ES2288555T3 - Moleculas de oligodesoxinucleotidos inmunoestimuladores. - Google Patents
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Abstract
Uso de una molécula de ácido oligodesoxinucleico (ODN) que tiene la estructura según la fórmula (I) en la que cualquier X es O u S. cualquier NMP es 2''-monofosfato o monotiofosfato de desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina-, desoxiguanosina-, desoxiinosina-, desoxicitosina-, desoxiuridina-, desoxitimidina-, 2-metil-desoxiinosina-, 5-metil-desoxicitosina-, desoxipseudouridina-, desoxirribosapurina-, 2-amino-desoxirribosapurina-, 6-S-desoxiguanina-, 2-dimetil-desoxiguanosina- o N-isopentenil-desoxiadenosina, NUC es un 2'' desoxinucleósido seleccionado entre el grupo compuesto por desoxiadenosina-, desoxiguanosina-, desoxiinosina-, desoxicitosina-, desoxiuridina-, desoxitimidina-, 2-metil-desoxiinosina-, 5-metil-desoxicitosina-, desoxipseudouridina-, desoxirribosapurina-, 2-amino-desoxirribosapurina-, 6-S-desoxiguanina-, 2-dimetil-desoxiguanosina- o N-isopentenil-desoxiadenosina, a y b son números enteros de 0 a 100 con la condición de que la suma de a + b esté entre 4 y 150, B y E son grupos comunes de los extremos 5'' o 3'' de moléculas de ácido nucleico y se seleccionan independientemente entre el grupo compuesto por -H, -CH3, -COH, -COCH3, -OH, -CHO, -PO4, -PSO3, -PSO2, -PS3O, -PS4, -SO3, -PO4-(CH2)1-6-NH2 o -PO4-(CH2)1-6-NH-marcado, para preparar una composición farmacéutica inmunoestimuladora.
Description
Moléculas de oligodesoxinucleótidos
inmunoestimuladores.
La presente invención se refiere a moléculas de
oligodesoxinucleótidos inmunoestimuladores (ODN) y composiciones
farmacéuticas que contienen estos ODN.
Las vacunas pueden salvar más vidas (y ahorra
recursos) que cualquier otra intervención médica (Nossal, 1998).
Gracias a los programas mundiales de vacunación, ha disminuido
drásticamente la incidencia de muchas enfermedades mortales. Aunque
esta noción es válida para un amplio grupo de enfermedades, por
ejemplo, tuberculosis, difteria, tosferina, sarampión o tétanos, no
hay vacunas eficaces para numerosas enfermedades infecciosas,
incluyendo la mayoría de las infecciones virales, tales como el
SIDA. Tampoco hay vacunas eficaces para otras enfermedades,
infecciosas o no, que se cobran millones de vidas al año incluyendo
la malaria o el cáncer. Además, la rápida aparición de bacterias y
microorganismos resistentes a antibióticos hace un llamamiento a
tratamientos alternativos siendo las vacunas una elección lógica.
Finalmente, la gran necesidad de vacunas también se ilustra por el
hecho de que las enfermedades infecciosas, por encima de las
enfermedades cardiovasculares, el cáncer o las lesiones, siguen
siendo las causas principales de muerte e incapacidad en el mundo
(Bloom y Widdus, 1998).
Desde un punto de vista inmunológico, un
problema principal hoy en día en el campo de la vacunación es que
las vacunas tradicionales (y/o los compuestos que modulan la
respuesta inmune contenidos en estas preparaciones) están diseñadas
para inducir niveles elevados de anticuerpos (Harrow y Lane, 1988).
Sin embargo, los anticuerpos no son eficaces por sí mismos para
prevenir un gran número de enfermedades, incluyendo la mayoría de
las enfermedades causadas por virus, bacterias intracelulares,
ciertos parásitos y el cáncer. Ejemplos de estas enfermedades son,
pero sin limitaciones, el virus al virus de VIH mencionado
previamente o las especies de Plasmodium que causan la
malaria. En numerosos sistemas experimentales, se ha mostrado que el
componente celular del sistema inmune, incluyendo las células T,
antes que el componente humoral, es importante para estas
indicaciones. Por tanto, son necesarias tecnologías nuevas
innovadoras para superar las limitaciones de las vacunas
convencionales. La atención debe ponerse en tecnologías que sabemos
de buena fuente induce respuesta del sistema inmune celular,
incluyendo las células T específicas de antígeno, que reconocen
moléculas expresadas en células infectadas por patógenos. De manera
ideal, las vacunas se diseñan de manera que induzcan tanto células T
que diferencias a las células enfermas y/o infectadas de las
células normales como, simultáneamente, anticuerpos secretados por
células B que reconocen patógenos en compartimentos
extracelulares.
Varias vacunas establecidas están compuestas de
organismos atenuados donde existe el riesgo de reversión de los
virus a cepas de tipo silvestre virulentas. Especialmente en
hospedadores inmunodeprimidos esta puede ser una situación que
ponga en peligro la vida del paciente. Alternativamente, las vacunas
se administrar como una combinación de antígenos derivados de
patógenos junto con compuestos que inducen o potencian la respuesta
inmune frente a estos antígenos (normalmente estos compuestos se
denominan adyuvantes), ya que estas vacunas en subunidades
generalmente no son eficaz por sí solas.
Aunque no hay duda de que las vacunas anteriores
son tratamientos médicos valiosos, tienen la desventaja de que,
debido a su complejidad, pueden provocan efectos adversos graves,
por ejemplo, frente a antígenos contenidos en la vacuna que
muestren reactividad cruzada con moléculas expresadas por las
células de los individuos vacunados. Además, es difícil cumplir los
requisitos actuales de las autoridades reguladoras, por ejemplo, la
Organización Mundial de la Salud (OMS), la Administración para
Alimentos y Fármacos (FDA) y sus equivalentes Europeos, sobre
especificaciones exactas de la composición de las vacunas y los
mecanismos de inducción de
inmunidad.
inmunidad.
Las células presentadoras de antígeno pertenecen
al sistema inmune innato, que se ha desarrollado como primera línea
de defensa para limitar la infección precoz después de la exposición
a los microorganismos (Hoffmann y col., 1999). Las células del
sistema inmune innato reconocen más bien patrones o estructuras
relativamente no específicos expresados en sus dianas que
estructuras específicas más sofisticadas reconocidas por el sistema
inmune adquirido (Hoffmann y col., 1999). Ejemplos de células del
sistema inmune son los macrófagos y las células dendríticas, pero
también los granulocitos (por ejemplo, neutrófilos), los linfocitos
citotóxicos naturales y otros. Por el contrario, las células del
sistema inmune adquirido reconocen estructuras antigénicas
específicas, incluyendo péptidos, en el caso de células T y péptidos
así como estructuras tridimensionales en el caso de células B. El
sistema inmune adquirido es mucho más específico y sofisticado que
el sistema inmune innato y mejora tras la exposición repetida a un
patógeno o antígeno determinado. Filogenéticamente, el sistema
inmune innato es mucho más antiguo y puede encontrarse ya en
organismos muy primitivos. No obstante, el sistema inmune innato es
crítico durante la fase inicial de la exposición antigénica puesto
que, además de contener a los patógenos, las células del sistema
inmune innato, por ejemplo, las APC, ceban a células del sistema
inmune adquirido y, por tanto, desencadenan respuestas inmune
específicas que llevan al aclaramiento de los intrusos. En resumen,
las células del sistema inmune innato y en especial las APC tienen
una función crítica durante la fase de inducción de las respuestas
inmune a) conteniendo las infecciones mediante un sistema primitivo
de reconocimiento de patrones y b) cebando a células del sistema
inmune adquirido lo que lleva a respuestas inmunes específicas y de
memoria que dan lugar al aclaramiento de los patógenos invasores o
de otras dianas (Roitt y col., 1998). Estos mecanismos pueden
también ser importantes para limpiar células tumorales o contener
su expansión.
Como se mencionó anteriormente, las células del
sistema inmune innato reconocen patrones expresados en sus dianas
respectivas. Ejemplos son los lipopolisacáridos (LPS) en el caso de
bacterias Gram-negativas, glucolípidos de
micobacterias, ácidos lipoteicoicos de bacterias
Gram-positivas, mananos de levaduras y ARN de doble
cadena de virus (Hoffmann y col., 1999). Además pueden reconocer
patrones tales como glucosilaciones de proteínas alteradas en
células tumorales.
Hallazgos recientes describen el ADN de
protozoos o de eucariotas inferiores como un patrón adicional
reconocido por el sistema inmune innato (pero posiblemente también
por el adquirido) de mamíferos (y posiblemente la mayoría sino
todos los vertebrados) (Krieg, 1996; Lipford y col., 1998).
El sistema inmune reconoce organismos
inferiores, incluso a bacterias, probablemente debido a diferencias
estructurales y de uso de secuencia entre el ADN del patógeno y el
del hospedador. En especial, se eligen como diana ADN de longitudes
cortas, derivados de invertebrados o en forma de ODN cortos
sintéticos que contienen dinucleótidos de citosina y guanina sin
metilar (CpG) en cierto contexto de base (Krieg y col., 1995). Los
motivos CpG se encuentran a la frecuencia esperada en el ADN de
bacteria pero es mucho menos frecuente en el ADN de vertebrados
(Lipford y col., 1998; Pisetsky, 1999). Además, los motivos CpG de
invertebrados (es decir, bacterias) no están metilados, mientras
que las secuencias CpG de vertebrados si lo están. Estas diferencias
entre el ADN bacteriano y el ADN de vertebrados permiten a los
vertebrados reconocer el ADN de invertebrados como una señal
de
peligro.
peligro.
Los ADN que contienen CpG naturales, ODN, así
como ODN sustituidos con tiofosfato (intercambio de restos fosfato
por tiofosfato) que contiene motivos CpG (CpG-ODN)
no son sólo potentes activadores de la respuesta de proliferación
de células inmunes y de respuestas inmunes humorales (Krieg y col.,
1995) sino que estimulan potentes respuestas inmunes celulares
(revisado por Lipford y col., 1998). Los ADN/ODN que contienen
motivos CpG no metilados pueden activar directamente a células
monocíticas (células dendríticas, macrófagos) y a células B.
Probablemente, los linfocitos citotóxicos naturales (NK) no se
activan directamente, pero responde a IL-12 derivada
de monocitos (interleucina 12) con un aumento marcado de su
producción de IFN-\gamma (Chace y col., 1997). En
consecuencia, la inducción de monocitos y de células NK por el ADN
con CpG promueve la inducción de respuestas de tipo Th1 y el
desarrollo de células T citotóxicas.
Se sabe que los ácidos ribonucleicos a base de
inosina y citosina, como el ácido
poliinosínico-policitidílico (poli I:C), promueve
respuestas inmunes específicas de Th1. Se sabe que estimulan la
producción de citocinas tales como IL-1\alpha y
IL-12 por los macrófagos (Manetti y col., 1995),
también se sabe que es un potente inductor del interferón de tipo 1
(Manetti y col., 1995) y un potente estimulador de células NK
(Cavanaugh y col., 1996).
Este efecto, sin embargo, está estrictamente
restringido a un ácido ribonucleico que contiene restos de inosina
y citidina (WO98/16247). Hasta el momento no se ha descrito esta
conexión para los ácidos ribonucleicos que contienen uridina.
Las investigaciones de los inventores de la
presente invención mostraron que los ODN que contienen motivos CpG
sin metilar, aunque son eficaces para estimular el sistema inmune,
tienen desventajas esenciales, especialmente con respecto a la
especificidad (fondo elevado) e inducción de efectos adversos, tales
como alta producción sistémica de TNF-\alpha. Se
sabe que la liberación sistémica elevada de
TNF-\alpha causa síndrome de choque tóxico, lo
que puede causar la muerte de los pacientes afectados.
En Kandimalla Ekambar y col. (Bioorganic &
Medicinal Chem. 9 (2001), 807-813), Seela y col.
(Helv. Chim. Acta 83 (2000), 2527-2540) y Bailly y
col. (PNAS 93 (1996), 13628-13628) se describen los
oligodesoxinucleótidos que contienen desoxiuridina
(U-ODN) como tal así como su uso en PCR y su
funcionamiento en la formación de dobles hélices de ADN.
Por tanto, un objetivo de la presente invención
es proporcionar nuevos ODN adecuados que no tengan efectos adversos
drásticos tales como los que tienen las secuencias ODN basadas en
CpG. Es un objetivo adicional reducir los efectos adversos de las
composiciones farmacéuticas que contienen ODN conocidos y
proporcionar composiciones farmacéuticas eficaces y seguras, bien
toleradas, con propiedades inmunoestimuladores eficaces que son
adecuados para la vacunación de animales, especialmente de
mamíferos, incluyendo a humanos.
\newpage
Este objetivo se resuelve mediante moléculas de
ácidos oligodesoxinucleicos inmunoestimuladores (ODN) que tiene la
estructura correspondiente a la fórmula (I)
en la que cualquier X es O u
S.
cualquier NMP es 2'-monofosfato
o monotiofosfato de desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo
compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina,
desoxiguanosina, desoxiinosina, desoxicitosina, desoxiuridina,
desoxitimidina,
2-metil-desoxiinosina,
5-metil-desoxicitosina,
desoxipseudouridina, desoxirribosapurina,
2-amino-desoxirribosapurina-,
6-S-desoxiguanina,
2-dimetil-desoxiguanosina o
N-isopentenil-desoxiadenosina,
NUC es un 2' desoxinucleósido seleccionado entre
el grupo compuesto por desoxiadenosina, desoxiguanosina,
desoxiinosina, desoxicitosina, desoxiuridina, desoxitimidina,
2-metil-desoxiinosina,
5-metil-desoxicitosina,
desoxipseudouridina, desoxirribosapurina,
2-amino-desoxirribosapurina,
6-S-desoxiguanina,
2-dimetil-desoxiguanosina o
N-isopentenil-desoxiadenosina,
a y b son números enteros de 0 a 100 con la
condición de que la suma de a + b esté entre 4 y 150,
B y E son grupos comunes de los extremos 5' o 3'
de moléculas de ácido nucleico y se seleccionan independientemente
entre el grupo compuesto por -H, -CH_{3}, -COH, -COCH_{3}, -OH,
-CHO, -PO_{4}, -PSO_{3}, -PSO_{2}, -PS_{3}O, -PS_{4},
-SO_{3},
-PO_{4}-(CH_{2})_{1-6}-NH_{2}
o
-PO_{4}-(CH_{2})_{1-6}-NH-marcado,
para preparar una composición farmacéutica inmunoestimuladora.
Sorprendentemente se descubrió que los ODN que
contienen restos de desoxiuridina (U-ODN) muestran
un efecto inmunoestimulador comparable o, en muchos casos, incluso
mejor que los ODN que contienen motivos CpG. Comparado con
CpG-ODN, los ODN según la presente invención inducen
números comparables o más elevados de células T específicos de un
antígeno o fragmento antigénico determinado. Además, los ODN según
la presente invención no inducen la producción sistémica de
citocinas proinflamatorias, tales como TNF-\alpha
e IL-6, reduciendo por tanto, la inducción de
reacciones adversas potencialmente dañinas.
Aunque se han descrito determinados efectos
inmunoestimuladores para las moléculas de ARN que contiene inosina,
tales como poli-IC o las moléculas mencionadas en el
documento WO98/16247, se ha descubierto sorprendentemente que las
moléculas de ácido desoxinucleico que contienen restos de
desoxiuridina pueden ser buenos ODN inmunoestimuladores.
Además, los U-ODN usados según
la presente invención (al contrario que los ODN basados en el motivo
CpG específico) no dependen de un motivo específico o una secuencia
palindrómica como se describe para los oligonucleótidos CpG
(véanse, por ejemplo, los documentos EP 0 468 520 A2, WO96/02555,
WO98/18810, WO98/37919, WO98/40100, WO98/52581, WO99/51259 y
WO99/56755). Por tanto, un grupo de U-ODN usados
según la presente invención puede contener preferiblemente un
motivo CU (y, por tanto, los ODN descritos en estas referencias
incorporadas, en los que uno o más restos de guanosina se
sustituyen por restos de desoxiuridina son realizaciones preferidas
de los presentes ODN). Esto no es necesario para sus propiedades
inmunoestimuladoras fundamentales, ya que los U-ODN
con una uridina no situada en un contexto CU o UC también muestran
propiedades inmunoestimuladoras.
El U-ODN usado según la presente
invención es, por tanto, una molécula de ADN que contiene un resto
de desoxiuridina la cual se proporciona, preferiblemente, en forma
de cadena sencilla.
El U-ODN usado según la presente
invención puede aislarse mediante procedimientos recombinantes o
sintetizarse químicamente. En el último caso, el
U-ODN usado según la presente invención puede
también contener oligonucleótidos modificados que pueden
sintetizarse usando transformaciones químicas convencionales, tales
como metilfosfonatos u otros oligonucleótidos modificados a base de
fósforo, tales como fosfotriésteres, fosfoamidatos y
fosforoditionatos. También pueden usarse otros oligonucleótidos
modificados no a base de fósforo (Stirchak y col., 17 de marzo
(1989), 6129-6141), sin embargo, entre los
monofosfatos o monotiofosfatos, se prefiere el
2'-monofosfato de desoxinucleósido para su uso en
la presente invención.
Los NMP de los U-ODN usados
según la presente invención se seleccionan preferiblemente entre el
grupo compuesto por monofosfato o monotiofosfato de
desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxiinosina, desoxicitosina,
desoxiuridina, desoxitimidina,
2-metil-desoxiuridina,
5-metil-desoxicitosina (normalmente,
el grupo fosfato o tiofosfato está en la posición 5' de la
desoxirribosa). Mientras que es esencial para los ODN basados en el
motivo CpG que este motivo no está metilado, sorprendentemente no
es el caso de los ODN usados según la presente invención, en los
que, por ejemplo, los restos
2-metil-desoxiinosina o
5-metil-desoxicitosina no tienen
efectos negativos generales sobre las propiedades
inmunoestimuladores de los ODN usados según la presente invención.
Alternativamente, en lugar de las formas 2-desoxi
de los NMP, también pueden estar presentes otros grupos,
especialmente internos, en la posición 2 del grupo ribosa, tales
como, por ejemplo, -F, -NH_{2}, -CH_{3}, especialmente
-CH_{3}. Por supuesto, los grupos -OH y -SH se excluyen de estar
presentes en el grupo 2' de la ribosa de los U-ODN
usados según la presente invención, especialmente el resto ribosa de
la NMP uridina.
La longitud de los ODN, usados según la presente
invención, está en el intervalo de los ODN convencionales usados
según la técnica anterior. Por tanto, las moléculas con una longitud
total de 4 y aproximadamente 150 muestran una disminución gradual
del potencial inmunoestimulador. Los ODN preferidos contienen entre
10 y 60, especialmente entre 15 y 40 bases (nucleósidos), que
implican que a + b en la fórmula I está entre 10 y 60,
preferiblemente, entre 15 y 40 en estas realizaciones
preferidas.
Mientras que las moléculas de ácido ribonucleico
que contienen inosina y citidina descritas como inmunoestimuladoras
en la técnica previa, han sido ácidos polinucleicos grandes y
relativamente indefinidos con pesos moleculares mucho mayores de
200.000 (un ácido poliinosínico-policitidílico
disponible en el mercado de Sigma Chemicals tiene un peso molecular
que oscila entre 220.000 y 460.000 (al menos
500-1.000 restos C + I). Las moléculas según la
presente invención son moléculas de ADN de longitud mucho menor con
una longitud y composición bien definidas, siendo muy reproducibles
en los productos.
Se prefiere además que el NMP que contiene
desoxiuridina de los U-ODN, según la fórmula I sea
un monotiofosfato con de uno a cuatro átomos de azufre y que
también NMP adicionales, especialmente todos los NMP adicionales,
están presentes como monotiofosfatos de nucleósidos, porque estos
ODN muestran mayor resistencia a la digestión por nucleasas (está
claro por la presente invención que el "mono" en los
"monotiofosfatos" se refiere al fosfato, es decir, que un
grupo fosfato (un átomo de fósforo) está presente en cada NMP).
Preferiblemente, al menos uno de X_{1} y X_{2} es S y al menos
uno de X_{3} y X_{4} es O en los NMP según la presente
invención. Preferiblemente, X_{3} y X_{4} son O (X_{3} puede
ser (debido a la síntesis del NMP) un derivado, por ejemplo, del
grupo fosfato o del grupo 3' de la NMP-ribosa).
Preferiblemente, los ODN usados según la
presente invención contiene la secuencia
en la
que,
cualquier n es un 2'-monofosfato
o monotiofosfato de desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo
compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina,
desoxiguanosina, desoxicitosina o desoxitimidina,
cualquier h es un 2'-monofosfato
o monotiofosfato de desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo
compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina,
desoxicitosina o desoxitimidina,
u es monofosfato o monotiofosfato de
desoxiuridina, cualquier w es un 2'-monofosfato o
monotiofosfato de desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo
compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina o
desoxitimidina, y cualquier d es un 2'-monofosfato
o monotiofosfato desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo
compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina,
desoxiguanosina o desoxitimidina.
Otros ODN preferidos usados según la presente
invención contienen la secuencia
en la que w, d, u y n se definen
como
anteriormente.
Como se destacaban anteriormente, no es
necesario un motivo específico (tal como CpG o un palíndromo) para
los U-ODN usados según la presente invención.
Sin embargo, se prefieren los ODN que contienen
un motivo CU de modo que es una realización preferida el ODN según
la fórmula I que contiene al menos un 2'-monofosfato
o monotiofosfato de desoxicitosina 3'-adyacente a
un 2'-monofosfato o -monotiofosfato de desoxiuridina
para formar este motivo 5'-CU 3'.
Los ODN preferidos según la presente invención
contiene una o más de las secuencias
en las
que
a es monofosfato o monotiofosfato de
desoxiadenosina,
g es monofosfato o monotiofosfato de
desoxiguanosina,
u es monofosfato o monotiofosfato de
desoxiuridina,
c es monofosfato o monotiofosfato de
desoxicitosina, y
t es monofosfato o monotiofosfato de
desoxitimidina,
Los U-ODN usados según la
presente invención son especialmente adecuados para su aplicación en
el campo farmacéutico, por ejemplo, para ser aplicados como
medicamentos para animales o humanos Están específicamente adaptados
para actuar como agentes inmunoestimuladores especialmente en o
junto con composiciones de vacunas.
Por tanto, la presente invención también se
refiere a una composición farmacéutica que comprende un ODN usados
según la presente invención.
Puesto que una composición farmacéutica
preferida según la presente invención es una vacuna, esta
composición debe contener un antígeno además del ODN usado según la
presente invención. El potencial de este antígeno para inducir una
protección/respuesta inmune en el individuo vacunado se aumenta
mucho si se combina con los ODN usados según la presente invención,
especialmente debido a su actividad inmunoestimuladora.
Una vacuna puede contener una variedad completa
de antígenos diferentes. Ejemplos de antígenos son organismos
completos muertos, tales como virus o bacterias inactivados, hongos,
protozoos o incluso células cancerígenas. Los antígenos también
pueden están compuestos por subfracciones de estos
organismos/tejidos, de proteínas o, en su forma más sencilla, de
péptidos. Los antígenos también pueden ser reconocidos por el
sistema inmune en forma de proteínas o péptidos glucosilados y
pueden también ser o contener polisacáridos o lípidos. Pueden
usarse péptidos cortos ya que, por ejemplos las células T
citotóxicas (CTL) reconocen antígenos en forma de péptidos cortos
normalmente de una longitud de 8-11 aminoácidos
junto con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC)
(Rammensee y col., Immunogenetics 41, (1995),
178-228). Las células B reconocen péptidos más
largos empezando en aproximadamente 15 aminoácidos (Harrow y col.,
Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)). Al
contrario que los epítopos de la célula T, la estructura
tridimensional de los antígenos de la célula B también puede ser
importante para el reconocimiento por anticuerpos. Para obtener
respuestas inmunes mantenidas específicas de antígenos, son útiles
los adyuvantes que desencadenan cascadas inmunes que implican a
todas las células necesarias del sistema inmune. En primer lugar,
los adyuvantes actúan, pero no están restringidos en su modo de
acción, sobre las denominadas células presentadoras de antígenos
(APC). Normalmente estas células encuentran primero los antígenos,
a lo que sigue de la presentación del antígeno procesado o sin
modificar al efector inmune. También pueden estar implicadas tipos
de células intermedias. En una respuesta inmune productiva sólo se
activan células efectoras con la especificidad apropiada. El
adyuvante también puede retener localmente antígenos y otros
factores inyectados conjuntamente. Además, el adyuvante puede actuar
como un agente quimiotáctico para otras células inmunes o puede
actuar localmente y/o sistemáticamente como un agente estimulador
del sistema inmune.
No son críticos los antígenos que se van a
utilizar en las composiciones presentes. Preferiblemente, se usan
como tales antígenos proteínas o péptidos derivados de un patógeno
viral o bacteriano o de hongos o parásitos (incluyendo antígenos
derivatizados, o antígenos glucosilados o lipidados, o polisacáridos
o lípidos). Otra fuente preferida de antígenos son los antígenos
tumorales. Los patógenos preferidos se seleccionan entre el virus
de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis A y B,
virus de la hepatitis C (VHC), virus del sarcoma de Rous (RSV),
virus del Epstein Barr (EBV), virus de la influencia, rotavirus,
Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumoniae,
Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis,
Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis,
Vibrio cholerae, Plasmodium sp. (P. falciparum,
P. vivax, etc.), Aspergillus sp. o Candida
albicans. Los antígenos también pueden ser moléculas expresadas
por células cancerígenas (antígenos tumorales). El proceso de
derivatización puede incluir la purificación de una proteína
específica a partir de las células del patógeno o cancerígenas, la
inactivación del patógeno así como la derivatización proteolítica o
química, o la estabilización de esta proteína. De la misma forma,
también pueden usarse antígenos tumorales (vacunas frente al cáncer)
o antígenos autoinmunes en la composición farmacéutica según la
presente invención. Con estas composiciones puede producirse una
vacunación frente a un tumor o un tratamiento para enfermedades
autoinmunes.
En el caso de los antígenos peptídicos, se
incluye en la invención actual el uso de
mimótopos/agonistas/superago-
nistas/antagonistas peptídicos o péptidos modificados en determinadas posiciones sin que afecte a las propiedades inmunológicas o mimótopos/agonistas/superagonistas/antagonistas no peptídicos (revisados por Sparbier y Walden, 1999). Los antígenos peptídicos también pueden contener elongaciones en el extremo carboxilo terminal o en el amino terminal del antígeno peptídico que facilitan la interacción con los compuestos policatiónicos o con los compuestos inmunoestimuladores. Pueden aplicarse de antagonistas peptídicos para el tratamiento enfermedades autoinmunes.
nistas/antagonistas peptídicos o péptidos modificados en determinadas posiciones sin que afecte a las propiedades inmunológicas o mimótopos/agonistas/superagonistas/antagonistas no peptídicos (revisados por Sparbier y Walden, 1999). Los antígenos peptídicos también pueden contener elongaciones en el extremo carboxilo terminal o en el amino terminal del antígeno peptídico que facilitan la interacción con los compuestos policatiónicos o con los compuestos inmunoestimuladores. Pueden aplicarse de antagonistas peptídicos para el tratamiento enfermedades autoinmunes.
Los antígenos también pueden derivatizarse para
que incluyan moléculas que potencien la presentación antigénica y
dirijan a los antígenos hacia células presentadoras de
antígenos.
En una realización de la invención, la
composición farmacéutica sirve para conferir tolerancia a proteínas
o a fragmentos de proteínas y péptidos que están implicados en
enfermedades autoinmunes. Los antígenos utilizados en estas
realizaciones sirven para hacer tolerante al sistema inmune o
regular por disminución las respuestas inmunes frente a epítopos
implicados en procesos autoinmunes.
Preferiblemente, la composición farmacéutica
según la presente invención, especialmente en forma de vacunas,
comprende además un polímero policatiónico, preferiblemente un
péptido policatiónico, especialmente, poliarginina, polilisina o un
péptido antimicrobiano.
Los compuestos policatiónicos que se usan según
la presente invención pueden ser cualquier compuesto policatiónico
que muestra el efecto característico según el documento WO 97/30721.
Los compuestos policatiónicos preferidas se seleccionan entre
polipéptidos básicos, policationes orgánicos, poliaminoácidos
básicos o mezclas de los mismos. Estos poliaminoácidos deben ser
una cadena con una longitud de al menos 4 restos de aminoácidos
(véase: Tuftsin según se describe en Goldman y col (1983)). Son
especialmente preferidas sustancias que contienen enlaces
peptídicos, como polilisina, poliarginina y polipéptidos que
contienen más del 20%, especialmente más del 50% de aminoácidos
básicos en un intervalo de más de 8, especialmente más de 20, restos
de aminoácidos o mezclas de los mismos. Otros policationes
preferidos y sus composiciones farmacéuticas se describen en el
documento WO 97/30721 (por ejemplo, polietilenimina) y el documento
WO 99/38528. Preferiblemente, estos polipéptidos contienen entre 20
y 500 restos de aminoácidos, especialmente entre 30 y 200
restos.
Estos compuestos policatiónicos pueden
producirse por tecnología química o recombinante o pueden derivar de
fuentes naturales.
Los (poli)péptidos catiónicos también
pueden ser péptidos policatiónicos microbianos antibacterianos con
propiedades como las revisadas por Ganz y Lehrer, 1999, y Hancock,
1999. Estos (poli)péptidos puede ser de origen procariota,
animal o vegetal o pueden producirse mediante tecnología química o
recombinante (Andreu y Rivas, 1998; Ganz y Lehrer, 1999; Simmaco y
col., 1998). Los péptidos también pueden pertenecer a la clase de
las defensinas (Ganz, 1999; Ganz y Lehrer, 1999). Las secuencias de
estos péptidos pueden encontrarse, por ejemplo, en la base de datos
de secuencias antimicrobianas en la siguiente dirección de
internet:
http://www.bbcm.univ.trieste.it/tossi/pag2.html
Estos péptidos de defensa o defensinas del
hospedador también son una forma preferida del polímero
policatiónico según la presente invención. Generalmente, se usa
como polímero policatiónico un compuesto permitido como producto
final de activación (o de regulación por disminución) del sistema
inmune adquirido, preferiblemente mediado por APC (incluyendo
células dendríticas).
En la presente invención se prefiere
especialmente el uso como sustancia policatiónica de péptidos
antimicrobianos derivados de catelicidina o derivados de la misma
(documento WO 02/13857), especialmente péptidos antimicrobianos
derivados de catelicidina de mamíferos, preferiblemente de humano,
bovino o ratón, o compuestos neuroactivos, tales como hormonas de
crecimiento (humanas).
Los compuestos policatiónicos derivados de
fuentes naturales incluyen HIV-REV o
HIV-TAT (péptidos catiónicos derivados, péptido de
Antennapedia, quitosano u otros derivados de quitina) u otros
péptidos derivados de estos péptidos o proteínas mediante
procedimientos bioquímicos o recombinantes. Otros compuestos
policatiónicos preferidos son las catelinas o sustancias
relacionadas o derivadas de catelina. Por ejemplo, la catelina de
ratón es un péptido que tiene la secuencia de aminoácido
NH_{2}-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH.
Las sustancias relacionadas o derivadas de catelina contienen la
secuencia de catelina completa o partes de la misma con al menos
15-20 restos de aminoácidos. Las derivaciones pueden
incluir la sustitución o modificación de los aminoácidos naturales
por aminoácidos que no se encuentran entre los 20 aminoácidos
convencionales. Además, pueden introducirse otros restos catiónicos
en estas moléculas de catelina. Se prefiere combinar estas
moléculas de catelina con el antígeno y el ODN inmunogénico según la
presente invención. Sin embargo, se ha descubierto
sorprendentemente que estas moléculas de catelina son también
eficaces como adyuvantes para un antígeno sin la adición de otros
adyuvantes. Por tanto, es posible usar estas moléculas de catelina
como adyuvantes eficaces en formulaciones de vacunas con o sin
otras sustancias inmunoactivadoras.
Otra sustancia policatiónica preferida que se
usa según la presente invención es un péptido sintético que
contiene al menos 2 motivos KLK separados por un enlazador de 3 a 7
aminoácidos hidrófobos (documento WO 02/32451).
Era realmente sorprendente que el efecto
inmunoestimulador de la composición farmacéutica según la presente
invención fuera significativamente mayor de lo que cabría esperarse
de la suma de los efectos de cada compuesto por separado o incluso
de la suma de los efectos del ODN o del policatión con el
antígeno.
B y E en la fórmula I son grupos comunes de los
extremos 5' y/o 3' de las moléculas de ácido nucleico. Ejemplos de
estos grupos están fácilmente a disposición de los expertos en la
materia (véase, por ejemplo "Oligonucleotides and
Analogues-A Practical Approach" (1991), ed.
Eckstein, Oxford University Press). En los U-ODN
según la presente invención, B y/o E se seleccionan
independientemente entre -H, -CH_{3}, -COCH_{3}, -OH, -CHO, un
grupo fosfato, tiofosfato, sulfato o tiosulfato o un grupo
fofosalquilo, especialmente con un alquilo de longitud
C_{1}-C_{6} y/o con un grupo amino terminal (el
grupo amino puede, por ejemplo, usarse para marcaje adicional de
los U-ODN según la presente invención, por ejemplo,
marcaje -PO_{4}-(CH_{2})_{n}-NH_{2}
o -PO_{4}-(CH_{2})_{n}-NH-).
Especialmente preferidos como B son los nucleósidos, especialmente
los 2'-desoxinucleótidos mencionados anteriormente
(es decir, sin el grupo fosfato o tiofosfato). Alternativamente,
estos grupos también pueden contener grupos enlazadores con otras
moléculas, especialmente moléculas vehículo o marcadores. En estas
formas de ODN, en las que los ODN se unen a superficies sólidas,
partículas o marcadores, estas superficies, partículas, marcadores,
etc. son entonces también parte de los grupos B y/o E.
Por supuesto, se incluyen en esta fórmula I
cualquier forma ionizada (sal) o formas tautoméricas de las
moléculas según la fórmula I.
La composición farmacéutica según la presente
invención puede además comprender ingredientes activos (sustancias
farmacéuticamente activas), especialmente sustancias que son útiles
en conexión con una vacuna. Las realizaciones preferidas de estos
ingredientes activos adicionales son citocinas, sustancias
antiinflamatorias, sustancias antimicrobianas o combinaciones de
las mismas.
Por supuesto, la composición farmacéutica según
la presente invención puede además contener sustancias auxiliares,
especialmente vehículos farmacéuticamente aceptables, sustancias
tamponadoras, estabilizadores o combinaciones de los mismos.
Las cantidades relativas de los ingredientes en
la presente composición farmacéutica dependen mucho de las
necesidades del antígeno individual y de los animales/humanos a los
que se aplicará esta composición. Por tanto, la composición
farmacéutica de acuerdo con la presente invención contiene
preferiblemente uno o más ODN según la presente invención,
preferiblemente de 1 pg a 10 g, preferiblemente de 1 ng a 1 g, más
preferido de 100 ng a 10 mg, especialmente de 10 \mug a 1 mg. El
antígeno así como el polímero policatiónico puede aplicarse en
dosis similares, se prefiere un intervalo de 1 a 10.000 \mug de
antígeno y 0,1 a 1.000 \mug de policatión por vacunación.
Las composiciones presentes pueden aplicarse a
un paciente, por ejemplo, un candidato a vacunación, en cantidades
suficientes, por ejemplo, en intervalos semanales, quincenales o
mensuales. Los pacientes que se van a tratar con las composiciones
presentes también puede vacunarse repetidamente o sólo una vez. Un
uso preferido de la presente invención es la inmunización activa,
especialmente de humanos o animales sin protección frente al
antígeno específico.
La vía de aplicación de la presente invención no
es crítica, por ejemplo, son adecuadas la inyección subcutánea,
intramuscular, intradérmica o transdérmica así como la ingestión
oral.
También es posible aplicar la presente invención
por separado, por ejemplo, inyectando la sustancia
inmunoestimuladora separadamente de la composición
antígeno/policatión. Por tanto, la presente invención también se
dirige a un kit que comprende una composición que contiene el
antígeno y el polímero policatiónico como un componente y una
composición que contiene la sustancia inmunoestimuladora o
quimiotáctica como segundo componente.
Los componentes pueden aplicarse en el mismo
sitio o al mismo tiempo, sin embargo, también es posible una
aplicación en sitios diferentes o a tiempo diferentes, o durante un
periodo de tiempo diferente. También es posible variar las
aplicaciones sistémicas o locales de la composición o de los
componentes, respectivamente.
La eficacia de un oligonucleótido
inmunoestimulador per se, según la presente invención, se
define por la disponibilidad local de una dosis mínimamente eficaz
durante un cierto intervalo de tiempo, y está limitada por la
semivida del oligonucleótido que prácticamente está definida in
vivo de manera exclusiva por la degradación enzimática mediante
nucleasas. Para salvaguardar la disponibilidad de la dosis necesaria
durante el intervalo de tiempo necesario; puede aplicarse un
régimen de administración a dosis elevadas (continuo) (tal como,
por ejemplo, durante una terapia complementaria con
oligonucleótidos). Una segunda estrategia preferida es la
estabilización de los oligonucleótidos frente a la degradación por
la nucleasa mediante uniones internucleotídicas a fosforotioato o
mediante la adición de policationes. Como se describen en los
ejemplos, proporcionando sólo una de las posibilidades de
estabilización (por ejemplo, preferiblemente sólo uniones
internucleotídica a fosforotioato o adición de sustancias
policatiónicas tales como la poliarginina) se dispone de hecho de
elevada eficacia. Sin embargo, la eficacia es incluso mayor si los
oligonucleótidos se estabilizan con ambos, por ejemplo, uniones
internucleotídicas a fosforotioato y adición de sustancias
policatiónicas (también llevando a una fijación del lado de la
vacunación).
Los detalles de la presente invención se
describen en los siguientes ejemplos y en las figuras, pero la
invención, por supuesto, no está limitada por estos.
La Figura 1 muestra cómo los
oligodesoxinucleótidos de monofosfato de desoxiuridina modificados
sustituidos con tiofosfato (U-ODN 13) inducen en
presencia o ausencia de
poli-L-arginina una fuerte respuesta
inmune frente al péptido derivado de melanoma
TP-2_{181-188}, que es más elevada
que la respuesta inmune inducía por CpG-ODN1668 o
CpG-ODN1668/poli-L-arginina.
Además, la Figura 1 muestra cómo cuando los U-ODN,
que no estaban sustituidos con tiofosfatos (U-ODN
13b), se usaban sólo tras la infección conjunta de
poli-L-arginina se inducía una
fuerte respuesta inmune frente al péptido. Los ratones se
inyectaron en las almohadillas plantares traseras con
TRP-2_{181-188},
TRP-2_{181-188} con
poli-L-arginina (pR60) o el
oligodesoxinucleótido que contiene U, U-ODN 13/13b,
o con la combinación de ambos, pR60 y U-ODN 13/13b.
Células del ganglio linfático drenadas cuatro días antes se
estimularon ex vivo con
TRP-2_{181-188}, un péptido no
relacionado OVA_{257-264}, U-ODN
13/13b o pR60. A las 24 horas se determinó el número de células que
producían IFN-\gamma usando un ensayo ELISPOT. Los
resultados se expresan como el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células de ganglio linfático
con la desviación típica de los triplicados.
La Figura 2 muestra cómo los
oligodesoxinucleótidos monofosfato de desoxiuridina modificados
(U-ODN 13) no inducen la producción sistémica de
TNF-\alpha e IL-6. Los ratones se
inyectaron en las almohadillas plantares traseras con
TRP-2_{181-188},
TRP-2_{181-188} y
poli-L-arginina o CpG 1668 o
U-ODN 13, o
TRP-2_{181-188} y la combinación
de poli-L-arginina y
U-ODN 13. Una hora después de la inyección, se tomó
una muestra de sangre de la cola y se preparó el suero. La cantidad
de TNF-\alpha e IL-6 en los sueros
se determinó usando ELISA.
La Figura 3 muestra cómo los
oligodesoxinucleótidos de monofosfato de desoxiuridina modificados
(U-ODN 13) inducen una respuesta inmune frente al
péptido derivado de ovoalbúmina OVA_{257-264}
(SIINFEKL). Los ratones se inyectaron en las almohadillas plantares
traseras con OVA_{257-264} solo,
OVA_{257-264} y
poli-L-arginina (pR60) o los
oligodesoxinucleótidos que contienen U, U-ODN 13, o
con OVA_{257-264} y la combinación de ambos, pR60
y U-ODN 13. Cuatro días antes, las células de los
ganglios linfáticos drenadas se estimularon ex vivo con
OVA_{257-264}, el péptido no relacionado
mTRP2_{181-188} (proteína 2 relacionada con la
tirosinasa murina, VYDFFVWL), U-ODN 13 y pR60. A
las 24 horas se determinó el número de células que producían
IFN-\gamma usando un ensayo ELISPOT. Los
resultados se expresan como el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células de ganglio
linfático con la desviación típica de los duplicados.
La Figura 4 muestra como los
oligodesoxinucleótidos de monofosfato de desoxiuridina modificados
(U-ODN 13) inducen una fuerte respuesta inmune
frente al péptido derivado de mastocitoma de ratón
P1A_{35-43} (LPYLGWLVF), que puede potenciarse
adicionalmente mediante la inyección conjunta de
poli-L-arginina. Los ratones se
inyectaron en las almohadillas plantares traseras con
P1A_{35-43} solo, P1A_{35-43} y
poli-L-arginina o
U-ODN 13, o con P1A_{35-43} y la
combinación de ambos, pR60 y U-ODN 13. Cuatro días
antes, las células de los ganglios linfáticos drenadas se
estimularon ex vivo con P1A_{35-43}, el
péptido no relacionado CSP (SYVPSAEQI), U-ODN 13 y
pR 60. A las 24 horas se determinó el número de células que
producían IFN-\gamma usando un ensayo ELISPOT.
Los resultados se expresan como el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células de ganglio
linfático con la desviación típica de los triplicados.
La Figura 5 muestra cómo un combinado de
oligodesoxinucleótidos de monofosfato de desoxiuridina modificados
(U-ODN 15) induce en presencia o ausencia de
poli-L-arginina una fuerte respuesta
inmune frente al péptido derivado de melanoma,
TRP-2_{181-188}. Los ratones se
inyectados en las almohadillas traseras con
TRP-2_{181-188},_{
}TRP-2_{181-188} con
poli-L-arginina (pR60) o el
combinado de oligodesoxinucleótidos que contienen U,
U-ODN 15, o con la combinación de pR60 y
U-ODN 15. Las células de ganglios linfáticos
drenadas cuatro días antes se estimularon ex vivo con
TRP-2_{181-188,} el péptido no
relacionado OVA_{257-264}, U-ODN
15 o pR60. A las 24 horas se determinó el número de células que
producían IFN-\gamma usando un ensayo ELISPOT. Los
resultados se expresan como el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células de ganglio linfático
con la desviación típica de los triplicados.
La Figura 6 muestra cómo un combinado de
oligodesoxinucleótidos de monofosfato de desoxiuridina modificados
(U-ODN 16) induce una fuerte respuesta inmune frente
al péptido derivado de melanoma,
TRP-2_{181-188}, que es más
elevada en comparación con la respuesta inmune tras la inyección de
TRP-2_{181-188} solo o en
combinación con ODN 20, un combinado de oligonucleótidos sin
monofosfato de desoxiuridina. Los ratones se inyectaron en las
almohadillas plantares traseras con
TRP-2_{181-188},
TRP-2_{181-188} con el combinado
de oligonucleótidos que contiene U, U-ODN 16 o el
combinado de oligonucleótidos ODN 20. Las células de ganglios
linfáticos drenados cuatro días antes se estimularon ex vivo
con TRP-2_{181-188}, el péptido no
relacionado OVA_{257-264}, U-ODN
16 u ODN 20. A las 24 horas se determinó el número de células que
producen IFN-\gamma usando un ensayo ELISPOT. Los
resultados se expresan como el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células de ganglio
linfático con la desviación típica de los triplicados.
La Figura 7 muestra la generación de respuestas
inmunes específicas frente a
TRP-2_{181-188} derivado de
melanoma con U-ODN 21 y U-ODN
22.
La Figura 8 muestra la generación de respuestas
inmunes específicas frente a
TRP-2_{181-188} derivado de
melanoma con U-ODN 24.
La Figura 9 muestra la generación de respuestas
inmunes específicas frente a
TRP-2_{181-188} derivado de
melanoma con diferentes U-ODN.
Si no se mencionaba otra cosa, en todos los
experimentos se usaron ODN sustituidos con tiofosfato (con restos
de fosfato sustituidos por tiofosfato, denominados en este documento
"oligodesoxinucleótidos sustituidos con tiofosfato") ya que
estos ODN mostraban mayor resistencia a la actividad de la nucleasa
(Ballas y col., 1996; Krieg y col., 1995; Parronchi y col.,
1999).
Ejemplo
1
- Ratones
- C57BI/6 (Harlan/Olac)
- Péptido
- El péptido TRP-2 (VYDFFVWL), un epítopo restringido a MHC de clase I (H-2kb) de la proteína 2 relacionada con tirosinasa de ratón (melanoma B16, Bloom, M.B. y col., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), se sintetizó por síntesis F-moc en fase sólida convencional, se purificó por HPLC y su pureza se analizó mediante espectroscopia de masas
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- Poli-L-arginina 60 (pR60)
- Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 restos de arginina; SIGMA chemicals
- \quad
- Dosis:100 \mug/ratón
- CpG 1668
- Los ODN sustituidos con tiofosfato que contenían un motivo CpG:
- \quad
- tcc atg acg ttc ctg atg ct, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen.
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
- U-ODN 13
- Los ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- tcc atg acu ttc ctg atg ct, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen.
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
- U-ODN 13b
- Los ODN que contenían monofosfato de desoxiuridina (no sustituido con tiofosfato):
- \quad
- tcc atg acu ttc ctg atg ct, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen.
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
\vskip1.000000\baselineskip
1.
TRP-2_{181-188}
2.
TRP-2_{181-188} + pR 60
3.
TRP-2_{181-188} +
CpG-ODN
4.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 13
5.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 13b
6.
TRP-2_{181-188} +
CpG-ODN + pR 60
7.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 13 + pR 60
8.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 13b + pR 60
A día 0, los ratones fueron inyectados en cada
almohadilla plantar de las patas traseras con un volumen total de
100 \mul (50 \mul por almohadilla) que contenían los componentes
mencionados anteriormente. Los animales se sacrificaron 4 días
después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos
poplíteos. Los ganglios linfáticos se pasaron a través de un filtro
para células de 70 \mum y se lavaron dos veces con medio DMEM
(GIBCO BRL) que contenía suero fetal de ternera al 5% (SFT, SIGMA
chemicals). El número apropiado de células se ajusto en medio
DMEM/SFT al 5%. Se realizó un ensayo ELISPOT para
IFN-\gamma por triplicado según se ha descrito
(Miyahira y col., 1995). Este procedimiento es un procedimiento
ampliamente utilizado que permite la cuantificación de células T
específicas del antígeno. Los linfocitos se estimularon ex
vivo por triplicado con medio (fondo-control),
péptido TRP-2_{181-188}, el
péptido no relacionado OVA_{257-264}, pR 60,
U-ODN 13 y Concanavalina A (Con A). Se contaron las
manchas que representaban células T individuales que producían
INF-\gamma y se restaron de todas las muestras los
valores de las manchas de fondo. El elevado número de manchas
detectadas tras la estimulación con Con A (datos no mostrados)
indica unas buenas condiciones de los linfocitos usados. En la
Figura 1 se ilustra el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células para cada grupo
experimental de ratones, se proporciona la desviación típica de los
triplicados estimulados ex vivo.
Este experimento muestra que la inyección de
TRP-2_{181-188} (péptido
hidrófobo) con U-ODN sustituidos con tiofosfato
potencia mucho las respuestas inmunes específicas de
TRP-2_{181-188} en comparación con
la inyección de TRP-2_{181-188}
solo. De manera interesante, en comparación con la inyección de
TRP-2_{181-188}/CpG-ODN,
la inyección de
TRP-2_{181-188}/U-ODN
13 induce mayor número de células T específicas de
TRP-2_{181-188}. La inyección
conjunta de poli-L-arginina no
influye en esta potente respuesta. Por el contrario, cuando se
usaba U-ODN 13b, que no está sustituido con
tiofosfatos, sólo se inducía una elevada respuesta inmune tras la
inyección conjunta de
poli-L-arginina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
- Ratones
- C57BI/6 (Harlan/Olac)
- Péptido
- El péptido TRP-2 (VYDFFVWL), un epítopo restringido a MHC de clase I (H-2kb) de la proteína 2 relacionada con tirosinasa de ratón (melanoma B16, Bloom, M.B. y col., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), se sintetizó por síntesis F-moc en fase sólida convencional, se purificó por HPLC y su pureza se analizó mediante espectroscopia de masas
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- Poli-L-arginina 60 (pR 60)
- Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 restos de arginina; SIGMA chemicals
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- CpG 1668
- Los ODN sustituidos con tiofosfato que contenían un motivo CpG:
- \quad
- tcc atg acg ttc ctg atg ct, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen.
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
- U-ODN 13
- Los ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- tcc atg acu ttc ctg atg ct, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen.
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
\vskip1.000000\baselineskip
1.
TRP-2_{181-188}
2.
TRP-2_{181-188} + pR 60
3.
TRP-2_{181-188} + CpG 1668
4.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 13
5.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 13 + pR 60
A día 0, los ratones fueron inyectados en cada
almohadilla plantar de las patas traseras con un volumen total de
100 \mul (50 \mul por almohadilla) que contenían los componentes
mencionados anteriormente. Una hora después de la inyección se tomó
una muestra de sangre a través de la vena caudal y se preparó el
suero. Las cantidades de TNF-\alpha y de
IL-6 en los sueros se determinaron mediante métodos
de ELISA específicos. La Figura 2 muestra cómo, al contrario que
con la aplicación de GpG-ODN 1668, la aplicación de
U-ODN 13 en combinación con un péptido no induce la
producción sistémica de citocinas proinflamatorias.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
- Ratones
- C57BI/6 (Harlan/Olac)
- Péptido
- El péptido OVA_{257-264} (SIINFEKL), un epítopo restringido a MHC de clase I (H-2kb) de la ovoalbúmina de pollo (Rotzschke y col., 1991), se sintetizó por síntesis química F-moc en fase sólida convencional, se purificó por HPLC y su pureza se analizó mediante espectroscopia de masas
- \quad
- Dosis: 300 \mug/ratón
- Poli-L-arginina 60 (pR 60)
- Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 restos de arginina; SIGMA chemicals
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- U-ODN 13
- Los ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- tcc atg acu ttc ctg atg ct, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen.
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
\vskip1.000000\baselineskip
1. OVA_{257-264}
2. OVA_{257-264} + pR 60
3. OVA_{257-264} +
U-ODN 13
4. OVA_{257-264} +
U-ODN 13 + pR 60
A día 0, los ratones fueron inyectados en cada
almohadilla plantar de las patas traseras con un volumen total de
100 \mul (50 \mul por almohadilla) que contenían los componentes
mencionados anteriormente. Los animales se sacrificaron 4 días
después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos
poplíteos. Los ganglios linfáticos se pasaron a través de un filtro
para células de 70 \mum y se lavaron dos veces con medio DMEM
(GIBCO BRL) que contenía suero fetal de ternera al 5% (SFT, SIGMA
chemicals). El número apropiado de células se ajusto en medio
DMEM/SFT al 5%. Se realizó un ensayo ELISPOT para
IFN-\gamma por duplicado según se ha descrito
(Miyahira y col., 1995). Este procedimiento es un procedimiento
ampliamente utilizado que permite la cuantificación de células T
específicas del antígeno. Los linfocitos se estimularon ex
vivo por duplicado con medio (fondo-control),
péptido OVA_{257-264}, el péptido no relacionado
TRP-2_{181-188}, pR 60,
U-ODN 13 y Concanavalina A (Con A). Se contaron las
manchas que representaban células T individuales que producían
INF-\gamma y se restaron de todas las muestras los
valores de las manchas de fondo. El elevado número de manchas
detectadas tras la estimulación con Con A (datos no mostrados)
indica unas buenas condiciones de los linfocitos usados. En la
Figura 3 se ilustra el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células para cada grupo
experimental de ratones, se proporciona la desviación típica de los
duplicados estimulados ex vivo.
Este experimento muestra que los ODN de
monofosfato de desoxiuridina modificado también induce una respuesta
inmune frente a un péptido hidrófilo
(OVA_{257-264}). La inyección conjunta de
poli-L-arginina no tiene influencia
sobre esta respuesta inmune.
\newpage
Ejemplo
4
- Ratones
- C57BI/6 (Harlan/Olac)
- Péptido
- Péptido P1A derivado de mastocitoma P815 de ratón (LPYLGWLVF), restringido a MHC de clase I (H2-Ld) (Lethe y col., 1992).
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- Poli-L-arginina 60 (pR 60)
- Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 restos de arginina; SIGMA chemicals
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- U-ODN 13
- Los ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- tcc atg acu ttc ctg atg ct, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen.
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
\vskip1.000000\baselineskip
1. P1A_{35-43}
2. P1A_{35-43} + pR 60
3. P1A_{35-43} +
U-ODN 13
4. P1A_{35-43} +
U-ODN 13 + pR 60
A día 0, los ratones fueron inyectados en cada
almohadilla plantar de las patas traseras con un volumen total de
100 \mul (50 \mul por almohadilla) que contenían los componentes
mencionados anteriormente. Los animales se sacrificaron 4 días
después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos
poplíteos. Los ganglios linfáticos se pasaron a través de un filtro
para células de 70 \mum y se lavaron dos veces con medio DMEM
(GIBCO BRL) que contenía suero fetal de ternera al 5% (SFT, SIGMA
chemicals). El número apropiado de células se ajusto en medio
DMEM/SFT al 5%. Se realizó un ensayo ELISPOT para
IFN-\gamma por triplicado según se ha descrito
(Miyahira y col., 1995). Este procedimiento es un procedimiento
ampliamente utilizado que permite la cuantificación de células T
específicas del antígeno. Los linfocitos se estimularon ex
vivo por triplicado con medio (fondo-control),
péptido P1A_{35-43}, el péptido no relacionado CSP
(SYVPSAEQI), pR 60, U-ODN 13 y Concanavalina A (Con
A). Se contaron las manchas que representaban células T individuales
que producían INF-\gamma y se restaron de todas
las muestras los valores de las manchas de fondo. El elevado número
de manchas detectadas tras la estimulación con Con A (datos no
mostrados) indica unas buenas condiciones de los linfocitos usados.
En la Figura 4 se ilustra el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células para cada grupo
experimental de ratones, se proporciona la desviación típica de los
triplicados estimulados
ex vivo.
ex vivo.
Este experimento muestra cómo los ODN de
monofosfato de desoxiuridina modificados inducen una fuerte
respuesta inmune frente al péptido derivado de mastocitoma
P1A_{35-43}. Esta respuesta puede potenciarse
adicionalmente mediante la aplicación conjunta de
poli-L-arginina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Para mostrar que la eficacia de un
oligonucleótido basado en desoxiuridina según la presente invención
no depende del resto de la secuencia (por ejemplo, mediante una
base, motivo o secuencia de base específicos), una posibilidad
podría ser probar cada uno de estos oligonucleótidos por separado,
sin embargo, puesto que esto es prácticamente imposible (por
ejemplo, un oligonucleótido 20 mer podría abarcar 2,7x10^{11}
secuencias diferentes), en el presente ejemplo se eligió otra forma
para probar la independencia de la secuencia. El objetivo del
ejemplo presente era ensayar el mayor número de secuencias posible
de una vez, ya que sólo es limitante el ensayo in vivo y no
la síntesis. Por esta razón, se obtuvo el actual
U-ODN 15 (véase a continuación) que contenía más de
nueve mil millones de secuencias diferentes. Esto hace que cualquier
secuencia individual inmunoestimuladora se diluya 10^{-9} por
debajo de cualquier dosis eficaz. Sólo la presencia de restos de
desoxiuridina es constante en todas las secuencias y, por tanto, no
se diluye. Si, por tanto, los motivos de secuencia además de la
desoxiuridina fueron importantes para la eficacia de los
oligonucleótidos inmunoestimuladores, no serían eficaces en
U-ODN-15 debido a la elevada
dilución. Por otro lado, si la desoxiuridina es esencial para la
eficacia y el resto de la secuencia no es significativo,
U-ODN debería ser
eficaz.
eficaz.
- Ratones
- C57BI/6 (Harlan/Olac)
- Péptido
- El péptido TRP-2 (VYDFFVWL), un epítopo restringido a MHC de clase I (H-2kb) de la proteína 2 relacionada con tirosinasa de ratón (melanoma B16, Bloom, M.B. y col., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), se sintetizó por síntesis F-moc en fase sólida convencional, se purificó por HPLC y su pureza se analizó mediante espectroscopia de masas
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- Poli-L-arginina 60 (pR 60)
- Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 restos de arginina; SIGMA chemicals
- \quad
- Dosis: 100 \mug-0,1 \mug/ratón
- U-ODN 15
- El combinado de ODN sustituidos con tiofosfato que contienen monofosfato de desoxiuridina
- \quad
- nhh hhh wdu dhh hhh hhh wn, fue sintetizado por NAPS GmbH, Göttingen. (n = GCAT, h = CAT, w = AT, d = GAT)
- \quad
- Dosis: 5 nmoles - 0,005 moles/ratón
\vskip1.000000\baselineskip
1.
TRP-2_{181-188}
2.
TRP-2_{181-188} + pR 60 (100
\mug)
3.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 15 (5 nmoles)
4.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 15 (0,5 nmoles)
5.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 15 (0,05 nmoles)
6.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 15 (0,005 nmoles)
7.
TRP-2_{181-188} + pR 60 (100
\mug) + U-ODN 15 (5 nmoles)
8.
TRP-2_{181-188} + pR 60 (10
\mug) + U-ODN 15 (0,5 nmoles)
9.
TRP-2_{181-188} + pR 60 (1 \mug)
+ U-ODN 15 (0,05 nmoles)
10.
TRP-2_{181-188} + pR 60 (0,1
\mug) + U-ODN 15 (0,005 nmoles).
A día 0, los ratones fueron inyectados en cada
almohadilla plantar de las patas traseras con un volumen total de
100 \mul (50 \mul por almohadilla) que contenían los componentes
mencionados anteriormente.
Los animales se sacrificaron 4 días después de
la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos poplíteos. Los
ganglios linfáticos se pasaron a través de un filtro para células de
70 \mum y se lavaron dos veces con medio DMEM (GIBCO BRL) que
contenía suero fetal de ternera al 5% (SFT, SIGMA chemicals). El
número apropiado de células se ajusto en medio DMEM/SFT al 5%. Se
realizó un ensayo ELISPOT para IFN-\gamma por
triplicado según se ha descrito (Miyahira y col., 1995). Este
procedimiento es un procedimiento ampliamente utilizado que permite
la cuantificación de células T específicas del antígeno. Los
linfocitos se estimularon ex vivo por triplicado con medio
(fondo-control), péptido
TRP-2_{181-188}, el péptido no
relacionado OVA_{257-264}, pR 60,
U-ODN 15 y Concanavalina A (Con A). Se contaron las
manchas que representaban células T individuales que producían
INF-\gamma y se restaron de todas las muestras los
valores de las manchas de fondo. El elevado número de manchas
detectadas tras la estimulación con Con A (datos no mostrados)
indica unas buenas condiciones de los linfocitos usados. En la
Figura 5 se ilustra el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células para cada grupo
experimental de ratones, se proporciona la desviación típica de los
triplicados estimulados ex vivo.
\newpage
Este experimento muestra que la inyección de
TRP-2_{181-188} (péptido
hidrófobo) con un combinado de ODN de monofosfato de desoxiuridina
modificado (20 mer, 5 nmoles) potencia mucho las respuestas inmune
específicas de TRP-2_{181-188} en
comparación con la inyección de
TRP-2_{181-188} solo. Incluso
cuando se usaban 10 veces menos U-ODN 15 (0,5
nmoles) podían inducirse una fuerte respuesta inmune. La inyección
conjunta de poli-L-arginina con el
péptido y U-ODN 15 (5 nmoles) no influyen sobre esta
fuerte respuesta.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
- Ratones
- C57BI/6 (Harlan/Olac)
- Péptido
- El péptido TRP-2 (VYDFFVWL), un epítopo restringido a MHC de clase I (H-2kb) de la proteína 2 relacionada con tirosinasa de ratones (melanoma B16, Bloom, M.B. y col., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), se sintetizó por síntesis F-moc en fase sólida convencional, se purificó por HPLC y su pureza se analizó mediante espectroscopia de masas
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- U-ODN 16
- El combinado de ODN sustituidos con tiofosfato que contienen monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- hhh wdu dhh h, fue sintetizado por NAPS GmbH, Göttingen. (n = GCAT, h = CAT, w = AT, d = GAT)
- \quad
- Dosis: 10 nmoles/ratón
- ODN 20
- El combinado de ODN sustituidos con tiofosfato:
- \quad
- hhh wdd dhh h, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen. (n = GCAT, h = CAT, w = AT, d = GAT)
- \quad
- Dosis: 10 nmoles/ratón
\vskip1.000000\baselineskip
1.
TRP-2_{181-188}
2.
TRP-2_{181-188} +
U-ODN 16 (10 nmoles)
3.
TRP-2_{181-188} + ODN 20 (10
nmoles)
A día 0, los ratones fueron inyectados en cada
almohadilla plantar de las patas traseras con un volumen total de
100 \mul (50 \mul por almohadilla) que contenían los componentes
mencionados anteriormente. Los animales se sacrificaron 4 días
después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos
poplíteos. Los ganglios linfáticos se pasaron a través de un filtro
para células de 70 \mum y se lavaron dos veces con medio DMEM
(GIBCO BRL) que contenía suero fetal de ternera al 5% (SFT, SIGMA
chemicals). El número apropiado de células se ajusto en medio
DMEM/SFT al 5%. Se realizó un ensayo ELISPOT para
IFN-\gamma por triplicado según se ha descrito
(Miyahira y col., 1995). Este procedimiento es un procedimiento
ampliamente utilizado que permite la cuantificación de células T
específicas del antígeno. Los linfocitos se estimularon ex
vivo por triplicado con medio (fondo-control),
péptido TRP-2_{181-188}, el
péptido no relacionado OVA_{257-264},
U-ODN 16, ODN 20 y Concanavalina A (Con A). Se
contaron las manchas que representaban células T individuales que
producían INF-\gamma y se restaron de todas las
muestras los valores de las manchas de fondo. El elevado número de
manchas detectadas tras la estimulación con Con A (datos no
mostrados) indica unas buenas condiciones de los linfocitos usados.
En la Figura 6 se ilustra el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células para cada grupo
experimental de ratones, se proporciona la desviación típica de los
triplicados estimulados ex vivo.
Este experimento muestra que la inyección de
TRP-2_{181-188} (péptido
hidrófobo) con un combinado de ODN de monofosfato de desoxiuridina
modificados (10 mer) potencia mucho las respuestas inmune
específicas de TRP-2_{181-188} en
comparación con la inyección de
TRP-2_{181-188} solo o en
combinación con ODN 20.
\newpage
Ejemplo
7
- Ratones
- C57BI/6 (Harlan/Olac)
- Péptido
- El péptido TRP-2 (VYDFFVWL), un epítopo restringido a MHC de clase I (H-2kb) de la proteína 2 relacionada con tirosinasa de ratón (melanoma B16, Bloom, M.B. y col., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), se sintetizó por síntesis F-moc en fase sólida convencional, se purificó por HPLC y su pureza se analizó mediante espectroscopia de masas
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- Poli-L-arginina 60 (pR 60)
- Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 restos de arginina; SIGMA chemicals
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- ODN 21
- Los ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- uau aua uau aua uau aua uau aua ua, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen.
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
- ODN 22
- Los ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- uiu iui uiu iui uiu iui uiu iui ui, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen.
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
\vskip1.000000\baselineskip
1.
TRP-2_{181-188}
2.
TRP-2_{181-188} + pR 60
3.
TRP-2_{181-188} + ODN 21
4.
TRP-2_{181-188} + pR 60 + ODN
21
5.
TRP-2_{181-188} + ODN 22
6.
TRP-2_{181-188} + pR 60 + ODN
22
A día 0, los ratones fueron inyectados en cada
almohadilla plantar de las patas traseras con un volumen total de
100 \mul (50 \mul por almohadilla) que contenían los componentes
mencionados anteriormente. Los animales se sacrificaron 4 días
después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos
poplíteos. Los ganglios linfáticos se pasaron a través de un filtro
para células de 70 \mum y se lavaron dos veces con medio DMEM
(GIBCO BRL) que contenía suero fetal de ternera al 5% (SFT, SIGMA
chemicals). El número apropiado de células se ajustó en medio
DMEM/SFT al 5%. Se realizó un ensayo ELISPOT para
IFN-\gamma por triplicado según se ha descrito
(Miyahira y col., 1995). Este procedimiento es un procedimiento
ampliamente utilizado que permite la cuantificación de células T
específicas del antígeno. Los linfocitos se estimularon ex
vivo por triplicado con medio (fondo-control),
péptido TRP-2_{181-188}, el
péptido no relacionado OVA_{257-264}, pR 60, ODN
21 ó 22 y Concanavalina A (Con A). Se contaron las manchas que
representaban células T individuales que producían
INF-\gamma y se restaron de todas las muestras los
valores de las manchas de fondo. El elevado número de manchas
detectadas tras la estimulación con Con A (datos no mostrados)
indica unas buenas condiciones de los linfocitos usados. En la
Figura 7 se ilustra el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células para cada grupo
experimental de ratones, se proporciona la desviación típica de los
triplicados estimulados ex vivo.
\newpage
Ejemplo
8
- Ratones
- C57BI/6 (Harlan/Olac)
- Péptido
- El péptido TRP-2 (VYDFFVWL), un epítopo restringido a MHC de clase I (H-2kb) de la proteína 2 relacionada con tirosinasa de ratón (melanoma B16, Bloom, M.B. y col., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), se sintetizó por síntesis F-moc en fase sólida convencional, se purificó por HPLC y su pureza se analizó mediante espectroscopia de masas
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- Poli-L-arginina 60 (pR 60)
- Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 restos de arginina; SIGMA chemicals
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- ODN 24
- Los ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- uuu uuu uuu uuu uuu uuu uuu uuu ut, fueron sintetizados por NAPS GmbH, Göttingen.
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
\vskip1.000000\baselineskip
1.
TRP-2_{181-188}
2.
TRP-2_{181-188} + pR 60
3.
TRP-2_{181-188} + ODN 24
4.
TRP-2_{181-188} + pR 60 + ODN
24
A día 0, los ratones fueron inyectados en cada
almohadilla plantar de las patas traseras con un volumen total de
100 \mul (50 \mul por almohadilla) que contenían los componentes
mencionados anteriormente. Los animales se sacrificaron 4 días
después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos
poplíteos. Los ganglios linfáticos se pasaron a través de un filtro
para células de 70 \mum y se lavaron dos veces con medio DMEM
(GIBCO BRL) que contenía suero fetal de ternera al 5% (SFT, SIGMA
chemicals). El número apropiado de células se ajusto en medio
DMEM/SFT al 5%. Se realizó un ensayo ELISPOT para
IFN-\gamma por triplicado según se ha descrito
(Miyahira y col., 1995). Este procedimiento es un procedimiento
ampliamente utilizado que permite la cuantificación de células T
específicas del antígeno. Los linfocitos se estimularon ex
vivo por triplicado con medio (fondo-control),
péptido TRP-2_{181-188}, el
péptido no relacionado OVA_{257-264}, pR 60, ODN
24 y Concanavalina A (Con A). Se contaron las manchas que
representaban células T individuales que producían
INF-\gamma y se restaron de todas las muestras los
valores de las manchas de fondo. El elevado número de manchas
detectadas tras la estimulación con Con A (datos no mostrados)
indica unas buenas condiciones de los linfocitos usados. En la
Figura 8 se ilustra el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células para cada grupo
experimental de ratones, se proporciona
\hbox{la desviación
típica de los triplicados estimulados ex vivo .}
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Para ilustrar y potenciar adicionalmente los
resultados del ejemplo 5, se realizaron además otros ejemplos
basados en U-ODN 16 (como se define en el ejemplo
6). Por razones comparativas, se usaron variantes en las que la
secuencia no contenía una base específica. U-ODN
16-A no contiene adenina, U-ODN
16-C no contiene citosina, U-ODN
16-G no contienen guanina y U-ODN
16-T no contiene timina. Si para mostrar eficacia,
además de desoxiuridina, fuera necesaria otra base específica, el
oligonucleótido correspondiente no debería mostrar eficacia alguna.
Sin embargo, si la desoxiuridina fuera suficiente para desarrollar
eficacia, entonces, se generarían células T productoras de
IFN-\gamma.
- Ratones
- C57BI/6 (Harlan/Olac)
- Péptido
- El péptido TRP-2 (VYDFFVWL), un epítopo restringido a MHC de clase I (H-2kb) de la proteína 2 relacionada con tirosinasa de ratón (melanoma B16, Bloom, M.B. y col., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), se sintetizó por síntesis F-moc en fase sólida convencional, se purificó por HPLC y su pureza se analizó mediante espectroscopia de masas
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- Poli-L-arginina 60 (pR 60)
- Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 restos de arginina; SIGMA chemicals
- \quad
- Dosis: 100 \mug/ratón
- ODN 16
- El combinado de ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- hhh wdu dhh h, fue sintetizado por NAPS GmbH, Göttingen. (h = CAT, w = AT, d = GAT)
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
- ODN 16-A
- El combinado de ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- aaa bcu caa a, fue sintetizado por NAPS GmbH, Göttingen. (a = CT, b : T, c = GT)
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
- ODN 16-G
- El combinado de ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- hhh wwu whh h, fue sintetizado por NAPS GmbH, Göttingen. (h = CAT, w = AT)
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
- ODN 16-C
- El combinado de ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- www wdu dww w, fue sintetizado por NAPS GmbH, Göttingen. (w = AT, d = GAT)
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
- ODN 16-T
- El combinado de ODN sustituidos con tiofosfato que contenían monofosfato de desoxiuridina:
- \quad
- eee fgu gee e, fue sintetizada por NAPS GmbH, Göttingen. (e = CA, F = A, g = GA)
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
- ODN 28
- La combinación de ODN sustituidos con tiofosfato que contenían desoxiuridina monofosfato:
- \quad
- hhh xdu dhh h, fue sintetizado por NAPS GmbH, Göttingen. (w = AT, d = GAT)
- \quad
- Dosis: 5 nmoles/ratón
\vskip1.000000\baselineskip
1.
TRP-2_{181-188}
2.
TRP-2_{181-188} + pR 60
3.
TRP-2_{181-188} + ODN 16
4.
TRP-2_{181-188} + ODN
16-A
5.
TRP-2_{181-188} + ODN
16-G
6.
TRP-2_{181-188} + ODN
16-C
7.
TRP-2_{181-188} + ODN
16-T
8.
TRP-2_{181-188} + ODN 28
9.
TRP-2_{181-188} + pR 60 + ODN
16
10.
TRP-2_{181-188} + pR 60 + ODN
16-A
11.
TRP-2_{181-188} + pR 60 + ODN
16-G
12.
TRP-2_{181-188} + pR 60 + ODN
16-C
13.
TRP-2_{181-188} + pR 60 + ODN
16-T
14.
TRP-2_{181-188} + pR 60 + ODN
28
A día 0, los ratones fueron inyectados en cada
almohadilla plantar de las patas traseras con un volumen total de
100 \mul (50 \mul por almohadilla) que contenían los componentes
mencionados anteriormente. Los animales se sacrificaron 4 días
después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos
poplíteos. Los ganglios linfáticos se pasaron a través de un filtro
para células de 70 \mum y se lavaron dos veces con medio DMEM
(GIBCO BRL) que contenía suero fetal de ternera al 5% (SFT, SIGMA
chemicals). El número apropiado de células se ajusto en medio
DMEM/SFT al 5%. Se realizó un ensayo ELISPOT para
IFN-\gamma por triplicado según se ha descrito
(Miyahira y col., 1995). Este procedimiento es un procedimiento
ampliamente utilizado que permite la cuantificación de células T
específicas del antígeno. Los linfocitos se estimularon ex
vivo por triplicado con medio (fondo-control),
péptido TRP-2_{181-188}, el
péptido no relacionado OVA_{257-264}, pR 60, los
diferentes ODN y Concanavalina A (Con A). Se contaron las manchas
que representaban células T individuales que producían
INF-\gamma y se restaron de todas las muestras los
valores de las manchas de fondo. El elevado número de manchas
detectadas tras la estimulación con Con A (datos no mostrados)
indica unas buenas condiciones de los linfocitos usados. En la
Figura 9 se ilustra el número de células que producen
IFN-\gamma/1x10^{6} células para cada grupo
experimental de ratones, se proporciona la desviación típica de los
triplicados estimulados ex vivo.
La Figura 9 muestra claramente cómo todas las
secuencias son eficaces, lo que lleva a la conclusión de que los
oligonucleótidos que contienen desoxiuridina no necesitan ninguna
secuencia específica alrededor o bases definidas (por ejemplo, una
secuencia motivo específica) para mostrar eficacia. Esta conclusión
también fue comprobada para U-ODN 21 (que contiene
sólo desoxiuridina y desoxiadenosina), U-ODN 22 y
U-ODN 24 (que ya no contiene ninguna base de ADN de
origen natural). Por tanto, está claro que la eficacia de los
oligonucleótidos según la presente invención, se basa en la
desoxiuridina en sí, pero no necesita ningún motivo específico de
base o bases específicas que aparecen de forma natural en el
ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacnt tcctgctgat gct
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> u
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20) .. (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnhhhhhwdnd hhhhhhhhwn
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiphhhwdndhhh
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Ala Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu
Lys Ile Gly Glu Lys}
\sac{Leu Lys Lys Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asn
Phe Phe Gln Lys Leu Val}
\sac{Pro Gln Pro Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9) .. (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacnt tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pollo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Tyr Leu Gly Trp Leu Val Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnanananana nanananana nanana
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=u; s=i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnsnsnsnsns nsnsnsnsns nsnsns
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipaaabcncaaa
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiphhhwwnwhhh
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
<210 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> U
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipwwwwdndwww
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> s=c o a
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n=u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipsssagngsss
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiphhhtdndhhy
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PROT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Tyr Val Pro Ser Ala Glu Gln Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiphhhwdddhhh
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Uso de una molécula de ácido
oligodesoxinucleico (ODN) que tiene la estructura según la fórmula
(I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que cualquier X es O u
S.
cualquier NMP es 2'-monofosfato
o monotiofosfato de desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo
compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina-,
desoxiguanosina-, desoxiinosina-, desoxicitosina-, desoxiuri-
dina-, desoxitimidina-, 2-metil-desoxiinosina-, 5-metil-desoxicitosina-, desoxipseudouridina-, desoxirribosapurina-, 2-amino-desoxirribosapurina-, 6-S-desoxiguanina-, 2-dimetil-desoxiguanosina- o N-isopentenil-desoxiadenosina,
dina-, desoxitimidina-, 2-metil-desoxiinosina-, 5-metil-desoxicitosina-, desoxipseudouridina-, desoxirribosapurina-, 2-amino-desoxirribosapurina-, 6-S-desoxiguanina-, 2-dimetil-desoxiguanosina- o N-isopentenil-desoxiadenosina,
NUC es un 2' desoxinucleósido seleccionado entre
el grupo compuesto por desoxiadenosina-, desoxiguanosina-,
desoxiinosina-, desoxicitosina-, desoxiuridina-, desoxitimidina-,
2-metil-desoxiinosina-,
5-metil-desoxicitosina-, de-
soxipseudouridina-, desoxirribosapurina-, 2-amino-desoxirribosapurina-, 6-S-desoxiguanina-, 2-dimetil-desoxigua-
nosina- o N-isopentenil-desoxiadenosina,
soxipseudouridina-, desoxirribosapurina-, 2-amino-desoxirribosapurina-, 6-S-desoxiguanina-, 2-dimetil-desoxigua-
nosina- o N-isopentenil-desoxiadenosina,
a y b son números enteros de 0 a 100 con la
condición de que la suma de a + b esté entre 4 y 150,
B y E son grupos comunes de los extremos 5' o 3'
de moléculas de ácido nucleico y se seleccionan independientemente
entre el grupo compuesto por -H, -CH_{3}, -COH, -COCH_{3}, -OH,
-CHO, -PO_{4}, -PSO_{3}, -PSO_{2}, -PS_{3}O, -PS_{4},
-SO_{3},
-PO_{4}-(CH_{2})_{1-6}-NH_{2}
o
-PO_{4}-(CH_{2})_{1-6}-NH-marcado,
para preparar una composición farmacéutica inmunoestimuladora.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que
cualquier NMP se selecciona entre el grupo compuesto por monofosfato
o monotiofosfato desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxiinosina,
desoxicitosina, desoxiuridina, desoxitimidina,
2-metil-desoxiuridina y
5-metil-desoxicitosina.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque a + b está entre 10 y 60,
preferiblemente entre 15 y 40.
4. Uso según cualquiera de la reivindicaciones 1
a 3, caracterizado porque al menos uno de X_{1} y X_{2}
es S y al menos uno de X_{3} y X_{4} es O, y preferiblemente
cualquier NMP es un nucleósido monotiofosfato.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho ODN
contiene la secuencia
en la
que,
cualquier n es un 2'-monofosfato
o monotiofosfato de desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo
compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina,
desoxiguanosina, desoxicitosina o desoxitimidina
cualquier h es un 2'-monofosfato
o monotiofosfato de desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo
compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina,
desoxicitosina o desoxitimidina
u es monofosfato o monotiofosfato de
desoxiuridina, cuando w es un 2'-monofosfato o
monotiofosfato de desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo
compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina o
desoxitimidina, y cualquier d es un 2'-monofosfato
o monotiofosfato de desoxinucleósido, seleccionado entre el grupo
compuesto por monofosfato o monotiofosfato de desoxiadenosina,
desoxiguanosina o desoxitimidina.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, caracterizado porque dicho ODN contiene al menos
2'-monofosfato o monotiofosfato de desoxicitosina
3'-adyacente a un 2'-monofosfato o
monotiofosfato de desoxiuridina.
7. Uso según cualquier de las reivindicaciones 1
a 6, caracterizado porque dicho ODN contiene la secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
a es monofosfato o monotiofosfato de
desoxiadenosina,
g es monofosfato o monotiofosfato de
desoxiguanosina,
u es monofosfato o monotiofosfato de
desoxiuridina,
c es monofosfato o monotiofosfato de
desoxicitosina y
t es monofosfato o monotiofosfato de
desoxitimidina.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7, caracterizado porque dicho ODN contiene la
secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que w, d, u y n se definen
como
anteriormente.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 8, caracterizado porque dicha composición farmacéutica
inmunoestimuladora es una vacuna.
10. Composición farmacéutica que comprende un
ODN como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
11. Composición farmacéutica que comprende
- un ODN como se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 y
- un antígeno.
12. Composición farmacéutica según las
reivindicaciones 10 u 11, caracterizada porque además
comprende un polímero policatiónico, preferiblemente un péptido
policatiónico, especialmente poliarginina, polilisina o un péptido
antimicrobiano, especialmente un péptido antimicrobiano derivado de
catelicidina, un péptido sintético que contiene 2 motivos KLK
separado por un enlazador de 3 a 7 aminoácidos hidrófobos o una
hormona de crecimiento, especialmente una hormona de crecimiento
humana.
13. Composición farmacéuticos según una
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 que además comprende
ingredientes activos adicionales, especialmente citocinas,
sustancias antiinflamatorias, sustancias antimicrobianas o
combinaciones de las mismas.
14. Composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizada
porque además contiene sustancias auxiliares, especialmente un
vehículo farmacéuticamente aceptable, sustancias tamponadoras,
estabilizadores o combinaciones de los mismos.
15. Composición farmacéutica según una
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizada
porque contiene de 1 ng a 1 g, preferiblemente de 100 ng a 10 mg,
especialmente de 10 \mug a 1 mg, de uno o más ODN según una
cualquiera de la reivindicaciones 1 a 9.
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