ES2284859T3 - Procedimiento para modular la proliferacion de celulas de carcinoma medular tiroideo. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para modular la tasa de proliferación de células de carcinoma medular tiroideo que comprende poner en contacto células de CMT in vitro con uno o más agonistas de SSTR2 y uno o más agonistas de SSTR5, en el que dicho agonista de SSTR2 reduce la tasa de proliferación de las células de CMT y dicho agonista de SSTR5 atenúa la reducción inducida por el agonista de SSTR-2 en la tasa de proliferación celular.
Description
Procedimiento para modular la proliferación de
células de carcinoma medular tiroideo.
Se ha demostrado que la somatostatina (SS), un
tetradecapéptido descubierto por Brazeau y col., tiene potentes
efectos inhibidores sobre varios procesos secretores en tejidos
tales como la pituitaria, el páncreas y el tracto gastrointestinal.
La SS también actúa como un neuromodulador en el sistema nervioso
central. Estos efectos biológicos de la SS, todos de naturaleza
inhibidora, son desencadenados a través de una serie de receptores
acoplados a proteínas G, de los cuales se han caracterizado cinco
subtipos diferentes (SSTR1 - SSTR5) (Reubi JC, y col., Cancer Res
47: 551-558, Reisine T, y col., Endocrine Review 16:
427-442, Lamberts SW, y col., Endocr Rev 12:
450-482, 4 Patel YC, 1999 Front Neuroendocrinology
20: 157-198). Estos cinco subtipos tienen unas
afinidades similares por los ligandos endógenos de la SS, pero
tienen una distribución diferente en diversos tejidos. La
somatostatina se une a los cinco subtipos distintos de receptores
(SSTR) con una afinidad relativamente alta e igual para cada
subtipo.
Existen pruebas de que la SS regula la
proliferación celular deteniendo el crecimiento celular a través de
los subtipos de SSTR1, 2, 4 y 5 (Buscail L, y col., 1995 Proc Natl
Acad Sci EE.UU. 92: 1580-1584; Buscail L, y col.,
1994 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 91: 2315-2319; Florio
T, y col., 1999 Mol Endocrinol 13: 24-37; Sharma K,
y col., 1999 Mol Endocrinol 13: 82-90), o induciendo
apoptosis a través del subtipo SSTR3 (Sharma K, y col., 1996 Mol
Endocrinol 10: 1688-1696). Se ha demostrado que la
SS y diversos análogos inhiben la proliferación celular normal y
neoplásica in vitro e in vivo (Lamberts SW, y col.,
Endocr Rev 12: 450-482) a través de receptores
específicos de la SS (SSTR) (Patel YC, 1999 Front Neuroendocrinology
20: 157-198) y posiblemente en diferentes acciones
postreceptor (Weckbecker G, y col., Pharmacol Ther 60:
245-264; Bell GI, Reisine T 1993 Trends Neurosci 16:
34-38; Patel YC, y col., Biochem Biophys Res Commun
198: 605-612; Law SF, y col., Cell Signal 7:
1-8). Además, existen pruebas de que los distintos
subtipos de SSTR son expresados en tejidos humanos normales y
neoplásicos (Virgolini I, y col., Eur J Clin Invest 27:
645-647), confiriendo diferentes afinidades
tisulares para los diversos análogos de la SS y una respuesta
clínica variable a sus efectos terapéuticos.
La unión a los diferentes tipos de subtipos de
receptores de somatostatina se ha asociado con el tratamiento de
diversas dolencias y/o enfermedades. Por ejemplo, la inhibición de
la hormona del crecimiento se ha atribuido al receptor de la
somatostatina de tipo 2 ("SSTR2") (Raynor, y col., Molecular
Pharmacol. 43: 838 (1993); Lloyd, y col., Am. J. Physiol. 268: G102
(1995)), mientras que la inhibición de la insulina se ha atribuido
al receptor de la somatostatina de tipo 5 ("SSTR5") (Coy, y
col. 197: 366-371 (1993)). La activación de los
tipos 2 y 5 se ha asociado con la supresión de la hormona del
crecimiento, y más particularmente, de adenomas secretores de GH
(acromegalia) y adenomas secretores de TSH. La activación del tipo 2
pero no del tipo 5 se ha asociado con el tratamiento de adenomas
secretores de prolactina. Otras indicaciones asociadas con la
activación de los subtipos de receptores de somatostatina incluyen
la inhibición de la insulina y/o el glucagón para tratar la diabetes
sacarina, angiopatías, retinopatía proliferativa, fenómeno del alba
y nefropatías; inhibición de la secreción de ácido gástrico, y más
particularmente de úlceras pépticas, fístulas enterocutáneas y
pancreaticocutáneas, síndrome de intestino irritable, síndrome de
evacuación gástrica rápida, síndrome de diarrea líquida, diarrea
asociada al SIDA, diarrea inducida por quimioterapia, pancreatitis
aguda o crónica y tumores secretores de hormona gastrointestinal;
tratamiento del cáncer, tal como del hepatoma; inhibición de la
angiogénesis; tratamiento de alteraciones inflamatorias tales como
la artritis; retinopatía; rechazo crónico de alotransplantes;
angioplastia; prevención de de las hemorragias de vasos
trasplantados y gastrointestinales. Se prefiere tener un análogo que
sea selectivo para el subtipo o subtipos de receptores específicos
de la somatostatina responsables de la respuesta biológica deseada,
reduciendo por tanto la interacción con otros subtipos de receptores
que podría dar lugar a efectos secundarios indeseables.
La somatostatina (SS) y sus receptores (SSTR1 a
SSTR5) se expresan en las células parafoliculares C normales humanas
y en células de carcinoma medular tiroideo (CMT). El CMT es un tumor
que se origina en las células parafoliculares C tiroideas que
produce calcitonina (CT), somatostatina, así como otros diversos
péptidos (Moreau JP, y col., Metabolism 45 (8 Suppl 1):
24-26). Recientemente, Mato y col. demostraron que
la SS y los SSTR son expresados en el CMT humano (Mato E, y col., J
Clin Endocrinol Metab 83: 2417-2420). Se ha
documentado que la SS y sus análogos inducen una disminución en los
niveles plasmáticos de CT y una mejora sintomática en los pacientes
con CMT. Sin embargo, hasta ahora la actividad antiproliferativa de
los análogos de la SS sobre las células tumorales no había sido
demostrada claramente (Mahler C, y col., Clin Endocrinol 33:
261-9; Lupoli G, y col., Cancer 78:
1114-8; Smid WM, y col., Neth J Med 40:
240-243). Por lo tanto, el desarrollo y la
valoración de los análogos selectivos de los subtipos de SSTR sobre
el crecimiento de células de CMT proporcionan una herramienta útil
para su aplicación clínica. Hasta ahora no se había informado de
ningún dato relativo a la implicación específica de los subtipos de
SSTR en la regulación del crecimiento de las células de CMT.
La presente invención se refiere al
descubrimiento de que la línea celular de CMT humano TT, que muestra
características celulares del CMT (Zabel M, y col., 1992
Histochemistry 102: 323-327, 2 Gagel RF, y col.,
1986 Endocrinology 118: 1643-1651, Liu JL, y col.,
1995 Endocrinology 136: 2389-2396) y que expresa de
forma estable todos los subtipos de SSTR, responde a la activación
de SSTR2 y de SSTR5 mediante agonistas selectivos de subtipo con dos
patrones diferentes en términos de incorporación de
[^{3}H]thy y del número de células. Los agonistas
preferentes del SSTR2 suprimen significativamente la incorporación
de [^{3}H]thy, es decir, inhiben la síntesis de ADN y
reducen la proliferación celular. Los agonistas selectivos del SSTR5
aumentan significativamente la incorporación de [^{3}H]thy
en células TT, es decir, aumentan la síntesis de ADN, pero
individualmente fracasan para influir en la proliferación celular.
Adicionalmente, los antagonistas del SSTR2 contrarrestan la acción
de los agonistas preferentes del SSTR2 sobre las células TT. Además,
el aumento de las concentraciones de un agonista selectivo de SSTR5
de una forma dependiente de la dosis evita la supresión de de la
incorporación de [^{3}H]thy en las células TT y la
proliferación producida por un agonista preferente de SSTR2, y
viceversa, mostrando un antagonismo entre dichos agonistas.
Recientemente se han demostrado las
interacciones hetero y homodiméricas entre los subtipos de las
familias de los receptores de opiáceos (Jordan BA, y col., 1999
Nature 399: 697-700.) y SS (Rocheville M, y col.,
2000 J. Biol. Chem. 275: 7862-7869). Los estudios en
células cultivadas de adenoma de pituitaria han demostrado que los
subtipos de SSTR 2 y 5 actúan sinérgicamente en la supresión de la
hormona de crecimiento y la secreción de prolactina (Shimon I, y
col., 1997 J. Clinical Invest. 100: 2386-2392,
Jaquet P, y col., 2000 J Clin Endocrinol Metab. 85:
781-792). El hallazgo de que la activación del SSTR5
reduce la actividad antiproliferativa mediada por el SSTR2 difiere
de los resultados en otros tejidos (Patel YC, 1999 Front
Neuroendocrinology 20: 157-198, Buscail L, y col.,
1995 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 92: 1580-1584,
Buscail L, y col., 1994 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 91:
2315-2319, Sharma K, y col., 1996 Mol Endocrinol 10:
1688-1696). Esta es la primera demostración de que
los subtipos de SSTR 2 y 5 pueden actuar en forma de antagonista
para regular el crecimiento celular.
Por lo tanto, los agonistas preferentes de SSTR2
y SSTR5 ejercen efectos diferenciales sobre la proliferación de la
línea celular TT de carcinoma medular tiroideo humano in
vitro, según su selectividad específica para SSTR. La
proliferación de la línea celular TT puede ser reducida por
agonistas selectivos de SSTR2, pero no por agonistas de SSTR5, y un
agonista de SSTR5 puede evitar los efectos antiproliferativos
mediados por el SSTR2. El papel inhibidor clave del SSTR2 sobre la
proliferación de las células de CMT demuestra que los análogos con
una afinidad y una selectividad por SSTR2 incrementadas con respecto
a SSTR5 serían útiles como agentes antiproliferativos en el
tratamiento del CMT.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que los agonistas de somatostatina selectivos para
el SSTR-2 son eficaces para reducir la tasa de
proliferación de las células de carcinoma medular tiroideo, y que
los agonistas de somatostatina selectivos para el
SSTR-5 son eficaces para atenuar esta reducción
inducida por el agonista del SSTR-2 en la tasa de
proliferación.
En un aspecto, la presente invención está
dirigida a un procedimiento para modular la tasa de proliferación de
células de CMT in vitro que comprende poner en contacto
células de CMT con uno o más agonistas de SSTR2 y uno o más
agonistas de SSTR5, en el que dicho agonista de SSTR2 sirve para
reducir la tasa de proliferación de las células de CMT, y dicho
agonista de SSTR5 sirve para atenuar la reducción inducida por el
agonista de SSTR-2 en la tasa de proliferación.
En una forma de realización, la invención está
dirigida al procedimiento inmediatamente anterior en el que dicho
agonista de SSTR-5 es
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2}
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra forma de realización, la invención está
dirigida a un procedimiento para disminuir la tasa de proliferación
de las células de carcinoma medular tiroideo que comprende poner en
contacto células de carcinoma medular tiroideo in vitro con
uno o más agonistas de SSTR2 o una sal farmacéuticamente aceptable
del mismo.
En un ejemplo preferido de la forma de
realización inmediatamente anterior, el agonista de
SSTR-2 es un agonista selectivo de
SSTR-2. En un ejemplo más preferido, el agonista de
SSTR-2 o la sal farmacéuticamente aceptable del
mismo tiene un valor de Ki para el SSTR-5 que es al
menos 2 veces mayor del que tiene para el SSTR-2,
más preferiblemente al menos 5 veces mayor del que tiene para el
SSTR-2, aún más preferiblemente al menos 10 veces
mayor del que tiene para el SSTR-2.
En otro ejemplo preferido de la forma de
realización anterior, el agonista de SSTR-2, o la
sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene un valor de Ki
menor de 5 nM, más preferiblemente menor de 1 nM.
En otro ejemplo preferido de la forma de
realización anterior, el agonista selectivo de
SSTR-2 es un compuesto elegido de la lista
constituida por
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2},
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe],
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2}
y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etansulfonilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que
"4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetilo"
denota la estructura:
y
"4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etansulfonilo-"
denota la
estructura:
En una tercera forma de realización, la
invención está dirigida al uso de una cantidad efectiva de un
agonista de SSTR2 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en
la fabricación de un medicamento para tratar el carcinoma medular
tiroideo.
En un ejemplo preferido de la tercera forma de
realización, el agonista de SSTR-2 es un agonista
selectivo de SSTR-2. En un ejemplo más preferido, el
agonista de SSTR-2, o la sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, tiene un valor de Ki para el
SSTR-5 que es al menos 2 veces mayor del que tiene
para SSTR-2, más preferiblemente al menos 5 veces
mayor del que tiene para el SSTR-2, aún más
preferiblemente al menos 10 veces mayor del que tiene para el
SSTR-2.
En otro ejemplo preferido de la tercera forma de
realización, el agonista de SSTR-2, o la sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene un valor de Ki menor de
5 nM, más preferiblemente menor de 1 nM.
En otro ejemplo preferido más de la tercera
forma de realización, el agonista selectivo de
SSTR-2 es un compuesto elegido de la lista
constituida por
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2},
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe],
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2}
y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etansulfonilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que
"4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetilo"
y
"4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etansulfonilo"
son según se definió previamente.
De forma relevante, como es bien sabido en la
técnica, la terapia convencional con yodo radiactivo, por ejemplo,
la administración de una sal de yodo radiactivo a un paciente, no
está disponible para el tratamiento del carcinoma medular tiroideo
dado que las células parafoliculares no captan yodo. Por lo tanto,
en otro aspecto, la invención proporciona el uso de una cantidad
efectiva de un agonista de SSTR2 o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, en el que dicho agonista de
SSTR-2 o la sal farmacéuticamente aceptable del
mismo comprende un resto de Tyr(I), en el que el átomo de
yodo de dicho resto de Tyr(I) comprende un isótopo de yodo
radioactivo en la fabricación de un medicamento para tratar el
carcinoma medular tiroideo. Preferiblemente, dicho isótopo de yodo
comprende ^{125}I, ^{127}I o ^{131}I.
En una forma de realización de la invención,
dichas células de carcinoma medular tiroideo han formado metástasis
fuera del tiroides. En una forma de realización adicional, dichas
metástasis están presentes en la linfa, el pulmón, el hígado, el
cerebro o el hueso.
Se recogieron células CHO-K1,
que expresan el SSTR2 humano, según se describe en Material y
Procedimientos, entonces se añadieron los análogos de SS
(10^{-7}-10^{-6} M) para medir la movilización
de Ca^{2+} intracelular, expresada como la proporción entre la
concentración de calcio intracelular medida después de la adición de
los análogos de SS y el valor observado en el nivel basal. Las
longitudes de onda de excitación y de emisión fueron de 340 y 510
nm, respectivamente. Los datos están representados como la media
\pm EEM.
Se recogieron células CHO-K1,
que expresan el SSTR5 humano, según se describe en Material y
Procedimientos, entonces se añadieron los análogos de SS
(10^{-7}-10^{-6} M) para medir la movilización
de Ca^{2+} intracelular, expresada como la proporción entre la
concentración de calcio intracelular medida después de la adición de
los análogos de SS (Compuesto 1, Compuesto 5 y Compuesto 6) y el
valor observado en el nivel basal. Las longitudes de onda de
excitación y de emisión fueron de 340 y 510 nm, respectivamente. Los
datos están representados como la media \pm EEM.
Las estructuras de los compuestos que aparecen
en la Figura 2 son como sigue:
- Compuesto 1:
- D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2} (ID. SEC. Nº: 2);
- Compuesto 2:
- ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe] (ID. SEC. Nº: 3);
- Compuesto 3:
- 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2} (ID. SEC. Nº: 4);
- Compuesto 4:
- 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etansulfonilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr- NH_{2} (ID. SEC. Nº: 5);
- Compuesto 5:
- D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2} (ID. SEC. Nº: 1); y
- Compuesto 6:
- Cpa-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-Nal-NH_{2} (ID. SEC. Nº: 6).
Se recogieron células CHO-K1,
que expresan el SSTR2 humano, según se describe en Material y
Procedimientos, entonces se añadieron Compuesto 6
(10^{-9}-10^{-6} M) y SS (10 nM) para medir el
efecto del Compuesto 6 sobre la movilización de calcio intracelular
estimulada por SS (10^{-8} M), y se expresó como el porcentaje
frente a SS sola. Las longitudes de onda de excitación y de emisión
fueron de 340 y 510 nm, respectivamente. Los datos están
representados como la media \pm EEM.
El ARN extraído (1 \mug/reacción) se trató con
desoxirribonucleasa y se sometió a una transcripción inversa usando
Oligo(dT) como cebador. Las muestras incubadas sin enzima RT
sirvieron como control. Las alícuotas del ADNc generado y los
controles negativos se sometieron a una subsiguiente amplificación
mediante PCR de los SSTR, usando los cebadores indicados en la Tabla
1. Los productos de la PCR se resolvieron en un gel de agarosa al
2%. Los productos de la PCR esperados de los SSTR
1-5 se representan en A (carril M, marcador de PCR;
G, producto de PCR de la amplificación con GAPDH).
Las células se incubaron en placas de 24
pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo complementado con
análogos de SS a varias concentraciones (10^{-9}, 10^{-8},
10^{-7} y 10^{-6} M). Los pocillos de control se trataron con la
disolución vehicular y se midió la incorporación de
[^{3}H]thy como radioactividad en el material precipitado
con TCA. Los datos de seis experimentos individuales evaluados
independientemente por cuadruplicado se expresan como la media \pm
EEM del porcentaje de inhibición por incorporación de
[^{3}H]thy frente a las células de control sin tratar
^{*}P< 0,05 y ^{**}P< 0,01 frente a control.
Las células se incubaron en placas de 96
pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo complementado con
análogos de SS a varias concentraciones (10^{-9}, 10^{-8},
10^{-7} y 10^{-6} M). Los pocillos de control se trataron con la
disolución vehicular. La proliferación de las células TT se midió
como la absorbancia a 490 nM de cada pocillo. Los datos de seis
experimentos individuales se evaluaron independientemente con ocho
replicados expresados como la media \pm EEM del porcentaje de
inhibición de la proliferación celular frente a las células de
control sin tratar ^{*}P< 0,05 y ^{**}P< 0,01 frente a
control.
Panel superior: las células se incubaron en
placas de 24 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo
complementado con 100 nM de Compuesto 1 o de Compuesto 2, con o sin
Compuesto 6 (10^{-7} M). Los pocillos de control se trataron con
la disolución vehicular. La incorporación de [^{3}H]thy se
midió como radioactividad en el material precipitado con TCA. Los
datos de seis experimentos individuales se evaluaron
independientemente con cuatro replicados expresados como la media
\pm EEM del porcentaje de inhibición de la incorporación de
[^{3}H]thy frente a las células de control sin tratar
^{*}P< 0,05 y ^{**}P< 0,01 frente a control.
Panel inferior: las células se incubaron en
placas de 96 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo
complementado con 10^{-7} M de Compuesto 1 o de Compuesto 2, con o
sin Compuesto 6 (10^{-7} M). Los pocillos de control se trataron
con la disolución vehicular.
La proliferación de las células TT se midió como
la absorbancia a 490 nM de cada pocillo. Los datos de seis
experimentos individuales se evaluaron independientemente con ocho
replicados expresados como la media \pm EEM del porcentaje de
inhibición de la proliferación celular frente a las células de
control sin tratar ^{*}P< 0,05 y ^{**}P< 0,01 frente a
control.
- -
- Panel superior: las células se incubaron en placas de 24 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo complementado con Compuesto 2 (10^{-7} M) con o sin concentraciones crecientes de Compuesto 5 (10^{-9}, 10^{-8}, 10^{-7} y 10^{-6} M), o con Compuesto 5 (10^{-7} M) con o sin concentraciones decrecientes de Compuesto 2 (10^{-6}, 10^{-7}, 10^{-8} y 10^{-9} M). Los pocillos de control se trataron con la disolución vehicular. La incorporación de [^{3}H]thy se midió como radioactividad en el material precipitado con TCA. Los datos de seis experimentos individuales se evaluaron independientemente con cuatro replicados expresados como la media \pm EEM del porcentaje de inhibición de la incorporación de [^{3}H]thy frente a las células de control sin tratar ^{*}P< 0,05 y ^{**}P< 0,01 frente a control
- -
- Panel inferior: las células se incubaron en placas de 96 pocillos durante 48 horas en un medio de cultivo complementado con Compuesto 2 (10^{-7} M) con o sin concentraciones crecientes de Compuesto 5 (10^{-9}, 10^{-8}, 10^{-7} y 10^{-6} M), o con Compuesto 5 (10^{-7} M) con o sin concentraciones decrecientes de Compuesto 2 (10^{-6}, 10^{-7}, 10^{-8} y 10^{-9} M). Los pocillos de control se trataron con la disolución vehicular, y la proliferación de las células TT se midió como la absorbancia a 490 nM de cada pocillo. Los datos de seis experimentos individuales se evaluaron independientemente con ocho replicados expresados como la media \pm EEM del porcentaje de inhibición de la proliferación celular frente a las células de control sin tratar *P< 0,05 y **P< 0,01 frente a control.
Se cree que el experto en la materia puede
utilizar, basándose en la descripción de este documento, la presente
invención hasta su más completa magnitud. Las siguientes formas de
realización específicas deben interpretarse, por tanto, como
meramente ilustrativas, y no limitantes del resto de la descripción,
que está limitado únicamente por el ámbito de las reivindicaciones
anexas.
Salvo que se defina de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el
mismo significado al comúnmente comprendido por el experto habitual
en la materia a la que pertenece esta
invención.
invención.
Se han aislado varios receptores de la
somatostatina (SSTR), por ejemplo, SSTR-1,
SSTR-2, SSTR-3,
SSTR-4 y SSTR-5. Por lo tanto, un
agonista de la somatostatina puede ser uno o más de un agonista de
SSTR-1, un agonista de SSTR-2, un
agonista de SSTR-3, un agonista de
SSTR-4 o un agonista de SSTR-5. Lo
que se entiende por un agonista del receptor de tipo 2 de la
somatostatina (es decir, un agonista de SSTR-2) es
un compuesto que (1) tiene una alta afinidad de unión (por ejemplo,
una K-i menor de 100 nM o preferiblemente menor de
10 nm o menor de 1 nM) por el SSTR-2 (por ejemplo,
según se define en el ensayo de unión a receptores descrito a
continuación) y (2) disminuye la tasa de proliferación de las
células de carcinoma medular tiroideo (por ejemplo, según se muestra
en el ensayo biológico descrito a continuación). Lo que se entiende
por un agonista selectivo del receptor de tipo 2 de la somatostatina
es un agonista del receptor de tipo 2 de la somatostatina que tiene
una afinidad de unión mayor (es decir, una menor Ki) por el
SSTR-2 que por el SSTR-5. Lo que se
entiende por un agonista del receptor de tipo 5 de la somatostatina
es un agonista de la somatostatina que (1) tiene una alta afinidad
de unión (por ejemplo, una Ki menor de 100 nM o preferiblemente
menor de 10 nm o menor de 1 nM) por el SSTR-5 (por
ejemplo, según se define en el ensayo de unión a receptores descrito
a continuación) y (2) atenúa el descenso en la tasa de proliferación
de las células de carcinoma medular tiroideo inducido por el
agonista de SSTR-2 (por ejemplo, según se muestra en
el ensayo biológico descrito a continuación). Lo que se entiende por
un agonista selectivo del receptor de tipo 5 de la somatostatina es
un agonista del receptor de tipo 5 de la somatostatina que tiene una
afinidad de unión mayor (es decir, una menor Ki) por el
SSTR-5 que por el SSTR-2.
En una forma de realización, el agonista de
SSTR-2 es también un agonista selectivo de
SSTR-2. En otra forma de realización, el agonista
selectivo de SSTR-2 tiene un valor de Ki para el
SSTR-5 que es al menos 2 veces (por ejemplo, al
menos 5 veces o al menos 10 veces) mayor que el que tiene para el
receptor SSTR-2 (por ejemplo, según se define en el
ensayo de unión a receptores descrito a continuación).
Algunos ejemplos de agonistas de
SSTR-2 que pueden usarse para practicar la presente
invención son:
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2},
(Compuesto 1),
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe],
(Compuesto 2),
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2},
(Compuesto 3) y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-2-etansulfonilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2},
(Compuesto
4).
4).
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de agonista de SSTR-5
que puede usarse para practicar la presente invención es:
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2}
(Compuesto 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Algunos ejemplos adicionales de agonistas de la
somatostatina son aquellos englobados por las fórmulas o aquellos
mencionados específicamente en las publicaciones establecidas a
continuación.
Solicitud EP Nº P5164EU (Inventor: G. Keri);
Van Binst, G. y col. Peptide
Research 5: 8 (1992);
Horvath, A. y col. Resumen,
"Conformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor
Activity", 22º European peptide Symposium, 13-19
de septiembre de 1992, Interlaken, Suiza;
Solicitud PCT Nº WO91/09056 (1991);
Solicitud EP Nº 0363589A2 (1990);
Patente de EE.UU. Nº 4.904.642 (1990);
Patente de EE.UU. Nº 4.871.717 (1989);
Patente de EE.UU. Nº 4.853.371 (1989);
Patente de EE.UU. Nº 4.725.577 (1988);
Patente de EE.UU. Nº 4.684.620 (1987);
Patente de EE.UU. Nº 4.650.787 (1987);
Patente de EE.UU. Nº 4.603.120 (1986);
Patente de EE.UU. Nº 4.585.755 (1986);
Solicitud EP Nº 0203031A2 (1986);
Patente de EE.UU. Nº 4.522.813 (1985);
Patente de EE.UU. Nº 4.486.415 (1984);
Patente de EE.UU. Nº 4.485.101 (1984);
Patente de EE.UU. Nº 4.435.385 (1984);
Patente de EE.UU. Nº 4.395.403 (1983);
Patente de EE.UU. Nº 4.369.179 (1983);
Patente de EE.UU. Nº 4.360.516 (1982);
Patente de EE.UU. Nº 4.358.439 (1982);
Patente de EE.UU. Nº 4.328.214 (1982);
Patente de EE.UU. Nº 4.316.890 (1982);
Patente de EE.UU. Nº 4.310.518 (1982);
Patente de EE.UU. Nº 4.291.022 (1981);
Patente de EE.UU. Nº 4.238.481 (1980);
Patente de EE.UU. Nº 4.235.886 (1980);
Patente de EE.UU. Nº 4.224.199 (1980);
Patente de EE.UU. Nº 4.211.693 (1980);
Patente de EE.UU. Nº 4.190.648 (1980);
Patente de EE.UU. Nº 4.146.612 (1979);
Patente de EE.UU. Nº 4.133.782 (1979);
Patente de EE.UU. Nº 5.506.339 (1996);
Patente de EE.UU. Nº 4.261.885 (1981);
Patente de EE.UU. Nº 4.728.638 (1988);
Patente de EE.UU. Nº 4.282.143 (1981);
Patente de EE.UU. Nº 4.215.039 (1980);
Patente de EE.UU. Nº 4.209.426 (1980);
Patente de EE.UU. Nº 4.190.575 (1980);
Patente EP Nº 0389180 (1990);
Solicitud EP Nº 0505680 (1982);
Solicitud EP Nº 0083305 (1982);
Solicitud EP Nº 0030920 (1980);
Solicitud PCT Nº WO88/05052 (1988);
Solicitud PCT Nº WO90/12811 (1990);
Solicitud PCT Nº WO97/01579 (1997);
Solicitud PCT Nº WO91/18016 (1991);
Solicitud británica Nº GB 2.095.261 (1981);
y
Solicitud francesa Nº FR 2.522.655 (1983).
\vskip1.000000\baselineskip
Nótese que para todos los agonistas de la
somatostatina descritos en este documento, cada resto de aminoácido
representa la estructura
-NH-C(R)H-CO-, en la
que R es la cadena lateral (por ejemplo, CH_{3} para Ala). Las
líneas entre los restos de aminoácidos representan enlaces
peptídicos que unen los aminoácidos. También, cuando el resto de
aminoácido es ópticamente activo, la configuración pretendida es la
de la forma L salvo que expresamente se indique la forma D. Por
claridad, los enlaces de disulfuro (por ejemplo, un puente
disulfuro) que existen entre dos tioles libres de restos de Cys, no
se muestran. Las abreviaturas de los aminoácidos habituales son de
acuerdo a las recomendaciones de la IUPAC-IUB.
Los procedimientos para sintetizar agonistas de
la somatostatina están bien documentados y entran en la capacidad de
una persona experta habitual en la materia.
La síntesis de secuencias cortas de aminoácidos
está bien establecida en la técnica de péptidos. Por ejemplo, la
síntesis de
H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2},
descrito anteriormente, puede conseguirse siguiendo el protocolo
establecido en el Ejemplo I de la Solicitud de Patente Europea
0395417A1. La síntesis de agonistas de la somatostatina con un
N-terminal sustituido puede conseguirse, por
ejemplo, siguiendo el protocolo establecido en el documento
WO88/02756, en la Solicitud de Patente Europea Nº 0329295 y en la
Publicación PCT Nº WO94/04752.
Algunos de los compuestos de la actual invención
pueden tener al menos un centro asimétrico. Algunos centros
asimétricos adicionales pueden estar presentes en la molécula,
dependiendo de la naturaleza de los diversos sustituyentes de la
molécula. Cada uno de dichos centros asimétricos producirá dos
isómeros ópticos, y se pretende que todos de dichos isómeros
ópticos, por separado, puros o parcialmente ópticamente purificados,
las mezclas racémicas o las mezclas diastereoméricas de los mismos,
estén incluidas en el ámbito de la actual invención.
Los compuestos de la actual invención
generalmente pueden aislarse en forma de sus sales de adición ácida
farmacéuticamente aceptables, tales como las sales derivadas del uso
de ácidos inorgánicos y orgánicos. Algunos ejemplos de dichos ácidos
son clorhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, fórmico, acético,
trifluoroacético, propiónico, maleico, succínico,
D-tartárico, L-tartárico, malónico,
metansulfónico y similares. Además, ciertos compuestos que contienen
una función ácida, tales como un carboxi pueden aislarse en forma de
su sal inorgánica en la que contraión puede elegirse entre sodio,
potasio, litio, calcio, magnesio y similares, así como entre bases
orgánicas.
Las sales farmacéuticamente aceptables pueden
formarse tomando aproximadamente 1 equivalente de un agonista de
SSTR-2, por ejemplo, el compuesto 1, y poniéndolo en
contacto con aproximadamente 1 equivalente o más del correspondiente
ácido apropiado de la sal que se desea. El desarrollo y aislamiento
de la sal resultante es conocido por los expertos habituales en la
materia.
Los compuestos de esta invención pueden
administrarse por las vías de administración oral, parenteral (por
ejemplo, por inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o
subcutánea, o un implante), nasal, vaginal, rectal, sublingual o
tópica, y pueden formularse con vehículos farmacéuticamente
aceptables para proporcionar formas de dosificación apropiadas para
cada vía de administración. Consecuentemente, la presente invención
incluye en su ámbito composiciones farmacéuticas que comprenden,
como principio activo, al menos un agonista de
SSTR-2 en asociación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Las formas de dosificación sólidas para su
administración por vía oral incluyen cápsulas, comprimidos,
píldoras, polvos y gránulos. En dichas formas de dosificación
sólidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un vehículo
inerte farmacéuticamente aceptable tal como sacarosa, lactosa o
almidón. Dichas formas de dosificación también pueden comprender,
como en la práctica normal, sustancias adicionales distintas a
dichos diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales
como estearato magnésico. En el caso de las cápsulas, los
comprimidos y las píldoras, las formas de dosificación también
pueden comprender agentes tamponantes. Los comprimidos y las
píldoras pueden prepararse adicionalmente con cubiertas
entéricas.
Las formas de dosificación líquida para su
administración por vía oral incluyen emulsiones, disoluciones,
suspensiones, jarabes farmacéuticamente aceptables, conteniendo los
elixires diluyentes inertes usados habitualmente en la técnica,
tales como agua. Además de dichos diluyentes inertes, las
composiciones también pueden incluir coadyuvantes, tales como
agentes humectantes, agentes emulsificantes y de suspensión, y
agentes edulcorantes, saborizantes y aromatizantes.
Las preparaciones según esta invención para su
administración por vía parenteral incluyen disoluciones acuosas o no
acuosas, suspensiones o emulsiones estériles. Algunos ejemplos de
disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol,
polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de de oliva y
aceite de maíz, gelatina, y ésteres orgánicos inyectables tales como
oleato de etilo. Dichas formas de dosificación también pueden
contener coadyuvantes tales como agentes conservantes, humectantes,
emulsificantes y dispersantes. Pueden esterilizarse mediante, por
ejemplo, filtración a través de un filtro de retención de bacterias,
incorporando agentes esterilizantes en las composiciones, irradiando
las composiciones o calentando las composiciones. También pueden
fabricarse en forma de composiciones sólidas estériles que pueden
ser disueltas en agua estéril o algún otro medio inyectable estéril
inmediatamente antes de su uso.
Las composiciones para su administración por vía
rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden
contener, además de la sustancia activa, excipientes tales como
manteca de cacao o una cera para supositorios.
Las composiciones para su administración por vía
nasal o sublingual también se preparan con excipientes
convencionales bien conocidos en la técnica.
En general, una dosis eficaz de principio activo
en las composiciones de esta invención puede ser variable; sin
embargo, es necesario que la cantidad de principio activo sea tal
que se obtenga una forma de dosificación adecuada. La dosis elegida
depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración
y de la duración del tratamiento, todo lo cual está en el dominio
del conocimiento de experto habitual en la materia. Generalmente se
administran unos niveles de dosificación de entre 0,0001 y 100 mg/kg
de peso corporal por día a los seres humanos y a otros animales, por
ejemplo, mamíferos.
Un intervalo de dosificación preferido es de
0,01 a 10,0 mg/kg de peso corporal por vía, que puede administrarse
como una dosis individual o dividirse en dosis múltiples.
Se usó un análisis mediante
RT-PCR para demostrar que los cinco subtipos de ARNm
de los SSTR son expresados en una línea celular de CMT humano, TT.
La capacidad de los análogos de la SS, con diferentes actividades y
especificidades por el SSTR2 y los 5 subtipos, para influir sobre la
actividad proliferativa de las células, puede evaluarse considerando
la incorporación de [^{3}H]thy, considerada como una medida
indirecta de la actividad sintética de ADN, y el número de células
viables.
Todos los agonistas preferentes de SSTR2 fueron
capaces de suprimir significativamente el número de células TT a
unas concentraciones que varían desde 10^{-9} M hasta 10^{-6} M.
El Compuesto 3 y el Compuesto 4 redujeron significativamente
(p<0,05) la incorporación de [^{3}H]thy a 10^{-9} M
pero no a 10^{-8} M y 10^{-7} M, cuando su máximo efecto
inhibidor sobre el número de células era apreciable. Cada compuesto
SSTR2 probado mostró una tendencia a disminuir la eficacia con el
aumento de la concentración, sin embargo, las curvas de respuesta
con forma de campana son habituales para la SS. La inhibición de la
incorporación de [^{3}H]thy y el número de células TT por
el Compuesto 1 y el Compuesto 2 a 10^{-7} M no se asoció con
ninguna acción citotóxica, según se demuestra mediante una tinción
con azul de tripano. Además, este efecto era completamente
contrarrestado mediante el cotratamiento de las células TT con
Compuesto 6, un antagonista selectivo de SSTR2. Considerados
conjuntamente, estos resultados indican que los análogos de la SS
con una selectividad preferente por el SSTR2 inhiben la
proliferación de las células TT interactuando específicamente con el
SSTR2.
La línea celular TT se obtuvo de la American
Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). La línea
celular TT consiste en células parafoliculares aneuploides
transformadas productoras de CT que se caracterizan por la presencia
de una mutación de TGC a TGG (Cys a Trp) en el exón 11 codón 634 del
protooncogen RET (Cooley LD, y col., 1995 Cancer Genet Cytogenet 80:
138-149), una característica que nosotros
confirmamos para la línea celular con la que trabajamos. Además, las
células TT muestran una expresión deteriorada del gen supresor
tumoral p53 (Velasco JA, y col., 1997 Int J Cancer 73:
449-455). Los estudios de inmunohistoquímica
demuestran que las células TT expresan CT y el receptor de la CT
(Frendo JL, y col., 1994 FEBS Lett. 342: 214-216),
antígeno carcinoembrionario (CEA), SS, neurotensina, péptido
liberador de gastrina (GRP), leu- y metencefalina, péptido liberador
de hormona paratiroidea (PTHrp), cromogranina A,
SP-I, sinaptofisina, enolasa específica de neuronas
(NSE), receptor de 1,25-dihidroxivitamina D_{3},
hidroxilasa de tirosina, \alpha-tubulina y
citoqueratina (Zabel M, y col., 1995 Histochemical J. 27:
859-868). Las células TT secretan una cantidad
significativa de CT y responden a cambios en los niveles de calcio
ionizado (Zabel M, y col., 1992 Histochemistry 102:
323-327). Por lo tanto, la línea celular TT es
adecuada para estudios sobre la función parafolicular y las
respuestas a estímulos endocrinos y farmacológicos.
Las células se mantuvieron en la Mezcla
Nutriente de Ham F12 con Glutamina (EuroClone Ltd, Torquay, Reino
Unido), complementada con un 10% de suero bovino fetal (FBS, Life
Technologies, Milán, Italia), 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de
estreptomicina y 100 \mug/ml de anfotericina (EuroClone Ltd,
Torquay, Reino Unido) a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 5%
CO_{2} y un 95% de aire.
Se extrajo el ARN total de células TT
subconfluyentes usando TRIZOL (Life Technologies, Milán, Italia). El
protocolo de TRIZOL es una modificación de la extracción con
guanidinio/fenol. En resumen, se aspiró el medio celular cultivado y
las células se lavaron con 1 x PBS. Se añadió el reactivo de TRIZOL
y las células se lisaron a temperatura ambiente durante 10 min. Se
añadió cloroformo a la mezcla de TRIZOL/lisado celular, y se dejó
reposar durante 2-3 min, y después se centrifugaron
a 12000 x g durante 15 min. La capa acuosa se eliminó de la mezcla
centrifugada. Se añadió isopropanol para precipitar el ARN, se
recogió el sedimento, se lavó con etanol al 75% y se secó al aire.
El ARN total se resuspendió en agua tratada con pirocarbonato de
dietilo (DEPC) y se cuantificó usando una espectrofotometría de UV a
260 nM. Para evitar la contaminación con ADN, se trató el ARN con
desoxirribonucleasa exenta de ribonucleasa (Promega, Milán,
Italia).
Usando un kit de síntesis de la primera hebra de
ADN complementario (ADNc) (SuperScript Preamplification System for
First Strand cDNA Synthesis, Life Technologies, Milán, Italia), se
retrotranscribió 1 \mug de ARN total según el protocolo del
fabricante. La mezcla RT de los tubos de PCR se cubrió con 50 \mul
de aceite mineral ligero blanco (Sigma-Aldrich Corp.
Milán, Italia); la RT se llevó a cabo en el Minicycler (MJ Research
Inc., Watertown, MA, EE.UU.) usando un programa con los siguientes
parámetros: 10 min a 70ºC, 1 min a 4ºC, 5 min a 4ºC. Después de
complementar con SuperScript II, la reacción se concretó a 42ºC
durante 50 min y después a 70º durante 15 min. Las muestras se
digirieron con ARNasa H (Promega, Milán, Italia) a 37ºC durante 20
min, y después se almacenaron a -20ºC hasta la primera PCR.
El ADNc (1 \mul de reacción de RT) se
amplificó entonces mediante PCR con 1 U de polimerasa Taq de ADN
(Life Technologies, Milán, Italia), en las condiciones recomendadas
por los proveedores, en una mezcla de reacción de 50 \mul. Después
de la desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 min, se llevaron a
cabo las reacciones de PCR usando los cebadores oligonucleotídicos y
las condiciones enumeradas en la Tabla 1, describiendo el tamaño de
los fragmentos esperados. Los productos de la PCR se analizaron en
un gel de agarosa al 2% y se visualizaron mediante una tinción con
bromuro de etidio (ETB). Para asegurar que no se producía una
contaminación durante el transcurso del procedimiento de
RT-PCR se prepararon dos clases de controles
negativos. El primer control negativo se fabricó omitiendo el ARN
total en la RT. El segundo se preparó sustituyendo la mezcla de ADNc
por agua en la reacción de PCR. La PCR sólo se consideró útil si no
se observaba ninguna banda en los carriles de control negativo en un
gel de agarosa al 2%. Cada producto de la PCR se sometió a una
digestión con enzimas de restricción y se analizó sobre un gel de
agarosa al 2% para confirmar adicionalmente la correcta
identificación de los amplicones.
Los análogos de la SS usados en este estudio y
sus respectivas afinidades por los diferentes SSTR se enumeran en la
Tabla 2. Cada compuesto, proporcionado por Biomeasure Incorporated
(Milford, MA, EE.UU.), se resuspendió en ácido acético 0,01 N que
contenía un 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) con objeto de
proporcionar una solubilidad uniforme y evitar una unión no
especifica a las diversas superficies de preparación. La
especificidad y la selectividad de los análogos se determinaron
mediante un Ensayo de Unión con Radioligando en células
CHO-K1 transfectadas de forma estable con cada uno
de los subtipos de SSTR, como sigue.
Las secuencias codificantes completas de los
fragmentos genómicos de los genes de los SSTR 1, 2, 3 y 4 y un clon
de ADNc de SSTR 5 se subclonaron en el vector de expresión mamífero
pCMV (Life Technologies, Milán, Italia). Se obtuvieron líneas
celulares clonadas que expresaban de forma estable los SSTR
1-5 mediante transfección en células
CHO-K1 (ATCC, Manassas, Va, EE.UU.) usando el método
de coprecipitación con fosfato cálcico (Davis L, y col., 1994 In:
Basic methods in Molecular Biology, 2ª edición, Appleton &
Lange, Norwalk, CT, EE.UU.: 611-646). Se incluyó el
plásmido pRSV-neo (ATCC) como un marcador
seleccionable. Las líneas celulares clonadas se seleccionaron en
medio RPMI 1640 que contenía 0,5 mg/ml de G418 (Life Technologies,
Milán, Italia), se clonaron en anillo y se expandieron en un
cultivo.
Las membranas para los ensayos de unión al
receptor in vitro se obtuvieron homogeneizando las células
CHO-Kl que expresaban los subtipos de SSTR en
Tris-HCl 50 mM enfriado en hielo y centrifugando dos
veces a 39000 g (10 min), con una resuspensión intermedia en tampón
fresco. Los sedimentos finales se resuspendieron en
Tris-HCl 10 mM para el ensayo. Para los ensayos de
los SSTR 1, 3, 4 y 5 las alícuotas de las preparaciones de membrana
se incubaron 90 min a 25ºC con
[^{125}I-Tyr11]SS-14 0,05
nM en HEPES 50 mM (pH 7,4) que contenía 10 mg/ml de BSA, MgCl_{2}
5 mM, 200 KIU/ml de Trasylol, 0,02 mg/ml de bacitracina y 0,02 mg/ml
de fluoruro de fenilmetilsufonilo. El volumen final de ensayo fue de
0,3 ml. Para el ensayo del SSTR 2 se empleó como radioligando
[^{125}I]MK-678 0,05 nM, y el tiempo de
incubación fue de 90 min a 25ºC. Las incubaciones se terminaron
mediante una filtración rápida a través de filtros GF/C (previamente
empapados con polietilenimina al 0,3%) usando un colector de
filtración Brandel. Cada tubo y filtro se lavaron entonces tres
veces con alícuotas de 5 ml de tampón enfriado en hielo. La unión
específica se definió como el radioligando total unido menos el
unido en presencia de SS-14 1000 nM para los SSTR 1,
3, 4 y 5, o de MK-6781000 nM para el SSTR2.
La actividad biológica de los agonistas y
antagonistas selectivos de SSTR se evaluó mediante el ensayo de
movilización de calcio en células CHO-K1 que
expresan el SSTR2 o el SSTR5 humanos. Las células se recogieron
incubándolas en una disolución salina tamponada con EDTA/fosfato al
0,3% (25ºC), y se lavaron dos veces mediante centrifugación. Las
células lavadas se resuspendieron en disolución salina tamponada de
Hank (HBSS) para cargar el indicador fluorescente de Ca^{2+}
Fura-2AM. Las suspensiones celulares
(aproximadamente 10^{6} células/ml) se incubaron con
Fura-2AM 2 mM durante 30 min a 25ºC. El
Fura-2AM no cargado se eliminó mediante
centrifugación dos veces en HBBS, y las suspensiones finales se
transfirieron a un espectrofluorómetro (Hitachi
F-2000) equipado con un mecanismo agitador magnético
y un soporte de cubeta con la temperatura regulada. Tras equilibrar
a 37ºC, se añadieron los análogos de SS para la medida de la
movilización intracelular de Ca^{2+}. Las longitudes de onda de
excitación y de emisión fueron 340 y 510 nm, respectivamente. En las
células que expresan el SSTR2 (Figura 1), el Compuesto 2 y el
Compuesto 1 estimularon significativamente la movilización
intracelular de Ca^{2+} (indicada como la proporción entre el
valor estimulado y el basal), mientras que el Compuesto 6 no lo
hizo, a las concentraciones probadas. Además, el Compuesto 4 y el
Compuesto 3 también eran muy potentes en la estimulación de la
movilización de Ca^{2+}. En las células que expresan el SSTR5
(Figura 2), el Compuesto 5 y el Compuesto 1 estimularon
significativamente la movilización intracelular de Ca^{2+},
mientras que el Compuesto 6 mostró una ligera actividad agonista en
el intervalo de 300 a 1000 nM. En las células que expresan el SSTR2
(Figura 3), el Compuesto 6 inhibió la movilización intracelular de
Ca^{2+} inducida por la SS en las células que expresan el SSTR2 de
una forma dependiente de la dosis, con una supresión completa de la
acción de la SS aproximadamente a 10^{-7} M. Por lo tanto, la
evaluación de la movilización intracelular de Ca^{2+} demostró que
la actividad biológica de cada uno de los diversos análogos estaba
en conformidad con su perfil de unión al receptor.
Los efectos de los agonistas y antagonistas
selectivos de SSTR sobre la síntesis de ADN en las células TT se
evaluaron determinando la tasa de incorporación de
[^{3}H]timidina ([^{3}H]thy), según se describió
previamente (Davis L, y col., 1994 en: Basic methods in Molecular
Biology, 2ª edición, Appleton & Lange, Norwalk, CT, EE.UU.:
611-646, degli Uberti EC, y col., 1991 J Clin
Endocrinol Metab 72: 1364-1371). Las células TT se
colocaron en placas múltiples de 24 pocillos (10^{5}
células/pocillo) y se incubaron durante 48 horas en un medio
complementado con FBS al 10% en presencia de ([^{3}H]thy
(1,5 \muCi/ml; 87 Ci/mmol) con o sin cada análogo de la SS a unas
concentraciones que varían desde 10^{-6} hasta 10^{-9} M. Los
tratamientos se renovaron añadiendo nuevos análogos a los pocillos
después de las primeras 24 h de incubación, sin eliminar el
medio.
Tras la incubación, las células se lavaron tres
veces con PBS enfriado en hielo y dos veces con ácido
tricloroacético al 10% enfriado en hielo (TCA). El material
precipitado con el TCA se solubilizó en 500 \muL de hidróxido
sódico 0,2 mol/L y SDS al 0,1%. Entonces se contó la radioactividad
asociada a las células con un espectrómetro de centelleo. Los
resultados (recuentos por min por pocillo) se obtuvieron
determinando el valor medio de al menos seis experimentos por
cuadruplicado. La viabilidad de las células TT en los cultivos de
control y tratado se evaluó mediante una tinción con azul de tripano
después de 24 y de 48 horas, y el número de células viables era
siempre del 85-95%.
Los efectos de los agonistas y antagonistas
selectivos de SSTR sobre la proliferación de las células TT se
evaluaron mediante el Ensayo de Proliferación Celular no Radioactivo
Acuoso CELL-TITER 96 (Promega, Milán, Italia), un
método colorimétrico para determinar el número de células viables en
ensayos de proliferación. El ensayo contiene disoluciones de un
compuesto de tetrazolio (reactivo de Owen; MTS) y un reactivo
acoplador de electrones (metosulfato de fenacina; PMS). El MTS es
biorreducido por las células a formazán, que es soluble en el medio
de cultivo tisular. La absorbancia del formazán a 490 nm puede
medirse directamente a partir de las placas de ensayo de 96 pocillos
(Zatelli MC, y col., 2000 J Clin Endocrinol Metab 85:
847-852; Cory AH, y col., 1991 Cancer Commun 3:
207-212). La conversión del MTS en la forma acuosa
soluble del formazán se consigue mediante las enzimas
deshidrogenasas que se encuentran en las células metabólicamente
activas. La cantidad de producto de formazán, medida por la cantidad
de absorbancia a 490 nm, es directamente proporcional al número de
células vivas en el cultivo. En resumen, las células TT se colocaron
en placas múltiples de 96 pocillos (2 x 10^{4} células/pocillo) y
se incubaron durante 48 horas en un medio complementado con FBS al
10% en presencia o ausencia de cada análogo de SS, a unas
concentraciones que varían desde 10^{-6} hasta 10^{-9} M. Los
tratamientos se renovaron añadiendo nuevos análogos a los pocillos
después de las primeras 24 h de incubación. Al final del periodo de
incubación se añadieron a cada pocillo 20 \mul de una disolución
combinada de MTS/PMS con una pipeta de repetición, y las placas se
incubaron durante 4 horas adicionales a 37ºC en una atmósfera
humidificada con CO_{2} al 5%. Entonces se registró la absorbancia
a 490 nm usando un lector de placas ELISA (EASIA Reader, Medgenix,
Camarillo, CA). Los resultados (absorbancia a 490 nm) se obtuvieron
determinando el valor medio de al menos seis experimentos en ocho
replicados.
Para comprender el papel individual de los
subtipos SSTR2 y SSTR5 en el control de la proliferación de las
células C parafoliculares, evaluamos si las células TT expresaban
SSTR que pudieran mediar en una potencial respuesta a compuestos
selectivos para los subtipos individuales de SSTR. Para estudiar
esta cuestión, aislamos el ARN total de las células TT cultivadas y
realizamos las reacciones de RT-PCR en las
condiciones descritas en Materiales y Procedimientos. La integridad
del ADNc se aseguró mediante la presencia de la señal de GAPDH. La
ausencia de contaminación por ADN genómico en las muestras de ADNc
se evaluó por la ausencia de amplificación en una reacción de PCR
usando muestras no retrotranscritas. La amplificación positiva de
los SSTR1, 2, 3, 4 y 5 se encontró en la línea celular examinada
(Fig. 4), lo que demuestra que estos receptores son expresados en la
línea celular TT del CMT humano. La demostración de que la línea
celular TT expresa de forma estable estos subtipos de SSTR hizo a
este sistema de modelo celular adecuado para evaluar la acción de
los análogos de la SS selectivos de
receptores.
receptores.
Los valores de la incorporación de
[^{3}H]thy obtenidos con unas concentraciones de 10^{-9}
a 10^{-6} M de agonistas preferentes del SSTR2 (Compuesto 1,
Compuesto 2, Compuesto 3 y Compuesto 4), de agonista preferente del
SSTR5 (Compuesto 5) y de antagonista preferente del SSTR2 (Compuesto
6) se presentan en la Figura 5. Según se indica, el Compuesto 2
suprimió significativamente la incorporación de [^{3}H]thy
en un 58-23% a unas concentraciones que varían de
10^{-9} a 10^{-7} M. El Compuesto 1 suprimió significativamente
la incorporación de [^{3}H]thy en un 41-21%
a unas concentraciones que varían de 10^{-9} a 10^{-6} M. La
incorporación de [^{3}H]thy también fue significativamente
reducida por el Compuesto 4 (-13%, p< 0,05) y por el Compuesto 3
(-17%, p<0,05) a 10^{-9} M. Por el contrario, el Compuesto 5
aumentó significativamente la incorporación de [^{3}H]thy
en células TT en un 80-175%. El antagonista
selectivo del SSTR2, el Compuesto 6, no alteró la incorporación de
[^{3}H]thy en células TT en comparación con las células de
control sin tratar.
Para examinar con más detalle la actividad de
los análogos de la SS sobre el crecimiento de las células TT,
también se analiza su efecto sobre el número de células viables. Los
efectos de los agonistas preferentes del SSTR2, de un agonista
preferente del SSTR5 y de un antagonista preferente del SSTR2 sobre
el número de células TT viables a unas concentraciones que varían
desde 10^{-9} hasta 10^{-6} M están representados en la Figura
6. Según se indica, todos los compuestos preferentes del SSTR2
inhibieron significativamente la proliferación celular cuando se
comparaban con las células de control sin tratar a cada
concentración probada. El agonista selectivo del SSTR5, el Compuesto
5, produjo un ligero aumento en la proliferación de las células TT
(de hasta el 11% a 10^{-8} M), sin embargo, esto no representa una
diferencia estadística con respecto a las células de control sin
tratar. El antagonista selectivo del SSTR2, el Compuesto 6, no
parecía afectar al crecimiento de las células TT a las
concentraciones probadas.
Para clarificar adicionalmente si el SSTR2
estaba específicamente implicado en la mediación de la actividad
antiproliferativa de los agonistas preferentes del SSTR2, se
evaluaron la incorporación de [^{3}H]thy y el crecimiento
celular en células TT expuestas durante 48 horas a Compuesto 1 y a
Compuesto 2, cada uno de ellos solo (a 10^{-7} M) o en combinación
con el Compuesto 6, un antagonista selectivo del SSTR2, a una
concentración equimolar (10^{-7} M). La inhibición de la
incorporación de [^{3}H]thy inducida tanto por el Compuesto
1 como por el Compuesto 2 fue suprimida por el cotratamiento de las
células TT con Compuesto 6 (Figura 7, panel superior). La inhibición
de la proliferación de las células TT inducida por el Compuesto 1 se
redujo significativamente desde el 46% hasta el 10% por el
cotratamiento con el Compuesto 6. Adicionalmente, el Compuesto 6
parecía bloquear completamente la actividad antiproliferativa del
Compuesto 2 (Figura 7, panel inferior). Por lo tanto, la implicación
específica del SSTR2 en la mediación del efecto inhibidor de un
agonista del SSTR2 sobre la proliferación de las células TT está
claramente demostrada.
Con objeto de analizar los efectos de un
agonista del SSTR2 y del SSTR5 combinados, se examinaron la
incorporación de [^{3}H]thy y la proliferación de células
TT probando cada uno de Compuesto 2 y Compuesto 5 a 10^{-7} M en
combinación con dosis crecientes (desde 10^{-9} M hasta 10^{-6}
M) del otro Compuesto. Los resultados se resumen en la Figura 8. Las
concentraciones crecientes del agonista del SSTR5 (desde 10^{-9} M
hasta 10^{-6} M) evitaban de una forma dependiente de la dosis la
supresión de la incorporación de [^{3}H]thy (Figura 8,
panel superior) y la proliferación de las células TT (Figura 8,
panel inferior) producida por el agonista del SSTR2 (10^{-7} M).
Estos datos demuestran un antagonismo entre los efectos mediados por
el SSTR5 y el SSTR2 sobre la proliferación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La afinidad del subtipo se determinó mediante
ensayos de unión de radioligando al receptor de membrana en células
de ovario de hámster chino que expresan el gen del SSR2 humano o el
ADNc del SSR5.
<110> Il Consorzio Ferrara Richerche
\hskip1cmSociete de Conseils de Recherches et D'Applications Scientifiques, S.A.S.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para Modular la
Proliferación de Células de Carcinoma Medular Tiroideo
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 50165/006EP2
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US02/06729
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-03-06
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/273.699
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-03-06
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe en la posición 1 es
D-Phe.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Trp en la posición 4 es
D-Trp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Phe Trp Trp Lys Thr Phe Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 1 es
D-Nal.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2, 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 2 y 7 están
cicladas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Cys Tyr Trp Lys Val Cys Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 1 es Tic.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Trp en la posición 3 es
D-Trp.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 5 es Abu.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)... (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido está ciclado en la posición
1 y en la posición 6.
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Tyr Trp Lys Xaa Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 6 es Abu
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe en la posición 1 es
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetilo-D-Phe.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2, 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 2 y 7 están
cicladas.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Trp en la posición 4 es
D-Trp.
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Cys Tyr Trp Lys Xaa Cys Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 5 es Abu.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe en la posición 1 es
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etansulfonilo-D-Phe.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2, 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 2 y 7 están
cicladas.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Trp en la posición 4 es
D-Trp
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Cys Tyr Trp Lys Xaa Cys Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 1 es Cpa.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en la posición 2 es
D-Cys.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 2, 7
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys en las posiciones 2 y 7 están
cicladas.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_ RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Trp en la posición 4 es
D-Trp.
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 8 es Nal.
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Cys Xaa Trp Lys Thr Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccggttga ctattacgcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctcactt ctaccattgt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\hskip1cmEP 1 390 406 B1
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgaagtcc tctggaatcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattgccag tagacagagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatctgcct ctgctacctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcccaaag aaggcaggct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Sintético
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\hfill20
Claims (23)
1. Un procedimiento para modular la tasa de
proliferación de células de carcinoma medular tiroideo que comprende
poner en contacto células de CMT in vitro con uno o más
agonistas de SSTR2 y uno o más agonistas de SSTR5, en el que dicho
agonista de SSTR2 reduce la tasa de proliferación de las células de
CMT y dicho agonista de SSTR5 atenúa la reducción inducida por el
agonista de SSTR-2 en la tasa de proliferación
celular.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en
el que dicho agonista de SSTR-5 es
D-Phe-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2}
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo
3. Un procedimiento para disminuir la tasa de
proliferación de células de carcinoma medular tiroideo que comprende
poner en contacto dichas células de carcinoma medular tiroideo in
vitro con uno o más agonistas de SSTR2 o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3 en
el que dicho agonista de SSTR-2 es un agonista
selectivo de SSTR-2 o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo.
5. Un procedimiento según la reivindicación 3 en
el que dicho agonista de SSTR-2 o la sal
farmacéuticamente aceptable del mismo tiene un valor de Ki para el
SSTR-5 que es al menos 2 veces mayor del que tiene
para el SSTR-2.
6. Un procedimiento según la reivindicación 3 en
el que dicho agonista de SSTR-2 o la sal
farmacéuticamente aceptable del mismo tiene un valor de Ki para el
SSTR-5 que es al menos 5 veces mayor del que tiene
para el SSTR-2.
7. Un procedimiento según la reivindicación 3
en el que dicho agonista de SSTR-2 o la sal
farmacéuticamente aceptable del mismo tiene un valor de Ki para el
SSTR-5 que es al menos 10 veces mayor del que tiene
para el SSTR-2.
8. Un procedimiento según la reivindicación 3
en el que dicho agonista de SSTR-2 o la sal
farmacéuticamente aceptable del mismo tiene un valor de Ki menor de
5.
9. Un procedimiento según la reivindicación 3
en el que dicho agonista de SSTR-2 o la sal
farmacéuticamente aceptable del mismo tiene un valor de Ki menor de
1.
10. Un procedimiento según la reivindicación 3
en el que dicho agonista selectivo de SSTR-2 es un
compuesto elegido de la lista constituida por:
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2};
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe];
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etansulfonilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
o una sal farmacéuticamente
aceptable del
mismo.
11. Uso de un agonista de SSTR-2
o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación
de un medicamento para el tratamiento del carcinoma medular
tiroideo.
12. Uso según la reivindicación 11 en el que
dicho agonista de SSTR-2 comprende un agonista
selectivo de SSTR-2 o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo.
13. Uso según la reivindicación 11 en el que
dicho agonista de SSTR-2 o la sal farmacéuticamente
aceptable del mismo tiene un valor de Ki para el
SSTR-5 que es al menos 2 veces mayor del que tiene
para el SSTR-2.
14. Uso según la reivindicación 11 en el que
dicho agonista de SSTR-2 o la sal farmacéuticamente
aceptable del mismo tiene un valor de Ki para el
SSTR-5 que es al menos 5 veces mayor del que tiene
para el SSTR-2.
15. Uso según la reivindicación 11 en el que
dicho agonista de SSTR-2 o la sal farmacéuticamente
aceptable del mismo tiene un valor de Ki para el
SSTR-5 que es al menos 10 veces mayor del que tiene
para el SSTR-2.
16. Uso según la reivindicación 11 en el que
dicho agonista de SSTR-2 o la sal farmacéuticamente
aceptable del mismo tiene un valor de Ki menor de 5 nM.
\newpage
17. Uso según la reivindicación 11 en el que
dicho agonista de SSTR-2 o la sal farmacéuticamente
aceptable del mismo tiene un valor de Ki menor de 1 nM.
18. Un procedimiento según la reivindicación 11
en el que dicho agonista de SSTR-2 o la sal
farmacéuticamente aceptable del mismo es un compuesto elegido de la
lista constituida por:
D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH_{2};
ciclo[Tic-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Phe];
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
y
4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-2-etansulfonilo-D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys)-Thr-NH_{2};
o una sal farmacéuticamente
aceptable del
mismo.
19. Un procedimiento según la reivindicación
11, en el que dicho agonista de SSTR-2 o la sal
farmacéuticamente aceptable del mismo comprende un resto de
Tyr(I), en el que el átomo de yodo de dicho resto de
Tyr(I) comprende un isótopo de yodo radioactivo.
20. Un procedimiento según la reivindicación 11
o la reivindicación 19, en el que dichas células de carcinoma
medular tiroideo han formado metástasis fuera del tiroides.
21. Un procedimiento según la reivindicación
20, en el que dichas metástasis están presentes en la linfa, el
pulmón, el hígado, el cerebro o el hueso.
22. Un procedimiento según la reivindicación
21, en el que dicho yodo es ^{125}I, ^{127}I o ^{131}I.
23. Uso de un agonista de SSTR2 y de un agonista
de SSTR5 en combinación en la fabricación de un medicamento para
modular una tasa de proliferación de células de carcinoma medular
tiroideo, en el que el agonista de SSTR2 reduce la tasa de
proliferación de las células de CMT, y dicho agonista de SSTR5
atenúa la reducción inducida por el agonista de
SSTR-2 en la tasa de proliferación celular.
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