ES2282150T3 - Aparato y metodos para someter a ensayo la coagulacion en muestras de fluidos. - Google Patents
Aparato y metodos para someter a ensayo la coagulacion en muestras de fluidos. Download PDFInfo
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Abstract
Cartucho para administrar una muestra de fluido a una ubicación de análisis que comprende: una carcasa que tiene una boca de entrada de muestra que puede cerrarse para recibir una muestra de fluido; una cámara de sujeción que tiene un primer extremo en comunicación con la boca de entrada, teniendo la cámara de sujeción un segundo extremo con un tope capilar; en la que la ubicación de análisis está en comunicación con el tope capilar; y en la que el tope capilar permite selectivamente el paso de la muestra desde la cámara de sujeción hasta la ubicación de análisis; una cámara de desbordamiento en comunicación con la cámara de sujeción para manejar el desbordamiento de la muestra de entrada; y una bomba para proporcionar una fuerza a la muestra de fluido en la cámara de sujeción, permitiendo así el paso de la muestra a través del tope capilar.
Description
Aparato y métodos para someter a ensayo la
coagulación en muestras de fluidos.
La presente invención se refiere a un aparato
para realizar una variedad de ensayos que responden a un cambio de
la viscosidad de un fluido de muestra y se refiere a métodos para
realizar tales ensayos. En particular, la presente invención se
refiere al uso de un cartucho para realizar uno o más ensayos de
coagulación. La presente invención hace uso adventicio de un medio
de bomba para mover una muestra de fluido. En una realización, el
movimiento de la muestra se logra mediante la aplicación reversible,
rápida y reproducible de presión a un fluido de muestra para
producir un movimiento sustancialmente recíproco que, a su vez,
puede detectarse por un sensor apropiado. El dispositivo descrito
tiene simplicidad y puede adaptarse al área de diagnósticos
clínicos de centros de atención, incluyendo el uso en sitios de
accidentes, salas de urgencias o unidades de cuidados intensivos
médicas.
Mantener la sangre en estado fluido, denominado
hemostasis, requiere un equilibrio sutil de pro- y anticoagulantes.
Los procoagulantes evitan la hemorragia excesiva bloqueando el flujo
de sangre desde un vaso dañado, mientras que los anticoagulantes
evitan que se formen coágulos en el sistema circulatorio que de otro
modo bloquearían los vasos sanguíneos y conducirían al infarto de
miocardio o accidente cerebrovascular.
La secuencia bioquímica que conduce a un coágulo
de sangre se denomina la cascada de coagulación. El mecanismo se
basa en la conversión catalítica de fibrinógeno, una proteína de
plasma soluble, en fibrina insoluble. La enzima que cataliza esta
reacción es la trombina, que no circula permanentemente en la sangre
en una forma activa sino que existe como protrombina, el precursor
inactivo de la trombina. La conversión en trombina se produce en
presencia de iones de calcio y tromboplastina tisular. Este
mecanismo se conoce como la ruta extrínseca. Una segunda ruta
intrínseca, más compleja, se activa mediante factores de
\hbox{coagulación asociados con plaquetas y se entiende bien
en la técnica.}
El diagnóstico de estados hemorrágicos tales
como la hemofilia, en la que uno o más de los doce factores de
coagulación de la sangre pueden ser defectuosos, puede lograrse
mediante una amplia variedad de pruebas de coagulación. Además, se
han desarrollado varias pruebas para monitorizar el avance del
tratamiento trombolítico. Se han desarrollado otras pruebas para
señalizar un estado pretrombolítico o hipercoagulable, o monitorizar
el efecto de administrar protamina a pacientes durante la cirugía
de derivación cardiopulmonar. Sin embargo, el principal valor de
las pruebas de coagulación está en monitorizar el tratamiento de
anticoagulación oral e intravenoso. Tres de las pruebas de
diagnóstico claves son el tiempo de tromboplastina parcial activada
(TTPA), tiempo de protrombina (TP) y tiempo de coagulación activado
(TCA).
Una prueba de TTPA evalúa las rutas intrínseca y
común de coagulación. Por este motivo a menudo se usa el TTPA para
monitorizar el tratamiento anticoagulación con heparina intravenosa.
Específicamente, mide el tiempo para que se forme un coágulo de
fibrina tras añadir el agente activante, calcio, y un fosfolípido a
la muestra de sangre citratada. La administración de heparina tiene
el efecto de suprimir la formación de coágulos.
Una prueba de TP evalúa las rutas extrínseca y
común de coagulación y, por tanto, se usa para monitorizar el
tratamiento de anticoagulación oral. La coumadina anticoagulante
oral suprime la formación de protrombina. En consecuencia, la
prueba se basa en la adición de calcio y tromboplastina tisular a la
muestra de sangre.
Una prueba de TCA evalúa las rutas intrínseca y
común de coagulación. A menudo se usa para monitorizar la
anticoagulación mediante el tratamiento con heparina. La prueba de
TCA se basa en la adición de un activador de la ruta intrínseca a
sangre completa reciente a la que no se ha añadido ningún
anticoagulante exógeno.
La tecnología de laboratorio habitual para las
pruebas de coagulación utiliza normalmente un método turbidimétrico.
Para el análisis, se recogen muestras de sangre completa en un
vacutainer de citrato y luego se centrifugan. El ensayo se realiza
con plasma al que se ha añadido un exceso suficiente de calcio para
neutralizar el efecto del citrato. Para una prueba de TP, se
proporciona tromboplastina tisular como un reactivo seco que se
reconstituye antes de su uso. Este reactivo es térmicamente
sensible y se mantiene a 4 grados C por los instrumentos. Se
transfieren alícuotas de muestra y reactivo a una cubeta y se
calientan a 37 grados C, y se realiza la medición basándose en un
cambio en la densidad óptica.
Como alternativa al método turbidimétrico, Beker
et al. (véase, Haemostasis (1982) 12:73) introdujeron un
reactivo de TP cromogénico (Thromboquant PT). El ensayo se basa en
la hidrólisis de p-nitroanilina a partir de un
péptido modificado,
Tos-Gly-Pro-Arg-pNA,
por trombina y se monitoriza espectrofotométricamente.
Se conocen dispositivos de monitorización de
coagulación para el análisis de sangre completa. Por ejemplo, un
cartucho de un único uso se ha descrito en la patente estadounidense
número 4.756.884 en el que se colocan reactivos secos en el
analizador que entonces se calienta hasta 37 grados C antes de
introducir una gota de sangre. La muestra se mezcla con el reactivo
mediante extracción capilar. El mecanismo de detección se basa en
luz láser que pasa a través de la muestra. Las células sanguíneas
que se mueven a lo largo de la trayectoria del flujo dan un patrón
de puntos específico para sangre no coagulada. Cuando la sangre se
coagula, el movimiento cesa produciendo un patrón específico para
sangre coagulada.
Se ha descrito un contador de coagulación
automático que mide el tiempo de coagulación activado (TCA) en
muestras de sangre de pacientes durante la derivación
cardiopulmonar. Se añade la muestra a un cartucho que incorpora un
dispositivo de agitación sobre el que se forma el coágulo. El
movimiento del dispositivo de agitación se controla por un detector
foto-óptico (véase, Keeth et al., Proceedings Am. Acad.
Cardiovascular Perfusion (1988) 9:22).
La patente estadounidense número 4.304.853
describe el uso de un sustrato que produce un producto electroactivo
al reaccionar con la enzima trombina. Se usa un sensor para
detectar el producto electroactivo. La descripción no incluye un
cartucho de un único uso y no describe el uso de un segundo sensor
para monitorizar la ubicación de la muestra.
La patente estadounidense número 4.497.744
describe un método turbidométrico para someter a ensayo la
coagulación. Se usa plasma que contiene un exceso de citrato en la
prueba. Se añade un reactivo que induce la coagulación, se coloca
la muestra en un turbidómetro, y se indica la coagulación mediante
un aumento en la turbidez de la muestra.
La patente estadounidense número 5.096.669,
incluye el formato general para el uso de un cartucho y analizador
para las pruebas de bioquímica sanguínea tales como niveles en
sangre de potasio y glucosa y el uso de una bomba para mover un
fluido de muestra hacia una región de sensor en una única
dirección.
La patente estadounidense número 5.200.051,
describe métodos eficaces de microfabricación de dispositivos
sensores para el análisis de analitos.
La patente estadounidense número 5.302.348
describe un aparato de prueba de coagulación de la sangre en el que
se fuerza la sangre a atravesar un conducto capilar. Cuando el
tiempo para atravesarlo supera el tiempo anterior en un determinado
porcentaje, se considera que se ha producido coagulación. El aparato
incluye una boca de entrada no cerrada que está conectada con dos
conductos, el primero recibe la muestra que va a someterse a
ensayo, el segundo recibe muestra de desbordamiento.
Las patentes estadounidenses números 5.447.440 y
5.628.961, describen un cartucho de un único uso y lector usados en
ensayos de coagulación. El estado de la muestra se determina por sus
propiedades de flujo según se detectan, por ejemplo, por un sensor
de conductividad.
Las patentes estadounidenses números 5.916.522 y
5.919.711 describen un dispositivo que usa electrodos específicos
de iones para medir la actividad iónica de fluidos incluyendo
fluidos corporales. Los fluidos se miden y transportan dentro del
dispositivo mediante centrifugación y presurización del
dispositivo.
Sigue habiendo una necesidad de un aparato y
método para realizar ensayos de la presente invención. Esta
invención es sensible a cambios en la coagulación de una muestra de
sangre, puede usarse en los centros de atención, especialmente en
ubicaciones, tales como la consulta del médico, que no tienen acceso
inmediato a instalaciones de prueba centralizadas, y el aparato
puede producirse en parte mediante métodos de microfabricación y se
adapta fácilmente para incluir una multiplicidad de pruebas,
incluyendo pruebas de analito y gasometría.
Ahora se ha descubierto sorprendentemente que
las necesidades enumeradas anteriormente, y más, pueden satisfacerse
mediante el aparato y método de la presente invención. En una
realización preferida de la invención, se describe un cartucho de
un único uso, desechable, que, junto con un dispositivo de lectura
externo, puede proporcionar información acerca de la propensión de
una muestra de fluido para experimentar cambios de viscosidad. En
particular, pueden obtenerse datos diagnóstico sobre fluidos
biológicos, tales como características de coagulación de muestras
de sangre completa.
De manera más importante, el aparato y método
descritos pueden incluir una batería de pruebas, todas las cuales
pueden realizarse simultáneamente en una única muestra de fluido,
normalmente en cuestión de décimas de segundos. Por ejemplo, el
tiempo requerido para realizar una prueba de TP normal es de
aproximadamente 12 segundos, mientras que pueden necesitarse de
aproximadamente 300 a más de 1000 segundos para pruebas de TCA
usando sangre de pacientes sumamente heparinizados. El aparato y
método de la presente invención está preferiblemente adaptado para
hacer uso de métodos y dispositivos de microfabricación,
especialmente sensores electroquímicos microfabricados, para
permitir la configuración de cartucho óptima y la adquisición,
manejo, tratamiento y almacenamiento de datos reproducibles.
La coagulación en la sangre o plasma se produce
cuando el fibrinógeno se convierte enzimáticamente en fibrina. En
esta conversión, se cortan pequeños fragmentos de péptidos de la
molécula de fibrinógeno para producir hebras de fibrina
individuales. Entonces las hebras forman una red con enlaces de
hidrógeno que sirve para gelificar la muestra. La enzima
responsable de la liberación de los fibrinopéptidos es la proteasa
trombina. Se genera en su forma activa como la penúltima etapa en
la cascada de coagulación, una serie de activaciones de proteasa
secuenciales que implican nueve proteínas plasmáticas.
La trombina es una proteasa que hidroliza
péptidos en el carboxilo terminal de arginina. Por tanto, su
presencia puede determinarse mediante la adición de un sustrato que
contiene arginina que, al convertirse, genera una especie
coloreada, fluorescente o electroactiva. En el aspecto más amplio de
la invención, un sensor detecta los cambios, por ejemplo, se usa un
electrodo en el cartucho para determinar amperométricamente la
especie electroactiva liberada. El aspecto de la especie
electroactiva está estrechamente relacionado con la coagulación de
la muestra de fluido.
Por tanto, en su sentido más general, una
realización de la presente invención se refiere a un cartucho para
medir un cambio en los parámetros de coagulación de una muestra de
fluido que comprende: (a) una carcasa que puede cargarse con una
muestra de fluido y equipada con un medio de desplazamiento de
muestra para aplicar una fuerza contra la muestra de fluido eficaz
para desplazar al menos una parte medida de la muestra de fluido
dentro de la carcasa; (b) al menos un sustrato, contenido en la
carcasa, que puede, tras el contacto con la muestra de fluido,
estimular reacciones enzimáticas relacionadas con la coagulación de
la muestra de fluido; (c) al menos un medio sensor, contenido en la
carcasa, que puede detectar las reacciones enzimáticas en la
muestra de fluido. En esta aplicación, el término "parámetros de
coagulación" se refiere a la medición determinada por las
pruebas de TTPA, TP, TCA y otras relacionadas generalmente con la
formación de coágulos, generalmente cuantificadas como tiempo hasta
la formación de
coágulos.
coágulos.
En realizaciones particulares de la presente
invención, la carcasa está equipada con uno o más medios de conexión
para unir la carcasa con un dispositivo de lectura. Por ejemplo, el
cartucho puede tener conectores electromecánicos para permitir que
el cartucho se una a un dispositivo de lectura externo que realiza
una variedad de funciones incluyendo, pero sin limitarse a, grabar,
presentar, manipular, almacenar, o utilizar de otro modo las medidas
que pueden llevarse a cabo usando el cartucho de la invención.
En la presente invención, el cartucho está
equipado con una bomba para desplazar la muestra de fluido. Por
ejemplo, el cartucho puede conectarse a una bomba externa que puede
ejercer entonces una fuerza contra la muestra de fluido para mover
la muestra dentro de la carcasa. Alternativamente, el medio de
desplazamiento de la muestra puede ser una bomba que ya forma una
parte integral del cartucho. En cualquier caso, el accionamiento de
la bomba de desplazamiento de la muestra permite que al menos una
parte de la muestra de fluido se mueva a través del sensor.
En una realización preferida de la invención, la
fuerza que se aplica a la muestra de fluido, así como su posterior
movimiento, es reversible de manera que al menos una parte de la
muestra de fluido se desplaza hacia atrás y hacia delante a través
del medio de sensor de una manera sustancialmente recíproca. Con el
contacto de la muestra de fluido con el reactivo, se detectan los
cambios posteriores en el contenido en trombina de la muestra de
fluido mediante monitorización de la muestra de fluido.
En una realización específica de la presente
invención, se describe un aparato para realizar un ensayo que
responde a la coagulación de una muestra de fluido que comprende:
(a) al menos un sensor sensible al desplazamiento de una muestra de
fluido a través del sensor; (b) al menos un sensor que puede
detectar amperométricamente una especie electroactiva; (c) al menos
un reactivo que puede estimular la coagulación de una muestra de
fluido; (d) un sustrato que puede reaccionar con una enzima
asociada a la coagulación con la generación de una especie
electroactiva y (e) una bomba para aplicar presión contra una
muestra de fluido en el dispositivo de retención de muestra para
desplazar al menos una parte de la muestra de fluido a través de los
sensores. Preferiblemente, la fuerza o presión se aplica de manera
reversible para hacer que la muestra de fluido se mueva de una
manera sustancialmente recíproca, de manera que la muestra de
fluido disuelve el sustrato y reactivo que estimula la coagulación.
En realizaciones particulares de la presente invención, se
proporciona una bomba que comprende un diafragma elástico en
comunicación fluida con la muestra que proporciona una fuerza
neumática a la muestra de fluido. Una bomba de diafragma preferida
puede tener un resorte interno o una esponja de caucho interna para
estimular la compresión y descompresión rápidas, reproducibles del
diafragma.
El cartucho de esta invención tiene prestaciones
para recibir una muestra de sangre, plasma u otro fluido y para
medir con precisión una alícuota de tamaño previamente seleccionado
de la muestra de fluido para el tratamiento adicional. Una alícuota
medida de este tipo se coloca en contacto con una cantidad
previamente medida de reactivo para activar y para detectar las
reacciones asociadas con la coagulación.
Tal como se mencionó anteriormente, la presente
invención también proporciona cartuchos y métodos de su uso en los
que los cartuchos pueden acoplarse a un dispositivo de lectura
externo que realiza varias funciones. Por tanto, la presente
invención también se refiere a un aparato en el que el sensor
proporciona una señal a un dispositivo de lectura externo que
acciona un pistón para comprimir y descomprimir la bomba de
diafragma. Cuando el sensor es un sensor de conductividad
(conductimétrico), preferiblemente un sensor de conductividad
microfabricado, la señal es una salida de conductividad. En una
realización, las señales de salida inferiores a un primer valor
previamente seleccionado hacen que el dispositivo de lectura accione
el pistón para comprimir el diafragma, y las señales de salida
superiores a un segundo valor previamente seleccionado hacen que el
dispositivo de lectura accione el pistón para descomprimir el
diafragma. Además de proporcionar una metodología de
retroalimentación, el dispositivo de lectura externo también puede
proporcionar capacidad de tratamiento de señales en la que los
datos sin procesar pueden procesarse para potenciar la cantidad de
información útil que puede obtenerse a partir de un ensayo dado. El
dispositivo de lectura externo también hace funcionar un sensor
amperométrico que oxida o reduce el producto de reacción de la
especie electrogénica que es indicativa de la coagulación. Esta
reacción electroquímica genera una corriente que se registra y trata
por el dispositivo de lectura externo. Otro aspecto de la presente
invención es el mantenimiento del cartucho a una temperatura dada,
preferiblemente a la temperatura fisiológica, con el fin de
garantizar un ensayo de coagulación fiable y reproducible.
Pueden someterse a ensayo diversas muestras de
fluidos según la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse
a, fluidos biológicos, tales como sangre completa y plasma. La
presente invención también es particularmente útil para realizar
ensayos sobre muestras de sangre anticoagulada, incluyendo, pero sin
limitarse a, sangre completa heparinizada o citratada.
Por tanto, es un objeto de la presente invención
proporcionar un aparato para realizar una prueba en sangre para
determinar el tiempo de protrombina (TP) que comprende: (a) al menos
un sensor de conductividad sensible al desplazamiento de una
muestra de sangre a través del sensor; (b) un segundo sensor que
puede detectar amperométricamente una especie electroactiva; (c) al
menos una mezcla de reactivos que comprende tromboplastina e iones
de calcio; (d) un sustrato que puede reaccionar con trombina con la
generación de una especie electroactiva; (e) una bomba para aplicar
de manera reversible presión contra la muestra de sangre para
desplazar al menos una parte medida de la muestra de sangre para
ponerla en contacto con el reactivo y sustrato y posteriormente a
través de los sensores, preferiblemente, de una manera
sustancialmente recíproca, entrando en contacto el reactivo y
estimulando la coagulación de la muestra de sangre.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un aparato para realizar una prueba en sangre para
determinar el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) que
comprende: (a) al menos un sensor de conductividad sensible al
desplazamiento de una muestra de sangre a través del sensor; (b) un
segundo sensor que puede detectar amperométricamente una especie
electroactiva; (c) al menos una mezcla de reactivos que comprende un
fosfolípido e iones de calcio; (d) un sustrato que puede reaccionar
con trombina con la generación de una especie electroactiva; y (e)
una bomba para aplicar de manera reversible presión contra la
muestra de sangre para desplazar al menos una parte medida de la
muestra de sangre para ponerla en contacto con el reactivo y
sustrato y posteriormente a través de los sensores,
preferiblemente, de una manera sustancialmente recíproca, entrando
en contacto el reactivo y estimulando la coagulación de la muestra
de sangre.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un aparato para realizar una prueba en sangre para
determinar el tiempo de coagulación activado (TCA) que comprende;
(a) al menos un sensor de conductividad sensible al desplazamiento
de una muestra de sangre a través del sensor; (b) un segundo sensor
que puede detectar amperométricamente una especie electroactiva;
(c) al menos un reactivo que puede activar la cascada de coagulación
extrínseca; (d) un sustrato que puede reaccionar con una enzima
asociada con la coagulación con la generación de una especie
electroactiva; y (e) una bomba para aplicar de manera reversible
presión contra la muestra de sangre para desplazar al menos una
parte medida de la muestra de sangre para ponerla en contacto con el
reactivo y sustrato y posteriormente a través de los sensores,
preferiblemente, de una manera sustancialmente recíproca, entrando
en contacto el reactivo y estimulando la coagulación de la muestra
de sangre.
Un objeto adicional de la presente invención es
la descripción de un método para llevar a cabo un ensayo de
coagulación que comprende: (a) colocar una muestra de fluido en un
dispositivo de retención de muestra para retener la muestra de
fluido sin que entre en contacto con un sensor y reactivo, siendo el
sensor sensible al desplazamiento de la muestra de fluido a través
del sensor y pudiendo el reactivo estimular un cambio de la
viscosidad de la muestra de fluido; (b) aplicar presión contra la
muestra de fluido en el dispositivo de retención de muestra para
desplazar al menos una parte de la muestra de fluido a través del
sensor. Preferiblemente, la fuerza o presión se aplica de manera
reversible de tal manera que la muestra de fluido se mueve de una
manera sustancialmente recíproca, de tal manera que la muestra de
fluido entra en contacto con el reactivo que estimula el cambio de
viscosidad de la muestra de fluido; (c) detectar este desplazamiento
de la muestra de fluido a través del sensor para indicar un cambio
de la viscosidad de la muestra de fluido; y (d) detectar la
generación de una especie electroactiva.
Otro objeto de esta invención es proporcionar un
cartucho para administrar una muestra medida a una ubicación de
análisis que comprende: una carcasa que tiene una boca de entrada de
muestra que puede cerrarse para recibir una muestra de fluido no
medida; una cámara de sujeción que tiene un primer extremo en
comunicación con la boca de entrada, teniendo la cámara de sujeción
un segundo extremo con un tope capilar; una ubicación de análisis
en comunicación con el tope capilar, permitiendo selectivamente el
tope capilar el paso de una muestra desde la cámara de sujeción
hacia la ubicación de análisis; una cámara de de desbordamiento en
comunicación con la cámara de sujeción para tratar el
desbordamiento de muestra de entrada; y una bomba para proporcionar
una fuerza a la muestra de fluido en la cámara de sujeción,
permitiendo así el paso de la muestra a través del tope
capilar.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un cartucho adaptado para su uso con un analizador para
someter a ensayo una enzima en una muestra de fluido que comprende:
una carcasa que tiene una boca de entrada de muestra, una cámara de
desbordamiento, una cámara de sujeción, y ubicación de análisis, un
cierre de boca de entrada estanco, una bomba accionada por el
analizador para mover la muestra dentro del cartucho, uno o más
depósitos de reactivo en la ubicación de análisis que comprenden al
menos un sustrato que puede reaccionar con una enzima en la muestra
de fluido, formando la reacción de la enzima un producto de reacción
detectable, un primer sensor para detectar la ubicación de la
muestra de fluido, y un segundo sensor para detectar el producto de
reacción detectable.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un cartucho adaptado para su uso con un analizador para
someter a ensayo una enzima en una muestra de fluido que comprende:
una carcasa que tiene una boca de entrada de muestra, cámara de
sujeción, y ubicación de análisis, un cierre de boca de entrada
estanco, una bomba accionada por el analizador para mover la
muestra dentro del cartucho, uno o más depósitos de reactivos en la
ubicación de análisis que comprenden al menos un sustrato que puede
reaccionar con una enzima en la muestra de fluido, formando la
reacción de la enzima un producto de reacción detectable,
comprendiendo una capa hidrófoba una parte de la ubicación de
análisis, un primer sensor para detectar la ubicación de la muestra
de fluido, y un segundo sensor para detectar el producto de
reacción detectable.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un aparato que contiene un cartucho de un único uso
usado en combinación con un analizador para determinar un parámetro
de coagulación de una muestra de sangre o derivado de sangre que
comprende: un cartucho que tiene una boca de entrada para recibir
una muestra no medida, un cierre de boca de entrada, una cámara de
sujeción en comunicación en un primer extremo con la boca de
entrada, y un tope capilar en comunicación con la cámara de
sujeción en un segundo extremo, el tope capilar también en
comunicación con una cámara de análisis, la cámara de sujeción en
comunicación con una cámara de desbordamiento para recibir y
retener la muestra en exceso, la cámara de desbordamiento en
comunicación con una bomba neumática accionada por el analizador,
accionando el analizador la bomba neumática para desplazar la
muestra en la cámara de sujeción a través del tope capilar hacia la
cámara de análisis para administrar una parte medida de la muestra
dentro de la cámara de análisis, conteniendo la cámara de análisis
un sustrato para la enzima trombina que puede disolverse en la
muestra medida, un sensor amperométrico para detectar el producto de
la reacción entre la trombina y el sustrato, y un sensor
conductimétrico para detectar la posición de la muestra en la
cámara de análisis, estando el sensor amperométrico y el sensor de
conductividad conectados al analizador para proporcionar señales de
salida al analizador, pudiendo el analizador usar la señal de salida
del sensor de conductividad para accionar la bomba neumática para
controlar la posición de la muestra en la cámara de análisis,
pudiendo el analizador determinar el parámetro de coagulación a
partir de la señal de salida del sensor amperométrico, y
conteniendo el cartucho una región hidrófoba entre el tope capilar y
la cámara de análisis para evitar que la muestra en la cámara de
análisis vuelva a la cámara de sujeción.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método para someter a ensayo una enzima en una
muestra de sangre o derivado de sangre que comprende las etapas de:
colocar la muestra de sangre o derivado de sangre en la boca de
entrada de un cartucho, cerrar la boca de entrada, activar la bomba
neumática, forzar así una muestra medida desde la cámara de muestra
hacia la cámara de análisis, hacer oscilar la muestra hacia atrás y
hacia delante en la cámara de análisis, y determinar la
concentración del producto de reacción usando el segundo
sensor.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método para someter a ensayo una enzima en una
muestra de sangre o derivado de sangre que comprende las etapas de:
introducir la muestra en un cartucho, medir una parte de la
muestra, mover la muestra medida hasta una ubicación de análisis,
mezclar la muestra medida con reactivo en la ubicación de análisis,
dejar que la enzima reaccione con el reactivo, colocar la muestra
reaccionada en un sensor, y detectar el producto de la reacción de
la enzima usando un sensor.
La presente invención abarca adicionalmente un
cartucho de un único uso, desechable, compuesto por una pluralidad
de sensores microfabricados para la determinación de la presencia o
concentración de uno o más analitos en un fluido de muestra, junto
con un sensor microfabricado para la determinación de cambios en la
viscosidad del fluido de muestra así como un sensor microfabricado
para la determinación de la presencia de una especie
electroactiva.
Otros objetos de la presente invención
resultarán evidentes para los expertos en la técnica,
particularmente tras considerar la siguiente descripción detallada
de las realizaciones preferidas.
La figura 1 es una representación esquemática de
la cascada de coagulación.
La figura 2 es una vista en planta de la parte
superior del cartucho.
La figura 3 es una vista en sección transversal
del área de boca de entrada de muestra del cartucho.
La figura 4 es una vista en sección transversal
del área de la cámara de sujeción y de la cámara previa al sensor
del cartucho.
La figura 5 es una vista en perspectiva de la
cámara de desbordamiento del cartucho.
Las figuras 6A, 6B, y 6C muestran la oscilación
de la muestra en la ubicación de análisis.
La figura 7 muestra los sensores conductimétrico
y amperométrico del cartucho.
La figura 8 muestra la placa hidrófoba en la
trayectoria del fluido.
La figura 9 es un diagrama que muestra la
concentración de reactivo en la muestra.
Lo siguiente describe la invención de un
cartucho desechable para su uso a pie de cama del paciente para
realizar una coagulación tradicional. El cartucho proporciona un
medio mediante el cual puede medirse una muestra de sangre y
mezclarse cuantitativamente con reactivos que activan la cascada de
coagulación. La formación de coágulos se detecta posteriormente
usando un sensor microfabricado alojado dentro del cartucho. Se
describen las características funcionales del cartucho y
sensor.
La patente estadounidense número 5.096.669,
describe un sistema para realizar pruebas cerca del paciente
compuesto por un analizador portátil y cartuchos de prueba
desechables. El cartucho se monta a partir de componentes moldeados
y aloja a los reactivos, calibradores y sensores necesarios para
realizar una variedad de pruebas químicas clínicas. Los cartuchos
contienen diversas combinaciones de sensores electroquímicos
tradicionales que se han miniaturizado mediante técnicas de
microfabricación. Se utilizan procedimientos litográficos y
tecnología de dispensación inventiva para crear sensores selectivos
de iones (Na^{+}, K^{+}, Cl^{-}, NH_{3}^{-}, Ca^{2+},
pH, y CO_{2}), amperométricos (glucosa, creatinina, lactato,
oxígeno), y conductimétricos (hematocrito). Los sensores se envasan
de manera que los cartuchos únicos contienen los patrones de pruebas
más comunes.
Las pruebas de coagulación comprenden varias
pruebas que se usan para indicar el estado del sistema de
coagulación de un paciente. Las pruebas se usan para monitorizar
pacientes que reciben tratamiento de anticoagulación agudo o
profiláctico o para examinar al paciente para detectar anomalías en
la coagulación. Debido a que el proceso de coagulación es complejo
e implica varios componentes sanguíneos, se han desarrollado varias
pruebas de coagulación para analizar la integridad de los diversos
subsistemas de coagulación.
La formación de coágulos sanguíneos es la
formación inducida por traumatismo de un coágulo gelatinoso
insoluble que sirve para disminuir el flujo sanguíneo en la zona
afectada. El gel se forma a medida que las hebras de fibrina, que
se generan mediante la acción de la trombina sobre la proteína
plasmática fibrinógeno, se reticulan para formar una estructura
tridimensional. La conversión de fibrinógeno se produce como la
etapa final en una serie de reacciones enzimáticas en la que se
activan enzimas de coagulación secuenciales, o factores. La serie
de reacciones enzimáticas se denomina cascada de coagulación y se
representa en la figura 1. Se inicia mediante la activación de los
factores XII o VIII. In vivo, el primero se convierte en su
forma activa en la superficie de las plaquetas que se han
aglomerado en sitios de daño tisular. El factor VIII se activa
mediante tromboplastina, una sustancia liberada por células
endoteliales dañadas. La activación del factor XII y factor VIII se
denomina activación intrínseca y extrínseca, respectivamente.
La figura I es una representación esquemática de
las etapas enzimáticas que se producen en la cascada de coagulación.
Cada factor se convierte en su forma activa sólo durante la
coagulación activa. Las flechas indican la secuencia de
activaciones requerida para la formación de coágulos. Tal como se
indicó, muchas de las reacciones también requieren la presencia de
iones de calcio libres (Ca^{++}) y fosfolípidos (PL),
representados conjuntamente como 82 en la figura 1. La coagulación
puede iniciarse mediante la activación de la ruta 74 intrínseca que
implica la activación del factor XII. Otro modo de iniciar la
coagulación es mediante la ruta 60 extrínseca que provoca la
activación del factor XII. La activación del factor XII se
representa en 62; del factor XI en 64; del factor IX en 66: del
factor X en 68 y en 70; del factor XIII en 72; del factor II en 76
(también denominado la conversión de protrombina en trombina); y la
conversión de fibrinógeno soluble en fibrina insoluble en 78 con la
formación de un coágulo en 80.
Las pruebas de coagulación realizadas más
frecuentemente miden el tiempo requerido para la formación de
coágulos en una muestra de sangre o plasma tras la adición de
reactivos de activación. El reactivo de iniciación usado indica la
parte de la cascada de coagulación que se activará y por tanto que
se someterá a ensayo. Las superficies cargadas negativamente imitan
la activación por plaquetas y se añade tromboplastina tisular para
iniciar la coagulación mediante la ruta intrínseca. Los
instrumentos de laboratorio más sofisticados miden, dispensan y
mezclan reactivos y muestra automáticamente. Métodos menos
automatizados requieren que el usuario mida y mezcla la muestra y
reactivo. La formación de coágulos en estos instrumentos se detecta
o bien mecánica o bien ópticamente.
La memoria descriptiva de funcionamiento
describe la secuencia de acontecimientos que debe producirse en el
transcurso de un ciclo de prueba. Para someter a ensayo una enzima
en una muestra de sangre o derivado de sangre esta memoria
descriptiva describe el siguiente método:
introducir la muestra en un cartucho,
medir una parte de la muestra,
mover la muestra medida hasta una ubicación de
análisis,
mezclar la muestra medida con reactivo en la
ubicación de análisis,
colocar la muestra que ha reaccionado en un
sensor, y
detectar el producto de la reacción enzimática
usando un sensor.
La memoria descriptiva del rendimiento expone
los criterios para parámetros tales como el intervalo de resultados
que se notificarán, la precisión y la exactitud necesaria de la
prueba, y las condiciones de funcionamiento aceptables. Los
resultados de las pruebas deben coincidir con la sensibilidad y el
intervalo de las pruebas de coagulación comúnmente aceptadas y
deben hacerlo con una precisión comparable o mejor. Además, como
dispositivo de centros de atención, puede hacerse funcionar por
personal no entrenado técnicamente, el software del analizador debe
detectar cualquier error de cartucho que se produzca.
La figura 2 es una vista en planta del lado 40
superior o primero del cartucho o carcasa 10. Se muestra la boca 12
de entrada de muestra y está rodeada por un pocillo 14 de muestra en
exceso circunferencial. Una tapa 38 a presión cierra la boca 12 de
entrada de muestra con la formación de un sello estanco. Una cámara
20 de sujeción de muestra está en comunicación con la boca 12 de
entrada de muestra. Un tope 22 capilar está en el extremo de la
cámara de sujeción de muestra que está distal a la boca 12 de
entrada de muestra. Una canal 24 previo al sensor conduce desde el
tope 22 capilar hasta la ubicación 31 de análisis. Un depósito 30 de
reactivo y sustrato está ubicado en la ubicación 31 de análisis.
Además, en comunicación con la ubicación 31 de análisis, hay
sensores 28 conductimétricos, un sensor 29 amperométrico, y un
sensor 32 de referencia. El sensor 29 amperométrico está ubicado
distal al tope 22 capilar y los sensores 28 conductimétricos están
ubicados proximales al tope 22 capilar. La ubicación 31 de análisis
está en comunicación con el tubo 34 de desechos. Una capa 26
hidrófoba está ubicada entre el canal 24 previo al sensor y la
ubicación 31 de análisis. La trayectoria 38 de fluido consiste en
la boca 12 de entrada de muestra, la cámara 20 de sujeción, el tope
22 capilar, el canal 24 previo al sensor, la ubicación 31 de
análisis, y el tubo 34 de desechos. Una bomba 36 de diagrama
flexible bombea aire que se transmite a través de la tubería 18 de
aire dentro de la cámara 16 de desbordamiento.
Aunque la bomba en la figura 2 es una bomba de
diafragma flexible, puede usarse cualquier bomba adecuada, tal como
de pistón y cilindro, electrodinámica, y sónica.
Muestra. Los ensayos de coagulación
comúnmente realizados con el cartucho de esta invención utilizan una
muestra de sangre, o una muestra de un derivado de sangre tal como
sangre que contiene un aditivo o diluyente, plasma, suero, o plasma
o suero que contienen un aditivo o diluyente.
Introducción de la muestra. La muestra se
deposita en el cartucho a través de la boca 12 de entrada de muestra
en la figura 2 y se muestra en sección transversal como 12 en la
figura 3. La abertura se diseña de manera que las fuerzas capilares
extraerán una gota que cuelga pegada al orificio de la boca dentro
del cartucho y hacia la cámara de sujeción de muestra. La acción es
un resultado de la geometría y alta energía superficial del
conducto plástico. Se logra una alta energía superficial con un
tratamiento en corona o tratamiento equivalente, tal como un
tratamiento con plasma de iones, antes del montaje del cartucho. Una
vez que la sangre alcanza la cámara de sujeción de muestra, su
superficie geométrica y tratada en corona hace que la sangre pase a
lo largo de su longitud hasta el punto de un tope capilar. El
límite superior del la zona de corte transversal de la cámara de
sujeción de muestra es el que evitaría la extracción capilar si se
sujetase el cartucho en vertical a medida que se llena. El límite
inferior de la sección transversal se determina por el volumen de
muestra requerido para las pruebas y la reproducibilidad requerida
de este volumen. La cámara de sujeción de muestra contiene 19
microlitros con un área de sección transversal de 0,0075 cm^{2}.
En otras realizaciones el volumen de la muestra de fluido medida
está en el intervalo de 1 microlitro a 1 mililitro. Un volumen
preferido de la muestra de fluido medida está en el intervalo de 15
microlitros a 50
microlitros.
microlitros.
Medir la muestra de fluido. La
reproducibilidad del volumen de muestra que se mueve dentro del
canal del sensor para mezclarse afecta a la reproducibilidad de la
concentración final de reactivo disuelto en la sangre. El método de
medición descrito a continuación proporciona reproducibilidad
volumétrica.
En todos los cartuchos la medición y bombeo de
fluidos y reactivos es independiente del usuario. Una vez que el
usuario rellena el cartucho, cierra la tapa a presión para sellar la
boca de entrada de sangre e inserta el cartucho en el analizador,
se produce el ciclo de prueba y se monitoriza mediante el software
de analizador. Tras la inserción, el analizador reconoce en primer
lugar el tipo de cartucho. Se inicia la secuencia de prueba
apropiada y se controla el momento, velocidad y duración de todos
los movimientos posteriores de fluido. La muestra de sangre se
mueve hacia dentro del canal de sensor, también denominado ubicación
31 de análisis en la figura 2 una vez que el elemento de
calentamiento se estabiliza a 37ºC. La muestra de sangre avanza a
medida que un pistón en el analizador empuja la membrana 36 de la
bomba de diafragma. Esto fuerza al aire a través de la tubería 18
de aire que conecta la cámara flexible de aire y la cámara 16 de
desbordamiento y mueve la sangre que está en frente del orificio
hacia el canal de sensor. El volumen de la muestra de fluido medida
es el volumen de la cámara 20 de sujeción entre el orificio (48 en
la figura 5) en la pared de la cámara de sujeción y el tope 22
capilar. El volumen de sangre que se mueve dependerá principalmente
del volumen de sangre en frente del orificio y en segundo lugar de
la razón de área superficial con respecto al volumen de la cámara
de sujeción de muestra, los hematocritos de la muestra (el
porcentaje del volumen de sangre compuesto por glóbulos rojos), y
la velocidad del fluido. Estos últimos tres parámetros determinan el
volumen de muestra que permanecerá sobre las paredes de la cámara
de sujeción de muestra a medida que se evacúa la cámara. El fluido
se medirá de la manera más precisa a baja velocidad desde una cámara
con una razón de área superficial con respecto a volumen baja. El
límite inferior en el área de sección transversal de la cámara de
sujeción de muestra se determina mediante la variación permisible
en la pérdida de volumen para tener cizalladura a la velocidad de
fluido necesaria.
La figura 3 es una vista en sección transversal
del área de boca 12 de entrada de muestra del cartucho o carcasa
10. La figura 3 muestra el lado superior o primero o carcasa 40
superior del cartucho, el lado de base o segundo o carcasa 44
inferior del cartucho, y la pared o cinta o película 42 interpuesta
entre los lados primero y segundo. La cinta 42 tiene una capa
adhesiva sobre cada lado y se adhiere a los lados superior 40 y de
base 44 del cartucho. La boca 12 de entrada de muestra se muestra
llena con muestra 46, y la muestra 46 también ha llenado la cámara
20 de sujeción de muestra. Un pocillo 14 circunferencial rodea la
boca 12 de entrada de muestra y se muestra rellena con muestra en
exceso.
Para llenar con precisión la cámara de sujeción
de muestra, debe haber extracción capilar suficiente para evitar no
llenar lo suficiente el cartucho así como una característica de tope
que evita que la muestra desborde en el canal previo al sensor. Tal
como se representa en la figura 4, se forma un tope 22 capilar
mediante un diámetro interno pequeño o agujero pasante en la junta
42 de cinta entre secciones de solapamiento de la cámara 20 de
sujeción de muestra y el canal 24 previo al sensor sirve para este
fin. El tope 22 capilar que se forma es relativamente corto: sólo
el espesor de la junta 42 de cinta. Aunque esto disminuye la
resistencia del capilar y por tanto disminuye su eficacia para
detener el fluido una vez que se llena el cartucho, es necesario ya
que minimiza la zona de alta cizalladura a través de la cual debe
pasar la muestra a medida que se empuja a través del diámetro
interno para la administración dentro del canal previo al sensor. La
región de alta cizalladura de poco volumen minimiza la pérdida de
muestra en las paredes del capilar y disminuye el potencial de
inclusión de segmentos de aire atrapados a medida que el extremo
trasero de la columna de fluido en movimiento sale de la región
capilar.
La figura 4 es una vista en sección transversal
de la conjunción de la cámara 20 de sujeción de muestra y la cámara
24 previa al sensor y el tope 22 capilar. Se muestra la base 44 con
la cámara 20 de sujeción de muestra cortada dentro de la misma. El
canal 24 previo al sensor se muestra cortado dentro de la parte 40
superior. La cinta 42 forma la pared superior de la cámara 20 de
sujeción de muestra y la pared inferior de la cámara 24 previa al
sensor. Un diámetro interno capilar o agujero 22 pasante perfora la
cinta 42 y limita el flujo entre la cámara 20 de sujeción de
muestra y la cámara 24 previa al sensor.
El tope capilar de la figura 4 es un diámetro
interno circular o agujero pasante. Otras formas adecuadas para el
tope capilar incluyen forma rectangular e irregular. Si es de forma
rectangular, ejemplos adecuados tienen una dimensión menor de
aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 400 micrómetros.
En tales ejemplos, la dimensión mayor del tope capilar es de
aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 1000
micrómetros.
El tope capilar tiene resistencia suficiente
como para detener la extracción capilar dentro del canal previo al
sensor. No es suficiente resistir a los cambios súbitos de presión
que se producen a medida que se cierra a presión el cierre del
cartucho. Para reducir la fuerza en la abertura capilar en este
punto, se incorporan dos características de "desbordamiento"
dentro del cartucho. La primera es el pocillo 14 de desbordamiento
en las figuras 2 y 3. A medida que se cierra el cierre a presión, se
empuja algo de muestra en exceso dentro del pocillo en vez de más
dentro del cartucho. La segunda característica es un orificio 48 (en
la figura 5) o ventilación de presión a través del cual puede fluir
la muestra en exceso dentro de la cámara 16 de desbordamiento. Tal
como se representa en la figura 5, la cámara 16 de desbordamiento es
una cámara de poco volumen en el lado superior del cartucho ubicada
por encima de la cámara de sujeción de muestra y separada de la
cámara por una pared de cinta 42. Un orificio 48 en la cinta 42
permite fluir la muestra en exceso hacia dentro de la cámara de
desbordamiento. El agujero u orificio 48 en la junta 42 de cinta
tiene un área superior a la abertura del tope capilar y por tanto
el orificio tiene una resistencia al flujo menor a la del tope
capilar. La cámara 16 de desbordamiento por encima de la abertura u
orificio 48 de la cinta tiene paredes muy bajas de manera que una
vez que la muestra se empuja a través de este agujero, toca el
plástico tratado en corona y se extrae dentro de la cámara. Por
tanto la muestra desplazada a medida que se cierra el cartucho está
atrapada dentro de esta cámara. Cuando se comprime la cámara
flexible de aire, se fuerza aire a través de la tubería 18 de aire
hacia la cámara 16 de desbordamiento. La alta razón de área
superficial con respecto al volumen de esta región potencia el
cizallamiento de la muestra de manera que el aire empuja una
trayectoria a través de la muestra en exceso dejando la muestra en
exceso sobre las paredes de la cámara de desbordamiento.
La figura 5 es una vista en perspectiva de la
cámara 16 de desbordamiento. La cámara 16 de desbordamiento está
ubicada directamente sobre la cámara de sujeción de muestra (no
mostrada en la figura 4). La cinta 42 que es la pared superior de
la cámara de sujeción de muestra (20 en la figura 2) también forma
la pared inferior de la cámara 16 de desbordamiento. Un orificio 48
en la cinta 42 permite la comunicación entre la cámara 16 de
desbordamiento y la cámara de sujeción de muestra (20 en la figura
2). El orificio puede ser de forma circular, rectangular, o
irregular. La cámara de desbordamiento se construye en forma de una
caja baja. Un tubo 18 de aire administra aire desde la bomba 36 (no
mostrada en la figura 5) hasta la cámara 16 de desbordamiento. El
volumen de la cámara de desbordamiento está en el intervalo de 0,2
microlitros a 1 mililitro. Un volumen preferido de la cámara de
desbordamiento está en el intervalo de 1 microlitro a 10
microlitros. El diámetro del orificio circular es desde
aproximadamente 100 micrómetros hasta aproximadamente 1000
micrómetros.
Movimiento de la muestra. En la figura 2,
se fuerza una muestra medida desde la cámara 20 de sujeción de
muestra a través del canal 24 previo al sensor hacia la ubicación
31 de análisis a medida que el émbolo en el analizador comprime la
cámara 36 flexible de aire del cartucho y fuerza aire a través de la
tubería 18 de aire hacia la cámara 16 de desbordamiento y a través
del orificio (48 en la figura 5). A medida que la muestra se mueve
a través de los conductos secos, es necesario que la parte frontal
del fluido humedezca las paredes de los canales de manera uniforme.
Si la energía superficial del conducto no es igual en todos los
lados, puede producirse un flujo irregular, provocando la formación
de burbujas de aire dentro del segmento. Las superficies del canal
dentro de la tapa, la junta adhesiva, el recubrimiento reactivo, y
las placas deben tener por tanto una energía superficial
equivalente. Se necesitan tratamientos superficiales de los
componentes para garantizar esta uniformidad.
Reactivo. En la técnica se conoce bien
colocar un reactivo seco en una trayectoria de fluido para su
reacción con una muestra que debe analizarse. Se incluyen una
variedad de componentes en el reactivo, algunos de los cuales
contribuyen a volver a disolver rápidamente el reactivo seco por la
muestra de fluido. Éstos incluyen un polímero soluble en agua,
gelatina, agarosa, un polisacárido, polietilenglicol, poliglicina,
un sacárido, sacarosa, un aminoácido, glicina, una sal tampón,
fosfato de sodio, tampón HEPES, y una molécula colorante.
En la técnica se conoce incluir un material para
inducir la coagulación mediante la ruta extrínseca (60 en la figura
1). Los materiales adecuados para su uso con el cartucho de esta
invención incluyen celite, caolín, tierra de diatomeas, arcilla,
dióxido de silicio, ácido elágico, tromboplastina natural,
tromboplastina recombinante, fosfolípido, y mezclas de los mismos.
Un inductor preferido es celite.
Reacción
trombina-sustrato. El sustrato usado en el
ensayo electrogénico tiene una unión amida que imita la unión amida
escindida de trombina en el fibrinógeno. Específicamente, el
sustrato es un resto
tosil-glicil-prolinil-arginil-,
H-D-fenilalanil-pipecolil-,
o
bencil-fenilalanil-valil-arginil-
unido a un resto
N-fenil-p-fenilendiamina
o
N-[p-metoxifenil-]-p-fenilendiamina.
La trombina escinde el enlace amida en el extremo carboxilo terminal
del residuo de arginina o residuo pipecolilo ya que el enlace se
asemeja estructuralmente a la unión amida escindida de trombina en
el fibrinógeno. El producto de la reacción
trombina-sustrato es el
tosil-glicil-prolinil-arginil-,
H-D-fenilalanil-pipecolil-,
o
bencil-fenilalanil-valil-arginil-
electroquímicamente inerte y los compuestos electroactivos
N-fenil-p-fenilendiamina
o
N-[p-metoxifenil-]-p-fenilendiamina.
Se seleccionó la secuencia tripeptídica dado que vuelve al sustrato
virtualmente no reactivo con proteasas de la sangre distintas de
trombina y la reactividad de la trombina con la unión amida de la
arginina en la molécula es muy similar a su reactividad con la
unión amida diana en el fibrinógeno. Cuando el sustrato está
presente en una muestra de sangre o derivado de sangre, la trombina
generada convierte simultáneamente al mismo y al fibrinógeno en sus
productos de escisión. El producto de reacción de especie
electroquímica se detecta mediante un sensor electroquímico.
Hay una amplia variedad de materiales
electrogénicos que muestran reacciones electroquímicas reversibles o
casi reversibles conocidas en la técnica que pueden someterse a
ensayo usando un sensor amperométrico de esta invención. Por
ejemplo, pueden detectarse ferroceno, ferrocianuro, y otras especies
organometálicas. Otros incluyen derivados de fenazina. Cualquier
material electrogénico adecuado puede combinarse con un sustrato
adecuado para su uso para someter a ensayo una enzima. Por ejemplo,
materiales electrogénicos adecuados pueden combinarse con un
tripéptido adecuado con un residuo de arginina para su uso para
determinar la presencia de trombina.
Un material electrogénico indicador que se
detecta a un potencial diferente del potencial de detección para el
sustrato o el producto electrogénico de la reacción enzimática puede
incluirse en el reactivo. Un segundo material electrogénico de este
tipo es útil para normalizar el sensor amperométrico. Materiales
electrogénicos adecuados para este fin incluyen ferroceno,
ferrocianuro, y otras especies organometálicas, derivados de
fenazina,
N-fenil-p-fenilendiamina
y
N-[p-metoxifenil-]-p-fenilendiamina.
La prueba se denomina "electrogénica"
porque las especies electroquímicamente detectables se generan para
permitir la determinación de una medición de velocidad o punto final
de la prueba. Esto es similar a las pruebas de punto final
"cromogénico" o "fluorogénico" en las que un cambio en las
propiedades de absorción o emisión de luz de una muestra indica la
medición de velocidad o punto final. En una prueba cromogénica, por
ejemplo, la parte escindida de la molécula de sustrato es incolora
cuando está unida al tripéptido y brillantemente coloreada cuando
se libera mediante la acción de trombina. Monitorizando la longitud
de onda a la que la especie libre absorbe luz, puede determinarse
el tiempo en el que se produce trombina activada, se ha mostrado que
las pruebas de TTPA y TP tienen una buena correlación con las
pruebas en plasma de TTPA y TP tradicionales.
El cartucho de esta invención no se limita sólo
al ensayo de enzimas de coagulación. Pueden concebirse ensayos para
una variedad de enzimas, tales como glucosa oxidasa, lactato
oxidasa, y otras oxidoreductasas, enzimas basadas en
deshidrogenasa, y fosfatasa alcalina y otras fosfatasas, y serina
proteasas. Con esta invención pueden someterse a ensayo otras
enzimas conocidas en la técnica que se someten a ensayo en
procedimientos químicos clínicos.
Mezcla de reactivos. Una vez en la
ubicación de análisis, debe mezclarse la muestra con el reactivo.
Para estas pruebas, se requiere que el reactivo se distribuya
homogéneamente a lo largo de toda la muestra en la región del
sensor en el plazo de unos pocos segundos desde el inicio de la
disolución.
En el cartucho de coagulación, se inicia la
reacción de coágulos en una región específica del canal del sensor
sobre las placas de sensor. Una longitud de la pared dentro del
canal está recubierta con el reactivo, tal como se indica en 30 en
la figura 2 y figura 6A-C. Haciendo oscilar un
segmento de la muestra sobre el reactivo induce la convección. El
movimiento está controlado de manera que el borde posterior del
segmento de sangre se mueve continuamente hacia atrás y hacia
delante a través del recubrimiento de reactivo, tal como se
representa en la figura 6A-C.
Las figuras 6A-C muestran la
ubicación 31 de análisis junto con otras partes de la trayectoria
del fluido, el canal 24 previo al sensor y el tubo 34 de desechos.
Se muestra el depósito 30 de reactivo seco en la ubicación 31 de
análisis. La figura 6B muestra una muestra 46 que ha pasado el
depósito de reactivo. La figura 6C muestra la muestra 46 tras haber
oscilado de vuelta sobre la zona en la que se depositó el reactivo.
Aunque se muestra el reactivo 30 depositado en la ubicación 31 de
análisis en la figura 6A, es posible colocar el depósito de
reactivo en más de un sitio en la ubicación de análisis, y pueden
colocarse depósitos de reactivos en cualquier ubicación en toda la
trayectoria del fluido (38 en la figura 2).
La oscilación se mantiene usando un sensor de
posición del fluido coincidente con el recubrimiento de reactivo.
Este sensor comprende las dos barras paralelas sobre la placa de
sensor mostradas en la figura 6. La figura 6 muestra los sensores
28 contuctimétricos. Estos sensores 28 se encuentran perpendiculares
a la longitud del canal de sensor y la resistencia eléctrica entre
los mismos se usa para monitorizar la posición relativa de la parte
frontal del fluido. En los extremos, una lectura de circuito abierto
indica que el fluido se ha empujado fuera del sensor y una lectura
de circuito cerrado indica que el sensor está cubierto con muestra.
El fluido se mueve continuamente hacia atrás y hacia delante con una
velocidad controlada. Controlando el tiempo durante el cual el
sensor permanece como un circuito abierto y cerrado se controla la
posición en la que el fluido cambia de dirección.
En un método preferido, la bomba neumática hace
oscilar la muestra en la cámara de análisis con borde posterior de
la muestra colocado en la región del sensor de conductividad con el
fin de disolver el sustrato en esa parte de la muestra cerca del
borde posterior. La oscilación puede tener una frecuencia en el
intervalo de 0,2 a 10 Hertz durante un periodo en el intervalo de 1
a 100 segundos. En un método preferido, la oscilación tiene una
frecuencia en el intervalo de aproximadamente 1,5 Hertz durante un
periodo de aproximadamente 20 segundos. En otro método preferido,
la oscilación tiene una frecuencia de aproximadamente 0,3 Hertz y el
segundo sensor o amperométrico genera una señal en cada oscilación.
Si hay eritrocitos presentes en la muestra de fluido, la oscilación
tiene una frecuencia adecuada para evitar la deposición de
eritrocitos sobre el sensor. En un método preferido, el sensor
amperométrico determina la concentración del producto cada vez que
se hace oscilar la muestra a través del sensor amperométrico.
En una realización preferida, la primera señal
del sensor amperométrico se almacena por el analizador y las
señales posteriores del sensor amperométrico se almacenan y se
comparan con la primera y otras señales almacenadas con el fin de
determinar la velocidad máxima de cambio en la señal del sensor
amperométrico. Estos datos se analizan para determinar una fracción
fija de la velocidad máxima de cambio de la señal del sensor
amperométrico. Estos datos se usan para determinar el parámetro de
coagulación de interés.
La figura 7 también muestra el sensor 29
amperométrico en el que la parte sensible tiene forma de una antena
31.
Aunque el sensor en el ejemplo en la figura 7 es
un sensor amperométrico, pueden usarse otros procedimientos
electroquímicos que usan otros sensores electroquímicos. Por
ejemplo, puede usarse un sensor potenciométrico para detectar
especies iónicas tales como Na^{+} y K^{+}.
En la realización preferida de la presente
invención, el analizador aplica un potencial a un sensor
amperométrico con la generación de una señal electroquímica, siendo
dicha señal proporcional a la concentración del producto en la
muestra de fluido. El sensor amperométrico tiene un potencial
aplicado de aproximadamente +0,4 V frente a un electrodo de
plata-cloruro de plata y, en otra realización
preferida, el sensor amperométrico tiene un potencial aplicado de
aproximadamente +0,1 V frente a un electrodo de
plata-cloruro de plata. La señal generada por el
producto de reacción enzimática a aproximadamente +0,1 V puede
distinguirse de la señal generada por el sustrato sin reaccionar a
aproximadamente +0,4 V.
En las realizaciones de la invención que
utilizan los sustratos de restos de
tosil-glicil-prolinil-arginil-,
H-D-fenilalanil-pipecolil-,
o
bencil-fenilalanil-valil-arginil-unido
a un resto de
N-fenil-p-fenilendiamina
o
N-[p-metoxifenil-]-p-fenilendiamina,
se detectan los sustratos intactos a un voltaje de aproximadamente
+0,4 V. Los productos de reacción electrogénicos
N-fenil-p-fenilendiamina
o
N-[p-metoxifenil-]-p-fenilendiamina
se detectan a un voltaje de aproximadamente +0,1 V. Por tanto, en
estas realizaciones, el analizador aplica un potencial a un sensor
amperométrico con la generación de una señal electroquímica que es
proporcional a la concentración del sustrato en la muestra de
fluido. Además, el analizador aplica un potencial a un sensor
amperométrico con la generación de una señal electroquímica que es
proporcional a la concentración del producto en la muestra de
fluido. Tras la hidrólisis del sustrato por la trombina, se forma un
producto que reacciona en el sensor amperométrico con la generación
de una señal que puede distinguirse de la señal generada por el
sustrato.
Debe observarse que los voltajes exactos usados
para detectar amperométricamente el sustrato y el producto variarán
dependiendo de la estructura química del sustrato y el producto. Es
importante que la diferencia de voltajes usados para detectar el
sustrato y el producto sea lo bastante grande como para evitar
interferencias entre las lecturas. Con algunos sustratos, el
voltaje requerido para detectar amperométricamente el sustrato es
tan elevado que está más allá de la medición práctica. En estos
casos, sólo es necesario que pueda detectarse amperométricamente el
producto.
Los sensores se microfabrican preferiblemente de
cualquier material electroconductor y están preferiblemente
compuestos por oro, platino, plata o iridio. Los métodos para
estructurar los metales sobre obleas de silicio se conocen bien en
la técnica. También es deseable recubrir el sensor con una capa
orgánica fina que evita el envenenamiento de la superficie del
sensor por componentes sanguíneos tales como una película de tiol
auto-ensamblada, tal como se conoce bien en la
técnica. Los mercaptoalcanoles forman películas de tiol
auto-ensambladas, y algunos ejemplos incluyen
mercaptoetanol, mercaptopropanol, mercaptobutanol, y mezclas de los
mismos.
La figura 9 es un gráfico de la distancia desde
el final del segmento de muestra en mm a lo largo de las abscisas
frente a la concentración de reactivo disuelto en micromoles a lo
largo de las ordenadas. Un diagrama en la parte superior de la
figura 9 muestra una muestra 46 de fluido, sensores 28
conductimétricos, y sensor 30 amperométrico. Los puntos de datos de
la figura 8 indican la concentración de reactivo disuelto a lo largo
de la longitud de la columna de muestra de fluido.
Mezclando de esta manera se produce un gradiente
de concentración a lo largo de la longitud del segmento de sangre.
Tal como se muestra en la figura 9, la concentración es superior en
el borde del segmento que se barrió a través del reactivo y
disminuye hacia el centro de la columna de fluido. En la figura 9,
la concentración medida y la variabilidad de concentración entre
cartuchos (las barras de error muestran una desviación estándar) se
representan como función de la posición a lo largo del segmento de
sangre. En la ubicación de sensor, una desviación estándar de la
concentración de reactivo es del 10% de la concentración media.
Mantenimiento de la posición del fluido.
En esta realización, el perfil de disolución no es uniforme, la
reproducibilidad entre cartuchos de la concentración de reactivo en
el sensor depende tanto de la consistencia entre cartuchos de la
colocación de la muestra como de la capacidad para mantener la
quiescencia dentro de la muestra durante todo el transcurso de la
prueba. Esto último se logra mediante un control de posición activo
usando una retroalimentación desde el mismo sensor de posición del
fluido empleado para monitorizar la oscilación de mezclado. Para
pruebas de corta duración, la resistencia entre las barras del
sensor se mantiene dentro de un intervalo un número fijado de
ohmios por encima de la lectura de circuito cerrado. Por tanto, la
superficie de contacto muestra-aire se mantiene
entre las dos barras. Si la muestra se desplaza de vuelta hacia la
cámara de sujeción de muestra, la resistencia disminuirá hasta que
se active un límite previamente fijado haciendo que el analizador
empuje la muestra hacia delante hasta que se logre de nuevo la
resistencia de control. Si la muestra se desplaza hacia el tubo de
desecho de cartucho, la resistencia se volverá superior haciendo que
el analizador extraiga la muestra hacia atrás. Dado que la
resistencia es una función sensible de la posición del fluido, la
parte frontal del fluido puede mantenerse en un intervalo de 100
micrómetros desde una posición nominal. Los movimientos correctivos
no provocan la convección dentro de la muestra ya que son de muy
baja amplitud y velocidad.
El control hasta una resistencia fijada es
suficiente en pruebas que requieren menos de 60 a 100 segundos para
completarse. Algunos tipos de pruebas de coagulación producen
resultados que siempre están en este intervalo. Sin embargo, otras
pruebas requieren hasta 15 minutos hasta de lograr el punto final.
Con tiempos prolongados, los glóbulos rojos pueden depositarse y
los componentes de la sangre pueden secarse en la superficie
expuesta de la placa. Ambas condiciones hacen que la resistencia
para una posición de fluido dada aumente e interfiera con el
controlador de posición. En el caso de la deposición, la resistencia
aumenta gradualmente haciendo que el controlador responda como si
el fluido se hubiese desplazado hacia delante. Entonces se extrae el
segmento hacia atrás para mantener la resistencia de punto
fijada.
Para salvar estos problemas en pruebas que
requieren periodos más prolongados de control de posición, se mueve
periódicamente el fluido hasta la posición de circuito completamente
cerrado y se mide la resistencia de circuito cerrado. Entonces
vuelve a colocarse el fluido a un valor de resistencia desviado con
respecto a la nueva lectura de circuito cerrado. La oscilación
humedece continuamente la placa para evitar el secado y la
resistencia desviada se fija con respecto a la lectura de circuito
cerrado para la muestra depositada. Estos movimientos no provocan
una convección excesiva dentro de la muestra ya que son de nuevo de
baja amplitud y velocidad.
La convección se produce dentro de la muestra
cerca del sensor si el segmento colocado no está aislado de manera
fluida. Cualquier trayectoria de flujo que conecte el segmento de
muestra colocado con la cámara de sujeción de muestra proporcionará
un camino mediante el cual el segmento de muestra puede sacarse
mediante sifón hacia atrás dentro de la cámara de sujeción. Esto es
porque la energía superficial y la razón de área superficial con
respecto a volumen de la cámara de sujeción de muestra necesarias
para permitir la extracción capilar también hace que la cámara se
humedezca preferiblemente. Si esto ocurre, el movimiento del fluido
sacándose mediante sifón desde el extremo de cola del segmento de
muestra hace que el fluido más profundo dentro del segmento se
extraiga sobre el sensor. Por tanto, la concentración de reactivo en
el volumen de muestra alrededor del sensor disminuye ya que se
mezcla con muestra que contiene una concentración inferior de
reactivo.
Una trayectoria de fluido que tiene resistencia
lo suficientemente baja como para permitir esta transferencia se
forma en la línea de separación entre la tapa de cartucho y la cinta
a medida que se empuja la muestra a través del canal previo al
sensor. Esto es porque el radio del borde del canal previo al
sensor, que se crea durante el proceso de moldeo por inyección de
la tapa, cuando se presiona contra la junta de cinta puede formar
un capilar fino que se llena de sangre sometida a cizalladura del
segmento de paso. Una vez lleno este capilar, la muestra puede
sacarse mediante sifón a través del mismo de vuelta a la cámara de
sujeción de muestra. Para evitar que se saque mediante sifón, debe
romperse la trayectoria de fluido. En una realización, esto se
logra en el cartucho de coagulación cortando una sección de la junta
de cinta por debajo del canal previo al sensor para exponer la
superficie de una placa de politetrafluoroetileno que está contenida
dentro de un pocillo en la base. La superficie de la placa se
nivela con la superficie de la base. El corte en la cinta crea una
muesca en el canal de tapa de manera que el capilar formado en la
línea de separación tapa-junta se interrumpe en la
región de la placa. La superficie hidrófoba de la placa de
politetrafluoroetileno evita la formación de una ruta alternativa a
lo largo de la superficie expuesta por la abertura. Esto se muestra
de manera esquemática en la figura 9.
La figura 8 muestra una placa 26 de
politetrafluoroetileno, ubicada en un pocillo sobre la base y
cubierta por la cinta 42, y una parte del canal 24 previo al
sensor. En esta parte del canal 24 previo al sensor, el canal corta
dentro de la parte superior o primer lado del cartucho y la cinta 42
forma la pared inferior del canal 24 previo al sensor. La figura 8
muestra una sección 50 en la que la cinta 42 se ha cortado
exponiendo una parte 51 de la placa 26 de politetrafluoroetileno a
la muestra contenida en el canal 24 previo al sensor. La muestra
que ha entrado en la región capilar descrita en el párrafo anterior
se representa en la figura 8 en 52.
La zona hidrófoba puede construirse usando
varios materiales diferentes. Puede ser un recubrimiento de matriz
hidrófoba tal como cera, gel de petróleo, y película orgánica no
polar. La zona hidrófoba puede formarse a partir de
politetrafluoroetileno, plástico recubierto con
politetrafluoroetileno, poliimida tratada con un plasma de ión
fluoruro, dióxido de silicio recubierto con un compuesto orgánico,
una aleación de tungsteno y titanio, y plata recubierta con cloruro
de plata. Una zona hidrófoba preferida está formada a partir de
politetrafluoroetileno.
Se han desarrollado y sometido a prueba
cartuchos prototipo para realzar pruebas de tiempo de coagulación
activado (TCA), tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), y
tiempo de protrombina (TP). Ensayos clínicos realizados con cada
tipo de cartucho han demostrado un rendimiento satisfactorio con
respecto a la precisión y exactitud de la prueba. Todas las pruebas
de coagulación utilizan los mismos componentes de cartucho y se
diferencian por la composición del reactivo seco.
Claims (43)
1. Cartucho para administrar una muestra
de fluido a una ubicación de análisis que comprende:
una carcasa que tiene una boca de entrada de
muestra que puede cerrarse para recibir una muestra de fluido;
una cámara de sujeción que tiene un primer
extremo en comunicación con la boca de entrada, teniendo la cámara
de sujeción un segundo extremo con un tope capilar; en la que la
ubicación de análisis está en comunicación con el tope capilar; y
en la que el tope capilar permite selectivamente el paso de la
muestra desde la cámara de sujeción hasta la ubicación de
análisis;
una cámara de desbordamiento en comunicación con
la cámara de sujeción para manejar el desbordamiento de la muestra
de entrada; y
una bomba para proporcionar una fuerza a la
muestra de fluido en la cámara de sujeción, permitiendo así el paso
de la muestra a través del tope capilar.
2. Cartucho según la reivindicación 1, en
el que la cámara de desbordamiento está ubicada por encima de la
cámara de sujeción y separada de la cámara de sujeción por una pared
de cámara de sujeción, y preferiblemente en el que la comunicación
entre la cámara de desbordamiento y la cámara de sujeción se realiza
mediante un orificio en la pared de la cámara de sujeción.
3. Cartucho según la reivindicación 2, en
el que la forma del orificio es circular, y preferiblemente en el
que el orificio tiene un diámetro de aproximadamente 100 micrómetros
a aproximadamente 1000 micrómetros.
4. Cartucho según la reivindicación 2, en
el que el área del orificio es mayor que el área del tope capilar y
preferiblemente en el que el orificio tiene una resistencia inferior
al flujo de fluido que el tope capilar.
5. Cartucho según la reivindicación 2, en
el que un techo de la cámara de sujeción comprende una cinta y el
orificio comprende un agujero en la cinta.
6. Cartucho según la reivindicación 2, en
el que el volumen de la cámara de sujeción entre el orificio y el
tope capilar corresponde sustancialmente al volumen de la muestra de
fluido, y preferiblemente, en el que la cámara de desbordamiento
recibe muestra en exceso desde la cámara de sujeción a través del
orificio.
7. Cartucho según la reivindicación 1,
que comprende además una cámara previa al sensor entre el tope
capilar y la ubicación de análisis, y preferiblemente, en el que el
área transversal de la cámara de sujeción es mayor que las áreas
transversales del canal previo al sensor y la ubicación de
análisis.
8. Cartucho según la reivindicación 7,
que comprende además una zona hidrófoba entre la ubicación de
análisis y la cámara previa al sensor, y preferiblemente, en el que
la zona hidrófoba comprende un recubrimiento de matriz hidrófoba
seleccionado del grupo que consiste en cera, gel de petróleo, y
película orgánica no polar.
9. Cartucho según la reivindicación 8, en
el que la zona hidrófoba comprende una capa de material seleccionado
del grupo que consiste en politetrafluoroetileno, plástico
recubierto con politetrafluoroetileno, poliimida tratada con plasma
de ión fluoruro, dióxido de silicio recubierto con un compuesto
orgánico, una aleación de tungsteno y titanio, y plata recubierta
con cloruro de plata, y preferiblemente en el que la zona hidrófoba
comprende una capa de politetrafluoroetileno.
10. Cartucho según la reivindicación 1, en el
que el tope capilar tiene una forma rectangular, en la que la
dimensión menor es de aproximadamente 100 micrómetros a
aproximadamente 400 micrómetros.
11. Cartucho según la reivindicación 1, en el
que las superficies de pared de la cámara de sujeción se tratan en
corona, y preferiblemente, en el que las superficies interiores de
la cámara de sujeción y/o la cámara de desbordamiento se tratan en
corona.
12. Cartucho según la reivindicación 1, en el
que el volumen de la cámara de desbordamiento está en el intervalo
de 0,2 microlitros a 1 mililitro, y preferiblemente en el intervalo
de 1 microlitro a 10 microlitros.
13. Cartucho según la reivindicación 1, en el
que la bomba está en conexión fluida con la cámara de
desbordamiento, y preferiblemente en el que la fuerza proporcionada
a la muestra es una fuerza neumática.
14. Cartucho según la reivindicación 1, que
incluye una carcasa superior, una carcasa inferior, y una película
recubierta en ambos lados con adhesivo, estando la película
interpuesta entre la carcasa superior y la carcasa inferior.
15. Cartucho según la reivindicación 1
adaptado para su uso con un analizador, y preferiblemente en el que
la bomba se acciona por un elemento accionador del analizador.
16. Cartucho según la reivindicación 1, que
comprende además una cantidad predeterminada de reactivo en la
ubicación de análisis para mezclar con la muestra de fluido, y que
comprende preferiblemente una cantidad predeterminada de reactivo
en la cámara de sujeción para mezclar con la muestra de fluido.
17. Cartucho según la reivindicación 1, que
comprende además un pocillo circunferencial alrededor de la boca de
entrada para recibir muestra de fluido derramada.
18. Cartucho según la reivindicación 1, en el
que la cámara de sujeción tiene una razón de superficie interior
con respecto al volumen inferior a la de la cámara de
desbordamiento.
19. Cartucho según la reivindicación 1, en el
que el cierre de boca de entrada crea un sello estanco cuando se
cierra.
20. Cartucho según la reivindicación 1, que
comprende además al menos un sensor, preferiblemente ubicado en la
ubicación de análisis.
21. Cartucho según la reivindicación 1, que
comprende:
un cierre de boca de entrada estanco,
uno o más depósitos de reactivos en la ubicación
de análisis que comprenden al menos un sustrato que puede
reaccionar con una enzima en la muestra de fluido, formando la
reacción de la enzima un producto de reacción detectable;
un primer sensor para detectar la ubicación de
la muestra de fluido; y
un segundo sensor para detectar el producto de
reacción detectable.
22. Cartucho según la reivindicación 21, que
además incluye una zona hidrófoba que comprende una parte de la
ubicación de análisis.
23. Cartucho según la reivindicación 21, en el
que el producto de reacción se detecta mediante un sensor óptico en
el que el producto de reacción es una especie electroquímica
detectada por un sensor electroquímico.
24. Cartucho según la reivindicación 21, en el
que la enzima se selecciona del grupo que consiste en factor VII,
factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, factor XII, trombina,
glucosa oxidasa, lactato oxidasa, y otras oxidoreductasas, enzimas
basadas en deshidrogenasa, fosfatasa alcalina y otras fosfatasas, y
serina proteasas, preferiblemente trombina.
25. Cartucho según la reivindicación 21, en el
que el reactivo incluye una especie electroquímica distinta del
sustrato y su producto de reacción, y preferiblemente en el que la
especie electroquímica puede detectarse a un potencial eléctrico
diferente del sustrato y el producto.
26. Cartucho según la reivindicación 21, en el
que el reactivo comprende una matriz que estimula la rápida
disolución en la muestra de fluido, y preferiblemente, en el que el
reactivo comprende uno o más componentes seleccionados del grupo
que consiste en un polímero soluble en agua, gelatina, agarosa, un
polisacárido, polietilenglicol, poliglicina, un sacárido, sacarosa,
un aminoácido, glicina, una sal tampón, fosfato de sodio, tampón
HEPES, y una molécula colorante.
27. Cartucho según la reivindicación 21, que
además comprende un reactivo que estimula la coagulación de la
sangre o un derivado de sangre, y preferiblemente en el que el
reactivo se selecciona del grupo que consiste en celite, caolín,
tierra de diatomeas, arcilla, dióxido de silicio, ácido elágico,
tromboplastina natural, tromboplastina recombinante, fosfolípido y
mezclas de los mismos.
28. Cartucho según la reivindicación 21, en el
que el primer sensor es un sensor conductimétrico y el segundo
sensor es un sensor amperométrico, y preferiblemente en el que el
sensor amperométrico y/o el sensor conductimétrico se
microfabrican.
29. Cartucho según la reivindicación 2, en el
que el analizador aplica un potencial a un sensor amperométrico con
la generación de una señal electroquímica, siendo dicha señal
proporcional a la concentración del sustrato en la muestra de
fluido.
30. Cartucho según la reivindicación 28, en el
que la hidrólisis del sustrato por la trombina forma un producto
que reacciona en el sensor amperométrico con la generación de una
señal que puede distinguirse de una señal generada por el
sustrato.
31. Cartucho según la reivindicación 28, en el
que dicho sensor amperométrico tiene un potencial aplicado de
aproximadamente +0,4 V frente a un electrodo de
plata-cloruro de plata, y preferiblemente en el que
dicho sensor amperométrico tiene un potencial aplicado de
aproximadamente +0,1 V frente a un electrodo de
plata-cloruro de plata.
32. Cartucho según la reivindicación 28, en el
que dicho sensor conductimétrico está proximal al tope capilar y
dicho sensor amperométrico está distal desde el tope capilar.
33. Cartucho según la reivindicación 21, en el
que dicho primer o dicho segundo sensor están compuestos por un
metal seleccionado del grupo que consiste en oro, platino, plata, e
iridio, y preferiblemente en el que dicho primer o dicho segundo
sensor está recubierto con una película de tiol
auto-ensamblada, y más preferiblemente en el que un
sensor está recubierto con un reactivo de mercaptoalcanol
seleccionado del grupo que consiste en mercaptoetanol,
mercaptopropanol, mercaptobutanol, y mezclas de los mismos.
34. Cartucho según la reivindicación 21, en el
que dicho primero o dicho segundo sensor tiene forma de una
antena.
35. Cartucho según la reivindicación 21, en el
que el sustrato se selecciona del grupo que consiste en un resto
tosil-glicil-prolinil-arginil-,
H-D-fenilalanil-pipecolil-,
y
bencil-fenilalanil-valil-arginil-
unido a un resto seleccionado del grupo que consiste en un resto
N-fenil-p-fenilendiamina,
y
N-[p-metoxifenil-]-p-fenilendiamina.
36. Cartucho según la reivindicación 21, en el
que el producto de reacción se selecciona del grupo que consiste en
un resto
N-fenil-p-fenilendiamina
y
N-[p-metoxifenil-]-p-fenilendiamina.
37. Método para someter a ensayo una enzima en
una muestra de sangre o derivado de sangre que comprende las etapas
de:
colocar la muestra de sangre o derivado de
sangre en la boca de entrada de un cartucho según la reivindicación
21,
cerrar la boca de entrada,
activar la bomba, forzando así la muestra desde
la cámara de muestra hacia la cámara de análisis,
hacer oscilar la muestra hacia atrás y hacia
delante en la cámara de análisis, y
determinar la concentración del producto de
reacción usando el segundo sensor.
38. Método según la reivindicación 37, en el
que la bomba hace oscilar la muestra en la cámara de análisis con
el borde posterior de la muestra colocado en la región de un sensor
seleccionado con el fin de disolver el sustrato en esa parte de la
muestra cerca del borde posterior.
39. Método según la reivindicación 37, en el
que la oscilación se realiza a una frecuencia en el intervalo de
0,2 a 10 Hertz durante un periodo en el intervalo de 1 a 100
segundos, preferiblemente en el que la oscilación se realiza a una
frecuencia en el intervalo de aproximadamente 1,5 Hertz durante un
periodo de aproximadamente 20 segundos, y más preferiblemente en el
que la oscilación se realiza a una frecuencia de aproximadamente
0,3 Hertz y el segundo sensor genera una señal en cada
oscilación.
40. Método según la reivindicación 37, en el
que la oscilación se realiza a una frecuencia suficiente para
evitar la deposición de eritrocitos sobre un sensor.
41. Método según la reivindicación 37, que
comprende además la etapa de almacenar una primera señal de sensor
amperométrico tras disolver un reactivo, y preferiblemente que
comprende la etapa de analizar señales de sensor amperométrico
posteriores para determinar la velocidad máxima de cambio en la
señal de sensor, y más preferiblemente que comprende además la
etapa de determinar una fracción fija de la velocidad máxima de
cambio en la señal de sensor, e incluso más preferiblemente que
comprende además la etapa de determinar el parámetro de coagulación
a partir de la primera señal de sensor y la fracción fija.
42. Método para someter a ensayo una enzima en
una muestra de sangre o derivado de sangre, que comprende las
etapas de:
introducir la muestra en el cartucho según la
reivindicación 1 que incluye una ubicación de análisis;
medir una parte de la muestra;
mover la muestra medida hasta la ubicación de
análisis;
mezclar la muestra medida con reactivo en la
ubicación de análisis;
dejar que la enzima reaccione con el
reactivo;
colocar la muestra que ha reaccionado en un
sensor; y
detectar el producto de la reacción enzimática
usando el sensor.
43. Aparato que contiene un cartucho de un
único uso usado en combinación con un analizador para determinar un
parámetro de coagulación de una muestra de sangre o derivado de
sangre, que comprende;
un cartucho que incluye una boca de entrada para
recibir una muestra, un cierre de boca de entrada, una cámara de
sujeción en comunicación en un primer extremo con la boca de
entrada, y un tope capilar en comunicación con la cámara de
sujeción en un segundo extremo, estando el tope capilar también en
comunicación con una cámara de análisis,
estando la cámara de sujeción en comunicación
con una cámara de desbordamiento para recibir y retener muestra en
exceso,
estando la cámara de desbordamiento en
comunicación con una bomba neumática accionada por el
analizador,
accionando el analizador la bomba neumática para
desplazar la muestra en la cámara de sujeción a través del tope
capilar dentro de la cámara de análisis para administrar una parte
medida de la muestra dentro de la cámara de análisis,
conteniendo la cámara de análisis un sustrato
para la enzima trombina que puede disolverse en la muestra medida,
un sensor amperométrico para detectar el producto de la reacción
entre la trombina y el sustrato, y un sensor conductimétrico para
detectar la posición de la muestra en la cámara de análisis,
estando el sensor amperométrico y el sensor
conductimétrico conectados al analizador para proporcionar señales
de salida al analizador,
pudiendo el analizador usar la señal de salida
del sensor conductimétrico para accionar la bomba neumática para
controlar la posición de la muestra en la cámara de análisis,
pudiendo el analizador determinar el parámetro
de coagulación a partir de la señal de salida del sensor
amperométrico, y
conteniendo el cartucho una zona hidrófoba entre
el tope capilar y la cámara de análisis para evitar que se extraiga
la muestra en la cámara de análisis hacia la cámara de sujeción.
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