerpo monoclonal 2D2C), y CD11b (identificado con anticuerpo monoclonal M1/70). Los anticuerpos monoclonales M1/69, M1/70, M1/42 se describen en Monoclonal antibodies, NY, Plenum 1980, ed. R. Kennett y col., páginas 185-217. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden preparar y caracterizar otros anticuerpos que son adecuados para la identificación de células dendríticas maduras. De forma similar, la producción de células precursoras dendríticas facilita también la producción de anticuerpos específicos para células precursoras dendríticas.

Para identificar y fenotipificar las células proliferantes y su progenie, los cultivos se pueden marcar con timidina tritiada para identificar las células en la fase S de la mitosis. Además del marcaje de las células con un marcador mitótico, las células pueden también marcarse conjuntamente con anticuerpos monoclonales para determinar cuándo se expresan los marcadores asociados con células dendríticas maduras. El fenotipo distintivo de los precursores de células dendríticas es estable de forma que, por ejemplo, la progenie de células dendríticas no se convierte en macrófagos incluso cuando se mantiene en factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF).

Otro índice de madurez en las células dendríticas es la capacidad de las células dendríticas maduras de estimular la proliferación de linfocitos T en la reacción con leucocitos mezclados (MLR). La capacidad de las células dendríticas de migrar hacia los ganglios linfáticos, es decir el retorno de células dendríticas, es otro índice de la madurez de las células dendríticas que puede usarse para evaluar la madurez de las células en el cultivo.

Los criterios que se han hecho evidentes para identificar células precursoras dendríticas de acuerdo con la invención permiten la identificación de progenitores proliferantes de células dendríticas en otros órganos. Es sabido que los precursores proliferantes dan lugar a poblaciones de células dendríticas de rápido recambio en el bazo (15) y linfa aferente (16). La proliferación de leucocitos (distintos de linfocitos T) tiene lugar en la médula ósea, pero puede ser que para células dendríticas, la médula siembre también la sangre y otros tejidos con progenitores que después proliferan de forma extensiva como se muestra en la presente memoria. Al poder preparar la traza diferente de célula dendrítica en grandes cantidades de acuerdo con el procedimiento de esta invención, podrían determinarse ahora otras áreas no exploradas anteriormente de la función de la célula dendrítica. Específicamente, las células dendríticas en crecimiento facilitarán los estudios moleculares y clínicos sobre el mecanismo de acción de estas células APC, incluyendo sus capacidades para captar y retener antígenos de forma inmunogénica y de actuar como adyuvantes para la generación de inmunidad in vivo.

Existe un interés creciente en el uso de proteínas y péptidos constituyentes para modular respuestas de linfocito T a antígenos microbianos y celulares complejos in situ. Se requieren adyuvantes típicamente artificiales tales como alumbre para producir un efecto inmunogénico máximo. Se sabe que varios antígenos son inmunogénicos cuando se administran en asociación con células dendríticas pero en ausencia de adyuvantes adicionales (1). La inmunogenicidad de células dendríticas in situ se ha demostrado con por ejemplo antígenos de contacto (45), antígenos de transplante (46-49), y más recientemente con proteínas extrañas (31,50,51). Otros tipos de antígenos incluyen pero no se limitan a antígenos microbianos, tumorales y virales. Las células dendríticas sirven directamente como APC in situ, porque los linfocitos T que están cebados están restringidos a reconocer sólo los antígenos presentados por la clase de MHC particular de las células dendríticas inmunizantes más que a la APC huésped (14,31,50,51). Estas observaciones, cuando se acoplan con los datos que indican que las células dendríticas son eficaces en la captura de antígenos proteicos de forma inmunogénica in situ(52-54), permiten considerar a estas APC como "adyuvantes naturales". Esta invención permite por lo tanto la utilización de células dendríticas mediante los procedimientos y composiciones descriptivos adecuados para proporcionar cantidades suficientes de precursores de células dendríticas con el fin de sacar provecho de sus capacidades únicas de presentación de antígeno en prácticas clínicas y terapéuticas.

Las células dendríticas son capaces de procesar antígenos complejos en aquellos péptidos que serían presentados por los propios productos MHC. Entre las realizaciones preferidas de la invención existe un procedimiento para usar células dendríticas por el que los precursores de células dendríticas internan partículas durante una etapa temprana de su desarrollo a partir de progenitores proliferantes. Los inventores han establecido que la estimulación de suspensiones de la médula ósea con GM-CSF conduce a la producción de agrupaciones de precursores de células dendríticas proliferantes. Las células que experimentan marcaje por pulsos con 3H-timidina en las agrupaciones carecen de muchos de los marcadores de las células dendríticas, por ejemplo, forma estrellada y rasgos antigénicos como el antígeno NLDC-145 y altos niveles de MHC de clase II. En los experimentos pulso-persecución, se libera la progenie marcada con 3H-timidina con todos los rasgos de las células dendríticas. Los inventores han encontrado que las células de los agregados son también fagocíticas, y que en protocolos análogos de pulso- persecución, la progenie de células dendríticas se marca claramente con el alimento fagocítico. Cuando las partículas son organismos BCG tales como los causantes de la tuberculosis, se presentan de manera potente los antígenos micobacterianos asociados con las células dendríticas a los linfocitos T in vitro e in situ.

Antígenos extraños y autoantígenos son procesados por las células dendríticas obtenidas mediante el procedimiento de la invención para retener su forma inmunogénica. La forma inmunogénica del antígeno implica el procesamiento del antígeno a través de la fragmentación para producir una forma del antígeno que puede ser reconocida por y estimular a linfocitos T. Preferiblemente, dichos antígenos extraños y autoantígenos son proteínas que son procesadas en péptidos por las células dendríticas. Los péptidos relevantes que se producen por las células dendríticas pueden extraerse y purificarse para usarlos como inmunógenos.

Los péptidos procesados por las células dendríticas pueden también usarse como tolerágenos para inducir tolerancia a las proteínas procesadas por las células dendríticas o los precursores de las células dendríticas. Preferiblemente cuando se usan como tolerágenos, los péptidos procesados se presentan sobre células dendríticas que han sido tratadas para reducir su capacidad de provocar una respuesta inmune como por inhibición de su función accesoria bloqueando las moléculas accesorias tales como B7 presentes sobre las células dendríticas.

Se pueden producir células dendríticas activadas por antígeno exponiendo el antígeno, in vitro, a las células dendríticas preparadas de acuerdo con el procedimiento de la invención.

Las células dendríticas se disponen en placas de cultivo y se exponen a antígeno en una cantidad suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir al antígeno unirse a las células dendríticas. La cantidad y tiempo necesarios para conseguir la unión del antígeno a las células dendríticas puede determinarse por inmunoensayo o ensayo de unión. Pueden usarse otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica para detectar la presencia de antígeno sobre las células dendríticas después de haberlas expuesto al antígeno.

Sin quedar ligados a ninguna teoría, la información en este momento sugiere que el desarrollo de las células dendríticas procede según la siguiente ruta [Fig. 11]. Los precursores de células dendríticas tanto en la sangre como en la médula carecen de antígenos MHC de clase II así como de marcadores de linfocitos T y células B y de monocitos [B220, CD-3, thy-1, CD4/8], y los precursores son no adherentes. Los precursores se unen al estroma y dan lugar a agregados de células positivas de clase II. Quizás, los agregados en crecimiento aparecen a partir de un subgrupo de células fuertemente positivas de clase II que se encuentran en la monocapa firmemente adherente incluso en puntos temporales más tardíos. Sin embargo, estas células firmemente adherentes y ricas en clase II carecen de actividad estimuladora de MLR de células dendríticas y pueden expresar niveles sustanciales de receptores Fc\gamma (FcR) y del antígeno F4/80. La etapa final del desarrollo es aquella en la que el agregado unido de forma holgada libera células dendríticas no proliferantes y maduras. Estas últimas presentan niveles incluso superiores de MHC de clase II [Fig. 2-3] y pueden unirse transitoriamente al plástico, como muchas de las células dendríticas liberadas desde el bazo (25). A medida que tiene lugar el desarrollo en el agregado, parece haber una reducción en los niveles de tinción citoplásmica para los receptores Fc\gamma y el antígeno F4/80, y un aumento en gránulos [M342, 2A1] y antígenos superficiales [33D1, NLDC145] que son característicos de las células dendríticas. Por último, la función accesoria para las respuestas inmunes dependientes de T primarias aumenta a medida que las células se liberan de los agregados en crecimiento.

Las células dendríticas maduras, aunque eficaces en la sensibilización de los linfocitos T frente a varios antígenos distintos, muestran poca o ninguna actividad fagocítica. Al nivel en que se requiere la endocitosis para el procesamiento y la presentación de los antígenos, no fue evidente previamente el modo en que las células dendríticas presentarían los péptidos asociados a partículas. En base al trabajo de los autores de esta invención, es ahora evidente que los progenitores de las células dendríticas proporcionadas por esta invención pueden internar dichas partículas para su procesamiento y presentación. Los tipos de partículas que pueden internarse por fagocitosis incluyen agentes bacterianos, virales, micobacterianos u otros agentes infecciosos capaces de causar enfermedad. Por consiguiente, cualquier partícula antigénica que sea internada y procesada por los precursores de células dendríticas de esta invención es también adecuada para la preparación de diversos inmunógenos, tolerágenos y vacunas descritas como parte de esta invención. El procesamiento de los antígenos por parte de las células dendríticas o por parte de los precursores de las células dendríticas incluye la fragmentación de un antígeno en fragmentos de antígeno que posteriormente son presentados.

La fagocitosis de materia particulada mediante precursores de células dendríticas puede realizarse por cultivo de los precursores de células dendríticas en presencia de materia particulada durante un tiempo suficiente para permitir que las células fagociten, procesen y presenten a los antígenos. Preferiblemente, el cultivo de las células en presencia de las partículas debería ser durante un periodo de entre 1 a 48 horas. Más preferiblemente, el cultivo de células en presencia de materia particulada será durante aproximadamente 20 horas. Los expertos en la técnica reconocerán que la longitud de tiempo necesaria para que una célula fagocite a una partícula dependerá del tipo celular y de la naturaleza de la partícula que se vaya a fagocitar. Los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos para controlar el grado de dicha fagocitosis.

Las células deberían exponerse al antígeno durante un tiempo suficiente para permitir que los antígenos se internen y se presenten sobre la superficie celular. El tiempo necesario para que las células internen y presenten al antígeno procesado puede determinarse usando protocolos pulso-persecución en los que a la exposición al antígeno le sigue un periodo de arrastre. Una vez que se determina el tiempo mínimo necesario para que las células expresen el antígeno procesado sobre sus superficies, se puede usar un protocolo pulso-persecución para preparar células y antígenos para provocar respuestas inmunogénicas.

Las células precursoras dendríticas fagocíticas se obtienen estimulando cultivos celulares que comprenden células precursoras dendríticas con GM-CSF para inducir agregados de células dendríticas en crecimiento. Estas células precursoras dendríticas pueden obtenerse de cualquiera de las fuentes tisulares que contienen precursores de células dendríticas descritas anteriormente. Preferiblemente, la fuente tisular es la médula ósea o cultivos de sangre. Las células del interior de estos agregados son claramente fagocíticas. Si los cultivos en desarrollo se exponen a partículas, se lavan y se someten a persecución durante dos días, el número de células dendríticas enriquecidas en MHC de clase II aumenta sustancialmente y al menos el 50% contienen partículas internadas tales como partículas micobacterianas BCG o partículas de látex. Las células dendríticas cargadas de micobacterias y recién desarrolladas son mucho más potentes a la hora de presentar los antígenos a linfocitos T cebados que los cultivos correspondientes de células dendríticas maduras que se exponen a un pulso de organismos.

Una situación similar tiene lugar cuando se inyectan células dendríticas cargadas con BCG en la pata o corriente sanguínea de ratones preinmunes. Las células dendríticas que han fagocitado organismos inducen las respuestas de linfocitos T más fuertes a antígenos micobacterianos en ganglios linfáticos drenantes y bazo. La administración de antígenos a células dendríticas en desarrollo inducidas por GM-CSF -aumentando tanto la captación de antígeno como el número de células- facilitará el uso de estas APC para la inmunización activa in situ. La producción de dichas fuertes respuestas inmunogénicas debido a la presentación del antígeno por parte de las células dendríticas hace estas células y este sistema particularmente deseables como adyuvantes útiles para la producción de respuestas inmunogénicas en individuos. Dichas respuestas inmunogénicas y el desarrollo de anticuerpos frente a los antígenos presentados pueden usarse para tratar infecciones en curso o prevenir infecciones futuras como con una vacuna. El uso de células dendríticas para producir una respuesta inmune terapéutica o profiláctica en un individuo puede ser particularmente útil para tratar o prevenir una infección por organismos resistentes a fármacos, tales como, por ejemplo, las micobacterias BCG causantes de la tuberculosis.

Puede obtenerse la inmunogenicidad de partículas ingestadas con micobacterias BCG (Fig. 12-13). En cualquier inóculo de la vacuna BCG, hay bacilos vivos [aproximadamente el 50% de los bacilos actúan como unidades formadoras de colonias], bacilos muertos, y probablemente un número de proteínas micobacterianas. El acúmulo de BCG fagocitado es presentado a los linfocitos T por parte de las células dendríticas. Esto es evidente después de comparar la presentación de antígenos micobacterianos con albúmina de suero bovino (BSA), un componente del suero en el que crecen las células dendríticas. Todas las poblaciones de APC fueron comparables respecto a la presentación de BSA, pero las células dendríticas que habían fagocitado la mayoría del BCG fueron las células APC más eficaces para las micobacterias (Fig 12 y 13, \blacklozenge). La captación de partículas BCG, por lo tanto, justifica la mayoría del cebado de micobacterias por los precursores de células dendríticas.

Los precursores de células dendríticas pueden pulsarse con antígenos micobacterianos de bacterias de tuberculosis, incluyendo por ejemplo antígeno de BCG, para inducir la resistencia en el huésped a una infección micobacteriana, una cuestión de importancia dada la necesidad de desarrollar mejores protocolos de tratamiento y vacunación para la tuberculosis, incluyendo la variedad resistente a fármacos (78).

En realidad, el protocolo pulso-persecución que puede usarse para cargar las células dendríticas en desarrollo con organismos de acuerdo con la presente invención permite que los dos amplios componentes de la inmunoestimulación tengan lugar secuencialmente. Estos componentes son: a) captación y presentación de antígeno, en esta invención la captación de partículas por parte de las células dendríticas inmaduras, y b) desarrollo de funciones accesorias o inmunoestimuladoras potentes durante el periodo de persecución. La situación es comparable a la observada en la manipulación de proteínas solubles (4,6) y partículas (74) por células Langerhans epidérmicas.

Cada uno de los dos componentes amplios de la función de las APC produce muchos subcomponentes. Por ejemplo, las células dendríticas inmaduras no sólo son más fagocíticas sino que exhiben otras características necesarias para la presentación de antígenos tales como biosíntesis activa de abundantes moléculas MHC de clase II y de cadena invariable (6,7) y numerosas vacuolas endocíticas ácidas (36).

La capacidad de cargar las APC con antígenos usando protocolos pulso-persecución puede ser un rasgo especial de las células dendríticas. Los anteriores estudios con macrófagos y células B habían sugerido que los epitopes de linfocitos T eran de vida corta (75). Los resultados descritos en la presente memoria y en otra parte (6,14,71) indican que los péptidos inmunogénicos puede tener vida larga sobre células dendríticas al menos dos días antes de la inyección en ratones. Esta capacidad de retención debería permitir a las células dendríticas migrar y sensibilizar a los linfocitos T en tejidos linfoides drenantes durante un periodo de varios días (14,50,51).

Un rasgo importante de las células dendríticas obtenidas mediante el procedimiento de esta invención es la capacidad de presentar eficazmente antígenos microbianos y otros antígenos en productos de ambas clases I y II. En el caso de BCG, la mayoría de las células cebadas son linfocitos T CD4+, probablemente porque la carga antigénica está manipulada por la ruta endocítica y los productos MHC de clase II (76). En el caso de la gripe, se ha encontrado que la ruta de la clase I para inducir linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) requiere la liberación adecuada de antígeno (virus infeccioso) en el citoplasma, mientras que la ruta puramente endocítica libera viriones no infecciosos para la presentación sólo a linfocitos T auxiliares CD4+ (77). Los cultivos de células dendríticas en desarrollo proporcionan una oportunidad para cargar productos MHC de clase I con péptidos, puesto que la proliferación celular permite la aplicación de diversos procedimientos de inserción de genes (como con vectores retrovirales).

Las células dendríticas proliferantes pueden inyectarse con un vector que permite la expresión de proteínas específicas por parte de células dendríticas. Estas proteínas virales que se expresan mediante las células dendríticas pueden procesarse y presentarse después sobre las superficies celulares de receptores MHC de clase I. Las células virales que presentan antígenos o los antígenos virales procesados por sí mismos pueden después usarse como inmunógenos para producir una respuesta inmunogénica frente a las proteínas codificadas por el vector.

Los vectores pueden prepararse para incluir secuencias de ADN específico que codifican y expresan genes para las proteínas de las que se desea una respuesta inmunogénica. Preferiblemente, se usan vectores retrovirales para infectar las células dendríticas. El uso de vectores retrovirales para infectar células huésped es conocido por los expertos en la técnica y se describe en el documento WO 92/07943 publicado el 14 de Mayo de 1992 y en Richard C. Mulligan, "Gene Transfer and Gene Therapy: Principle, Prospects and Perspective" en Enology of Human Disease at the DNA Level, capítulo 12. J. Linsten y A. Peterson, ediciones Rover Press, 1991.

Usando células dendríticas en desarrollo para cargar productos MHC de clase I y/o II, se pueden conseguir in situ varios componentes deseables de modulación de los linfocitos T. La captación y presentación de antígenos por progenitores inmaduros, permite a las APC confeccionar los péptidos que son apropiados para los productos MHC de un individuo, y aumenta el número de APC estimuladoras especializadas. Estas propiedades de las poblaciones de progenitores de células dendríticas encuentran muchas de las demandas del uso de células como vehículos para la inmunización activa y la inmunoterapia in situ.

La presente invención proporciona por primera vez un procedimiento de obtención de células dendríticas en cantidades suficientes para ser usadas para tratar o inmunizar animales o seres humanos con células dendríticas que han sido activadas con antígenos. Además, las células dendríticas pueden obtenerse en cantidades suficientes para ser útiles como reactivos para modificar antígenos de una manera tal que hagan a los antígenos más eficaces como antígenos dependientes de linfocitos T.

Para usar células dendríticas activadas por antígeno como un agente terapéutico o un inmunógeno se inyectan células dendríticas activadas por antígeno mediante cualquier procedimiento que provoque una respuesta inmune en un animal o ser humano singénico. Preferiblemente, las células dendríticas se inyectan de nuevo en el mismo animal o ser humano del cual se obtuvo la fuente tisular. El sitio de la inyección puede ser subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular, intradérmico o intravenoso. El número de células dendríticas activadas por antígeno reinyectadas de nuevo en el animal o ser humano que necesite el tratamiento puede variar dependiendo, entre otros, del antígeno y tamaño del individuo. Un rasgo clave en la función de las células dendríticas in situ es la capacidad de migrar o retornar hacia las regiones dependientes de T de los tejidos linfoides, donde las células dendríticas estarían en una posición óptima para seleccionar los linfocitos T necesarios que reaccionan frente a antígenos de entre el acúmulo de linfocitos recirculantes inactivos y de esta forma iniciar la respuesta dependiente de linfocitos T.

De acuerdo con el procedimiento preferido de estimulación de una respuesta inmune en un individuo, se identificaría una fuente tisular de ese individuo para proporcionar los precursores de células dendríticas. Si se usa la sangre como fuente tisular preferiblemente se trataría en primer lugar al individuo con citoquina para estimular la hematopoyesis. Después del aislamiento y expansión de la población de precursores de células dendríticas, las células se ponen en contacto con el antígeno. Preferiblemente, el contacto con el antígeno se realiza in vitro. Después de que haya pasado tiempo suficiente para permitir que las células procesen y presenten el antígeno sobre sus superficies, los complejos célula-antígeno se sitúan de nuevo en el individuo en cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune. Preferiblemente entre 1 x 10^{6} y 10 x 10^{6} células que presentan antígeno se inyectan de nuevo en el individuo.

Los antígenos se pueden preparar mediante la combinación de sustancias a modificar u otros antígenos con las células dendríticas preparadas de acuerdo con el procedimiento de la invención. Las células dendríticas procesan o modifican antígenos de una manera que promueve la estimulación de linfocitos T por parte de los antígenos procesados o modificados. Dichos antígenos modificados por célula dendrítica son ventajosos porque pueden ser más específicos y tener menos epitopes no deseables que los antígenos dependientes de linfocitos T no modificados. Los antígenos modificados por célula dendrítica pueden purificarse mediante procedimientos convencionales bioquímicos. Por ejemplo, se sabe usar anticuerpos de productos del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) para seleccionar complejos MHC-peptido antigénico y después eluir los péptidos procesados requeridos con ácido [Rudensky y col., Nature 353:622-7 (1991); Hunt y col., Science 255:1261-3 (1992)].

Las células dendríticas activadas por antígeno y los antígenos modificados por célula dendrítica pueden usarse ambos para provocar una respuesta inmune frente a antígeno. Las células dendríticas activadas o los antígenos modificados pueden usarse como vacunas para prevenir infecciones futuras o pueden usarse para activar el sistema inmune para tratar enfermedades en curso. Las células dendríticas activadas o los antígenos modificados pueden formularse para uso como vacunas o composiciones farmacéuticas con vehículos adecuados tales como solución salina fisiológica u otros líquidos inyectables. Las vacunas o composiciones farmacéuticas que comprenden los antígenos modificados o las células dendríticas activadas por antígeno se administrarían en cantidades terapéuticamente eficaces suficientes para provocar una respuesta inmune. Preferiblemente, debería administrarse por dosis entre aproximadamente 1 a 100 microgramos de antígeno modificado, o su equivalente cuando está unido a células dendríticas.

Las células dendríticas pueden usarse para preparar auto-péptidos, que son adecuados para tratar enfermedades autoinmunes. Dichas enfermedades autoinmunes incluyen pero no se limitan a diabetes juvenil, esclerosis múltiple, miastenia grave y dermatitis atópica. Sin quedar ligado a ninguna teoría, se cree que las enfermedades autoinmunes proceden de una respuesta inmune dirigida contra "auto-proteínas", es decir, autoantígenos que están presentes o son endógenos en un individuo. En una respuesta autoinmune, estas "auto-proteínas" se presentan a linfocitos T lo que provoca que los linfocitos T se vuelvan "auto-reactivos". Se pulsan células dendríticas con el antígeno endógeno para producir el "auto-péptido" relevante. El auto-péptido relevante es diferente para cada individuo porque los productos del MHC son altamente polimórficos y las moléculas de MHC de cada individuo podrían unirse a diferentes fragmentos peptídicos. Los auto-péptidos pueden usarse después para diseñar péptidos que compiten o para inducir tolerancia a las auto-proteínas en el individuo necesitado del tratamiento.

Debido a que las células dendríticas pueden ahora crecer a partir de precursores de acuerdo con los procedimientos y principios identificados en la presente memoria, y porque las células dendríticas pueden modificar antígenos para producir linfocitos T asesinos, las composiciones de esta invención son particularmente útiles como vacunas frente a virus y células tumorales para los que los linfocitos T asesinos podrían proporcionar resistencia.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción de células dendríticas de ratón in vitro a partir de precursores de células dendríticas proliferantes de la sangre Materiales

A. Ratones: Ratones BALB/C. BALB/C X DBA/2 F1, BALB/C X C57BL/6 F1, C57BL/6 X DBA/2 F1, y C57BL/6 machos y hembras, de 6-8 semanas de edad se compraron a Japan SLC Inc [Shizuoka, Japón], Instituto Trudeau [Saranac Lake, NY], y Charles River Wiga [Sulzberg, FRG]. Se evaluaron cuatro preparaciones de rGM-CSF con resultados similares, con un rendimiento de células dendríticas que alcanza una meseta con 30-100 U/ml. Las preparaciones procedían del Dr. S. Gillis, Immunex Corp., Seattle WA; Genetics Institute [sobrenadante de células COS transfectadas con mGM-CSF; usado a 30 U/ml o superior]; y del Dr. T. Sudo [sobrenadante de células CHO transfectadas con el vector de expresión, pHSmGM-CSF (22), y material expresado por E. Coli].

B. Preparación sanguínea: Se extrajo sangre por punción cardíaca o a partir de la arteria carótida. La sangre se diluyó en, o se dejó gotear en, RPMI-1640 con heparina 100 U/ml [aproximadamente 2 ml/ratón]. Se sedimentaron las células sanguíneas a 1000 rpm a 4ºC, se volvieron a suspender en RPMI 1640, y se sedimentaron otra vez. El sedimento se suspendió en 1 ml de RPMI 1640 por ratón y se mezcló con un volumen igual de cloruro amónico al 1,66% en agua destilada para lisar los eritrocitos. Después de dos minutos a temperatura ambiente, la suspensión se centrifugó a 1000 rpm a 4ºC. El sedimento, que contenía todavía eritrocitos, se resuspendió otra vez en 0,5 ml de RPMI y 0,5 ml de NH_{4}Cl durante dos minutos, se diluyó en RPMI, y se volvió a sedimentar. Después de dos lavados más, la mayor parte de las plaquetas y eritrocitos se habían eliminado y se había obtenido una población de leucocitos de la sangre.

C. Agregados de células dendríticas proliferantes a partir de sangre suplementada con GM-CSF

Se cultivaron leucocitos de la sangre, normalmente a partir de ratones CXD2 F1, en pocillos de cultivo tisular de 16 mm [placas de 24 pocillos, Costar, nº 25820] en medio (1 ml por pocillo) suplementado con GM-CSF a 30 U/ml y a 1,5 x 10^{6} células/pocillo. El medio fue RPMI 1640 suplementado con suero de ternera fetal al 5% [JRH Biosciences, Lenexa, KA], 2-ME 50 \muM, gentamicina 20 \mug/ml, y GM-CSF de ratón recombinante. Después del cultivo durante toda la noche, muchos monocitos adheridos y las células no adherentes se transfirieron a nuevos pocillos de 16 mm. Las células adherentes no desarrollaron colonias de células dendríticas, pero durante la semana siguiente, las poblaciones no adherentes exhibieron tres cambios. En primer lugar, la mayor parte de los linfocitos y granulocitos murieron o pudieron ser eliminados mediante lavado. En segundo lugar, la superficie del pocillo se cubrió con una monocapa de células estrechamente adherentes que incluían macrófagos y fibroblastos. En tercer lugar, se desarrollaron pequeños agregados de células fijados a sitios dispersos por la monocapa. Los cultivos se alimentaron con GM-CSF (30 U/ml) en el día 6-7 y después cada tres días por aspiración de 0,5-0,75 ml del medio y añadiendo de nuevo un volumen igual de medio recién preparado con GM-CSF. Los agregados continuaron expandiéndose en número y tamaño. Aproximadamente el día 10, las células estaban preparadas para ser subcultivadas. Cualquier célula suelta residual podría ser retirada mediante un aclarado antes de desalojar los agregados en medio recién preparado y GM-CSF. Aproximadamente 0,8-1 millones de células desalojadas por pocillo original se dividieron en tres pocillos de subcultivo.

La mayor parte de los agregados se separaron durante este primer subcultivo, mientras que la mayoría de la monocapa adherente permaneció unida al pocillo original. Después de la transferencia, la mayoría de las células en los agregados desalojados se encontraban adheridas como células individuales al nuevo pocillo de cultivo pero durante un periodo de 2-3 días, volvieron a aparecer los agregados. Los agregados se fijaron de nuevo a las células estromales adherentes, pero estas células adherentes eran mucho menos numerosas que la monocapa densa en el cultivo original. Durante los siguientes 4-7 días, los agregados rellenaron los pocillos. Estas colonias eran a menudo más grandes que las de los pocillos originales y se cubrieron con muchas prolongaciones celulares de tipo lámina típicas de células dendríticas. Fue más difícil contar las células en este momento, ya que muchos de los agregados contenían un núcleo de células asociadas de forma estrecha. Sin embargo, el número de células individuales que podía recubrirse por pocillo aumentó aproximadamente dos veces entre los días 10 y 17 del cultivo.

Si los cultivos se dejaban sobrecrecer, se liberaban algunas células con la morfología de células dendríticas. De forma más típica, las células no se dejaron sobrecrecer y los agregados se desalojaron y subcultivaron de nuevo aproximadamente a los 20 días. Antes del subcultivo, los agregados podían purificarse a partir de las células libres por sedimentación 1g. Dichas preparaciones se realizaron de manera más fácil con periodos más largos de tiempo de cultivo, es decir, fue más fácil aislar agregados intactos después de 3 frente a 2 y frente a 1 semana de cultivo. Con un subcultivo adicional, el número de agregados que se produjeron por pocillo se redujo progresivamente. Sin embargo se pudieron generar colonias de células en crecimiento, como se confirmó mediante marcado con 3H-TdR y autorradiografía [más adelante], en subcultivos durante 1-2 meses. Después del subcultivo en las semanas 2-3, se liberaron ahora en el medio células dendríticas individuales típicas. Mediante observación directa con grabación de vídeo, estas células liberadas tenían la motilidad activa de las células dendríticas, extendiéndose y retrayéndose continuamente grandes velos o prolongaciones celulares de tipo lámina. En presencia continuada de GM-CSF, uno observaba las células dendríticas libres así como las colonias en expansión. En ausencia de GM-CSF, sólo se liberaban células dendríticas libres y los agregados esencialmente se separaron y no se volvieron a formar en el medio y no se desarrollaron colonias de agregados. Los rendimientos de células dendríticas libres por subcultivo variaban entre 0,3-2,5 x 10^{5}.

En resumen, a partir de un cultivo mononuclear de sangre de partida de 1,5 x 10^{6} células, donde era difícil detectar células dendríticas, los inventores obtuvieron de media 5-10 subcultivos cada uno con al menos 3-10 x 10^{4} células dendríticas liberadas a las 3 semanas, así como muchos agregados capaces de proliferación adicional. Por lo tanto, se desarrollaron agregados de células en crecimiento en sangre de ratón suplementada con GM-CSF, y estos agregados se cubrieron con células dendríticas muchas de las cuales pudieron liberarse espontáneamente en el medio.

D. Fenotipo de los agregados celulares y células dendríticas liberadas de los mismos

Se realizaron preparaciones de citoespin en una citocentrífuga Shandon usando 3-10 x 10^{4} células. Se almacenaron los portaobjetos con desecante antes de la fijación en acetona y la coloración con mAb seguido de Ig de ratón anti-rata peroxidasa [Boehringer Mannheim Biochemicals, nº 605-545] o Ig de conejo anti-hámster [Acccurate Chemical & Scientific Corp., nº JZY-036-003]. Las preparaciones se colorearon con Giemsa y se montaron en Permount para un análisis de campo brillante. Para la citofluorografía [FACScan, Becton Dickinson], se colorearon alícuotas de las células con mAb de rata o hámster primario seguido de Ig de ratón anti-rata FITC [Boehringer, nº 605-540] o Ig de conejo anti-hámster biotin [Accurate, JZY-066-003] y FITC-avidina.

Se examinaron preparaciones citoespin de 2-3 semanas de cultivo con un panel de mAb y un procedimiento con inmunoperoxidasa. Las células liberadas, y muchas de las células que pudieron ser desalojadas de la periferia del agregado, fueron similares en su forma estrellada y su fenotipo. La mayoría de las células se colorearon intensamente con mAb a productos MHC de clase II, el antígeno común de leucocito CD45, el receptor CR3 CD11b, y el antígeno estable al calor (HSA), y CD44. La coloración con mAb al receptor Fc [2,4G2] y antígeno del macrófago F4/80 (MAC) fue débil o indetectable en más del 95% de las células. Los cultivos contenían sólo células B raras [mAb B220, RA-3], linfocitos T [mAb thy-1, B5-5] o granulocitos [GRAN, mAb RB6]. Algunas células en la periferia del agregado, y muchas de las células que se liberaron de los agregados, se colorearon con dos marcadores que están restringidos de forma extensa a las células dendríticas. El antígeno de célula interdigitante [mAb NLDC 145 (13), IDC], que se une también al epitelio tímico, coloreó muchos pero no todos los perfiles dendríticos. Prácticamente todos los perfiles dendríticos se colorearon con mAb granulocitos de tinción 2A1 y M342 en la región perinuclear de células dendríticas maduras, de linfocitos B, así como de células interdigitantes en secciones a través de las áreas T de órganos linfoides. Los macrófagos de muchos sitios [monocitos de la sangre; macrófagos de la cavidad peritoneal; macrófagos en secciones de ganglio linfático, timo, bazo] no contienen gránulos reactivos 2A1 o M342.

Se usó citofluorografía para ganar información semicuantitativa sobre la expresión de antígenos en la superficie celular. Se aplicó un panel de mAb a dos poblaciones: células que pudieron ser desalojadas de los agregados mediante el uso de pipetas Pasteur, y células que se liberaron espontáneamente cuando se subcultivaron los agregados durante un día. Estas poblaciones "desalojadas" y "liberadas" fueron idénticas respecto a su forma dendrítica y su fenotipo excepto algunas excepciones consideradas más adelante. El fenotipo de las células liberadas se muestra en la Fig. 2, y las pequeñas diferencias entre los agregados y las células liberadas se encuentran en la Fig. 3.

Prácticamente todas las células dendríticas que se desarrollan en y desde los agregados expresaban altos niveles de antígenos comunes de leucocito [CD45, mAb M1/9,3] y antígenos estables al calor [mAb M1/69 y J11d], así como altos niveles de CD44 y CD11b [mAb M1/70]. Se detectaron bajos niveles de los siguientes antígenos sobre la superficie celular: el antígeno de célula dendrítica 33D1, el marcador macrófago F4/80, el antígeno del receptor Fc\gamma 2,4G2, el antígeno CD25 del receptor de p55 IL-2 3C7, y la integrina CD11c N418 [Fig. 2]. Estos antígenos se detectaron en todas las células mediante FACS aunque muchos de los antígenos como F4/80 y 2,4G2 eran débiles o estaban ausentes en el citoplasma con un procedimiento con inmunoperoxidasa. No estaban presentes varios antígenos: el granulocito RB6, la célula B RA3, thy-1 B5-5, CD4 GK 1,5, y el macrófago de la zona marginal SER-4 (SER-4 MZ MAC.)[Fig 2].

La expresión de los productos MHC de clase I y II mediante células dendríticas en estos cultivos fue muy alta pero no obstante bimodal [Fig 2 y Fig 3]. La mayoría de las células dendríticas que se desalojaron de los agregados presentaban niveles algo más bajos de productos MHC de clase I y II, mientras que las células dendríticas que fueron liberadas de los agregados presentaban niveles muy altos de productos MHC. El otro marcador que fue diferente en las células dendríticas liberadas y unidas de forma holgada fue NLDC 145 que fue mayor en la población liberada. [Fig. 3, paneles superiores]. Los inventores concluyeron que el fenotipo de las células que surgen de los agregados proliferantes es muy similar al observado en las células dendríticas cultivadas a partir de la piel, bazo y timo (24,28) con la excepción de que el marcador M1/70 CD11b es más abundante.

E. Autorradiografía con 3H-TdR para verificar el crecimiento de los precursores de células dendríticas

Después de dos y tres semanas en cultivo líquido, los pocillos contenían numerosos agregados celulares en expansión, y en algunos casos ya se estaban liberando grandes cantidades de células dendríticas no adherentes. Los cultivos se marcaron con 3H-timidina para identificar y fenotipificar las células proliferantes y a su progenie. Para un marcaje por pulsos, se añadió 3H-TdR a los cultivos [6 Ci/mM, 1 \muCi/ml final]. Dos horas más tarde, el medio se reemplazó por medio exento de 3H-TdR, y los cultivos se separaron en células liberadas no adherentes y agregados adherentes residuales para su examen en preparaciones citoespin [Shandon Inc, Pittsburgh PA, nº 59900102]. Las células citoespin se colorearon para antígenos específicos con mAb e inmunoperoxidasa como anteriormente. También, los portaobjetos se sumergieron en una emulsión fotográfica [emulsión para autorradiografía Kodak tipo NTB2 nº 165-4433] para su exposición [5 días] antes del desarrollo, coloreando con Giemsa, y montaje en Permount. Para los experimentos pulso-persecución, se usó una dosis inferior de 3H-TdR para mantener la viabilidad celular, pero aparte de eso las células se manipularon de forma similar. El pulso se aplicó a 0,1 \muCi/ml durante un tiempo de dos horas o de 16 horas, este último para proporcionar índices iniciales de marcaje más altos. Las células se lavaron y se sometieron a persecución durante 1-3 días antes de la recolección y análisis como anteriormente con inmunoperoxidasa, autorradiografía y coloración con Giemsa.

Los cultivos de dos y tres semanas se expusieron a 3H-TdR y se examinó la actividad proliferativa de los mismos. Las células marcadas se lavaron, se centrifugaron sobre portaobjetos, y se colorearon los citoespines con mAb y un procedimiento con inmunoperoxidasa antes de la inmersión y exposición a emulsión fotográfica. Fueron marcadores importantes los mAb 2A1 y NLDC-145 que reconocen gránulos intracelulares y un antígeno de la superficie de la célula en células dendríticas maduras respectivamente.

Cuando se marcaron los cultivos con un pulso de 2 horas de 3H-TdR, fue evidente que el índice de marcaje en los agregados fue muy alto, estando en la fase S al menos un 10-15% de los perfiles en los agregados. Por el contrario, si se aplicaba 3H-TdR a los cultivos que estaban liberando células dendríticas no adherentes típicas, la fracción liberada contenía sólo raros perfiles marcados. Si se retiraba el GM-CSF, el marcaje con 3H-TdR se terminaba en un día. Prácticamente ninguna célula marcada con 3H-TdR en el agregado marcó con mAb a los marcadores encontrados sobre las células dendríticas maduras, es decir, 2A1 y NLDC145. El nivel de tinción con mAb anti-MHC de clase II fue menor en las células en la fase S que en las poblaciones de células dendríticas liberadas [no mostrado].

Los experimentos pulso-persecución se realizaron entonces para establecer que las células marcadas en el agregado estaban dando lugar a células dendríticas típicas. Los cultivos se expusieron en primer lugar a una dosis baja de 3H-TdR, durante un tiempo de 2 horas o de 16 horas, este último para marcar un porcentaje mayor de células en los agregados. Se lavaron los pocillos libres de marcador isotópico, y después los agregados se desalojaron y separaron de las células libres por sedimentación 1g. Los agregados se transfirieron a medio recién preparado sin marcador isotópico, y durante los siguientes 1-3 días de cultivo, se liberaron muchas células dendríticas en el medio. Cuando se examinaron los cultivos sometidos a persecución, se hicieron varios descubrimientos. El índice de marcaje permaneció alto, es decir, la mayor parte de la progenie de las células que estaban proliferando en los agregados no se estaban perdiendo de los cultivos. En segundo lugar, el recuento de granos se diluyó varias veces respecto a aquellos evidentes en el pulso original. En tercer lugar, las células que expresaban los marcadores de células dendríticas maduras [NLDC145, el antígeno granular 2A1, altos niveles de MHC de clase II] no estaban radiomarcadas. Por lo tanto, los agregados celulares que el factor GM-CSF estaba induciendo en sangre de ratón cultivada estaban proliferando activamente y liberando progenie no proliferante con muchos de los rasgos citológicos y antigénicos típicos de las células dendríticas maduras, incluyendo el antígeno granular 2A1, el marcador NLDC145, y altos niveles de MHC de clase II.

F. Función celular accesoria para las respuestas proliferativas de linfocitos T

La actividad estimulante de MLR se controló en los cultivos de sangre tratada con GM-CSF. Las células de los cultivos sanguíneos se expusieron a 1500 radios [137Cs] y se aplicaron en dosis medidas a 3 x 10^{5} linfocitos T singénicos o alogénicos purificados en placas de microensayo de fondo liso de 96 pocillos. Los linfocitos T eran suspensiones de ganglio linfático y de bazo no adherentes a lana nailon, que se trataron con los mAb anti-Ia + J11d y complemento para retirar las células APC residuales. La captación de 3H-TdR se midió a las 72-86 horas [6 Ci/mM, 4 \muCi/ml final].

Inicialmente había muy poca o ninguna actividad estimulante de MLR [Fig 4, \bigstar]. Se apreció alguna actividad estimuladora en el día 1 del cultivo [Fig 4, \medcirc]. Un examen de las preparaciones de citoespin reveló que estas células sanguíneas no adherentes en el día 1 presentaban un subgrupo bajo [<0,3%] pero claro de perfiles dendríticos ricos en Ia. En el día 7, cuando los agregados proliferantes se hicieron evidentes por primera vez en la monocapa, la actividad estimulante de los agregados desalojados había aumentado más, pero todavía era 100 veces menor en actividad específica que las células dendríticas típicas [Fig 4, comparar \Delta y \medbullet] aunque la mayor parte de las células en el día 7 y los siguientes puntos temporales fueron MHC de clase II positivas. En el día 14, momento en el que las células dendríticas no adherentes típicas estaban justo empezando a liberarse de los agregados, la población no adherente presentaba una actividad estimulante de MLR considerable, [Fig 4, \nabla]. Después de tres semanas, las células dendríticas maduras típicas se habían vuelto abundantes, y estas realmente estimulaban de forma comparable a sus homólogos esplénicos [Fig 4, comparar \lozenge y \medbullet]. Otras células en el cultivo, tales como aquellas desalojadas desde los agregados, fueron aproximadamente diez veces menos activas que las células dendríticas [Fig 4, \blacklozenge]. Los investigadores concluyen que los agregados de las células dendríticas proliferantes presentan cierta actividad estimulante de MLR pero que son las células liberadas maduras las que son completamente potentes, unas 100-300 veces más activas por célula que las poblaciones en el cultivo de partida en los días 1-7. Durante el día 7-20 del cultivo, el número total de células también aumentó al menos 5-10 veces.

G. Actividad de retorno de células dendríticas in vivo

Un segundo rasgo especializado de las células dendríticas es su capacidad de retorno a las áreas T de los tejidos linfoides periféricos (8,10). Las células dendríticas u otros tipos de células fueron marcadas a 2-10 x 10^{6}/ml con carboxifluoresceína durante 10 minutos sobre hielo [Molecular Probes C-1157; concentración final 30 \muM en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) con FCS al 5%], se lavaron en RPMI 1640, y se inyectaron en un volumen de 50 \mul de RPMI-1640 en las almohadillas de las patas. Un días más tarde, se retiraron los ganglios linfáticos drenantes poplíteos, se congelaron en medio OCT, y se seccionaron [10 \mu] en un criostato. Para tomar muestras del ganglio entero, los inventores tomaron muestras duplicadas a intervalos regulares. Se aplicaron las secciones a portaobjetos multipocillo [microportaobjetos Carlson Scientific nº 111006], se almacenaron a -20ºC, se secaron en un desecador 30 minutos antes de su uso [o se dejó a temperatura ambiente durante toda una noche], se fijó en acetona, y se coloreó con un anticuerpo anti-FITC de conejo conjugado con peroxidasa [Dakopatts, P404]. Para verificar que las células dendríticas en los ganglios linfáticos estaban en las áreas dependientes de T como se describió (8), los inventores añadieron mAb apropiado a las células B, linfocitos T, macrófagos o células dendríticas y visualizaron estas últimas con Ig de ratón anti-rata conjugado con fosfatasa alcalina [Boehringer Mannheim, nº 605-5357] + un kit de cromógeno [Biomeda Corp, Foster City CA nºS04]. Los inventores después bloquearon la peroxidasa endógena con "Endo Blocker" [Biomeda Corp, nº M69] seguido de anti-FITC peroxidasa como antes.

Los leucocitos de la sangre, incluso cuando se administraban a una dosis de 10^{6} células por almohadilla de pata, no retornaron al órgano linfoide. Cuando los inventores ensayaron las células dendríticas que se habían generado con GM-CSF a partir de la sangre, observaron el retorno al área T con inyecciones de 200.000 células. La localización selectiva hacia las áreas T se confirmó marcando doblemente las muestras con mAb que colorean las células B o los linfocitos T. Por lo tanto, las células dendríticas producidas en cultivo presentan los rasgos funcionales clave de este linaje: retorno a las regiones dependientes de T y fuerte actividad accesoria.

H. Requisitos para la generación de colonias de células dendríticas a partir de sangre

El fenotipo superficial de la célula sanguínea que da lugar a las colonias de células dendríticas se evaluó por tratamiento de la población de partida con anticuerpos y complemento.

El tratamiento con anti-célula dendrítica 33D1, anti-MHC de clase II o anti-thy-1 no eliminó la unidad formadora de colonia [no mostrado]. La retirada de las células thy-1^{+} o Ia^{+}, en cambio, enriqueció el número de colonias varias veces. Se ensayaron también otros factores CSF diferentes de GM-CSF, o bien al comienzo del cultivo de 1-3 semanas, o después de la transferencia de los agregados de 2-3 semanas de edad para formar células tipo velo. Ninguno de los factores CSF ensayados, en concreto, IL-3, M-CSF, G-CSF, SCF, facilitaron la formación de colonias o células dendríticas maduras. Por lo tanto, las colonias dendríticas en crecimiento son muy dependientes de GM-CSF.

En un esfuerzo por identificar los precursores proliferantes del sistema de células dendríticas, los investigadores prepararon cultivos a partir de varios tejidos que carecían de células dendríticas maduras y suplementaron estos con diferentes factores de crecimiento particularmente los factores CSF [M-CSF, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-1 y SCF]. No se observaron precursores de células dendríticas en la epidermis neonatal, que contiene principalmente células Langerhans Ia^{-} (29). Para evitar el sobrecrecimiento de granulocitos en la mayoría de los cultivos de médula ósea que puede dificultar la identificación de colonias celulares típicas o grandes números de células dendríticas, es preferible retirar los granulocitos proliferantes no adherentes en los días 2 y 4. La sangre, que presenta pocas células dendríticas típicas en el ratón (30), demostró ser muy eficaz a la hora de obtener precursores de células dendríticas. Después de aproximadamente 6 días en cultivo aparecieron agregados de células en crecimiento, y estos a menudo estaban cubiertos con perfiles que presentan las prolongaciones celulares inusuales y móviles de las células dendríticas. Con el tiempo se liberaron células dendríticas no adherentes típicas. Estas últimas presentaban la morfología y movimiento de las células dendríticas tal y como se describió previamente en cultivos de bazo de ratón, piel de ratón, linfa de varias especies, y sangre humana (25-27). Por lo tanto, para identificar células dendríticas proliferantes parece esencial empezar con una población de partida apropiada, preferiblemente sangre, y suplementar el cultivo con GM-CSF.

Sin desear quedar ligados a ninguna teoría, los investigadores piensan que los agregados iniciales que aparecían en los cultivos representaban clones, ya que pronto se observaron grupos muy pequeños de 4-6 células, por ejemplo el día 5. Los investigadores intentaron demostrar que los agregados eran clonales mezclando células de la sangre de cepas diferenciadas con marcadores de antígenos polimórficos como CD44 y MHC de clase II. Sin embargo, los investigadores no pudieron completar los experimentos ya que encontraron que las cepas de ratón se diferenciaban en el número y velocidad con los que las colonias se desarrollaban. Las cepas BALB/C y DBA [y las cepas F1 derivadas de las mismas] fueron las más activas; B6 y B10 fueron varias veces menos activas; y las cepas como CBA/J, C3H/He, y A/J fueron fuentes pobres de agregados de células dendríticas proliferantes.

Los precursores a los agregados de células dendríticas proliferantes no eran monocitos o células dendríticas típicos porque el número de agregados que se desarrolló podía aumentarse sustancialmente si uno eliminaba los monocitos por adherencia o las células Ia-positivas con anticuerpo y complemento. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría, los investigadores concluyen de forma tentativa que la sangre contiene un precursor Ia-negativo que forma un agregado proliferante. En el agregado, las células dendríticas maduran y se liberan como progenie no proliferante.

La formación de agregados de células dendríticas requería GM-CSF exógeno. Si los agregados se colocaban en factores CSF restringidos a macrófago o granulocito [M-CSF, G-CSF], cesaba la proliferación y no se formaban ni macrófagos ni granulocitos. Al contener los cultivos macrófagos y algunas células estromales, además de los agregados de células dendríticas, fue posible que se produjeran otras citoquinas que fueron críticas para la formación de células dendríticas. Parece, sin embargo, que las células en los agregados han perdido sensibilidad a M- y G-CSF, y que las células dendríticas representan una ruta de desarrollo mieloide distinta. Quizás, si desear quedar ligados a ninguna teoría, la ruta se origina a partir de un precursor común en el que el linaje de la célula dendrítica es una rama que no responde más a factores CSF restringidos a macrófagos y granulocitos.

Para establecer las relaciones precursor-producto que estaban teniendo lugar en estos cultivos líquidos fue importante el marcaje con 3H-timidina, usando protocolos de pulsos y pulso-persecución. En un pulso de dos horas, prácticamente cada célula marcada carecía de dos típicos marcadores de células dendríticas maduras, en concreto, el antígeno de la superficie de la célula interdigitante NLDC-145 (13), y los antígenos citoplásmicos granulares 2A1/M342 recientemente identificados (34). Estos mAb no colorean la mayoría de las poblaciones de macrófagos que los investigadores han examinado como células aisladas [sangre, bazo, macrófagos peritoneales] o en secciones [corteza tímica, pulpa roja del bazo, médula del ganglio linfático]. En los protocolos pulso-persecución se liberó de los agregados un gran número de progenie marcada, y estas células liberadas fueron no adherentes, móviles, y fuertemente estimuladoras en la MLR. Después de autorradiografía y marcaje con inmunoperoxidasa combinados, la progenie marcada portaba los antígenos granulares, el antígeno NLDC-145, y niveles muy altos de MHC de clase II. Cada uno de estos marcadores citológicos y antigénicos están altamente restringidos a las células dendríticas.

Sin desear quedar ligados a ninguna teoría, los investigadores creen que la maduración hasta células dendríticas no proliferantes típicas tuvo lugar dentro del agregado. Los agregados se cubrieron con células con las prolongaciones celulares de tipo lámina o velo de las células dendríticas. También se observaron en la periferia de los agregados celulares células con marcadores de entre los marcadores de células dendríticas maduras [altos niveles de MHC de clase II, gránulos positivos 2A1, antígeno NLDC]. Sin embargo, fue difícil aislar el agregado intacto, es decir, sin desalojar estas células más maduras. El mecanismo por el que las células dendríticas maduraron y abandonaron el agregado no estaba claro. La maduración se potenció en cultivos más antiguos [> 2 semanas] o retirando las células del estroma adherente. Tanto la proliferación como la maduración se bloqueaban si los cultivos contenían demasiados fibroblastos.

La maduración funcional que tuvo lugar en el agregado proliferante es sorprendente. Las células dendríticas que se generaron en cultivo fueron potentes estimuladores de MLR. 100 células dendríticas inducían una MLR primaria mucho más fuerte que 100.000 leucocitos sanguíneos. El aumento de la actividad estimulante por célula Ia-positiva fue de al menos 2 logs entre el tiempo en que aparecieron por primera vez los agregados y el tiempo en que las células dendríticas típicas se liberaron en grandes cantidades. Durante este periodo de tiempo, la recuperación celular aumentó de 5-10 veces. También la progenie de células dendríticas retornó de una forma precisa al área de linfocito T del ganglio linfático, otra propiedad funcional que no se detectaba en células sanguíneas [no se muestran los datos].

Ejemplo 2 Generación de un gran número de células dendríticas a partir de cultivos de médula ósea de ratón suplementada con GM-CSF Materiales

A. Ratones: Se adquirieron ratones BALB/C hembra, DBA/2 macho, y C57BL/6 hembra, 7 semanas de edad, de Japan SLC [Hamamatsu, Shizuoka, Japón]. Los ratones BALB/C x DBA/2 F1, de ambos sexos, de 7-10 semanas de edad, se adquirieron de Japan SLC y del Trudeau Institute, Saranac Lake, NY.

Reactivos: El medio de cultivo fue RPMI-1640 [Nissui, Tokyo, Japón; GIBCO, Grand Island, NY] suplementado con FCS al 5%, 2-mercaptoetanol 50 \muM, y gentamicina 20 \mug/ml. Kirin Brewery Co [Maebashi, Gumma, Japón] proporcionó amablemente rGM-CSF murino [10^{8} U/mg de proteína]. Se describe en otra parte de esta memoria un panel de mAb de rata y hámster a antígenos de leucocito de ratón (23,24). Se adquirieron en Boehringer Mannheim [Indianapolis, IN] los IgG de ratón anti-rata conjugados con FITC y peroxidasa y los Ig de cabra anti-hámster conjugados con FITC y peroxidasa [cadena \gamma y L] se adquirieron en Jackson Immunoresearch Lab [Westgrove, PA] y Caltag [San Francisco, CA] respectivamente.

B. Cultivos de médula ósea: Después de retirar todos los tejidos musculares con una gasa de los fémures y tibias de ratón, los huesos se colocaron en una placa de 60 mm con alcohol al 70% durante un minuto, se lavaron dos veces con PBS, y se transfirieron a una placa recién preparada con RPMI-1640. Ambos extremos de los huesos se cortaron con unas tijeras en la placa, y después la médula se retiró por inundación usando 2 ml de RPMI-1640 con una jeringa y una aguja de calibre 25. El tejido se suspendió, se pasó a través de una malla de nailon para retirar los pequeños trozos de hueso y restos, y se lisaron los eritrocitos con cloruro amónico. Después del lavado, se mataron los linfocitos y células Ia-positivas con un cóctel de mAb y complemento de conejo durante 60 minutos a 37ºC. Los mAb fueron anti-CD4 GK 1,5, anti-CD8 HO 2,2, anti-Ia B21-2, y anti-B220/CD45R RA3-3A1/6,1 obtenidos todos de ATCC [TIB 207, 150, 229, y 146 respectivamente]. Se colocaron 7,5 x 10^{5} células en placas de 24 pocillos [Nunc, Naperville, IL] en 1 ml de medio suplementado con 500-1000 U/ml de rGM-CSF. Los cultivos se alimentaron cada dos días normalmente durante aproximadamente 2 a 10 días, agitando suavemente las placas, aspirando los ¾ del medio, y añadiendo de nuevo medio recién preparado con GM-CSF. Un objetivo de estos lavados fue retirar los granulocitos no adherentes sin desalojar las agrupaciones de células dendríticas en desarrollo que estaban unidas de forma holgada a macrófagos firmemente adherentes.

Para enriquecer la cantidad de las células dendríticas en crecimiento, los inventores utilizaron un procedimiento similar al descrito para los cultivos de células de sangre de ratón del ejemplo 1. Brevemente, los agregados de células unidas se desalojaron con pipetas Pasteur y se aplicaron a columnas de 6 ml de FCS-RPMI 1640 al 50%. Los granulocitos residuales en los cultivos, a menudo también en los agregados, se disociaron fácilmente en esta etapa. Tras la sedimentación 1g de las células desalojadas, las agrupaciones se movieron hacia el fondo del tubo y los granulocitos individuales quedaron en la parte superior. Los agregados se subcultivaron a 2-3 x 10^{5}/ml en medio recién preparado con GM-CSF, típicamente durante un día en pocillos de 16 mm. Después del cultivo durante toda una noche, se liberaron un gran número de células dendríticas típicas. En estos cultivos se expandieron también los macrófagos adherentes, pero la mayoría permaneció firmemente adherida a la superficie del cultivo.

C. Comparación citológica de precursores de células dendríticas y no-linfocitos de médula ósea Ia-negativos

Para comparar las fracciones liberada [enriquecida con células dendríticas; parte superior] y adherente [enriquecida con macrófagos; parte inferior] de cultivos de médula ósea de 7 días, se cultivaron no-linfocitos de médula ósea, Ia-negativos en GM-CSF. En los días 2 y 4, se retiraron células no adherentes mediante un suave lavado y en el día 6, se aislaron los agregados de células unidas de forma holgada mediante sedimentación 1g. Después de un día de cultivo, las células que se liberaron de los agregados se citocentrifugaron sobre portaobjetos de vidrio y se colorearon con diferentes mAb + anti-Ig peroxidasa así como Giemsa y esterasa no específica. Las células firmemente adherentes en los cultivos originales se desalojaron con EDTA y también se citocentrifugaron. En la fracción liberada hay muchos perfiles dendríticos [una lente manual es útil para detectar la forma de las células y los granulocitos contaminantes, en el tinte Giemsa], mientras que las células adherentes son en la mayoría macrófagos vacuolados típicos. Sobre todas las células liberadas pero sólo para unos pocos granulocitos típicos tiene lugar una fuerte expresión de MHC de clase II. Sólo un subgrupo de las células firmemente adherentes expresan la clase II. La mayor parte de las células liberadas expresan el antígeno vacuolar endocítico 2A1, mientras que las células adherentes son 2A1 débiles o negativas.

D. Antígenos de superficie celular e intracelulares: La coloración de la superficie celularutilizó citofluorografía [FACScan; Becton Dickinson, Mountain View CA]. A la coloración con mAb de hámster o rata primarios le siguió Ig de cabra anti-hámster o Ig de ratón anti-rata conjugado con FITC como se describe en el ejemplo 1D. Se ensayó sobre las preparaciones de citoespin un panel de mAb a los antígenos de superficie celular (23,24) e intracelulares (33,34). Los investigadores estudiaron tanto las poblaciones adherentes como las no adherentes, desalojándose las primeras en presencia de EDTA 10 mM [las células adherentes se lavaron dos veces con PBS y una vez con EDTA-PBS, y después se incubaron con EDTA-PBS durante 20 minutos a 37ºC]. Los citoespines se fijaron en acetona y se colorearon con mAb seguido de Ig anti-hámster o anti-rata conjugado con peroxidasa. La peroxidasa se visualizó con diaminobencidina, y los núcleos se contracolorearon con Giemsa.

E. Ensayos citológicos: Las coloraciones con Giemsa se realizaron sobre preparaciones de citoespin como fue el caso del tinte con esterasa no específica [acetato de \alpha-naftilo como sustrato] usando procedimientos convencionales (35) excepto por el hecho de que las preparaciones de citoespin se fijaron con glutaraldehído al 2% en medio de Hanks en lugar de formalina acetona tamponada. Las observaciones por contraste de fase, normalmente de células vivas, se realizaron con microscopios invertidos [Nikon Diaphot] a un aumento final de 100 y 400X. Se realizaron microscopía por transmisión de electrones (36) y autorradiografía con ^{3}H-timidina sobre las células dendríticas en desarrollo tal y como se describe en el ejemplo 1E.

F. Reacciones con leucocitos mezclados: Se expusieron a 15 Gy de irradiación por rayos X células procedentes de cultivos de médula ósea y se aplicaron en dosis medidas a 3 x 10^{5} linfocitos T alogénicos o singénicos en placas de cultivo de fondo plano y de 96 pocillos durante cuatro días. Los linfocitos T se prepararon pasando suspensiones de bazo y ganglio linfático a través de lana nailon y después eliminando las APC residuales con anticuerpos anti-Ia + J11d + complemento. Se midió la captación de 3H-timidina 80-94 horas después de un pulso de 4 \muCi/ml [222 GBq/mmol; American Radiolabeled Chemicals, Inc, St. Louis, MO].

G. Agregados de células dendríticas proliferantes a partir de médula ósea de ratón suplementada con GM-CSF

Antes del cultivo, los investigadores trataron las suspensiones de médula con un cóctel de mAb a antígenos de células B, linfocitos T, y antígenos de MHC de clase II + complemento. Este pretratamiento de células de médula ósea que reduce el número de células B y granulocitos, es necesario para identificar células dendríticas en crecimiento en la médula ósea porque las células B y los granulocitos son también sensibles a GM-CSF y proliferan y enmascaran la presencia de precursores de células dendríticas.

Por consiguiente, en el día 2 y en el día 4 del cultivo, los investigadores agitaron suavemente las placas para retirar las células adherentes de forma holgada que se demostró que eran granulocitos típicos en la morfología y expresión del antígeno RB6 [véase más adelante]. Con estas etapas, los investigadores reconocieron el día 4 agregados celulares unidos a una capa de células adherentes. Algunos de los perfiles en los agregados presentaban las prolongaciones celulares de tipo lámina o velo de las células dendríticas. Los agregados pudieron desalojarse mediante un suave pipeteo y se separaron por sedimentación 1g. En tres horas de redisposición en placas, muchas células adherentes espinosas emigraron desde las agrupaciones y presentaban la apariencia de células adherentes esplénicas recientes (13). Después de otro día de cultivo, estas células adherentes se desprendieron de la superficie y se observaron muchas células dendríticas típicas flotando en el medio de cultivo. Cuando el día 6 se recogieron los agregados se obtuvieron rendimientos de células dendríticas óptimos y después se cultivaron durante una noche entera. La capacidad de la médula ósea de generar células dendríticas es sorprendente, > 5 x 10^{6} a partir de los cuatro huesos principales de las extremidades traseras en una semana.

Unidas a la superficie de los pocillos de cultivo se encontraban células con los rasgos citológicos de los macrófagos, y estas también se expandieron en número durante la primera semana de cultivo. Estas células pudieron desalojarse por pipeteo después de incubación a 37ºC en presencia de EDTA 10 mM.

Si se mantenían los cultivos en M-CSF, se desarrollaba un gran número de macrófagos y se unían firmemente a la superficie plástica. Sin embargo, no se observaban células dendríticas o agregados de células dendríticas. Si se aplicaba una mezcla de M-CSF y GM-CSF, entonces se observaban colonias de macrófagos adherentes así como agregados de granulocitos en crecimiento y células dendríticas.

H. Desarrollo de potentes células estimuladoras de MLR en cultivos de médula ósea

Es sabido que las suspensiones de médula ósea de ratón no son activas como estimuladores de MLR (38) y no contienen células dendríticas detectables (30). Dadas las observaciones citológicas anteriores, los investigadores cultivaron no-linfocitos de médula ósea Ia-negativos durante 6 días y se comprobó su actividad estimuladora de MLR a intervalos diarios. En tanto en cuanto se suplementaran los cultivos con GM-CSF, se desarrollaba una fuerte actividad estimuladora de MLR [Fig 5]. El aumento fue progresivo y hacia el día 6, tan sólo 100 de las células de la médula indujeron MLR con índices de estimulación de 20 o más.

Para correlacionar el desarrollo de la actividad estimulante de MLR con la aparición de células dendríticas en estos cultivos heterogéneos, los investigadores separaron en primer lugar los cultivos en fracciones no adherentes y adherentes de manera holgada [Fig 6A]. Las células no adherentes, que eran principalmente granulocitos en los primeros cuatro días, se obtuvieron mediante agitación suave de las placas y recogida de las células. Las células adherentes de manera holgada, que contenían los agregados de los presuntos precursores de células dendríticas y de las células dendríticas en el día 4 y momentos posteriores, se desalojaron por pipeteo sobre la superficie de células estromales firmemente adherentes. En los días 2 y 4, la actividad estimulante más potente se dio en la fracción adherente. En el día 6, la fracción no adherente fue muy activa. Si uno evaluaba los macrófagos firmemente adherentes, no se observaba actividad estimulante de MLR [Fig 6B, cuadrados vacios].

Tal y como se mencionó anteriormente, en presencia de GM-CSF los cultivos desarrollaban agregados de células en crecimiento que liberaban células dendríticas típicas entre los días 4-8 del cultivo. Estos agregados pudieron aislarse por pipeteo suave sobre la monocapa seguido de sedimentación 1g. Cuando los agregados se devolvieron al cultivo, se liberaron las poblaciones enriquecidas en células dendríticas, y estas células liberadas se demostró que presentaban una actividad estimulante de MLR muy fuerte que es característica de las células dendríticas [Fig 6B].

I. Marcadores de la superficie celular-citofluorografía

Mediante citofluorografía, se distinguieron fácilmente dos poblaciones de células en las células no adherentes o fácilmente desalojadas. Una población presentaba una baja dispersión de luz hacia delante, altos niveles del antígeno RB6, y bajos niveles de MHC de clase II. La otra población era mayor y presentaba el fenotipo recíproco. Las células agregadas estaban enriquecidas respecto a cultivos no fraccionados en células de MHC de clase II positivas [Fig 8, comparar izquierda con el centro], y el nivel de MHC de clase II en células individuales aumentó cuando los agregados se cultivaron durante una noche para liberar poblaciones altamente enriquecidas de células dendríticas [Fig 8, comparar el centro con derecha]. Se observaron en los cultivos del día 6 frente a los del día 4 más células negativas de antígeno RB6 ricas en MHC de clase II [Fig 8]. Ninguna de las células reaccionó con los mAb del antígeno B220 de las células B o el antígeno SER-4 de macrófagos [no mostrado].

Se realizaron estudios FACS más detallados en las células que se habían liberado de los agregados. Los granulocitos se excluyeron sobre la base de una inferior dispersión de luz hacia delante. Las mayores células dendríticas presentaban niveles uniformemente altos de MHC de clase I y II así como CD44 y CD11b [Mac-1; M1/70]. Se observó coloración de nivel intermedio para el antígeno estable al calor [HSA; M1/69], CD45 [M1/9,3], y CD18 [2E6]. Fue evidente una coloración a un nivel inferior para el receptor IL-2 de baja afinidad [CD25, 7D4], antígeno de célula interdigitante [NLDC-145], receptor Fc\gamma [2,4G2], antígeno de célula dendrítica [33D1], antígeno de macrófago [F4/80], e integrina-\beta2 CD11c p150/90 [N418]. No fueron detectables varios antígenos incluyendo los marcadores de fagocito [macrófago de la zona marginal SER-4, granulocito RB6] y linfocito [linfocito B RA3-6,1; linfocito T CD3,4,8 y thy-1]. Este fenotipo es similar en muchos aspectos al observado en células dendríticas epidérmicas y esplénicas (24, 27, 28). La única excepción es el alto nivel en las células derivadas de médula de CD11b, una integrina que ayuda a mediar en la migración de células mieloides a partir de la vasculatura.

J. Preparaciones citoespin

Se prepararon citoespines para comparar adicionalmente las células dendríticas liberadas con la población estromal firmemente adherente. Mediante la coloración con Giemsa, las células que se habían liberado de los agregados presentaban la típica forma estrellada de las células dendríticas, mientras que las células adherentes eran en su mayor parte macrófagos vacuolados. Muchas de las células dendríticas presentaban una mancha perinuclear de tinte de esterasa no específica, mientras que las poblaciones más adherentes presentaban abundante esterasa citoplásmica.

Las células liberadas se colorearon intensamente para los productos MHC de clase II, excepto por los contaminantes con núcleos de granulocito típicos. Las células fuertemente adherentes contenían una subpoblación de células positivas de clase II. Recientemente, se han descrito antígenos que se localizan principalmente en vacuolas intracelulares de células dendríticas y células B pero no fagocitos mononucleares. Los anticuerpos se denominan M342 (34) y 2A1. Muchas de las células dendríticas presentaban una fuerte coloración 2A1, y un número menor expresaban M342. Las células adherentes presentaban unos pocos perfiles con 2A1 débil.

El desarrollo de las células Ia-positivas, y las células que expresan antígenos intracelulares granulares, se cuantificó sobre citoespines [Fig 10]. Los antígenos MHC de clase II se expresaron en primer lugar, seguidos por los antígenos granulares 2A1 y M342 [Fig 10]. El día 8, la mayoría de las células eran dendríticas y presentaban altos niveles de productos MHC de clase II y antígeno 2A1. Si los granulocitos no eran retirados de los cultivos, el rendimiento de las células no adherentes era mucho mayor pero el porcentaje mayor de células positivas MHC de clase II que los investigadores detectaron fue del 30%, y fue difícil identificar y aislar los agregados que fueron los sitios de crecimiento de las células dendríticas.

Cuando se colorearon los citoespines para otros antígenos mieloides, las células liberadas se colorearon débilmente y a veces en absoluto por encima del nivel de fondo con monoclonales al receptor Fc\gamma [2,4G2] y antígeno restringido a macrófago [F4/80]. Por el contrario la mayoría de las células firmemente adherentes se colorearon intensamente para ambos antígenos. Esto sugiere que mientras que se encuentren bajos niveles de 2,4G2 y F4/80 en la superficie de las células dendríticas liberadas, la síntesis y expresión están siendo probablemente reguladas a la baja como ocurre cuando las células dendríticas epidérmicas se sitúan en cultivo (27).

El día 4, unas 30-50.000 células Ia-positivas se encontraban flotando en los cultivos, mientras que tanto en el día 6 como en el día 8, se recogieron otras 50-100.000 células Ia-positivas. Los datos cuantitativos indicaron que cada pocillo produjo unas 200.000 o más células Ia-positivas en una semana. Como los investigadores habían obtenido aproximadamente 20-30 pocillos de células Ia-negativas de médula de partida a partir de dos tibias y dos fémures, el rendimiento total de las células Ia-positivas es de 5 x 10^{6} o más, excediendo el número total estimado de células Langerhans en la piel de un ratón (27).

K. Experimentos pulso-persecución con 3H-timidina

Para documentar adicionalmente la proliferación y diferenciación de las células dendríticas en estos cultivos, se aislaron agrupaciones de células en el día 4, se expusieron a un pulso de 12 horas de 3H-timidina, y se examinaron por autorradiografía inmediatamente o después de 1, 2 y 3 días de persecución en medio exento de 3H-timidina. La mayoría de las células en el agregado se marcaron inicialmente, y casi todas las células liberadas de los agregados se marcaron. Durante la persecución, porcentajes en aumento de la progenie liberada expresaban el antígeno gránulo 2A1 de células dendríticas maduras.

L. Microscopía electrónica

Las células liberadas presentaban muchos velos grandes o lamelipodios extendiéndose desde varias direcciones del cuerpo de la célula. El citoplasma tenía muchas mitocondrias, pocos gránulos y lisosomas densos en electrones, pero varias vesículas translúcidas electrónicas algunas con los rasgos citológicos de los cuerpos multivesiculares. Las numerosas prolongaciones celulares que se extienden desde las células dendríticas fueron evidentes en las secciones semifinas de las preparaciones de esta invención.

Una célula dendrítica derivada de la médula ósea muestra en el día 5 de cultivo muchos velos citoplásmicos. Un primer plano de la región perinuclear muestra perfiles del retículo liso y vacuolas. Hay unas pocas estructuras lisosómicas o fagocíticas.

Ejemplo 3 Progenitores de células dendríticas de ratón fagocitan partículas sensibilizando ratones frente a antígenos micobacterianos in vivo. Materiales y procedimientos

A. Ratones: Ratones machos y hembras BALB/C X DBA/2 F1, C57BL/6 X DBA/2 F1, y BALB/C se compraron al Instituto Trudeau [Saranac Lake, NY], y a Japan SLC [Hamamatsu] y se usaron a las 6-10 semanas de edad.

B. Cultivos de médula ósea: Como se describe en el ejemplo 2 anterior, se inundó la médula ósea procedente de los fémures y tibias, se liberó de eritrocitos con cloruro amónico al 0,83%, y se cultivó en placas de 24 pocillos [Nunc, Napaville, IL y Corning nº 25820, Corning NY] a 10^{6} células/pocillo en 1 ml de RPMI-1640 suplementado con suero de ternera fetal al 5%, 20 \mug/ml de gentamicina, y 1000 U/ml de GM-CSF murina recombinante [Kiren Brewery, Maebashi, Gumma, Japón; 9,7 x 10^{7} U/mg]. El día 2, se retiraron 0,75 ml de medio y células no adherentes, y se reemplazaron con medio recién preparado. Esto se repitió los días 4-5, retirando por ello la mayoría de los granulocitos en desarrollo y dejando atrás agrupaciones de células dendríticas proliferantes adherentes a un estroma que incluían macrófagos dispersados. El medio de cultivo se suplementó después con partículas de micobacteria BCG [descrito en mayor detalle más adelante], y se dejó que tuviera lugar la fagocitosis durante 20-24 horas normalmente durante los días 5- 6. En este momento los cultivos se lavaron y quedaron libres de células sueltas y partículas, y se analizó inmediatamente la captación de partículas por parte de las células. Alternativamente, las células en los cultivos lavados se desalojaron y 3-4 x 10^{6} células se transfirieron a una placa Petri de 60 mm para someterlas a un periodo de "persecución" de 1 ó 2 días en medio suplementado con GM-CSF recién preparado y libre de partículas. Las células dendríticas maduras y ricas en clase II se desarrollaron durante la persecución como se describió en el ejemplo 2, y se aislaron por aislamiento de células en FACS [más adelante]. Para comparar la actividad fagocítica de las células dendríticas maduras y en desarrollo, se administraron también partículas a los cultivos de médula ósea de 7-8 días que son ricos en células dendríticas maduras no proliferantes individuales.

C. Particulados: Se administraron micobacterias BCG [Trudeau Institute, 1,5-2,5 x 10^{8} CFU (unidades formadoras de colonia)/ml; Kyowa Pharmaceutical Industries, Tokyo] a aproximadamente 10^{7} BCG vivo por pocillo de 16 mm de diámetro. La captación se evaluó siguiendo una coloración "resistente a ácidos" usando un procedimiento de auramina-rodamina que es más sensible que Ziehl Neelsen y facilita los recuentos del organismo. Se añadió carbono coloidal [Pellikan Ink, Hannover, Alemania] a una dilución 1:2000. El carbono se identificó como una tinción granular negra en muestras coloreadas con Diff-Quik® [Baxter Healthcare Corp, Miami, FL]. Se aplicaron suspensiones de partículas de látex 2u [0,5% v/v; Seradyn, Indianapolis, IN] a los cultivos a 50 \mul/pocillo, una dosis que cubre la superficie del pocillo de cultivo con perlas.

D. Aislamiento de células dendríticas maduras por aislamiento de células en FACS

Tal y como se mencionó anteriormente en el ejemplo 2, las células dendríticas que se producen en cultivos de médula ósea estimulada con GM-CSF expresan niveles muy altos de productos MHC de clase II superficiales [monoclonales B21-2, TIB 227 y M5/114, TIB 120 de ATCC] así como niveles moderados de un antígeno restringido a célula dendrítica reconocido por NLDC-145 monoclonal.

Inmediatamente después del pulso con BCG, o después de dos días adicionales de cultivo de "persecución", las células se colorearon con B21-2 biotina y FITC-estreptavidina [Tago, Burlingame, CA]. Las células ricas en clase II se aislaron después [FACStar Plus, Becton Dickinson, Mountainview, CA] y se citocentrifugaron sobre portaobjetos de vidrio [Shandon Inst. Sewicky, PA]. Las células aisladas se colorearon con Diff Quick® que perfila la forma estrellada de las células dendríticas en citoespines y permite la enumeración de perfiles que contienen depósitos perinucleares de carbono coloidal o de esferas de látex internados. Para visualizar BCG, los citoespines se fijaron en acetona absoluta durante 10 minutos a temperatura ambiente y se colorearon con anti-clase II M5/114, anti-célula dendrítica NLDC-145, o anti-B220 RA3-6B2 o anti-célula B [el último como control] seguido de Ig de ratón anti-rata conjugado con POX [Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN] y diaminobencidina tetraHCl [Polyscience Inc, Warrington, PA]. Las preparaciones después se marcaron doblemente para los bacilos resistentes a ácido con auramina rodamina. Prácticamente todas las células en la preparación eran ricas en NLDC-145 y productos MHC de clase II. Se enumeró el número de bacilos BCG en al menos 400 células.

E. Microscopía electrónica: Para probar que se habían internado todos los BCG asociados a célula, las células dendríticas producidas en los protocolos pulso-persecución [anteriores] se fijaron en glutaraldehído al 2,5% y se procesaron para EM (microscopía electrónica) como se describió en el ejemplo 2.

F. Presentación de antígeno in vitro : Se cebaron ratones con adyuvante de Freunds completo [CFA, SIGMA, St. Louis, MO; 25 \mul en las patas anteriores y posteriores] o como un control, el adyuvante de Freunds incompleto exento de micobacterias [ICFA]. De 7 a 14 días más tarde, los ganglios linfáticos drenantes se disociaron en una suspensión celular individual y se liberaron de APC con mAb a antígenos de MHC de clase II, de B220, y antígenos estables al calor [anti-Ia M5/114, anti-B220 RA3-6B3, y anti-HSA J11d; TIB 120, 146, y 183 de ATCC respectivamente] y complemento de conejo. Se cultivaron en placas de microensayo de fondo plano de 96 pocillos [Corning nº 25860] 3 x 10^{5} de estos linfocitos T cebados, libres de APC en medio RPMI-1640 suplementado con suero de ratón al 0,5% y 2-mercaptoetanol 50 \muM. Se añadieron dosis medidas de APC pulsadas con BCG, de médula ósea o de bazo. Se añadió 1 \muCi de 3H-timidina de captación [NEN, Boston, MA; 20 Ci/mmol; 4 \muCi/ml] para controlar la síntesis de ADN a las 72-88 horas. Los datos se muestran como medias de triplicados en los que los errores típicos fueron < 15% de la media.

G. Presentación de antígeno in vivo : Se administraron in vivo APC que se habían pulsado con antígeno in vitro a ratones CXD2 F1 no cebados. Para cebar los linfocitos T en los ganglios linfáticos drenantes, se inyectaron en la patas 2 x 10^{5} células dendríticas, y 5 días más tarde estuvieron preparadas las células del ganglio linfático. Para cebar los linfocitos T en el bazo, se inyectaron por vía i.v. 10^{6} células, y 5 ó 10 días más tarde estuvieron preparados los esplenocitos. Para medir el cebado de los linfocitos T, se cultivaron la mayoría de las células del ganglio linfático o del bazo como antes y se expusieron con dosis medidas de antígenos de proteína, o bien derivados de proteína purificados [PPD, de Statenserum Institute, Copenhague, Dinamarca, o procedentes del Dr. Ichiro Toida, Research Institute for BCG en Japón, Kiyose, Tokyo] o albúmina de suero bovino [Sigma] y se midió la captación de 3H-timidina en los días 72-88. Para caracterizar las células proliferantes, se trataron las poblaciones con anticuerpos y complemento antes de medir la captación de 3H-timidina.

H. Fagocitosis de partículas de látex dentro de agrupaciones de células dendríticas en desarrollo: protocolos de pulso y pulso-persecución

Cuando se estimula la sangre o la médula ósea de un ratón con GM-CSF, aparecen agregados de células proliferantes, y estos dan lugar a un gran número de células dendríticas inmunoestimuladoras típicas. En la médula ósea, que se usó para los experimentos descritos más adelante, los agregados proliferantes se identifican mejor retirando por lavado la mayor parte de los granulocitos no adherentes que están también inducidos por GM-CSF en los cultivos. En los días 5-6, momento temporal en el que por primera vez se pudo medir el tamaño de los agregados [5-10 células de ancho], los investigadores aplicaron diferentes partículas durante un periodo de 20-22 horas.

Después de la administración de las esferas de látex 2u, se observó un marcaje pesado en los macrófagos dispersados sobre la monocapa. Además, apareció cierto marcaje claro en los agregados de células dendríticas en desarrollo [Fig 12A].

Los agregados que habían sido expuestos a partículas se volvieron a cultivar durante dos días adicionales. Durante este tiempo, se liberaron un gran número de células a la suspensión. Estas fueron principalmente células dendríticas maduras con formas estrelladas características y altos niveles de antígenos MHC de clase II y NLDC-145. Cuando las células liberadas se examinaron por microscopía luminosa, muchas de ellas contenían esferas de látex y a menudo alrededor de una zona perinuclear clara o centroesfera [Fig 12B]. Los investigadores estudiaron también de forma similar la captación de carbono coloidal. Cuando los agregados se pulsaron con coloide y se permitió la formación de células dendríticas maduras durante un periodo de persecución, algunas de las células liberadas presentaban una centroesfera con depósitos de carbono pequeños pero de corte limpio [Fig 12C]. Por el contrario, cuando se ofreció látex o carbono para la maduración de células dendríticas, tuvo lugar muy poca captación [Fig 12D].

I. Captación de micobacterias BCG por células dendríticas en desarrollo-tintes resistentes a ácido

Se administraron micobacterias BCG vivas como alimento fagocítico durante un periodo de 20-22 horas usando el protocolo para la administración de partículas de látex descrito anteriormente. Se visualizaron bacilos asociados celularmente mediante una coloración resistente a ácido fluorescente sensible. Después de un pulso de 20 horas, los agregados de células dendríticas en desarrollo contenían muchos organismos. Para aislar las células dendríticas más maduras de los cultivos, las células se volvieron a suspender y se aislaron aquellas células con niveles altos de productos MHC de clase II. Inmediatamente después del pulso con BCG, aproximadamente el 20% de las células aisladas contenían bacilos resistentes a ácido [Tabla 1]. La mayoría de las células débiles en MHC de clase II no se estudiaron más debido a la adherencia excesiva durante el aislamiento celular.

Se estudiaron después cultivos de células compañeras después de 2 días de un cultivo de persecución. Al formarse muchas células dendríticas maduras durante el periodo de persecución, el número de progenie rica en Ia había aumentado cuatro veces [Tabla 1].

TABLA 1 Frecuencia de células dendríticas con organismos BCG fagocitados en cultivos de médula ósea de ratón estimulada con GM-CSF

N^{o}	Exposición a BCG	N^{o} células	%	N^{o} de
Exp		contadas	fagocítico	BCG/CD
1	Pulso días 5-6	469	18,1	2,6
		498	18,5	2,5
2	Pulso días 5-6	444	22,5	3,0
		463	22,2	2,9
Pulso, persecución de dos días	564	57,1	3,8
		579	57,0	3,2
3	Pulso días 5-6	440	21,8	2,1
		623	22,8	2,9
Pulso, persecución de dos días	487	50,3	2,9
		511	58,7	4

Datos cuantitativos de células dendríticas que contienen BCG.

Se estimularon con GM-CSF cultivos de médula ósea de ratón en pocillos de 16 mm durante 5 días, se lavaron, y se expusieron a organismos BCG durante 20 días. Los cultivos se lavaron otra vez y se examinaron inmediatamente, o se combinaron y transfirieron a una placa de 60 mm para realizar un cultivo de persecución de dos días adicional. Las células dendríticas en los cultivos se seleccionaron como células ricas en Ia usando un citofluorímetro y después citocentrifugando sobre portaobjetos de vidrio para llevar a cabo una tinción para bacilos resistentes a ácido. Durante el periodo de persecución, el porcentaje de células ricas en Ia en los cultivos aumentó 2-2,5 veces, y el número total de células aumentó 2 veces, dando como resultado un aumento de 4-5 veces en el número de células ricas en Ia.

El porcentaje de células dendríticas que contenían BCG también se elevó al 50% [Tabla 1, Fig 13]. Los experimentos de doble marcaje verificaron que las células con bacilos resistentes a ácido expresaban MHC de clase II y el antígeno NLDC 145 restringido a célula dendrítica [Fig 13]. Al haber aumentado cuatro veces en sólo dos días el número total de células positivas MHC de clase II y NLDC-145, es probable que estas células dendríticas cargadas de BCG se derivaran de progenitores menos maduros pero fagocíticos en los agregados.

J. Microscopía electrónica de APC pulsadas con BCG

La localización perinuclear de las partículas asociadas celularmente por microscopía luminosa indicó que los organismos se habían internado. El asunto fue verificado por microscopía electrónica. Aproximadamente el 50% de los perfiles de células dendríticas contenían BCG internado, aunque el número de organismos por perfil era pequeño, normalmente uno pero sólo hasta cuatro, Figs. 14 A, B. Cada organismo parecía ocupar su propia vacuola. Parecía que una membrana fagosomal aproximaba estrechamente a la mayoría de los bacilos, Fig. 14 C, D.

K. Presentación in vitro de antígenos micobacterianos a linfocitos T cebados

Para ensayar la función de presentación de las células dendríticas que habían sido pulsadas o sometidas a pulso-persecución con organismos BCG, los inventores prepararon en primer lugar linfocitos T sensibles a antígeno a partir de ganglios linfáticos drenantes de ratones a los que se les había inyectado CFA [adyuvante de Freund completo, que contiene micobacterias inactivadas por calor] o con adyuvante de Freund incompleto [IFA como control; véase procedimientos]. Cuando las células dendríticas se añadieron a los linfocitos T cebados con IFA, se observó una reacción con leucocitos mezclados singénicos. Esto fue comparable tanto si las células APC habían sido expuestas a BCG o no. [Fig 15, derecha]. Sin embargo, cuando las células dendríticas habían sido pulsadas con BCG y añadidas a linfocitos T cebados con CFA, se indujeron fuertes respuestas proliferantes [Fig 15, izquierda]. Si las células dendríticas se ensayaban inmediatamente después del pulso de un día, o después de un periodo de persecución de dos días adicional, la población perseguida era mucho más potente. [Fig 15, izquierda; comparar \blacklozenge y \blacktriangledown]. Tan sólo 100 células dendríticas sometidas a pulso-persecución con BCG provocaban respuestas de linfocitos T medibles in vitro [Fig 15, izquierda \blacklozenge]. Las poblaciones sometidas a pulso-persecución con BCG también fueron de 5-10 veces más potentes a la hora de inducir sensibilidad respecto a antígenos micobacterianos que las células dendríticas maduras expuestas recientemente a PPD o bien a BCG. [Fig 15 izquierda, comparar \blacklozenge con \medbullet, \blacktriangle]. Por lo tanto, parece que el grado de fagocitosis se correlaciona con la eficacia de la presentación, al ser las poblaciones sometidas a pulso-persecución las APC más activas y contener la mayoría de BCG intracelular. [Tabla 1].

L. Presentación in vivo de antígenos micobacterianos a ratones insensibilizados

Se ensayaron poblaciones comparables de APC pulsadas con BCG, y pulsadas-perseguidas con BCG para estudiar su capacidad de presentación de antígenos micobacterianos a ratones no cebados. Después de la inyección en las almohadillas de las patas, se observó una fuerte sensibilidad hacia PPD. [Fig 16]. De nuevo las células dendríticas fueron las más potentes si se ensayaban después de una persecución de dos días [Fig 16; comparar \lozenge y \Delta], y este periodo de persecución aumentó en gran medida el rendimiento total de las células dendríticas.

Para ensayar si el aumento de la función de presentación de antígenos de las células dendríticas sometidas a pulso-persecución con BCG estaba relacionado con el aumento en el número de células APC que portaban BCG, se ensayaron también poblaciones cebadas para estudiar la sensibilidad hacia albúmina de suero bovino [BSA], ya que las células dendríticas habían crecido en presencia de suero de ternera fetal. Todas las poblaciones de células dendríticas, independientemente de los detalles de la exposición a BCG, cebaron a los ratones de forma similar respecto a BSA. [Fig 16, símbolos rellenos]. Esto indica que cada población fue eficaz de forma comparable en la inmunización a una proteína soluble, mientras que las células dendríticas que habían fagocitado BCG fueron más eficaces en la provocación de respuestas a antígenos micobacterianos.

Los marcadores de superficie de las células cebadas se ensayaron mediante lisis mediada por anticuerpo y complemento de las poblaciones antes de la medición de la captación de 3H-timidina [datos no mostrados]. Las células proliferantes fueron positivas para thy-1, pero negativas para MHC de clase II, antígeno estable al calor, y B220. El sobrenadante del cultivo de hibridoma anti-CD4 bloqueó la proliferación en más de un 85%, es decir, las células cebadas fueron linfocitos T de tipo auxiliar.

Se observó también el cebado cuando los linfocitos T del bazo se ensayaron después de una infusión intravenosa de células dendríticas sometidas a pulso con BCG y sometidas a pulso-persecución con BCG [Fig 17]. Las células fueron más sensibles a los 5 días frente a los 10 días después de la inyección [comparar Figs 17 A y C]. De nuevo las células dendríticas que habían sido cultivadas ["perseguidas"] durante dos días después de la exposición a BCG fueron las más potentes [Fig 12 comparar \blacklozenge con \blacktriangle; pero todas las poblaciones cebaron las células del bazo de forma similar respecto a BSA [Fig 17B]. Los investigadores concluyen que los progenitores de células dendríticas capturan y retienen antígenos micobacterianos de una manera que es altamente inmunogénica in vivo.

Ejemplo 4 Células dendríticas activadas por antígeno como inmunógenos

Se disponen en placas células dendríticas preparadas de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 1 a una concentración de aproximadamente 1 x 10^{5} células por pocillo de una placa de cultivo de plástico de 24 pocillos. Las células se incuban en RPMI 1640 que contiene suero de ternera fetal al 5% y GM-CSF (30 u/ml). Se añade antígeno a los cultivos de células dendríticas y los cultivos se incuban con antígeno durante aproximadamente cuatro horas o durante tiempo suficiente para permitir a las células dendríticas manipular el antígeno de una forma inmunológicamente relevante, o de una forma que pueda ser reconocida por los linfocitos T. Dicha manipulación del antígeno por parte de las células dendríticas implica 1) la adquisición, 2) el procesamiento, y 3) la presentación del antígeno a los linfocitos T por parte de las células dendríticas de una forma que es reconocida por los linfocitos T. Después de la unión del antígeno a las células dendríticas, las células se recogen del cultivo y se usan para inmunizar ratones singénicos. Las células dendríticas activadas se inyectan por vía subcutánea en los ratones en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune al antígeno.

Ejemplo 5

Se pulsan células dendríticas preparadas como se describe en el ejemplo 1 con un antígeno de proteína durante un tiempo suficiente para permitir a las células dendríticas adquirir, procesar y presentar el antígeno modificado sobre la superficie de las células dendríticas. Las células dendríticas se recogen después del cultivo para la extracción del antígeno modificado.

Para la extracción del antígeno modificado, las células dendríticas se solubilizan con detergente para extraer el antígeno modificado unido a las moléculas de MHC. Las moléculas de MHC unidas al antígeno modificado se purifican por precipitación con anticuerpos que unen las moléculas MHC tales como MH2. Los antígenos modificados se extraen del precipitado para análisis.

Ejemplo 6 Preparación de células dendríticas a partir de la sangre humana A. Pacientes

Se realizaron 17 experimentos con sangre de pacientes humanos sometidos a quimioterapia de consolidación (15 con leucemias/linfomas en total remisión, 2 con tumores sólidos) seguido de tratamiento con G-CSF. Se realizaron tres experimentos con sangre de pacientes después del tratamiento por quimioterapia (1 leucemia (mieloica aguda), 2 tumores sólidos) y del tratamiento con GM-CSF. Se presentan los resultados de los tres experimentos, dos del grupo de pacientes tratados con G-CSF, A y B, y uno del grupo de pacientes tratados con GM-CSF, C.

B. Fundamento

Los resultados de los procedimientos descritos en el ejemplo 1 respecto a la sangre de ratón y en el ejemplo 2 respecto a la médula ósea (J. Exp. Med. 175:1157- 1167, 1992 y J. Exp. Med. 176:1693-1702, 1992), identificaron varias características del crecimiento y desarrollo de las células dendríticas: (a) los progenitores de las células dendríticas no expresan los antígenos MHC de clase II que son típicos de la progenie inmunoestimuladora madura y de muchos otros tipos de células (células B, monocitos); (b) los progenitores de las células dendríticas requieren GM-CSF y quizás otras citoquinas que pueden ser provistas por las células en cultivo o como suplementos para proliferar y madurar; (c) las etapas críticas en el crecimiento y desarrollo de las células dendríticas tienen lugar en agregados distintivos que son adherentes de forma holgada a las superficies del cultivo tisular convencional; (d) controlando la aparición de estos agregados, uno puede evaluar las numerosas variables que son pertinentes para la generación de células dendríticas, un tipo de célula que presenta antígeno, que se presenta en pequeñas cantidades pero que está especializada y que opera de manera potente para inducir inmunidad y tolerancia a los linfocitos T in situ (Ann. Rev. Immunol. 9:271-296, 1991).

C. Protocolo

1. Se aislaron células mononucleares sanguíneas por sedimentación en medios densos convencionales, aquí Lymphoprep (Nycomed, Oslo).

2. Las células mononucleares aisladas se liberaron de células que no fueran progenitores de células dendríticas. Estos contaminantes se cubrieron con anticuerpos monoclonales a antígenos CD3 y HLA-DR y se liberaron sobre placas petri cubiertas con IgG de cabra anti-ratón, purificado por afinidad ("panning").

3. Se dispusieron en pocillos de cultivo de plástico de 16 mm de diámetro 10^{6} células en 1 ml de medio de cultivo (Costar, Rochester, N.Y.). El medio fue RPMI-1640 suplementado con 2-mercaptoetanol 50 \muM, glutamina 10 mM, gentamicina 50 \mug/ml, suero al 5% de sangre de médula (sin inactivación por calor) o suero de ternera fetal al 5% (con inactivación), y 400 U/ml de GM-CSF recombinante humano. Cada segundo día después de esto y durante un total de 16 días, los cultivos se alimentaron retirando 0,3 ml de medio y reemplazando esto con 0,5 ml de medio recién preparado suplementado con las citoquinas.

Las células se cultivaron en las siguientes condiciones: 1) sin la presencia de citoquinas adicionales; 2) GM-CSF, 400 u 800 U/ml; 3) GM-CSF, 400 u 800 U/ml, más IL- 1\alpha, 50 unidades LAF/ml durante las últimas 24 horas de cultivo; 4) GM-CSF, 400 u 800 U/ml, más TNF-\alpha, 50 U/ml; 5) GM-CSF, 400 u 800 U/ml, más TNF-\alpha, 50 U/ml, más IL-1\alpha, 50 unidades LAF/ml durante las últimas 24 horas de cultivo; 6) GM- CSF, 400 u 800 U/ml, más IL-3, 100 U/ml; 7) GM-CSF, 400 u 800 U/ml, más IL-3, 100 U/ml, más IL-1\alpha, 50 unidades LAF/ml durante las últimas 24 horas.

En el experimento C, se ensayaron también las células no dendríticas que se hundieron metrizamida densa.

4. El quinto días aparecieron agregados de células dendríticas proliferantes características (en lo sucesivo denominados "bolas"), que se evidenciaron tras el examen con un microscopio de contraste de fase invertido. Estas bolas aumentaron de tamaño durante el transcurso de una semana (día 5-11). Algunas bolas aparecieron en los pocillos originales (etapas 3 y 4), pero estas típicamente no aumentaron en el mismo grado que los pocillos no adherentes (etapa 4). Los pocillos deben subcultivarse, por ejemplo, 1 pocillo separarse en 2-3 pocillos, a medida que aumenta la densidad celular.

5. Se usaron dos enfoques alternativos para aislar las células dendríticas maduras a partir de los cultivos en crecimiento. Un procedimiento consistía en retirar células que fueran no adherentes y separar las bolas de las no bolas mediante sedimentación 1g. Las células dendríticas se liberaron entonces en grandes cantidades de las bolas durante 1-2 días adicionales de cultivo, y se aislaron las células dendríticas maduras a partir de las no bolas por flotación sobre metrizamida densa como describió (Freudenthal y Steinman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7698-7702, 1990). El segundo procedimiento es más simple pero esencialmente termina la fase de crecimiento del procedimiento. De acuerdo con el segundo procedimiento, se recogieron células no adherentes cuando las bolas eran muy grandes. Las células se dejaron sobre hielo durante 20 minutos, se volvieron a suspender vigorosamente con una pipeta para desagregar las bolas, y las células dendríticas maduras flotaron sobre columnas de metrizamida.

6. Para demostrar la actividad inmunoestimuladora de la progenie de células dendríticas, se añadieron dosis medidas de células irradiadas (30 a 30.000 en diluciones seriadas de orden 3) a linfocitos T liberados de células accesorias (200.000 para el ensayo de reacción con leucocitos mezclados, MLR; 150.000 para el ensayo de mitogénesis oxidante, OXMI). La respuesta de linfocito T se midió con un pulso de 16 horas de 3H-timidina en el quinto día (MLR) o en el segundo día (OXMI). Los experimentos de estimulación de linfocitos T (reacción con leucocitos mezclados y mitogénesis oxidante) se realizaron en presencia de 1 microgramo/ml de indometacina. Los datos de los tres experimentos MLR se presentan en las Figs. 18A, B, y C.

D. Resultados

1. GM-CSF es una citoquina esencial. G-CSF, M-CSF, IL-3, o la ausencia de citoquina no permiten el desarrollo de las bolas de células dendríticas. GM-CSF a 400-800 U/ml es óptimo, con independencia de si los donantes han sido tratados con GM-CSF o G-CSF para aumentar el número de células progenitoras mieloides en la sangre. La adición de TNF\alpha a 10-50 U/ml normalmente pero no siempre aumentaba los rendimientos de las células dendríticas hasta dos veces (cf. Caux y col., Tumor necrosis factor alpha strongly potentiates interleukin-3 and

\hbox{granulocyte-macrophage}

colony-stimulating factor-induced proliferation of human hematopoietic CD34+ progenitor cells, Blood 2292-2298, 1990). Como fue evidente a partir de los experimentos representativos descritos en las Figs. 18A, B, y C, la suplementación con TNF\alpha también mejora sustancialmente la función de la progenie de células dendríticas. En algunos experimentos rhu IL-1\alpha (50 unidades del LAF (factor activador linfocitario)/ml) demuestra un aumento adicional en la función, cuando se añade durante las últimas 24 horas del cultivo. Los experimentos con tejido procedente de pacientes con tumores sólidos o leucemias/linfomas dieron resultados comparables con respecto a la generación de células dendríticas.

2. Partiendo de 60 ml de sangre, y después del cultivo en presencia de sólo GM- CSF, el rendimiento de células dendríticas inmunoestimuladoras maduras típicas fue de 6-12 x 10^{6} células, representando el 40-80% de las células totales. Este rendimiento es al menos 20 veces mayor que el rendimiento de células dendríticas maduras en 60 ml de sangre recién extraída que sería como mucho del 5% (3-6 x 10^{5}) de este (Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7698-7702, 1990).

3. El fenotipo de las células dendríticas generadas por este procedimiento incluía el hecho de que las células eran fuertemente positivas por HLA-DR, productos MHC de clase II pero negativas por CD1a, CD14, y marcadores de células B.

4. El desarrollo de granulocitos en los cultivos reduce la pureza de las células dendríticas. Típicamente, estas bolas de granulocito son, más adherentes y se dejan detrás en la etapa de transferencia del día 2 del protocolo. Si estas colonias de granulocito adherentes vuelven a aparecer, pueden transferirse las células dendríticas en crecimiento a otro pocillo por simple transferencia.

Ejemplo 7

Se han ensayado otras fuentes de progenitores de células dendríticas de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 6:

(a) Para dos pacientes, se proporciona también una pequeña muestra de médula ósea. Cuando se aplicó el procedimiento anterior, las bolas de células dendríticas y las células dendríticas inmunoestimuladoras maduras se formaron en grandes cantidades.

(b) Se ha evaluado sangre de 7 donantes normales usando el procedimiento descrito en el ejemplo 6. El número de bolas demostró ser mucho menor (10-20/pocillo de 2 x 10^{6} células), pero el uso de sangre normal es obviamente más simple y tiene la ventaja de que no se forman colonias de granulocitos como se mencionó anteriormente (comentario 5) al comparar sangre y médula de ratón, J. Exp. Med. 175:1157-1167, 1992 frente a J. Exp. Med. 176:1693-1702, 1992).

(c) Se ensayó también sangre del cordón fetal o umbilical, porque también contiene más células progenitoras que la sangre de adulto. Al ser el número de progenitores CD34+ todavía muy pequeño (aproximadamente del 1%), los investigadores ensayaron el procedimiento más sencillo anterior en el que las células CD34+ no se purifican inicialmente. Las bolas de células dendríticas (CD) se inducen fácilmente, excepto por el hecho de que los eritrocitos que son tóxicos se eliminaron. Se añadió el anti-eritroide monoclonal VIE-G4 (proporcionado por el Dr. W. Knapp, Viena) a la etapa de "panning" (etapa 2), y se usó una flotación adicional sobre Lymphoprep (etapa 1) después de la etapa de "panning". Los rendimientos de las células dendríticas procedentes de sangre de médula son aproximadamente comparables a los descritos en el procedimiento (1-5 x 10^{6} células dendríticas, representando un 20-40% de las células totales a partir de 40 ml de sangre de médula sin una etapa de flotación sobre metrizamida). Las bolas son más adherentes, y las células dendríticas expresan CD1a, en contraste con la sangre de adultos.

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Claims

1. Un procedimiento de producción de una población de precursores de células dendríticas que comprende:

a): proporcionar una fuente tisular que comprende precursores de células dendríticas;

b): tratar la fuente tisular para aumentar la proporción de precursores de células dendríticas para obtener una población de células adecuada para el cultivo in vitro;

c): cultivar la fuente tisular sobre un sustrato en un medio de cultivo que comprende GM-CSF para obtener células no adherentes y agrupaciones de células;

d): subcultivar las células no adherentes y agrupaciones de células para producir agregados de células que comprenden precursores de células dendríticas proliferantes;

e): subcultivar en serie los agregados de células una o más veces para enriquecer la proporción de precursores de células dendríticas.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fuente tisular es la sangre o médula ósea y el factor GM-CSF está presente en el medio a una concentración de aproximadamente 1-1000 U/ml.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además que cuando la fuente tisular es la médula ósea la etapa de tratamiento (b) comprende la matanza de células que expresan antígenos que no se expresan sobre células precursoras dendríticas poniendo en contacto la médula ósea con anticuerpos específicos para antígenos no presentes sobre células precursoras dendríticas en un medio que comprende complemento.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la fuente tisular es la médula ósea y los anticuerpos se dirigen contra al menos un antígeno seleccionado entre el grupo constituido por el antígeno Ia, antígenos presentes sobre linfocitos T, y antígenos presentes sobre células dendríticas maduras.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la médula ósea se cultiva con rGM-CSF a una concentración de aproximadamente 500-1000 U/ml.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que los no-linfocitos de la médula Ia-negativos se cultivan a una concentración de aproximadamente 5 x 10^{5} células/cm^{2}.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que los anticuerpos anti-antígeno Ia y los anticuerpos anti-linfocitos T, anti-células B y anti-monocito se seleccionan de entre el grupo constituido por anti-CD4 GK 1,5, anti-CD8 Ho 2,2, anti-Ia B21-2, y anti-B220/CD45R RA3-3A1/6,1.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que los agregados celulares de la etapa (e) se subcultivan en serie de una a cinco veces.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que los agregados celulares se subcultivan en serie de dos a tres veces.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que los agregados celulares se subcultivan en serie dos veces.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que las células no adherentes y las agrupaciones celulares de la etapa (c) se subcultivan después de aproximadamente 0,3 a 1 día y los agregados celulares se subcultivan en serie cada 3 a 30 días.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que los agregados celulares se subcultivan en serie cada 10 a 20 días.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que los agregados celulares se subcultivan en serie cada 20 días.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la fuente tisular es la sangre o médula ósea, las células no adherentes y las agrupaciones celulares de la etapa (c) se subcultivan después de aproximadamente 0,3 a 1 día, los agregados celulares se subcultivan en serie de una a cinco veces cada 3 a 30 días.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que las células no adherentes y las agrupaciones celulares de la etapa (c) se subcultivan después de aproximadamente un medio día y los agregados celulares se subcultivan en serie dos veces después de 20 días.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el medio de cultivo se selecciona entre el grupo constituido por RPMI 1640, DMEM, y \alpha-MEM y donde el medio de cultivo se suplementa con suero.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el suero de ternera fetal se presenta en el medio de cultivo en una cantidad de aproximadamente 1 a 15%.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el suero de ternera fetal se presenta en el medio de cultivo en una cantidad de aproximadamente el 10%.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la fuente tisular es sangre y la concentración de GM-CSF en el medio es aproximadamente 30-100 U/ml.

20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la fuente tisular es la médula ósea y la concentración de GM-CSF en el medio es aproximadamente 500-1000 U/ml.

21. Un procedimiento de producción de una población de células dendríticas maduras a partir de cultivos de células proliferantes que comprende:

b): tratar la fuente tisular de (a) para aumentar la proporción de precursores de células dendríticas para obtener una población de células adecuada para el cultivo in vitro;

c): cultivar la fuente tisular sobre un sustrato en un medio de cultivo que comprende GM-CSF para obtener células no adherentes y agrupaciones celulares;

d): subcultivar las células no adherentes y las agrupaciones celulares para producir agregados celulares que comprenden precursores de células dendríticas proliferantes;

e): subcultivar en serie los agregados celulares una o más veces para enriquecer la proporción de precursores de células dendríticas; y

f): continuar el cultivo de precursores de células dendríticas durante un periodo de tiempo suficiente para permitirles que maduren a células dendríticas maduras.

22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la fuente tisular es sangre o médula ósea y el factor GM-CSF está presente en el medio a una concentración de aproximadamente 1-1000 U/ml.

23. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende además que cuando la fuente tisular es la médula ósea la etapa de pretratamiento comprende la matanza de células que expresan antígenos que no se expresan en células precursoras dendríticas poniendo en contacto la médula ósea con anticuerpos específicos de antígenos no presentes en células precursoras dendríticas en un medio que comprende complemento.

24. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la fuente tisular es la médula ósea y los anticuerpos se dirigen contra al menos un antígeno seleccionado entre el grupo que consiste en antígeno Ia, antígenos presentes sobre linfocitos T y antígenos presentes sobre células dendríticas maduras.

25. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la médula ósea se cultiva con rGM-CSF a una concentración de aproximadamente 500-1000 U/ml.

26. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que los no-linfocitos de la médula Ia-negativos se cultivan a una concentración de aproximadamente 5 x 10^{5} células/cm^{2}.

27. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que los anticuerpos anti-antígeno Ia y los anticuerpos anti-linfocitos T, anti-células B y anti-monocito se seleccionan entre el grupo constituido por anti-CD4 GK 1,5, anti-CD8 Ho 2,2, anti-Ia B21-2, y anti-B220/CD45R RA3-3A1/6,1.

28. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que los agregados celulares de la etapa (e) se subcultivan en serie de una a cinco veces.

29. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, en el que los agregados celulares se subcultivan en serie de dos a tres veces.

30. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, en el que los agregados celulares se subcultivan en serie dos veces.

31. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que las células no adherentes y las agrupaciones de células de la etapa (c) se subcultivan después de aproximadamente 0,3 a 1 día y los agregados celulares se subcultivan en serie cada 3 a 30 días.

32. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, en el que los agregados celulares se subcultivan en serie cada 10 a 20 días.

33. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 32, en el que los agregados celulares se subcultivan en serie cada 20 días.

34. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, en el que los agregados celulares se subcultivan en serie de una a cinco veces.

35. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, en el que las células no adherentes y las agrupaciones celulares de la etapa (c) se subcultivan después de aproximadamente un medio día y los agregados celulares se subcultivan en serie dos veces después de 20 días.

36. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el medio de cultivo se selecciona entre el grupo constituido por RPMI 1640, DMEM, y \alpha-MEM y donde el medio de cultivo se suplementa con suero.

37. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 36, en el que el suero de ternera fetal está presente en el medio de cultivo en una cantidad de aproximadamente 1 a 15%.

38. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 37, en el que el suero de ternera fetal está presente en el medio de cultivo en una cantidad de aproximadamente el 10%.

39. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la fuente tisular es sangre y donde el factor GM-CSF está presente en el medio a una concentración de aproximadamente 30-100 U/ml.

40. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la fuente tisular es la médula ósea y donde el factor GM-CSF está presente en el medio a una concentración de aproximadamente 500-1000 U/ml.

41. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la fuente tisular es sangre humana y el factor GM-CSF está presente en el medio a una concentración de aproximadamente 400 a 800 U/ml.

42. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, en el que al menos un factor seleccionado entre el grupo constituido por TNF-\alpha, G-CSF, IL-1 e IL-3 está presente en el medio de cultivo.

43. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la fuente tisular es sangre humana y el factor GM-CSF está presente en el medio a una concentración de aproximadamente 400 a 800 U/ml.

44. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 43, en el que al menos un factor seleccionado entre el grupo constituido por TNF-\alpha, G-CSF, IL-1 e IL-3 está presente junto con GM-CSF en el medio de cultivo.

45. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en el que la fuente tisular es sangre humana y el factor GM-CSF está presente en el medio a una concentración de aproximadamente 400 a 800 U/ml.

46. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45, en el que al menos un factor seleccionado entre el grupo constituido por TNF-\alpha, G-CSF, IL-1 e IL-3 está presente junto con GM-CSF en el medio de cultivo.

47. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fuente tisular se obtiene a partir de un individuo que ha sido tratado previamente con una sustancia para estimular hematopoyesis antes de la retirada de la fuente tisular del individuo.

48. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 47, en el que la sustancia hematopoyética se selecciona entre el grupo constituido por GM-CSF y G-CSF.