ES2214479T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican para una proteina con actividad ureasica. - Google Patents
Secuencias de nucleotidos que codifican para una proteina con actividad ureasica.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION INMUNOGENA QUE COMPRENDE TODO O PARTE DE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS (VIII) DE LA UREASA, ASI COMO LOS FRAGMENTOS (VI), (VIII) Y(X) DE LA UREASA, Y PROCESO DE PRODUCCION DE UN COMPLEJO INMUNOLOGICO ENTRE FRAGMENTOS Y ANTICUERPOS FORMADOS CONTRA LA PROTEINA DE ACTIVIDAD DE UREASA EN C.PYLORI.
Description
Secuencias de nucleótidos que codifican para una
proteína con actividad ureásica.
La invención tiene como objeto secuencias de
nucleótidos que codifican para una ureasa, tal como la expresada
naturalmente en Campylobacter pylori y sus aplicaciones
biológicas, particularmente para la detección de C. pylori
en el hombre o en el entorno.
C. pylori es una bacteria gram negativa
que se encuentra en la actualidad exclusivamente en la superficie
de la mucosa de la parte antral del estómago en el hombre, y más
particularmente alrededor de las heridas y de los cráteres de las
úlceras gástricas y duodenales. El 25% de la población es portadora
de C. pylori: el 8% presenta una enfermedad ulcerosa, el 9%
padece de dispepsia no ulcerosa y el 8% es portador
asintomático.
Todas las C. pylori aisladas y descritas
hasta hoy, tienen las tres propiedades siguientes:
Las bacterias producen una ureasa dotada de una
gran actividad.
Éstas se adhieren fuertemente a las células
epiteliales de la mucosa gástrica, traduciéndose esta propiedad
in vitro por una fuerte adhesión a las células Hela.
Las C. pylori producen y liberan una
enzima que presenta una actividad proteolítica que conduce a la
degradación de la mucosidad y, por tanto, a un debilitamiento de la
barrera natural que protege la mucosa gástrica.
La detección de C. pylori in situ
en el hombre y en el entorno y el estudio de su poder patógeno -
está considerada como la responsable de las gastritis activas en el
hombre – se enfrentan sin embargo a las dificultades de cultivo de
este microorganismo.
Su crecimiento es muy lento (de 6 a 7 días en un
medio agar sangre), y debe efectuarse en condiciones de
microaerofilia, siendo tóxico el oxígeno del aire.
La investigación de medios de detección de esta
bacteria ha llevado a los inventores a identificar los genes
responsables de la producción de ureasa en C. pylori.
La determinación de la secuencia de nucleótidos
de un fragmento intragénico ha permitido disponer de una
herramientautilizable como sonda de detección para la
identificación específica de C. pylori.
Por tanto, la invención tiene como objeto
suministrar nuevas secuencias de nucleótidos capaces de codificar
para proteínas con actividad ureásica tales como las expresadas en
C. pylori.
Asimismo, tiene como objeto proporcionar
fragmentos de esta secuencia utilizables como sondas de detección
de C. pylori.
Además, la invención se dirige a suministrar una
proteína con actividad ureásica, tal como la expresada en C.
pylori, de pureza elevada, y fragmentos de esta proteína.
La secuencia de nucleótidos según la invención
está caracterizada porque comprende al menos una parte de una
secuencia que codifica para una proteína con actividad ureasa, tal
como la expresada en C. pylori.
Más particularmente, la invención tiene como
objeto una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse con genes
que codifican para una proteína con actividad ureasa tal como la
expresada en C. pylori, en las siguientes condiciones: 68ºC,
6 x SSC (1 x SSC está constituido por NaCl 0,15 M y citrato sódico
0,15 M, pH 7), en medio Denhardt (Ficoll al 1%, polivinilpirrolidona
al 1%, albúmina sérica bovina al 1%).
Según otro aspecto de la invención, la secuencia
de nucleótidos está caracterizada porque lleva la información
necesaria para la producción de una proteína con actividad ureasa o
de sus fragmentos, capaces de formar un complejo inmunológico con
anticuerpos dirigidos respectivamente contra una proteína de
actividad ureasa, tal como la expresada en C. pylori, o
contra fragmentos de esta última.
Asimismo, la secuencia según la invención está
caracterizada porque comprende al menos una parte de un fragmento
de aproximadamente 8kb correspondiente al fragmento de restricción
EcoRI (ClaI, BamHI)-PstI (HindIII).
El mapa de restricción enzimática de este
fragmento se representa en la figura 2.
Una secuencia más especialmente preferida
comprende al menos una parte de un fragmento de aproximadamente 4,2
kb (\pm5%) delimitado por los nucleótidos del extremo situados
respectivamente a una distancia de aproximadamente 0,55 kb corriente
arriba del sitio H2 representado en la figura 2, y de
aproximadamente 0,7 kb corriente abajo del sitio B1 representado en
la figura 2.
Las secuencias constituidas por este fragmento
llevan información necesaria para la expresión de una proteína con
actividad ureasa, tal como la expresada de manera natural en C.
pylori.
La expresión de estas secuencias puede producirse
en cualquier otro microorganismo capaz de utilizar la información
que llevan estas secuencias para su beneficio, particularmente en
una cepa de Campylobacter deficiente de manera natural en
genes que codifican para la producción de una proteína con
actividad ureasa (o incluso la cepa de Campylobacter
ureasa^{-}).
Además, según otro aspecto, la invención se
dirige a una secuencia recombinante que comprende una de las
secuencias anteriormente definidas, llegado el caso, asociada con
un promotor capaz de controlar la transcripción de la secuencia y
de una secuencia de ADN que codifica para señales de finalización
de la transcripción.
Asimismo, la presente solicitud describe vectores
recombinantes de expresión y de clonación, capaces de transformar
una célula huésped apropiada, que comprende al menos una parte de
una secuencia de nucleótidos tal como la anteriormente definida
bajo el control de elementos de regulación que permiten su
expresión.
Unos vectores recombinantes preferidos encierran
al menos una parte de la secuencia de aproximadamente 4,2 kb
mencionada anteriormente.
Las cepas de microorganismos transformadas se
describen igualmente en el marco de la presente solicitud. Estas
cepas comprenden una de las secuencias de nucleótidos anteriormente
definidas o incluso un vector recombinante tal como el definido
anteriormente.
La cepa E. coli S17-1
presentada el 16 de agosto de 1988 bajo el nº I-795
en la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (Colección
Nacional de Cultivo de Microorganismos) (C.N.C.M.) del Instituto
Pasteur en PARÍS (Francia) lleva el plásmido PILL590 de 16,3 kb
aproximadamente, que comprende el fragmento de restricción de
aproximadamente 8 kb EcoRI (ClaI, BamHI)-PstI (Hind
III) expuesto anteriormente.
La invención se dirige además a una proteína que
presenta una actividad ureasa del tipo expresado naturalmente en
C. pylori, así como los fragmentos peptídicos de esta
proteína.
La proteína de la invención, y sus fragmentos,
corresponden, según el código genético universal, a las secuencias
de nucleótidos anteriormente definidas, en particular al menos a
una parte de la secuencia de aproximadamente 4,2 kb.
La proteína de la invención está caracterizada
también porque se trata de una proteína tal como la obtenida por
transformación de células huésped por medio de un vector
recombinante como el definido anteriormente, en cultivo, en un
medio apropiado, de las células huésped transformadas y la
recuperación de la proteína a partir de estas células o
directamente a partir del medio de cultivo. La producción de ureasa
o de fragmentos de esta última por este procedimiento, también
forma parte de la invención.
La proteína de la invención y sus fragmentos, que
también pueden obtenerse por síntesis química, presentan
ventajosamente un grado de pureza elevado y se utilizan para
formar, según las técnicas clásicas, anticuerpos policlonales.
La invención también se dirige a tales
anticuerpos policlonales, así como a los anticuerpos monoclonales
capaces de reconocer específicamente la proteína anteriormente
mencionada y sus fragmentos.
Las secuencias de nucleótidos anteriormente
definidas se obtienen según las técnicas clásicas de la ingeniería
genética por clonación e identificación de los genes responsables
de la síntesis de una proteína con actividad ureasa en C.
pylori.
Asimismo, la invención se dirige a las
aplicaciones biológicas de las secuencias de nucleótidos, de las
proteínas correspondientes y de los anticuerpos monoclonales o
policlonales.
Estas aplicaciones comprenden la elaboración, a
partir de fragmentos intragénicos, de sondas para la detección de
C. pylori. Particularmente, esta elaboración comprende la
desnaturalización de las secuencias bicatenarias para obtener una
secuencia monocatenaria que se puede utilizar como sonda.
Los ensayos realizados con dichos fragmentos para
detectar la posible presencia de secuencias complementarias en
diversos Campylobacter y en los microorganismos que
pertenecen a géneros distintos, han demostrado la gran
especificidad de estos fragmentos.
Por tanto, la invención se dirige a sondas de
detección caracterizadas porque comprenden al menos una parte de
una secuencia de nucleótidos anteriormente definida.
Cualquier sonda que únicamente se distinga de la
anterior, al nivel de su secuencia de nucleótidos, por
sustituciones o alteraciones de nucleótidos que no produzcan
modificación alguna de sus propiedades de hibridación con el genoma
de C. pylori, entra en el ámbito de la invención.
El fragmento de ADN utilizado como sonda
comprende un número de nucleótidos suficiente para obtener la
especificidad necesaria y la formación de un híbrido estable.
Es posible utilizar fragmentos que alcancen
varias kb, obteniéndose resultados de alta especificidad de igual
manera que con fragmentos más cortos de aproximadamente 25 a 40
nucleótidos.
Unas sondas apropiadas para este tipo de
detección se marcan ventajosamente con un elemento radioactivo o
cualquier otro grupo que permita su reconocimiento en el estado de
hibridación con la preparación que encierra el ADN que se va a
estudiar.
Según las técnicas clásicas, estas sondas se
ponen en contacto con una muestra biológica que tiene bacterias, o
directamente con estas bacterias o sus ácidos nucleicos, en
condiciones que permiten la hibridación eventual de la secuencia de
nucleótidos de la sonda con una secuencia complementaria,
eventualmente contenida en el producto probado.
Por ejemplo, se puede poner en práctica el método
de hibridación dot blot. Este método comprende, tras la
desnaturalización del ADN anteriormente obtenido a partir de
bacterias procedentes de biopsias antrales, el depósito de una
cantidad alícuota de este ADN en membranas de nitrocelulosa, la
hibridación de cada membrana en las condiciones habituales con la
sonda y la detección del híbrido formado de manera clásica.
De este modo, también puede utilizarse un método
de hibridación sobre réplica, según la técnica de Southern. Este
método comprende la separación electroforética en gel de agarosa de
los fragmentos de ADN generados tras el tratamiento del ADN por
enzimas de restricción, la transferencia tras la desnaturalización
alcalina en membranas apropiadas y su hibridación con la sonda en
las condiciones habituales. No siempre es necesario proceder a la
expresión anterior del ADN, basta con que el ADN esté accesible a
la sonda.
La detección para la identificación específica de
las C. pylori puede realizarse igualmente por técnicas de
amplificación del ADN (PCR). Estas técnicas se describen
particularmente en las patentes US.4683202 y 4683195 a nombre de
Cetus Corporation.
Para la realización de estas técnicas, se
utilizan dos cebadores de 10 a 40 nucleótidos, ventajosamente de
aproximadamente una veintena de nucleótidos, estando comprendidos
estos cebadores en una de las secuencias de nucleótidos
anteriormente definidas o susceptibles de hibridarse con una parte
de una de las secuencias nucleotídicas anteriormente definidas, o
de sus secuencias complementarias. De manera ventajosa, estos
cebadores son de aproximadamente 200 a 250 nucleótidos de distancia
cuando están hibridados (o unidos) a las hebras del ADN que se va a
amplificar. Una de las secuencias es capaz de unirse a una
secuencia de nucleótidos de una de las hebras de fragmentos de ADN
que se va a amplificar, estando situada esta secuencia al nivel de
un extremo de este fragmento (por ejemplo, el extremo 5'); la otra
secuencia es capaz de unirse a una secuencia de nucleótidos de la
segunda hebra del fragmento de ADN que se va a amplificar, estando
situada esta última secuencia al nivel del extremo de este
fragmento opuesto al anteriormente mencionado (estando indicado este
último extremo por el extremo 3' en el ejemplo propuesto).
Los cebadores preferidos están comprendidos en la
secuencia de nucleótidos del fragmento de restricción
H2-H3 de la figura 2, y están a 200 a 250
nucleótidos de distancia aproximadamente.
Particularmente, se trata de los fragmentos en
cada extremo de esta secuencia de restricción
HindIII-HindIII, respectivamente.
Un procedimiento de detección in vitro de
la presencia eventual de C. pylori en una muestra biológica
comprende las siguientes etapas:
- posiblemente, la amplificación anterior de la
cantidad de secuencias de nucleótidos susceptibles de estar
contenidas en la muestra, mediante la puesta en contacto de esta
muestra con los cebadores, tales como los descritos anteriormente,
siendo susceptibles estos cebadores de unirse, por una parte, al
extremo 5' de una hebra de dicha secuencia de nucleótidos y, por
otra parte, al extremo 3' de la otra hebra de dicha secuencia de
nucleótidos, respectivamente, estando seguido este contacto por una
etapa de amplificación génica en presencia de una ADN polimerasa y
de cuatro nucleósidos trifosfato dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
repitiéndose varias veces estas operaciones de hibridación de los
cebadores y de amplificación génica,
- la puesta en contacto de la muestra biológica
en cuestión con una sonda nucleotídica según la invención, en
condiciones que permitan la producción de un complejo de
hibridación formado entre la sonda y la secuencia de
nucleótidos,
- la detección del complejo de hibridación.
De este modo, la invención proporciona
herramientas que permiten detectar rápidamente C. pylori,
in situ, y en el entorno con una gran especificidad, sin
tener que realizar cultivos.
Dichas herramientas de detección son
particularmente útiles para estudiar el depósito natural de estas
bacterias, los métodos de transmisión, de circulación y de
contaminación. Además, en el diagnóstico in vitro practicado
en las biopsias, el uso de estas sondas permite una ganancia de
tiempo considerable con respecto a las técnicas actuales que,
además, requieren una tecnología que únicamente puede realizarse
en servicios especializados, es decir, técnicas bacteriológicas o
que utilizan la microscopia electrónica.
Se han obtenido resultados reproducibles
utilizando como sonda intragénica el fragmento de 8 kb
aproximadamente definido anteriormente.
Considerando su especificidad con respecto a
C. pylori, estas sondas constituyen asimismo una herramienta
de gran interés.
Para estudiar el poder patógeno de C.
pylori para evitar la infección, también es posible estudiar el
papel desempeñado por C. pylori en el desarrollo de las
enfermedades ulcerosas e identificar los determinantes genéticos
que parecen implicados en el poder patógeno de este organismo para
crear in vitro mutantes isogénicos de C. pylori, es
decir, bacterias modificadas genéticamente en cada uno de los
determinantes que parecen desempeñar un papel en la patogénesis de
la infección, mutantes que podrán probarse en modelos animales.
La invención se refiere también a la detección
del polimorfismo de los genes que codifican para la ureasa en C.
pylori con ayuda de las sondas nucleotídicas anteriormente
definidas y enzimas de restricción apropiadas. Las condiciones en
las que se realiza esta detección se describen más particularmente
en el artículo de Gusella J.F. en J. of Clin. - investigations
(1986), 77, 1723-1726.
Asimismo, la invención se dirige a las
aplicaciones inmunológicas de la proteína codificada, más
especialmente para la elaboración de antisuero específico, así como
de anticuerpos policlonales y monoclonales. Los anticuerpos
policlonales se forman, según las técnicas clásicas, por inyección
de la proteína en animales, la recuperación de antisueros, y de los
anticuerpos a partir de los antisueros, por ejemplo, por
cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales se producen
habitualmente fusionando células de mieloma con células de rata de
animales anteriormente inmunizadas con ayuda de las proteínas de la
invención.
Además, la invención se refiere a un
procedimiento de detección in vitro de la posible presencia
de C. pylori en una muestra biológica susceptible de
contenerla. Este procedimiento se caracteriza porque comprende:
- la puesta en contacto de la muestra con un
anticuerpo según la invención, en condiciones que permitan la
producción de un complejo inmunológico formado entre toda o parte
de la proteína con actividad ureasa producida por C. pylori
y este anticuerpo, y
- la detección del complejo inmunológico.
Para la realización de los métodos de detección
in vitro anteriormente considerados basados en el uso de
sondas nucleotídicas, se ha recurrido ventajosamente a equipos o
kits que comprenden:
- llegado el caso, al menos un par de cebadores
según la invención,
- una cantidad determinada de una sonda
nucleotídica según la invención,
- ventajosamente, un medio apropiado
respectivamente en la formación de una reacción de hibridación
entre la secuencia que se va a detectar y la sonda.
- ventajosamente, reactivos que permiten la
detección de los complejos de hibridación formados entre la
secuencia de nucleótidos y la sonda durante la reacción de
hibridación.
Para la realización de los métodos de detección
in vitro definidos anteriormente, basados en el uso de
anticuerpos, se ha recurrido ventajosamente a equipos o kits, que
comprenden:
- una cantidad determinada de un anticuerpo según
la invención,
- ventajosamente, un medio apropiado en la
formación de una reacción inmunológica entre al menos una parte de
la proteína con actividad ureasa producida por una cepa de C.
pylori y el anticuerpo,
- ventajosamente, reactivos que permiten la
detección de complejos inmunológicos formados entre al menos una
parte de la proteína con actividad ureasa y el anticuerpo durante
la reacción inmunológica.
Un estudio en profundidad del fragmento de 4,2 kb
definido anteriormente ha permitido situar los genes de estructura
que codifican para las subunidades polipeptídicas principales de la
ureasa de C. pylori.
Este estudio se ha realizado fabricando mutantes
en los plásmidos recombinantes introducidos en E. coli y
C. jejuni incapaces de sintetizar la ureasa,
(Baskerville-A, Nevell D. (1988), Gut.29,
465-472. Se ha utilizado el sistema de
transcripción-traducción in vitro de E.
coli, así como un sistema de expresión en minicélulas para
identificar y localizar, en el seno del fragmento de 4,2 kb de
C. pylori, el conjunto de genes que codifican para las
subunidades de la ureasa: se han identificado dos proteínas
principales de 26 kDa y 61 kDa. Paralelamente, tras varias
deleciones en el seno del fragmento de 4,2 kb, se ha utilizado un
sistema de transferencia por conjugación de una cepa de E.
coli a C. jejuni (del tipo explicitado en la descripción
detallada a continuación) para identificar las regiones
indispensables en la expresión de la actividad ureásica y
correlacionar la deleción de una región con la desaparición de un
polipéptido y la pérdida de la actividad ureásica. De este modo, se
ha determinado que los genes que codifican para los dos péptidos
necesarios en la expresión de la actividad ureásica se sitúan en la
región central de 3,35 kb, corriente abajo del sitio H3 de la
figura 2, y sobre B1. La transcripción de los genes que codifican
para los polipéptidos de 61 kDa o de 26 kDa se realiza en el
sentido EcoRI-PstI. El fragmento de 3,35 kb es
necesario pero no suficiente en la expresión de la actividad
ureásica en C. jejuni. Una región adyacente de 0,85 kb,
situada corriente arriba y aparentemente no asociada con la
expresión de polipéptidos en E. coli, es indispensable en la
expresión de la actividad ureásica en C. jejuni.
El análisis de los mutantes de deleción por
transcripción-traducción in vitro ha
permitido observar que los dos polipéptidos de 26 y 61 kDa están
codificados por dos fragmentos de ADN adyacentes.
A continuación, se ha descrito la siguiente
secuencia nucleotídica (V):
Más particularmente, la presente solicitud
describe una secuencia nucleotídica correspondiente, según el
código genético universal, a la siguiente secuencia de aminoácidos
(VI) de 26 kDa (codificada por la secuencia nucleotídica (V)):
239 aminoácidos
Peso molecular: 26.522 daltons.
La secuencia nucleotídica (VII) siguiente
codifica para la secuencia de aminoácidos (VIII).
Particularmente, la invención tiene como objeto
cualquier secuencia nucleotídica correspondiente, según el código
genético universal en al menos una parte de la secuencia
nucleotídica (VII) siguiente:
569 Aminoácidos
Peso molecular: 61.729 daltons
La comparación de la secuencia de aminoácidos
VIII con la de la ureasa de judía (Jack bean) que se describe
particularmente en Eur. J. Biochem. 175, 151-165
(1588), muestra de forma inesperada un nivel elevado de homologías
de aminoácidos. Esta conservación de estructura ha permitido a los
inventores deducir el sitio activo de la subunidad ureásica de 61
kDa que está comprendida, total o parcialmente, en la secuencia
polipeptídica delimitada por los aminoácidos situados en las
posiciones 206 y 338 de la secuencia VIII descrita
anteriormente.
La presente solicitud describe asimismo toda o
parte de la secuencia nucleotídica IX constituida sucesivamente de
la secuencia V y de la secuencia VII.
Asimismo, la solicitud describe una secuencia
nucleotídica correspondiente, según el código genético universal en
al menos una parte de la secuencia de aminoácidos (X) de 87 kDa
constituida sucesivamente de la secuencia VI y de la secuencia
VIII.
La solicitud describe igualmente sondas de
detección de la posible presencia de C. pylori en una
muestra biológica, caracterizadas porque éstas comprenden al menos
una parte de una secuencia de nucleótidos definida
anteriormente.
Ni que decir tiene que las bases de las
secuencias de nucleótidos considerados pueden estar en un orden
distinto al encontrado en los genes y/o que estas bases pueden ser,
llegado el caso, sustituidas, dado que una sonda elaborada a partir
de dichas secuencias da una respuesta característica y no equívoca
respecto a la capacidad de reconocer la presencia de genes que
codifican para la proteína con actividad ureasa de C.
pylori.
Cualquier secuencia de nucleótidos susceptible de
hibridarse con la de las cadenas de nucleótidos anteriormente
mencionadas, tal como la obtenida por transcripción enzimática
inversa del ARN correspondiente o incluso por síntesis química,
entra igualmente en el marco de la invención.
Cualquier sonda que únicamente se distinga de la
anterior, al nivel de su secuencia de nucleótidos, por
sustituciones o alteraciones de los nucleótidos no produciendo
modificación de sus propiedades de hibridación con el genoma de
C. pylori, entra en el marco de la invención.
Las sondas anteriormente mencionadas se pueden
utilizar en procedimientos de diagnóstico in vitro de la
posible presencia de C. pylori en una muestra biológica
descrita anteriormente.
Asimismo, la invención tiene como objeto
cebadores nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 40
nucleótidos, estando comprendidos estos cebadores en una de las
secuencias nucleotídicas V o VII anteriormente definidas (o en una
de las secuencias derivadas de estas secuencias V y VII) o siendo
susceptibles de hibridarse con una parte de una de las secuencias
nucleotídicas anteriormente mencionadas o con sus secuencias
complementarias (particularmente en las condiciones de hibridación
anteriormente definidas).
La invención se refiere igualmente al uso de
estos cebadores en los métodos de diagnóstico in vitro
definidos anteriormente, para la previa amplificación de la
cantidad de nucleótidos de C. pylori susceptibles de ser
contenidos en la muestra biológica según el procedimiento descrito
anteriormente.
La invención se refiere igualmente a los vectores
recombinantes de expresión y de clonación, capaces de transformar
una célula huésped apropiada, que comprende toda o parte de una
secuencia nucleotídica idéntica o derivada de las secuencias
nucleotídicas V, VII y IX anteriormente mencionadas.
La invención se dirige igualmente a un
procedimiento de producción de proteínas correspondiente a toda o
parte de la secuencia anteriormente mencionada, comprendiendo este
procedimiento la transformación de células huésped apropiadas
(particularmente aquellas descritas anteriormente) con ayuda de los
vectores anteriormente mencionados y la recuperación de las
proteínas así producidas seguida, llegado el caso, de una etapa de
purificación de estas proteínas.
El procedimiento de producción de proteínas
anteriormente definido comprende, llegado el caso, una etapa previa
de amplificación del gen que codifica para la proteína de la que se
busca la producción, realizándose esta etapa con ayuda de pares de
cebadores de la invención según el procedimiento anteriormente
descrito.
Asimismo, la invención tiene como objeto los
polipéptidos (o proteínas) codificados por las secuencias
nucleotídicas descritas anteriormente. Particularmente, la
invención se refiere a la secuencia de aminoácidos X de 87 kDa, y
sus fragmentos, no siendo dichos fragmentos un fragmento peptídico
del segmento (VI o VIII).
La invención se refiere asimismo a los
anticuerpos policlonales y monoclonales obtenidos a partir de todos
o parte de los polipéptidos descritos anteriormente y susceptibles
de formar un complejo inmunológico con los mismos.
La invención se dirige igualmente a los
anticuerpos, particularmente monoclonales, obtenidos con ayuda de
una secuencia peptídica de al menos aproximadamente 10 a 15
aminoácidos de la secuencia VI, o de la secuencia VIII.
Unos anticuerpos monoclonales preferidos de la
invención se dirigen contra toda o parte de la secuencia delimitada
por los aminoácidos situados en las posiciones 206 y 338 de la
secuencia VIII, y más particularmente aquellos obtenidos con ayuda
de una secuencia peptídica de al menos aproximadamente 10 a 15
aminoácidos de la secuencia delimitada por los aminoácidos situados
en las posiciones 206 y 338 de la secuencia VIII.
Asimismo, la invención tiene como objeto el uso
de los anticuerpos anteriormente mencionados para la realización de
métodos de diagnóstico in vitro, así como en los kits de
diagnóstico in vitro de la infección de un individuo por
C. pylori, tal como se describe anteriormente.
La invención prevé asimismo composiciones
inmunogénicas que comprenden total o parcialmente polipéptidos
descritos anteriormente, y más particularmente, toda o parte de la
secuencia polipeptídica delimitada por los aminoácidos situados en
las posiciones 206 y 338 de la secuencia VIII, en asociación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Tales composiciones inmunogénicas se pueden
utilizar como composiciones de vacunas para prevenir la infección
de un individuo por C. pylori.
La invención se refiere igualmente a
composiciones farmacéuticas que comprenden uno (o varios)
anticuerpos tales como los descritos anteriormente, y más
particularmente a los anticuerpos susceptibles de formar un complejo
inmunológico con toda o parte de la secuencia peptídica delimitada
por los aminoácidos situados en las posiciones 206 y 338 de la
secuencia VIII, en asociación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Tales composiciones farmacéuticas según la
invención se pueden utilizar para el tratamiento de las patologías
relacionadas con la infección de un individuo por C. pylori,
particularmente de las gastritis y úlceras gástricas y
duodenales.
Otras ventajas y características de la invención
se exponen en la descripción que sigue relativa a la clonación de
los genes responsables de la producción de la proteína con
actividad ureasa en C. pylori, la secuenciación de la región
asociada con la expresión de la proteína con actividad ureasa y la
especificidad de sondas nucleotídicas para la detección de C.
pylori.
En esta descripción, se hace referencia a las
figuras 1 y 2 que representan:
- La figura 1, el mapa de restricción de un
fragmento PstI-EcoRI del cósmido recombinante IID2
que lleva la información necesaria para la expresión de la ureasa
en C. jejuni, y
- la figura 2, el mapa de restricción de un
fragmento de aproximadamente 8 kb de pILL590.
El ADN cromosómico de la cepa C. pylori
(85P) está preparado para generar fragmentos de ADN de elevado peso
molecular; aproximadamente 300 \mug de este ADN cromosómico se
someten a una digestión parcial controlada por la endonucleasa de
restricción Sau3A y se depositan en un gradiente de sacarosa para
aislarse selectivamente de los fragmentos de digestión comprendidos
entre 35 y 45 kilobases. De estos fragmentos, 1,5 \mug se unen
in vitro al vector lanzadera-cósmido pILL575
linearizado por la endonucleasa BamHI y desfosforilado. pILL575 se
ha fabricado a partir del cósmido lanzadera pILL550 descrito por
Labigne-Roussel et al. en J. Bacteriol.
169:5320-5323, 1987, en el que se ha insertado el
sitio "cos" del fago lambda (fragmento Bgl II de 1,7 kb de
pERG153 insertado en el sitio Pvu II de pILL550); por tanto, se
puede mover como el mismo por conjugación, codifica para una
resistencia a la kanamicina que se expresa a la vez en E.
coli y Campylobacter (Km) y se replica a la vez en E.
coli y en C. jejuni por la presencia de dos orígenes de
replicación, una funcional en E. coli exclusivamente, la otra
solamente en Campylobacter. Los productos de esta unión se
empaquetan in vitro en las partículas de lambda, después se
introducen por transfección en una cepa de E. coli que aloja
un plásmido IncP capaz de complementar en trans las funciones de
transferencia de cósmidos recombinantes. Las colonias de E.
coli infectadas y resistentes a la kanamicina se conservan
inmediatamente de manera individual a -80ºC; un banco genómico
cosmídico representativo del conjunto del genoma de
Campylobacter pylori se realiza en E. coli
conservando aproximadamente 500 clones independientes.
Cada uno de los cósmidos recombinantes se
transfiere entonces por conjugación de E. coli a una cepa
receptora de Campylobacter jejuni C31, naturalmente
ureasa^{-}.
Se verifica para cada uno de estos
transconjugantes resistentes a la kanamicina, si existe síntesis
por Campylobacter jejuni de una ureasa.
Se aísla un cósmido en 106 analizados que lleva
una información genética que confiere a Campylobacter jejuni
C31 la capacidad de producir una ureasa. El cósmido recombinante
(IID2) tiene un tamaño de 54 kilobases. La posición relativa de los
sitios de escisión por las endonucleasas de restricción PstI, BamHI,
SmaI y EcoRI en esta secuencia se presenta en la figura 1.
Se efectúa la subclonación de los genes ureasa
realizando a partir del ADN cosmídico IID2 preparado en E.
coli digestiones parciales por la endonucleasa Sau3A para
generar fragmentos de digestiones parciales que tienen de 8 a 15
kilobases. Se busca el plásmido más pequeño clonado en E.
coli que confiere la aptitud de producir una ureasa tras su
transferencia por conjugación en el Campylobacter
receptor.
Cuatro plásmidos de 37 probados llevan la
información necesaria en la expresión de la ureasa en
Campylobacter jejuni: pILL586, pILL589 y pILL590
(véase la figura 2).
En comparación con los mapas de restricción de
estos cuatro híbridos, se constata la presencia de una secuencia de
nucleótidos de 4,2 kilobases común a los cuatro híbridos, lo que
sugiere que se trata de la región necesaria para la expresión de la
ureasa. Se han realizado un cierto número de deleciones que
confirman estas conclusiones (véase la figura 2).
El fragmento EcoRI-Pst I de
pILL590 se ha utilizado como sonda en hibridaciones con el ADN
total de C. pylori 85P para garantizar que los distintos
fragmentos de restricciones generados con BamHI e HindIII a partir
de pILL590 estaban presentes en 85P. Los resultados obtenidos
muestran que la secuencia de 8 kb presente en pILL590 no ha sufrido
redisposiciones durante las distintas etapas de clonación.
La secuencia del fragmento HindIII comprendida
entre los sitios H2 y H3 corresponde a la secuencia de los 294
nucleótidos de la cadena (I).
La siguiente secuencia de 610 nucleótidos de la
cadena (II) es interna al fragmento definido por los sitios H4 y B1
(figura 2).
El fragmento EcoRI-PstI de 8 kb
procedente de pILL590 se ha utilizado como sonda radioactiva en
experimentos de hibridación.
Se han probado 32 Campylobacter
pylori en hibridación en colonias y han dado una señal
positiva; en 35 Campylobacter jejuni, fetus y
coli estudiados, ninguno ha dado señal positiva en
condiciones de hibridación rigurosas clásicas (formamida al 50%
37ºC, 3 X SSC).
En las mismas condiciones, la sonda C.
pylori de 8 kilobases no ha dado señal positiva con la lista de
los siguientes microorganismos que son todos productores de
ureasa:
Klebsiella oxytoca (3 cepas),
Klebsiella pneumoniae (3 cepas), Proteus mirabilis (3
cepas), Proteus morganii (3 cepas), Proteus vulgaris
(2 cepas), Providencia stuartii (3 cepas), Pseudomonas
picketti (3 cepas), Yersinia enterocolitica (3 cepas), 5
cepas de Acinetobacter ureasa^{+}, 2 cepas de
Escherichia coli ureasa^{+} y 3 cepas de Citrobacter
freundii ureasa^{+}.
La ausencia de falso positivo con el fragmento de
8 kb garantiza la especificidad de las sondas nucleotídicas
propuestas.
Un procedimiento de preparación de anticuerpos
comprende:
- la inmunización de un animal con ayuda de un
polipéptido anteriormente definido, y
- la recuperación de los anticuerpos formados
según las técnicas clásicas.
Un modo de preparación apropiado de los ácidos
nucleicos (que comprenden como máximo 200 nucleótidos - o pb,
cuando se trata de ácidos nucleicos bicatenarios) de la invención
por vía química comprende las siguientes etapas:
- la síntesis de ADN utilizando el método
automatizado de la beta-cianetil fosforamidita
descrito en Bioorganic Chemistry 4; 274-325,
1986,
- la clonación de los ADN así obtenidos en un
vector plasmídico apropiado y la recuperación de los ADN por
hibridación con una sonda apropiada.
Un modo de preparación, por vía química, de
ácidos nucleicos de longitud superior a 200 nucleótidos - o pb
(cuando se trata de ácidos nucleicos bicatenarios) comprende las
siguientes etapas:
- la unión de oligonucleótidos sintetizados
químicamente, dotados en sus extremos de sitios de restricción
diferentes, cuyas secuencias son compatibles con la cadena de
aminoácidos del polipéptido natural según el principio descrito en
Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 80; 7461-7465,
1983,
- la clonación de los ADN así obtenidos en un
vector plasmídico apropiado y la recuperación del ácido nucleico
buscado por hibridación con una sonda apropiada.
Claims (7)
1. Secuencia de nucleótidos correspondiente,
según el código genético universal, a la secuencia comprendida
entre los aminoácidos situados en las posiciones 206 y 338 de la
secuencia (VIII).
2. Secuencia de nucleótidos caracterizada
porque está delimitada por dos sitios de restricciones de la figura
2 comprendidos entre los sitios H1 y B2 y que comprende los sitios
H1, H2, H3, H4, B1 y B2.
3. Fragmentos peptídicos caracterizados
porque se eligen entre:
a) La secuencia de aminoácidos (X) de 87 kDa.
b) Un fragmento de la secuencia a), comprendiendo
dicho fragmento una actividad ureasa y no siendo un fragmento
peptídico de la secuencia (VI) o (VIII).
4. Procedimiento de producción de un complejo
inmunológico entre una proteína con actividad ureasa expresada por
C. pylori o fragmentos de esta última conforme a aquellos de
la reivindicación 3 y anticuerpos, estando caracterizado
dicho procedimiento por la puesta en contacto de dicha proteína o
de dichos fragmentos peptídicos con un líquido biológico que
contiene dichos anticuerpos.
5. Uso de las secuencias según las
reivindicaciones 1 y 2, como sonda de detección en un procedimiento
de detección in vitro de la presencia de C. pylori en
una muestra susceptible de contenerla.
6. Uso de los fragmentos según la reivindicación
3, en la fabricación de una composición para la inducción de la
síntesis de anticuerpos específicos contra dichos fragmentos o de
una respuesta inmunitaria.
7. Uso de los fragmentos peptídicos elegidos
entre a) la secuencia de aminoácidos (VI) de 26 kDa, b) la
secuencia de aminoácidos (VIII) de 61 kDa o c) un fragmento de una
de las secuencias a) o b), comprendiendo dicho fragmento una
actividad ureasa, en la fabricación de una composición para la
inducción de la síntesis de anticuerpos específicos contra dichos
fragmentos o de una respuesta inmunitaria.
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