ES2279646T3 - Anticuerpos de integrina monoclonales humanizados. - Google Patents

Abstract

El uso de un anticuerpo que neutraliza el receptor proteico AlfavBeta3 humano y el receptor proteico AlfavBeta5 humano que comprende una cadena pesada que tiene CDHR3 de: RGVRGSMDY en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad seleccionada entre el grupo constituido por; aterosclerosis, restenosis, cáncer, metástasis cancerosa, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular, osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Paget, hipercalcemia de tumores malignos, lesiones osteolíticas producidas por metástasis ósea, pérdida ósea debida a inmovilización, deficiencia de hormonas sexuales.

Description

Anticuerpos de integrina monoclonales humanizados.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales humanizados (mAb) y a los genes que los codifican. Más específicamente, esta invención se refiere a anticuerpos monoclonales humanos específicamente reactivos con varias integrinas heterodiméricas. Dichos anticuerpos son útiles para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de diversas enfermedades asociadas con angiogénesis (por ejemplo, metástasis cancerosa, artritis reumatoide, aterosclerosis) entre otros trastornos.

Antecedentes de la invención

Las integrinas son una superfamilia de receptores de adhesión celular, que son glicoproteínas transmembrana heterodiméricas expresadas en diversas células, y que están hechas de diversas cadenas alfa y beta. Entre esas integrinas están las que llevan el ligando RGD, en el que una cadena de proteína se denomina \alpha_{v}. Las integrinas o receptores de adhesión de la superficie celular que comparten la cadena \alpha_{v} incluyen el receptor de vitronectina \alpha_{v}\beta_{3}, expresado en varias células incluyendo células endoteliales, del músculo liso, osteoclastos, y tumorales; y también los receptores \alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{v}\beta_{6}, \alpha_{v}\beta_{8} y \alpha_{v}\beta_{1}. Estos receptores se expresan principalmente en células cancerosas, tales como células tumorales y en lesiones metastásicas. Están presentes en algunas lesiones inmunohistológicas, en la placenta y también están implicados trastornos angiogénicos que implican la vasculatura.

Como un ejemplo, se ha postulado que el receptor \alpha_{v}\beta_{3} expresado en la membrana de células osteoclastos media en el proceso de reabsorción del hueso y contribuye al desarrollo de osteoporosis [Ross, y col., J. Biol. Chem., 1993, 268 (13): 9901-7]. Como otro ejemplo, se ha postulado que el receptor \alpha_{v}\beta_{3} expresado en células de músculo liso aórtico humano estimula su migración a la neoíntima, lo que conduce a la formación de aterosclerosis y restenosis después de la angioplastia [Brown, y col., Cardiovascular Res., 1994, 28: 1815]. La conexión entre el antagonismo del receptor de vitronectina y la restenosis después de procedimientos vasculares se mencionó por Choi y col, J. Vasc. Surg., 1994, 19: 125-34. La Publicación de Patente Internacional Nº WO95/25543, publicada el 9 de marzo de 1995, se refiere a un procedimiento para inhibir la angiogénesis administrando un antagonista del receptor de vitronectina.

Adicionalmente, un estudio reciente mencionaba a un antagonista de \alpha_{v}\beta_{3} cómo promotor de la regresión tumoral induciendo apoptosis en vasos sanguíneos angiogénicos [P. C. Brooks, y col., Cell, 1994, 79: 1157-1164]. Análogamente, se mencionó un anticuerpo monoclonal murino LM609 desarrollado para el receptor de vitronectina presentado en la Publicación de Patente Internacional Nº WO89/05155, publicada el 9 de junio de 1995, como útil en la inhibición del crecimiento tumoral. Véase, también, D. A. Cheresh y col, Cell, 1998, 57: 59-69.

Aunque se ha sugerido la inmunoterapia pasiva que emplea anticuerpos monoclonales de una especie heteróloga (por ejemplo, murino) como un mecanismo útil para tratar o prevenir diversas enfermedades o trastornos, una alternativa para reducir el riesgo de una respuesta inmune no deseable por parte del paciente, dirigida contra el anticuerpo extraño es emplear anticuerpos "humanizados". Estos anticuerpos son sustancialmente de origen humano, siendo solamente las Regiones Determinantes Complementarias (CDR) y ciertos restos de marco que influyen la conformación de CDR, de origen no humano. Ejemplos particularmente útiles de este enfoque para el tratamiento de algunos trastornos se describen en la Solicitud PCT PCT/GB91/01554, Nº de Publicación WO 92/04381 y Solicitud PCT PCT/GB93/00725, Nº de Publicación WO 93/20210.

Los nuevos mAb humanos o anticuerpos humanizados son particularmente útiles en solitario o en combinación con moléculas existentes para formar composiciones inmunoterapéuticas. Existe aún una necesidad en la técnica de mAb adicionales para receptores de la superficie celular o anticuerpos humanizados de los mismos que puedan bloquear de forma selectiva la integrina y muestren una larga semivida en suero.

Sumario de la invención

En un aspecto, esta invención se refiere a un nuevo anticuerpo monoclonal humanizado que neutraliza la función biológica de los receptores que llevan la cadena \alpha_{v}. Específicamente, Este anticuerpo es reactivo con diversas de dichas integrinas heterodiméricas y fragmentos funcionales de las mismas que llevan la cadena de subunidad \alpha_{v}. Este anticuerpo humanizado neutraliza específicamente el receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano (receptor de vitronectina) y el \alpha_{v}\beta_{5} humano.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que contiene uno (o más) anticuerpos alterados y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona procedimientos para y componentes útiles en, la producción recombinante de anticuerpos humanizados y alterados (por ejemplo, anticuerpos manipulados, CDR, fragmentos Fab o F(ab)_{2}, o análogos de los mismos) que se obtienen de anticuerpos monoclonales de neutralización (mAb) para los receptores que contienen \alpha_{v} humana. Estos componentes incluyen secuencias de ácidos nucleicos aisladas y secuencias que los codifican, así como plásmidos recombinantes que contienen las secuencias de ácidos nucleicos bajo el control de secuencias reguladoras seleccionadas que son capaces de dirigir la expresión de las mismas en células huésped (preferiblemente de mamífero) transfectadas con los plásmidos recombinantes. El procedimiento de producción implica cultivar una célula huésped transfectada de la presente invención en condiciones tales que el anticuerpo humano o alterado se exprese en dicha célula, y aislar el producto expresado de la misma.

Otra realización más de la invención es una composición farmacéutica que comprende al menos una dosis de una cantidad inmunoterapéuticamente eficaz de los anticuerpos de esta invención junto con al menos un anticuerpo monoclonal o alterado adicional. Una composición particularmente deseable comprende como anticuerpo adicional, un anticuerpo anti-receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano, que se distingue del anticuerpo sujeto en virtud de ser reactivo con un epítope diferente del receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano heterodimérico. Uno de dichos ejemplos es el anticuerpo D12 descrito en la Solicitud de Patente Internacional Nº WO98/40488, publicada el 17 de septiembre de 1998.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen adicionalmente en la descripción detallada y las realizaciones preferidas de la misma.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1A ilustra las secuencias ADN y de aminoácidos de región variable de cadena pesada del mAb B9 murino [SEC ID Nº 1, 2 y 38], en la que las CDR se representan en negrita y subrayadas.

La Fig. 1B es la secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos de consenso del subgrupo I de VH humano [SEC ID Nº 3], en la que las CDR se representan en negrita y subrayadas.

La Fig. 1C ilustra las secuencias ADN y de aminoácidos de región variable de cadena pesada sintéticas de la cadena pesada humanizada de consenso de B9HZHC 1-0, [SEC ID Nº 4 y 5], en las que las CDR se representan en negrita y subrayadas. Los asteriscos por encima de los aminoácidos indican restos marco murino preferidos conservados en la cadena pesada sintética.

La Fig. 2A ilustra las secuencias ADN y de aminoácidos de cadena ligera del mAb B9 murino [SEC ID Nº 6 y 7], en las que las CDR se representan en negrita y subrayadas.

La Fig. 2B es la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de consenso del subgrupo I de V kappa humano de [SEC ID Nº 8], en la que las CDR se representan en negrita y subrayadas.

La Fig. 2C es las secuencias ADN y de aminoácidos de región variable de cadena ligera sintéticas del B9HZLC 1-0 de cadena ligera humanizado, sintético de consenso, [SEC ID Nº 9 y 10], en la que las CDR se representan en negrita y subrayadas. Los asteriscos indican restos marco murino preferidos y se ilustran por encima del resto de aminoácido.

La Fig. 3 ilustra las secuencias de ADN y aminoácidos que representan el intermedio de la región variable de cadena pesada de B9 sintética [SEC ID Nº: 11 y 12]. Los sitios de restricción de la enzima endonucleasa están subrayados.

La Fig. 4 ilustra las secuencias de ADN y aminoácidos que representan el intermedio de la región variable de cadena ligera de B9 sintética [SEC ID Nº: 13 y 14]. Los sitios de restricción de la enzima endonucleasa están subrayados.

La Fig. 5 es la secuencia de aminoácidos de la región marco de REI kappa V humano modificado con las CDR subrayadas y en negrita. El último QQ de la secuencia representa los dos primeros aminoácidos de la tercera CDR [SEC ID Nº 15].

La Fig. 6 ilustra las secuencias de ADN y aminoácidos [SEC ID Nº 28 y 29] que representan una secuencia que codifica la cadena ligera de B9 humanizado AB9HZLCREIº. Las CDR se muestran en negrita.

La Fig. 7 ilustra las secuencias de ADN y aminoácidos [SEC ID Nº 30 y 31] de la secuencia que codifica la cadena ligera de B9 humanizado, AB9HZLC1-1\equiv.

La Fig. 8 es un gráfico que muestra los resultados del modelo de xenoinjerto tumoral murino con el ensayo HT29 del Ejemplo 14, con las células inyectadas por vía intraperitoneal.

La Fig. 9 es un gráfico que muestra los resultados del modelo de xenoinjerto tumoral murino con el ensayo HT29 del Ejemplo 14, con las células inyectadas por vía subcutánea.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos útiles incluyendo anticuerpos monoclonales, recombinantes y sintéticos (y fragmentos de los mismos) que neutralizan el receptor de vitronectina \alpha_{v}\beta_{3} humano y los receptores \alpha_{v}\beta_{5} humanos, así como la unión a otras integrinas que llevan la subunidad \alpha_{v}; ácidos nucleicos aislados que las codifican y diversos medios para su producción recombinante así como usos terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico de dichos anticuerpos y fragmentos de los mismos.

Los anticuerpos de esta invención inhiben la unión de vitronectina y otros ligandos al receptor de vitronectina (\alpha_{v}\beta_{3}). Los anticuerpos de esta invención inhiben la unión de ligandos al receptor \alpha_{v}\beta_{5}. Estos anticuerpos también pueden inhibir la unión de ligandos a los receptores \alpha_{v}\beta_{1} y \alpha_{v}\beta_{6} y \alpha_{v}\beta_{8}. Estos anticuerpos pueden bloquear de forma selectiva las integrinas \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} y muestran una semivida en suero de aproximadamente 60 horas in vivo en modelos animales. Específicamente, los anticuerpos incluyendo el B9 monoclonal murino y el anticuerpo humanizado HuB9, que neutralizan de forma específica \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}, son deseables para su uso como reactivos terapéuticos agudos y subagudos para el tratamiento de los trastornos mediados por estos receptores. La inhibición de estos receptores por los anticuerpos de esta invención permite el tratamiento terapéutico o la profilaxis de dichas enfermedades.

I. Definiciones

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, los siguientes términos se definen de la siguiente manera:

La frase "trastornos mediados por receptores heterodiméricos que contienen \alpha_{v}" incluye, aunque sin limitación, trastornos cardiovasculares o trastornos relacionados con angiogénesis, tales como cánceres, por ejemplo, tumores sólidos y metástasis, angiogénesis asociada con retinopatía diabética, aterosclerosis y restenosis, trastornos inflamatorios crónicos, degeneración macular, y enfermedades en las que la reabsorción del hueso está asociada con patología tal como osteoporosis. Los anticuerpos de esta invención son principalmente útiles también como agentes anti-metastásicos y antitumorales.

"Anticuerpo alterado" se refiere a una proteína codificada por una región codificante de inmunoglobulina alterada de su forma natural, que puede obtenerse mediante expresión en una célula huésped seleccionada. Dichos anticuerpos alterados son anticuerpos manipulados (por ejemplo, anticuerpos humanos quiméricos, humanizados o conformados de nuevo o modificados inmunológicamente) o fragmentos de los mismos que carecen de toda o parte de una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, Fv, Fab, o F(ab')_{2} y similares.

"Región codificante de inmunoglobulina alterada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo alterado de la invención o un fragmento del mismo.

"Anticuerpo humano conformado de nuevo" se refiere a un anticuerpo alterado en el que como mínimo al menos una CDR de un segundo anticuerpo aceptor humano se sustituye por al menos una CDR de un primer anticuerpo donador monoclonal humano. Preferiblemente se sustituyen las seis CDR. Más preferiblemente, una región de combinación de antígenos completa, por ejemplo, un Fv, Fab, o F(ab')_{2}, de un segundo anticuerpo monoclonal aceptor humano se sustituye por la región correspondiente en un primer anticuerpo monoclonal donador humano. Más preferiblemente la región Fab de un primer donador humano se une de forma operativa a las regiones constantes apropiadas de un segundo anticuerpo aceptor humano para formar un anticuerpo monoclonal de longitud completa.

"Primer compañero de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una región marco o variable de inmunoglobulina humana en la que las regiones que codifican CDR nativas (o de origen natural) se sustituyen por las regiones que codifican CDR de un anticuerpo humano donador. La región variable humana puede ser una cadena pesada de inmunoglobulina, una cadena ligera (o las dos cadenas), un análogo o fragmento funcional de las mismas. Dichas regiones que codifican CDR, situadas en la región variable de anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden determinarse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo Kabat y col. Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 4ª Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) describe normas para situar CDR. Además, se conocen programas informáticos que son útiles para identificar regiones/estructuras de CDR.

"Segundo compañero de fusión" se refiere a otra secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o péptido a la que el primer compañero de inmunoglobulina se fusiona en marco o por medio de una secuencia engarce convencional (es decir, se une de forma operativa). Preferiblemente el compañero de fusión es un gen de inmunoglobulina y cuando es así, se denomina un "segundo compañero de inmunoglobulina". El segundo compañero de inmunoglobulina puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante completa del mismo (es decir, homólogo - el primer y segundo anticuerpo alterados se obtienen de la misma fuente) o un anticuerpo adicional (es decir, heterólogo) de interés. Puede ser una cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, o las dos cadenas como parte de un único polipéptido. El segundo compañero de inmunoglobulina no se limita a una clase o isotipo de inmunoglobulina particular. Además, el segundo compañero de inmunoglobulina puede comprender parte de una región constante de inmunoglobulina, tal como se encuentra en una Fab, o F(ab)_{2} (es decir, una parte discreta de una región constante o región marco humana). Un segundo compañero de fusión también puede comprender una secuencia que codifica una proteína integral de membrana expuesta en la superficie externa de una célula huésped, por ejemplo como parte de una biblioteca de exposición de fagos, o una secuencia que codifica una proteína para detección analítica o de diagnóstico, por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, \beta-galactosidasa, etc.

Los términos Fv, Fc, Fd, Fab o F(ab')_{2} se usan con sus significados convencionales [véase por ejemplo, Harlow y col, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)].

Como se usa en este documento, un "anticuerpo manipulado" describe un tipo de anticuerpo alterado, es decir un anticuerpo sintético de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo quimérico, humanizado, conformado de nuevo o modificado inmunológicamente en oposición a un fragmento de anticuerpo) en el que una porción de los dominios variables de cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo aceptor seleccionado, se sustituyen por partes análogas de uno o más anticuerpos donadores que tienen especificidad por el epítope seleccionado. Por ejemplo, dichas moléculas pueden incluir anticuerpos caracterizados por una cadena pesada humanizada asociada con una cadena ligera no modificada (o cadena ligera quimérica), o viceversa. Los anticuerpos manipulados también pueden caracterizarse por la alteración de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las regiones marco del dominio variable ligero y/o pesado del anticuerpo aceptor para conservar la especificidad de unión del anticuerpo donador. Estos anticuerpos pueden comprender la sustitución de una o más CDR (preferiblemente todas) del anticuerpo aceptor con CDR de un anticuerpo donador descrito en este documento.

Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un tipo de anticuerpo manipulado que contiene una región variable de origen natural (cadena ligera y cadena pesada) obtenida de un anticuerpo donador junto con regiones constantes de cadena ligera y pesada obtenidas de un anticuerpo aceptor de una especie heteróloga.

Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo manipulado que tiene sus CDR obtenidas de una inmunoglobulina donadora no humana, obteniéndose las restantes partes obtenidas de inmunoglobulina de una (o más) inmunoglobulina(s) humana(s). Además, los restos de soporte en marco pueden alterarse para preservar la afinidad de unión [véase, por ejemplo, Queen y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10032 y Hodgson y col., 1991, Biol Technology, 9: 421].

Un "anticuerpo inmunológicamente modificado" se refiere a un tipo de anticuerpo manipulado en el que se realizan cambios en secuencias donadoras y/o aceptoras para modificar regiones que implican artefactos de clonación, potenciaciones de líneas microbianas, etc. con el objetivo de reducir la posibilidad de una respuesta inmune al anticuerpo por parte del paciente tratado con el anticuerpo modificado.

La expresión "anticuerpo donador" se refiere a un anticuerpo (monoclonal o recombinante) que aporta las secuencias de ácidos nucleicos de sus regiones variables, CDR, u otros fragmentos funcionales o análogos de los mismos a un primer compañero de inmunoglobulina, para proporcionar la región codificante de inmunoglobulina alterada y dar como resultado el anticuerpo alterado expresado con la especificidad antigénica y actividad neutralizadora característica del anticuerpo donador. Un anticuerpo donador adecuado para uso en esta invención es una anticuerpo anti-\alpha_{v}\beta_{3} y anti-\alpha_{v}\beta_{5} monoclonal murino de neutralización, denominado B9. Se define que B9 tiene las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable y cadena ligera variable que se muestran en las Fig. 1A y 2A, respectivamente [SEC ID Nº 2 y 7].

La expresión "anticuerpo aceptor" se refiere a un anticuerpo (monoclonal o recombinante) de una fuente no relacionada genéticamente con el anticuerpo donador, que aporta todas (o cualquier porción, pero preferiblemente todas) las secuencias de ácidos nucleicos que codifican sus regiones marco de cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes de cadena pesada y/o ligera al primer compañero de inmunoglobulina. Preferiblemente un anticuerpo humano es el anticuerpo aceptor.

Regiones "VH de consenso" o "VL de consenso" se refieren a secuencias de aminoácidos que pueden funcionar de manera similar a las regiones marco del anticuerpo aceptor, pero se seleccionan mediante técnicas informáticas convencionales. En resumen, provista de una secuencia de aminoácidos VH o VL dada, las secuencias VH y VL humanas más próximas a la secuencia dada se reúnen para identificar el subgrupo de anticuerpos más próximo. Una vez que se ha seleccionado el subgrupo, se comparan todos los anticuerpos humanos de ese subgrupo y se prepara una secuencia consenso de las cadenas VH y VL. Las secuencias consenso se usan para generar una región marco sintética deseable para el anticuerpo humanizado.

"CDR" son las secuencias de aminoácidos de región determinante complementaria de un anticuerpo. Las CDR son las regiones hipervariables de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina. Véase por ejemplo, Kabat y col, Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 4ª Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Hay tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera (o regiones CDR) en las porciones variables de una inmunoglobulina. Por tanto "CDR" como se usa en este documento se refiere a las tres CDR de cadena pesada, o las tres CDR de cadena ligera (o a todas las CDR de cadena pesada y ligera, si fuera apropiado). Las CDR proporcionan la mayoría de restos de contacto para la unión del anticuerpo al antígeno o epítope. Las CDR de interés de esta invención se obtienen de secuencias de cadena pesada y ligera variables del anticuerpo donador, e incluyen análogos de las CDR de origen natural, cuyos análogos también comparten o conservan la misma especificidad de unión y/o capacidad de neutralización del antígeno que el anticuerpo donador del que se obtuvieron.

Por "compartir la especificidad de unión y/o capacidad de neutralización del antígeno" se entiende, por ejemplo, que aunque mAb B9 puede caracterizarse por cierto nivel de afinidad por el antígeno, una CDR codificada por una secuencia de ácido nucleico de mAb B9 en un entorno estructural apropiado puede tener una afinidad menor o mayor. Se espera que las CDR de mAb B9 en dichos entornos reconozcan no obstante el(los) mismo(s) epítope(s) que el mAb B9 intacto.

Un "fragmento funcional" es una secuencia variable de cadena pesada o ligera parcial (por ejemplo, deleciones menores en los extremos amino o carboxilo de la región variable de la inmunoglobulina) que conserva la misma especificidad de unión y/o capacidad de neutralización del antígeno que el anticuerpo del que se obtuvo el fragmento.

Un "análogo" es una secuencia de aminoácidos modificada en al menos un aminoácido, en la que dicha modificación puede ser una modificación química o sustitución en un aminoácido o una sustitución o una redisposición de unos pocos aminoácidos (es decir, no más de 10), cuya modificación permite que la secuencia de aminoácidos conserve las características biológicas, por ejemplo, especificidad y alta afinidad por el antígeno, de la secuencia no modificada. Por ejemplo, pueden construirse diferentes variantes humanizadas usando las secuencias descritas en este
documento.

También pueden surgir análogos en forma de variaciones alélicas. Una "variación o modificación alélica" es una alteración en la secuencia de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos o péptidos de la invención. Dichas variaciones o modificaciones pueden deberse a la degeneración del código genético o pueden manipularse de forma deliberada para proporcionar características deseadas. Estas variaciones o modificaciones pueden o no dar como resultado alteraciones en cualquier secuencia de aminoácidos codificada. Por ejemplo, pueden construirse mutaciones silenciosas, mediante sustituciones, cuando se crean ciertos sitios de restricción de endonucleasa en o alrededor de regiones que codifican CDR.

La expresión "agentes efectores" se refiere a moléculas vehículo no proteicas a las que pueden asociarse los anticuerpos alterados, y/o cadenas ligeras o pesadas naturales o sintéticas del anticuerpo donador u otros fragmentos del anticuerpo donador mediante procedimientos convencionales. Dichos vehículos no proteicos pueden incluir vehículos convencionales usados en el campo del diagnóstico, por ejemplo, poliestireno u otras perlas plásticas, polisacáridos, por ejemplo, como los usados en el sistema BIAcore (Pharmacia), u otras sustancias no proteicas útiles en el campo médico, y seguras para la administración a seres humanos y animales. Otros agentes efectores pueden incluir un macrociclo, para quelar un átomo de metal pesado, o radioisótopos. Dichos agentes efectores también pueden ser útiles para aumentar la semivida de los anticuerpos alterados, por ejemplo polietilenglicol.

II. Anticuerpos Monoclonales murino que se unen a heterodímeros que contiene \alpha_{v}

Para uso en la construcción de los anticuerpos humanizados, fragmentos y proteínas de fusión de esta invención, puede usarse una especie no humana para generar la inmunoglobulina deseable después de la presentación con un receptor heterodimérico que contiene \alpha_{v} humano como antígeno. Se emplean técnicas de hibridoma convencionales para proporcionar una línea celular de hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal no humano (mAb) a los receptores que contienen \alpha_{v}. Como ejemplo, la producción de mAb B9 murino se describe en detalle en el Ejemplo 2 a continuación. Para facilitar la descripción a continuación, el término B9 puede referirse al mAb B9 o a cualquiera de los otros mAb del Ejemplo 2.

B9 es un anticuerpo donador deseable para uso en el desarrollo de un anticuerpo quimérico o humanizado de esta invención. Las características del mAb B9 murino de neutralización obtenido como se describe en el Ejemplo 2 incluyen una especificidad de unión al antígeno para \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} humanos, y posiblemente a otros receptores heterodiméricos que contienen \alpha_{v}, y las características que se muestran en la Tabla 1 a continuación. El isotipo del mAb B9 del Ejemplo 2 es IgG_{1}, y tiene una afinidad de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,3 nM contra los receptores \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}, dependiendo del ensayo empleado. El anticuerpo reconoce la subunidad \alpha_{v} de los receptores \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} heterodiméricos y no reconoce ninguna subunidad \beta de forma individual. La unión se ilustra mediante unión y actividad funcional (neutralización) en los ensayos in vitro de los Ejemplos 3-10 a continuación.

Dadas las secuencias proporcionadas, es decir, la región variable de cadena ligera de B9 [SEC ID Nº 6] y la región variable de cadena pesada de B9 [SEC ID Nº 1], un especialista en la técnica podría obtener las restantes porciones de la cadena pesada usando, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, y de este modo obtener una molécula de mAb completa. Como alternativa, podría construirse una molécula de B9 usando técnicas análogas a las descritas a continuación para los mAb sintéticos y recombinantes de la invención y empleando otras cadenas pesadas de subtipo de IgG murino.

Pueden desarrollarse otros anticuerpos de subunidad anti-\alpha_{v} seleccionando hibridomas o bibliotecas combinatorias, o anticuerpos de presentación de fago [W. D. Huse y col., 1988, Science, 246: 1275-1281] usando el mAb murino descrito en este documento y su epítope \alpha_{v}. Puede seleccionarse una colección de anticuerpos, incluyendo productos de hibridoma o anticuerpos obtenidos del repertorio de inmunoglobulina de cualquier especie, en un ensayo de competencia convencional, tal como el descrito en los Ejemplos 5, 8 y 9 a continuación, con uno o más epítopes descritos en este documento. De este modo, la invención hace disponible un anticuerpo, diferente de B9, que es capaz de unirse a y neutralizar los receptores que contienen \alpha_{v}. Otros mAb generados contra un \alpha_{v} deseado o un epítope de la cadena \beta adecuado y producidos mediante técnicas convencionales, incluyen sin limitación, genes que codifican mAb murino, mAb humanos, y anticuerpos combinatorios.

Donde en la siguiente descripción el anticuerpo donador se identifica como B9, esta denominación se hace solamente para ilustración y simplicidad de la descripción.

III. Clonación Combinatoria para Obtener Anticuerpos Humanos

Como se ha mencionado anteriormente, varios problemas han dificultado la aplicación directa de la tecnología de hibridoma de G. Kohler y C. Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497 para la generación y aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos. Entre estos hay una carencia de compañeros de fusión de líneas celulares de mieloma adecuadas usados para formar líneas celulares de hibridoma así como la mala estabilidad de dichos hibridomas incluso cuando están formados. Por lo tanto, se prefiere el enfoque de biología molecular de clonación combinatoria.

La clonación combinatoria se describe en general en la publicación de PCT WO90/14430. Expuesto de forma simple, el objetivo de la clonación combinatoria es transferir a una población de células bacterianas la capacidad genética inmunológica de una célula, tejido u órgano humano. Se prefiere emplear células, tejidos u órganos que sean inmunocompetentes. Las fuentes particularmente útiles incluyen, aunque sin limitación, bazo, timo, ganglios linfáticos, médula ósea, amígdalas, y linfocitos de la sangre periférica. Las células pueden estimularse opcionalmente con el receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano in vitro, o seleccionarse de donantes que se sepa que han producido una respuesta inmune o donantes que son VIH^{+} pero asintomáticos.

La información genética (es decir, los anticuerpos humanos producidos en los tejidos en respuesta a la estimulación mediante el antígeno integrina heterodimérica que contiene \alpha_{v}) aislada a partir de las células donantes puede estar en forma de ADN o ARN y se amplifica convenientemente mediante PCR o técnicas similares. Cuando se aísla en forma de ARN, la información genética se convierte preferiblemente en ADNc mediante la trascripción inversa antes de la amplificación. La amplificación puede ser generalizada o puede hacerse a la medida más específicamente, por ejemplo, mediante una selección cuidadosa de secuencias cebadoras de PCR, puede conseguirse una amplificación selectiva de genes de inmunoglobulina o subconjuntos dentro de esta clase de genes.

Una vez que se obtienen las secuencias del componente génico, en este caso los genes que codifican las regiones variables de las diversas cadenas de anticuerpo pesadas y ligeras, los genes de la cadena pesada y ligera se asocian en combinaciones aleatorias para formar una biblioteca combinatoria aleatoria. Se han descrito diversos sistemas de vectores de ADN recombinante para facilitar la clonación combinatoria. [Véase por ejemplo publicación de PCT Nº WO90/14430 supra, Scott y Smith, 1990, Science, 249: 386-406 o la Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409]. Una vez que se ha generado la biblioteca combinatoria los productos pueden, después de la expresión seleccionarse convenientemente mediante bioselección con el receptor que contiene \alpha_{v} humano seleccionado o, si fuera necesario, mediante bioselección bloqueada por epítopes como se describe con más detalle a continuación.

Inicialmente se prefiere en general usar fragmentos Fab de mAb, tales como B9, para la clonación combinatoria y la exploración y después convertir los Fab a mAb de longitud completa después de la selección de las moléculas candidato deseadas. Sin embargo, también pueden usarse anticuerpos de cadena sencilla para la clonación y exploración.

IV. Fragmentos de anticuerpo

La presente invención contempla el uso de fragmentos Fab o fragmentos F(ab')_{2} de mAb de longitud completa obtenidos, dirigidos contra el receptor \alpha_{v}\beta_{3} o \alpha_{v}\beta_{5} de integrina humana. Aunque estos fragmentos pueden ser independientemente útiles como agentes protectores y terapéuticos in vivo contra afecciones mediadas por los receptores que contienen \alpha_{v} humanos o in vitro como parte de un diagnóstico para una enfermedad mediada por el receptor que contiene \alpha_{v} humano, se emplea en este documento como un componente para un anticuerpo humano conformado de nuevo. Un fragmento Fab contiene toda la cadena ligera y la porción amino terminal de la cadena pesada; y un fragmento F(ab')_{2} es el fragmento formado por dos fragmentos Fab unidos por puentes disulfuro adicionales. Los anticuerpos monoclonales de unión al receptor que contiene \alpha_{v} humano de la presente invención proporcionan fuentes de fragmentos Fab y fragmentos F(ab')_{2}, estos últimos fragmentos pueden obtenerse a partir de una biblioteca de fagos combinatoria [véase, por ejemplo, Winter y col., 1994, Ann. Rev. Immunol, 12:433-455 o Barbas y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10164-10168 que se incorporan por la presente como referencia en su totalidad]. Estos fragmentos Fab y F(ab')_{2} son útiles por sí mismos como agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico, y como donadores de secuencias incluyendo las regiones variables y secuencias de CDR útiles en la formación de anticuerpos recombinantes o humanizados como se describen en este documento.

V. Secuencias de Aminoácidos y Nucleótidos Anti-anticuerpos humanos de Interés

El mAb B9 u otros anticuerpos descritos en este documento pueden aportar secuencias, tales como secuencias peptídicas de cadena pesada y/o ligera variable, secuencias marco, secuencias CDR, fragmentos funcionales, y análogos de los mismos, y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican, útiles para diseñar y obtener diversos anticuerpos alterados que se caracterizan por la especificidad de un antígeno del anticuerpo donador.

Como ejemplo, la presente invención proporciona por tanto secuencias de cadena ligera variable y de cadena pesada variable del mAb B9 anti-humano y secuencias obtenidas de las mismas. El ADN y las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de mAb B9 se presentan ilustradas mediante la Figura 1A [SEC ID Nº 1 y 2]. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de mAb B9 se presentan en la Figura 2A [SEC ID Nº 6 y 7].

Las secuencias de ácidos nucleicos de esta invención, o fragmentos de las mismas, que codifican las secuencias peptídicas de cadena ligera y cadena pesada variables también son útiles para la introducción mutagénica de cambios específicos dentro de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las CDR o regiones marco, y para la incorporación de la secuencia de ácido nucleico modificada o de fusión resultante en un plásmido para la expresión. Por ejemplo, pueden usarse sustituciones silenciosas en la secuencia de nucleótidos de las regiones que codifican el marco y la CDR para crear sitios de restricción enzimática que podrían facilitar la inserción de regiones CDR (y/o marco) mutagenizadas. Estas regiones que codifican CDR pueden usarse en la construcción de anticuerpos humanos conformados de nuevo de esta invención.

Teniendo en cuenta la degeneración del código genético, pueden construirse diversas secuencias codificantes que codifiquen las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera variables, y secuencias CDR de la invención así como fragmentos funcionales y análogos de los mismos que compartan la especificidad por el antígeno del anticuerpo donador. Las secuencias de ácidos nucleicos aisladas de esta invención, o fragmentos de las mismas, que codifican las secuencias peptídicas de cadena variable o CDR pueden usarse para producir anticuerpos alterados, por ejemplo, anticuerpos quiméricos o humanizados, u otros anticuerpos manipulados de esta invención cuando se combinan de forma operativa con un segundo compañero de inmunoglobulina.

Debe observarse que además de las secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican porciones del anticuerpo y anticuerpos alterados descritos en este documento, la presente invención también abarca otras de dichas secuencias de ácidos nucleicos, tales como las complementarias para las secuencias que codifican CDR nativas o complementarias a las regiones marco humanas modificadas que rodean a las regiones que codifican CDR. Dichas secuencias incluyen todas las secuencias de ácidos nucleicos que en virtud de la redundancia del código genético, son capaces de codificar las mismas secuencias de aminoácidos que se proporcionan en las Figuras 1A y 2A. Una secuencia variable de cadena ligera humanizada ejemplar se ilustra en la Figura 2C [SEC ID Nº 9]. Una secuencia variable de cadena pesada humanizada ejemplar se ilustra en la Figura 1C [SEC ID Nº 4]. Estas cadenas pesadas y las regiones variables de cadenas ligeras tienen tres secuencias CDR descritas con detalle en las secuencias murino de las Figuras 1A y 2A. Otras secuencias de ADN útiles que abarca está invención incluyen las secuencias que hibridan en condiciones rigurosas de hibridación (véase por ejemplo, T. Maniatis y col., 1982, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, páginas 387 a 389] con las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada de las Fig. 1A y 2A (incluyendo también Fig. 1C y 2C para las secuencias humanas sintéticas) y que conservan las propiedades de unión al antígeno de esos anticuerpos. Un ejemplo de una de dichas condiciones de hibridación rigurosa es la hibridación a 4x SSC a 65ºC seguida de un lavado en 0,1x SSC a 65ºC durante una hora. Como alternativa una condición de hibridación rigurosa ejemplar es en formamida al 50%, 4x SSC a 42ºC. Preferiblemente, estas secuencias de ADN de hibridación son al menos de aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, es decir, aproximadamente el tamaño de una CDR. Otras secuencias de ADN útiles son por encima del 60%, preferiblemente por encima del 70% y más preferiblemente por encima del 80% o el 90% homólogas a la secuencia o fragmentos de la secuencia de mAb B9.

Donde en esta memoria descriptiva, se definen secuencias de proteínas y/o ADN mediante sus porcentajes de homología o identidad con secuencias identificadas, los algoritmos usados para calcular los porcentajes de identidad o porcentajes de similitud incluyen los siguientes: algoritmo de Smith-Waterman [J. F. Collins y col., 1988, Comput. Appl. Biosci., 4: 67-72; J. F. Collins y col., Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M.J. Bishop y col., eds.). en Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, England, UK (1987) pág. 417], por ejemplo, MPSEARCH y los programas BLAST y FASTA [E. Gr. Shpaer y col., 1996, Genomics, 38: 179-191], incluyendo el programa BLAST2 [S. D. Altschul y col., J. Mol. Biol., 215: 403-407 (1990)].

VI. Regiones que Codifican Inmunoglobulina Alterada y Anticuerpos Alterados

Las regiones que codifican inmunoglobulina alterada codifican anticuerpos alterados que incluyen anticuerpos manipulados tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos humanizados, conformados de nuevo, y modificados inmunológicamente. Una región que codifica inmunoglobulina alterada deseada contiene regiones que codifican CDR en forma de regiones Fab que codifican péptidos que tienen la especificidad por el antígeno del anticuerpo B9 anti-humano, preferiblemente un anticuerpo de alta afinidad tal como los proporcionados por la presente invención, insertado en un compañero de inmunoglobulina aceptor.

Cuando el aceptor es un compañero de inmunoglobulina, como se ha definido anteriormente, incluye una secuencia que codifica una segunda región del anticuerpo de interés, por ejemplo una región Fc. Los compañeros de inmunoglobulina también pueden incluir secuencias que codifican otra inmunoglobulina a la cual la región constante de cadena ligera o pesada se fusiona en marco o por medio de una secuencia engarce. Los anticuerpos manipulados dirigidos contra fragmentos funcionales o análogos de la integrina que contiene la subunidad \alpha_{v} humana seleccionada, pueden diseñarse para provocar una unión potenciada con el mismo anticuerpo.

El compañero de inmunoglobulina también puede asociarse con agentes efectores como se ha definido anteriormente, incluyendo moléculas vehículo no proteicas, a las cuales el compañero de inmunoglobulina puede unirse de forma operativa mediante medios convencionales.

La fusión o engarce entre los compañeros de inmunoglobulina, por ejemplo, secuencias de anticuerpos y el agente efector puede ser mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante enlace covalentes o iónicos convencionales, fusiones de proteínas, o reticuladores hetero-bifuncionales, por ejemplo, carbodiimida, glutaraldehído, y similares. Dichas técnicas se conocen en la técnica y se describen fácilmente en textos convencionales de química y
bioquímica.

Adicionalmente, también pueden construirse secuencias engarces convencionales que proporcionan simplemente una cantidad deseada de espacio entre el segundo compañero de inmunoglobulina y el agente efector, en la región codificante de inmunoglobulina alterada. El diseño de dichos engarces se conoce bien por los especialistas en la técnica.

Además, pueden modificarse secuencias señal para las moléculas de la invención para potenciar la expresión. Por ejemplo, el anticuerpo humano conformado de nuevo que tiene las secuencias señal y CDR obtenidas de la secuencia de cadena pesada del mAb B9, puede tener el péptido señal original sustituido con otra secuencia señal, tal como la secuencia líder Campath [Page, M. J. y col., 1991, BioTechnology, 9: 64-68].

Un anticuerpo alterado ejemplar, un anticuerpo humano conformado de nuevo, contiene una secuencia de péptidos o proteína de cadena pesada variable y toda la de cadena ligera que tiene la especificidad por el antígeno de mAb B9 fusionada a las regiones pesadas constantes C_{H1}-C_{H3} obtenidas de un segundo anticuerpo humano.

En otra realización más, el anticuerpo manipulado de la invención puede tener unido un agente adicional. Por ejemplo, el procedimiento de tecnología de ADN recombinante puede usarse para producir un anticuerpo manipulado de la invención en el que el fragmento Fc o dominio C_{H2}-C_{H3} de una molécula de anticuerpo completa se ha sustituido por una enzima u otra molécula detectable (es decir, un efector polipeptídico o molécula informadora).

Otra proteína deseable de esta invención puede comprender una molécula de anticuerpo completa, que tiene cadenas pesada y ligera de longitud completa, o un fragmento discreto de la misma, tal como los fragmentos Fab o F(ab')_{2}, un dímero de cadena pesada, o cualquier fragmento recombinante mínimo de los mismos tal como un F_{v} o un anticuerpo de cadena sencilla (SCA) o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el mAb B9 donador seleccionado. Dicha proteína puede usarse en forma de un anticuerpo alterado, o puede usarse en su forma no fusionada.

Allí donde el compañero de inmunoglobulina se obtiene de un anticuerpo diferente del anticuerpo donador, por ejemplo, cualquier isotipo o clase de regiones marco o constantes de inmunoglobulina, o se selecciona mediante un programa informático en forma de secuencia consenso, como se define anteriormente, se produce un anticuerpo manipulado. Los anticuerpos manipulados pueden comprender regiones constantes y regiones marco variables de inmunoglobulinas (Ig) de una fuente, por ejemplo, el anticuerpo aceptor o secuencias consenso, y una o más (preferiblemente todas) CDR del anticuerpo donador, por ejemplo, el anticuerpo B9 antihumano descrito en este documento. Además, pueden realizarse alteraciones, por ejemplo, deleciones, sustituciones, o adiciones, de la región marco del dominio variable ligero y/o pesado del mAb aceptor a los niveles de ácido nucleico o aminoácidos, o de las regiones CDR del donador para conservar la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo donador o para reducir la inmunogenicidad potencial.

Dichos anticuerpos manipulados se diseñan para emplear una (o las dos) de las cadenas ligeras y/o pesadas variables del mAb receptor que contiene la subunidad \alpha_{v} anti-humana (modificado opcionalmente como se ha descrito) o una o más de las CDR de cadena pesada o ligera identificadas a continuación. Los anticuerpos manipulados de la invención son neutralizantes, es decir, inhiben de forma deseable la unión del ligando al receptor \alpha_{v}\beta_{3} o \alpha_{v}\beta_{5} in vitro e in vivo en modelos animales de enfermedades mediadas por estos receptores, por ejemplo, cánceres.

Dichos anticuerpos manipulados pueden incluir un anticuerpo humano conformado de nuevo que contiene las regiones constantes de cadena pesada y ligera fusionadas a los fragmentos funcionales del anticuerpo humano anti-\alpha_{v}\beta_{3}/\alpha_{v}\beta_{5}. Un anticuerpo aceptor humano (o de otro animal) adecuado puede ser uno seleccionado entre una base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAT^{7}, la base de datos de Los Alamos, y la base de datos Swiss Protein mediante homología con las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del anticuerpo donador. Como alternativa, puede usarse una secuencia consenso formada mediante todas las secuencias humanas conocidas en la base de datos de un subgrupo muy próximo al del anticuerpo donador, para suministrar las regiones marco. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología con las regiones marco del anticuerpo donador (en base a aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de cadena pesada y/o una región marco variable de cadena pesada para la inserción de las CDR donadoras. Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones marcos variables o constantes de cadena ligera puede seleccionarse de forma similar. Debe observarse que no se requiere que las cadenas ligera y pesada del anticuerpo aceptor se originen del mismo anticuerpo
aceptor.

Es deseable que las regiones marco y constante heterólogas se seleccionen de clases e isotipos de inmunoglobulina humana, tales como IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA e IgE. Los dominios Fc no se limitan a secuencias nativas, sino que incluyen variantes mutantes conocidas en la técnica que alteran la función. Por ejemplo, se han descrito mutaciones en los dominios Fc de ciertos anticuerpos de IgG que reducen la unión del complemento mediado por Fc y el receptor Fc [véase, por ejemplo, A. R. Duncan y col., 1988, Nature, 332:563-564; A. R. Duncan y G. Winter, 1988, Nature, 332:738-740; M.-L. Alegre y col., 1992, J. Immunol., 148:3461-3468; M.-H. Tao y col., 1993, J. Exp. Med., 178:661-667; V. Xu y col., 1994, J. Biol. Chem., 269: 3469-2374] y alteran la tasa de eliminación [J.-K. Kim y col., 1994, Eur. J. Immunol., 24:542-548] y reducen la heterogeneidad estructural [S. Angal y col., 1993, Mol. Immunol., 30: 105-108]. Además, son posibles otras modificaciones tales como oligomerización del anticuerpo mediante la adición del segmento de cola de IgM y otras mutaciones [R. I. F. Smith y S. L. Morrison, 1994, Biotechnology, 12:683-688; R. I. F. Smith y col., 1995, J. Immunol., 154: 2226-2236] o adición del segmento de cola de IgA [I. Kariv y col., 1996; J. Immunol., 157: 29-38]. Sin embargo, el anticuerpo aceptor no necesita comprender solamente secuencias de proteína de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, puede construirse un gen en el que una secuencia de ADN que codifica parte de una cadena de inmunoglobulina humana se fusiona con una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos no de inmunoglobulina tal como un efector polipeptídico o molécula informadora.

Un ejemplo de un anticuerpo alterado particularmente deseable es un anticuerpo humanizado que contiene toda o una porción de las secuencias de aminoácidos del dominio variable de B9 y algunas porciones de las regiones marco del anticuerpo donador, o CDR de los mismos insertadas en las regiones marco de un anticuerpo humano seleccionado. Este anticuerpo humanizado se dirige contra receptores \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} humanos, entre otros. De forma adecuada, en estos anticuerpos humanizados una, dos, o preferiblemente tres CDR de las regiones variables de cadena pesada y/o de cadena ligera del anticuerpo B9 se insertan en las regiones marco de un anticuerpo humano o secuencia consenso seleccionado, sustituyendo las CDR nativas de este último anticuerpo o secuencia consenso.

Preferiblemente, en un anticuerpo humanizado los dominios variables en las cadenas pesadas y ligeras humanas se han manipulado mediante una o más sustituciones de CDR. Es posible usar las seis CDR, o diversas combinaciones de menos de las seis CDR. Por ejemplo, es posible sustituir solamente las CDR en la cadena pesada humana, usando como cadena ligera la cadena ligera sin modificar el anticuerpo aceptor humano. Como otra alternativa, puede seleccionarse una cadena ligera compatible de otro anticuerpo humano recurriendo a las bases de datos de anticuerpos convencionales. El resto del anticuerpo manipulado puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina humana aceptora adecuada.

El anticuerpo alterado tiene por lo tanto la estructura de un anticuerpo humano natural o un fragmento del mismo, y posee la combinación de propiedades requeridas para uso terapéutico eficaz, por ejemplo, tratamiento de enfermedades mediadas por receptores humanos que contienen la subunidad \alpha_{v}, o para usos de diagnóstico.

Los especialistas en la técnica entenderán que un anticuerpo alterado puede modificarse adicionalmente mediante cambios en los aminoácidos del dominio variable sin afectar necesariamente la especificidad y la alta afinidad del anticuerpo donador (es decir, un análogo). Se prevé que los aminoácidos de cadena pesada y ligera puedan sustituirse por otros aminoácidos en los marcos de dominio variable o en las CDR o en ambas. Se prefieren particularmente la modificación inmunológica de dichas secuencias reconstruidas como se ilustra en los ejemplos en este documento.

Además, la región variable constante puede alterarse para potenciar o disminuir las propiedades selectivas de las moléculas de la presente invención mediante dimerización, unión a receptores de Fc, o la capacidad de unirse y activar complementos [véase, por ejemplo, Angal y col., 1993, Mol. Immunol., 30: 105-108; Xu y col., 1994, J. Biol. Chem., 269: 3469-3474; Winter y col., EP 307.434-B], o como se ha descrito anteriormente.

Dichos anticuerpos son útiles en la prevención y tratamiento de trastornos mediados por estas integrinas que contienen la subunidad \alpha_{v}, como se ha descrito en este documento.

VII. Producción de Anticuerpos Alterados y Anticuerpos Manipulados

Los anticuerpos humanizados y quiméricos, conformados de nuevo y manipulados humanos resultantes de esta invención, pueden expresarse en células huésped recombinantes, por ejemplo, COS, CHO o células de mieloma, recurriendo a la tecnología de ADN recombinante usando técnicas de manipulación genética. También pueden emplearse las mismas o técnicas similares para generar otras realizaciones esta invención.

Descrito en resumen, se produce un vector de expresión o plásmido recombinante convencional colocando estas secuencias codificantes para el anticuerpo alterado en asociación operativa con secuencias de control reguladoras convencionales capaces de controlar la replicación y expresión en, y/o la secreción de, una célula huésped. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias promotoras, por ejemplo, promotor CMV, y secuencias señal, que pueden obtenerse de otros anticuerpos conocidos. Análogamente, puede producirse un segundo vector de expresión que tenga una secuencia de ADN que codifique una cadena ligera o pesada de un anticuerpo complementario. Preferiblemente este segundo vector de expresión es idéntico al primero excepto en la medida en que las secuencias codificantes y marcadores seleccionables están afectadas, para asegurar en la medida de lo posible que cada cadena polipeptídica se expresa funcionalmente. Como alternativa, las secuencias codificantes de cadena pesada y ligera para el anticuerpo alterado pueden residir en un único vector.

Una célula huésped seleccionada se co-transfecta mediante técnicas convencionales con el primer y segundo vectores (o se transfecta simplemente mediante un único vector) para crear la células huésped transfectadas de la invención que comprende las cadenas ligera y pesada sintéticas recombinantes. La célula transfectada se cultiva después mediante técnicas convencionales para producir el anticuerpo manipulado de la invención. La producción del anticuerpo que incluye la asociación de la cadena pesada y la cadena ligera recombinantes se mide en el cultivo mediante un ensayo apropiado, tal como ELISA o RIA. Pueden emplearse técnicas convencionales similares para construir otros anticuerpos alterados y moléculas de esta invención.

Pueden seleccionarse vectores adecuados para las etapas de clonación y subclonación empleadas en los procedimientos y construcción de las composiciones de esta invención por un especialista en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse la series pUC convencionales de vectores de clonación. Un vector usado es pUC19, que está disponible en el mercado de proveedores, tales como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Adicionalmente, puede usarse para la clonación cualquier vector que sea capaz de replicar fácilmente, tenga abundantes de sitios de clonación y genes seleccionables (por ejemplo, resistencia a antibióticos), y se manipule fácilmente. Por tanto, la selección del vector de clonación no es un factor limitante de esta invención.

Análogamente, los vectores empleados para la expresión de los anticuerpos manipulados de acuerdo con la invención pueden seleccionarse por un especialista en la técnica entre cualquier vector convencional. Los vectores preferidos incluyen por ejemplo plásmidos pCD o pCN. Los vectores también contienen secuencias reguladoras seleccionadas (tales como promotores CMV) que dirigen la replicación y expresión de secuencias de ADN heterólogas en células huésped seleccionadas. Estos vectores contienen las secuencias de ADN descritas anteriormente que codifican el anticuerpo manipulado o la región codificante de inmunoglobulina alterada. Además, los vectores pueden incorporar las secuencias de inmunoglobulinas seleccionadas modificadas mediante la inserción de sitios de restricción deseables para la fácil manipulación.

Los vectores de expresión también pueden caracterizarse mediante genes adecuados para amplificar la expresión de las secuencias de ADN heterólogas, por ejemplo, el gen de dihidrofolato reductasa de mamíferos (DHRF). Otras secuencias de vectores preferibles incluyen una secuencia señal de poliadenilación (poli A), tal como de la hormona del crecimiento bovina (BGH) y la secuencia promotora de betaglobina (betaglopro). Los vectores de expresión útiles en este documento pueden sintetizarse mediante técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica.

Los componentes de dichos vectores, por ejemplo, replicones, genes de selección, potenciadores, promotores, secuencias señal y similares, pueden obtenerse de fuentes comerciales o naturales o sintetizarse mediante procedimientos conocidos para uso en la dirección de la expresión y/o secreción del producto del ADN recombinante en un huésped seleccionado. Otros vectores de expresión apropiados de los que se conocen numerosos tipos en la técnica de expresión en mamíferos, bacterias, insectos, levaduras y hongos también pueden seleccionarse para este fin.

La presente invención también abarca una célula transfectada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias codificantes de los anticuerpos manipulados o moléculas de inmunoglobulinas alteradas de los mismos. Las células huésped útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores de clonación también son convencionales. Sin embargo, de forma más deseable, se usan células de diversas cepas de E. coli para la replicación de los vectores de clonación y otras etapas en la construcción de anticuerpos alterados de esta invención.

Las células huésped adecuadas o las líneas celulares para la expresión del anticuerpo manipulado o anticuerpo alterado de la invención son preferiblemente células de mamífero tales como CHO, COS, células de fibroblastos (por ejemplo, 3T3) y células de mieloma. Más preferiblemente se usa una CHO o una célula de mieloma. Pueden usarse células humanas, que permiten que la molécula se modifique con patrones de glicosilación humanos. Como alternativa, pueden emplearse otras líneas celulares eucariotas. La selección de células huésped de mamífero adecuadas y procedimientos para la transformación, cultivo, amplificación, selección y producción y purificación del producto se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989 Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2ª edición., Cold Spring Harbor Laboratory (Nueva York).

Las células bacterianas pueden mostrarse útiles como células huésped adecuadas para la expresión de los Fab recombinantes de la presente invención [véase, por ejemplo, Plückthun, A., 1992, Immunol. Rev., 130:151-188]. La tendencia de las proteínas expresadas en células bacterianas de estar en forma no plegada o plegada de forma incorrecta o en forma no glicosilada no plantea una preocupación grande, puesto que los Fab no están glicosilados normalmente y pueden manipularse para la expresión exportada reduciendo de este modo la alta concentración que facilita el plegamiento incorrecto. Sin embargo, debería seleccionarse cualquier Fab recombinante producido en una célula bacteriana, para la conservación de la capacidad de unión al antígeno. Si la molécula expresada por la célula bacteriana se produjo y se exportó en una forma plegada apropiadamente, esta célula bacteriana sería un huésped deseable. Por ejemplo, se conocen bien diversas cepas de E. coli usadas para la expresión como células huésped en el campo de la biotecnología. También pueden emplearse en este procedimiento diversas cepas de B. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares.

Donde se desee, también están disponibles cepas de levaduras conocidas por los especialistas en la técnica como células huésped, así como células de insecto, por ejemplo, Drosophila y Lepidoprera y sistemas de expresión virales. Véase, por ejemplo Miller y col., 1986, Generic Engineering 8: 277-298 y referencias citadas en ese documento.

Los procedimientos generales mediante los cuales los vectores de la invención pueden construirse, los procedimientos de transfección requeridos para producir las células huésped de la invención, y los procedimientos de cultivo necesarios para producir el anticuerpo alterado de la invención a partir de dicha célula huésped, son todos técnicas convencionales. Del mismo modo, una vez producidos, los anticuerpos alterados de la invención pueden purificarse a partir de los contenidos del cultivo celular de acuerdo con procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Dichas técnicas están dentro del alcance de la técnica y no limitan esta invención.

Otro procedimiento más de expresión de anticuerpos conformados de nuevo puede utilizar la expresión en un animal transgénico, tal y como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.873.316.

Una vez expresado mediante el procedimiento deseado, se examina después la actividad in vitro del anticuerpo manipulado mediante el uso de un ensayo apropiado. Actualmente se emplean formatos de ensayo de ELISA convencionales para evaluar cualitativa y cuantitativamente la unión del anticuerpo alterado a los receptores \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} humanos. Véase, el Ejemplo 3 a continuación. Adicionalmente, pueden usarse también otros análisis in vitro (tal como el Ejemplo 9) y otros modelos animales in vivo (tales como Ejemplos 13 y 14) para verificar la eficacia de neutralización antes de los estudios clínicos humanos posteriores realizados para evaluar la persistencia del anticuerpo alterado en el cuerpo a pesar de los mecanismos normales de eliminación.

Como ejemplo específico de los procedimientos de producción descritos anteriormente, se genera un anticuerpo B9 humanizado y se expresa como se describe en detalle en el Ejemplo 11 a continuación.

VIII. Usos Terapéuticos/Profilácticos

Esta invención también se refiere a una procedimiento para tratar seres humano (u otros mamíferos) que experimentan síntomas relacionados con enfermedades que están mediadas por receptores tales como \alpha_{v}\beta_{3}, \alpha_{v}\beta_{5}, \alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{v}\beta_{6}, y \alpha_{v}\beta_{8}, que comprenden administrar una dosis eficaz de anticuerpos incluyendo uno o más de los anticuerpos alterados descritos en este documento o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos de esta invención son útiles para tratar enfermedades en las que la patología subyacente es atribuible a un ligando que interactúa con un receptor que contiene \alpha_{v}, tal como el receptor de vitronectina. Por ejemplo, estos anticuerpos son útiles como agentes anti-tumorales, anti-angiogénicos, anti-inflamatorios y anti-metastásicos, y son particularmente útiles en el tratamiento de aterosclerosis, restenosis, metástasis cancerosa, artritis reumatoide, retinopatía diabética y degeneración macular.

Análogamente, estos anticuerpos son útiles para el tratamiento de afecciones en las que la pérdida de la matriz ósea crea patología. De este modo, los presentes anticuerpos son útiles para el tratamiento de osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Paget, hipercalcemia de tumores malignos, lesiones osteolíticas producidas por la metástasis ósea, pérdida ósea debida a la inmovilización o deficiencia de hormonas sexuales.

La respuesta terapéutica inducida por el uso de las moléculas de esta invención se produce mediante la unión al receptor seleccionado, por ejemplo, \alpha_{v}\beta_{3} o los otros mencionados anteriormente, y de este modo el bloqueo posterior del desarrollo de la enfermedad. Por tanto, las moléculas de la presente invención, cuando están en preparaciones y formulaciones apropiadas para uso terapéutico, son altamente deseables para las personas que experimentan trastornos mediados por estos receptores que contienen \alpha_{v} humano. Por ejemplo, pueden ser deseables tratamientos más largos cuando se tratan enfermedades crónicas o similares. La dosis y duración del tratamiento se relaciona con la duración relativa de las moléculas de la presente invención en la circulación humana, y puede ajustarla un especialista en la técnica dependiendo de la afección tratada y del estado general de salud del paciente.

Los anticuerpos alterados, anticuerpos y fragmentos de los mismos de esta invención también pueden usarse en solitario o junto con otros anticuerpos, particularmente anticuerpos humanos o humanizados que reaccionan con otros epítopes en el receptor de integrina seleccionado como agente profiláctico.

El modo de administración de los agentes terapéuticos y profilácticos de la invención puede ser cualquier vía adecuada que suministre el agente al huésped. Los anticuerpos alterados, anticuerpos, anticuerpos manipulados, y fragmentos de los mismos, y composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para administración parenteral, es decir por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intravenosa, o por vía intranasal.

Los agentes terapéuticos y profilácticos de la invención pueden prepararse en forman de composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo alterado de la invención como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se prefiere una suspensión o solución acuosa que contiene el anticuerpo, preferiblemente, tamponada a pH fisiológico, en una forma fácil para inyección. La composición para administración parenteral comprenderá normalmente una solución del anticuerpo manipulado de la invención o un cóctel del mismo disuelto en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Pueden emplearse diversos vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y están generalmente sin material particulado. Estas soluciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajuste del pH y agentes tamponantes, etc.

La concentración del anticuerpo de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5%, normalmente a o al menos aproximadamente el 1%, hasta tanto como el 15 ó el 20% en peso y se seleccionará principalmente en base a volúmenes de líquido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado.

Por tanto, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular podría prepararse para contener 1 ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg de un anticuerpo manipulado de la invención. De forma deseable, las composiciones pueden contener de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 80 mg de anticuerpo, o más preferiblemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 75 mg de anticuerpo de acuerdo con esta invención. Análogamente, podría prepararse una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa para contener aproximadamente 250 ml de solución de Ringer estéril, y de aproximadamente 1 a aproximadamente 75 y preferiblemente de 5 a aproximadamente 50 ng/ml de un anticuerpo manipulado de la invención. Los procedimientos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral los conocen bien o serán evidentes para los especialistas en la técnica. Dichos procedimientos se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Se prefiere que los agentes terapéuticos y profilácticos de la invención, cuando están en una preparación farmacéutica, se presenten en formas de dosificación unitaria. Los especialistas en la técnica pueden determinar fácilmente la dosis terapéuticamente eficaz apropiada. Para tratar eficazmente un trastorno inflamatorio en un ser humano u otro animal, debe administrarse por vía parenteral preferiblemente i.v. o i.m (por vía intramuscular) una dosis de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg por 70 kg de peso corporal de una proteína o un anticuerpo de esta invención. Dicha dosis puede, si fuera necesario, repetirse a intervalos de tiempo apropiados seleccionado según sea apropiado por un médico.

Los anticuerpos, anticuerpos alterados o fragmentos de los mismos descritos en este documento puede liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con inmunoglobulinas convencionales y pueden emplearse técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.

En un régimen terapéutico alternativo más, lo anticuerpos alterados y anticuerpos monoclonales de esta invención pueden usarse en una terapia combinada para las enfermedades descritas como antagonistas de pequeñas moléculas, las dosificaciones y regímenes de administración se describe en, por ejemplo la Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO96/00730, publicada el 11 de enero de 1996 y la Publicación de Patente Internacional PCT Nº WO96/00574, publicada el 11 de enero de 1996. Dicha terapia de combinación puede implicar administrar un anticuerpo de esta invención a un paciente durante un periodo de tiempo corto, es decir, de varias semanas a seis meses, seguido del tratamiento terapéutico crónico con el antagonista de molécula pequeña durante un periodo de tiempo más largo. En otra realización, esta realización de un procedimiento de tratamiento puede implicar periodos de tratamiento alterno de administrar inmunoterapia con los anticuerpos de esta invención seguidos de tratamientos con antagonistas no peptídicos pequeños. Dichos procedimientos terapéuticos combinados emplearían las mismas dosificaciones descritas anteriormente para inmunoterapia y las dosificaciones especificadas en las solicitudes citadas anteriormente para las terapias no peptídicas.

IX. Usos de Diagnóstico

Los anticuerpos alterados y anticuerpos manipulados de esta invención también pueden usarse en regímenes de diagnóstico, tales como para la determinación de trastornos mediados por receptores que contienen \alpha_{v} humanos o rastrear el desarrollo del tratamiento de dichos trastornos. Como reactivos de diagnóstico, estos anticuerpos alterados pueden marcarse de forma convencional para uso en ELISA y otros formatos de ensayo convencionales para la medición de los niveles del receptor que contiene la subunidad \alpha_{v} humana en el suero, plasma, u otro tejido apropiado o la liberación por células humanas en cultivo. La naturaleza del ensayo en el que se usan los anticuerpos alterados es convencional y no limitan esta descripción.

Los siguientes ejemplos ilustran diversos aspectos de esta invención incluyendo la construcción de anticuerpos manipulados ejemplares y la expresión de los mismos en vectores y células huésped adecuadas, y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. Todos los aminoácidos se identifican mediante los códigos convencionales de tres letras o una letra. Todas las enzimas de restricción, plásmidos, y otros reactivos y materiales necesarios se obtuvieron de fuentes comerciales a menos que se indique otra cosa. Toda la metodología de ligamiento de clonación general y de ADN recombinante era como se realizó en T. Maniatis y col., o Sambrook y col., ambos citados anteriormente.

Ejemplo 1 Purificación de receptores \alpha_{V}\beta_{3}, \alpha_{V}\beta_{5} y \alpha_{V}\beta_{1}

El receptor de la proteína \alpha_{V}\beta_{3} humana y otros receptores proteicos se purificaron a partir de la placenta humana de la siguiente manera.

Se congelaron placentas inmediatamente después del parto, después se descongelaron parcialmente y se cortaron en tiras pequeñas que se picaron en pedazos finos usando una picadora de carne comercial. Normalmente se picaron de cinco a diez placentas al mismo tiempo. Los pedazos se colocaron en tubos de centrífuga de 50 ml (6 tubos por placenta) y se almacenaron congelados a -20º C hasta su uso.

Se preparó una columna de inmunoafinidad para cada integrina usando anticuerpos monoclonales individuales. El mAb anti-\alpha_{V}\beta_{3} (LM609) se purificó a partir de líquido ascítico murino adquirido de Chemicon International, Inc. (Temecula, CA). Los anticuerpos monoclonales 23C6 o D12 se purificaron a partir de medios de hibridoma. Un mAb anti-\alpha_{V}\beta_{5} (P1F6) y mAb anti-\alpha_{V}\beta_{1} (mAbl6) se adquirieron de Becton Dickinson. LM609 o 23C6 o D12 (50 mg), P1F6 (25 mg) y mAb16 (25 mg) se inmovilizaron en AffiGel 10 (BioRad) a 5 mg de mAb/ml de resina siguiendo las instrucciones del fabricante. Para retirar las proteínas de unión no específica, se trataron 20 ml de AffiGel 10 con Tris HCl 1 M pH 7,5 y se introdujeron en una columna Econo. Los mAb inmovilizados se introdujeron en la columna EconoColumn (BioRad), columna de 10 ml para LM609 o 23C6 o D12, una de 5 ml para P1F6 y una de 5 ml para mAb16. Las columnas se conectaron en tándem: la primera columna contenía AffiGel 10 para unión no específica, la segunda columna contenía mAb \alpha_{V}\beta_{3}, la tercera columna contenía mAb \alpha_{5}\beta_{1} y la cuarta columna contenía mAb P1F6 (el \alpha_{V}\beta_{5}). Las columnas se equilibraron con tampón T (Tris HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,1 M, CaCl 2 mM, octilglucósido al 1%) en la cámara de frío.

La placenta picada (9 tubos) se descongeló parcialmente y se dispersó minuciosamente usando una espátula en tampón T+ octilglucósido al 6% (la concentración final de OG era del 3%). La mezcla se almacenó durante 5 horas o durante una noche a 4ºC. La solución en masa se transfirió a frascos de centrifuga de 250 ml y se centrifugó a 13.000 rpm durante una hora. El sobrenadante transparente se transfirió a tubos de centrifuga de 50 ml y se centrifugo a 20.000 rpm durante una hora. El sobrenadante transparente se combinó y se introdujo a un caudal de 30 ml/hora en las columnas dispuestas y pre-equilibradas en tampón T en modo en tándem como se ha descrito anteriormente. Al final de la carga, las columnas se lavaron con >250 ml de tampón T. Las columnas individuales se separaron después y las integrinas unidas se eluyeron con ácido acético 0,2 M hasta que el pH del eluato alcanzó <3,0. Las soluciones de integrina eluida se neutralizaron rápidamente a >pH 7,0 con base Trizma 1 M. La columna también se neutralizó mediante un lavado con tampón T.

Las soluciones de integrina eluida (25 ml) se concentraron a 1 ml usando Aquaside III (Calbiochem) en una bolsa de diálisis de límite 5.000. Las integrinas concentradas se dializaron durante una noche contra tampón T. El rendimiento final fue de aproximadamente 1 mg para cada integrina por placenta.

Ejemplo 2 Generación de anticuerpos monoclonales murino

Se generaron mAb murino con actividad anti-\alpha_{V}\beta_{3} mediante tecnología de hibridoma clásica de acuerdo con Lane y col., 1986, Methods in Enzymol., 121:183. Generalmente, se administraron 20-50 \Phig de receptor \alpha_{V}\beta_{3} por vía intraperitoneal, subcutánea, e intravenosa a dos ratones Balb/c. Se ensayó la actividad de unión y neutralización anti-\alpha_{V}\beta_{3} en sueros de los animales inmunizados en ensayos de los Ejemplos 3, 4 y 5 a continuación. Los bazos de ratones que mostraba sueros positivos se fusionaron con una célula de mieloma SP2 de acuerdo con los procedimientos de Lane y col., citados anteriormente. Se obtuvieron diecisiete líneas celulares de hibridoma resultantes, que secretaban anticuerpos de proteína anti-\alpha_{V}\beta_{3} humana potenciales. Estos mAb anti-\alpha_{V}\beta_{3} se generaron y aislaron a partir del cultivo mediante procedimientos convencionales y se ensayaron en ensayos de los siguientes ejemplos.

La Tabla I es un resumen de los datos recogidos de los Ejemplos 3-10 a continuación sobre el mAb B9 murino, el mAb LM609 murino de la técnica anterior y otros mAb murino de esta invención. Los datos mostraron que el mAb B9 era un mAb con un perfil de actividad favorable. El mAb B9 que funcionó adecuadamente en estos ensayos se seleccionó después para la humanización como se describe en el Ejemplo 11, y se ensayó adicionalmente después en modelos animales de los Ejemplos 13 y 14. El mAb B9 tenía una reactividad cruzada mínima con conejo (no detectable en estudios in vivo), por lo tanto, los modelos humanos y de primates de restenosis, angiogénesis o aterosclerosis son aplicables para la eficacia del ensayo.

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TABLA I

1

2

Ejemplo 3 Ensayo de unión ELISA con \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}

La unión de las diversas construcciones de anticuerpos a la proteína receptora \alpha_{v}\beta_{3} y proteína receptora \alpha_{v}\beta_{5} de humana purificada como antígenos (receptor unido a la placa o a las perlas mediante biotina-avidina) se midió en un ELISA de fase sólida convencional.

El antígeno diluido en CO_{3} 0,1 M pH 9,2 se adsorbió en microplacas de poliestireno de fondo redondeado (Dynatech, Immunolon II) durante 18 horas. Los pocillos se lavaron después una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tween 20 al 0,05%. Los anticuerpos (50 \Phil/pocillo) se diluyeron a concentraciones variables en PBS/Tween 20 al 0,05% y se añadieron a los pocillos revestidos con antígeno durante dos horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05%, usando un lavador de microplacas Titertek 320, seguido de adición de IgG HRP-anti-ratón (100 \Phil/pocillo) diluido 1:10.000.

Después de lavar cinco veces, se añadió diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD) (1 mg/ml) y se incubaron las placas 10 minutos adicionales. La reacción se interrumpió mediante la adición de NaF 0,1 M y se leyó la absorbancia a 450 nm usando un lector de ELISA Dynatech MR 7000.

Ejemplo 4 Ensayos de unión de ELISA con \alpha_{v}\beta_{3,} \alpha_{5}\beta_{1} y \alpha_{11}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}

Los mAb positivos en el ensayo del Ejemplo 3 se seleccionaron usando los mismos protocolos excepto que el antígeno era otro receptor humano \alpha_{5}\beta_{1} o \alpha_{11}\beta_{3}. Estos ensayos se realizaron para determinar la selectividad para el antígeno heterodimérico \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} en oposición a la selectividad para una subunidad \beta solamente. Los resultados de estos ensayos se presentan en la Tabla I anteriormente para todos los mAb del Ejemplo 2 y para LM609.

Ejemplo 5 Ensayo de ELISA de neutralización

Se añadieron receptores de vitronectina \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} (0,2 \mug/pocillo), purificados a partir de placenta humana, a placas de ELISA de 96 pocillos (Coming, New York, NY). Las placas se incubaron durante una noche a 4ºC. En el momento del experimento las placas se aspiraron y se incubaron en 0,1 ml de tampón A (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2}, 1mM, pH 7,4) que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 3% durante 1 hora a temperatura ambiente para bloquear la unión no específica. Después de aspirar la solución de bloqueo, se añadieron diversas concentraciones de mAb a los pocillos seguidas de la adición de fibrinógeno biotinilado 5 nM en 0,1 ml de Tampón A que contenía BSA al 0,1%. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.

Después de la incubación, se aspiraron los pocillos completamente y se lavaron dos veces con 100 \Phil de tampón de unión. Se cuantificó el fibrinógeno unido mediante la adición de 0,1 ml de un anticuerpo anti-biotina conjugado con fosfatasa alcalina (dilución 1:2000, Sigma), seguido del lavado dos veces con tampón de unión y la adición de 100 \Phil del sustrato p-nitrofenil fosfatasa preparado diariamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit del sustrato de fosfatasa alcalina, BioRad). La cinética del desarrollo de coloración se siguió usando un lector de placas de microtitulación.

Este ensayo detectó la inhibición de la unión entre el receptor \alpha_{v}\beta_{3} purificado y su ligando, fibronectina, los resultados de estos ensayos se presentan en la Tabla I anteriormente, para todos los mAb del Ejemplo 2 y para LM609.

Ejemplo 6 Citometría de flujo

Para caracterizar varios de los mAb murino obtenidos como se ha descrito anteriormente con el mAb LM609 murino conocido, se realizó este ensayo para detectar la unión al receptor de la superficie nativa y la reactividad cruzada entre especies.

Descrito brevemente, las células se lavaron en 10 ml de PBS frío y se resuspendieron en PBS frío para dar entre 1 x 10^{7} y 2 x 10^{7} células/ml. Se añadieron alícuotas de 0,1 ml/pocillo a una placa de fondo en "V" de 96 pocillos. Después, se añaden 25 \Phil de anticuerpo primario. Las placas se agitan durante cinco minutos, y después se incuban en hielo durante 25 minutos. Las placas se centrifugan durante cinco minutos y se sacuden. En lo sucesivo, los contenidos de cada pocillo se resuspenden en 50 \Phil de PBS frío, y se centrifugan y sacuden de nuevo. Se repite el lavado y los contenidos se resuspenden en 50 \Phil de PBS frío. Se añade anticuerpo secundario marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (50 \Phil) a cada pocillo. Las placas se agitan durante cinco minutos, y se incuban en hielo en la oscuridad durante 20 minutos. Se añade un \Phil de yoduro de propidio (PI) (1mg/ml)/PBS hasta una concentración final de 10 \Phig/ml (1 \Phig en 0,1 ml). La incubación continúa durante cinco minutos, seguida de centrifugado y lavado dos veces en PBS frío.

Las células se resuspenden en 0,1 ml de PBS frío, y se transfieren a tubos Falcon transparentes de 12 x 75. El volumen se ajusta a 1 ml, y las células se mantienen frías en la oscuridad hasta la lectura mediante FLOW.

El anticuerpo secundario: IgG,M,A de cabra anti-ratón, se marca con FITC 1:25/PBS-BSA al 0,2%-NaN_{3} al 0,1% (Sigma F1010 Nº de lote 045H8822) y se mantiene frío en la oscuridad hasta la lectura mediante FLOW.

Los resultados de estos ensayos se presentan en la Tabla I y muestran una clara indicación de que B9 se une a las células que expresan \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5}. La citometría de flujo usando células del músculo liso (SMC) humanas indicaba que mAb B9 tiene gran capacidad para unirse a un receptor nativo en la superficie celular.

Ejemplo 7 Inmunohistología

La inmunohistología se realizó en tejidos que expresaban altos niveles de receptores, tales como osteoclastoma humano. Los datos de inmunohistología (osteoclastoma humano) mostraron que B9 tiene una capacidad de detección superior. Véase la Tabla I. B9 detecta \alpha_{v}\beta_{3}/\alpha_{v}\beta_{5} humano, de babuino y de conejo en células y tejido humano.

Ejemplo 8 BIAcore para determinar la afinidad del mAb a los receptores

Se realizó un análisis BIAcore (Pharmacia) para medir la afinidad de unión de mAb B9 (6 nM) con \alpha_{v}\beta_{3} y \alpha_{v}\beta_{5} inmovilizado. Las interacciones de estos receptores con B9 se estudiaron usando tecnología BIAcore mediante inmovilización de los receptores en la superficie del sensor, y pasando soluciones del mAb sobre su superficie. Las descripciones de la instrumentación y las superficies del sensor se describen en [Brigham-Burke, Edwards y O'Shannessy, 1992, Analytical Biochem., 205: 125-131]. Los receptores se inmovilizaron insertándolos en una vesícula de fosfolípidos y produciendo una membrana bicapa híbrida sobre una superficie sensora hidrófoba. Una descripción más completa de la generación de membranas de bicapa híbrida en superficies de sensor de BIAcore se proporciona en Plant y col., 1995, Analyt. Biochem., 226: 342-348: Las muestras del mAb se pasaron sobre esta superficie y las velocidades a las que se unen y después se disocian de la superficie se midieron y analizaron usando el software proporcionado con el instrumento.

La Tabla II proporciona estos datos. Las constantes de velocidad cinética y la constante de afinidad calculada (K_{D}) se obtuvieron del análisis de tres concentraciones de mAb (100, 24, 6 nM) realizado por triplicado. Los datos del Biacore mostraron que la afinidad de unión (K_{D}) de B9 es aproximadamente 5 veces mayor que la del Mab D12 para el receptor \alpha_{v}\beta_{3}.

TABLA II

3

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En un segundo formato del análisis BIAcore, se empleó Proteína A para inmovilizar los mAb en la superficie del sensor y después se pasaron muestras de las proteínas receptoras sobre esta superficie y las velocidades a las que se unen y después se disocian de la superficie se midieron y analizaron usando el software proporcionado con el instrumento. La Tabla III proporciona datos que permiten la evaluación de diferentes construcciones de B9 humanizadas para su actividad de unión contra el receptor \alpha_{v}\beta_{3}. Los mAb B9 humanizados en la Tabla III, se caracterizan por la cadena pesada de IgG1, excepto por B9HL1G4, que tiene una cadena pesada de IgG4. Se representan tres cadenas ligeras diferentes mediante L1, L2, y L3. El mAb anti-\alpha_{v}\beta_{3} (D12IgG1) se incluyó para comparación. La K_{as} (velocidad de asociación) y la K_{dis} (velocidad de disociación) son mediciones que calculan la afinidad de los mAb contra el receptor \alpha_{v}\beta_{3} (K_{D} en nM). Estos datos de Biacore indican que los mAb tienen una mayor afinidad por el receptor \alpha_{v}\beta_{3} que el mAb D12.

TABLA III

4

5

Ejemplo 9 Ensayo de migración de células del músculo liso (SMC) vascular

La migración de células del músculo liso (SMC) vascular desde los medios en el área de la herida para iniciar el crecimiento de la neoíntima es una respuesta de remodelado esencial después de la lesión vascular. La inhibición de la migración de SMC atenúa la formación de la neoíntima. La migración de SMC vascular está mediada por el receptor humano \alpha_{v}\beta_{3}, que se expresa en VSMC y se regula positivamente después de la lesión vascular. La osteopontina, un ligando del receptor humano \alpha_{v}\beta_{3}, se regula positivamente después de la angioplastia y promueve la migración de VSMC mediante la integrina. Este experimento se realizó para demostrar la capacidad de un anticuerpo para \alpha_{v}\beta_{3} humano de inhibir la migración de VSMC in vitro.

Se usaron células del músculo liso aórtico humano. La migración celular se controló en una cámara de cultivo celular Transwell usando una membrana de policarbonato con poros de 8 \mum (Costar). La superficie inferior del filtro se revistió con vitronectina u osteoporina. Las células se suspendieron en medio mínimo esencial de Difco (DMEM) suplementado con BSA al 0,2% a una concentración de 2,5-5,0 x 10^{6} células/ml, y se trataron previamente con anticuerpo de ensayo a diversas concentraciones durante 20 minutos a 20ºC. El disolvente en solitario se usó como control. Se colocaron 0,2 ml de la suspensión celular en el compartimento superior de la cámara. El compartimento inferior contenía 0,6 ml de DMEM suplementado con BSA al 0,2%. La incubación se realizó a 37ºC en una atmósfera de aire al 95%/CO_{2} al 5% durante 24 horas.

Después de la incubación, las células no migradas en la superficie superior del filtro se retiraron raspando suavemente. El filtro se fijo después en metanol y se tiñó con tinte Giemsa al 10%. La migración se midió a) contando la cantidad de células que habían migrado a la superficie inferior del filtro o b) extrayendo las células teñidas con ácido acético al 10% seguido de determinación de la absorbancia a 600 nM.

Ejemplo 10 Adhesión de células HEK293 para determinar la inhibición de la adhesión

Se obtuvieron células de riñón embrionario humano (células HEK293) de ATCC (Nº de catálogo CRL 1573). Se cultivaron las células en medio mínimo esencial de Earl (EMEM), medio que contenía sales de Earl, suero fetal bovino (FBS) al 10%, glutamina al 1% y Penicilina-Estreptomicina al 1%.

Un fragmento de EcoRI-KpnI de 3,2 kb de la subunidad \alpha_{v} y un fragmento XbaI-XhoI de 2,4 kb de la subunidad \beta_{3} se insertaron en los sitios de clonación EcoRI-EcoRV del vector pCDN que contiene un promotor CMV y un marcador G418 seleccionable mediante ligamiento de extremos romos. Para la expresión estable, se electrotransformaron 80 x 10^{6} células HEK 293 con construcciones \alpha_{v}+\beta_{3} (20 \Phig de ADN de cada subunidad) usando un Gene Pulser [P. Hensley y col., 1994, J. Biol. Chem., 269: 23949-23958] y se colocaron en placas de 100 mm (5 x 10^{5} células/placa). Después de 48 horas, el medio de cultivo se suplementó con 450 \Phig/ml de Geneticin (G418 Sulfate, GIBCO-BRL, Bethesda, MD). Las células se mantuvieron en medio de selección hasta que las colonias eran lo suficientemente grandes para someterse al ensayo.

Se revistieron previamente placas de ELISA de 96 pocillos de Coming durante una noche a 4ºC con 0,1 ml de vitronectina humana (0,2 \Phig/ml en medio RPMI). En el momento del experimento, las placas se lavaron una vez con medio RPMI y se bloquearon con BSA al 3,5% en medio RPMI durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células 293 transfectadas se resuspendieron en medio RPMI, suplementado con Hepes 20 mM, pH 7,4 y BSA al 0,1% a una densidad de 0,5 x 10^{6} células/ml. Se añadieron 0,1 ml de suspensión celular a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a 37ºC, en presencia o ausencia de diversos antagonistas de \alpha_{v}\beta_{3}. Después de la incubación, se añadieron 0,025 ml de una solución de formaldehído al 10%, pH 7,4, y las células se fijaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las placas se lavaron 3 veces con 0,2 ml de medio RPMI y las células adherentes se tiñeron con 0,1 ml de azul de toluidina al 0,5% durante 20 minutos a temperatura ambiente.

El exceso de tinte se retiró mediante lavado extenso con agua desionizada. El azul de toluidina incorporado en las células se eluyó mediante la adición de 0,1 ml de etanol al 50% que contenía HCl 50 mM. La adhesión celular se cuantificó a una densidad óptica de 600 nm en un lector de placas de microtitulación (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA).

La neutralización de la inhibición del receptor de adhesión celular demostró que B9 es superior a D12 y LM609 para inhibir la adhesión celular (véase Tabla I; véase también).

Ejemplo 11 Generación de B9 humanizado A. Generación de regiones Variables de Cadena Pesada y Ligera

Se adoptó una estrategia de humanización para obtener un Mab humanizado al máximo que conservaba completamente la afinidad y avidez de unión al antígeno. Los ADNc de la cadena pesada variable (VH) y cadena ligera variable kappa (Vk) se clonaron y secuenciaron. La secuencia de VHB9 se muestra en la Fig. 1A [SEC ID Nº 1 y 2] (con las CDR en negrita y subrayadas) y la secuencia de VkB9 se muestra en la Fig. 2A [SEC ID Nº 6 y 7] (con las CDR en negrita y subrayadas).

Después de la clonación del ADNc y el análisis de la secuencia, se descubrió que VHB9 y VkB9 eran más similares al subgrupo I de Kabat VH (Fig. 1B; [SEC ID Nº 3]) y subgrupo I de Vk (Fig. 2B; [SEC ID Nº 8]), respectivamente. Las regiones VH y VL humanizadas se sintetizaron combinando las regiones marco de las secuencias consenso del subgrupo de la región V humana junto con las regiones CDR de B9.

El modelado molecular de B9 usando estructuras cristalinas conocidas revela ciertos restos de marco VH y VL que pueden contactar con restos CDR, y de este modo influir en su conformación. Dichos restos marco pueden por lo tanto, contribuir a la formación de una especificidad de antígeno particular y afinidad de unión asociada. Ocho de dichos restos marco VH murino (indicados mediante asteriscos en la Fig. 1C [SEC ID Nº 4 y 5]) y un resto marco Vk murino (indicado mediante asteriscos en la Fig. 2C [SEC ID Nº 9 y 10]) se introdujeron en las regiones marco de consenso humanas, dando como resultado B9HZHC1-0 (Fig. 1C; [SEC ID Nº 4 y 5]) y B9HZLC1-0 (Fig. 2C; [SEC ID Nº 9 y 10]).

B. Análisis de Secuencia de ADNc de Cadena Pesada y Ligera de Mab B9

Se realizó microsecuenciación de los aminoácidos N-terminales de cadenas pesadas y ligeras de B9. La secuencia VH, QVQLQQSGAELMKPGA [SEC ID Nº 16] y la secuencia Vk DIQMTQTTSSLAXAXL [SEC ID Nº 17] N-terminales, se usaron para diseñar cebadores de PCR degenerados que podían dirigir la amplificación por PCR de las regiones VH y Vk desconocidas, respectivamente. Estos cebadores degenerados se diseñaron de modo que las regiones V amplificadas codificaran de todos modos extremos N auténticos.

Se purificó ARN total de células de hibridoma B9 usando reactivo TRIzol (Life Technologies Nº de Cat. 15596-026) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN se precipitó con isopropanol y se disolvió en agua destilada. Se transcribieron inversamente cien ng de ARN con un kit de RT-PCR según las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim Nº 1483-188) usando oligo-dT para el cebado. Para la cadena pesada, se realizó amplificación por PCR del híbrido de ARN/ADN durante 25 ciclos usando un cebador inverso CH1 de IgG_{1} murino: 5' AGG GGC CAG TGG ATA GAC 3' [SEC ID Nº 18] y un cebador directo degenerado basado en la secuencia de proteína VH N-terminal SBA3204: 5' GCT ACC GGT GTC CAC TCC CAA GTN CA(A/G) CTN CA(A/G) CA
3' [SEC ID Nº 19].

Análogamente, para la cadena ligera, se realizó amplificación por PCR del híbrido de ARN/ADN durante 25 ciclos usando un cebador inverso kappa murino SBA0352: 5' GCA CCT CCA GAT GTT AAC TGC 3' [SEC ID Nº 20] y un cebador directo degenerado basado en la secuencia de proteína Vk N-terminal SBA9258: 5' GCT ACC GGT GTC CAC TCC GA(C/T) AT(A/C/T) CA(A/G) ATG ACN CA 3' [SEC ID Nº 21]. El ADN de PCR se analizó en un gel de agarosa al 0,8%. Los insertos de PCR del tamaño apropiado, -400 pb, se secuenciaron mediante una modificación del procedimiento de Sanger.

La secuencia de 5 clones de cadena ligera y 5 de pesada se compararon para generar una secuencia de región variable de cadena pesada B9 de consenso (Fig. 1C: [SEC ID Nº 4 y 5]) y una secuencia de región variable de cadena ligera 3G9 de consenso (Fig. 2C: [SEC ID Nº 9 y 10]). Las CDR se muestran en negrita. Las 17 primeras bases de la secuencia de ADN para las cadenas pesadas y ligeras se generaron con cebadores de PCR, sin embargo la secuencia de proteína traducida es exacta.

C. Humanización de B9

El anticuerpo B9 humanizado como se describe en este documento está constituido por la cadena pesada de consenso sintética B9HZHC1-0 [SEC ID Nº 4] de la Fig. 1C, y la cadena ligera de consenso sintética B9HZLC1-0 [SEC ID Nº 9] de la Fig. 2C. El anticuerpo se construyó de la siguiente manera:

i. Construcción de B9HZHC1-0

Se diseñó una región variable de cadena pesada humanizada sintética usando marcos de secuencia consenso del subgrupo I de cadena pesada humana de acuerdo con lo definido por Kabat y las CDR de cadena pesada de B9 murino, descritas anteriormente. Se introdujeron ocho sustituciones de aminoácidos marco murino que podían influir en la presentación de CDR (véase asteriscos en la Fig. 1C). Se sintetizaron cuatro oligonucleótidos sintéticos solapantes con las siguientes secuencias:

6

\hskip0,5cm

7

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8

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y

9

Cuando hibridan y se extienden, las secuencias de oligonucleótidos codifican los aminoácidos de la región V de la cadena pesada humanizada (véase Fig. 3; [SEC ID Nº 11 y 12]). Este gen sintético se amplificó por PCR con los cebadores SBB0191: 5 = TTA ACC GGT GTC CAC TCC CAA GTT CAG 3 = [SEC ID Nº 36] y SBB0192: 5 = GCT GGG GCC CTT GGT ACT AGC TGA GGA 3 = [SEC ID Nº 37] y se ligaron al vector de clonación pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, Nº de Cat. K2000-01), y se aislaron después de una digestión de restricción en AgeI, ApaI.

Este fragmento de ADN se ligó en el vector pCDHCAGE que se había digerido con restricción previamente con AgeI y ApaI. pCDHCAGE es una variante de los plásmidos pCDN [Nambi y col., 1994, Mol. Cell. Biochem., 131:75-85] y F9HZLC1-1-pCN [Publicación de Patente Internacional Nº WO94/05690]. Estos vectores de plásmido variantes de pCDN contienen, en general, un gen de beta lactamasa, un origen de replicación SV40, una secuencia promotora de citomegalovirus, una cadena ligera humanizada seleccionada, una señal poli A para hormona del crecimiento bovina, un promotor de betaglobina, un gen de resistencia a neomicina, y otra secuencia señal poli A para BGH en un trasfondo pUC19. pCDHCAGE contiene además la secuencia líder de inmunoglobulina CAMPATH en la que se ha introducido un único sitio AgeI en el extremo 3', una secuencia de engarce seguida de secuencias codificantes de cadena pesada ininterrumpidas que comienzan en un único sitio ApaI en el extremo 5' de la región CH1 humana, hasta el final de la región CH3 humana. El gen resultante codifica una cadena pesada humanizada completa, que comprende el codón de inicio, el péptido líder CAMPATH, la región VH humanizada, y una región constante de IgG_{1} completa. Esta construcción de expresión se denomina pCDB9HZHC1-0, y cuando se cultiva en una célula huésped adecuada, produce una cadena de IgG_{1} humana completa con la región V de cadena pesada de B9 humanizada B9HZHC1-0 (Fig. 1C; [SEC ID Nº 4 y 5]).

ii. Construcción de B9HZLC1-0

Se diseñó una región variable de cadena ligera humanizada sintética usando un marco de consenso de región variable del subgrupo I de cadena ligera humana de acuerdo con lo descrito por Kabat, y las CDR de cadena ligera de B9 como se ha descrito anteriormente. Se introdujo una sustitución de aminoácidos marco murino que podía influir en la presentación de CDR (véase asterisco en la Fig. 2C: [SEC ID Nº 9 y 10]). Se generaron cuatro oligonucleótidos sintéticos solapantes con las siguientes secuencias:

10

\hskip0,5cm

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

14

Cuando hibrida y se extiende, la secuencia de oligonucleótidos codifica los aminoácidos de la región Vk de B9 humanizada, B9HZLC1-0 (véase Fig. 4 [SEC ID Nº 13 y 14]).

Esta región Vk sintética se amplificó después por PCR usando los cebadores SBB0034: 5' TTT TTG GCT ACC GGT GTC CAC TCC GAT ATT CAG 3' [SEC ID Nº 26] y SBB0035: 5' ACG GGT ACC TCC ACC GAA CGT CCA AGG 3' [SEC ID Nº 27] y se ligaron al vector de clonación pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, Nº de Cat. K2000-01), y se aislaron después de una digestión de restricción con AgeI, KpnI.

\newpage

Este fragmento de ADN se ligó al vector pCNLCAGE que se había digerido previamente con restricción con AgeI y KpnI. pCNLCAGE es una variante de los plásmidos pCDN [A. Nambi y col., 1994, Mol. Cell. Biochem., 131: 75-85] y F9HZLC1-1-pCN [Publicación de Patente Internacional Nº WO94/05690]. Estos vectores variantes del plásmido pCDN contienen, en general, un gen de beta lactamasa, un origen de replicación SV40, una secuencia promotora de citomegalovirus, una cadena ligera humanizada seleccionada, una señal poli A para hormona del crecimiento bovina, un promotor de betaglobina, un gen de resistencia a neomicina, y otra secuencia señal poli A para BGH en un trasfondo pUC19. pCNLCAGE contiene además la secuencia líder de inmunoglobulina CAMPATH en la que se ha introducido un único sitio AgeI en el extremo 3', una secuencia de engarce seguida de secuencias codificantes de cadena ligera ininterrumpidas que comienzan en un único sitio KpnI en el medio de la región Jk humana hasta el final de la región Ck humana (es decir, la región constante de cadena ligera del isotipo k, en oposición al isotipo lambda). El gen resultante codifica una cadena ligera humanizada completa, que comprende el codón de inicio en el extremo del dominio Ck. Esta construcción de expresión se denomina pCNB9HZLC1-0, y cuando se cultiva en una célula huésped adecuada, produce una cadena k humana completa con la región V de cadena ligera de B9 humanizada B9HZLC1-0 (Fig. 2C; [SEC ID Nº 9 y 10]).

D. Expresión de Anticuerpo Humanizado en células de Mamífero

El vector de cadena pesada pCDB9HZHC1-0 y el vector de cadena ligera pCDB9HZLC1-0 descritos anteriormente, se usaron para producir anticuerpo HuB9 en células COS y células CHO.

Para la caracterización inicial, las cadenas pesada y ligera del HuB9 humanizado se expresaron en células COS esencialmente como se describe en Current Protocols in Molecular Biology (editado por F. M. Ausubel y col., 1988, John Wiley & Sons, vol. 1, sección 9.1). Descrito brevemente, las células COS se co-transfectaron con 10 \Phig de cada plásmido. En el día 1 después de la transfección, el medio de cultivo se sustituyó con un medio sin suero que se cambió el día 3. El medio sin suero era una formulación patentada, pero se obtienen resultados satisfactorios usando DMEM suplementado con TTS^{TM} Premix (mezcla de insulina, transferrina, selenio - Collaborative Research, Bedford, MA) y 1 mg/ml de BSA. El mAb se aisló y preparó a partir del medio acondicionado del día 3 + día 5 mediante procedimientos de cromatografía de afinidad de proteína A convencionales (por ejemplo, como se describe en Protocols in Molecular Biology) usando, por ejemplo resina de afinidad Prosep A (Bioprocessing Ltd., UK).

El B9 humanizado se expresó en forma de una molécula kappa \gamma_{1}, en células COS transfectadas de forma transitoria. Se descubrió que los sobrenadantes de este cultivo se unen al receptor \alpha_{v}\beta_{3} y al receptor \alpha_{v}\beta_{5} en ensayos ELISA y BIAcore descritos anteriormente.

Para producir grandes cantidades de los mAb HuB9 (100-200 mg), los plásmidos se introdujeron en un sistema de células CHO patentado, la línea celular CHO-Ela. Esta línea celular proporciona mayores cantidades de mAb (aproximadamente 10 mg de cada uno) y permite ensayar el perfil de actividad de anticuerpos quiméricos y humanizados. Sin embargo, se obtendrán resultados similares usando células CHO dhfr^{-} como se ha descrito anteriormente [P. Hensley y col., citado anteriormente]. En resumen, se electroporan un total de 30 \Phig de ADN de plásmido linealizado (15 \mug de cada uno de los plásmidos de cadena pesada o ligera) en 1 x 10^{7} células. Las células se seleccionan inicialmente en medio sin nucleósidos en placas de 96 pocillos. Después de tres a cuatro semanas, se seleccionan medios de pocillos de crecimiento positivo para inmunoglobulina humana usando el ensayo ELISA del Ejemplo 3. Las colonias de mayor expresión se multiplican y seleccionan en concentración en aumento de metotrexato para la amplificación de los vectores transfectados. El anticuerpo se purifica a partir de medio acondicionado mediante procedimientos convencionales usando cromatografía de afinidad de proteína A (Protein A sepharose, Pharmacia) seguida de cromatografía de exclusión por tamaños (Superdex 200, Pharmacia).

La concentración y la actividad de unión al antígeno del anticuerpo eluido, se miden mediante los ensayos de ELISA de los Ejemplos 3 y 4. Las fracciones que contienen el anticuerpo se reúnen y se purifican adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

Ejemplo 12 Construcción de B9HZREI y otras variantes humanizadas

Una segunda construcción tiene una cadena ligera basada en el marco de consenso REI humano para proporcionar una cadena ligera alternativa en el caso de expresión inestable en líneas celulares de producción de B9 humanizado. Esta variante difiere de B9HZLC1-0 solamente en dos intercambios de aminoácidos conservativos, L73F y F83I (convención de numeración de Kabat).

Descrito brevemente, se diseñó una cadena ligera kappa humanizada en base a un marco de cadena kappa REI humana modificada de la Fig. 5 [SEC ID Nº 15] y las CDR de Vk de B9 descritas anteriormente. Como para B9HZLC1-0, se introdujo solamente un resto marco donador (B9), en una posición identificada en experimentos de modelado que podía influir en la presentación de CDR. Se usó mutagénesis sitio-dirigida para incorporar los intercambios de aminoácidos L73F y F83I en el intermedio de B9HZLC1-0 (Fig. 4 [SEC ID Nº 13 y 14]). Después de la digestión con AgeI-KpnI, el fragmento basado en REI se clonó en pCNLCAGE digerido con AgeI-KpnI como se ha descrito para B9HZLC1-0. La región V humanizada resultante era la del B9HZLCREI de la Fig. 6 [SEC ID Nº 28 y 29].

Se creó una tercera variante de cadena ligera humanizada de B9 que difería de B9HZLC1-0 en el único intercambio de aminoácidos K103N (convención de numeración de Kabat). Esta variante se creó mediante mutagénesis sitio-dirigida del intermedio B9HZLC1-0 (Fig. 4 [SEC ID Nº 13 y 14]) y se clonó en pCNLCAGE como se ha descrito anteriormente. La región V humanizada resultante era la del B9HZLC1-1 de la Fig. 7 [SEC ID Nº 30 y 31].

Se creó una variante isotípica de IgG4 de B9HZHC1-0 clonando el fragmento AgeI-ApaI de la cadena pesada sintética del intermedio B9HZHC1-0 (Fig. 3; [SEC ID Nº 11 y 12]) en un vector de expresión de IgG_{4} digerido con AgeI-ApaI. Este vector, pCDHCAGEG4, es un derivado de pCDHCAGE en el que la región C de IgG_{4} sustituye a las secuencias de la región C de IgG_{1}. La construcción resultante codifica una cadena pesada de IgG_{4} completa con la región variable de B9HZHC1-0.

Ejemplo 13 Modelo SCID de cáncer

El modelo SCID, en el que se injerta piel humana en el ratón SCID, que sirve como fuente de neovascularización angiogénica, y posteriormente acepta tumor humano (crecimiento tumoral apoyado por la vasculatura humana), se utiliza para ensayar la eficacia de los anticuerpos mAb B9 y HuB9. La inhibición del crecimiento tumoral indica que los mAb B9 (anti-\alpha_{v}\beta_{3} y anti-\alpha_{v}\beta_{5} humanos positivos, anti-\alpha_{v}\beta_{3} murino negativo) juegan un papel en la inhibición de la angiogénesis dependiente de \alpha_{v}\beta_{3}.

También se ensayan las actividades in vivo de los anticuerpos de esta invención en otros modelos de mamífero de metástasis cancerosa, artritis reumatoide y aterosclerosis, por ejemplo modelos de babuino.

Ejemplo 14 Modelo de xenoinjerto tumoral en ratón con HT29

El modelo de xenoinjerto en ratón SCID con células tumorales humanas HT29 demostró que los mAb de B9 tienen actividad anti-tumoral. La actividad de los mAb B9 se evaluó modificando el modelo. En el primer experimento, las células se inyectaron por vía intraperitoneal y el tratamiento también fue intraperitoneal. El efecto de los mAb sobre el crecimiento tumoral mostró que el tamaño del tumor de los animales tratados era 6,5 veces más pequeño. Véase la Fig. 8.

En el segundo modelo experimental, las células se inyectaron por vía subcutánea. El tratamiento era mediante inyección intraperitoneal, dos veces por semana a 1 mg/dosis de mAb B9 (n = 8). Los resultados indicaban que los animales sin el tratamiento tenían tumores 2-3 veces más grandes que los animales tratados con los mAb B9. El tumor subcutáneo es un sistema más vigoroso que el tumor intraperitoneal descrito anteriormente. Véase la Fig. 9.

La inmunohistología en los tumores de ambos modelos mostró que los tumores de control no tratados eran positivos para B9 (marcado directo con B9 biotinilado). Los tumores de los ratones tratados eran negativos para B9.

Ejemplo 15 Modelo de angiogénesis del anillo de la aorta humana

Este ensayo in vitro se realiza para medir la actividad anti-angiogénica. La aorta torácica humana se extrae y se corta en secciones de aproximadamente 1 mm y se coloca en placas de cultivo de 24 pocillos que contienen una matriz tridimensional. Las células endoteliales forman capilares similares a vasos que se ramifican a partir de la aorta. Se introducen mAb B9 en este sistema y se estudia su efecto sobre la angiogénesis.

Los resultados de los Ejemplos 3 a 10 establecen que los anticuerpos B9 y HuB9 tienen potente actividad anti-receptor in vitro y es probable que muestren eficacia profiláctica y terapéutica in vivo en modelos animales. Por tanto, los anticuerpos B9 y HuB9 son candidatos para aplicación terapéutica, profiláctica y de diagnóstico en el hombre.

<110> Jonak, Zdenka L.

\hskip1cm

Taylor, Alexander H.

\hskip1cm

Trulli Jr., Stephen H.

\hskip1cm

Johanson, Kyung O.

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Anticuerpos Monoclonales Humanizados

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> P50860

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/199.149

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 24-11-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> B9 murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(354)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> B9 murino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210>3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> VH Kabat subgrupo I

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> B9 humanizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(354)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> B9 humanizado

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> células murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> células murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

22

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Vk subgrupo I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> B9 humanizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(306)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> B9 humanizado

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 386

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> B9 murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(384)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> B9 murino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> B9 humano y murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS)

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(324)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> B9 humano y murino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> células humanas y murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> VH murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Val Gln Leu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Vk murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Xaa Ala Xaa Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador inverso murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggggccagt ggatagac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador directo murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctaccggtg tccactccca agtncarctn carca

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador inverso kappa murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacctccag atgttaactg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador directo degenerado murino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctaccggtg tccactccga yathcaratg acnca

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttggcta ccggtgtcca ctccgatatt cag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgggtacct ccaccgaacg tccaagg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> células humanas y murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(306)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> células humanas y murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

38

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 315

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> células humana y murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(315)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> células humana y murino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttaaccggtg tccactccca agttcag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctggggccc ttggtactag ctgagga

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (6)

1. El uso de un anticuerpo que neutraliza el receptor proteico \alpha_{v}\beta_{3} humano y el receptor proteico \alpha_{v}\beta_{5} humano que comprende una cadena pesada que tiene CDHR3 de:

RGVRGSMDY

en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad seleccionada entre el grupo constituido por; aterosclerosis, restenosis, cáncer, metástasis cancerosa, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular, osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Paget, hipercalcemia de tumores malignos, lesiones osteolíticas producidas por metástasis ósea, pérdida ósea debida a inmovilización, deficiencia de hormonas sexuales.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende las CDR de cadena pesada de la Fig. 1C.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende las CDR de cadena ligera de la Fig. 2C.

4. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo comprende la secuencia amino de cadena pesada Fig. 1C y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la Fig. 2C.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la Fig. 5.

6. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo funcional seleccionado entre el grupo constituido por; Fv, Fab, F(ab')_{2}.