ES2274549T3 - Compuestos para la inhibicion de la angiogenesis por terapia de genes . - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS DE TERAPIA GENETICA PARA INHIBIR LA ANGIOGENESIS ASOCIADA CON EL CRECIMIENTO DE TUMORES SOLIDOS, LA METASTASIS TUMORAL, LA INFLAMACION, LA PSORIASIS, LA ARTRITIS REUMATOIDE, LOS HEMANGIOMAS, LA RETINOPATIA DIABETICA, LOS ANGIOFIBROMAS, Y LA DEGENERACION MACULAR. SE PRESENTA UNA METODOLOGIA DE TERAPIA GENETICA PARA INHIBIR EL CRECIMIENTO TUMORAL PRIMARIO Y LA METASTASIS MEDIANTE TRANSFERENCIA GENETICA DE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO QUE CODIFICA UNA FORMA SOLUBLE DEL RECEPTOR DE LA QUINASA DE LA TIROSINA VEGF A UN ANFITRION MAMIFERO. LA SECUENCIA DE NUCLEOTIDO TRANSFERIDA TRANSCRIBE UN ARNM Y UNA PROTEINA RECEPTORA SOLUBLE QUE SE UNE CON UN VEGF EN REGIONES EXTRACELULARES ADYACENTES AL TUMOR PRIMARIO Y A LAS CELULAS ENDOTELIALES MUSCULARES. LA FORMACION DE UN COMPLEJO SVEGFR/VEGF EVITARA LA UNION DEL VEGF CON LOS RECEPTORES DE LA QUINASA DE TIROSINA KDR Y FLT-1, ANTAGONIZANDO LA TRANSDUCCION DE LAS SEÑALES INTRACELULARES NORMALES ASOCIADAS CON LA ANGIOGENESIS TUMORAL INDUCIDA POR LAS CELULAS ENDOTELIALES VASCULARES. ADEMAS, LA EXPRESION DE UNA QUINASA DE TIROSINA DE RECEPTOR SOLUBLE TAMBIEN PUEDE IMPARTIR UN EFECTO TERAPEUTICO UNIENDOSE BIEN CON O BEN SIN VEGFS PARA FORMAR HETERODIMEROS NO FUNCIONALES CON LOS RECEPTORES DE LA QUINASA DE TIROSINA DE LONGITUD COMPLETA ESPECIFICOS PARA EL VEGF Y, POR CONSIGUIENTE, INHIBIRA LAS ACTIVIDADES MITOGENICAS Y ANGIOGENICAS DEL VEGF.

Description

Compuestos para la inhibición de la angiogénesis por terapia de genes.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a compuestos útiles en la fabricación de un medicamento para uso en terapia de genes para la inhibición de la angiogénesis asociada con el crecimiento de tumores, inflamación, psoriasis, artritis reumatoide, hemangiomas, retinopatía diabética, angiofibromas, y degeneración macular.

Igualmente, esta invención se refiere a modelos animales útiles en la investigación de la inhibición de la angiogénesis mediada por terapia de genes. Además, la invención se refiere a vectores recombinantes que son útiles en los procedimientos de terapia de genes descritos.

Fundamentos de la invención

Las células endotelilaes vasculares forman una monocapa no trombogénica luminal a lo largo del sistema vascular. Los mitógenos promueven el desarrollo, crecimiento, reparación y angiogénesis vascular embriónica en estas células. La angiogénesis implica la degradación proteolítica de la membrana basal sobre la cual residen las células endoteliales, seguido de la subsiguiente migración quimiotáctica y mitosis de estas células para soportar el crecimiento sostenido de un nuevo brote capilar. Una clase de mitógenos selectivos para células endoteliales vasculares incluyen el factor de crecimiento endoletial vascular (denominado como VEGF o VEGF-A) y los homólogos del factor de crecimiento de la placenta (PIGF), VEGF-B y VEGF-C.

El VEGF humano existe en forma de un homodímero glucosilado en una de las cinco formas procesadas maduras que contienen 206, 189, 165, 145 y 121 aminoácidos, siendo la más prevalente la forma de 165 aminoácidos.

La Patente de EE.UU. No. 5.240.848, describe el nucleótido y la secuencia aminoácida que codifica la forma de 189 aminoácidos del VEGF humano.

La Patente de EE.UU. No. 5.332.671, describe el nucleótido y la secuencia aminoácida que codifica la forma de 165 aminoácidos del VEGF humano.

Charnock-Jones, y otros, (Biol. Reproduction, vol. 48, págs. 1120-1128, (1993)), describe el mRNA variante de corte y empalme del VEGF145.

La Patente de EE.UU. No. 5.194.596, describe el nucleótido y la secuencia aminoácida que codifica la forma de 121 aminoácidos del VEGF humano.

Las formas de 206 aminoácidos y de 189 aminoácidos del VEGF humano contienen, cada una de ellas, un inserto de 24 aminoácidos altamente básico que promueve la estrecha unión a heparina, y presumiblemente, a proteoglucanos de heparina sobre superficies celulares y dentro de matrices extracelulares (Ferrara, y otros, J. Cell. Biochem., vol. 47, págs. 211-218, (1991)). La forma VEGF165 se une a la heparina en un menor grado, en tanto que la VEGF122 no se une a la heparina.

Igualmente, el PlGF es un homodímero glucosilado que comparte un 46% de homología con el VEGF a nivel de proteína. El corte y empalme diferencial del mRNA del PlGF humano conduce o bien a un precusor de 170 aminoácidos o bien a uno de 149 aminoácidos, los cuales son proteolíticamente procesados a formas maduras de 152 ó 131 aminoácidos de longitud, respectivamente (Maglione, y otros, Oncogene, vol. 8, págs. 925-931, (1993); Hauser y Weich, Growth Factors, vol. 9, págs. 259-268, (1993)).

El VEGF-B ha sido recientemente aislado y caracterizado (Olofsson, y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 93, págs. 2576-2581, (1996); Grimmond, y otros, Genome Research, vol. 6, págs. 124-131, (1996)). Los cDNAs humanos de longitud total codifican precursores de 188 y 207 aminoácidos, en los que las porciones terminales NH_{2} son proteolíticamente procesadas a formas maduras de 167 y 186 aminoácidos de longitud. La expresión del VEGF-B humano se ha encontrado predominantemente en el corazón y músculo esquelético en forma de un homodímero ligado a un disulfuro. Sin embargo, el VEGF-B humano puede, igualmente, formar un heterodímero con el VEGF (id. @ 2580).

El VEGF-C ha sido, igualmente, recientemente aislado y caracterizado (Joukov, y otros, EMBO J., vol. 15, págs. 290-298, (1996)). Se obtuvo un cDNA que codifica el VEGF-C a partir de una línea de células de adenocarcinoma prostático humano. Se procesó proteolíticamente una proteína precursora de 32 kDa para generar la forma de 23 kDa madura, la cual se une al receptor tirosina quinasa, Flt-4.

El VEGF-D se identificó en una biblioteca EST, se clonó la región que codifica la longitud total y se reconoció como que era la más homóloga al VEGF-C entre las secuencias aminoácidas de la familia VEGF (Yamada, y otros, Genomics, vol. 42, págs. 483-488, (1997)). Se ha mostrado que el mRNA del VEGF-D humano está expresado en el pulmón y músculo.

El VEGF y sus homólogos imparten actividad mediante unión a receptores tirosina quinasa de ligamiento a la membrana de plasma de célula endotelial vascular, los cuales, a continuación, activan la transducción de la señal y las señales celulares. La familia del receptor Flt es un receptor tirosina quinasa principal que se une al VEGF con alta afinidad. Actualmente, la familia del receptor flt incluye el flt-1 (Shibuya, y otros, Oncogene, vol. 5, págs. 519-524, (1990)), KDR/flk-1 (Terman, y otros, Oncogene, vol. 6, págs. 1677-1683, (1991); Terman, y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 187, págs. 1579-1586, (1992)), y flt-4 (Pajusola, y otros, Cancer Res., vol. 52, págs. 5738-5843, (1992)).

La implicación del VEGF en la promoción de la angiogénesis del tumor ha producido estudios de investigación de posibles antagonistas del proceso. Tanto anticuerpos policlonales (Kondo, y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 194, págs. 1234-1241, (1993)) como monoclonales (Kim, y otros, Growth Factors, vol. 7, págs. 53-64, (1992); Kim, y otros, Nature, vol. 362, págs. 841-844, (1993)) generados contra el VEGF se ha mostrado que que suprimen la actividad del VEGF in vivo. Las estrategias de anticuerpos anti-VEGF para impedir la angiogénesis y su tumor acompañante han sido igualmente tratadas por Kim y otros (Nature, vol. 362, págs. 841-844, (1993)) y Asano y otros (Cancer Research, vol. 55, págs. 5296-5301, (1995)).

Kendall y Thomas (Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 90, págs. 10705-10709, (1993)), han aislado y caracterizado un cDNA que codifica una forma soluble secretada de flt-1 a partir de células endoteliales de vena umbilical humana cultivada (HUVEC). La versión recombinante de esta proteína se purificó mediante unión a heparina inmovilizada. Se mostró que el flt-1 soluble aislado inhibía la actividad del VEGF in vitro. No se describe ninguna sugerencia con respecto a protocolos de transferencia de genes.

Millauer y otros (Nature, vol. 367, págs. 576-579, (1994)), describe la inhibición in vivo de la angiogénesis de tumor mediante la expresión de un mutante flk-1 generado artificialmente, en el cual se ha eliminado el dominio quinasa intracelular pero no el anclaje de ligamiento de la membrana. Los autores no adelantan ninguna doctrina ni sugerencia de que un forma soluble de un receptor tirosina quinasa del VEGF sería útil en aplicaciones de terapia de genes.

La neovascularización de tumores malignos es un proceso integral que contribuye al crecimiento de tumor sólido y la progresión neoplástica (Kondo y otros, Biochemical & Biophysical Research Communications, vol. 194, págs. 1234-1241, (1993); Carrau y otros, Invasion & Metastasis, vol. 15, págs. 197-202, (1995)). En este contexto, diversos estudios han demostrado una correlación positiva entre neovascularización en tumores malignos y pobres resultados clínicos (Volm y otros, Anticancer Research, vol. 16, págs. 213-217, (1996); Toi y otros, Japanese Journal of Cancer Research, vol. 85, págs. 1045-1049, (1994); Shpitzer y otros, Archives of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, vol. 122, págs. 865-868, (1996); Staibano y otros, Human Pathology, vol. 27, págs. 695-700, (1996); Giatromanolaki y otros, J. of Pathology, vol. 179, págs. 80-88, (1996)). Aunque el proceso angiogénico tiene diversos mediadores, parece que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) puede ser un factor de crecimiento crítico con respecto a la iniciación de la cascada de episodios que estimulan la nueva formación de vasos sanguíneos en diversos tipos de tumores (Toi y otros, Cancer, vol. 77, págs. 1101-1106, (1996); Maeda y otros, Cancer, vol. 77, págs. 858-863, (1996); Anan y otros, Surgery, vol. 119, págs. 333-339, (1996)).

Aiello y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 92, págs. 10457-10461, (1995)), describe receptores del VEGF extracelulares quiméricos manipulados genéticamente para bloquear la angiogénesis en células no malignas.

A pesar de los recientes avances en la identificación de genes que codifican ligandos y receptores implicados en la angiogénesis, no se ha adelantado ninguna aplicación de terapia de genes que obvie el efecto perjudicial que este proceso tiene en la promoción del crecimiento de tumores primarios y la subsiguiente metástasis. La presente invención está destinada y satisface esta necesidad.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de terapia de genes para la inhibición de la angiogénesis inducida por el VEFG asociada con el crecimiento de tumor sólido, o metástasis de tumor. Estos trastornos están relacionados dado que el VEGF actúa como un mitógeno para estimular la angiogénesis local a partir de células endoteliales vasculares, lo cual, a su vez, exacerba la afección. Específicamente, se proporciona el uso de un DNA vector tal como se define en la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis de un tumor sólido o metastático en un huésped mamífero.

La presente invención se refiere a la transferencia de gen de un DNA vector y concomitantemente la expresión in vivo de una forma soluble de un receptor tirosina quinasa (sVEGF-R) dentro del huésped mamífero, el cual une el VEGF un VEGF homólogo en y alrededor del sitio localizado del trastorno. La formación de un complejo sVEGF-R/VEGF inhibiría la unión del VEGF a los receptores tirosina quinasa FLT-1 y KDR mediante ligamiento de la membrana de célula endotelial vascular, previniendo, de esta forma, la iniciación de la transducción de la señal que estimula la angiogénesis. Además, la expresión de sVEGF-R puede igualmente impartir un efecto terapéutico mediante la unión a VEGF-Rs asociados a la membrana. Se estima que los VEGF-Rs se dimerizan mediante la unión del ligando VEGF dimérico, lo cual, a su vez, permite a los dominios tirosina quinasa intracelulares del receptor transfosforilarse entre sí, generando restos tirosina fosforilados que facilitan la subsiguiente unión y activación de las proteínas de transducción de la señal más abajo. Los sVEGF-Rs pueden formar heterodímeros con VEGF-Rs de longitud total, lo cual, dado que los sVEGF-Rs están exentos de una región tirosina quinasa intracelular, previene la transfosforilación del dominio tirosina quinasa del receptor, la iniciación de la transducción de la señal y, de esta forma, la mitogénesis y angiogénesis inducida por VEGF en una manera negativa dominante.

Una aplicación preferida de la presente invención se refiere a compuestos para promover la inhibición de la angigénesis y metástasis de tumores sólidos mediante el uso de la metodología de terapia de genes descrita. En particular, se describen compuestos para la inhibición del crecimiento y metástasis de tumores primarios mediante la transferencia de genes de una secuencia nucleótida que codifica un sVEGF-R a un huésped mamífero. La secuencia nucleótida transferida transcribe el mRNA y expresa el sVEGF-R, de manera tal, que el sVEGF-R se une al VEGF en regiones extracelulares adyacentes al tumor primario y las células endoteliales vasculares. La formación de un complejo sVEGF-R/VEGF prevendrá la unión del VEGF a los receptores tirosina quinasa KDR y FLT-1, antagonizando la transducción de las señales intracelulares normales asociadas con la angiogénesis del tumor inducida por células endoteliales vasculares. Además, la expresión de sFLT-1 puede impartir, igualmente, un efecto terapéutico mediante la unión o bien con o bien sin VEGFs para formar heterodímeros no funcionales con VEGF-Rs de longitud total y, de esta forma, la inhibición de las actividades mitógenas y angiogénicas de los VEGFs.

En la presente invención, se usa en protocolos de terapia de genes una versión truncada de una forma transmembrana o soluble de FLT-1 (Shibuya, y otros, Oncogene, vol. 5, págs. 519-524, (1990)). Estará dentro del alcance del técnico experto el generar el constructo que exprese la proteína FLT-1 truncada que se una al VEGF, un VEGF homólogo y/o se dimerice con un VEGF-R de longitud total inhibiendo su activación sobre la membrana de plasma de superficie de células endoteliales vasculares (Figura 1). Un constructo de este tipo puede generarse mediante técnicas de DNA recombinantes conocidas en la técnica, usando un fragmento de DNA que codifica una secuencia aminoácida de un receptor FLT. Usando técnidas de DNA recombinantes, se construyeron moléculas de DNA que codifican al menos una porción del receptor de VEGF capaces de unirse al VEGF sin estimular o bien la mitogénesis o bien la angiogénesis. Se usaron técnicas de DNA recombinantes estándar tales como las descritas por Maniatis y otros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor University, Cold Spring Harbor, New York, (1982)).

En la presente invención, un DNA cortado y empalmado alternativamente expresado de manera natural que codifica una forma soluble de FLT-1 (Kendall y Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 90, págs. 10705-10709, (1993)) descrito aquí como sVEGF-RI o sFLT-1 y listado como SEC ID NO: 1 (secuencia nucleótida) y SEC ID NO: 2 (secuencia aminoácida) es el molde para la construcción de un vector de terapia de genes, en el que el sFLT-1 expresado se une al VEGF e inhibe la formación, dimerización y activación de los complejos de VEGF-Rs de longitud total y, en consecuencia, la angiogénesis patológica.

La presente invención se refiere tanto a vectores recombinantes víricos como no víricos para suministro a huéspedes diana. A tal fin, un plásmido recombinante no vírico preferido descrito aquí es el pcDNA3/sflt-1. Un plásmido recombinante especialmente preferido de la presente invención es el pcDNAIAsFLT-1, tal como se describe en la Sección Ejemplo 5.

Para suministro y expresión prolongada dentro de células diana próximas a un tumor sólido, se prefiere un sistema adenovirus (Ad) recombinante. Un sistema adnovirus particularmente útil usado en la presente invención, es el descrito en el Ejemplo 4.

El constructo puede suministrarse al huésped mamífero usando un vector u otro vehículo de suministro. Los vehículos de suministro de DNA pueden incluir vectores víricos tales como adenovirus, virus adeno-asociados, y vectores retrovíricos. Véanse, por ejemplo, Chu y otros, Gene Teraphy, vol. 1, págs. 292-299, (1994); Couture y otros, Hum. Gene Teraphy, vol. 5, págs. 667-677, (1994); y Eiverhand y otros, Gene Teraphy, vol. 2, págs. 336-343, (1995)). Los vectores no víricos, que son igualmente adecuados, incluyen DNA desprotegidos (véanse Secciones de Ejemplos 1, 2, 3 y 5), complejos DNA-lípidos, por ejemplo conjugados de ligando o mediado por liposoma/poli-L-lisina, tal como sistemas de suministro mediados por asialoglucoproteína. Véanse, por ejemplo, Felgner y otros, J. Biol. Chem., vol. 269, págs. 2550-2561, (1994); Derossi y otros, Restor. Neurol. Neuros., vol. 8, págs. 7-10, (1995); y Abcallah y otros, Biol. Chem., vol. 85, págs. 1-7, 1995)). Se prefiere que células locales tales como células de tejido adiposo o células de músculo liso, así como células del tumor, sean dianas para suministro y concomitantemente expresión in vivo de la proteína sVEGF-R respectiva, con el fin de promover la inhibición de la angiogénesis del tumor.

Un Ad/sVEGF-RI recombinante es un virus preferido para células diana próximas a un tumor sólido.

Un virus Ad/sVEGF-RI recombinante especialmente preferido es el AdHCMVsFLT-1.

Otro virus Ad/sVEGF-RI recombinante especialmente preferido es el AdHCMVI1sFLT.

El constructo puede ser dirigido fundamentalmente a células endoteliales vasculares próximas al crecimiento del tumor. Los vehículos de suministro de DNA descritos anteriormente pueden ser usados para identificar el constructo de transferencia de genes a células endoteliales vasculares del huésped mamífero.

Tal como se usa aquí, "VEGF" o "VEGF-A" se refiere al factor de crecimiento endotelial vascular.

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Tal como se usa aquí, "homólogo de VEGF" se refiere a homodímeros de VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y PlGF y a cualquier heterodímero funcional formado entre VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y PlGF, incluyendo pero sin limitarse a él, un heterodímero VEGF-A/PlGF.

Tal como se usa aquí, "VEGF-B" se refiere al factor B de crecimiento endotelial vascular.

Tal como se usa aquí, "VEGF-C" se refiere al factor C de crecimiento endotelial vascular.

Tal como se usa aquí, "VEGF-D" se refiere al factor D de crecimiento endotelial vascular.

Tal como se usa aquí, "KDR" o "FLK-1" se refiere al receptor que contiene el dominio del inserto quinasa o quinasa de hígado fetal.

Tal como se usa aquí, "FLT-1" se refiere a receptor de tirosina quinasa tipo fms.

Tal como se usa aquí, "Ad" se refiere a adenovirus.

Tal como se usa aquí, "HUVEC" se refiere a célula(s) endotelial de vena umbilical humana.

Tal como se usa aquí, el término "huésped mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo un ser humano.

Tal como se usa aquí, "sVEGF-R" se refiere genéricamente a una forma soluble de un receptor de tirosina quinasa que se une a su factor de crecimiento endotelial vascular respectivo tal como VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y PlGF sin estimulación de la activación, mitogénesis de células endoteliales vasculares o angiogénesis del receptor.

Tal como se usa aquí, "sVEGF-RI" o "sFLT-1" se refiere a la forma soluble humana nativa de sFLT y presentada aquí en forma de cDNA (comprendiendo la SEC ID NO: 1) y la forma proteína (SEC ID NO: 2).

Tal como se usa aquí, "VEGF-Rs" se refiere a un receptor de tirosina quinasa específico del homólogo del VEGF/VEGF de tipo salvaje humano, tal como FLT-1 y KDR.

Tal como se usa aquí, "mVEGF-R" se refiere genéricamente a un receptor de tirosina quinasa específico del homólogo del VEGF/VEGF de tipo salvaje humano, tal que está unido a la membrana, incluyendo pero silimitarse a FLT-1, VEGF-RTMI, KDR, y VEGF-RTMII, tal como se muestra en la Figura 1.

Un objeto de la presente invención es el proporcionar compuestos para inhibir la angiogénesis y el crecimiento de tumores sólidos.

Igualmente, un objeto de la presente invención es usar sVEGF-RI en la fabricación de un medicamento para uso en procedimientos de terapia de genes, para inhibir la angiogénesis y el crecimiento de tumores sólidos.

Un objeto de la presente invención es describir modelos animales para la determinación de la eficacia de construcciones basadas en FLT-1 para el suministro de células y expresión in vivo en el huésped mamífero.

Un objeto de la presente invención es proporcionar vectores de DNA recombinantes que contienen constructos sVEGF-RI para uso en terapia de genes con el fin de inhibir localmente la angiogénesis en un huésped mamífero.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de VEGF-Rs (FLT-1 y KDR) de longitud total, los receptores de VEGF solubles (sVEGF-RI y sVEGF-RII) y los receptores solubles que contienen la región transmembrana C-terminal (sVEGF-RTMI y sVEGF-RTMII), con los dominios proteína de cada uno.

La Figura 2 muestra la secuencia nucleótida que codifica el sFLT-1 humano [sVEGF-RI] (SEC ID NO: 1).

La Figura 3A y la Figura 3B muestran la secuencia aminoácida de sFLT-1 humano [sVEGF-RI] (SEC ID NO: 2).

La Figura 4 muestra la inhibición del crecimiento de nódulos de tumor en ratones desnudos para células de ratón HT-1080 transfectadas transitoriamente con pcDNA3/sflt-1 (o) o pcDNA3 (\medbullet). El día 0 se inyectaron 3 x 10 células.

La Figura 5 muestra la inhibición del crecimiento de nódulos de tumor en ratones desnudos para células de ratón HT-1080 transfectadas de manera estable con pcDNA3/sflt-1 (\medbullet) o pcDNA3 (o).

La Figura 6 muestra la representación de supervivencia de ratones scid inyectados con (a) células de glioblastoma humano D-54MG transfectadas de manera estable con pcDNA3 (\blacksquare); (b) células de glioblastoma humano D-54MG transfectadas de manera estable con pcDNA-sflt-1 (\boxempty); y (c) células de glioblastoma humano D-54MG no transfectadas (\medbullet).

La Figura 7 muestra puntos de datos adicionales procedentes del experimento detallado en la Figura 6, fundamentalmente el que usó un modelo de glioma humano de ratón scid CB-17 para confirmar el efecto de la expresión estable de sflt-1 sobre el crecimiento del tumor y la supervivencia. (a) células de glioblastoma humano D-54MG transfectadas de manera estable con pcDNA3 (\blacksquare); (b) células de glioblastoma humano D-54MG transfectadas de manera estable con pcDNA-sflt-1 (\ding{115}); células de glioblastoma humano D-54MG no transfectadas (o).

La Figura 8 muestra que el crecimiento del tumor en ratones, medido mediante el volúmen y masa promedio (\pmSD), fue significativamente inhibido por la expresión del gen sflt-1 (ensayo T de Student de 1 medida, p<0,0001 para comparación de masas) subclonado dentro de pCDNA1A3, dando como resultado pcDNAIAsFLT-1.

La Figura 9 muestra que las masas del tumor en ratones de células que expresan sFLt-1 fueron significativamente menores que, o bien las células de control tratadas con adenovirus (p = 0,035), o bien las células de control no tratadas con virus (p = 0,007) usando el ensayo T de Student de 1 medida apropiado.

Descripción detallada de la invencion

Tal como se describe más adelante, el suministro in vivo de un constructo de DNA que codifica el sVEGF-R está dirigido a células y tejidos que circundan el tumor, incluyendo pero sin limitarse a ellas, células endoteliales vasculares, células de músculos, células adiposas, así como células de tumores y tejidos que circundan dicho tejido de músculo y tejido adiposo.

La presente invención se refiere, igualmente, a compuestos para el tratamiento terapéutico de la extensión metastática de tumores, la causa principal de mortalidad por cáncer. Las células de tumores pueden metastatizarse mediante entrada dentro del sistema circulatorio, transporte a sitios distantes, re-implantación dentro de los tejidos circundantes y crecimiento. La inhibición de cualquier etapa en este proceso sería de esperar que inhibiera el establecimiento final y crecimiento de focos metastáticos. A tal fin, un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de los constructos para terapia de genes de la presente invención, para inhibir la extensión metastática de tumores. La significativa inhibición del establecimiento de focos de pulmón metastático HT1080 mediante la expresión de sflt tal como se muestra en el Ejemplo 2, muestra que el sflt es eficaz en la inhibición de este proceso. El experimento de inyección en la vena de la cola de células HT1080 transfectadas con sflt-1, monitorizó la implantación y/o crecimiento de células de tumores circulantes, dos de las etapas cruciales en la extensión metastática. Se considera que el sflt puede disminuir la eficacia de la extravasación de células de tumores fuera de la sangre y dentro del tejido circundante, posiblemente por la inhibición de la permeabilidad vascular inducida por VEGF, lo cual podría facilitar la migración de la célula a través de las paredes de los vasos. Adicionalmente, la expresión de sFlt se espera que interrumpa el desarrollo neovascular dentro de focos metastáticos, disminuyendo, de esta forma, su crecimiento y/o viabilidad.

El molde para la puesta en práctica de la presente invención es el cDNA que codifica una forma soluble de FLT-1 (sVEGF-RI), descrito por Kendall y Thomas (Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 90, págs. 10705-10709, (1993)). En resumen, se aisló un clon de cDNA que codifica el sVEGF-RI en una vía de dos etapas usando tecnología basada en la reacción de cadena de polimerasa (PCR) y rastreo de la biblioteca de cDNA. En la primera etapa, se usaron oligonucleótidos de DNA derivados a partir de la información de la secuencia del dominio extracelular procedente de FLT, KDR u otro receptor de VEGF de longitud total conocida, para diseñar cebadores oligonucleótidos para la amplificación de fragmentos de DNA específicos de sVEGF-R. En la segunda etapa, estos fragmentos se clonaron con el fin de servir como sondas para el aislamiento del cDNA de sVEGF-R completo procedente de una biblioteca de cDNA de lambda gt10 comercialmente disponible (Clontech) derivada a partir de HUVECs (ATCC CRL 1730). Este cDNA de sVEGF-RI expresa alternativamente una forma cortada y empalmada del mRNA del precursor FLT-1 que incluye 31 restos aminoácidos únicos en el C-terminal que no se encuentran en FLT-1 (véase Figura 2 y SEC ID NO: 1 para la secuencia nucleótida y Figura 3 y SEC ID NO: 2 para la secuencia aminoácida). Estos 31 restos únicos están codificados por un intrón que no es eliminado en esta versión alternativamente cortada y empalmada. El mRNA alternativamente cortado y empalmado se tradujo dentro de esta región intrón hasta que se encontró el primer codón de parada. Este molde (sflt-1 o sVEGF-RI) para un vector para terapia de genes expresará el sVEGF-RI in vivo y se unirá al VEFG y/o se heterodimerizará con VEGF-Rs de longitud total (p. ej., VEGF-RI/FLT-1 y VEGF-RII/KDR), inhibiendo, de esta forma, la angiogénesis del tumor.

El cDNA de sVEGF-RI clonado obtenido a través de los procedimientos descritos anteriormente, puede expresarse de manera recombinante mediante clonación molecular dentro de un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de transcripción apropiados, y ser transferido dentro de células huéspedes procarióticas o eucarióticas, para producir sVEGF-RI recombinante. Las técnicas para dichas manipulaciones están completamente descritas por Maniatis y otros (véase cita anterior), y son bien conocidas en la técnica.

Tal como se ha indicado anteriormente, una realización preferida de la presente invención se refiere a compuestos útiles en la fabricación de un medicamento para uso en procedimientos de inhibición de la angiogénesis de tumores sólidos con el fin de prevenir un adicional crecimiento del tumor y una eventual metástasis. A tal fin, cualquier tumor sólido o la región que circunda al tumor accesible a la transferencia de genes será una diana para las aplicaciones terapéuticas descritas. Un gen sVEGF-RI alojado dentro de un sistema de transferencia de genes con base vírica o no vírica recombinante, puede ser dirigido a células diana situadas en la proximidad del tumor mediante cualquiera de entre un cierto número de procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a ellos, (a) procedimientos quirúrgicos asociados con la administración de una cantidad eficaz del DNA en el sitio en y alrededor del tumor (lo que implica la eliminación inicial de una porción o del tumor completo, si es posible); (b) inyección del vehículo de transferencia de genes directamente dentro o adyacente al sitio del tumor; y, (c) suministro localizado o sistémico del vector de transferencia de genes y/o del producto de genes usando técnicas conocidas en la técnica; tal como se enumeran más adelante.

De acuerdo con ello, cualquier tumor sólido que contenga células que expresen el VEGF serán una diana potencial para el tratamiento. Los ejemplos, pero sin entender su enumeración como una limitación, de tumores sólidos que serán particularmente vulnerables a las aplicaciones de terapia de genes de sVEGF-RI, son: (a) neoplasmas del sistema nervioso central tal como, pero nuevamente no necesariamente limitados a ellos, glioblastomas, astrocitomas, neuroblastomas, meningiomas, ependimomas; (b) cánceres de tejidos dependientes de hormonas tales como próstata, testiculares, útero, cervix, ovarios, carcinomas mamarios incluyendo pero no limitado a ellos, carcinoma in situ, carcinoma medular, carcinoma tubular, carcinomas invasivos (infiltrantes) y carcinomas mucinosos; (c) melanomas, incluyendo pero sin limitarse a ellos, cutáneos y melanomas oculares; (d) cánceres del pulmón que incluyen al menos carcinoma de célula escamosa, carcinoma fusiforme, carcinoma de célula pequeña, adenocarcinoma y carcinoma de célula grande; y (e) cánceres del sistema gastrointestinal tal como esófago, estómago, intestino delgado, colon, colorectal, rectal y región anal, lo cual incluye al menos adenocarcinomas del intestino grueso.

Los vectores de expresión se definen aquí como secuencias de DNA que se requieren para la transcripción de copias clonadas de genes y la traducción de sus mRNAs en un huésped apropiado. Dichos vectores pueden usarse para expresar genes eucarióticos en una diversidad de huéspedes tales como bacterias, algas azulverdosas, células de hongos, células de levaduras, células de plantas, células de insectos y células de animales.

Los vectores diseñados específicamente permiten el cambio de DNA entre huéspedes tales como células de bacteria-levadura o bacteria-animal o bacteria-insecto. Un vector de expresión construido de manera apropiada debería contener: un origen de replicación para replicación autónoma en células huéspedes, marcadores seleccionables, un número limitado de sitios de enzima de restricción útiles, un potencial para alto número de copias, y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de DNA que dirige la RNA polimerasa para unirse al DNA e iniciar la síntesis de RNA. Un promotor fuerte es aquel que da lugar a que se inicien mRNAs con alta frecuencia. Los vectores de expresión pueden incluir, pero sin limitarse a ellos, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, virus o plásmidos diseñados específicamente.

Para expresar sVEGF-RI recombinante en células de mamíferos, pueden usarse una diversidad de vectores de expresión de mamíferos. Los vectores de expresión de mamíferos comercialmente disponibles que pueden usarse de manera adecuada para la expresión de sVEGF-RI recombinante incluyen, pero sin limitarse a ellos, pcDNA3.1 (Invitrogen), pBlueBacHis2 (Invitrogen), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 y pLITMUS39 (New England Biolabs), pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), y \lambdaZD35 (ATCC 37565).

El DNA que codifica un sVEGF-RI puede clonarse, igualmente, dentro de un vector de expresión para expresión en una célula huésped recombinante. Las células huéspedes recombinantes pueden ser procarióticas o eucarióticas, incluyendo pero sin limitarse a ellas, células de bacterias, levaduras, mamíferos incluyendo, pero sin limitarse a ellas, líneas de células de origen humano, bovino, porcino, mono y roedor, y líneas de insectos, incluyendo pero sin limitarse a ellas, líneas de células derivadas de drosofila, polilla, mosquito y larva de polilla. El vector de expresión puede introducirse dentro de las células huéspedes a través de uno cualquiera de entre un cierto número de técnicas, incluyendo pero sin limitarse a ellos, transformación, transfección, complejos de DNA de Ad/polilisina, fusión del protoplasto, y electroporación. Las líneas de células derivadas a partir de especies de mamíferos que pueden usarse de manera adecuada y las cuales se encuentran comercialmente disponibles, incluyen pero limitarse a ellas, CV-1 (ATCC CCL 70),
COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CRL 171) y células HEK 293. Las líneas de células de insectos que pueden usarse de manera adecuada y las cuales se encuentran comercialmente disponibles, incluyen pero limitarse a ellas, 3M-S (ATCC CRL 8851), polilla (ATCC CCL 80), mosquito (ATCC CCL 194 y 195; ATCC CRL 1660 y 1591) y larva de polilla (Sf9, ATCC CRL 1711).

Un fragmento que codifica un sVEGF-RI puede suministrarse bien sistémicamente o bien a células diana en la proximidad de un tumor sólido del huésped mamífero mediante procedimientos a base de virus o de no virus. Los sistemas de vectores víricos que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus; (c) vectores de virus adeno-asociados; (d) vectores del virus herpes simplex; (e) vectores SV 40; (f) vectores de virus polioma; (g) vectores de virus papiloma; (h) vectores de picarnovirus; e (i) vectores de virus vaccinia. Los procedimientos no víricos de suministro incluyen, pero sin estar necesariamente limitados a ellos, inyección directa de DNA desprotegido, tal como un vector de expresión de DNA plasmido recombinante descrito aquí, que comprende un fragmento de DNA que codifica al sVEGF-RI.

De acuerdo con ello, la presente invención se refiere a vectores recombinantes no víricos para suministro a los huéspedes diana. A tal fin, un plásmido recombinante preferido descrito aquí es el pcDNA3/sflt-1. Un plásmido recombinante especialmente preferido de la presente invención es el pcDNAIAsFLT-1, tal como se describe en la Sección Ejemplo 5.

Para suministro y expresión prolongada dentro de células diana próximas a un tumor sólido, se prefiere un sistema de adenovirus (Ad) recombinante. En el Ejemplo 4 se describe un sistema de adenovirus particularmente útil usado en la presente invención.

Un Ad/sVEGF-RI recombinante es un virus preferido para la identificación de células próximas a un tumor sólido.

Un virus Ad/sVEGF-RI recombinante especialmente preferido es el AdHCMVsFLT-1.

Otro virus Ad/sVEGF-RI recombinante especialmente preferido es el AdHCMVI1sFLT.

Los virus Ad/sVEGF-RI recombinantes de la presente invención, que incluyen AdHCMVsFLT-1 y AdHCMVI1sFLT, son administrados preferiblemente al huésped mediante inyección directa dentro de un tumor sólido y/o tejido quiescente próximo al tumor sólido, tal como tejido adiposo o de músculo. Por supuesto, será útil transfectar células de tumor en la región de tejido adiposo y de músculo identificado. La expresión transitoria de un sVEGF-RI en estas células circundantes dará como resultado un incremento extracelular local en estas proteínas y promoverá la unión con VEGF y VEGF-Rs de longitud total, inhibiendo, de esta manera, la formación de dímeros VEGF-R de longitud total activados.

Los virus Ad/VEGF-RI recombinantes de la presente invención, que incluyen AdHCMVsFLT-1 y AdHCMVI1sFLT, pueden suministrarse igualmente mediante inyección i.v. Un adenovirus recombinante suministrado mediante inyección i.v. infectará, preferencialmente, hepatocitos cuando se administra intravenosamente, en los cuales la expresión persiste durante aproximadamente 3-4 semanas posteriores a la infección inicial. La cantidad adecuada dependerá de un cierto número de factores, tales como el vector particular escogido, el huésped, potencia del promotor usado y la severidad de la enfermedad a ser tratada.

El técnico experto puede alterar la cantidad del virus administrado al paciente, dependiendo del procedimiento de suministro, tamaño del tumor y eficacia de expresión a partir del virus recombinante. Una dosis dentro del intervalo de 10^{9}-10^{11} pfu de adnovirus es la preferida para tratar la mayoría de los tumores primarios. El técnico experto comprenderá igualmente que, el número de partículas víricas que codifican el transgen, sean o no competentes de la replicación en una célula huésped complementadora, son una unidad de dosificación relevante. En la mayoría de los constructos de adenovirus, existen de 50 a 100 veces más partículas que contienen DNA que pfus.

Los véctores no víricos que son igualmente adecuados, incluyen complejos de DNA-lípido, por ejemplo conjugados de ligando o mediado por liposoma/poli-L-lisina, tal como sistemas de suministro mediados por asiloglucoproteína (véanse, p. ej., Felgner y otros, J. Biol. Chem., vol. 269, págs. 2550-2561, (1994); Derossi y otros, Restor. Neurol. Neoros., vol. 8, págs. 7-10, (1995); y Abcallah y otros, Biol. Cell., vol. 85, págs. 1-7, (1995)).

Existen muchas realizaciones de la presente invención las cuales los expertos en la técnica pueden apreciar a partir de la memoria descriptiva. A tal fin, pueden usarse con éxito diferentes promotores de transcripción, terminadores, véctores vehículo o secuencias de genes específicas.

La presente invención proporciona compuestos útiles en la fabricación de un medicamento para uso en procedimientos de terapia de genes, los cuales inhiben la angiogénesis del tumor en un huésped mamífero. Resultará fácilmente obvio para el técnico experto que, en principio, pueden usarse diversas formas de la secuencia nucleótida que codifica el sVEGF-RI para alterar la secuencia aminoácida de la proteína expresada. La proteína expresada alterada puede tener una secuencia aminoácida alterada, que se une aún al VEGF y, a su vez, inhibe la cascada molecular requerida para estimular la angiogénesis del tumor. Por ejemplo, se consideran diversas formas truncadas COOH-terminales del sVEGF-RI. Será fácil para el técnico experto generar dichas formas alteradas revisando esta memoria descriptiva. Cualquiera de dichas versiones truncadas de FLT que sea soluble y que se una a VEGF, un homólogo de VEGF y/o FLT-1 o KDR, se considera un equivalente funcional a la vista de las directrices de esta memoria descriptiva.

Con el fin de ilustrar la presente invención, se proporcionan los ejemplos siguientes, sin ser estos, sin embargo, limitativos de la misma.

Ejemplo 1 Aislamiento de un cDNA que codifica sFLT-1 humano

Se usaron productos derivados mediante PCR como sondas de hibridación para rastreo de una biblioteca de cDNA de lambda gt10 derivada a partir de HUVECs (Clontech). La siembra y toma de placas de la biblioteca se realizaron mediante procedimientos estándar (Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor laboratory, Cold Sring Harbor, New York, (1982)). Las sondas marcadas cebadas aleatoriamente con ^{32}P-dCTP a una alta actividad específica y con cada sonda se llevó a cabo un rastreo separado de la biblioteca (1 x 10^{6} placas por tamíz). Las sondas se agregaron a tampón de hibridación (formamida al 50%, 5 x Denhardts, 6 x SSC (1 x SCC = NaCl 0,15 M, Na_{3}citrato\cdot2H_{2}O 0,015 M, pH 7,0), SDS al 0,1%, 100 mg/ml de DNA de esperma de salmón) a 1x10^{6} cpm/ml.

Se detectaron cuatro fagos hibridizantes de manera positiva usando la sonda específica de flt-1. Estos fagos hibridizantes de manera positiva se observaron que eran menores que el flt-1 de longitud total.

Dentro de vectores pGEM se subclonaron dos clones de cDNA de flt-1 de aproximadamente 2,0 kb y 2,7 kb de longitud (Promega) y se secuenciaron bidireccionalmente en su totalidad mediante el procedimiento de terminación de cadena (Sanger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 74, págs. 5463-5467, (1977)), mostrándose que contenían un marco de lectura abierto único de aproximadamente 569 aminoácidos. El análisis de secuencias demostró que se había perdido una porción de la región de codificación de flt-1 5' procedente de estos clones. El remanente del extremo 5' se clonó usando PCR y se combinó con el DNA de los clones que carecían del extremo 5', proporcionando un marco de lectura abierto único que codifica aproximadamente 687 aminoácidos.

La secuencia nucleótida del cDNA de sVEGF-RI (sflt-1) derivada de flt-1 y la secuencia aminoácida deducida se muestran en la Figura 2 (secuencia nucleótida: SEC ID NO: 1) y la Figura 3 (secuencia aminoácida: SEC ID NO: 2). La inspección de la secuencia aminoácida deducida revela la presencia de un único marco de lectura ambierto grande de 687 aminoácidos. Por comparación con la secuencia aminoácida del receptor del VEGF FLT-1 de longitud total, 31 aminoácidos están codificados en el extremo C-terminal del cDNA de sVEGF-FI, que son diferentes de los de FLT-1.

Ejemplo 2 Inhibición de la angogénesis del tumor en ratones mediante administración de células que expresan transitoriamente sVEGF-RI

El cDNA de sVEGF-RI descrito en el Ejemplo 1, clonado en pGEM3z y denominado como psflt-1, se digerió con BamHI, se purificó y se ligó dentro de pcDNA3 digerido con BamHI. El plásmido resultante, pcDNA3/sflt-1 (alternativamente denominado como SFLT-1), se verificó mediante mapaje de restricción así como secuenciación del DNA del inserto BamHI de 500 bp 5' y 3'. El plásmido se transformó dentro de E. coli Top10F' y se purificó usando Quiagen mega prep y el kit de eliminación Qiagen Endotoxin.

El plásmido de expresión pcDNA3/sflt-1, se mezcló con adenovirus-polilisina (AdPl) y se transfectó dentro de células de ratón HT-1080 (ATCC CRL 1730). Las transfecciones de control se realizaron de una forma idéntica usando pcDNA3 no modificado. Las células HT-1080 se transfectaron al alcanzar una confluencia del 80% y se recolectaron a las16-24 horas para posterior estudio.

El recuento de células sobre cavidades por triplicado se realizó para 3 puntos de tiempo dentro de los 7 días de la transfección usando exclusión por azul tripano, no revelándose diferencias en las curvas de crecimiento entre los dos grupos.

Las células recolectadas se inyectaron o bien subcutáneamente o bien a través de la vena de la cola en ratones desnudos, midiéndose los nódulos en días seleccionados para los núdulos subcutáneos. Para las inyecciones a través de la vena de la cola, se realizaron dos conjuntos de experimentos. En el primer experimento, los animales se sacrificaron antes del desarrollo de nódulos pero hubo diferencias detectables en los pesos de los pulmones, aunque los pesos no fueron significativamente diferentes. En el segundo experimento, hubo diferencias definitivas en el número de nódulos por secciones, teniendo el grupo sflt-1 menos nódulos/sección de tejido.

La transfección transitoria con pcDNA3/sflt-1 (n = 7), comparada con un control de pcDNA (n = 6), dió como resultado un crecimiento más lento de los nódulos del tumor en todos los días examinados (p<0,01). Estas células tenían velocidades de crecimiento idénticas in vitro a lo largo de un período de 96 horas. Los volúmenes de nódulo promedio para células transfectadas con sflt-1 fueron de 50 mm^{3}, 75 mm^{3} y 190 mm^{3} los días 7, 12 y 17, respectivamente. Por el contrario, usando células transfectadas con pcDNA3 de control, los nódulos fueron de 151 mm^{3}, 261 mm^{3} y 474 mm^{3} los días 7, 12 y 17. De manera similar, los pesos de pulmón medios fueron menores en animales que recibieron células transfectadas con pcDNA3/sflt-1 (171 mg, n = 3) mediante inyección en vena de cola, en comparación con los controles de pcDNA3 (205 mg, n = 3). La Figura 4 muestra una disminución marcada en el volúmen del tumor en ratones desnudos inyectados con células HT-1080 que expresan transitoriamente sVEGF-RI en la forma de pcDNA3/sflt-1.

Un segundo estudio diseñado para investigar la capacidad de la terapia de genes basada en sFLT, para ser aplicada al tratamiento de la metástasis de tumores, proporcionó resultados similares. Las células HT-1080 se transfectaron transitoriamente con pcDNA3 o pcDNA3/sflt-1. Se inyectaron 4 x 10^{6} células el día 0 a través de la vena de cola de cada ratón. Los animales se sacrificaron después de un mes y se extrajeron los pulmones, se pesaron y se examinaron histológicamente para determinar el tamaño del tumor. La histología pulmonar realizada sobre animales que recibieron tumores inyectados intravenosamente reveló una diferencia notable entre los dos grupos. Las células transfectadas con pcDNA3 se asociaron con una extensión del tumor intramural pulmonar, edema parenquimal masivo e infiltrado mononuclear 20 días después de la inyección intravenosa de células tumorales. Por el contrario, las células transfectadas con pcDNA3/sflt-1 se asociaron con focos de tumor raros, la ausencia de edema e histología del parénquima del pulmón casi normal. Ocho de los 9 animales inyectados con células HT-1080 que expresan transitoriamente sVEGF-RI estuvieron limpios de crecimiento del tumor. Inversamente, las células de tumor HT-1080 transfectadas con el plásmido de control pcDNA3 mostraron 2 de 9 sin crecimiento del tumor, mientras que 7 de 9 formaron nódulos en el pulmón. Estos datos muestran que las aplicaciones de terapia de genes basadas en sFLT pueden usarse para tratar metástasis de tumores.

En tercer lugar, se examinó un modelo singénico. Se generaron clones agrupados o bien para pcDNA3 o bien pcDNA3/sflt-1 en células de glioma de ratón GL261. El recuento de células de las células desarrolladas en el cultivo no reveló diferencias entre los grupos. Todos los 3 animales con pcDNA3 desarrollaron grandes tumores después de aproximadamente un mes. Dos de 3 del grupo con sFLT-1 estuvieron libres de tumor. El tercero había formado un tumor muy pequeño. La histopatología diferió, pero todos los tumores tenían un aspecto maligno claro.

Ejemplo 3 Inhibición de la angiogénesis de tumores en ratones mediante administración de células transfectadas de manera estable con un fragmento de cDNA que codifica el sVEGF-RI

El estudio descrito en el Ejemplo 2 se repitió con células HT-1080 transfectadas de manera estable o bien con pcDNA3 de control o bien con pcDNA3/sflt-1. La Figura 5 muestra una inhibición virtualmente completa del crecimiento del tumor comparada con los datos adicionales generados con células de tumor transfectadas transitoriamente.

Para determinar los efectos de sVEGF-RI sobre la supervivencia de animales, la línea de células de glioma humano D-54MG se transfectó de manera estable con pcDNA3/psflt-1 o un control de pcDNA3. Los clones se agruparon y se inyectaron el mismo número de células intracrealmente usando un dispositivo estereotáctico de ratón con suturas del cráneo como marcas de referencia. Previamente, se había determinado que el modelo tenía características de supervivencia fiables. Los animales fueron tratados de manera idéntica post-operativamente. La Figura 6 muestra que los ratones inyectados con un control no transfectado murieron el día 26, los ratones inyectados con células de control transfectadas con pcDNA3 murieron el día 25, en tanto que todos los ratones que recibieron células transfectadas con pcDNA3/sVEGF-R estaban vivas el día 41. La Figura 7 muestra puntos de datos ampliados procedentes de este experimento, los cuales muestran que la superviviencia media para células D-54MG transfectadas con pcDNA3/sflt-1 fue de 46,5 días. Tal como se ha indicado anteriormente en este párrafo, las células de glioma humano D-54MG fueron transfectadas con pcDNA3/sflt-1 o pcDNA3 usando transfección con AdpL. Las células fueron subsiguientemente propagadas en medio completo conteniendo 400 \mug/ml de antibiótico G418 (Gibco BRL, Grand Island, NY) durante un mes para seleccionar una población de clones que contenían el plásmido pcDNA3/sflt-1 o pcDNA3. A continuación, las células seleccionadas, las cuales representan una población de clones agrupados, se recolectaron usando solución de tripsina/EDTA (Gibco) y se contaron usando un hematocitómetro con exclusión por azul tripano. Las células se resuspendieron hasta una concentración final de 10^{7} células/100 \mul en DMEM/F12 libre de suero conteniendo metilcelulosa al 5% como un vehículo para potenciar la viabilidad de la célula. Se realizó una incisión en la línea media del cuero cabelludo, seguido de un agujero con un buril de 0,5 mm a 1,5-2,0 mm a la derecha de la línea media y 0,5-1,0 mm posterior a la sutura coronal. Las células se cargaron dentro de una microjeringa de 100 \mul y se inyectaron 5 \mul estereotácticamente. Una aguja de galga 30 montada sobre la microjeringa se insertó verticalmente a través del agujero del buril hasta una profundidad de 2,5 mm. Cuarenta y cinco a sesenta segundos después de la inyección, la aguja se extrajo lentamente y se cerró la incisión con clips para heridas Michel de 9 mm. Los ratones se devolvieron a jaulas de policarbonato microaislante estéril, se dispusieron sobre un lecho de calentamiento hasta su recuperación, y se suministró comida de laboratorio tratada en autoclave y agua estéril sin límitación. Los animales se comprobaron dos veces al día con el fin de determinar su supervivencia. Estos resultados demuestran que los animales con sFLT-1 sobrevivieron más tiempo que los controles históricos y los controles subsiguientes.

Ejemplo 4 Construcción de AdHCMVsFLT-1

Para la construcción de vectores de adenovirus (Ad) independientes del ayudante, se han desarrollado diversos sistemas y, recientemente, han sido revisados por Graham y Prevec (Mol. Biotech., vol. 3, págs. 207-220, (1995)) y Hitt y otros ("Técnicas para la construcción y caracterización de vector adenovirus humano", en Methods in Molecular Genetics, Volume 7. Molecular Virology Techniques Part B, ed. Kenneth W. Adolph, Academic Press, Inc. Orlando, Florida). Todos estos sistemas implican la clonación del transgen de interés (región de codificación flanqueada por secuencias reguladoras apropiadas) dentro de un plásmido lanzadera, en el cual está flanqueado por secuencias Ad homólogas a la región del genoma vírico dentro del cual se introducirá el transgen. A continuación, el DNA procedente del plásmido lanzadera es rescatado dentro del virus bien por ligamiento directo in vitro seguido de transfección o bien mediante recombinación de homólogos in vivo después de transfección dentro de células 293.

Los plásmidos lanzadera E1 han sido desarrollados para el rescate de insertos dentro de la región E1. Estos plásmidos contienen el 16% izquierdo del genoma Ad con una deleción de secuencias E1 y sitios de clonación dentro de los cuales se introduce el transgen. Si se encuentran disponibles sitios de restricción convenientes en la estructura principal del vector, puede realizarse el ligamiento directo del plásmido lanzadera al DNA vírico purificado in vitro, seguido de transfección dentro de células 293 para generar virus infecciosos. Este procedimiento, aunque eficaz, puede requerir un rastreo extensivo si el DNA vírico no está completamente restringido y, en muchos casos, no es práctico debido a la ausencia de sitios de restricción únicos correctamente posicionados. Por estas razones, muchos protocolos están basados en la recombinación de homólogos in vivo para generar virus infecciosos. Para construir un virus mediante recombinación de homólogos, el plásmido lanzadera puede transfectarse dentro de células 293 con DNA vírico purificado que ha sido restringido en el extremo izquierdo o con DNA vírico contenido en un segundo plásmido. Al igual que como con el ligamiento directo, el uso de DNA vírico purificado requiere, a veces, un rastreo extensivo para obtener el vector deseado, debido a la regeneración del virus progenitor y, por esta razón, son más deseables los sistemas plásmidos. Se han desarrollado un cierto número de sistemas plásmidos para el rescate de insertos dentro de regiones E1 (McGrory y otros, Virology, vol. 163, págs. 614-617, (1988)) o E3 (Ghosh-Choudhury y otros, Gene, vol. 50, págs. 161-171, (1986); Mittal y otros, Virus Res., vol. 28, págs. 67-90, (1993)) o ambas (Bett y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, págs. 8802-8806, (1994)).

Las etapas implicadas en la construcción de los vectores Ad independientes del ayudante que expresan sFLT-1 se describen más adelante. Todas las etapas implican el uso de protocolos estándar para la generación de vectores de adenovirus (Hitt y otros, en Methods in Molecular Genetics, Volume 7. Molecular Virology Techniques Part B, ed. Kenneth W. Adolph, Academic Press, Inc. Orlando, Florida). Las secuencias de codificación para sFLT se obtuvieron a partir del plásmido psflt-1 mediante digestión con BamHI e inserción dentro del sitio BamHI en la región de policlonación del plásmido lanzadera E1, p\DeltaE1sp1HCMV-BGHpA, generando el pHCMVsFLT-1. El p\DeltaE1sp1HCMV-BGHpA contiene secuencias Ad5 desde la bp 1 hasta 341 y bp 3524 hasta 5790 con un promotor caja que consiste en el promotor HCMV, una región de policlonación y la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino insertada en la orientación antiparalela de E1 entre las bp 341 y bp 3524 de Ad5. A continuación, el pHCMVsFLT-1 se cotransfectó dentro de células 293 con plásmido pJM17 de genoma de Ad (McGrory y otros, Virology, vol. 163, págs. 614-617, (1988)) y el virus AdHCMVsFLT-1 se generó mediante recombinación in vivo entre los plásmidos. El pJM17 contiene esencialmente el genoma de Ad entero, pero no es infeccioso en transfecciones únicas de células 293 ya que contiene una inserción de un derivado pBR322 en el bp 1339 en secuencias de Ad, lo cual hace que el genoma vírico resultante sea demasiado grande para encapsidar. La recombinación in vivo entre pJM17 y pHCMVsFLT-1 genera un vector de un tamaño encapsidable que contiene la caja de expresión sFLT-1 en la región E1.

Igualmente, se describe un virus adenovirus recombinante adicional. Esencialmente, es el mismo que el vector descrito anteriormente, pero usa un segmento promotor HCMV ligeramente diferente que consiste en el promotor HCMV y el primer intrón (Intrón A). Este constructo incrementa los niveles de expresión dentro del huésped mamífero. Para construir este vector, se obtuvieron secuencias de codificación de sFLT-1 a partir del plásmido pHCMVsFLT-1 (anteriormente descrito), mediante digestión con KpnI y EcoRI. A continuación, el fragmento sFLT-1 se insertó dentro de los sitios KpnI y EcoRI en el plásmido lanzadera E1, pHCMVI1-BGHpA, generando el pHCMVI1sFLT-1. El pHCMVI1sFLT-1 se había cotransfectado dentro de células 293 con plásmido pJM17 de genoma de Ad. Como alternativa, el pHCMVI1sFLT-1 se digerió con PacI y se ligó con DNA vírico purificado procedente del virus AdE1PacIE3, igualmente digerido con PacI. Después de la transfección de los productos de ligamiento dentro de células 293, se rastrearon placas víricas para obtener el vector AdHCMVI1sFLT-1.

Ejemplo 5 La transfección estable de células de fibrosarcoma HT1080 humano con sFlt-1 inhibe el crecimiento de tumor sólido

Generación de plásmido sFLT-1 - Se construyó un plásmido adicional (pcDNAIAsFLT-1) que contenía el Intrón A de HCMV más arriba del cDNA de sflt-1, con el fin de generar clones HT-1080 que secreten cantidades incrementadas de sflt-1. En estudios previos, se ha demostrado que este intrón potencia la expresión de genes en 10-100 veces sobre plásmidos que contienen únicamente el promotor temprano HCMV. Para la construcción de pcDNAIAsFLt-1, se digerió pcDNA3 con NruI y KpnI (para eliminar el promotor HCMV) y se ligó con el fragmento MscI/KpnI procedente del plásmido pVIJNS-MCS (que contiene el promotor HCMV e Intrón A), generando el pcDNAINTA. A continuación, el pcDNAINTA se digerió con KpnI y EcoRI y se ligó a un fragmento KpnI/EcoRI que contiene las secuencias que codifican sFLT-1, generando pCDNAIAsFLT-1.

Selección de clones HT1080 transfectados de manera estable con pcDNAIAsFLT-1 y que expresan sFlt-1 - Se transfectaron células de tumor HT1080 de fibrosarcoma humano (Rasheed y otros, Cancer, vol. 33, págs. 1027-1033, (1974)) con el plásmido (pcDNAIAsFLT-1) que contiene el gen sFlt-1 humano bajo el control del promotor HCMV que contiene el primer intrón HCMV y el gen de resistencia a medicamentos G418 seleccionable. Las células HT1080 transfectadas agrupadas de manera estable, se sembraron en discos de 100 cm a una densidad de 10 y 100 células/placa. Las células se desarrollaron en medio suplementado DMEM [Medio de Eagle modificado de Dulbecco/F-12 (DMEM), GIBCOBRL (Cat# 11331-030), suero bovino fetal al 10% (GIBCOBRL Cat# 16000-028) y 1 x penicilina-estreptomicina (GIBCOBRL Cat# 15070-063)] con 500 \mug/ml de G418 (GIBCOBRL Cat# 10131-035). El medio se reemplazó cada día hasta que las colonias individuales se desarrollaron hasta diámetros de 2,5 mm, aproximadamente. Las colonias aisladas se trataron con tripsina (GIBCOBRL Cat# 25200-056), se transfirieron a placas de 24 cavidades y se desarrollaron hasta confluencia. Se retiró 1 ml de medio y se ensayó para determinar la actividad de unión de VEGF. El clon estable seleccionado para posteriores estudios tenía velocidades de crecimiento similares in vitro comparado tanto con células no transfectadas como con células transfectadas con pCDNA3, con división celular que se producía aproximadamente cada 48 horas.

Protocolo de unión de VEGF - Se lavó Heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia Cat# 17-0467-01) 3 veces con solución salina tamponada con fosfato [PBS] (GIBCOBRL Cat#20012-027), y se resuspendió en un volúmen igual de PBS. De cada cavidad se retiró 1 ml de medio acondicionado, se mezcló con 50 \mul de suspensión de Heparin-Sepharose CL-6B y se incubó durante una noche a 4ºC con mezclado constante. Las esférulas de Heparin-Sepharose se granularon mediante centrifugación (10.000 xg durante 2 minutos) y se lavaron 3 veces con PBS. La proteína unida se eluyó con 40 \mul de PBS que contenía NaCl 1,2 M. Se retiró una parte alícuota de 10 \mul y se agregó a 10 \mul de DMEM/gelatina al 2%, se agregó 1 \mul de ^{125}I-VEGF (Amarsham Cat# IM 274; 100.000 cpm/\mul) y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. A la reacción se agregaron 2 \mul de suberato de bis(sulfosuccinimidilo) BS^{3} 10 mM [SB^{3}] (Pierce Cat# 21579 G) y se incubaron durante un tiempo adicional de 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción de reticulación se interrumpió mediante la adición de 20 \mul de 2X tampón de muestra Laemmli (BioRad Cat# 161-0637). Las complejos de reticulación se separaron mediante SDS/PAGE al 7,5% y se visualizaron mediante autoradiografía.

Preparación de clones seleccionados para el estudio del crecimiento del tumor - Se sembraron células en matraces T-75 y se desarrollaron hasta confluencia en medio suplementado DMEM. Las células se lavaron con PBS y se tripsinizaron en 20 ml. La tripsinización se interrumpió mediante la adición de 8 ml de medio suplementado DMEM y las células desprendidas se retiraron y contaron. Las células se granularon mediante centrifugación (1000 rpm en una centrífuga de sobremesa Sorvall 6000B) durante 5 minutos y se resuspendieron en PBS con calcio y magnesio hasta una concentración final de 1,0 x 10^{7} células/ml y se inyectaron 0,5 ml de células subcutáneamente dentro de ratones.

Resultados - Las células HT-1080 (0,5 x 10^{6} células/0,5 ml) transfectadas de manera estable bien con plásmido de control o bien con plásmido que codifica sflt-1 [pcDNAIAsFLT-1] (n = 10/grupo) que se clonaron y seleccionaron para alta expresión de sflt-1, se inyectaron subcutáneamente dentro de ratones hembra Balb/c nu/nu (Charles River Laboratories). La longitud y anchura del tumor se midieron como una función del tiempo y se usaron para calcular el volúmen del tumor mediante la ecuación:

Volúmen = 4/3 \cdot p \cdot (longitud/2)(anchura/2)(longitud + anchura)/4),

la cual estima el volúmen de la mitad de un elipsoide achatado, dando por supuesto que la altura es el promedio de la longitud y la anchura. El día 12 después de la implantación del tumor, la ulceración fue visible, de manera que los tumores se extirparon y pesaron; la expresión de sFlt-1 ocasionó una reducción del 93% en la masa del tumor. Tal como se muestra en la Figura 8, el crecimiento de tumores medido mediante el volúmen y masa promedio (\pmSD) estuvieron significativamente inhibidos por la expresión del gen sflt-1 (ensayo T de Student de 1 medida, p<0,0001 para comparaciones de masas).

Ejemplo 6 La infección de células de fibrosarcoma HT1080 humano con adenovirus de replicación defectuosa que expresa sFlt-1 humano inhibe el crecimiento del tumor

La generación de constructos adenovíricos sFlt-1 es tal como se describe en la Sección Ejemplo 4.

Infección adenovírica de células HT1080 in vitro e implantación in vivo - Se sembraron células en matraces T-75 y se desarrollaron hasta confluencia en medio suplementado DMEM. Un matraz de células se tripsinizó (2 ml), las células se retiraron y se resuspendieron en medio suplementado DMEM y se contaron para determinar el número de células/placa. Se retiró el medio de desarrollo de los matraces y las células unidas se lavaron con PBS que contenía calcio y magnesio. Tanto los adenovirus de control como los adenovirus que expresan sFlt-1 humano bajo control de HCM/intrón A, se agregaron a matraces a una multiplicidad de infección de 20 virus pfu (unidades de formación de placas)/célula en 2 ml de PBS con calcio y magnesio y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Se retiró el virus y las células se incubaron en un incubador humidificado con CO_{2} al 5% a 37ºC durante un tiempo adicional de 24 horas. Las células se lavaron con PBS y se tripsinizaron con 2 ml de tripsina. La tripsinización se interrumpió mediante la adición de medio suplementado DMEM y las células desprendidas se retiraron y contaron. Las células se granularon mediante centrifugación (1000 rpm en una centrífuga de sobremesa Sorvall 6000B) durante 5 minutos y se resuspendieron en PBS con calcio y magnesio hasta una concentración final de 1,0 x 10^{7} células/ml y 0,5 ml de células se inyectaron subcutáneamente dentro de ratones hembra Balbc nu/nu de 6-8 semanas de edad.

Resultados - Las células del tumor que no estuvieron expuestas a virus, o lo estuvieron a adenovirus de control o a adenovirus que expresa sFlt-1 bajo control del promotor HCMV/intrón A [AdHCMVI1sflt-1] (n = 5/grupo), se dejaron crecer subcutáneamente en ratones desnudos. Después de 11 días de crecimiento in vivo, la piel sobre el tumor comenzó a ulcerarse en los animales de control, de modo que los tumores se extrajeron de todos los animales y se pesaron. Los masas de tumor promedio \pmSEMs del grupo se muestran en la Figura 9.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: MERCK & Co., INC.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: TERAPIA DE GENES PARA INHIBICIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DIRECCIÓN: J. Mark Hand - MERCK & CO., INC.

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(B)

CALLE: 126 EAST LINCOLN AVENUE - P-P- BOX 2000

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: RAHWAY

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(D)

ESTADO: NJ

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(E)

PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA

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(F)

CÓDIGO: 07065-0900

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(v)

FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Diskete

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(B)

ORDENADOR: IBM Compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

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(D)

SOFTWARE: FastSEQ Versión 1.5

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: u.s. 60/026.641

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 24 de Septiembre de 1996

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(viii)

PROCURADOR/AGENTE DE INFORMACIÓN:

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(A)

NOMBRE: Hand, J. Mark

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.545

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 19810Y

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELEFONO: 908-594-3905

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(B)

TELEFAX: 908-594-4720

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(C)

TELEX:

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 2313 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

FORMA DE LA HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: linear

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

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(iii)

HIPOTÉTICA: No

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(iv)

ANTISENTIDO: No

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO:

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

1

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 687 pares de bases

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

FORMA DE LA HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: linear

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(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

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(iii)

HIPOTÉTICA: No

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(iv)

ANTISENTIDO: No

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(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

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3

4

5

6

Claims (11)

1. El uso, para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis de un tumor sólido o metastático en un mamífero huésped, de un vector de DNA que expresa una forma soluble de un receptor de tirosina quinasa que comprende la secuencia aminoácida establecida en la SEC ID NO: 2, en la que el receptor de tirosina quinasa forma un dímero con VEGF, un homólogo de VEGF o una proteína del receptor de tirosina quinasa específica de VEGF.

2. Uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicho huésped mamífero es un humano.

3. Uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que dicho vector de DNA es un adenovirus recombinante.

4. Uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que dicho vector de DNA es un vector plásmido de DNA recombinante.

5. Uso de acuerdo con la Reivindicación 3, en el que dicho adenovirus recombinante se suministra mediante infección dentro de las células de un tumor sólido o las células adyacentes a dicho tumor sólido.

6. Uso de acuerdo con la Reivindicación 5, en el que dichas células están seleccionadas entre el grupo que consiste en células adiposas, células del músculo y células endoteliales vasculares.

7. Uso de acuerdo con la Reivindicación 6, en el que dicho adenovirus recombinante es AdHCMVsFLT-1 o AdHCMVI1sFLT.

8. Uso de acuerdo con la Reivindicación 4, en el que dicho vector plásmido de DNA recombinante se suministra mediante inyección dentro de las células de un tumor sólido o las células adyacentes a dicho tumor sólido.

9. Uso de acuerdo con la Reivindicación 8, en el que dichas células están seleccionadas entre el grupo que consiste en células adiposas, células del músculo y células endoteliales vasculares.

10. Uso de acuerdo con la Reivindicación 9, en el que dicho vector plásmido de DNA recombinante es pcDNA3/sflt-1 o pcDNA3IA/sflt-1.

11. Un procedimiento de determinación de la eficacia de la inhibición de la angiogénesis del tumor, el cual comprende:

(a) transfección de células del tumor cultivadas con un vector de DNA que expresa sFLT, el cual comprende la secuencia aminoácida establecida en la SEC ID NO: 2;

(b) inyección de dichas células del tumor transfectadas dentro de un ratón;

(c) sacrificio de dicho ratón después de un intervalo que permite el crecimiento del tumor dentro de dicho ratón; y,

(d) observación de la formación de nódulos del tumor en dicho ratón, comparada con un ratón inyectado con células del tumor transfectadas con el vector solamente o células de tumor no transfectadas.