ES2297862T3 - Analogos de peptidos que se unen a radiometales. - Google Patents
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Abstract
La presente invención describe nuevos ligandos de unión a metal que se pueden acoplar a péptidos para su empleo en procedimientos de diagnosis y terapia. Los péptidos que contiene ligandos se producen mediante un procedimiento en el que se puede efectuar la introducción del ligando o la ciclación en cualquier punto durante la síntesis del péptido. Estos ligandos péptidos son fácilmente trazados con radiometales, tales como isótopos de tecnecio y renio mientras que mantienen su capacidad de unión fuerte específica a los receptores péptidos.
Description
Análogos de péptidos que se unen a
radiometales.
Esta invención proporciona derivados de péptidos
cíclicos y acíclicos biológicamente útiles en los que una o más
cadenas laterales de aminoácidos o un segmento fijado a la cadena
peptídica contienen restos quelantes que pueden unir firmemente
iones metálicos, que incluyen radionúclidos. Los péptidos marcados
llevan el metal a objetivos específicos in vivo tales como
receptores y antígenos, y son útiles para la preparación de
composiciones para la formación de imágenes radiodiagnósticas, para
la terapia y la radioterapia. También se proporcionan métodos
nuevos para preparar los péptidos.
Los péptidos radiomarcados son útiles en el
diagnóstico y la terapia de una diversidad de enfermedades humanas
que se caracterizan por la sobreexpresión de receptores de hormonas
peptídicas. Así, por ejemplo, se ha demostrado que los análogos
radiomarcados de LHRH (hormona liberadora de hormona luteinizante) y
de somatostatina se unen selectivamente a tumores sensibles a
hormonas caracterizados por la sobreexpresión en la superficie
celular de receptores hormonales de LHRH. De forma similar, se han
usado análogos de hormonas peptídicas tales como
^{123}I-péptido intestinal vasoactivo (VIP),
^{99m}Tc-P829,
^{111}In-DTPA-octreótido y
^{111}In-bis-MSH-DTPA
para formar imágenes de tumores humanos que sobreexpresan
receptores de VIP, somatostatina, somatostatina y hormona
estimulante de melanocitos (MSH), respectivamente. Véase: Virgolini
et al. Engl. J. Med. 169:1116 (1994); Virgolini et
al. J. Nucl. Med. 36:1732, (1995); Lister-James
et al. Nucl. Med., 36, 91P, #370, resumen de la reunión de
1995; Pearson et al. J. Med. Chem. 39:1361, (1996); Krenning
et al. J. Nucl. Med., 33:652 (1992); y Wraight et al.
Brit. J. Radiol. 65:112 (1992).
Muchos péptidos que contienen tirosina se pueden
marcar con ^{125}I mediante métodos conocidos y usarlos para
estudios de unión a receptores. Por ejemplo, la incidencia del
aumento del receptor de VIP se ha estudiado in vitro en una
gran diversidad de tipos de cáncer mediante el uso de
^{125}I-[Tyr^{10}]-VIP como radioligando. Véase
Reubi, Nucl. Med. 36:1846 (1995). El receptor de VIP se
detectó en una gran diversidad de tipos de cáncer, que incluyen
tumores de mama, de próstata, ováricos, pancreáticos, endometriales,
de vejiga, de colon, esofágicos, SCLC, astrocitoma, glioblastoma,
meningioma, feocromocitoma, linfoma, neuroblastoma, adenoma, y GEP.
También se ha usado un análogo de VIP yodado,
^{123}I-[Tyr^{10}]-VIP, para formar imágenes de
tumores ricos en receptores de VIP en humanos. Véase Virgolini et
al, anteriormente mencionado.
Sin embargo, el uso de radioyodo para usos
diagnósticos y terapéuticos in vivo tiene diferentes
desventajas. ^{123}I, el isótopo más útil in vivo, es muy
caro (45,30 dólares/mCi) y se debe producir en un ciclotrón. Este
isótopo, además, tiene una semivida de solamente 13,2 horas, por lo
que es necesario que se produzca en una ubicación geográfica
cercana al lugar en el que se debe usar cualquier agente radioyodado
para la formación de imágenes. Se prefieren otros radioisótopos,
tales como ^{99m}Tc y ^{188}Re, para usos diagnósticos y
terapéuticos, respectivamente. ^{99m}Tc, por ejemplo, es barato
(0,50 dólares/mCi), se puede conseguir fácilmente (se produce en un
generador a partir de ^{99}Mo, un producto de reactor), y tiene
una energía de emisión \gamma ideal para la formación de imágenes
con una cámara \gamma.
Algunos péptidos contienen directamente o son
susceptibles a la introducción de residuos que permiten la unión
directa de radiometales tales como ^{99m}Tc y ^{188}Re al
péptido. Por ejemplo, somatostatina contiene un enlace disulfuro
que, tras la reducción, proporciona dos cadenas laterales de
cisteína que contienen sulfhidrilo que pueden unir directamente
^{99m}Tc. Véase la patente de EE.UU. nº 5.225.180. Véanse además
los documentos WO 94/28942, WO 93/21962 y WO 94/23758. Los
complejos de este tipo tienden, sin embargo, a ser heterogéneos e
inestables, lo que limita su utilidad clínica. Además, el uso de
sulfhidrilos libres de esta manera limita los radiometales que se
pueden usar para marcar el péptido a aquellos que se unen firmemente
a los grupos S-B libres. Este método experimenta
además el problema de que la unión directa del metal a una cadena
lateral de aminoácido puede influir enormemente en la conformación
del péptido, por lo que se alteran de manera adversa las
propiedades de unión al receptor del compuesto.
La mayoría de los péptidos no contienen un
motivo de secuencia de aminoácidos de unión de metal o, por diversas
razones tales como las descritas anteriormente, no son susceptibles
a modificaciones adecuadas de la secuencia que permitirían la
introducción de tal motivo. Se debe introducir en el péptido, por lo
tanto, algún medio para hacer que el péptido sea capaz de unir
radiometales. Una aproximación preferida es fijar un ligando de
unión de metal en un sitio especificado dentro del péptido, de
manera que se forma un único complejo definido y estable. Los
ligandos usados para unir metales contienen a menudo una diversidad
de heteroátomos tales como nitrógeno, azufre, fósforo y oxígeno que
tienen una elevada afinidad por los metales. Por ejemplo, el
documento US 5.449.761 se refiere a construcciones de polipéptidos
que seleccionan objetivos y con unión de metales que contienen un
esqueleto de hidrocarburo unido al menos a dos unidades, y cada una
comprende un resto -N-C(zs)- y un péptido.
Además, el documento WO 96/40756 describe el resto de unión de
radiometal PtscGC como se define en los ejemplos de referencia de
la presente solicitud que comprende un residuo de tiourea, de
glicocola y de cisteína, y dicho resto de unión está unido a
análogos de péptidos de LHRH.
Los quelatos se han fijado convencionalmente por
medio de enlaces covalentes al extremo N-terminal de
un péptido o análogo de péptido, tras la síntesis independiente del
péptido y de los restos de quelato. Por ejemplo, Maina et
al. han descrito el acoplamiento de un quelador de
tetra-amina al extremo N-terminal de
un análogo de somatostatina, lo que permite el marcado con
^{99m}Tc del péptido. Véase J. Nucl. Biol. Med. 38:452 (1994). El
acoplamiento de esta manera es indeseable, sin embargo, cuando el
extremo N-terminal del péptido desempeña un papel
importante en sus propiedades de unión al receptor. Por lo tanto, la
aplicación de este método está limitada por la necesidad de que el
extremo N-terminal del péptido acomode la presencia
de un quelador (habitualmente voluminoso estéricamente) sin afectar
de manera adversa a las propiedades de unión del péptido.
De forma alternativa, se han introducido agentes
quelantes en las cadenas laterales de péptidos por medio de
reacciones selectivas de sitio que afectan a residuos de aminoácidos
particulares. Por ejemplo, el residuo de lisina de la posición 6 de
LHRH se ha acilado directamente con un grupo quelante. Véase Bajusz,
S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6313 (1989). Este
método está limitado intrínsecamente por la carencia de selectividad
química disponible cuando más de una cadena lateral puede
reaccionar potencialmente con el quelador, o cuando la secuencia
del péptido no contiene un aminoácido que se pueda derivatizar de
esta manera. Una limitación adicional de esta aproximación puede
surgir cuando se usan ligandos multidentados. Una única molécula de
ligando puede reaccionar con múltiples moléculas de péptido, lo que
da como resultado la formación de cantidades significativas de
productos entrecruzados.
Se han introducido agentes quelantes en la
cadena lateral de un péptido por medio de
tris-aminoácidos como describió Dunn T.J. et
al., documento WO 94/26294. Este método no proporciona un método
para ciclar los péptidos. Los grupos protectores de las cadenas
laterales usados para introducir el ligando descrito en este trabajo
son los mismos que se usan generalmente para la ciclación amida de
péptidos. Véase Felix et al. Int. J. Peptide Protein Res.
32:441 (1988).
Se ha sintetizado un agente quelante de BAT
(bisaminotiol) completamente protegido y se ha acoplado a la cadena
lateral de un residuo de lisina, que se pudo incorporar después en
un péptido. Véase Dean et al., documento WO 93/25244.
Estos precursores completamente protegidos consumen mucho tiempo,
son caros y engorrosos de preparar. La dificultad y el gasto para
preparar tales precursores hacen que este método sea insostenible
para preparar una serie variada de ligandos fijados a la diversidad
de ligadores que se necesitan para diseñar un agente de selección
de objetivo que porta un metal.
Una solución potencial para este problema es
usar una estrategia con grupos protectores que permita el
acoplamiento selectivo de un resto quelador a posiciones
especificadas dentro de una cadena peptídica. La diversidad de
reactividades químicas presentes en las cadenas laterales de los
aminoácidos de un péptido ha llevado, sin embargo, a dificultades
para conseguir una selectividad suficiente en la desprotección
específica de sitio de los grupos protectores. Esta carencia de
selectividad también ha dificultado hasta ahora los intentos de
desproteger de manera selectiva dos o más grupos funcionales
diferentes dentro de un péptido para permitir el acoplamiento de
estos grupos, por ejemplo, en un péptido cíclico.
Edwards et al., J. Med. Chem. 37:3749
(1994), ha descrito un método con fragmentos para construir un
disulfuro cíclico en una resina con la fijación posterior de un
ligando intacto (DTPA). Esta aproximación proporcionó el agente
conocido de selección de objetivo de somatostatina
DTPA-octreótido. Esta aproximación se diseñó
específicamente para la preparación de un compuesto conocido. Una
situación más típica, sin embargo, requiere una diversidad de
péptidos marcados para optimizar la unión a un objetivo particular.
Tal situación requiere, por lo tanto, una aproximación más amplia
que permita la construcción de múltiples ligandos, construidos mejor
en fragmentos, colocados en cualquier punto deseado de una
secuencia que también se puede ciclar en una diversidad de
posiciones de la secuencia peptídica.
Las consideraciones adicionales para la síntesis
de péptidos que pueden unir metales de manera selectiva incluyen el
efecto del quelato sobre la conformación del péptido. La mayoría de
los péptidos son sumamente flexibles conformacionalmente, mientras
la unión eficaz al receptor requiere habitualmente que el péptido
adopte una conformación específica. El hecho de si el péptido puede
o no adoptar esta conformación específica se ve sumamente afectado
por las interacciones entre cargas e hidrofílicas/hidrofóbicas, lo
que incluye el efecto de un resto quelante de metal fijado de
manera covalente. Es posible incrementar la afinidad y la
selectividad por el receptor del péptido restringiendo las
conformaciones que puede adoptar el péptido, preferiblemente
mediante el bloqueo del péptido en una conformación activa. Esto se
consigue a menudo más fácilmente preparando péptidos cíclicos. Los
péptidos cíclicos tienen la ventaja añadida de una resistencia
incrementada hacia las proteasas, y por lo tanto con frecuencia
manifiestan una semivida biológica más larga que el péptido lineal
correspondiente.
Los péptidos se pueden ciclar mediante una
diversidad de métodos, tales como la formación de disulfuros,
sulfuros y, en especial, la formación de lactamas entre las
funciones carboxilo y amino de los extremos N- y
C-terminales o de las cadenas laterales de los
aminoácidos. Sin embargo, la plétora de funciones en una cadena
peptídica significa generalmente que, para la mayoría de los
péptidos excepto los más cortos, es muy difícil conseguir el
acoplamiento selectivo entre dos grupos funcionales deseados de un
péptido.
Está claro, por lo tanto, que son muy deseables
los péptidos cíclicos que pueden quelar iones metálicos a la vez
que mantienen la capacidad de unirse específicamente con una
afinidad elevada a un receptor. También es deseable tener un medio
para fijar un resto quelante a cualquier posición predeterminada de
un péptido, y tener un medio para formar de manera selectiva
péptidos cíclicos entre dos posiciones preseleccionadas cualesquiera
de una cadena peptídica. Además, es deseable tener acceso a un
método que permitiría acoplar un resto quelante a un péptido en
cualquier etapa deseada durante la síntesis del péptido.
Por lo tanto, es un objetivo de la presente
invención proporcionar péptidos que pueden unir radionúclidos a la
vez que mantienen la capacidad de unirse específicamente al receptor
del péptido. Es un objetivo adicional de la invención proporcionar
métodos para preparar y radiomarcar péptidos que pueden unir
radionúclidos a la vez que mantienen la capacidad de unirse
específicamente al receptor del péptido. Es otro objetivo adicional
de la invención usar los péptidos radiomarcados para la preparación
de composiciones diagnósticas y terapéuticas para la formación de
imágenes o para el tratamiento de un tumor, una lesión infecciosa,
un infarto de miocardio, un coágulo, una placa ateroesclerótica, o
un órgano o tejido normal.
Al llevar a cabo los anteriores objetivos de la
invención se ha proporcionado, de acuerdo con un aspecto de la
presente invención, un péptido que comprende un resto de unión de
radiometal, en el que dicho resto de unión comprende la estructura
I:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1}, R^{2} y
R^{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, cicloalquilo,
cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, arilo, arilo
sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, y un
grupo protector que se puede eliminar en las condiciones de
síntesis peptídica, con tal de que al menos uno de R^{1}, R^{2}
o R^{3} sea H. R^{5}, R^{7}, R^{8}, R^{9} y R^{10} se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo
C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, arilo y arilo
sustituido, y R^{4} y R^{6} juntos forman un enlace directo.
R^{8} y R^{9} juntos o R^{7} y R^{9} juntos pueden formar un
anillo cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, y NR^{10} está
localizado en el extremo N-terminal de dicho
péptido, o está localizado en una cadena lateral de aminoácido de
dicho
péptido.
péptido.
En las realizaciones preferidas de la invención,
R^{1} es H, R^{3} es H, R^{4} es H, o R^{4} y R^{6}
juntos forman un enlace directo. En otras realizaciones preferidas,
R^{2} es alquilo C_{1}-C_{6} o fenilo
sustituido o sin sustituir, o más preferiblemente metilo o fenilo.
En otras realizaciones preferidas, R^{8} y R^{9} son
metilo.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, los
péptidos comprenden además un átomo metálico unido. En las
realizaciones preferidas el átomo de metal es ^{99m}Tc, ^{186}Re
o ^{188}Re.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para preparar una composición quelante de
metales, en el que se pone en contacto una disolución de un péptido
que comprende un resto de unión de radiometal con iones estañosos,
en el que el resto de unión tiene la estructura expuesta
anteriormente, tras lo cual se pone en contacto la disolución con
un radionúclido, y se recupera el péptido radiomarcado. En una
realización preferida del método el radionúclido es ^{188}Re- o
^{186}Re-perrenato o
^{99}Tc-pertecnetato.
De acuerdo con aún otro aspecto de la invención,
se proporciona el uso de péptidos radiomarcados para la preparación
de composiciones diagnósticas para la formación de imágenes de un
tumor, una lesión infecciosa, un infarto de miocardio, un coágulo,
una placa ateroesclerótica, o un órgano o tejido normal, que
comprende administrar a un paciente humano un péptido radiomarcado
junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y, después de un
tiempo suficiente para que se localice dicho péptido radiomarcado y
para que se aclare la señal de fondo fuera del objetivo, el sitio o
sitios de aumento de dicho péptido radiomarcado se detectan mediante
una cámara externa de formación de imágenes, en el que el péptido
radiomarcado se prepara poniendo en contacto una disolución de un
péptido con iones estañosos, en el que el péptido comprende un resto
de unión de radiometal que tiene la estructura expuesta
anteriormente, y después poniendo en contacto dicha disolución con
un radionúclido y recuperando el péptido
radiomarcado.
radiomarcado.
\newpage
De acuerdo con otro aspecto de la invención se
proporcionan péptidos que tienen una estructura seleccionada del
grupo que consiste en:
en las que (Chel) es un resto de
unión de radiometal que tiene la estructura expuesta
anteriormente.
La presente invención proporciona restos
quelantes nuevos que se pueden unir de forma covalente a péptidos,
péptidos cíclicos y análogos de péptidos. Los restos quelantes
permiten que los péptidos, péptidos cíclicos y análogos de péptidos
unan metales de manera estable, especialmente radiometales. También
se proporcionan métodos para preparar estos queladores, péptidos y
análogos de péptidos. Los péptidos y los análogos de péptidos se
preparan introduciendo de forma específica de sitio los restos
quelantes de metales en los péptidos que se sintetizan mediante
métodos en fase sólida o en fase líquida. Los restos quelantes se
pueden fijar a una cadena lateral que tiene amino de un aminoácido
de la cadena peptídica, o se pueden fijar al extremo
N-terminal del péptido. Los péptidos según la
invención incluyen análogos cíclicos con unión de metal de LHRH,
péptido intestinal vasoactivo (VIP), heregulinas (péptidos de unión
a erbB) \alpha, \beta1, \beta2 y \beta3,
melanotropina (\alpha-MSH), somatostatina,
calcitonina, factor de crecimiento epidérmico, hormona liberadora
de gonadotropina, hormona liberadora de hormona del crecimiento,
dinorfina, péptido relacionado con el gen de calcitonina,
vasotocina, mesotonina, hormona adrenocorticotrópica,
corticotropina, gonadotropina, prolactina, vasopresina, oxitocina,
sustancia P, sustancia K y angiotensina.
Los restos quelantes se representan mediante la
fórmula general I:
en la que R^{1}, R^{2} y
R^{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, cicloalquilo,
cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, arilo, arilo
sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, y un
grupo protector que se puede eliminar en las condiciones de
síntesis peptídica. Al menos uno de R^{1}, R^{2} o R^{3} debe
ser H. R^{5}, R^{7}, R^{8}, R^{9} y R^{10} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en H, alquilo
C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, arilo y arilo
sustituido. R^{4} y R^{6} juntos forman un enlace directo, y
R^{8} y R^{9} juntos o R^{7} y R^{9} juntos pueden formar
también un anillo cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. NR^{10}
está localizado en el extremo N-terminal del péptido
al que está fijado el quelador, o está localizado en una cadena
lateral de aminoácido de ese péptido. Cuando R^{1}, R^{2},
R^{5} o R^{6} albergan una función sustituida con heteroátomo,
el heteroátomo se puede usar también para llevar a cabo reacciones
adicionales de acoplamiento al
péptido.
Los ejemplos de grupos alquilo
C_{1}-C_{6} incluyen metilo, etilo,
n-propilo, i-propilo,
n-butilo, i-butilo,
s-butilo, t-butilo,
n-pentilo, i-pentilo y
n-hexilo. Cicloalquilo incluye cicloalquilo
C_{3}-C_{6}, tal como ciclohexilo.
Heterocicloalquilo incluye tetrahidrofurano, tetrahidropirano,
pirrolidina y piperidina. Heteroarilo incluye pirrolilo, furanilo,
tienilo, imidazolilo, oxazolilo, oxazoliltio, tiazolilo, pirazolilo
pirrolidinilo, piridinilo, pirimidinilo, morfolinilo y piperizinilo.
Arilo incluye arilo C_{6}-C_{12} tal como
fenilo, \alpha-naftilo o
\beta-naftilo.
Alcarilo incluye: aril
C_{6}-C_{12}-alquilo
C_{1}-C_{6}, tal como fenilalquilo
C_{1}-C_{6}, o \alpha- o
\beta-naftilalquilo
C_{1}-C_{6}, tal como bencilo, feniletilo,
fenilpropilo, fenilbutilo, fenilpentilo, \alpha- o
\beta-naftilmetilo, naftiletilo, naftilpropilo,
naftilbutilo o naftilpentilo.
Los ejemplos de grupos sustituyentes incluyen:
alcoxi C_{1}-C_{6}, por ejemplo, metoxi, etoxi,
propoxi; alquiltio C_{1}-C_{6}, por ejemplo
metiltio, etiltio, propiltio; aril
C_{6}-C_{12}-alcoxi
C_{1}-C_{6}, por ejemplo fenilalcoxi
C_{1}-C_{6} tal como benciloxi; aralquiltio, por
ejemplo fenilalquiltio C_{1}-C_{6} tal como
benciltio; amino, amino sustituido, por ejemplo alquilamino
C_{1}-C_{6} tal como metilamino, etilamino;
aril C_{6}-C_{12}-alquilo
C_{1}-C_{6}, tal como fenilalquilo
C_{1}-C_{6}, por ejemplo bencilo; arilo
C_{6}-C_{12} tal como fenilo; cicloalquilo
C_{3}-C_{8} tal como ciclohexilo; y cicloalquil
C_{3}-C_{8}-alquilo
C_{1}-C_{6} tal como ciclohexilmetilo.
Las realizaciones preferidas de la invención
incluyen compuestos en los que R^{2} es H, metilo o fenilo, y en
los que R^{8} y R^{9} son metilo. Otras realizaciones preferidas
son aquellas en las que R^{1}, R^{3}, R^{5}, R^{7} y
R^{10} son H.
Los péptidos se pueden sintetizar mediante el
uso de derivados de bis-aminoácidos protegidos de
forma diferencial en los que cada función amino se puede
desproteger selectivamente. Estos derivados se introducen en una
cadena peptídica en crecimiento durante la síntesis del péptido
mediante una metodología convencional de acoplamiento a péptidos.
Después se desprotege selectivamente una de las funciones amino, lo
que permite el acoplamiento posterior de todo o parte de una
molécula quelante, o la adición de residuos de aminoácidos
adicionales para continuar la síntesis del péptido. La síntesis del
péptido se puede continuar mediante acoplamiento en el grupo
\alpha-amino, lo que lleva a un péptido con un
esqueleto amida convencional, o en el grupo amino de la cadena
lateral para producir un péptido cuyo esqueleto amida está
interrumpido por la estructura de la cadena lateral. De forma
alternativa, se puede usar la función amino libre para ciclar sobre
un grupo funcional reactivo localizado en otra parte del péptido,
por lo que se produce un péptido cíclico. Los
bis-aminoácidos adecuados serán fácilmente
aparentes para el técnico experto, e incluyen lisina, ornitina y
ácido 2,3-diaminopropiónico
(amino-serina). De forma alternativa, el resto
quelante se puede introducir al final de la síntesis del péptido
acoplando el resto quelante al extremo N-terminal
desprotegido del péptido unido a la resina. El resto quelante se
puede añadir como una unidad completa, en forma protegida o
desprotegida, o se puede sintetizar por etapas para construir la
estructura quelante completa.
Los bis-aminoácidos usados en la
presente invención se pueden representar en general mediante la
fórmula:
ZHN-CH(-R-NHY)-CO_{2}H
en la que R es (CH_{2})_{n} o
(CH_{2})_{n}-X-(CH_{2})_{n} en
la que X es un heteroátomo tal como O, S o N y
n=1-20. De forma alternativa, los átomos de
hidrógeno de los grupos CH_{2} se pueden sustituir con grupos
alquilo C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido o alquenilo, o anillos
cíclicos o heterocíclicos tales como ciclohexano, benceno y
piperidina, u otros grupos conocidos para el técnico experto. Los
sustituyentes Z e Y pueden ser independientemente H, N, alquilo
C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, arilo o arilo
sustituido.
Si la síntesis del péptido continúa, se puede
llevar a cabo la desprotección selectiva del segundo grupo amino
del bis-aminoácido en cualquier momento durante la
síntesis del péptido para introducir el resto quelante. Se puede
sintetizar el resto quelante completo antes del acoplamiento al
péptido, o se puede sintetizar mediante el acoplamiento secuencial
de segmentos al péptido. Una vez que se completa la construcción de
toda la estructura péptido/quelador, la escisión, desprotección y
purificación proporciona el derivado deseado del péptido. Este
derivado se marca después con un radiometal para el uso en
aplicaciones radiodiagnósticas y radioterapéuticas.
De forma alternativa, si todo o parte de la
molécula quelante se acopla primero al grupo amino desprotegido, la
segunda etapa es desproteger el otro grupo amino y continuar con la
síntesis del péptido. Si se acopla solamente parte del resto de
quelador al péptido en esta etapa, la síntesis del quelador se puede
finalizar en cualquier momento durante o después de la síntesis de
la cadena peptídica mediante reacciones apropiadas de desprotección
y acoplamiento. Las etapas finales de escisión, desprotección y
purificación proporcionan de nuevo el derivado del péptido puro,
que se radiomarca después como se mencionó anteriormente.
La fijación del quelador al péptido antes de la
escisión de la resina da como resultado la formación reducida de
productos de entrecruzamiento, incluso cuando se usan queladores
multidentados activados tales como dianhídrido de DTPA.
La preparación de péptidos cíclicos se consigue
mediante la desprotección selectiva de dos restos funcionales
compatibles en posiciones especificadas de la secuencia del péptido,
seguida de ciclación entre los restos compatibles. La ciclación se
puede llevar a cabo entre dos puntos cualesquiera de la secuencia
del péptido, lo que incluye entre los extremos N- y
C-terminales, entre un extremo y un grupo funcional
interno dentro de la secuencia del péptido, o entre dos grupos
funcionales internos. La ciclación se puede llevar a cabo mediante
el uso de síntesis de péptidos en fase líquida o en fase sólida,
pero se lleva a cabo preferiblemente mediante el uso de técnicas en
fase sólida.
La desprotección y la ciclación se pueden llevar
a cabo en cualquier momento durante la síntesis del péptido antes
de las reacciones finales de desprotección. Por ejemplo, se puede
preparar la secuencia completa del péptido protegida antes de la
ciclación, o la ciclación se puede llevar a cabo en un intermedio
del péptido protegido, seguido por la finalización de la síntesis.
De forma similar, la ciclación se puede llevar a cabo antes o
después de que todo o parte del resto quelante de metal se acople al
péptido. El uso de una resina fotoescindible o de otro tipo
conocida para los expertos en la técnica en un sintetizador de
péptidos en fase sólida permite también la liberación de un péptido
protegido desde un soporte sólido, con la posterior desprotección y
ciclación selectiva en fase líquida. De forma alternativa, las
cadenas laterales a ciclar se pueden desproteger selectivamente
antes de la escisión desde la resina, y la ciclación se lleva a cabo
en fase líquida.
Las reacciones que afectan al extremo
C-terminal del péptido, que incluyen pero no se
limitan a las reacciones de ciclación, se pueden llevar a cabo por
medio de la liberación de un péptido protegido de la resina de la
manera descrita anteriormente. De forma alternativa, se puede fijar
la cadena peptídica en crecimiento a la resina por medio de la
cadena lateral de un residuo, y proteger de forma adecuada el grupo
carboxilo C-terminal. Cuando se desea una reacción
con el grupo carboxilo C-terminal, se desprotege
selectivamente y se permite que se desarrolle la reacción. En el
caso de las reacciones de ciclación, la desprotección del extremo
C-terminal se puede llevar a cabo antes, durante o
después de la desprotección selectiva del grupo reactivo
compatible.
Los péptidos quelantes de radiometales de la
presente invención retienen de forma estable el radionúclido en la
sangre y otros líquidos y tejidos corporales. Tanto los reactivos
como las condiciones del método presente se simplifican en gran
medida con respecto a los del estado de la técnica, y los péptidos
marcados son especialmente adecuados para la preparación de
composiciones para aplicaciones de radiodiagnóstico y radioterapia
mediante el uso de marcado con tecnecio o renio.
La aproximación resumida anteriormente permite
la colocación de un resto de unión de radiometal en cualquier parte
de una secuencia peptídica. La colocación del resto quelante en una
cadena lateral de aminoácido, directamente o por medio de un grupo
espaciador, en vez de en el extremo N-terminal de un
péptido, tiene la ventaja añadida de distanciar espacialmente el
complejo metálico del esqueleto del péptido, por lo que se minimiza
el efecto del complejo metálico sobre la conformación del péptido.
Esto también permite que se use el extremo
N-terminal del péptido para ciclar el péptido, si
es necesario.
Se sabe que la conformación peptídica está muy
influida por las interacciones entre cargas e
hidrofílicas/hidro-
fóbicas, y por lo tanto es importante considerar estas variables cuando se diseña un ligando quelante para usarlo en péptidos. Se prefiere que se prepare y se ensaye una diversidad de complejos quelantes de cargas e hidrofobicidades variables y que contengan grupos espaciadores de diversas longitudes para seleccionar el péptido con metal complejado que exhibe la combinación óptima de selectividad por el objetivo, farmacocinética y estabilidad del quelato. El técnico experto apreciará que tales ensayos son rutinarios en la técnica.
fóbicas, y por lo tanto es importante considerar estas variables cuando se diseña un ligando quelante para usarlo en péptidos. Se prefiere que se prepare y se ensaye una diversidad de complejos quelantes de cargas e hidrofobicidades variables y que contengan grupos espaciadores de diversas longitudes para seleccionar el péptido con metal complejado que exhibe la combinación óptima de selectividad por el objetivo, farmacocinética y estabilidad del quelato. El técnico experto apreciará que tales ensayos son rutinarios en la técnica.
Los péptidos radiomarcados de la presente
invención se unen específicamente a una célula o tejido enfermo que
exhibe una densidad elevada de receptores y una afinidad elevada por
el péptido. La radiactividad del radionúclido permite el
diagnóstico y/o tratamiento del tumor o del tejido enfermo. La
invención también incluye composiciones farmacéuticas que
comprenden una cantidad eficaz de al menos uno de los péptidos
radiomarcados de la invención en combinación con un vehículo
estéril farmacéuticamente aceptable, como se describe, por ejemplo,
en Remington's Pharmaceutical Sciences; Drug Receptors and Receptor
Theory, 18ª ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). La
invención también incluye equipos para marcar péptidos que son
útiles y fáciles de usar en un entorno clínico.
Los péptidos de la invención contienen derivados
de aminoácidos quelantes de radiometales como se definen en la
reivindicación 1, que se caracterizan por la presencia de al menos
un grupo tiol o tiocarbonilo, y al menos un nitrógeno presente como
una amina terciaria, una hidrazona, o una amida o hidrazida
secundaria. Los átomos de azufre y nitrógeno están dispuestos de
manera adecuada para formar un ligando multidentado capaz de unir
firmemente y de manera preferente un ión metálico. El ligando
multidentado puede contener además un grupo espaciador que sirve
para separar el metal quelado del resto del péptido. El ión metálico
es preferiblemente un radionúclido reducido, y en una realización
preferida es ^{99m}Tc, ^{186}Re o ^{188}Re.
La invención también proporciona un método para
colocar ligandos para otros metales en cualquier punto de una
secuencia peptídica. Estos ligandos se pueden introducir intactos,
por ejemplo DTPA, o como fragmentos. De esta manera los ligandos
para otros metales de interés médico que incluyen, pero no se
limitan a, In, Ga, Y, Cu, Pt, Mn, Gd, Au, Ag, Hg y Lu, se pueden
colocar en una secuencia peptídica de selección de objetivo.
El método permite la introducción de cualquier
quelato o fragmento de quelato de metal que está protegido de
manera adecuada para la síntesis del péptido. El método también
proporciona un método para la introducción de derivados de ligando
sensibles a bases que se pueden colocar en cualquier punto de la
secuencia del péptido, mientras se introduzcan al final de la
síntesis. Un ejemplo de referencia es la síntesis de un ligando
fijado a la cadena lateral de lisina mediante el uso del siguiente
fragmento de ligando,
tritil-S-COCH_{2}N(Boc)CH_{2}CO_{2}H.
El éster de S-tritilo será sensible a bases, de
forma que no sería posible colocar este fragmento de ligando en el
péptido en un momento anterior de la síntesis.
Cada uno de los restos quelantes de la invención
se pueden preparar mediante métodos bien conocidos para el
practicante experto de la técnica de síntesis orgánica. Los restos
quelantes se construyen a partir de subunidades que se unen entre
sí mediante reacciones simples de acoplamiento o de condensación,
tales como la condensación de una función amina, hidrazina o
hidrazida con un grupo carboxilo activado, el acoplamiento de
hidrazinas con aldehídos, o las reacciones de aminación reductora
entre aminas y aldehídos. Como se usa aquí, el término
"condensación" pretende abarcar las reacciones que acoplan
subunidades del resto quelante, y así abarca reacciones tales como
la aminación reductora, además de las reacciones que se adaptan a la
definición clásica de una reacción de condensación.
Tras la reacción de condensación, se pueden
desproteger grupos funcionales adicionales de la subunidad para
permitir reacciones de condensación adicionales. Por ejemplo, se
puede condensar una segunda subunidad que porta un grupo carboxilo
libre y una función amina protegida con una función amina, hidrazina
o hidrazida en una primera subunidad para producir un fragmento
mayor protegido de manera adecuada del ligando de unión de metal.
La función amina del segundo resto de la subunidad se puede
desproteger después y acoplarla adicionalmente a una tercera
subunidad. Como se usa aquí, el término "fragmento" pretende
abarcar una subunidad o construcción de subunidades que comprende
todo o parte del ligando de unión de metal.
Los métodos para activar grupos carboxilo para
tales reacciones de condensación son conocidos para los expertos en
la técnica de síntesis orgánica y de síntesis de péptidos, e
incluyen el uso de ésteres activos y de agentes de acoplamiento de
carbodiimida y de fosforilazida. Los grupos protectores adecuados se
usan para proteger las funciones de las subunidades cuando la
reactividad de las funciones es incompatible con la reacción usada
para unir las subunidades, o con las reacciones usadas para la
síntesis de la cadena peptídica. Los grupos protectores para las
funciones mercapto, amino y ácido carboxílico se conocen bien en la
técnica. Véase, por ejemplo, Greene, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC
SYNTHESIS (Wiley Interscience, NY, 1981). Las subunidades usadas
para construir el quelato se preparan fácilmente mediante métodos
conocidos en la técnica, o están disponibles comercialmente de
proveedores tales como Advanced ChemTech (Lexington, KY), Milligen
(Burlington, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA), o Aldrich
Chemical Corp. (Milwaukee, WI).
Las reacciones de condensación usadas para unir
las subunidades de quelador se pueden llevar a cabo antes de la
síntesis del péptido, o durante la síntesis de la secuencia del
péptido. Cuando el derivado de aminoácido se construye a partir de
sus subunidades antes de la síntesis del péptido, las funciones
\alpha-amino y \alpha-carboxilo
se deben proteger de forma adecuada de una manera que sea compatible
posteriormente con la desprotección y activación selectiva de estas
funciones para la síntesis del péptido. Se conocen en la técnica
ejemplos de tales grupos protectores, e incluyen los grupos
fluorenmetiloxicarbonilo (Fmoc), benciloxicarbonilo (Cbz),
butoxicarbonilo (Boc), aliloxicarbonilo (Aloc),
4-metoxitritilo (mtt), y
1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo
(Dde) para la protección de grupos amino. Los grupos para la
protección de carboxilo incluyen los ésteres de metilo (Me),
bencilo (Bn), 'butilo ('Bu) y alilo, respectivamente.
Los grupos protectores de grupos amino y
carboxilo se deben seleccionar de forma que cada grupo se pueda
desproteger selectivamente en presencia del otro. Se dice que tales
restos protectores son ortogonales. La necesidad de usar grupos
protectores ortogonales excluye, por ejemplo, el uso del grupo Cbz
para la protección de la función amino en presencia de un grupo
carboxilo protegido como un éster de bencilo. Véase Greene,
anteriormente mencionado. En una realización preferida el grupo
\alpha-amino se protege como un grupo Fmoc, y el
grupo \alpha-carboxilo es un éster de metilo. El
grupo protector de tiol usado en los compuestos de la invención
puede ser cualquier grupo orgánico o inorgánico que se elimine
fácilmente en condiciones suaves, para regenerar el sulfhidrilo
libre en presencia del péptido sin alterar sustancialmente la
actividad de la proteína. Los grupos protectores adecuados se
enumeran en Greene, anteriormente mencionado, págs.
193-217. Los ejemplos de grupos protectores
adecuados incluyen grupos tritilo sustituidos y sin sustituir,
ésteres de tiol, tiocarbamatos y disulfuros. En una realización
preferida el grupo protector de tiol es un grupo tritilo o un grupo
4-metoxitritilo. Los expertos en la técnica están
familiarizados con los procedimientos de protección y de
desprotección de los grupos tiol. Por ejemplo, los tioésteres de
benzoato se pueden desproteger en condiciones suaves y selectivas
mediante el uso de hidroxilamina. Una vez que se completa la
construcción del resto quelante protegido, la función
\alpha-carboxilo se desprotege y se acopla al
extremo amino de la cadena peptídica mediante el uso de métodos
convencionales de síntesis de péptidos. Véase Bodanszky et
al., THE PRACTICE OF PEPTIDE SYNTHESIS (Springer Verlag,
Heidelberg, 1984).
Cuando el derivado de aminoácido quelante de
metal se construye a partir de sus subunidades durante la síntesis
peptídica, la cadena del péptido se construye mediante síntesis
convencional en fase líquida o, preferiblemente, en fase sólida
hasta el momento en el que se debe incorporar el derivado. El
bis-aminoácido protegido de manera diferencial se
acopla después al extremo amino de la cadena peptídica. La
desprotección selectiva posterior de uno de los grupos amino del
derivado permite que continúe la síntesis del péptido o la síntesis
del quelador.
Si la función \alpha-amino se
desprotege primero, todos o parte de los residuos de aminoácidos
restantes se acoplan después a la cadena peptídica de manera
convencional. La función amino de la cadena lateral del derivado se
desprotege después, y el resto quelante se construye como se
describió anteriormente. El péptido completo se puede desproteger y
purificar después mediante métodos estándar.
Si la función amino de la cadena lateral se
desprotege primero, todo o parte del resto quelante se construye
después como se describió anteriormente, seguido de la desprotección
del grupo \alpha-amino. La síntesis del péptido
se completa de manera convencional como se describió
anteriormente.
Una vez que la síntesis del péptido se completa,
el péptido completamente protegido se desprotege y se purifica. Los
métodos para la desprotección y la purificación de péptidos
sintéticos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo,
Bodanszky, anteriormente mencionado. Si el péptido se sintetizó
mediante técnicas en fase sólida, el péptido se debe escindir
además de la resina usada como soporte sólido para la síntesis. Los
métodos para llevar a cabo esta escisión también se conocen en la
técnica. Los métodos para purificar péptidos sintéticos tales como
los de la presente invención también son conocidos para los expertos
en la técnica. Tales métodos incluyen, por ejemplo, intercambio de
iones, cromatografía de filtración en gel, y cromatografía líquida a
alta presión de fase inversa (RP-HPLC). En una
realización preferida de la invención, el péptido se purifica
mediante RP-HPLC mediante el uso de empaquetamiento
de una columna de sílice de octadecilsilano (C18) a escala
preparativa, y elución con un gradiente de acetonitrilo en un 0,1%
de ácido trifluoroacético (TFA). La pureza del péptido se puede
confirmar mediante métodos estándar tales como
RP-HPLC analítica o electroforesis capilar. La
identidad del péptido se puede confirmar mediante espectroscopía de
RMN o, en una realización preferida de la invención, mediante
espectroscopía de masas.
Como se expuso anteriormente, es importante que
el resto quelante no interfiera con la unión del péptido al
receptor apropiado. La determinación de los residuos del péptido que
se pueden sustituir sin afectar de manera adversa a la unión al
receptor se puede llevar a cabo de una manera sistemática y sencilla
preparando una serie de péptidos en la que cada residuo sucesivo se
sustituye, por ejemplo, por alanina (un "barrido de alaninas").
Los péptidos sustituidos con alanina se criban después en función
de su actividad biológica. Los sintetizadores de péptidos modernos
hacen la síntesis de péptidos de esta manera bastante sencilla, y el
cribado de un gran número de péptidos es rutinario para el técnico
experto. La retención de la afinidad de unión elevada por el
receptor en un péptido que contiene tal sustitución de alanina
denota que el aminoácido sustituido es menos importante para la
unión al receptor, e indica una posición en la que se puede colocar
el residuo de unión de metal. La síntesis de péptidos en la que se
coloca un quelador en cada una de estas posiciones es sencilla
entonces, y el cribado rutinario establece la posición óptima para
el quelador.
El quelador contiene un grupo tiol junto con un
grupo tiosemicarbazona, y se puede representar mediante la fórmula
general I:
en la que R^{1}, R^{2} y
R^{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, cicloalquilo,
cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, arilo, arilo
sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo y un grupo
protector que se puede eliminar en las condiciones de síntesis
peptídica. Al menos uno de R^{1}, R^{2} o R^{3} debe ser H.
R^{5}, R^{7}, R^{8}, R^{9} y R^{10} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en H, alquilo
C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, arilo y arilo
sustituido. R^{4} y R^{6} juntos forman un enlace directo, y
R^{8} y R^{9} juntos o R^{7} y R^{9} juntos pueden formar
también un anillo cicloalquilo o cicloalquilo sustituido. NR^{10}
está localizado en el extremo N-terminal del péptido
al que se fija el quelador, o está localizado en una cadena lateral
de aminoácido de ese péptido. Cuando R^{1}, R^{2}, R^{5} o
R^{6} albergan una función sustituida con heteroátomo, el
heteroátomo se puede usar también para llevar a cabo reacciones
adicionales de acoplamiento al
péptido.
Aunque para poner en práctica la invención no es
necesaria la comprensión del mecanismo de la unión del metal por
los restos quelantes, y sin desear limitarse por ninguna teoría, se
cree que el metal se une al quelador por medio de los dos átomos de
azufre más los dos átomos de nitrógeno. Se realiza la hipótesis de
que los nitrógenos de unión del metal son el nitrógeno \alpha del
aminoácido que contiene \beta-tiol y el nitrógeno
de tiocarbazona distal respecto del grupo tiocarbonilo. Cuando el
metal es radioperrenato reducido o radiopertecnetato reducido, los
dos átomos de azufre y los dos átomos de nitrógeno proporcionan
cuatro posiciones de coordinación para el metal.
Estos compuestos se pueden preparar mediante
métodos que se conocen bien en la técnica de síntesis orgánica.
Así, por ejemplo, los compuestos que tienen la fórmula I se pueden
preparar mediante acoplamiento amida entre un resto de aminoácido
con \alpha-carboxilo protegido que tiene una
cadena lateral que contiene \beta-tiol protegido
o sin proteger (un "aminoácido de tipo cisteína"), y un resto
de tiosemicarbazona que contiene carboxilo. Este acoplamiento se
puede llevar a cabo mediante el uso de métodos conocidos, tales como
acoplamiento mediado por carbodiimida. La desprotección del grupo
\alpha-carboxilo del aminoácido permite el
acoplamiento amida del resto quelante a una cadena lateral de
amina, o al extremo amino, del péptido. De forma alternativa, se
puede acoplar primero al péptido un aminoácido de tipo cisteína
protegido en S y N que tiene una cadena lateral que contiene
\beta-tiol, seguido por desprotección en N y
acoplamiento amida a un resto de tiosemicarbazona que contiene
carboxilo.
Los aminoácidos de tipo cisteína se pueden
preparar mediante métodos estándar de síntesis de aminoácidos. La
configuración en el carbono \alpha puede ser (R) o (S), o el
aminoácido puede ser racémico. De forma similar, la configuración
del carbono \beta cuando se sustituye de manera asimétrica puede
ser (R), (S) o (R/S). El aminoácido se protege para las reacciones
posteriores de acoplamiento mediante el uso de métodos estándar.
Las tiosemicarbazonas se pueden preparar
mediante la condensación de semicarbazidas con compuestos de
carbonilo. En una realización preferida, se hace reaccionar una
tiosemicarbazida con ácido glioxílico para formar la
tiosemicarbazona correspondiente.
El VIP natural tiene la secuencia:
- HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH_{2}
Un barrido de alaninas ha revelado varios
residuos cuya sustitución con alanina no afecta en gran medida a la
unión al receptor. Estos residuos incluyen Lys-15,
Gln-16, Val-19,
Lys-21, Asn-24,
Ser-25 y los extremos N- y
C-terminales. Estas posiciones son sitios posibles
para la fijación de un ligando de unión de metal según la presente
invención.
Los derivados quelantes basados en la fijación
del ligando de unión de metal en estas posiciones incluyen aquellos
con un resto de unión de metal fijado, directamente o por medio de
un grupo espaciador, al farmacóforo por medio de la amina de la
cadena lateral de una lisina u otro residuo de
bis-aminoácido. Los derivados quelantes específicos
de esta estructura general incluyen
en las
que
- \quad
- Ma es ácido mercaptoacético,
- \quad
- PtscG es ácido 2-(4-fenil-3-tiosemicarbazidil)acético o PhNHCSNHNHCH_{2}CO_{2}H,
- \quad
- \gammaAbu es ácido \gamma-aminobutírico, y
- \quad
- en K(PtscGC), los paréntesis indican que los aminoácidos encerrados están fijados a la amina \varepsilon de la lisina y el primer aminoácido fijado es C seguido por PtscG.
En cada uno de los compuestos descritos
anteriormente el resto quelante se debe sustituir por un quelador
de fórmula general I, como se describió anteriormente, para los
fines de la presente invención.
La LHRH natural tiene la secuencia
- <GHWSYGLRPG-NH_{2}
en la que <G es ácido piroglutámico. Se sabe
además que el péptido bicíclico AcNal_{d}Cpa_{d}W_{d}
(ciclo4-10) D (ciclo5-8)
ER_{d}LKPDap-NH_{2} (en el que W_{d} indica
que se usó el isómero D del aminoácido, Nal es
2-naftilalanina, Cpa es
4-clorofenilalanina y Dap es ácido
2,3-diaminopropiónico) se une al receptor de LHRH.
Véase Bienstock et al. J. Med. Chem. 36:3265 (1993). Se sabe
además que la cadena lateral de la posición 6 de LHRH es muy
tolerante a los sustituyentes voluminosos. Véase Barbacci et
al. J. Biol. Chem. 270:9585 (1995). Esta localización es un
sitio posible para la fijación de un ligando de unión de metal según
la presente invención.
Los derivados quelantes lineales basados en la
fijación del ligando de unión de metal en esta posición incluyen
aquellos con un resto de unión de metal fijado, directamente o por
medio de un grupo espaciador, al farmacóforo por medio de la amina
de la cadena lateral de una lisina o de otro residuo de
bis-aminoácido. Los derivados quelantes lineales
específicos de estas estructuras generales incluyen
\vskip1.000000\baselineskip
en las
que:
- \quad
- <G es ácido piroglutámico,
- \quad
- Ma es ácido mercaptoacético
- \quad
- azaG es azaglicocola o H_{2}NNHCH_{2}CO_{2}H,
- \quad
- PtscG es ácido 2-(4-fenil-3-tiosemicarbazidil)acético o PhNHCSNHNHCH_{2}CO_{2}H,
- \quad
- Dap es ácido 2,3-diaminopropiónico
- \quad
- iD es un ácido aspártico acoplado por medio del grupo carboxilo de la cadena lateral,
- \quad
- iE es un ácido glutámico acoplado por medio del grupo ácido de la cadena lateral,
- \quad
- DiGly es HOOCCH_{2}NHCH_{2}COO-,
- \quad
- Mta(hqss) es S-(2,5-dihidroxifenil-S-metil) sulfonioacetilo
- \quad
- C_{a} es una cisteína protegida con Acm
- \quad
- Mta es el metiltioéter del ácido mercaptoacético,
- \quad
- Nal es 2-naftilalanina,
- \quad
- Cpa es 4-clorofenilalanina,
- \quad
- en K_{d}, el subíndice d indica que se usó el isómero D, y
- \quad
- en K(MaGC), los paréntesis indican que los aminoácidos encerrados están fijados a la amina \varepsilon de la lisina y el primer aminoácido fijado es C seguido por G y terminando en Ma.
Además, se pueden preparar complejos de estos
péptidos con metales que no son radiactivos. Tales complejos
incluyen:
En cada uno de los compuestos descritos
anteriormente el resto quelante se debe sustituir por un quelador
de fórmula general I, como se describió anteriormente, para los
fines de la presente invención.
La \alpha-MSH natural tiene la
secuencia:
- Ac-SYSMEHFRWGKPV-NH_{2}.
Se ha demostrado previamente que el péptido
cíclico NleDHF_{d}RWK-NH_{2} (en el que Nle es norleucina
y F_{d} indica D-Phe) tiene una afinidad elevada
por el receptor de \alpha-MSH y se sabe que es
relativamente estable in vivo. Véase
Al-Obeidi et al. J. Amer. Chem. Soc. 111:3413
(1989); Haskell-Luevano et al. J. Med. Chem.
39:432 (1996). La porción subrayada indica los residuos de la
porción ciclada del péptido, y también los extremos de la
estructura cíclica, es decir, el péptido está ciclado mediante un
enlace amida de las cadenas laterales de ácido aspártico y
lisina.
Los derivados quelantes lineales basados en las
estructuras de estos péptidos de unión a receptores de
\alpha-MSH conocidos incluyen aquellos con un
derivado quelante fijado al extremo N-terminal del
péptido, directamente o por medio de un grupo espaciador, tal como
ácido \gamma-aminobutírico
(\gamma-Abu). Los derivados quelantes lineales
específicos con esta estructura general incluyen:
en los que
\gamma-Abu es ácido
\gamma-aminobutírico y R_{n} es un residuo de
arginina
nitrado.
En cada uno de los compuestos descritos
anteriormente el resto quelante se debe sustituir por un quelador
de fórmula general I, como se describió anteriormente, para los
fines de la presente invención.
El proceso para preparar un complejo
quelador-metal/péptido cíclico es análogo al
descrito anteriormente para los péptidos lineales, excepto en que
en algún momento durante o después de la síntesis de la cadena
peptídica se lleva a cabo la ciclación. La ciclación se puede dar
entre dos grupos funcionales cualesquiera del péptido, tales como
los extremos del péptido o las cadenas laterales de los aminoácidos.
La ciclación se puede llevar a cabo mediante formación de disulfuro
o sulfuro, o preferiblemente mediante formación de lactama. La
ciclación selectiva de sitio requiere la desprotección selectiva de
dos grupos funcionales del péptido. Para la formación de lactama
esto requiere el uso de un grupo protector de amino y de carboxilo
que se puedan desproteger en presencia de otros grupos protectores
de amino y de carboxilo. Esta tarea se hace más difícil cuando la
síntesis del péptido también requiere que se lleve a cabo la
desprotección selectiva entre estos otros grupos protectores. Por
lo tanto, se ha comprobado que es difícil llevar a cabo en la
práctica una estrategia de grupos protectores tan sofisticada.
Los métodos de la presente invención permiten
que tanto la ciclación como el acoplamiento del resto quelador al
péptido se lleven a cabo en cualquier momento durante la síntesis
del péptido. El uso de grupos protectores apropiados permite que la
síntesis del péptido, la construcción del ligando y la ciclación del
péptido se lleven a cabo en cualquier orden que se desee. Esta
aproximación es más eficaz que los métodos en fase sólida que
ciclan el péptido separado de la resina, o que los métodos que fijan
los ligandos en disolución tras la síntesis del péptido cíclico.
Los métodos de la presente invención se pueden
usar en fase líquida, pero preferiblemente se llevan a cabo
mediante el uso de un sintetizador de péptidos automatizado en fase
sólida. El uso de un sintetizador automatizado de
multi-pocillos permite preparar de manera simultánea
un gran número de péptidos, que difieren en el punto de fijación
del resto de quelador o en el sitio de ciclación. Las denominadas
"bibliotecas combinatorias", en las que los péptidos que
contienen ligandos se desprotegen mientras todavía están fijadas al
soporte sólido, se pueden hacer reaccionar con el metal apropiado
para formar complejos y después cribarlas en un ensayo de
bioactividad adecuado para seleccionar el compuesto que tiene las
características deseadas óptimas de unión a receptor y
estabilidad.
La síntesis combinatoria se puede llevar a cabo
en síntesis "divididas" o mediante síntesis "paralelas".
En la síntesis dividida, los intermedios del péptido sintético
unidos a microesferas se subdividen en diferentes grupos para la
adición del siguiente aminoácido en cada etapa sucesiva. Después de
cada etapa las microesferas se dividen en grupos diferentes para la
siguiente reacción. En la síntesis paralela, se sintetizan
compuestos diferentes en recipientes de reacción diferentes, tales
como los pocillos de un sintetizador de péptidos. La síntesis
dividida proporciona cantidades pequeñas de un gran número de
compuestos, mientras la síntesis paralela proporciona cantidades
mayores de un número más pequeño de compuestos.
La síntesis combinatoria también requiere que
cada compuesto individual se marque de alguna manera para que se
pueda identificar en la etapa de cribado. Se conocen en la técnica
diversos medios para marcar compuestos para este fin. Por ejemplo,
se usan compuestos aromáticos halogenados inertes como marcadores
que se pueden identificar mediante cromatografía de gases. Véase
Borman, Chem. Eng. News 74:29 (1996).
En una realización preferida de la invención, la
ciclación se lleva a cabo mediante formación de lactama. Lo más
preferiblemente, la función amino se protege mediante el uso de un
grupo Aloc, y la función carboxilo se protege como un grupo éster
de alilo. Esto permite la desprotección simultánea de las funciones
amino y carboxilo mediante el uso de
Pd(PPh_{3})_{4} en presencia de un nucleófilo para
el grupo alilo. El nucleófilo usado generalmente es hidruro de
tri-n-butil estaño
(''Bu_{3}SnH).
Antes de la presente invención se sabía que las
aminas reaccionarían con los iones alilo mediante catálisis con
Pd^{0}. Véase, por ejemplo, Roos et al., J. Org. Chem.
60:1733 (1995) y Heck, PALLADIUM REAGENTS IN ORGANIC SYNTHESES,
Academic Press, 1995, págs. 122-131. Los presentes
inventores descubrieron que esto provocaba un problema para la
desprotección simultánea de las funciones amino y carboxilo
protegidas con alilo, debido a la reacción secundaria en la que la
función amino recién desprotegida se alquilaba con el grupo alilo.
Se descubrió, sin embargo, que la adición de piperidina como
aceptor de grupos alilo durante la reacción de escisión de Aloc
catalizada con Pd inhibió esta reacción secundaria indeseada. Esto
permitió la desprotección, por ejemplo, de las cadenas laterales de
ácido aspártico y lisina de forma selectiva y simultánea, a la vez
que se reducía en gran medida la formación de la
N^{t}-alil lisina indeseada. Los expertos en la
técnica reconocerán que otras aminas primarias o secundarias
también serán aceptores adecuados de grupos alilo.
Este método es útil y ventajoso porque es
compatible con la síntesis de péptidos basada en Fmoc. Permite la
preparación de péptidos cíclicos en resinas HMP y PAM en las que se
puede usar la protección de cadenas laterales con Boc o Fmoc además
de la protección de cadenas laterales con Aloc. Esta técnica permite
además la síntesis de péptidos cíclicos que contienen un ligando de
unión de metal fijado a la cadena lateral de un aminoácido en
cualquier punto de una cadena peptídica. Así, se usan tres grupos
protectores de nitrógeno ortogonales: uno para construir la cadena
peptídica, tal como Fmoc o Boc; un segundo para fijar un ligando de
unión de metal a una cadena lateral de un
bis-aminoácido tal como
4-metiltritilo (mtt) o
1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo
(Dde); y un tercero, tal como Aloc, para llevar a cabo la ciclación
de cadena lateral a cadena lateral. Se pueden usar otros grupos
protectores, tales como grupos Boc, Cbz, ^{t}Bu y bencilo para la
protección de otras funciones amino y carboxilo de cadenas
laterales que no se desprotegen hasta que ha finalizado la síntesis
del péptido. Las combinaciones de estos grupos protectores permiten
el uso de resinas de tipo Rink, Wang, Merrifield, PAM y HMP para la
síntesis de péptidos en fase sólida. La escisión de los péptidos de
la resina se puede llevar a cabo con ácido trifluoroacético (para
las síntesis basadas en Fmoc) o HF o trifluorometanosulfonato de
trimetilsililo (para las síntesis basadas en Boc).
Los péptidos cíclicos de la invención tienen una
longitud de 4 a 100 residuos, y tienen hasta 5 grupos quelantes de
metales. Los péptidos pueden contener regiones cicladas que tienen
una longitud de entre 2 y 60 aminoácidos, y pueden contener más de
una porción cíclica.
La ciclación se da preferiblemente entre cadenas
laterales amino y carboxilo de aminoácidos para formar puentes de
lactama, pero también puede ser entre una amina de cadena lateral y
el extremo carboxilo para formar un puente de lactama, entre un
ácido de cadena lateral y la amina N-terminal para
formar lactama, entre tioles para formar puentes disulfuro, entre
hidrazinas y ésteres para formar hidrazidas, entre hidrazinas y
aldehídos para formar hidrazonas, entre un tiol y un grupo saliente
adecuado para formar un sulfuro, o entre un grupo hidroxilo y otro
grupo saliente adecuado para formar un éter. Cuando hay presente más
de una región cíclica en el compuesto, los puentes de las regiones
cíclicas pueden ser del mismo o de diferentes tipos.
Cuando se debe formar un disulfuro cíclico, el
péptido de interés se sintetiza preferiblemente mediante el uso de
protección con Acm en los tioles y protección con Aloc en las
cadenas laterales de amino. El Aloc se escinde y el ligando
quelante se acopla al péptido. El grupo Acm se escinde después y el
disulfuro se cicla mediante el uso de trifluoroacetato de talio. De
forma alternativa, los tioles se pueden proteger mediante el uso de
grupos S-tritilo, y la ciclación se puede llevar a
cabo en disolución tras la escisión de la resina.
La preparación de un sulfuro cíclico se puede
llevar a cabo, por ejemplo, mediante ciclación de un tiol con una
función \alpha-haloamido presente en una cadena
lateral de amina. Así, por ejemplo, el péptido se puede sintetizar
con protección con Fmoc en el extremo N-terminal y
protección con S-tritilo en el tiol. Una cadena
lateral de lisina protegida con Aloc se desprotege después y el
quelador se acopla a la lisina como se describió anteriormente. El
Fmoc se escinde y se hace reaccionar con cloruro de cloroacetilo o
un reactivo equivalente. Si se usa una resina estable en ácidos tal
como la resina BromoWang fotoescindible, Wang, J. Org. Chem. 41:3258
(1976), el grupo protector de tiol se elimina y el péptido se cicla
en la resina.
Se preparan sulfuros cíclicos entre residuos de
las cadenas laterales mediante el uso de un grupo protector
adecuado en el extremo N-terminal del péptido que
permite la desprotección selectiva en dos cadenas laterales amino
protegidas de forma diferencial. Por ejemplo, el extremo
N-terminal se puede proteger con un grupo acetilo o
Boc, y las cadenas laterales se pueden proteger con grupos Fmoc y
Aloc. Tras la síntesis del péptido, se desprotege selectivamente
una cadena lateral de aminoácido (por ejemplo, Fmoc) y se acopla con
el resto de quelato como se describió anteriormente. Otra cadena
lateral amino (por ejemplo Aloc o Dde) se desprotege después y se
acopla a un electrófilo de sulfuro tal como haloacetilo o maleimida.
El grupo protector en el azufre de interés se escinde y se lleva a
cabo la ciclación en la resina mediante el uso de un catalizador
básico. De forma alternativa, el péptido se puede escindir y la
ciclación se puede llevar a cabo en disolución.
La \alpha-MSH natural tiene la
secuencia Ac-SYSMEHFRWGKPV-NH_{2}.
Se ha demostrado previamente que el péptido cíclico
NleDHF_{d}RWK -NH_{2} (en el que Nle es norleucina y
F_{d} indica D-Phe) tiene una afinidad elevada
por el receptor de \alpha-MSH y se sabe que es
relativamente estable in vivo. Véase
Al-Obeidi et al. J. Amer. Chem. Soc.
111:3413 (1989); Haskell-Luevano et al. J.
Med. Chem. 39:432 (1996). La porción subrayada indica los residuos
de la porción ciclada del péptido, y también los extremos de la
estructura cíclica, es decir, el péptido está ciclado mediante un
enlace amida de las cadenas laterales de ácido aspártico y lisina.
La estructura cíclica se usa como base para construir péptidos
marcados según la presente invención.
Los derivados quelantes cíclicos basados en la
estructura del ligando de unión a receptor de
\alpha-MSH conocido incluyen aquellos con un
derivado quelante fijado al extremo N-terminal del
péptido, directamente o por medio de un grupo espaciador, tal como
ácido \gamma-aminobutírico
(\gamma-Abu). Los derivados quelantes específicos
de esta estructura general incluyen:
en las
que
Ma es ácido mercaptoacético,
\gammaAbu es ácido
\gamma-aminobutírico,
PtscG es ácido
2-(4-fenil-3-tiosemicarbazidil)acético,
y
DTPA es ácido dietilentriaminpentaacético.
En cada uno de los compuestos descritos
anteriormente el resto quelante se debe sustituir por un quelador
de fórmula general I, como se describió anteriormente, para los
fines de la presente invención.
El VIP natural tiene la secuencia:
- HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN-NH_{2}
Se cree que el VIP nativo forma una estructura
helicoidal en disolución. Véase Musso et al. Biochemistry
27:8174 (1988). La estructura helicoidal putativa se puede
estabilizar mediante ciclación intramolecular por medio de las
cadenas laterales de residuos colocados en proximidad espacial por
la estructura helicoidal. Los ejemplos incluyen:
(en los que Nle es norleucina).
Véase O'Donnell et al. J. Pharm. Exp. Ther. 270:1282; patente
de EE.UU. nº 4.822.890; Bolin, sol. de pat. eur. 0 536 741 A2. La
porción subrayada indica los residuos de la porción ciclada del
péptido, y también los extremos de la porción ciclada, es decir, el
péptido se cicla por medio de la formación de un enlace amida entre
las cadenas laterales del ácido aspártico y de la lisina. Estas
estructuras cíclicas se usan como base para construir péptidos
marcados según la presente
invención.
Los derivados quelantes cíclicos basados en
estas estructuras incluyen aquellos con un resto de unión de metal
fijado, directamente o por medio de un grupo espaciador, al
farmacóforo por medio de la amina de la cadena lateral de una
lisina u otro residuo de bis-aminoácido. Los
derivados quelantes específicos de esta estructura general
incluyen
En cada uno de los compuestos descritos
anteriormente el resto quelante se debe sustituir por un quelador
de fórmula general I, como se describió anteriormente, para los
fines de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
1
Se suspendió
N^{\varepsilon}-Fmoc-L-lisina
(10,00 g, 27,1 mmoles, 100% mol, Bachem Biosciences, Inc.) en
dioxano (100 ml) y Na_{2}CO_{3} (1 M, 33 ml) para formar una
suspensión lechosa. Se añadió cloroformato de alilo (3,2 ml, 30,2
mmoles, 111% mol) a dioxano (10 ml) y esta disolución se añadió gota
a gota a la suspensión de
N^{\varepsilon}-Fmoc-L-lisina
durante 10 min. Se añadió carbonato sódico (1 M, 20 ml) en dos
porciones y se añadió una cantidad adicional de cloroformato de
alilo (0,3 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante
16 horas. Los disolventes volátiles se eliminaron a presión reducida
y el residuo se lavó con éter dietílico (50 ml). El líquido
residual se acidificó después con HCl (1 M) y se extrajo con acetato
de etilo (2x150 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron
con NaCl saturado (50 ml), se secaron con Na_{2}SO_{4} y se
evaporaron a presión reducida para obtener un producto oleoso bruto
(16 g). El producto bruto se disolvió en éter (100 ml) y se formó
un sólido blanco que se extrajo mediante filtración. El disolvente
del filtrado se eliminó a presión reducida para proporcionar un
aceite amarillo pálido viscoso (8,34 g, 68% de rendimiento) que
finalmente formó un sólido vítreo.
Ejemplo de referencia
2
Se disolvió ácido
2-(trifenilmetilmercapto)acético (20,35 g, 60,9 mmoles, 100%
mol) en THF anhidro (150 ml) y se refrigeró en un baño de agua
helada. Se añadió carbazato de t-butilo (8,61 g,
65,1 mmoles, 107% mol) a la disolución de reacción seguido de
diisopropilcarbodiimida (10,0 ml, 63,9 mmoles, 105% mol). La
reacción se dejó calentar lentamente a temperatura ambiente y se
agitó durante 28 horas. La mezcla de reacción se filtró para
eliminar el precipitado blanco que se había formado, y el filtrado
se concentró hasta una espuma blanca mediante la eliminación del
disolvente a presión reducida. Este material se disolvió en
cloroformo (75 ml). Después se añadió ácido acético (75 ml) seguido
de la adición de eterato de trifluoruro de boro (10,0 ml, 81
mmoles, 134% mol). La reacción se agitó a temperatura ambiente
durante 6 horas y después se paró vertiendo la mezcla de reacción
en agua (200 ml) que contenía acetato sódico (30 g). Esta mezcla se
extrajo con cloroformo (2x100 ml). Las capas orgánicas se
combinaron, se lavaron con disolución saturada de NaCl (150 ml), se
secaron con Na_{2}SO_{4} y se filtraron. El disolvente se
eliminó a presión reducida para obtener un aceite dorado pálido que
se solidificó en reposo. El sólido se suspendió en éter
dietílico/hexanos 1:1 (200 ml) y se recogió mediante filtración. El
sólido se lavó con una cantidad adicional de éter dietílico/hexanos
1:1 (100 ml) y se secó para proporcionar el producto deseado (15,44
g, 73% de rendimiento) que tenía un valor de MH^{+} mediante ESMS
calculado de 349, observado de 349.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
3
Se disolvió monohidrato de ácido glioxílico
(0,59 g, 6,41 mmoles, 110% mol) en metanol (20 ml) y se añadió
2-(trifenilmetilmercapto)acetil hidrazida (2,03 g, 5,82
mmoles, 100% mol). Se añadió dioxano (20 ml) a la mezcla de
reacción turbia y la reacción se agitó a temperatura ambiente
durante 18 horas. Se añadió borohidruro sódico (1,76 g) a la mezcla
de reacción y después de 30 minutos se añadió otra cantidad de
borohidruro sódico (0,60 g). La reacción se agitó durante 3 horas a
temperatura ambiente, después se paró vertiendo la mezcla de
reacción en HCl (1 M, 60 ml). La mezcla se extrajo con acetato de
etilo (2x50 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con
disolución saturada de NaCl (40 ml), se secaron con
Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron a presión reducida
en rotavapor para proporcionar un sólido (2,5 g) que tenía un valor
de MH^{+} mediante ESMS calculado de 407, hallado de 407.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
4
Se disolvió
N^{\beta}-[2-(trifenilmetiltio)acetil]azaglicocola
(2,39 g, 5,89 mmoles, 100% mol) en dioxano (50 ml). Se añadió
dicarbonato de di-t-butilo
(BOC)_{2}O, (2,07 g, 9,48 mmoles, 161% mol) a la disolución
de reacción seguido por la adición de Na_{2}CO_{3} (1 M, 15
ml). Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15
minutos, y después se añadieron cantidades adicionales de
Na_{2}CO_{3} (1 M, 10 ml) y (BOC)_{2}O (1,41 g). La
disolución se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y
después se hizo reaccionar con NaOH (6 M, 3 ml) y
(BOC)_{2}O (1,4 g) durante 1 hora. La mezcla de reacción
bruta se acidificó después hasta pH 3 con ácido cítrico (1 M) y se
extrajo con acetato de etilo (200 ml). La capa orgánica se lavó con
disolución saturada de cloruro sódico (60 ml), se secó con
Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró a presión reducida para
obtener el producto bruto. El producto bruto se disolvió en éter y
se diluyó para obtener una mezcla 1:1 con hexanos que provocó que
se formase un precipitado blanco. El sólido blanco se recogió
mediante filtración para obtener el producto deseado (1,48 g, 50%
de rendimiento) que tenía un valor de MH^{+} mediante ESMS
calculado de 507, hallado de 507.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
5
Se suspendió
4-fenil-3-tiosemicarbazida
(6,02 g, 36 mmoles, 100% mol) en metanol (40 ml). Se añadió
monohidrato de ácido glioxílico (3,32 g, 36,1 mmoles, 100% mol) y
la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se
añadió cuidadosamente borohidruro sódico (1,50 g), y la mezcla de
reacción burbujeó vigorosamente. La mezcla de reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 1 hora, y después se añadió NaBH_{4}
(0,66 g), seguido por la adición de ácido acético glacial (6 ml).
Después de 15 minutos se añadió NaBH_{4} (1,08 g), y la reacción
se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. Después se añadió
una cantidad adicional de NaBH_{4} (1,66 g) y la reacción se
agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, antes de pararla con
HCl (1 M, 200 ml). La mezcla se extrajo después con acetato de etilo
(2x150 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con
disolución saturada de NaCl (100 ml), se secaron con
Na_{2}SO_{4}, se filtraron, y el disolvente se eliminó a
presión reducida para proporcionar un sólido amarillo (9,03 g) que
tenía un valor de M-H^{+} mediante ESMS en modo
de ión negativo calculado de 224, hallado
de 224.
de 224.
\newpage
Ejemplo de referencia
6
Se disolvió ácido
2-(4-fenil-3-tiosemicarbazidil)acético
(8,93 g, 37,9 mmoles, 100% mol) y (BOC)_{2}O (9,10 g) en
dioxano (100 ml). Se añadió carbonato sódico (1 M, 50 ml) y agua (50
ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. Se
añadió hidróxido sódico (1 M, 40 ml) y una cantidad adicional de
(BOC)_{2}O (6,21 g), y la reacción se agitó durante la
noche a temperatura ambiente. La reacción se paró con ácido cítrico
(1 M) y se extrajo con acetato de etilo (2x100 ml). Las capas
orgánicas se combinaron, se lavaron con NaCl saturado (50 ml), se
secaron con Na_{2}SO_{4}, y se filtraron. El filtrado se
concentró a presión reducida para proporcionar un sólido gomoso (19
g). El sólido bruto se suspendió en éter y se recogió mediante
filtración un sólido blanco. El sólido se lavó con éter (100 ml)
para obtener el producto deseado (3,17 g) que tenía un valor de
MH^{+} mediante ESMS calculado de 326, hallado de 326.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
7
Se condensó carbazato de
t-butilo con monohidrato de ácido glioxílico en
metanol. Esta hidrazona bruta se redujo después mediante
hidrogenación catalítica con un 10% de Pd/C. Este producto se mezcló
después con dioxano y base y se añadió gota a gota una disolución
en dioxano de cloruro de trifenilmetanosulfenilo. La
N^{\alpha}-(trifenilmetilsulfenil)-N^{\beta}-(Boc)azaglicocola
deseada (25 g) se obtuvo tras el tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de referencia
8
Se llevó a cabo la síntesis peptídica en fase
sólida a una escala de 0,050 mmoles mediante el uso de un
sintetizador de péptidos modelo 348 de Advanced ChemTech modificado
para operar en atmósfera de nitrógeno de la misma manera que el
modelo 396. Se emplearon los grupos aliloxicarbonilo (Aloc) y
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) para la
protección de nitrógenos, y se usaron diisopropilcarbodiimida
(DIC)/hidroxibenzotriazol (HOBT) para activar los grupos carboxilo
para el acoplamiento. Se usó una diversidad de resinas tales como
Rink, Pal, y TentaGel S RAM para las amidas
C-terminales y Wang, 2-clorotritilo
o TentaGel S PHB para los ácidos C-terminales.
Para permitir la introducción del resto de
quelato de unión de metal y/o para permitir la ciclación por medio
de cadenas laterales de aminoácidos desprotegidas selectivamente, se
usó un bis-aminoácido protegido de forma
diferencial para la síntesis del péptido. Los derivados de
bis-aminoácidos protegidos de forma diferencial
elegidos fueron
\alpha-Aloc-Lys(\varepsilon-Fmoc)OH
y
\alpha-Fmoc-Lys(\varepsilon-Aloc)OH.
El derivado
\alpha-Aloc-Lys(\varepsilon-Fmoc)OH
permitió que los fragmentos de ligando se introdujeran en la cadena
lateral mediante el uso de un procedimiento rutinario con Fmoc.
Los grupos Aloc se escindieron en el aparato en
el modo manual lavando el péptido unido a la resina con
diclorometano (3x porciones de 2 ml) y después mezclando la resina
con una disolución (2 ml) que contenía
tetrakis(trifenilfosfina)paladio[0] (10 mg) y
ácido acético (0,1 ml). Después se añadió hidruro de tributilestaño
(0,3 ml) y la mezcla se agitó en vórtex durante una hora. La célula
de reacción se vació después, la resina se lavó con diclorometano (3
x 2 ml) y después se reanudó la síntesis con Fmoc estándar. Los
péptidos se escindieron de la resina con una disolución de ácido
trifluoroacético (TFA), anisol y etanoditiol durante 1 a 3 horas en
la proporción 23:3:1. La mezcla de escisión bruta se vertió después
en éter para precipitar el péptido bruto, que se purificó después
mediante HPLC de fase inversa mediante el uso de un sistema de
cartuchos Prep Pak C-18 de Waters Delta Pak eluidos
con un gradiente apropiado de TFA (0,1%) en agua y/o TFA (0,1%) en
acetonitrilo (90%) y agua (10%). Se recogieron las fracciones que
contenían los péptidos purificados deseados, y los disolventes
volátiles se eliminaron a presión reducida para obtener las
disoluciones acuosas de los péptidos que después se liofilizaron.
Las muestras de los productos liofilizados se mandaron después a
analizar mediante electronebulización (ESMS) o bombardeo con átomos
rápidos (FABMS) para confirmar que la masa observada de los
productos coincidía con la masa calculada del péptido deseado.
La siguiente tabla muestra algunas de las
secuencias de los péptidos de referencia sintetizados mediante los
métodos descritos anteriormente.
- <G:
- ácido piroglutámico
- PtscG:
- ácido 2-(4-fenil-3-tiosemicarbazidil)acético o PHNHCSNHNHCH_{2}CO_{2}H
- Ma:
- ácido mercaptoacético
- azaG:
- azaglicocola o H_{2}NNHCH_{2}CO_{2}H
- Dap:
- ácido 2,3-diaminopropiónico
- \gammaAbu:
- ácido \gamma-aminobutírico
- Nal:
- 2-naftilalanina
- Cpa:
- 4-clorofenilalanina
- K_{d}:
- el subíndice d indica que se usó el isómero D
- K(MaGC):
- los paréntesis indican que los aminoácidos encerrados están fijados a la amina \varepsilon de la lisina y el primer aminoácido fijado es C seguido por G y terminando en Ma
- iD:
- ácido isoaspártico
- iE:
- ácido isoglutámico
Otros péptidos de referencia y péptidos que
están dentro del alcance de la reivindicación 1 que tienen como
resto de unión de radiometal TscGC o MtscGC sintetizados mediante
estos métodos incluyen:
La porción subrayada de la secuencia es cíclica.
TscG es 3-tiosemicarbazonilglioxilo, es decir
H_{2}NCSNHNCHCO-
MtscG es
4-metil-3-tiosemicarbazonilglioxilo,
es decir CH_{3}NHCSNHCHCO-
Ma es mercaptoacetilo: HSCH_{2}CO-
Los grupos enumerados entre paréntesis están
fijados a la cadena lateral del aminoácido a la izquierda del
paréntesis.
Ejemplo de referencia
9
El método para sintetizar péptidos cíclicos se
demostró preparando el análogo cíclico de la hormona estimulante de
melanocitos \alpha (\alphaMSH)
MaGC\gamma-AbuNleDHF_{d}RWK-NH_{2},
en la que el subrayado indica que la secuencia del péptido está
ciclada en forma de una lactama por medio de las cadenas laterales
de ácido aspártico y lisina. Los residuos a usar para la ciclación
se protegieron en sus cadenas laterales como el grupo Aloc (para la
lisina) y como el éster de alilo (para el aspartato). El péptido se
construyó mediante el uso de la química de Fmoc como se describió
anteriormente, en una resina Rink amida basada en poliestireno.
Primero se llevó a cabo la desprotección de
alilo y de Aloc mediante el uso de
Pd(PPh_{3})_{4}, ácido acético y Bu_{3}SnH en
ausencia de piperidina como aceptor de grupos alilo. Tras la
escisión de los grupos protectores de las cadenas laterales, la
resina se lavó y el péptido parcialmente protegido se cicló mediante
el uso del método descrito por Felix et al., Int. J. Peptide
Protein Res. 32:441 (1988). El péptido se escindió después de la
resina y se purificó para aislar la amida cíclica sustituida con
N-alilo como el único péptido puro de la mezcla de
productos.
La reacción de escisión de Aloc se modificó
después mediante la adición de piperidina como aceptor de grupos
alilo.
Cuando los grupos Aloc y alilo se escindieron se
usó una mezcla que contenía 0,5 ml de ácido acético glacial, 10 ml
de diclorometano, 0,0563 g de
tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0), más 1,0 ml de
piperidina como aceptor de grupos alilo. Cada pocillo del
sintetizador de péptidos contenía 0,05 mmoles de péptido en resina
Rink, y se trató con 0,3 ml/pocillo de hidruro de tributilestaño a
temperatura ambiente durante 1 h con agitación en vórtex. La resina
se lavó con: 2x2 ml/pocillo de diclorometano, 2x1 ml/pocillo de
metanol, 2x1 ml/pocillo de diisopropiletil amina, y 3x1 ml/pocillo
de NMP tras la escisión de los grupos protectores de las cadenas
laterales. Las cadenas laterales del péptido se acoplaron después
mediante el método de Felix anteriormente mencionado (15 h,
mediante el uso de BOP y DIEA). El péptido se escindió y se purificó
como se describió anteriormente para proporcionar un péptido puro
con el valor de MH^{+} deseado mediante ESMS de 1302. El producto
secundario N-alilado se observó solamente en
cantidades mínimas.
Ejemplo de referencia
10
Se reconstituyó un vial de Glucoscan (DuPont)
con 2,18 mCi de NaTcO_{4} en 1 ml de solución salina para formar
el complejo ^{99m}Tc-gluceptato. Se preparó
<GHWSYK(MaGC)LRPG amida (IMP3) como se describió
anteriormente. Se preparó ^{99m}Tc-IMP3 mezclando
360 \mul (874 \muCi) de ^{99m}Tc-gluceptato
con 640 \mul de péptido en solución salina. El precipitado
formado inicialmente desapareció tras calentar durante 15 min a
75ºC. Una tira de TLC instantánea (ITLC) desarrollada con mezcla
H_{2}O:EtOH:NH_{4}OH (5:2:1) mostró un 6,2% de la actividad en
el origen como coloide. La HPLC mostró un 100% de la actividad
asociada al péptido con un TR de 6,95 min, mientras el péptido sin
marcar eluyó a los 6,4 min en las mismas condiciones de HPLC
(columna C-18 de fase inversa, gradiente de
0-100% de B en 10 min a un caudal de 3 ml/min, en el
que A es un 0,1% de TFA en H_{2}O y B es un 90% de CH_{3}CN,
0,1% de TFA). La recuperación de la columna de HPLC fue del 85% de
la actividad inyectada.
IMP3 se formuló y se liofilizó para el marcado
con ^{99m}Tc en las cantidades mostradas a continuación:
en la que \alphaDG es
\alpha-D-glucoheptonato. Los
viales liofilizados se reconstituyeron con \sim900 \muCi de
NaTcO_{4} en solución salina. Se observó turbidez en todos los
viales. Los viales se calentaron durante 15 min a 75ºC, pero la
turbidez persistió. El análisis mediante ITLC de los coloides mostró
coloides del 14, 21 y 9% en el origen para los viales 1, 2 y 3,
respectivamente.
Para evitar la precipitación durante el marcado
con ^{99m}Tc, se variaron las proporciones de
\alpha-D-glucoheptonato
(\alphaDG) y tartrato respecto de Sn (II) en los viales
liofilizados. Se formularon y se liofilizaron los siguientes viales
(250 \mug de IMP3 con 25 \mug de Sn(II)) con las
proporciones de tartrato y \alphaDG mostradas más adelante. Los
viales se reconstituyeron con \sim500 \muCi de NaTcO_{4} en 1
ml de solución salina. Las observaciones se indican en la columna
de observaciones. Las tiras de ITLC se desarrollaron después de 15
min a temperatura ambiente tras el calentamiento a 75ºC durante 15
min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repitió el protocolo anterior para los viales
3, 7 y 8 y se determinó que los coloides eran de un 5,3, 3,8 y
4,6%, respectivamente, después de calentar 15 min a 75ºC. Se observó
un único máximo ancho en una columna de HPLC inversa a un TR de 7
min.
La solubilidad de los péptidos que son poco
solubles en solución salina sola se incrementa mediante la adición
de un agente solubilizante tal como etanol o
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina.
Los resultados de marcar otros péptidos de
referencia con tecnecio-99 se muestran en la
siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
En un método de marcado alternativo, se
formularon disoluciones diluidas (30 \mug/ml) del péptido en
equipos de marcado antes de la adición de pertecnetato. La
disolución final contuvo el péptido, un 10% de
hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
(HPCD), glucoheptonato 200 mM, tampón acetato 21 mM de pH 5,3, 2 mg
de ácido ascórbico y 100 \mug de cloruro estañoso en 1,5 ml de
volumen total. En otras formulaciones se añadieron dos equivalentes
de ión estañoso respecto del péptido en un tampón que contenía un
15% de HPCD, glucoheptonato 200 mM y tampón acetato 21 mM de pH
5,6.
Ejemplo de referencia
11
Se sintetizó IMP3,
(<GHWSYK(MaGC)LRPG amida) como anteriormente. IMP3
tiene un tiempo de retención de 6,4 min en una columna
C-18 de fase inversa mediante el uso de un gradiente
de 0-100% de B en 10 min a un caudal de 3 ml/min en
el que A es un 0,1% de TFA en H_{2}O y B es un 90% de CH_{3}CN,
0,1% de TFA.
IMP3 se formuló en cantidades de 1 mg y 250
\mug con 450 \mug de Sn(II) y
\alpha-D-glucoheptonato en una
proporción de 1:17,5, y se liofilizó. Los viales liofilizados de
IMP3 (1 mg y 250 \mug) se reconstituyeron con 617 y 578 \muCi
de NaReO_{4} en solución salina. Los viales se calentaron durante
15 min a 75ºC. El análisis mediante HPLC en las condiciones
descritas anteriormente mostró máximos únicos a un TR de 7,0 min
para ambos viales. El líquido de salida se recogió y se contó en un
contador \gamma. Para el vial de 1 mg, la recuperación de la
actividad fue de un 88%, mientras que la recuperación fue de un 77%
para el vial de 250 \mug. Los análisis del coloide en una tira de
ITLC desarrollada en H_{2}O:EtOH:NH_{4}OH (5:2:1) mostraron un
1,4 y un 1,2% de la actividad en el origen para los viales de 1 mg y
de 250 \mug, respectivamente.
El marcado con ^{188}Re a temperatura ambiente
no se desarrolló tan bien como a 75ºC. A temperatura ambiente,
solamente se incorporó un pequeño porcentaje de la actividad
(<5%) al péptido, y el resto de la actividad eluyó en el volumen
muerto (1,2 min).
Ejemplo de referencia
12
Se usaron las líneas celulares de adenocarcinoma
de mama humano MCF-7,
SK-BR-3 y
MDA-MB-231 para ensayar los
análogos de LHRH marcados con radiometal. Se usaron células HT29
para ensayar los análogos de VIP marcados. Todas las líneas
celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection,
Rockville, MD. Las células se cultivaron en DMEM complementado con
un 5% de suero bovino fetal, 5% de suero equino definido, penicilina
(100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y
L-glutamina (2 mM). Se realizó un pase rutinario de
las células tras el desprendimiento con tripsina y un 0,2% de
EDTA.
Se determina la especificidad de los péptidos
análogos de LHRH sin marcar mediante ensayos de unión competitiva a
células. Las células seleccionadas como objetivo se lavan con medio
nuevo, y se ajustan a 5 x 10^{5} células/ml. Se añaden 100 \mul
de la suspensión celular (100 \mul) por pocillo a una placa de
microtitulación de 96 pocillos. Se deja que las células se fijen y
después se tratan con concentraciones diferentes de los péptidos en
presencia de ^{125}I-LHRH (Amersham Life Science,
Arlington Heights, IL, 2.000 Ci/mmol). Después de una incubación de
2 h a temperatura ambiente con agitación, las células se lavan dos
veces y se cuenta la radiactividad asociada a las células, y se
compara la concentración de los péptidos que provoca un 50% de
inhibición de la unión de la LH-RH marcada.
Para determinar las constantes de unión al
receptor, se incuban diluciones en serie de LHRH radiomarcada con 5
x 10^{5} células en una placa de 96 pocillos. Todos los ensayos se
realizan por triplicado con y sin una concentración elevada de LHRH
sin marcar para permitir la determinación del péptido unido de forma
específica. Después de una incubación de 2 h a temperatura
ambiente, las células se lavan y se cuentan. Se determina la
constante de asociación en equilibrio, K_{D}, y el número total de
sitios receptores por célula mediante el análisis de Scatchard.
Para ensayar los análogos de VIP y sus complejos
metálicos se usa el protocolo descrito por Virgolini et al.
(Cancer Res. 54:690 (1994)). Brevemente, se mezcla
^{125}I-VIP con concentraciones crecientes de
péptido de ensayo en una disolución de tampón de unión, tras lo cual
se añade cada disolución a células HT29 en una placa de cultivo de
48 pocillos. Cada concentración se ensaya por triplicado. Las
células se incuban a 4ºC durante 2 h, seguido por tres lavados con
tampón de unión helado. Las células se lisan después con NaOH 2 M
durante 5 min y el líquido del pocillo se extrae con una torunda de
algodón. La actividad de la torunda de algodón se cuenta mediante
el uso de un contador \gamma.
Claims (20)
1. Un péptido que comprende un resto de unión de
radiometal, en el que dicho resto de unión comprende la
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1}, R^{2} y
R^{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, cicloalquilo,
cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, arilo, arilo
sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, y un
grupo protector que se puede eliminar en condiciones de síntesis
peptídica, con tal de que al menos uno de R^{1}, R^{2} o R^{3}
sea
H,
R^{5}, R^{7}, R^{8}, R^{9} y R^{10} se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo
C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, arilo y arilo
sustituido, y R^{4} y R^{6} juntos forman un enlace directo, y
R^{8} y R^{9} juntos o R^{7} y R^{9} juntos pueden formar un
anillo cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, y
en la que NR^{10} está localizado en el
extremo N-terminal de dicho péptido, o está
localizado en una cadena lateral de aminoácido de dicho
péptido.
2. Un péptido según la reivindicación 1, en el
que R^{1} es H.
3. Un péptido según la reivindicación 1, en el
que R^{3} es H.
4. Un péptido según la reivindicación 1, en el
que R^{5} es H.
5. Un péptido según la reivindicación 1, en el
que NR^{10} está localizado en el extremo
N-terminal de dicho péptido.
6. Un péptido según la reivindicación 1, en el
que NR^{10} está localizado en una cadena lateral de aminoácido
de dicho péptido.
7. Un péptido según la reivindicación 2, en el
que R^{2} es alquilo C_{1}-C_{6} o fenilo
sustituido o sin sustituir.
8. Un péptido según la reivindicación 2, en el
que R^{2} es H.
9. Un péptido según la reivindicación 8, en el
que R^{3} es H.
10. Un péptido según la reivindicación 9, en el
que R^{5} es H.
11. Un péptido según la reivindicación 10, en el
que R^{7}, R^{8} y R^{9} son cada uno H.
12. Un péptido según la reivindicación 11, en el
que R^{2} es fenilo.
13. Un péptido según la reivindicación 11, en el
que R^{2} es metilo.
14. Un péptido según la reivindicación 1, en el
que R^{8} y R^{9} son metilo.
15. Un péptido según la reivindicación 1, que
comprende además un átomo de metal unido.
16. Un péptido según la reivindicación 15, en el
que dicho átomo de metal se selecciona del grupo que consiste en
^{99m}Tc, ^{186}Re y ^{188}Re.
17. Un método para preparar una composición
quelante de metal, que comprende poner en contacto una disolución
de un péptido que comprende un resto de unión de radiometal con
iones estañosos, en el que dicho resto de unión de radiometal
comprende la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1}, R^{2} y
R^{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, cicloalquilo,
cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, arilo, arilo
sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, y un
grupo protector que se puede eliminar en condiciones de síntesis
peptídica, con tal de que al menos uno de R^{1}, R^{2} o R^{3}
sea H. R^{5}, R^{7}, R^{8}, R^{9} y R^{10} se seleccionan
independientemente del grupo que consiste en H, alquilo
C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, arilo y arilo
sustituido, y R^{4} y R^{6} juntos forman un enlace directo, y
R^{8} y R^{9} juntos o R^{7} y R^{9} juntos pueden formar un
anillo cicloalquilo o cicloalquilo sustituido,
y
en la que NR^{10} está localizado en el
extremo N-terminal de dicho péptido, o está
localizado en una cadena lateral de aminoácido de dicho
péptido,
y después poner en contacto dicha disolución con
un radionúclido y recuperar el péptido radiomarcado.
18. El método de la reivindicación 17, en el que
dicho radionúclido se selecciona de ^{188}Re- o
^{186}Re-perrenato y
^{99m}Tc-pertecnetato.
19. El uso de un péptido radiomarcado preparado
poniendo en contacto una disolución del péptido con iones estañosos
en el que dicho péptido comprende un resto de unión de radiometal
que comprende la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{1}, R^{2} y
R^{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en
H, alquilo C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, cicloalquilo,
cicloalquilo sustituido, heterocicloalquilo, arilo, arilo
sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcarilo, y un
grupo protector que se puede eliminar en condiciones de síntesis
peptídica, con tal de que al menos uno de R^{1}, R^{2} o R^{3}
sea
H,
R^{5}, R^{7}, R^{8}, R^{9} y R^{10} se
seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo
C_{1}-C_{6}, alquilo
C_{1}-C_{6} sustituido, arilo y arilo
sustituido, y R^{4} y R^{6} juntos forman un enlace directo, y
R^{8} y R^{9} juntos o R^{7} y R^{9} juntos pueden formar un
anillo cicloalquilo o cicloalquilo sustituido, y
en la que NR^{10} está localizado en el
extremo N-terminal de dicho péptido, o está
localizado en una cadena lateral de aminoácido de dicho péptido
y después poner en contacto dicha disolución con
un radionúclido y recuperar el péptido radiomarcado en la
fabricación de una composición diagnóstica para la formación de
imágenes de un tumor, una lesión infecciosa, un infarto de
miocardio, un coágulo, una placa ateroesclerótica, que comprende
administrar a un paciente humano dicho péptido radiomarcado junto
con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y, después de un tiempo
suficiente para que se localice dicho péptido radiomarcado y para
que se aclare la señal de fondo fuera del objetivo, el sitio o
sitios de aumento de dicho péptido radiomarcado se detectan mediante
una cámara externa de formación de
imágenes.
imágenes.
\newpage
20. Un péptido según la reivindicación 1, en el
que dicho péptido se selecciona del grupo que consiste en:
en los que (Chel) es el resto de unión de
radio-metal de la reivindicación 1.
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