ES2206509T3 - Biomatriz para la regeneracion de tejidos. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN IMPLANTE (1) PARA REPARAR UN DEFECTO DE UN TEJIDO, EL IMPLANTE (1) COMPRENDE UN MATERIAL EN FORMA DE HEBRA O SUTURA (2) Y UNA MATRIZ DE GEL (4) QUE CONTIENE CELULAS REPARADORAS (6) QUE SE HAN DISPUESTO ALREDEDOR DE UNA PARTE CENTRAL (8) DE LA SUTURA (2). LA SUTURA (2) TIENE EXTREMOS LIBRES (10 Y 12) QUE SE UTILIZAN PARA VOLVER A UNIR EL TEJIDO ADYACENTE AL DEFECTO. LOS EXTREMOS LIBRES (10 Y 12) PUEDE COSERSE DENTRO DEL CUERPO DEL TEJIDO SUJETANDO DE ESTA FORMA LOS EXTREMOS DEL TENDON EN SU SITIO Y SUJETANDO TAMBIEN LA MATRIZ DE GEL (4) EN LA POSICION DEL DEFECTO.

Description

Biomatriz para la regeneración de tejidos.

En el contexto de la reparación de tejido esquelético, la terapia de regeneración de tejido es la aplicación local de células autólogas (derivadas del huésped) para fomentar la reconstrucción de los defectos del tejido causados por trauma, enfermedad o intervenciones quirúrgicas. El objetivo del enfoque de la terapia de regeneración del tejido es entregar altas densidades de células competentes en la reparación (o células que pueden volverse competentes cuando son influidas por el entorno local) al sitio del defecto en un formato que optimiza tanto la mecánica de la herida inicial como la producción eventual de neotejido. Para la reparación de tejido blando, es probable que se necesite uno o más vehículos de implante para 1) transportar y constreñir las células autólogas en el sitio del defecto y 2) proporcionar estabilidad mecánica inicial al sitio quirúrgico. En un sistema óptimo es probable que el vehículo se degrade lentamente a una tasa comparable con la producción de neotejido y el desarrollo de resistencia en el tejido reparador (1).

El enfoque de la terapia de regeneración del tejido contrasta de manera significativa con los enfoques más pasivos para reparar heridas en los que no se intenta entregar ni reclutar células reparadoras en el sitio del defecto. Por ejemplo, en el caso de la reparación del ligamento cruzado anterior (ACL) con injertos polímeros sintéticos (presumiblemente "inertes"), el proceso de curación depende totalmente de las respuestas celulares locales para iniciar y controlar la incorporación de un implante permanente (2).

Recientemente, se ha ensayado dispositivos más activos usando andamios de matriz diseñados para entregar y/o dirigir procesos celulares. Estos últimos han influido, por ejemplo, la reparación del tendón o ACL (3-7), reparación del menisco (8-11) y reparación del cartílago articular (12-15). Alternativamente, se ha estudiado también el uso de factores peptídicos administrados localmente, destinados a estimular el reclutamiento de células reparadoras y su fijación y/o diferenciación (16-19).

En los, probablemente, mejor documentados experimentos actuales de reparación del tendón, Silver, Dunn y sus colegas, han descrito investigaciones extensivas del rendimiento de las prótesis de fibra de colágeno para la reparación del tendón de Aquiles (3-5) y ligamento cruzado anterior (ACL) (6,7) en conejos. Informan de que a las 52 semanas después del implante en el defecto del tendón de Aquiles, el tendón reconstruido (prótesis + tejido de reparación) era aproximadamente un 66% tan resistente como el tejido normal de todos los implantes ensayados, incluido un injerto de tendón autólogo y composites de fibra de colágeno reticulados con glutaraldehido o carbodiimida (5). Se observó que tanto los implantes autólogos como las prótesis reticuladas con carbodiimida se biodegradaban rápidamente, recuperando entonces rápidamente resistencia al producirse nuevo tejido. Las prótesis reticuladas con glutaraldehido se biodegradaron mucho más lentamente en el modelo de tendón de Aquiles y quedaron rodeadas con una gruesa cápsula que finalmente interrumpió el proceso de degradación. Aunque el neotendón desarrollado en estos estudios fue similar al normal, no era idéntico. Por ejemplo, el ángulo de engarce del colágeno del neotendón era similar al tendón normal en todos los implantes, pero la longitud del engarce de neotendón era menor que aproximadamente el 30% del normal para los dispositivos protésicos de colágeno. Además, los módulos de los neotendones formados a partir de los implantes de degradación más rápida (tendón autólogo y fibras de colágeno reticuladas con carbodiimida) eran notablemente menores que para el tendón normal. Finalmente, el neotendón observado no se ensambló con la microarquitectura fascicular del tendón normal. Estos investigadores llegaron a la conclusión de que la tasa de degradación de la prótesis, y la consiguiente transferencia de carga al nuevo tejido, puede ser tan importante como la resistencia a la tracción inicial de la prótesis para determinar las propiedades finales del tejido de reparación (5). Se observó una generación similar de neoligamento en los implantes ACL al cabo de 20 semanas, aunque la recuperación de resistencia del tejido puede ser algo más lenta en el entorno sinovial avascular (7).

Basado en esta evidencia, está claro que por lo menos en el animal sano, se puede reclutar células competentes en la reparación a partir de los tejidos que rodean a defectos en tendones y ligamentos, y que estas células iniciaran la producción de neotejido. Estos investigadores no aclaran bien en qué grado las células reclutadas representaron fenotipos diferenciados (por ejemplo, fibroblastos del tendón), en oposición a las células cepa pluripotentes no diferenciadas, ni si números incrementados de tales células mejorarían la tasa de síntesis o la microarquitectura y las propiedades mecánicas del neotejido producido.

Muchos procesos mediados por células que están relacionados con la producción de tejido esquelético dependen del número de células implicadas, tanto en la tasa como en la magnitud del efecto. Por ejemplo, en la producción in vitro de tejido conectivo, la tasa de contracción del gel de colágeno por fibroblastos embebidos en el gel es dependiente del número de células presentes en el cultivo (20). Una actividad de contracción de gel similar ha sido también correlacionada con la secreción dependiente de la densidad celular de un factor de promoción de contracción por células endoteliales (21). Además, el grado de orientación de los fibroblastos en cultivos realizados con geles de colágeno está directamente relacionado con la densidad celular inicial (22). Este efecto de orientación celular ha sido correlacionado con la observación de "centros de organización" en el cultivo, cuyo número se ha sugerido que es un indicador directo de la capacidad morfogenética a los niveles molecular y celular (23).

La diferenciación dependiente de la densidad celular fue demostrada claramente en el cultivo de células de yema de la pata del pollito (24). Cuando se cultivó a una densidad muy baja (10^{6} células/platillo 35 mm), estas células no presentan propiedades condrogénicas ni osteogénicas. A densidades "intermedias" de cultivo celular (2 x 10^{6} células/platillo 35 mm), las células presentaron la máxima frecuencia de osteogénesis, mientras que a una densidad todavía más alta (5 x 10^{6} células) se observó la máxima frecuencia de fenotipo condrocitos.

En cada caso citado anteriormente, el número de células inicialmente presente influye fuertemente en la naturaleza de los procesos mediados por células que están implicados en la formación del tejido esquelético, y la tasa a la que ocurren estos procesos de desarrollo y fisiológicos. Por consiguiente, en los procesos reparadores de los tejidos esqueléticos, Caplan y colaboradores han planteado la hipótesis de que puede requerirse cierto umbral mínimo de número celular en el sitio de reparación antes de que pueda tener lugar la formación de neotejido "normal" (25). Igualmente, en muchos casos, este umbral mínimo puede rebasar el número de células reparadoras reclutables, incluyendo menos células comprometidas que pueden diferenciar para reparar fenotipos competentes; por lo tanto, el grado al que puede ocurrir el proceso reparador puede limitarse por este único parámetro.

Recientemente se han llevado a cabo investigaciones preliminares del enfoque de la terapia de regeneración de tejidos en un modelo de reparación de tendón en el tendón de Aquiles del conejo (25). Había tres componentes en este modelo: el defecto, las células y el vehículo para entregar las células al sitio del defecto. El vehículo de entrega en este modelo debe retener las células en el sitio del defecto, estabilizar la mecánica del tejido, y luego biodegradarse lentamente a medida que se produce el tejido nuevo.

US 5.061.283 describe un dispositivo apropiado para usar en la reparación de un tendón lacerado o seccionado, particularmente, un tendón flexor de la mano, que tiene un cuerpo de banda plana con extremos opuestos del cuerpo destinados a anclar suturas de conexión. Dicho dispositivo comprende una porción de cuerpo alargada que tiene una estructura de banda plana, estando adaptada la porción de cuerpo en extremos opuestos para conectarse a por lo menos una sutura portadora de aguja. El cuerpo del dispositivo y la sutura o suturas asociadas pueden cubrirse con uno o más recubrimientos de gel tales como, por ejemplo, alginato cálcico. Para reparar un tendón seccionado usando el dispositivo de acuerdo con US 5.061.283 se han formado incisiones en cada extremo del tendón seccionado, cuyas incisiones sirven para recibir parte del dispositivo, respectivamente, que se sujeta entonces mediante suturación del dispositivo en el tendón. US 5.061.283 no menciona células vivas como parte de/o para producir el dispositivo descrito.

US 5.226.914 en general describe varios procesos y dispositivos para utilizar células mesenquimales derivadas de médula aisladas y expandidas por cultivo (células cepa mesenquimales) para tratar trastornos esqueléticos y otros trastornos del tejido conectivo. Se expone en dicho documento que las células cepa mesenquimales antes mencionadas puede incluirse bajo ciertas condiciones para diferenciarse en tipos diferentes de tejido conectivo deseado tales como células formadoras del hueso o cartílago. Los factores que inducen diferenciación de las células mesenquimales derivadas de la médula y expandidas por cultivo son reputados como estímulos mecánicos, celulares y bioquímicos. Sin embargo, la única diferenciación de células cepa mesenquimales descritas en US 5.266.914 es la diferenciación al hueso que ocurrió en cerámicas porosas de fosfato cálcico sin formación de cartílago.

La presente invención se refiere a un implante para reparar un defecto del tejido como se ha especificado en la reivindicación 1.

Aunque un material preferido para la matriz de gel empleada como en la reivindicación 1 se compone de fibrillas de colágeno tipo I purificado, otros materiales que se puede usar igualmente incluyen, por ejemplo, 1) geles de colágeno contraidos por las células que contienen otros componentes de la matriz extracelular, tales como proteoglicanos o glicosaminoglicanos, glicoproteinas (fibronectina, laminina, etc), otros colágenos (por ejemplo los tipos II o IV), elastina y/o factores de crecimiento de péptidos bioactivos o citoquinas; 2) otros biopolímeros tales como fibrina; 3) fibras sintéticas biodegradables fabricadas a partir de polímeros tales como ácidos polilácticos o poliglicólicos, policaprolactonas, o poliaminoácidos, o sus copolímeros, que pudieran colarse o arrollarse en/o sobre la sutura; o 4) estructuras compuestas tales como estructuras de colágeno/ácido poliláctico.

Además de las suturas sencillas de filamento simple, se puede usar también dispositivos multifilamentos producidos por trenzado, tisaje o tricotaje de materiales fibrosos biodegradables incluidas las suturas o fibras de colágeno o similares. Las células podrían fijarse en general a tales dispositivos por procesos mediados por células tales como la contracción de geles de colágeno, o por procesos físicos o químicos no mediados por células tales como la gelatina de colada de gel, o un arrollamiento de estructuras fibrosas o membranosas que contienen células alrededor del dispositivo. Tales dispositivos de implante podrían tener una o más agujas unidas a cada extremo del dispositivo para facilitar la fijación a tejidos blandos o duros, y podrían ser de una variedad de geometrías incluida la construcción planar, cilíndrica o tubular, dependiendo del tejido específico a reparar, el modo de fijación del implante y/o el método usado para unir la combinación de biomatriz que contiene células al dispositivo de implantación.

La presente invención se refiere a un implante para usar en un método para la implantación de cualquier tipo de células que efectúen la reparación del tejido. Aunque la invención no se limita a ningún tipo de célula particular, una realización particularmente preferida incluye células cepa mesenquimales humanas (MSCs), o cualquiera de su progenie comprometida o diferenciada. Las células se obtienen preferiblemente del material al que está destinado el implante, y pueden ser expandidas por cultivo preferiblemente antes del implante. El animal es preferiblemente un ser humano.

Métodos han demostrado el cultivo de MSCs o fibroblastos de tendón sobre suturas Dexon de dos agujas haciendo que las células contraigan los geles de colágeno alrededor de la región central de las suturas. El dispositivo compuesto de célula autóloga/gel de colágeno/sutura puede implantarse directamente entre los extremos libres de defectos del tendón de espesor total, tal como para reparar el tendón de Aquiles humano, ligamento tal como para reparar el ligamento cruzado anterior, o cartílago tal como para reparar el cartílago articular, menisco, o el disco de la articulación temporomandibular.

En la realización mostrada en la figura 1, el implante 1 comprende un cordón de material de sutura 2 y una matriz de gel 4 conteniendo células reparadoras 6 y que ha sido contraído alrededor de la porción central 8 de la sutura 2. La sutura 2 tiene extremos libres 10 y 12 que se usan para reunir el tejido T adyacente al defecto. Como se muestra, los extremos libres 10 y 12 han sido cosidos en el cuerpo del tejido manteniendo no solamente los extremos del tendón en su sitio sino manteniendo también la matriz de gel 4 en posición en el defecto.

La figura 2 muestra un conjunto de molde 15 que se puede usar para formar un implante de la invención. El conjunto de molde 15 incluye el molde 16 en el que se ha formado la matriz de gel que contiene células alrededor de la sutura 2 que se muestra aquí con agujas 3 y 5 en sus extremos. El alambre de tensión 18 que mantienen la sutura 2 bajo tensión en el molde 16 y el platillo de incubación 20 en el que se incuba la preparación de matriz para fraguar el gel. Una realización específica de esto es descrita en el ejemplo que sigue.

Ejemplo 1

Se usó un conjunto de molde para preparar un implante destinado a reparar un defecto del tejido de acuerdo con la invención. Pequeños cilindros de vidrio, 5 mm x 27 mm, cuyos extremos habían sido cerrados por fusión, fueron cortados longitudinalmente a través del centro para formar moldes de vidrio en forma de canoa. Se curvaron alambres quirúrgicos rígidos para formar pequeños alambres de tensión en forma de arcos con sus extremos conformados para disponerse justamente a 2 mm de profundidad dentro de los moldes de vidrio. El molde de vidrio fue colocado dentro de un platillo de cultivo de 100 mm con una sutura extendiéndose sobre el alambre de tensión situado en el centro del molde como preparación para la suspensión de gel a verter.

Se suspendieron células cepa mesenquimales autólogas (4 x 10^{6} células) en 0,5 ml de 2 X DMEM-LG y se mezclaron perfectamente para crear una suspensión de una sola célula. Después se añadieron 0,5 ml de solución de colágeno tipo I esterilizado (Pancogene S^{TM}, Gattefossé SA, Lyon, Francia; 3 mg/ml; dializada en 0,001M HCl a la suspensión de células y se pipetaron arriba y abajo para formar una suspensión homogénea de células en el gel. Esta suspensión de gel fue vertida inmediatamente dentro del molde de vidrio preparado en el platillo de cultivo. Se colocó la tapa sobre el platillo y se puso en la incubadora a 37ºC durante 15-20 minutos para fraguar el gel. Después de completar la gelación, se inundó el platillo con agente sin suero hasta que se cubrió el molde de vidrio y se volvió a poner en la incubadora durante 4-6 horas. La contracción del gel por las células se produjo hasta el punto de que el gel se despegó de las paredes del molde y disminuyó en diámetro y longitud un 10% aproximadamente. Si se cultiva las células en este aparato durante 20 horas aproximadamente el gel se contrae aproximadamente al 60% de su dimensión radial original. Al cabo de 4 horas, el gel estaba firmemente unido a la sutura central, hasta el punto de que la sutura y el muelle de tensión podían elevarse del agente, retirando el muelle de tensión, e implantando el gel en el defecto quirúrgico como se ha descrito.

Los dispositivos de reparación del tejido preparados por este procedimiento fueron implantados en el defecto modelo del tendón de Aquiles del conejo con o sin una funda de Vicrilo. Observaciones histológicas de estos implantes al cabo de 1, 3 y 8 semanas, indican que por este procedimiento se formaron tejidos de neotendón ya en 1-3 semanas. Estos tejidos precoces de neotendón son morfológicamente similares a los tejidos producidos a partir de célula del tendón o implante MSC en el modelo de reparación de funda de Vicrilo en tiempos posteriores.

Literatura citada

1. Goodship AE and Cooke P. Bicompatibility of tendon and ligament prostheses. Critical Reviews in Biocompatibility 1986; 2(4): 303-334.

2. Bonnarens F.O. and Drez, D., Jr. Biomechanics of artificial ligaments and associated problems. In: Jackson DW, Drez Jr. D, Eds. The anterior cruciate deficient knee: New concepts in ligament Repair,St. Louis: C.V. Mosby Co., 1987; 239-253.

3. Goldstein JD, Tria AJ, Zawadshy JP, Kato YP, Christiansen D, Silver FH. Development of a Reconstituted Collagen Tendon Prosthesis: A preliminary study. J Bone Jt Surig 1989; 71 A(8):1183-1191.

4. Hsu SYC, Cheng JCY, Chong YW, Leung PC. GIutaraldehyde-treated bioprosthetic substitute for rabbit Achilles tendon. Biomaterials 1989; 10: 258-264.

5. Kato YP, Dunn MG, Zawadsky JP, Tria AJ, Silver FH. Regeneration of Achilles tendon with a collagen tendon Prosthesis: Results of a one-year implantation study. J Bone Jt Surg 1991; 73A:561-574.

6. Kato YP, Dunn MG, Tria AJ, Zawadsky JP, Silver FH. Preliminary assessment of a collagen fiber ACL prosthesis. Proceedings ofthe 17th Annual Meeting of the Society for Biomaterials, Abstract 265, Scottsdale Arizona 1991.

7. Dunn MG, Tria AJ, Kato YP, Bechler JR, Ochner RS, Zawadsky JP and Silver FH. Anterior cruciate ligament reconstruction using a composite collagenous prosthesis. A biomechanical and histologic study in rabbits. Am. J. Sports Med. 1991; 20: 507-515.

8. Klompmaker J, Jansen HWB, Veth RPH, de Groot JH, Nijenhuis AJ, Pennings AJ. Porous polymer implantfor repair of meniscal lesions: A preliminarystudy in dogs. Biomaterials 1991; 12:810-816.

9. Henning CE, Lynch MA, Yearout KM, Vequist SW, Stallbaumer RJ, Decker KA. Arthroscopic meniscal repair using an exogenous fibrin clot. Clin Ortho 1990;252:64-72.

10. Wood DJ, Minns RJ, Strover A. Replacement of the rabbit medial meniscus with a polyester-carbon fibre bioprosthesis. Biomateriais 1990; 11: 13-16.

11. Stone KR, Rodkey WG, Webber RJ, McKinney L, Steadman JR. Collagen-based prostheses for meniscal regeneration. Clin Ortho 1990;252: 129-135.

12. Grande DA, Pitman MI, Peterson L, Menche 0, Klein M. The repair of experimentally produced defects in rabbit articular cartilage by autologous chondrocyte transplantation. J Ortho Res 1989; 7: 208-218.

13. Grande DA. Technique for healing lesions in cartilage. U.S. Patent Number 4,846,835, July 11, 1989,

14. von Schroeder HP, Kwan M, Amiel D, Coutts RD. The use of polylactic acid matrix and periosteal grafts for the reconstruction of rabbit knee articular defects. J Biomed Mat Res 1991; 25:329-339.

15. Wakitani S, Kimura T Hirooka A, et al. Repair of rabbit articular surfaces with allograft chondrocytes embedded in collagen gel. J Bone Joint Surg 1989; 71-B:74-80.

16. Wang EA, Rosen V, D'Alessandro JS, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation. Biochem 1990; 87:220-224.

17. Syftestad GT Lucas PA, Ohgushi H, Gaplan Al. Chondrogenesis as an in vitro responseto bioactive factors extracted from adult bone and nonskeletal 30 tissues. In: Thomhill T SennA, eds. Development and diseases of cartilage and bone matrix.,UCLA Symposium Volume, New York: Alan Liss, Inc., 1987; 187-199.

18. Syftestad GT Lucas PA, Caplan Al. The in vitro chondrogenic response of limb bud mesenchyme to a water-soluble fraction prepared from demineralized bone matrix. Differentiation 1985; 29:
230-23

19. Lucas PA, Syftestad GT Caplan Al. A watersoluble fraction from adult bone stimulates the differentiation of cartilage in explants of embryonic muscle. Differentiation 1988; 37:47-52.

20. Bell E, Ivarsson B, Merrill C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76(3): 1274-1278

21. Guidry C, Hohn S, Hook M. Endothelial cells secrete a factor that promotes fibroblast contraction of hydrated collagen gels. J Cell Biol 1990;110: 519-528.

22. Klebe RJ, Caldwell H, Milam S. Cells transmit spatial information by orienting collagen fibers. Matrix 1989; 9;451-458.

23. Klebe RJ, Overfelt TM, Magnuson Vi-, Steffensen B, Chen D, Zardeneta G. Quantítative assay formorphogenesis indicates the role of extracellular matrix components and G proteins. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:9588-9592.

24. Caplan Al. Effects of the nicotinamide-sensitive teratogen 3-acetylpyridine on chick limb ceils in culture. Exp Cell Res 1970; 62:341-355.

25. Caplan Al, Fink DJ, Goto T, Linton AE, Young RG, Wakitani S, Goldberg VM, Haynesworth SE. Mesenchymal Stem Cells and Tissue Repair In: Jackson DW et al., eds. The Anterior Cruciate Ligament: Current and Future Concepts,New York: Raven Press, Ltd., 1993; 405-417.

Claims (11)

1. Implante (1) para reparar un defecto de tejido en un cuerpo humano o animal no humano, cuyo implante (1) comprende:

-

un miembro (2) portador de carga fisiológicamente compatible que tiene medios para fijar bajo tensión tejido adyacente al defecto a reparar;

-

alrededor del cual se sitúa una matriz de gel contraída (4); y

-

células cepa mesenquimales (6) dentro de dicha matriz de gel contraída (4);

-

habiendo contraído las células (6) dicha matriz de gel (4); y

-

habiéndose contraído dicha matriz de gel (4) durante la aplicación de una fuerza de tracción al miembro fisiológico portador de carga (2).

2. Implante (1) según la reivindicación 1, en el que la matriz de gel (4) es un gel de colágeno.

3. Implante (1) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho implante (1) es apropiado para el tratamiento de un defecto del tejido blando en un cuerpo humano o animal no humano.

4. Implante (1) según la reivindicación 3, en el que el defecto de tejido blando es un defecto del tendón, un defecto del cartílago, o un defecto de cartílago articular o un defecto del ligamento.

5. Implante (1) según la reivindicación 1, que incluye un dispositivo de fijación fibroso, degradable como un miembro portador de carga (2) contiguo con/y unido a dicha matriz de gel (4) entre un primer y segundo emplazamientos espaciados para extenderse a través de dicho defecto.

6. Implante (1) según la reivindicación 5, en el que el miembro portador de carga (2) es alargado entre dichos primer y segundo emplazamientos.

7. Implante (1) según la reivindicación 5 ó 6, en el que el miembro portador de carga (2) es una sutura.

8. Implante (1) según la reivindicación 5 a 7, en el que se selecciona el miembro portador de carga (2) del grupo consistente en un filamento sencillo, filamentos múltiples, materiales fibrosos biodegradables, filamentos tejidos, fibras de colágeno y por lo menos un filamento flexible y plegable.

9. Implante (1) según la reivindicación 5 a 8, en el que el miembro portador de carga (2) es por lo menos un filamento con sus respectivos extremos (10, 12) extendidos más allá de dichos primer y segundo emplazamientos.

10. Implante (1) según la reivindicación 1, en el que el miembro portador de carga (2) presenta una carga de tracción mientras es contraída dicha matriz de gel (4), aplicando dicha carga al miembro portador de carga (2) en el primer y segundo extremos del miembro portador de carga con dicho gel (4) localizado entre dichos extremos.

11. Implante (1) según la reivindicación 5 a 10, en el que el miembro portador de carga (2) es una sutura cuyos extremos (10, 12) están destinados a ser unidos a dicho tejido T con la sutura y matriz de gel (4) extendidas a través de dicho defecto.