ES2208946T3 - Liposomas que contienen un compuesto de cisplatino. - Google Patents
Liposomas que contienen un compuesto de cisplatino.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UNA COMPOSICION DE LIPOSOMA QUE CONTIENE UN COMPONENTE DE CISPLATINA DERIVADO. LOS LIPOSOMAS TIENEN UNA SUPERFICIE DE REVESTIMIENTO DE CADENAS HIDROFILICAS DE POLIMERO EN LAS SUPERFICIES INTERIORES Y EXTERIORES Y UN COMPONENTE DE CISPLATINA DERIVADO. EL COMPONENTE ESTA DERIVADO EN LOS LIPOSOMAS CON UNA RETENCION NOTABLEMENTE MAYOR COMPARADA A LOS LIPOSOMAS QUE CARECEN DE REVESTIMIENTO DE POLIMERO. TAMBIEN SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE LA COMPOSICION.
Description
Liposomas que contienen un compuesto de
cisplatino.
La presente invención se refiere a una
composición liposómica que contiene un compuesto de cisplatino
ocluido.
Freise, J., y otros, Arch. Int.
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El cisplatino
(cis-diamina-dicloroplatino(II)),
es uno de los agentes antitumor más eficaces usados en el
tratamiento sistémico de cánceres de células germinales. Este
medicamento quimioterapéutico es altamente eficaz en el tratamiento
de modelos de tumores en animales de laboratorio y en tumores de
humanos, tales como neoplasmas endométricos, de vejiga, ovarios y
testicular, así como carcinoma de célula escamosa de la cabeza y
cuello (Sur, y otros, (1983); Steerenberg, y otros, (1987)).
Al igual que otros agentes quimioterapéuticos del
cáncer, el cisplatino es un medicamento altamente tóxico. Los
inconvenientes principales del cisplatino son su extrema toxicidad,
que es el factor principal limitante de la dosis, su rápida
excreción a través de los riñones, con una vida media de circulación
de únicamente unos pocos minutos, su fuerte afinidad a las proteínas
del plasma (Freise, y otros, (1982)).
Los intentos para minimizar la toxicidad del
medicamento han incluido la quimioterapia de combinación, la
síntesis de análogos de cisplatino (Prestayko, (1991); Weiss, y
otros, (1993)), la inmunoterapia y la oclusión en liposomas (Sur, y
otros, (1983); Weiss, y otros, (1993)). Los agentes
antineoplásticos, incluyendo el cisplatino, ocluido en liposomas,
han reducido su toxicidad con respecto al agente en forma libre, al
mismo tiempo que mantienen su actividad antitumor (Steerenberg, y
otros, (1987); Weiss, y otros, (1993)).
Sin embargo, el cisplatino es difícil de ocluir
de manera eficaz en liposomas debido a la baja solubilidad acuosa
del medicamento, aproximadamente 1,0 mg/ml a temperatura ambiente, y
su baja lipofilicidad, contribuyendo ambos factores a una baja
relación medicamento/lípido.
Los liposomas que contienen cisplatino adolecen
de otro problema: la estabilidad de la composición. En particular,
la retención del medicamento en el liposoma durante el
almacenamiento es un problema reconocido (Freise, y otros, (1982);
Gondal, y otros, (1993); Potkul, y otros, (1991); Steerenberg, y
otros, (1987); Weiss, y otros, (1993)), habiéndose informado de una
vida media limitada de los liposomas que contienen cisplatino, del
orden de varias semanas a 4ºC (Gondal, y otros, (1993); Potkul, y
otros, (1991)).
El Documento
EP-A-0551169, describe una
composición de liposoma en la que una solución acuosa que contiene
un medicamento soluble en agua en concentración saturada o más a
temperatura ambiente, está encapsulada en liposomas. No se describen
liposomas con un recubrimiento de un polímero hidrófilo que recubre
el liposoma.
En un aspecto, la invención incluye una
composición liposómica que contiene un compuesto de cisplatino
ocluido. La composición incluye liposomas que tienen una superficie
exterior y una superficie interior que definen un compartimento de
liposoma acuoso. Los liposomas están compuestos de un lípido
formador de vesículas y entre 1-20 moles por ciento
de un lípido formador de vesículas derivado con un polímero
hidrófilo. Los liposomas están formados de manera tal que el
polímero hidrófilo forma un recubrimiento de cadenas de polímero
hidrófilo sobre ambas superficies interior y exterior. El compuesto
de cisplatino está ocluido en los liposomas con una retención
substancialmente mayor que en los liposomas que carecen de los
recubrimientos con polímero sobre las superficies interior y
exterior.
En una realización, el compuesto de cisplatino es
cisplatino natural y está ocluido en los liposomas en una relación
de medicamento a lípido de entre 10 a 20 \mug/mg de lípido total.
En otra realización, el compuesto de cisplatino es un análogo de
cisplatino.
En otra realización, las cadenas de polímero
hidrófilo están compuestas de un polímero hidrófilo seleccionado
entre el grupo constituido por polivinilpirrolidona,
polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina,
polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida,
polimetacrilamida, polidimetilacrilamida,
polihidroxipropilmetacrilato, polihidroxietilacrilato,
hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenoglicol, y
poliaspartamida. En una realización preferida, el polímero hidrófilo
es polietilenoglicol.
Los liposomas, en una realización, tienen tamaños
entre 80-160 nm, preferiblemente
100-140 nm, lo más preferiblemente entre
100-120 nm.
En una realización preferida, el lípido formador
de vesículas es fosfatidilcolina de soja hidrogenada y el lípido
formador de vesículas derivado es diestearil fosfatidiletanolamina
derivada con polietilenoglicol.
En otro aspecto, la invención incluye un
procedimiento de oclusión de un compuesto de cisplatino en
liposomas, mediante el calentamiento de una solución acuosa de un
compuesto de cisplatino a una temperatura suficiente como para
aumentar su solubilidad por encima de la solubilidad del compuesto a
temperatura ambiente. A la solución del compuesto de cisplatino
calentada se agrega un lípido formador de vesículas y entre
aproximadamente 1-20 moles por ciento de un lípido
formador de vesículas derivado con un polímero hidrófilo. Mediante
dicha adición, se forman liposomas que tienen un recubrimiento de la
superficie interior y un recubrimiento de la superficie exterior de
cadenas de polímero hidrófilo y el compuesto de cisplatino queda
ocluido en los liposomas con una retención substancialmente mayor
que en los liposomas que carecen de los recubrimientos con
polímero.
En una realización del procedimiento, el
compuesto de cisplatino es cisplatino natural y la solución de
cisplatino acuosa se calienta a una temperatura suficiente como para
lograr un aumento del doble de la solubilidad de la cisplatina sobre
su solubilidad a temperatura ambiente.
En otra realización, una solución de lípidos
formadores de vesículas calentada hasta aproximadamente 10ºC de la
temperatura de la solución del cisplatino, se agrega a la solución
de cisplatino.
En otra realización, agregada a la solución de
cisplatino existe una solución que contiene un lípido formador de
vesículas que tiene una temperatura de transición de fase dentro de
aproximadamente 10ºC de la temperatura a la cual se ha calentado la
solución de cisplatino.
En otra realización, la solución formadora de
vesículas agregada a la solución de cisplatino contiene un lípido
formador de vesículas que tiene una temperatura de transición de
fase entre 40-70ºC.
Estos y otros objetos y características de la
invención serán más totalmente evidentes cuando se lea la
descripción detallada siguiente de la invención, conjuntamente con
los dibujos adjuntos.
La Figura 1 es una ilustración esquemática de un
liposoma formado de acuerdo con la invención;
la Figura 2 ilustra un esquema de reacción
general para la derivación de un lípido formador de vesículas con un
polialquiléter;
la Figura 3 es un esquema de reacción para la
preparación de fosfatidiletanolamina derivada con polietilenogicol
mediante un agente de enlace de cloruro cianúrico;
la Figura 4 ilustra un esquema de reacción para
la preparación de osfatidiletanolamina derivada con polietilenogicol
mediante un reactivo de activación de diimidazol;
la Figura 5 es una gráfica del volumen de un
tumor, en mm^{3}, como una función de los días
post-inoculación para ratones inoculados con el
modelo de tumor de colon C26 y tratado los días 12, 19 y 26 con
solución salina (\blacksquare), cisplatino libre
(
\arrowup), carboplatino libre (\bullet) o con cisplatino ocluido en liposoma (
\arrowdown);
la Figura 6 es una gráfica del volumen de un
tumor, en mm^{3}, como una función de los días
post-inoculación para ratones inoculados con el
modelo de tumor de colon C26 y tratado los días 12, 19 y 26 con
solución salina (\blacksquare), cisplatino libre
(
\arrowup) o con cisplatino ocluido en liposoma de acuerdo con tres regímenes de dosificación (
\arrowdown,\blacksquare, \bullet); y
la Figura 7 es una gráfica del volumen de un
tumor, en mm^{3}, como una función de los días
post-inoculación para ratones inoculados con
carcinoma de pulmón de Lewis y tratado los días 7, 14 y 21 con
solución salina (\blacksquare), cisplatino libre IV
(\blacklozenge), cisplatino libre IP (\bullet) o con cisplatino
ocluido en liposoma IV (
\arrowup) o IP (
\arrowdown).
La composición liposómica de la presente
invención incluye liposomas que tienen un compuesto de cisplatino
ocluido de manera estable. Tal como aquí se usa, un "compuesto de
cisplatino ocluido de manera estable" se refiere a cisplatino
natural o un análogo de cisplatino capturado dentro de un liposoma,
fundamentalmente dentro del espacio acuoso del liposoma, de manera
tal que el compuesto de cisplatino es retenido de manera substancial
dentro del liposoma antes de la administración.
La Figura 1 ilustra un liposoma 10, preparado de
acuerdo con la invención, el cual incluye una bicapa de lípido
interior 12 y una bicapa de lípido exterior 14. Las bicapas de
lípido interior y exterior están formadas predominantemente por
lípidos formadores de vesículas, tal como el lípido 16, el cual
incluye un grupo de cabeza polar 16a y una cola hidrófoba 16b. Los
ejemplos de lípidos formadores de vesículas se enumeran más
adelante.
El liposoma 10 incluye además lípidos formadores
de vesículas derivados con un polímero hidrófilo, tal como el lípido
derivado 18 en la Figura 1. El lípio derivado 18 incluye una cola
hidrófoba 18a, un grupo de cabeza polar 18b, y unido al grupo de
cabeza polar, por medios descritos más adelante, un polímero
hidrófilo 18c. El polímero hidrófilo proporciona los recubrimientos
superficiales 20, 21 de las cadenas polímeras hidrófilas tanto sobre
una superficie exterior 22 de la bicapa del lípido exterior 14 como
sobre una superficie interior 24 de la bicapa del lípido interior
12. El recubrimiento de la superficie exterior de las cadenas del
polímero hidrófilo es eficaz para proporcionar un liposoma con un
largo tiempo de vida de circulación en sangre in vivo. Tal
como se ilustrará más adelante, los recubrimientos superficiales
interior y exterior son además eficaces para proporcionar una
composición de liposomas con cisplatino con un largo período de
almacenamiento, p. ej., una composición de liposoma estable en la
que el compuesto de cisplatino está ocluido en el liposoma.
El liposoma 10 incluye igualmente un compuesto de
cisplatino, p. ej., cisplatino natural o un análogo de cisplatino,
en forma ocluida. El medicamento está ocluido en el compartimento
acuoso interior 26 en forma disuelta o en forma precipitada. En los
estudios realizados en apoyo de la invención, se ocluyó cisplatino
natural en liposomas preparados con un recubrimiento superficial de
cadenas de polímero hidrófilo sobre las superficies interior y
exterior del liposoma. Estos liposomas, cuando se compararon con
liposomas que carecían del recubrimiento de polímero hidrófilo,
tenían una estabilidad mejorada, tal como se evidenció mediante la
capacidad para retener el medicamento dentro del liposoma durante un
período de tiempo más largo.
La composición de liposoma de la presente
invención se compone fundamentalmente de lípidos formadores de
vesículas. Un lípido formador de vesícula de este tipo, es uno que:
(a) puede formarse espontáneamente dentro de vesículas bicapas en
agua, tal como se ejemplifica mediante los fosfolípidos, o (b) se
incorpora de manera estable dentro de bicapas de lípidos, con su
parte hidrófoba en contacto con el interior, la región hidrófoba de
la membrana bicapa, y su parte de grupo de cabeza polar hacia el
exterior, la superficie polar de la membrana.
Los lípidos formadores de vesículas de este tipo
son, preferiblemente, aquellos que tienen dos cadenas de
hidrocarburos, típicamente cadenas acilo, y un grupo de cabeza
polar. Existe una diversidad de lípidos formadores de vesículas
sintéticos y lípidos formadores de vesículas que se producen de
manera natural, incluyendo los fosfolípidos, tal como la
fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico
(PA), fosfatidilinositol (PI) y esfingomielina (SM), en los cuales
las dos cadenas de hidrocarburos tienen una longitud comprendida,
típicamente, entre 14-22 átomos de carbono, y
conteniendo grados variables de insaturación. Un lípido preferido
para uso en la presente invención es fosfatidilcolina de soja
hidrogenada (HSPC).
Los lípidos y fosfolípidos anteriormente
descritos, en los cuales las cadenas acilo tiene grados variables de
saturación, pueden obtenerse comercialmente o prepararse de acuerdo
con procedimientos publicados.
El lípido formador de vesículas puede
seleccionarse con el fin de lograr un grado especificado de fluidez
o de rigidez, para controlar la estabilidad del liposoma en el suero
y para controlar la velocidad de liberación del agente ocluido en el
liposoma. Los liposomas que tienen un bicapa de lípido más rígida, o
una bicapa cristalina líquida, se logran mediante la incorporación
de un lípido relativamente rígido, p. ej., un lípido que tiene una
temperatura de transición de fase relativamente alta, p. ej., hasta
80ºC. Los lípidos rígidos, es decir, saturados, contribuyen a una
mayor rigidez de la membrana en la bicapa del lípido. Otros
componentes lípidos, tal como el colesterol, son igualmente
conocidos por contribuir a la rigidez de la membrana en estructuras
bicapa de lípidos.
La fluidez del lípido se logra mediante la
incorporación de un lípido relativamente flúido, típicamente uno que
tenga una fase de lípido con una baja temperatura de transición de
fase de líquido a líquido-cristalina, p. ej., a la
temperatura ambiente o por debajo de la misma
(20-25ºC).
Los lípidos adecuados para uso en la composición
de liposoma con cisplatino de la presente invención, incluyen
lípidos formadores de vesículas que tienen temperaturas de
transición de fase a la temperatura ambiente o por debajo de la
misma y aquellos que tienen una temperatura de transición de fase
alta. En una realización preferida, se usa un lípido formador de
vesículas que tiene una temperatura de transición de fase entre
40-70ºC. En otra realización, el lípido usado en la
formación de liposomas es uno que tiene una temperatura de
transición de fase entre aproximadamente 20ºC, más preferiblemente
10ºC, lo más preferiblemente 5ºC, de la temperatura a la cual la
solución que contiene el compuesto de cisplatino se calienta durante
la preparación del liposoma, tal como se describe más adelante. Las
temperaturas de transición de fase de los lípidos se encuentran
tabuladas en una diversidad de fuentes, tal como el catálogo de
Avanti Polar Lipids y la Lipid Thermotropic Phase
Transition Database (LIPIDAT, NIST Standard Reference Database
34).
Los liposomas pueden incluir otros lípidos que
pueden estabilizar una vesícula o un liposoma compuesto
predominantemente de fosfolípidos. Un lípido frecuentemente usado
para este fin es el colesterol en una proporción de entre 25 a 40
moles por ciento. A una proporción de entre 0 a 20 moles por ciento,
el colesterol en una bicapa separa los campos que existen
conteniendo colesterol y fosfolípidos y fosfolípido puro (Mabrey, y
otros, (1978)). Estas bicapas muestran una permeabilidad
incrementada al agua (Tsong, (1975)). En una realización de la
presente invención, se incluye colesterol en la composición de
liposoma, tal como se describe más adelante.
En el procedimiento de la invención, se preparan
liposomas que contienen un compuesto de cisplatino mediante la
adición de una solución acuosa calentada de un compuesto de
cisplatino a una mezcla de lípidos formadores de vesículas que
contiene entre 1-20 moles por ciento de un lípido
formador de vesículas derivado con un polímero hidrófilo. Los
lípidos se disuelven en un disolvente adecuado, tal como etanol,
metanol, cloroformo o mezclas de los mismos.
Antes de la adición de los lípidos, la solución
acuosa de cisplatino se calienta a una temperatura suficiente como
para aumentar su solubilidad sobre la solubilidad a temperatura
ambiente del compuesto de cisplatino. Es decir, la solución se
calienta a una temperatura que logra que al menos se aumente
aproximadamente dos veces, preferiblemente tres veces, lo más
preferiblemente cuatro veces, su solubilidad sobre la solubilidad de
la solución acuosa a temperatura ambiente del compuesto de
cisplatino. Por ejemplo, el cisplatino, que tiene una solubilidad
acuosa de 1 mg/ml a 20-25ºC, puede calentarse hasta
aproximadamente 63ºC para aumentar la solubilidad acuosa hasta
aproximadamente 8,5 mg/ml. La solubilidad del cisplatino y de
análogos de cisplatino puede ser determinada fácilmente por un
experto en la técnica de acuerdo con procedimientos estándar.
En una realización de la invención, la solución
que contiene el lípido formador de vesículas se calienta hasta
dentro de aproximadamente 20ºC, más preferiblemente 10ºC, lo más
preferiblemente 5ºC, de la temperatura de la solución de
cisplatino.
En el ejemplo detallado más adelante, el lípido
formador de vesículas HSPC, el lípido formado de vesículas
PEG-DSPE y el colesterol, se disuelven en etanol
calentado hasta aproximadamente 65ºC, justamente por encima de la
temperatura de transición de fase del HSPC entre aproximadamente
52-60ºC. Una solución acuosa de cisplatino natural
se calienta entre 63-67ºC. Las soluciones se mezclan
conjuntamente para formar liposomas que contienen el compuesto de
cisplatino en forma ocluida.
El procedimiento de la invención logra una alta
encapsulación de cisplatina, encapsulando típicamente entre
10-20 \mug de medicamento/mg de lípido, y
proporciona liposomas que tienen, además del recubrimiento
superficial exterior, un recubrimiento superficial interior de las
cadenas del polímero hidrofílico, con el compuesto de cisplatino
ocluido de manera estable dentro del liposoma.
Tal como se ha expuesto anteriormente, los
liposomas de la presente invención tienen un recubrimiento
superficial de las cadenas del polímero hidrófilo sobre las
superficies de la bicapa de lípido tanto interior como exterior. El
recubrimiento superficial se logra incluyendo en la composición del
liposoma entre 1-20 moles por ciento de un lípido
derivado con un polímero hidrófilo.
Los polímeros hidrófilos adecuados para la
derivación con un lípido formador de vesículas incluyen
polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina,
polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina,
polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida,
polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato,
polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa,
polietilenoglicol, y poliaspartamida. Los polímeros pueden usarse
como homopolímeros o como polímeros de bloque o al azar.
Una cadena de polímero hidrófilo preferido es la
de polietilenoglicol (PEG), preferiblemente en forma de una cadena
de PEG conteniendo un peso molecular entre
500-10.000 daltons, más preferiblemente entre
1.000-5.000 daltons. Los análogos terminados en
metoxi o etoxi de PEG son igualmente polímeros de PEG hidrófilos
preferidos, comercialmente disponibles en una diversidad de tamaños
de polímeros, p. ej., 120-20.000 daltons.
Los lípidos formadores de vesículas adecuados
para derivación con un polímero hidrófilo, incluyen cualquiera de
los lípidos enumerados anteriormente y, en particular, los
fosfolípidos, tal como diestearil fosfatidiletanolamina (DSPE). La
preparación derivada con PEG se describe más adelante (Ejemplo
1).
El lípido derivado se incorpora dentro del
liposoma mediante la inclusión de un lípido anfipático derivado con
polímero hidrófilo con lípidos formadores de vesículas durante la
formación de las vesículas del lípido.
Una vez formado el liposoma, las cadenas de
polímero hidrófilo proporcionan un recubrimiento superficial sobre
ambas superficies interior y exterior de la bicapa del lípido, tal
como se ha expuesto con respecto a la Figura 1. Lo importante, es
que el recubrimiento superficial es eficaz para mejorar la
estabilidad de los liposomas, tal como se describe más adelante. El
recubrimiento superficial es igualmente eficaz para ampliar el
tiempo de circulación en sangre del liposoma con respecto a la
ausencia de un recubrimiento de este tipo. La ampliación del
incremento del tiempo de circulación en sangre es, preferiblemente,
de varias veces sobre el logrado en ausencia del recubrimiento de
polímero, tal como se describe en la Patente de EE.UU. No. 5.013.556
en copropiedad.
Los liposomas en la composición de la presente
invención pueden comprender otros componentes, tales como moléculas
diana, en las que se incluyen anticuerpos, fragmentos de
anticuerpos, o moléculas de reconocimiento de superficie de células,
las cuales están unidas a los liposomas mediante cadenas de polímero
hidrófilo. Por ejemplo, un lípido formador de vesículas se deriva
con una cadena de polímero hidrófilo, tal como se ha descrito
anteriormente, y el polímero hidrófilo se funcionaliza en su extremo
para el acoplamiento de anticuerpos a su extremo funcionalizado. El
grupo extremo funcionalizado puede ser un grupo hidracida o
hidracina, el cual es reactivo frente a grupos aldehidos, aunque
pueden usarse cualquiera de entre un cierto número de grupos
reactivos terminales con PEG para el acoplamiento a anticuerpos. Las
hidracidas pueden igualmente acilarse mediante ésteres activos o
grupos carboxilos activados por carbodiimida. Los grupos acil acida
reactivos como especies acilantes pueden obtenerse fácilmente a
partir de hidracidas y permiten la unión de moléculas que contienen
grupos amino. El grupo extremo funcionalizado puede ser igualmente
2-piridiltio-propionamida, para el
acoplamiento de un anticuerpo u otra molécula al liposoma a través
de un enlace disulfuro.
La composición de liposoma de la presente
invención está destinada para uso en la terapia del cáncer, más
particularmente en la terapia de tumores. Dentro de los liposomas
está ocluido un compuesto de cisplatino y la composición de liposoma
se administra al sujeto. Tal como se ha mencionado aquí, un
compuesto de cisplatino se refiere a cisplatino natural o sus
análogos. En una realización preferida, el compuesto de cisplatino
es cisplatino natural y, en otra realización, el compuesto de
cisplatino es un análogo de cisplatino, preferiblemente un análogo
de cisplatino hidrófilo.
El cisplatino natural, mencionada aquí también
como cisplatino, es un complejo de metal pesado que contiene un
átomo central de platino rodeado por dos átomos de cloro y dos
moléculas de amoníaco en la posición cis. Es un polvo amarillo con
la fórmula molecular PtCl_{2}H_{6}N_{2}, y un peso molecular
de 300,1. Es soluble a temperatura ambiente en agua o solución
salina a una concentración de 1 mg/ml y tiene un punto de fusión de
207ºC (Physician's Desk Reference, (1994)) y se descompone a
270ºC.
Los átomos de cloro en la molécula de cisplatino
están sujetos a reacciones de desplazamiento químico por
nucleófilos, tales como agua o grupos sulfhidrilo. Al pH fisiológico
en presencia de NaCl 0,1 M, las especies moleculares predominantes
son cisplatino y monohidroximonocloro cis-diamina
platino(II) en concentraciones aproximadamente iguales.
El medicamento está disponible en forma de una
solución estéril que contiene 1 mg de cisplatino y 9 mg de NaCl por
ml de agua y, en esta forma, se administra típicamente
intravenosamente para la terapia de tumores, a una dosis de entre
aproximadamente 20-120 mg/m^{2} (Physician's
Desk Reference, (1994)). El medicamento puede administrarse solo
o en combinación con otros agentes quimioterapéuticos, en forma de
una inyección bolo o como una infusión lenta a lo largo de un
período de varias horas.
Como agente único, el cisplatino puede
administrarse, por ejemplo, a una dosis de 100 mg/m^{2}
intravenosamente una vez cada 4 semanas (Physician's Desk
Reference, (1994)) o a una dosis de 20 mg/m^{2} de cisplatino
administrado como una infusión intravenosa rápida diariamente
durante 5 días y repetida a intervalos de 4 semanas (Prestayko,
(1991)). En el tratamiento de cáncer de célula escamosa de la cabeza
y cuello, el cisplatino administrado intravenosamente como una
infusión de 24 horas a una dosis de 80 mg/m^{2} logra una
respuesta favorable (Prestayko, (1991)).
Aunque activo como un agente único, el cisplatino
se administra frecuentemente en combinación con otros agentes, entre
los que se incluyen vinblastina, bleomicina, actinomicina,
adriamicina, prednisona, vincristina y otros (Prestayko, (1991)).
Por ejemplo, la terapia de cáncer de ovario puede incluir 60
mg/m^{2} de cisplatino y 60 mg/m^{2} de adriamicina
administrados como una infusión de 24 horas. En la presente
invención, la terapia de combinación puede incluir cisplatino
ocluido en liposomas administrado con otro agente quimioterapéutico
en forma libre o en forma ocluida en liposomas, tal como la
doxirubicina ocluida en liposomas descrita en la Patente de EE.UU.
No. 5.527.528.
En la presente invención, el cisplatino se ocluye
en los liposomas, los cuales se han dimensionado entre
80-160 nm, más preferiblemente entre
100-140 nm, lo más preferiblemente entre
100-120 nm, adecuados para administración
intravenosa. Los liposomas que contienen cisplatino se administran a
las dosificaciones dadas anteriormente para el medicamento libre;
no obstante, dichas dosificaciones pueden ajustarse considerando la
respuesta a la toxicidad reducida del medicamento proporcionada por
la oclusión liposómica. Tal dosificación ajustada puede ser
determinada fácilmente de manera experimental por un experto en la
técnica.
La concentración liposómica interna de cisplatino
está comprendida entre 1-9 mg de cisplatino/ml, más
preferiblemente entre 4-9 mg/ml, lo más
preferiblemente entre 6-8,5 mg/ml. La suspensión de
liposoma que contiene el cisplatino está a una concentración de
entre aproximadamente 1-2 mg de cisplatino/ml de
volumen de suspensión total, para administración intravenosa.
En otra realización de la invención, el compuesto
de cisplatino ocluido dentro de los liposomas es un análogo de
cisplatino. Se han sintetizado un amplio espectro de análogos de
cisplatino, los cuales ofrecen un espectro antitumor diferente,
mejor índice terapéutico y toxicidad reducida con respecto al que
ofrece el cisplatino natural. Dichos análogos incluyen
carboplatino, ormaplatino, oxaliplatino, DWA2114R, zeninplatino,
enloplatino, lobaplatino, CI-973,
254-S y JM-216 (Weiss, y otros,
(1993)). Algunos análogos de cisplatino, tal como espiroplatino, se
ha encontrado que son más tóxicos que el cisplatino natural. Aunque
los análogos de cisplatino más tóxicos no son deseables para
administración intravenosa en forma libre, dichos análogos pueden
tener uso en forma ocluida en liposomas, la cual reduce la
toxicidad del medicamento.
Para los fines de la presente invención, los
análogos que tienen algún grado de solubilidad en agua, tal como el
carboplatino, iproplatino y otros, son preferidos, de manera que el
medicamento está ocluido fundamentalmente en el compartimento
acuoso interior del liposoma.
En una realización preferida, el análogo de
cisplatino es carboplatino
(1,1-ciclobutano-dicarboxilato-diaminoplatino),
el cual contiene ligandos orgánicos en un complejo planar
tetra-coordinado de platino. Este análogo de
cisplatino ha demostrado una actividad antitumor equivalente o
superior al cisplatino y menor nefrotoxicidad en estudios
preclínicos (Weiss, y otros, (1993)).
Los liposomas que contienen un análogo de
cisplatino pueden administrarse solos o en combinasción con otros
agentes quimioterapéuticos, en forma libre o en forma ocluida en
liposomas, tal como se ha expuesto anteriormente con respecto al
cisplatino natural.
La Sección A que figura a continuación, describe
la síntesis de lípidos formadores de vesículas derivados con un
polímero hidrófilo para uso en la formación de los liposomas de la
presente invención. La Sección B describe un procedimiento de
preparación de liposomas, el cual incluye los lípidos derivados y un
compuesto de cisplatino.
La Figura 2 muestra un esquema de reacción
general para la preparación de un lípido formador de vesículas
derivado con un polímero hidrófilo, biocompatible, tal como se
ejemplifica mediante el polietileno glicol (PEG), el cual es
fácilmente soluble en agua, puede acoplarse a lípidos formadores de
vesículas, y es tolerante in vivo sin efectos tóxicos.
Preferiblemente, el polímero termina mediante un grupo metoxi, etoxi
u otro grupo no reactivo por un extremo, o es un polímero en el
cual un extremo es más reactivo que el otro.
El polímero se activa en un extremo mediante
reacción con un agente de activación adecuado, tal como ácido
cianúrico, diimidazol, reactivo anhidrido, o similar, tal como se
describe más adelante. A continuación, el compuesto activado se hace
reaccionar con un lípido formador de vesículas, tal como
fosfatidiletanol (PE), para producir el lípido derivado.
Como alternativa, el grupo polar en el lípido
formador de vesículas puede activarse para la reacción con el
polímero, o los dos grupos pueden unirse en una reacción de
acoplamiento concertada, de acuerdo con procedimientos de
acoplamiento conocidos. El PEG terminado en un extremo con un grupo
metoxi o etoxi puede obtenerse comercialmente en una diversidad de
tamaños del polímero, p. ej., con pesos moleculares de
500-20.000 daltons.
Preferiblemente, el lípido formador de vesículas
es uno que tiene dos cadenas de hidrocarburos, típicamente cadenas
acilo, y un grupo de cabeza polar, tal como los enumerados
anteriormente.
La Figura 3 muestra un esquema de reacción para
la producción de un lípido de PE-PEG, en el cual el
PEG se deriva a PE mediante un grupo cloruro cianúrico. Los
detalles de la reacción se proporcionan en el Ejemplo 1. Brevemente,
el PEG terminado en metoxi se activa con cloruro cianúrico en
presencia de carbonato sódico, bajo condiciones que producen el
compuesto de PEG activado de la figura. Este material se purifica
para eliminar el ácido cianúrico sin reaccionar. El compuesto de PEG
activado se hace reaccionar con PE en presencia de trietilamina para
producir el compuesto de PE- PEG deseado, tal como se muestra en la
figura. El rendimiento es de aproximadamente 8-10%
con respecto a las cantidades iniciales de PEG.
El procedimiento recién descrito puede aplicarse
a una diversidad de aminas lípidas, en las que se incluyen PE,
colesteril amina y glucolípidos con grupos
azúcar-amina.
Un segundo procedimiento de acoplamiento de un
polialquiléter, tal como PEG terminado a una amina lípida, se
ilustra en la Figura 4. En este caso, el PEG terminado se activa
con un reactivo de acoplamiento carbonil diimidazol, para formar el
compuesto de imidazol activado mostrado en la Figura 4. La reacción
con una amina lípida tal como PE, conduce al acoplamiento de PEG al
lípido mediante un enlace amida, tal como se ilustra en el
compuesto de PEG-PE mostrado en la figura. Los
detalles de la reacción se muestran en el Ejemplo 2.
Los liposomas pueden prepararse mediante una
diversidad de técnicas, tales como las detalladas por Skoza, y
otros, (1980). Un procedimiento para la preparación de liposomas
que contienen medicamentos, es el procedimiento de evaporación de
fase inversa, descrito por Szoka y en la Patente de EE.UU. No.
4.235.871. Las vesículas de evaporación de fase inversa (REVs)
tienen, típicamente, tamaños promedio entre 2-4
micrómetros y son predominantemente oligolamelares, es decir,
contienen una o unas pocas cubiertas bicapa de lípido.
En otro procedimiento, pueden formarse vesículas
multilamelares (MLVs) mediante simples técnicas de hidratación de
la pelicula del lípido. En este procedimiento, una mezcla de
lípidos formadores de liposomas del tipo detallado anteriormente
disuelta en un disolvente adecuado, se evapora en un recipiente para
formar una película fina, la cual, a continuación, se recubre
mediante un medio acuoso. La película de lípido se hidrata,
formando MLVs, típicamente con tamaños entre aproximadamente 0,1 a
10 micrómetros.
A continuación, los liposomas se dimensionan; un
procedimiento de dimensionado eficaz para REVs y MLVs implica la
extrusión de una suspensión acuosa de los liposomas a través de una
serie de membranas de policarbonato que tienen un tamaño de poro
uniforme seleccionado dentro del intervalo de 0,03 hasta 0,2
micrómetros, típicamente 0,05, 0,08, 0,1 ó 0,2 micrómetros. El
tamaño de poro de la membrana corresponde de manera aproximada a los
tamaños más grandes de liposomas producidos mediante extrusión a
través de dicha membrana, particularmente cuando la preparación se
extruye dos o más veces a través de la misma membrana. Los
procedimientos de homogeneización son igualmente útiles para
liposomas de dimensiones bajas hasta tamaños de 100 nm o menores
(Martin, (1990)).
En la presente invención, la composición de
liposoma se prepara, típicamente, con entre aproximadamente
25-80 moles por ciento de lípidos formadores de
vesículas, 10-40 moles por ciento de colesterol, y
1-20 moles por ciento de lípido derivado con
polímero. Un ejemplo de formulación de liposoma incluye
fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y colesterol (Col), en
una relación aproximadamente 1:1 molar, y entre aproximadamente
1-5 moles por ciento de DSPE-PEG,
agregado para formar liposomas con un recubrimiento superficial de
bicapa interior y exterior de
PEG.
PEG.
Generalmente, el compuesto de cisplatino se
incorpora dentro de los liposomas durante la formación del liposoma,
agregando la solución de lípidos a una solución que contiene el
medicamento, tal como se describe más adelante.
De acuerdo con el procedimiento de la invención,
y tal como se describe en el Ejemplo 3, se preparó una solución de
lípidos que contenía entre 50-200 mg/ml de lípidos
totales formados por PEG-DSPE, HSPC y colesterol
(relación molar 50,6/44,3/5,1), disolviendo los lípidos en etanol
caliente (60-65ºC). Se calentó una solución acuosa
de cisplatino (8,5 mg/ml de cisplatino en cloruro sódico al 0,9%)
hasta una temperatura suficiente como para aumentar
significativamente su solubilidad con respecto a la solubilidad del
compuesto a temperatura ambiente; específicamente, la solución de
cisplatino se calentó hasta aproximadamente 63ºC, incrementándose la
solubilidad del cisplatino aproximadamente ocho veces, desde 1
mg/ml hasta 8,5 mg/ml.
La solución de cisplatino y la solución de
lípidos se mezclaron conjuntamente para formar liposomas,
manteniéndose la temperatura de la mezcla entre
60-65ºC.
Los liposomas, después de diafiltración y
diálisis, se extruyeron a través de filtros de policarbonato de 0,2
\mum y 0,1 \mum con el fin de dimensionar los liposomas entre
aproximadamente 100-120 nm. La suspensión de
liposomas se enfrió a temperatura ambiente y el cisplatino
precipitado no ocluido se eliminó mediante filtración y
diafiltración.
Los liposomas finales contenían una fase interna
de cisplatino encapsulado a una concentración de 8,5 mg/ml en
cloruro sódico al 0,9% y una fase externa de solución de
sacarosa/cloruro sódico. Antes de su envasado para estudios de
estabilidad, tal como se describe más adelante, y/o antes de su
administración, la suspensión de liposomas se llevó hasta una
concentración de cisplatino de 1,05 mg/ml con una solución de
sacarosa/cloruro sódico/histidina y el pH se ajustó a 6,5.
La estabilidad de los liposomas preparados tal
como se describe más adelante (Ejemplo 5), se evaluó mediante: (i)
análisis de la suspensión de liposomas para determinar las
concentraciones de cisplatino y platino, (ii) determinación del por
ciento de platino encapsulado, (iii) medición del tamaño de los
liposomas, y (iv) medición del pH de la suspensión de liposomas,
todos ellos en función del tiempo y la temperatura.
Tal como se describe en el Ejemplo 4, la
concentración de cisplatino se midió mediante un ensayo de la
suspensión de liposomas para determinar la concentración de
cisplatino mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC). En
este procedimiento, se agrega un disolvente orgánico a la muestra de
liposomas con el fin de romper la bicapa de lípido, liberándose el
cisplatino ocluido, antes del ensayo para determinar la
concentración de cisplatino. La concentración de platino en la
suspensión liposómica se determinó mediante absorción atómica. El
porcentaje de platino encapsulado se midió separando los liposomas
del medicamento no encapsulado mediante cromatografía de exclusión
por tamaños y determinando tanto las fracciones liposómica como de
medicamento para determinar el contenido de platino mediante
absorción atómica. El tamaño del liposoma se determinó mediante
dispersión de luz dinámica.
En la Tabla 1 se resumen los resultados.
Los liposomas almacenados a temperaturas de -40ºC
y -20ºC no mostraron pérdidas medibles en las concentraciones de
cisplatino o platino después de almacenamiento durante tres meses.
Tampoco se observó un cambio significativo en el tamaño del
liposoma o en el pH de la suspensión después del período de
almacenamiento de tres meses. A -20ºC y después de 18 meses de
almacenamiento, el cisplatino se mantuvo dentro de los liposomas,
tal como se evidenció mediante una pérdida no significativa tanto en
las concentraciones de cisplatino como de platino. La composición
del liposoma fue igualmente estable cuando se almacenó a
2-8ºC durante 18 meses. Tal como se observa en la
Tabla 1, no se observaron pérdidas medibles en las concentraciones
de cisplatino o de platino. Al alcanzar el período de tiempo de 18
meses, el porcentaje de platino encapsulado fue del 99%, lo cual
indica que la totalidad, excepto un 1% del platino ocluido, se
mantuvo dentro de los liposomas. El que el platino ocluido esté en
la forma de cisplatino, resulta evidente a partir de la
concentración de cisplatino, la cual no disminuye a lo largo del
período de almacenamiento de 18
meses.
meses.
Bajo condiciones de almacenamiento más agresivas
de 30ºC y 40ºC, se observó alguna disminución en las concentraciones
de cisplatino y platino, y el porcentaje de platino encapsulado fue
del 93% después de 3 meses a 30ºC y del 91% después de 1 mes a
40ºC. Se observaron pocos cambios en el tamaño del liposoma.
Los datos indican que la composición de los
liposomas de la presente invención es eficaz para retener el
cisplatino en los liposomas, proporcionando, de esta forma, una
composición de liposoma estable. Esta estabilidad se puso en
evidencia en particular mediante el punto de tiempo de 6 meses a
2-8ºC, en el cual la concentración de cisplatino se
mantuvo constante y el 99% del platino estaba encapsulado en los
liposmas.
Los liposomas de la presente invención, que
tienen un recubrimiento superficial interior y exterior de cadenas
de polímero hidrófilo, se compararon con liposomas
"convencionales", es decir, liposomas que carecían del
recubrimiento superficial interior y exterior de cadenas de
polímero hidrófilo.
Tal como se describe en el Ejemplo 5, se
prepararon liposomas que contenían cisplatino de acuerdo con la
presente invención a partir de HSPC/Col/mPEG-DSPE
en una relación molar de 50,6/44,3/5,1. Se preparó una composición
de liposomas comparativa, la cual era idéntica a los liposomas de la
presente invención, excepto que el mPEG-DSPE se
reemplazó con la misma cantidad molar de diestearil fosfatidil
glicol (DSPG), que tiene la misma cola de hidrocarburo y la misma
carga en el grupo de cabeza polar que el mPEG-DSPE.
La composición de liposomas comparativa, la cual carecía del
polímero hidrófilo, no tenía un recubrimiento superficial de cadenas
de polímero hidrófilo en ninguna de las bicapas del lípido interior
ni exterior.
En un primer estudio (Ejemplo 5A), las
composiciones de liposomas se incubaron a 60ºC durante 6 horas.
Después de la incubación, se midieron, de acuerdo con los
procedimientos descritos anteriormente, la concentración de
cisplatino de la suspensión liposómica, el porcentaje de platino
encapsulado, el tamaño del liposoma y el pH de la suspensión. Los
resultados, resumidos en la Tabla 2, muestran que después del
período de incubación, la composición de liposomas de la presente
invención tenía un 24% (desde 0,38 mg/ml hasta 0,29 mg/ml) de
disminución en la concentración de cisplatino, en tanto que la
concentración de cisplatino de la suspensión de liposomas
comparativa disminuyó un 44% (desde 0,25 mg/ml hasta 0,14 mg/ml). El
porcentaje de platino encapsulado de los liposmas de la presente
invención fue del 96% después de la incubación. Los liposomas
comparativos tenían un porcentaje de encapsulación de platino del
81%, lo cual indica que el 19% de las especies que contenían platino
se habían fugado de los liposomas. En una realización de la
invención, la composición de liposomas se caracteriza por un por
ciento de platino encapsulado superior aproximadamente al 85%, más
preferiblemente 90%, cuando se almacena a 60ºC durante 6 horas.
En un segundo estudio (Ejemplo 5B), se incubaron,
a 40ºC y durante 2 semanas, liposomas que tenían las composiciones
descritas anteriormente para los datos presentados en la Tabla 2;
los resultados se muestran en la Tabla 3. En este estudio, los
liposomas se diluyeron hasta una concentración de cisplatino de 1,0
mg/ml en un diluyente de histidina/sacarosa/cloruro sódico descrito
en el Ejemplo 3G. Después del período de incubación, se observó un
29% (desde 0,75 hasta 0,53 mg/ml) de disminución en la concentración
de cisplatino de la suspensión que contenía liposomas que tenían un
recubrimiento de PEG. El porcentaje de platino encapsulado fue del
95%. Estos datos indican que una porción del cisplatino se había
convertido en otras especies moleculares, tal como
monohidroximonocloro cis-diamina platino, tal como
se ha expuesto anteriormente, y que únicamente aproximadamente el 5%
de las especies que contenían platino se habían fugado de los
liposomas después de incubación a 40ºC durante 2 semanas.
La composición de liposomas comparativa, después
de almacenamiento a 40ºC durante 2 semanas, no tenía cisplatino
medible en los liposomas, lo que sugiere que casi la totalidad del
cisplatino se había convertido en otras especies moleculares. El
81% de las especies que contenían platino estaban encapsuladas en
los liposomas; en otras palabras, el 19% de las especies que
contenían platino se habían fugado de los liposomas. Claramente, el
liposoma preparado de acuerdo con las invención que tiene un
recubrimiento superficial interior y exterior de cadenas de polímero
hidrófilo, tiene una retención substancialmente mayor de cisplatino
que los liposomas comparativos.
En otro estudio, se prepararon liposomas
comparativos tal como se ha descrito anteriormente y se almacenaron
a 2-8ºC durante 2 meses. En la Tabla 4, se resumen
los datos de estabilidad para este estudio, conjuntamente con los
datos de la Tabla 1 a la misma temperatura para liposomas
preparados de acuerdo con la invención, para comparación.
Resulta evidente, a partir de los datos mostrados
en la Tabla 4, que comparados con los liposomas que carecen de un
recubrimiento superficial interior y exterior de cadenas de
polímero hidrófilo, la composición de liposomas de la presente
invención que tiene dicho recubrimiento superficial, es eficaz para
reducir la pérdida de cisplatino de los liposomas. En particular,
la composición de liposomas es eficaz para reducir la conversión de
cisplatino en otras especies moleculares, tal como se pone en
evidencia mediante la comparación de las concentraciones de
cisplatino y el porcentaje de platino encapsulado para las dos
composiciones.
En resumen, los datos de estabilidad presentados
en las Tablas, 2, 3 y 4, indican que los liposomas preparados de
acuerdo con la presente invención, que tienen un recubrimiento
superficial interior y exterior de cadenas de polímero hidrófilo,
proporcionan una composición liposómica de cisplatino, establemente
ocluido, mediante: (1) la reducción de la conversión de cisplatino
en otras especies moleculares, y (2) la reducción de la fuga de
cisplatino (y otras especies que contienen platino) de los
liposomas.
Los liposomas que contienen cisplatino preparados
de acuerdo con la invención, se administraron a ratones portadores
de tumores y se compararon con cisplatino y carboplatino libres
para determinar la eficacia antitumor. Tal como se describe en el
Ejemplo 6, los ratones portadores del modelo de tumor de colon C26
se trataron con la composición de cisplatino ocluida en liposomas
de la presente invención, con cisplatino libre o con carboplatino
libre. El cisplatino libre se administró intravenosamente a la
dosis máximamente tolerada de cisplatino, 6 mg/kg una vez a la
semana durante 3 semanas. El carboplatino libre se administró a una
dosis equivalente clinicamente a cisplatino de 100 mg/kg,
administrado igualmente intravenosamente a la misma frecuencia. El
cisplatino ocluido en liposomas se administró intravenosamente a la
misma dosis y frecuencia que el cisplatino libre, 6 mg/kg una vez a
la semana durante 3
semanas.
semanas.
Los resultados se muestran en la Figura 5, en la
que el volumen del tumor en mm^{3} se muestra como una función de
días post-inoculación. El tratamiento de los grupos
de ensayo se inició cuando fue evidente una masa de tumor palpable
de aproximadamente 100 mm^{3}, aproximadamente al día 12. Tal
como se indica mediante triángulos sombreados a lo largo del eje de
las x, los grupos de ensayo se trataron los días 12, 19 y 26. El
tumor en los animales que recibieron solución salina
(\blacksquare) continuó desarrollándose. Los animales tratados
con cisplatino (
\arrowup) o con carboplatino libre (\bullet) mostraron una reducción similar en el desarrollo del tumor con relación a los animales no tratados. Los animales tratados con cisplatino ocluido en liposomas que tenían un recubrimiento de polietilenoglicol sobre las superficies interior y exterior de los liposomas (\arrowdown) mostraron una reducción significativa en el tamaño del tumor con relación a los animales tratados con el medicamento libre.
Se realizó otro estudio de acuerdo con el Ejemplo
6, en el que el cisplatino ocluido en liposomas se administró de
acuerdo con diferentes planificaciones de dosificación. Es decir, el
cisplatino ocluido en liposomas se administró con una dosis de
carga mayor seguido de dosis más pequeñas en las semanas segunda y
tercera. Los resultados se muestran en la Figura 6, en la que los
animales en ensayo que recibieron solución salina (\blacksquare)
y cisplatino libre (
\arrowup) a 6 mg/kg una vez a la semana durante 3 semanas mostraron un incremento continuado en la masa del tumor. Los animales tratados con cisplatino ocluido en liposomas habían disminuido significativamente las masas de tumores en comparación con los animales tratados con solución salina o cisplatino libre. La eficacia antitumor del cisplatino ocluido en liposomas fue similar para las planificaciones de dosificaciones de 6 mg/kg una vez a la semana durante 3 semanas (\bullet), una dosis inicial de 12 mg/kg con dosis posteriores de 4 mg/kg los días 19 y 26 (\blacklozenge) y una dosis inicial de 14 mg/kg con dosis posteriores de 4 mg/kg los días 19 y 26 (
\arrowdown).
Los ratones portadores del modelo de tumor de
carcinoma de pulmón de Lewis, se trataron con cisplatino,
administrado intravenosamente e intraperitonealmente, o con
cisplatino ocluido en liposomas, administrado de manera similar. Tal
como se describe en el Ejemplo 6, el tratamiento se inició cuando
se observó una masa de tumor de aproximadamente 100 mm^{3} en los
animales en ensayo, con tratamientos llevados a cabo los días 7, 14
y 21 después de la inoculación. Un grupo de control de ratones
portadores de tumores se trataron con solución salina.
Los resultados se muestran en la Figura 7, en la
que el volumen del tumor, en mm^{3}, se representa como una
función de días post-inoculación. El tratamiento se
indica mediante triángulos sombreados a lo largo del eje de las x
los días 7, 14 y 21. El tumor en ratones tratados con solución
salina (\blacksquare) se desarrolló de manera continua a lo largo
del período de ensayo. La respuesta en la masa del tumor a
cisplatino libre administrado intravenosamente (\blacklozenge) o
intraperitonealmente (\bullet) a una dosis de 6 mg/kg en los días
de tratamiento indicados, fue similar. El tratamiento con 12 mg/kg
de cisplatino ocluido en liposomas, administrado intravenosamente
(
\arrowup) o intraperitonealmente (
\arrowdown) en los días de tratamiento indicados, mostraba eficacia antitumor mejorada con relación a los animales tratados con cisplatino libre. La administración intravenosamente e intraperitonealmente fue de igual eficacia.
A partir de lo anterior, puede observarse la
forma en que se cumplen las diversas características y objetos de
la invención. La composición de liposomas de la presente invención
incluye liposomas que tienen un recubrimiento superficial interior
y un recubrimiento superficial exterior de cadenas de polímero
hidrófilo y un compuesto de cisplatino ocluido. Los estudios
realizados en apoyo de la invención, demuestran que el cisplatino
está ocluido de manera estable en los liposomas, tal como se pone en
evidencia mediante la retención de cisplatino y platino después de
incubación a varios tiempos a diversas temperaturas. El cisplatino
ocluido de manera estable en los liposomas ofrece las ventajas de
toxicidad reducida y de eficacia mejorada, con relación al
medicamento administrado en forma libre, ya que, después de su
administración, el medicamento permanece ocluido en el liposoma con
una pequeña fuga a la corriente sanguínea. El recubrimiento
superficial exterior de cadenas de PEG proporciona un tiempo de
vida de circulación en sangre largo, lo que permite a los liposomas
alcanzar un sitio diana, tal como un tumor.
Los ejemplos siguientes están destinados a
ilustrar, pero no a limitar, el alcance de la invención.
Materiales: El cisplatino se obtuvo de W.C.
Hereaus GmbH (Hanau, Alemania). El DSPE se adquirió de Avanti Polar
Lipids (Birmingham, AL) y el
metoxi-polietilenoglicol (mPEG), de 2000 daltons de
peso molecular, se obtuvo de Fluka Chemie AG (Buchs, Suiza). El
colesterol se obtuvo de Croda, Inc., (NY, NY). El HSPC fue fabricado
por Lipoid K.G. (Ludwigshafen Alemania) y el
mPEG-DSPE fue fabricado por Sygena, Inc., (Liestal,
Suiza).
Se preparó
2-o-metoxipolietileno glicol
1900-4,6-dicloro-1,3,5-riacina,
anteriormente denominado PEG activado, tal como se describe en J.
Biol. Chem., vol. 252, pág. 3582, (1977), con las siguientes
modificaciones.
Se disolvió cloruro cianúrico (5,5 g, 0,03 mol)
en 400 ml de benceno anhidro que contenía 10 g de carbonato sódico
anhidro, y se agregó PEG-1900 (19 g, 0,01 mol),
agitándose la mezcla durante una noche a temperatura ambiente. La
solución se filtró y se agregaron lentamente con agitación 600 ml
de éter de petróleo (intervalo de ebullición,
35-60ºC). El precipitado finamente dividido se
recogió sobre un filtro y se redisolvió en 400 ml de benceno. El
procedimiento de precipitación y filtración se repitió varias veces
hasta que el éter de petróleo estuvo libre de cloruro cianúrico tal
como se determinó mediante cromatografía líquida de alta presión
sobre una columna (250x3,2 mm) de 5 metros "LiChrosorb" (E.
Merck), revelada con hexano, y detectada con un detector
ultravioleta. La valoración del PEG-1900 activado
con nitrato de plata después de hidrólisis durante una noche en
tampón acuoso a pH 10,0, proporcionó un valor de 1,7 moles de
cloruro liberado/mol de PEG.
El análisis mediante TLC del producto se efectuó
con placas de TLC de fase inversa obtenidas de Baker usando
metanol/agua, 4:1 (v/v), como revelador y exposición a vapor de
yodo para visualización. Bajo estas condiciones, el metoxi
poliglicol 1900 de partida apareció a R_{f}= 0,54 a 0,60. El PEG
activado apareció a R_{f}= 0,41. El cloruro cianúrico sin
reaccionar apareció a R_{f}= 0,88 y fue separado.
El PEG activado se analizó para la determinación
del nitrógeno, aplicándose una corrección apropiada en la selección
de la cantidad de reactante a usar en las etapas de síntesis
posteriores. De acuerdo con ello, cuando el producto contenía
únicamente el 20% de la cantidad teórica de nitrógeno, la cantidad
de material usado en la siguiente etapa de síntesis se aumentó por
100/20, es decir, en 5 veces. Cuando el producto contenía el 50% de
la cantidad teórica de nitrógeno, únicamente fue necesario un
aumento por 100/50, es decir, en 2 veces.
En un tubo de ensayo con tapa de rosca, se
evaporaron 0.74 ml de una solución madre de 100 mg/ml (0,100 mol) de
fosfatidiletanolamina de huevo en cloroformo hasta sequedad bajo
una corriente de nitrógeno y se agregó al residuo del PEG activado
descrito en la sección A, en una cantidad como para proporcionar 205
mg (0,100 mol). A esta mezcla, se agregaron 5 ml de dimetil
formamida anhidra. A la mezcla, se agregaron 27 microlitros (0,200
mol) de trietilamina, desplazándose el aire con una corriente de
nitrógeno. La mezcla se calentó durante una noche en un baño de
arena mantenido a 110ºC.
A continuación, la mezcla se evaporó hasta
sequedad bajo vacío, obteniéndose una masa pastosa de sólido
cristalino. Este sólido se disolvió en 5 ml de una mezcla de 4
volúmenes de acetona y 1 volumen de ácido acético. La mezcla
resultante se colocó en la parte superior de una columna de
absorción cromatográfica de 21 mm x 240 mm empaquetada con gel de
sílice (Kieselgel 60 de Merck, malla 70-230), la
cual había sido previamente humedecida con un disolvente compuesto
de acetona/ácido acético, 80:20 (v/v).
La cromatografía de columna se reveló con la
misma mezcla disolvente, recolectándose partes alícuotas de
eluyente de 20 a 50 ml. Cada porción de eluyente se ensayó mediante
TLC sobre placas recubiertas con gel de sílice, usando
2-butanona/ácido acético/agua, 40:25:5, (v/v/v) como
revelador y exposición a vapor de yodo para visualización. Las
fracciones que contenían únicamente material de R_{f}=
aproximadamente a 0,79 se combinaron y evaporaron hasta sequedad
bajo vacío. El secado hasta peso constante bajo alto vacío,
proporcionó 86 mg (31,2 micromoles) de sólido casi incoloro
N-(4-cloro-poliglicol
1900)-1,3,5-triacinil
fosfatidiletanolamina de huevo conteniendo fósforo.
El compuesto sólido se recogió en 24 ml de
etanol/cloroformo, 50:50, y se centrifugó para separar el material
insoluble. La evaporación de la solución clarificada hasta sequedad
bajo vacío, proporcionó 21 mg (7,62 micromoles) de sólido
incoloro.
Se disolvieron 9,5 gramos (5 mmoles) de
polietileno glicol metil éter 1900 obtenido de Aldrich Chemical Co.
en 45 ml de benceno, el cual había sido secado sobre tamices
moleculares. Se agregaron 0,89 gramos (5,5 mmoles) de carbonil
diimidazol puro. La pureza se comprobó mediante un espectro de
infrarrojos. El aire en el recipiente de reacción se desplazó con
nitrógeno. El recipiente se cerró y se calentó en un baño de arena
a 75ºC durante 16 horas.
La mezcla de reacción se enfrió, formándose una
solución transparente a temperatura ambiente. La solución se diluyó
a 50,0 ml con benceno seco y se almacenó en un refrigerador en
forma de 100 micromol/ml de solución madre del carbamato de
imadazol de PEG éter 1900.
10,0 ml (1 mmol) de la solución de 100 mmol/ml de
solución madre del carbamato de imidazol de polietileno glicol metil
éter 1900 (compuesto X), se pipeteó dentro de un matraz de 10 ml
con forma de pera. El disolvente se eliminó bajo vacío. Se
agregaron 3,7 ml de una solución 100 mg/ml de fosfatidil etanolamina
de huevo (V) en cloroformo (0,5 mmol). El disolvente se eliminó
bajo vacío. Se agregaron 2 ml de
1,1,2,2-tetracloroetileno y 139 microlitros (1,0
mmol) de trietilamina (VI). El recipiente se cerró y se calentó en
un baño de arena mantenido a 95ºC durante 6 horas. Al cabo de este
tiempo, se realizó una cromatografía de capa fina con fracciones de
la mezcla anterior con el fin de determinar la extensión de
conjugación sobre placas de TLC recubiertas con SiO_{2}, usando
butanona/ácido acético/agua, 40:5:5, como revelador. La
visualización mediante vapor de yodo reveló que la mayor parte de
la fosfatidiletanolamina libre de R_{f}= 0,68 había reaccionado,
reemplazándose por un lípido que contenía fósforo a R_{f}= 0,78 a
0,80.
El disolvente procedente de la mezcla de reacción
remanente se evaporó bajo vacío. El residuo se recogió en 10 ml de
cloruro de metileno y se colocó sobre la parte superior de una
columna de absorción cromatográfica de 21 mm x 270 mm empaquetada
con Kieselgel 60 de Merck (gel de sílice de malla
70-230), la cual había sido previamente lavada con
cloruro de metileno. La mezcla se pasó a través de la columna,
usando los disolventes siguientes.
| ml | % en volumen de | % en volumen de metanol con |
| cloruro de metileno | 2% de ácido acético | |
| 100 | 100 | 0 |
| 200 | 95 | 5 |
| 200 | 90 | 10 |
| 200 | 85 | 15 |
| 200 | 60 | 40 |
Se recogieron porciones de 50 ml y cada porción
se ensayó mediante TLC sobre placas recubiertas con SiO_{2},
usando la absorción con vapor de I_{2} para visualización después
de revelado con cloroformo/metanol/agua/hidróxido amónico
concentrado, 130:70:8:0,5%, (v/v/v/v). La mayor parte de los
fosfatos se encontró en las fracciones 11, 12, 13 y 14.
Estas fracciones se combinaron, se evaporaron
hasta sequedad bajo vacío y se secaron en alto vacío hasta peso
constante. Proporcionaron 669 mg de una cera incolora de carbamato
de fosfatidiletanolamina de polietileno glicol metil éter. Esto
representó 263 micromoles y un rendimiento del 52,6% en base a la
fosfatidiletanolamina.
\newpage
Un espectro de NMR del producto disuelto en
deutero-cloroformo, mostró picos que correspondían
al espectro para PE de huevo, conjuntamente con un singlete fuerte
debido a los grupos metileno de la cadena de óxido de etileno a
Delta= 3,4 ppm. La relación de protones metileno procedentes del
óxido de metileno a los protones metilo terminales de los grupos PE
acilo, fue lo sduficientemente grande como para confirmar un peso
molecular de aproximadamente 2000 para la porción de óxido de
polietileno de la molécula del producto deseado de polietileno
glicol conjugado con carbamato de fosfatidiletanolamina, p. mol.
2,654.
A. Etapa 1
Se calentó agua estéril a 63-67ºC
en un recipiente a presión revestido con TEFLON y se agregó cloruro
sódico (0,9%). Se agregó cisplatino a una concentración de 8,5
mg/ml y se mezcló hasta disolución, aproximadamente
15-25 minutos.
B. Etapa 2
Se agregaron 257,0 g de PEG-DSPE,
719,4 g de HSPC y 308,4 g de colesterol (relación molar de
50,6:44,3:5,1) a 900 ml de etanol deshidratado a
60-65ºC y se mezcló hasta disolución,
aproximadamente 2 horas. Los lípidos disueltos se agregaron a 7670
g de solución de medicamento, obteniéndose una concentración de
lípidos total de aproximadamente 150 mg/ml.
C. Etapa 3
La solución de lípidos caliente se agregó
rápidamente a la solución de medicamento caliente
(63-67ºC), con mezclado, para formar una suspensión
de liposomas conteniendo tamaños uniformes. La suspensión se mezcló
durante una hora a 63-67ºC. La concentración de
cisplatino en la mezcla de hidratación fue de 7,2 mg/ml y, en esta
fase, aproximadamente el 30% del medicamento se encapsuló en los
liposomas. El 10% del volumen de solución total fue etanol y la
concentración de lípidos total fue de 150 mg de lípidos/ml.
D. Etapa 4
Los liposomas se dimensionaron al diámetro de
partícula promedio deseado mediante extrusión controlada a través
de cartuchos de filtro de policarbonato alojados en recipientes de
acero inoxidable revestidos con TEFLON. La suspensión de liposomas
se mantuvo a 63-65ºC durante el procedimiento de
extrusión, un período de 6-8 horas.
E. Etapa 5
Después del dimensionado, la suspensión de
liposomas se enfrió a temperatura ambiente (20-35ºC)
y se filtró a través de un filtro de 142 mm Versapor de Gelman de
1,2 \mum (polímero acrílico sobre un soporte de Nilón 66), para
separar el medicamento precipitado. En esta fase, se encapsuló
aproximadamente el 50% del medicamento.
F. Etapa 6
Se preparó una solución de sacarosa/cloruro
sódico, disolviendo sacarosa (100 mg/ml) y cloruro sódico (0,058
mg/ml) en agua estéril. El pH de la solución se ajustó
aproximadamente a 5,5 con HCl o NaOH 2 N. La solución se filtró a
través de un filtro Durapore de 0,22 \mum.
La suspensión de liposomas se diluyó en una
relación aproximada de 1:1 (v/v) con la solución de
sacarosa/cloruro sódico y se diafiltró a través de un ultrafiltro
de fibra hueca de polisulfona. Se realizaron ocho intercambios de
volumen contra la solución de sacarosa/cloruro sódico para eliminar
el etanol y el medicamento no encapsulado. La temperatura del
flúido del procedimiento se mantuvo aproximadamente a
20-30ºC. El tiempo de diafiltración total fue de
aproximadamente 4,5 horas.
A continuación, la suspensión de liposomas se
concentró hasta aproximadamente 1,2 mg de cisplatino/ml mediante
ultrafiltración. El flúido del procedimiento de
post-diafiltración se analizó para determinar el
contenido de cisplatino mediante HPLC. Los liposomas tenían una
fase interna de 8,5 mg/ml de cisplatino en coloruro sódico al 0,9%
y una fase externa de solución de sacarosa/cloruro sódico.
G. Etapa 7
Se preparó un diluyente disolviendo histidina (10
mM) en una solución de sacarosa/cloruro sódico (sacarosa al
10%/NaCl 1 mM) hasta una concentración de histidina diana de 1,55
mg/ml en la mezcla final. La suspensión de liposomas se diluyó
hasta una concentración de cisplatino diana de 1,05 mg/ml con el
diluyente de histidina. El pH de la suspensión se ajustó a 6,5 con
NaOH o HCl 2 N.
H. Etapa 8
La suspensión de liposomas se calentó a
33-38ºC y se filtró a través de un filtro de
poliétersulfona Supor de Gelman de 0,2 \mum. El tiempo de
filtración total fue de aproximadamente 10 minutos.
Se preparó una suspensión de liposomas que
contenían cisplatino tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. Se
introdujeron partes alícuotas de 5 ml de la suspensión de liposomas
en viales de vidrio de 10 cm^{3}, se sellaron bajo condiciones
asépticas y se introdujeron en incubadoras o refrigeradores a las
temperaturas siguientes: - 40ºC, -20ºC, 2-8ºC, 30ºC,
40ºC. A intervalos, se extrajeron muestras de cada vial almacenado
a cada temperatura y se ensayaron por triplicado para:
1. Determinar la concentración de cisplatino: La
concentración de cisplatino se midió rompiendo la bicapa del
liposoma con un diluyente orgánico para liberar el cisplatino
ocluido y, a continuación, determinación de la concentración de
cisplatino mediante cromatografía líquida de alta presión
(HPLC);
2. Determinar la concentración de platino, medida
mediante absorción atómica;
3. Determinar el por ciento de platino
encapsulado: El por ciento de platino encapsulado se determinó
separando los liposomas del cisplatino no encapsulado mediante
cromatografía de exclusión por tamaños y ensayando las fracciones
liposómica y de medicamento para determinar el contenido de platino
mediante absorción atómica;
4. Determinar el tamaño del liposoma, determinado
mediante difusión de luz dinámica; y
5. Determinar el pH de la suspensión de
liposomas.
En la Tabla 1 se muestran los resultados.
Se prepararon liposomas que contenían cisplatino
sin recubrimiento superficial interior ni exterior de cadenas de
polímero hidrofílico para comparación con los liposomas de la
presente invención. Los liposomas comparativos se prepararon tal
como se ha descrito en el Ejemplo 3, excepto que el diestearil
fosfatidilglicerol (DSPG) se substituyó por el derivado
PEG-DSPE, p. ej., la composición del liposoma estaba
formada por HSPC/Col/DSPG en una relación molar de
50,6/44,3/5,1.
La estabilidad de la composición de liposomas
comparativa y de la composición de liposomas de la presente
invención, se compararon diluyendo las muestras de liposomas con
solución salina (1:1, v/v) e incubando las suspensiones durante 6
horas a 60ºC. Después de la incubación, las muestras se ensayaron
para determinar la concentración de cisplatino, el % de
encapsulación de platino, el tamaño del liposoma y el pH, de
acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 4. En la
Tabla 2 se resumen los resultados.
Las composiciones de liposomas se diluyeron hasta
una concentración de cisplatino de 1 mg/ml con el diluyente de
histidina/cloruro sódico descrito en el Ejemplo 3G. Las
suspensiones de liposomas se incubaron a 40ºC durante 2 semanas,
después de lo cual se midieron la concentración de cisplatino, el %
de encapsulación de platino, el tamaño del liposoma y el pH.
Se prepararon liposomas que contenían cisplatino
ocluido tal como se ha descrito en el Ejemplo 3, compuestos de
HSPC, colesterol y mPEG-DSPE en una relación molar
de 50,6:44,3:5:1. El contenido en lípidos total fue de
aproximadamente 71 mg/ml y la concentración de cisplatino fue de 1
mg/ml.
El modelo de tumor de colon C26 se desarrolló en
ratones macho Balb/c (Simonson Laboratories, Inc., Gilroy, CA). Los
tumores se recolectaron de los ratones donantes y se cortaron
finamente en medio RPMI con suero bovino fetal al 10% (FCS). A
continuación, los tumores se digerieron con una mezcla de enzima (10
ml de proteasa tipo IX al 0,25% y colagenasa tipo IV al 0,25% en
solución salina compensada de Hank (HBSS) y 0,2 ml de DNasa al
0,02% en HBSS) durante 30-60 minutos a 37ºC. La
suspensión de células individuales de células de tumor se lavaron
dos veces en medio RPMI con FCS, se concentraron mediante
centrifugación y se resuspendieron en medio RPMI con FCS para
inoculación. Se inocularon un millón de células de tumor (0,1 ml) en
el costado izquierdo de ratones de 5-6 semanas de
edad.
Durante todos los experimentos, los animales se
mantuvieron en ciclos de 12 horas de luz:12 horas de oscuridad,
alimentados sin limitación con comida para roedores y agua.
Los ratones portadores de tumores se dividieron
en grupos de n=9 para tratamiento con cisplatino ocluido en
liposomas, cisplatino libre (Platinol- AQ^{R}, Bristol
Laboratories, Princeton, NJ) o carboplatino libre (Paraplatin^{R},
Bristol Laboratories), de acuerdo con el regimen de tratamiento
mostrado en la Tabla 5.
El cisplatino libre y el cisplatino ocluido en
liposomas se administraron intravenosamente a una dosis de 6 mg/kg
semanalmente durante 3 semanas. El carboplatino se administró
intravenosamente a una dosis de 100 mg/kg semanalmente durante 3
semanas. El grupo de control de ratones (n=5) recibió 0,1 ml de
solución salina intravenosamente semanalmente durante 3 semanas. Los
resultados se muestran en la Figura 5.
Los ratones se inocularon con las células de
tumor de colon C26 de acuerdo con el procedimiento anteriormente
descrito. El tratamiento de los ratones portadores de tumores se
inició cuando la mayoría de los animales tenían masas de tumores
palpables de aproximadamente 100 mm^{3}. Los ratones se trataron
con cisplatino ocluido en liposomas o con cisplatino libre una vez
por semana durante 3 semanas, de acuerdo con el regimen mostrado en
la Tabla 6.
- ^{1} Dosis de carga inicial seguida de 2 dosis más pequeñas.
El cisplatino libre se administró
intravenosamente a una dosis de 6 mg/kg una vez por semana durante
3 semanas a ratones portadores de tumor (n=9). El cisplatino
ocluido en liposomas, preparado tal como se ha descrito
anteriormente, se administró intravenosamente de acuerdo con
planificaciones de tres dosificaciones a ratones portadores de
tumor. Un grupo (n=9) recibió 6 mg/kg de cisplatino ocluido en
liposomas una vez por semana durante 3 semanas; otro grupo (n=9),
recibió una primera dosis de 14 mg/kg, seguido de dosis posteriores
en las semanas 2 y 3 de 4 mg/kg; otro grupo (n=9), recibió una
primera dosis de 12 mg/kg, seguido de 4 mg/kg en las semanas 2 y 3
del estudio. El grupo de control (n=5), recibió solución salina
cada día del tratamiento. Los resultados se muestran en la Figura
6.
El modelo de tumor de pulmón de Lewis (LL/2,
CRL-1642, ATCC, Rockville, MD), se desarrolló en
ratones macho G6C-F1 (Simonson Laboratories, Inc.,
Gilroy, CA). Los tumores se recolectaron a partir de ratones
donantes y se trataron tal como se ha indicado anteriormente para
inoculación de un experimento. Se inocularon un millón de células
de tumor (0,1 ml) en el costado izquierdo de ratones machos
B6C3-F1 de 5-6 semanas de edad.
El tratamiento de los ratones portadores de
tumores se inició siete días después de la inoculación, cuando la
mayoría de los animales tenían masas de tumores palpables. Los
animales se trataron de acuerdo con el regimen mostrado en la Tabla
7.
El grupo de control (n=9) recibió solución salina
los días de tratamiento (días 7, 14 y 21). Dos grupos de animales
recibieron cisplatino libre a 6 mg/kg cada día de tratamiento; en un
grupo (n=9), el cisplatino libre se administró intravenosamente, en
el otro grupo (n=9) el medicamento se administró
intraperitonealmente. Los dos grupos recibieron cisplatino ocluido
en liposomas a 12 mg/kg cada día de tratamiento; un grupo (n=7)
recibió la dosis intravenosamente, el otro grupo (n=9) recibió la
dosis intraperitonealmente. Los resultados se muestran en la Figura
7.
Claims (14)
1. Una composición liposómica que contiene un
compuesto de cisplatino ocluido, que comprende liposomas que tienen
una superficie exterior y una superficie interior que definen un
compartimento de liposoma acuoso, y que están compuestos de un
lípido formador de vesículas y entre 1-20 moles por
ciento de un lípido formador de vesículas derivado con un polímero
hidrófilo, estando formados dichos liposomas de manera tal que el
polímero hidrófilo forma un recubrimiento de cadenas de polímero
hidrófilo sobre ambas superficies interior y exterior, y estando el
compuesto de cisplatino ocluido en dichos liposomas.
2. La composición de la Reivindicación 1, en la
que dichas cadenas de polímero hidrófilo están compuestas de un
polímero hidrófilo seleccionado entre el grupo constituido por
polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina,
polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina,
polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida,
polidimetilacrilamida, polihidroxipropilmetacrilato,
polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa,
polietilenoglicol, y poliaspartamida.
3. La composición de la Reivindicación 2, en la
que dichas cadenas de polímero hidrófilo están compuestas de
polietilenoglicol.
4. La composición de la Reivindicación 1, en la
que dichos liposomas tienen tamaños entre 80-160
nm.
5. La composición de la Reivindicación 1, en la
que dicho lípido formador de vesículas es fosfatidilcolina de soja
hidrogenada y dicho lípido formador de vesículas derivado es
diestearil fosfatidiletanolamina derivada con polietilenoglicol.
6. La composición de la Reivindicación 1, en la
que dicho compuesto de cisplatino es cisplatino o un análogo de
cisplatino seleccionado entre el grupo constituido por carboplatino,
ormaplatino, oxaliplatino, DW A2114R, zeninplatino, enloplatino,
lobaplatino, CI-973, 254-S y
JM-216.
7. La composición de la Reivindicación 6, en la
que dicho compuesto de cisplatino es cisplatino.
8. La composición de la Reivindicación 7, en la
que dicho compuesto de cisplatino está ocluido en una relación de
medicamento a lípido de entre 10 a 20 \mug/mg de lípido
total.
9. La composición de la Reivindicación 1, en la
que dichos liposomas están suspendidos en un medio acuoso en una
concentración de lípido en el liposoma entre 50-200
mg/ml, y la composición se caracteriza por un por ciento de
platino encapsulado por encima de aproximadamente 90% cuando se
almacena a 60ºC durante un período de 6 horas.
10. Un procedimiento para la oclusión de un
compuesto de cisplatino en liposomas, que comprende:
el calentamiento de una solución acuosa de un
compuesto de cisplatino a una temperatura suficiente como para
aumentar su solubilidad sobre la solubilidad del compuesto a
temperatura ambiente;
la adición a la solución caliente de un lípido
formador de vesículas y entre 1-20 moles por ciento
de un lípido formador de vesículas derivado con un polímero
hidrófilo; y
mediante dicha adición, la formación de liposomas
que tienen un recubrimiento superficial interior y un recubrimiento
superficial exterior de dicho polímero hidrófilo y estando dicho
compuesto de cisplatino ocluido en dichos liposomas.
11. El procedimiento de la Reivindicación 10, en
el que dicho calentamiento incluye el calentamiento de cisplatino
natural a una temperatura suficiente como para lograr un aumento al
doble la solubilidad de cisplatino sobre su solubilidad a
temperatura ambiente.
12. El procedimiento de la Reivindicación 11, en
el que dicha adición incluye la adición de una solución de lípidos
formadores de vesículas calentada hasta dentro de aproximadamente
10ºC de la temperatura de la solución de cisplatino.
13. El procedimiento de la Reivindicación 11, en
el que dicha adición incluye la adición de una solución que contiene
un lípido formador de vesículas que tiene una temperatura de
transición de fase dentro de aproximadamente 10ºC de la temperatura
a la cual se ha calentado la solución que contiene el compuesto de
cisplatino.
\newpage
14. El procedimiento de la Reivindicación 10, en
el que dicha adición incluye la adición de una solución que contiene
un lípido formador de vesículas que tiene una temperatura de
transición de fase comprendida entre 40-70ºC.
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