ES2273668T3 - Soluciones para el trasplante de organos que contienen conjugados de compuestos peptidicos solubles que aseguran la union de la membrana. - Google Patents
Soluciones para el trasplante de organos que contienen conjugados de compuestos peptidicos solubles que aseguran la union de la membrana. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2273668T3 ES2273668T3 ES00907842T ES00907842T ES2273668T3 ES 2273668 T3 ES2273668 T3 ES 2273668T3 ES 00907842 T ES00907842 T ES 00907842T ES 00907842 T ES00907842 T ES 00907842T ES 2273668 T3 ES2273668 T3 ES 2273668T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- organ
- polypeptide
- derivative
- storage
- complement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Una preparación de prevención de lesión de reperfusión isquémica para perfusión de un órgano antes del transplante o almacenamiento del órgano que comprende: un derivado soluble de un polipéptido soluble, comprendiendo el citado derivado dos o más elementos de unión a membrana heterólogos con baja afinidad a membrana asociados covalentemente con el polipéptido elementos que son capaces de interactuar, independientemente y con aditividad termodinámica, con componentes de membranas del órgano expuesto a fluidos de perfusión extracelulares; y una solución de inundado de almacenamiento fisiológicamente aceptable, donde el citado derivado consiste en un fragmento de CRI (las tres Primeras Repeticiones de Coincidencia Cortas, SCRI-3) conjugado a miristoilo y una secuencia de aminoácidos básicos, como SEQ ID No. 1; y la citada solución de inundado de almacenamiento fisiológicamente aceptable es Soltran, que contiene los siguientes constituyentes por 1 litro de solución, citrato de potasio (8, 6 g), citrato de sodio (8, 2 g), manita (33, 8 g) sulfato de magnesio (10, 0 g) y tiene un pH de 7, 1 y una osmolaridad de 486 mOsm/l.
Description
Soluciones para el transplante de órganos que
contienen conjugados de compuestos peptídicos solubles que aseguran
la unión de la membrana.
Esta invención se refiere a formulaciones de
polipéptidos y sus derivados que actúan como inhibidores o
reguladores de los sistemas inmune o de coagulación y se utilizan en
transplantes de órganos. La invención proporciona soluciones que
incluyen, por ejemplo, inhibidores de complementos o reguladores de
la función de linfocitos T ó B en formas moleculares modificadas
que pueden utilizarse para perfundir y modificar órganos antes del
transplante o para almacenar órganos antes del transplante, y para
localizar agentes en órganos. La invención se refiere también a
métodos de hacer formulaciones según la invención y a la utilización
de estas formulaciones hechas. Cuando está legalmente permitido, la
invención se refiere también a métodos de prevención, tratamiento o
mejora de una enfermedad asociada con inflamación, activación de
complemento inapropiada o activación inapropiada de coagulante o
procesos trombóticos antes, durante, o después del transplante de
un órgano. Por ejemplo, la invención proporciona métodos de
prevención, tratamiento o mejora del rechazo hiperagudo o agudo de
aloinjerto de órganos transplantados tales como riñón, corazón,
hígado o pulmones (particularmente en individuos sensibilizados por
órganos previamente transplantados), lesión de reperfusión de
isquemia en órganos transplantados, rechazo de xenoinjerto y
rechazo de injerto corneal.
El término transplante indica aquí la colocación
de un órgano, por ejemplo, corazón, riñón o pulmón en un paciente
humano o un animal. Incluye también transplantes de piel, como
pueden ser necesarios, por ejemplo, después de quemaduras graves.
El propósito del reemplazamiento es la extracción de un órgano o
tejido enfermo del huésped y su substitución por un órgano o tejido
sano del donante. Este último puede proceder de un cadáver
reciente, un voluntario sano o un animal de otra especie. Cuando
donante y receptor son de la misma especie, el transplante se
conoce como aloinjerto. Cuando donante y receptor son de distinta
especie el transplante se conoce como xenoinjerto. Las técnicas
necesarias para el transplante son diversas y dependen en gran
medida de la naturaleza del órgano que se transplanta; han sido
desarrolladas con suficiente detalle en las últimas décadas en que
el transplante en el hombre es ahora una actividad de común en el
marco de los hospitales. Aunque las operaciones quirúrgicas se
pueden describir ahora como de rutina, el éxito del transplante como
modalidad terapéutica depende de una serie de posibles cuestiones
fisiológicas. Por ejemplo, el huésped puede rechazar el nuevo
órgano a través de mecanismos de rechazo hiperagudo dependiente de
anticuerpo, procesos de rechazo agudo mediado por células o
procesos de degeneración crónica. Todos estos procesos destructivos
pueden envolver la activación del complemento en algún grado.
Además puede no poderse transplantar un nuevo órgano que retenga
una completa viabilidad vascular si, por ejemplo, un órgano se ha
deteriorado en el almacenamiento después de separarlo del
donante,
Se ha publicado también la utilización de
vejigas artificiales como transplantes (Oberpenning y col. 1999
Nature Biotechnology, 17, 149). En este caso, se ha hecho
crecer la vejiga artificial a partir de células de vejiga de un
individuo en el laboratorio y haciendo luego crecer las células en
un soporte artificial, Cuando la nueva "vejiga" ha llegado a
su completo crecimiento se ha transplantado a perros.
El sistema del complemento se compone de más de
30 proteínas diferentes que son importantes en la respuesta del
sistema inmune a antígenos extraños. El sistema del complemento se
activa cuando sus componentes primarios se escinden y los
productos, solos o con otras proteínas, activan las proteínas del
complemento adicionales lo que da lugar a una cascada proteolítica.
La activación del sistema del complemento conduce a una variedad de
respuestas que incluye permeabilidad vascular incrementada,
quimiotaxis de células fagocíticas, activación de células
inflamatorias, opsonización de partículas extrañas, muerte directa
de células y daño a tejidos. La activación del sistema del
complemento puede ser disparada por complejos
antígeno-anticuerpo (el camino clásico) o, por
ejemplo, por lipopolisacáridos presentes en las paredes celulares de
bacterias patógenas (el camino alternativo).
Se sabe que la activación del complemento tiene
lugar en una amplia variedad de procesos inflamatorios agudos que
incluyen los asociados con lesiones de isquemia y reperfusión
(Rossen y col. 1985 Circ. Res., 57, 119; Morgan B.P., 1990.
"Los efectos biológicos de la activación del complemento". En
Complement, Clinical Aspects and Relevance to Disease
(Academic Press, Londres).
La asociación de activación adversa del
complemento con fallo del transplante y/o injertos ha sido descrita
por varios autores: En estudios de xenoinjertos cardiacos de ratón a
rata se ha llegado a la conclusión de que la supresión temporal de
activación del complemento inducía supervivencia a largo plazo
(Koyamada y col., 1998, Transplantation, 65
1210-5). La función de los pulmones en
xenotransplantes de cerdo a primate mejoraba también cuando se
utilizaba un regulador del complemento en el modelo experimental
(Yeatman y col. 1998, Transplantation, 65,
1084-93). En una revisión, Sheerin y Sacks (Curr.
Opin. Nefrol. Hypertens, 1998, 7, 305-10)
aclararon los estudios que ahora llevan a cabo acerca del papel del
complemento en la patogénesis de lesión renal, debida, entre otros,
a los procedimientos de transplante; llegaron a la conclusión de que
la síntesis del complemento local era una diana potencial para
terapia basada en complemento. Esta estrategia fue compartida por
Johnson (Transplantation, 1997, 6, 120-7)
quien también presta atención a la aparición de activación del
complemento durante la hemodiálisis renal así como xenotransplante y
el hecho de que los inhibidores del complemento puedan utilizarse
para control de la inflamación asociada con activación del
complemento. La activación adversa del complemento no está limitada
al área de transplante xenogeneico sino que se observa también en
transplante de aloinjertos, incluso en individuos emparejados con
idéntico HLA, donde se ha informado que el 10 por ciento de los
riñones transplantados ha sido rechazado por mecanismos
inmunológicos, principalmente mediados por complemento (Brasile y
col. 1987 Transplant. Proc. 19 894-5). La
activación del complemento durante el transplante se puede asociar
también con procesos trombóticos que pueden dispararse por
activación de células endoteliales (Bach y col. 1994, Inmunol
Rev. 141, 5-30)
Se ha demostrado que el tipo 1 de receptor del
complemento (CR1) está presente en las membranas de eritrocitos,
monocitos/macrófagos, granulocitos, células B, algunas células T,
células dendríticas foliculares del bazo, y podocitos glomerulares.
El CR1 une a los componentes del complemento C3b y C4b y se conoce
también como receptor C3b/C4b. La organización estructural y
secuencia primaria de un alotipo de CR1 es conocida (Klickstein y
col., 1987, J. Exp. Med. 165: 1095-1112,
Klickstein y col. 1988, J. Exp. Med
168:1699-1717; Hourcade y col. 1988, J. Exp.
Med. 168:1255-1270 WO 89/09220, WO 91/05047). Se
compone de 30 repeticiones de coincidencia cortas (SCRs) que
contienen cada una alrededor de 60-70 aminoácidos.
En cada SCR, se conservan alrededor de 29 de una media de 65. Se ha
propuesto que cada SCR forme una estructura tridimensional en
triple bucle a través de uniones disulfuro siendo la tercera y
primera y la cuarta y segunda semi-cistinas en
enlaces disulfuro. El CR1 está dispuesto además como 4
repeticiones homólogas largas (LHRs) de 7 SCRs cada una. Después de
una secuencia líder, la molécula de CR1 consta de
LHR-A de terminal N, las siguientes dos
repeticiones, LHR-B y LHR-C, y la
mayor parte de LHR-D de terminal C seguido de dos
SCRs adicionales, una región de transmembrana putativa de 25
radicales y una cola citoplásmica de 43 radicales.
Basándose en la molécula de CR1 maduro que tiene
un radical de glutamina de terminal N predicho, designado después
como radical 1, los primeros tres dominios de SCR de
LHR-A, citados aquí como SCR1, SCR2 y SCR3,
consisten en los radicales 2-58,
63-120 y 125-191, respectivamente,
de CR1 maduro.
Hourcade y col. 1988, J. Exp. Med. 168:
1255-1270 observaron una sede de poliadenilación
alternativa en la unidad transcripcional de CR1 humano de la que
se predecía la producción de una forma secretada de CR1. El ARNm
codificado por esta secuencia truncada comprende las primeras 8,5
SCRs de CR1, y codifica una proteína de aproximadamente 80 kDa que
se supone que incluye el dominio de unión de C4b. Cuando se
transfecta un ADNc que corresponde a esta secuencia truncada a
células COS y se expresa, ello demuestra la actividad de unión de
C4b esperada pero no la unión a C3b (Krych y col. 1989, FASEB
J. 3: A368; Krych y col. Proc. Nat. Acad. Sci 1991, 88,
4353-7). Krych y col observaron también un ARNm
similar al predicho en varias líneas celulares humanas y han
postulado que tal forma soluble truncada de CR1 con actividad de
unión a C4b puede ser sintetizada en humanos.
Además, Makrides y col. (1992, J. Biol.
Chem. 267 34 24754-61) han expresado SCR 1+2 y
1+2+3+4 de LHR-A como proteínas unidas a membrana
en células CHO. Además, las repeticiones de coincidencia cortas 8 a
11 de CR1 y el ancla de fosfatidilo de Factor de Aceleración de la
Degradación (Decay Accelerating Factor) han sido sintetizadoa como
construcción de expresión estable unida a membrana en una línea
celular endotelial de cerdo (Mikata S., y col. Transplant
Inmunol. 1998 2: 107-10). La Patente
estadounidense 5847082 describe inhibidores del complemento
quiméricos que comprenden porciones del inhibidor del complemento
CD59 y un dominio de transmembrana que sirve para anclar la
proteína quimérica a la membrana celular mientras se retienen aún
las propiedades inhibidoras del complemento de la molécula CD59
progenitora. La Patente estadounidense 5843778 describe proteínas
quiméricas que contienen porciones de la proteína de control del
complemento de vacuna y un dominio de transmembrana así como otras
proteínas de fusión relacionadas. En todos estos casos, sin embargo,
el suministro de un inhibidor del complemento a una superficie
celular depende de la expresión del gen transfectado
correspondiente a esa célula y tiene lugar normalmente en el
contexto de un animal transgénico.
Varios fragmentos de CR1 solubles han sido
generados también a través de procedimientos de ADN recombinante
por eliminación de la región de transmembrana desde los ADNs que son
expresados (WO 89/09220, WO 91/05047). Los fragmentos de CR1
solubles eran C3b y/o C4b unidos, funcionalmente activos y mostraban
actividad de co-factor de Factor I dependiendo de
las regiones que contuvieran. Estas construcciones inhibían in
vitro funciones relacionadas con complemento tales como
estallido oxidante de neutrófilos, hemolisis mediada por
complemento, y producción de C3a y C5a. Una construcción soluble
particular, sCR1/pSCR1c, mostraba también actividad in vivo
en una reacción de Arthus pasiva inversa (WO 89/09220, WO 91/05047,
Yeh y col. 1991, J. Immunol. 149-250),
suprimía inflamación miocárdica post-isquémica y
necrosis (WO 89/09220, WO 91/05047; Weisman y col. Science,
1990, 249: 146-1511; Dupe, R. y col. Trombosis
& Haemostasis (1991) 65(6) 695) y también bloqueaba
inflamación del SNC, desmielinación y depósito de componentes de
complemento en un modelo de encefalomielitis alérgica experimental
desmielinante mediada por anticuerpo (ADEAE), (Piddlesden y col.
1994, J. Immunol. 152, 5477.
Se ha demostrado que CR1 soluble inhibe procesos
de rechazo mediados por complemento en varios modelos de
transplante (Pruitt & Bollinger, 1991, J. Surg. Res.
50:350; Pruitt y co. 1991 Transplantation 52; 868, Pruitt y
col. 1994, Transplantation 57, 363-370). Se
ha visto que también este agente reduce lesión vascular y trombosis
microvascular en rechazo de aloinjerto renal en la rata (Pratt y
col. 1996, Am. J. Pathol. 149, 2055-2066.
Pratt y col., 1997, Eur. J. Inmunol. 27,
2848-2853)
El papel de linfocitos T activados en el rechazo
de transplantes está bien establecido y es la base de varios
métodos terapéuticos inmuno-supresores conocidos por
su utilidad en retrasar rechazo del injerto. Estos incluyen agentes
tales como ciclosporina, FK506 y rapamicina, que son ligandos para
los receptores conocidos como ciclofilinas o inmunofilinas y que
intervienen en caminos de señalización celular a través de la
inhibición de la actividad de fosfatasa de calcineurina (véase, por
ejemplo, Ho y col. 1996, Clin. Immunol. Immunopathol., 80,
p. 40-5)
La utilización de los OKT3 anticuerpos
monoclonales anti-CD3 que pueden eliminar e inhibir
células-T positivas a CD3 es también pertinente.
Este proceso puede, él mismo, estar unido a activación del
complemento ya que pacientes de aloinjerto renal tratados con el
anticuerpo monoclonal OKT3 experimentaban menos efectos
secundarios y menos activación del complemento si el anticuerpo era
administrado como una infusión de dos horas en lugar de como una
infusión de bolus; los autores llegaron a la conclusión de que la
activación del complemento parecía jugar un papel en el desarrollo
de los efectos secundarios después de la primera dosis de OKT3
(Buysmann y col. 1997, Transplantation, 64,
1620-3).
La Patente WO 98/02454 describe derivados
hidrosolubles de polipéptidos que contienen dos o más elementos de
unión a membrana heterólogos cada uno de los cuales tienen una
afinidad relativamente baja para los componentes de la membrana
celular exterior pero que, en combinación, dan alta afinidad y
selectividad relativa para unión a membranas exteriores de
diferentes tipos de células.
Los derivados preferidos de esa invención tienen
la siguiente estructura
[P]-\{L-[W]\}_{n}-X
en la
que
- P
- es el polipéptido soluble
cada L es,
independientemente, un grupo flexible de
unión,
cada W es, independientemente, un
elemento peptídico de unión a
membrana
- n
- es un entero de 1 o más y
- X
- es un una entidad peptídica o no peptídica de unión a membrana que puede estar unida covalentemente a un W
Los elementos peptídicos de unión a membrana
están situados preferiblemente en forma secuencial ya sea en el
terminal N ó en el C del polipéptido soluble y tienen una longitud
de preferiblemente 8 a 20 aminoácidos. Las secuencias de
aminoácidos están unidas entre sí y al péptido soluble por grupos de
unión que se seleccionan preferiblemente de secuencias de
aminoácidos hidrófilas y/o flexibles de 4 a 20 aminoácidos;
polímeros sintéticos lineales hidrófilos, y grupos puentes
químicos.
Se ha encontrado ahora que órganos perfundidos
con una nueva formulación de un agente que es un derivado soluble
de un polipéptido soluble que actúa, por ejemplo, como un inhibidor
o regulador de los sistemas inmune o de coagulación, polipéptido o
derivado que ha sido modificado según WO 98/02454 (incluyendo tales
modificaciones ciertos nuevos elementos de unión a membrana),
adsorben ese agente y que el órgano retendrá el agente durante
períodos prolongados. El agente perfundido es así capaz de proteger
un órgano tal como el riñón, o un tejido tratado por ingeniería
genética, del ataque del complemento sin necesidad de expresión de
la molécula protectora en un animal transgénico o a través de
terapia génica.
Según la invención, se proporciona una
preparación para perfusión de un órgano antes del transplante o
almacenamiento del órgano que comprende un derivado soluble de un
pelipéptido soluble, comprendiendo el citado derivado dos o más
elementos heterólogos de unión a membrana con baja afinidad a
membrana asociados covalentemente con el polipéptido, elementos que
son capaces de interactuar, independientemente y con aditividad
termodinámica, con componentes de membranas del órgano expuesto a
fluidos de perfusión extracelular; y una solución de almacenamiento
de inundación fisiológicamente aceptable.
Por "heterólogo" se entiende que los
elementos no se encuentran en la proteína de longitud completa
natural de la que puede derivarse una proteína soluble.
Por "polipéptido soluble" se entiende un
derivado truncado de una proteína de longitud completa que carece
de su capacidad natural de unión a membrana, y/o un polipéptido que
tiene un nivel de solubilidad en medios acuosos de >100
\mug/ml.
Por "elemento de unión a membrana con baja
afinidad a membrana" se entiende que el elemento tiene solamente
una moderada afinidad a membranas, que es una disociación constante
mayor de 0,1 \muM, preferiblemente 1 \muM-1 mM.
El elemento tiene preferiblemente un tamaño < 5 kDa.
El derivado deberá incorporar suficientes
elementos con bajas afinidades a componentes de membrana para dar
por resultado un derivado con una elevada afinidad (preferiblemente
una constante de disociación de 0,01-10 nM) a
membranas específicas. Los elementos se combinan de manera que crean
una alta afinidad global para la membrana diana particular pero la
combinación carece de esa alta afinidad para otras proteínas para
las que los elementos pueden ser ligandos (de baja afinidad)
Los elementos deberán elegirse de manera que
retengan solubilidad útil en medios de formulación farmacéutica,
preferiblemente mayor de 100 \mug/ml. Preferiblemente, al menos un
elemento es hidrófilo.
Preferiblemente el polipéptido tiene actividad
anticoagulante, antitrombótica o inmunoreguladora. Entre los
ejemplos de polipéptidos que tienen actividad inmunoreguladora están
polipéptidos con actividad inhibidora del complemento.
Preferiblemente, el polipéptido es un fragmento de polipéptido CR1.
Ejemplos de polipéptidos preferidos que tienen actividad
antitrombótica o anticoagulante son Proteína C activada e hirudina
y sus análogos.
Específicamente, la presente invención se
refiere a una preparación para prevención de lesión de reperfusión
isquémica para perfusión de un órgano antes del transplante o
almacenamiento del órgano que comprende:
- un derivado soluble de un polipéptido soluble, comprendiendo el citado derivado dos o más elementos heterólogos de unión a membrana con baja afinidad a membrana asociados covalentemente con el polipéptido, elementos que son capaces de interactuar, independientemente y con aditividad termodinámica, con componentes de membranas del órgano expuesto a fluidos de perfusión extracelular; y
- una solución de almacenamiento de inundación fisiológicamante aceptable, donde el citado derivado consiste en un fragmento de CRI (las primeras tres Repeticiones de Coincidencia Cortas, SCRI-3) conjugado a miristoilo y una secuencia de aminoácido básica, como SEQ ID No. 1, siendo Soltran la citada solución de almacenamiento de inundación fisiológicamente aceptable, que contiene los siguientes constituyentes por litro de solución, citrato de potasio (8,6 g), citrato de sodio (8,2 g), manita (33,8 g), sulfato de magnesio (10,0 g) y tiene un pH de 7,1 y una osmolaridad de 486 mOsm/l.
Además, según la invención se proporciona un
método para producir una preparación según la invención que
comprende: expresar ADN que codifica la porción de polipéptido del
derivado en una célula huésped recombinante; modificación
post-traduccional del polipéptido para introducir
químicamente los elementos de unión a membrana para formar el
derivado; recuperación del derivado;
\hbox{y mezclado del derivado con la solución de inundación de almacenamiento.}
Los métodos según la invención pueden comprender
además: preparación de un vector de expresión replicable capaz, en
la célula huésped recombinante, de expresar el ADN que codifica el
polipéptido; transformación de la célula huésped recombinante con
el vector; y cultivo de la célula huésped transformada bajo
condiciones que permiten la expresión del polímero de ADN para
producir el polipéptido.
Además, según la invención se proporciona un
método para preparar un órgano in vitro antes del
transplante o almacenamiento del órgano, que comprende: hacer una
preparación según la invención; y perfusión del órgano con la
solución preparada.
Además, según la invención se proporciona la
utilización de la preparación en la manufactura de un agente para
la prevención, tratamiento o mejora de lesión de reperfusión
isquémica asociada con inflamación o activación inapropiada del
complemento de un órgano, antes, durante o después del
almacenamiento o antes o durante el transplante.
La invención proporciona la localización de
agentes terapéuticos en membranas celulares de órganos específicos
a los que se accede por perfusión, con lo que se proporciona uno o
más de varios efectos biológicamente significativos con ventajas
terapéuticas potenciales que incluyen, sin que quede limitado a
ellas, inhibición de activación de complemento, inhibición de
función de linfocitos T citotóxica.
Las soluciones de inundación de almacenamiento
se utilizan para inundar órganos antes del transplante para
preparar el injerto para el transplante. Se diseñan para resolver
los problemas percibidos asociados con almacenamiento prolongado
de órganos. Las soluciones de inundación de almacenamiento consisten
en soluciones acuosas estériles con un pH, osmolaridad y
composición iónica compatibles con el órgano y teniendo en cuenta
la actividad metabólica y el contenido del nucleótido adenina del
órgano durante el almacenamiento.
Existe un cierto número de soluciones de
inundación de almacenamiento comercialmente disponibles que tienen
diferentes composiciones químicas. Las que se utilizan
principalmente en el marco de los hospitales son
"Euro-Collins", fabricada por Fresenius AG de
Alemania, "VI-ASPAN.RTM", fabricada por DuPont
Chemical Company y solución de perfusión de riñón "Soltran",
fabricada por Baxter Healthcare Ltd. Reino Unido. Además, están
descritas un número de soluciones de almacenamiento de inundación y
que se podrán emplear dentro de algún tiempo en el marco de los
hospitales. Estas incluyen las descritas en la Patente
estadounidense No. 5702881, basadas en un medio de cultivo de
células de mamífero con excipientes específicos adicionales y las
descritas en la Patente estadounidense No. 5693462, que contiene
excipientes alternativos, especialmente compuestos que contienen
amiloride.
El Soltran de Baxter Healthcare Ltd contiene los
siguientes constituyentes (por 1 litro de solución)
Citrato de potasio | 8,6 g |
Citrato de sodio | 8,2 g |
Manita | 33,8 g |
Sulfato de magnesio | 10,0 g |
La solución tiene un pH de 7,1 y una
osmolaridad de 486 mOsm/litro.
Se puede emplear una solución salína próxima a
isotónica (0,145 M) como simple solución de inundación de
almacenamiento.
Se han indicado varias adiciones a las
soluciones de inundación de almacenamiento para mejorar la
supervivencia del órgano y reducir las lesiones de reperfusión.
Estas incluyen pentoxifilina (Okabayashi y col., 1994, Ann.
Thorac. Surg. 58, 416-420), trimetazidina (Hauet
y col., Transplantation, 64 1082-1086) y
nitroprusiato (Fujino y col., 1997, J. Heart Lung Transplant.
16, 1073-1080). En todos estos casos, las adiciones
se hicieron a soluciones de almacenamiento de inundación y el
procedimiento de transplante suponía la transferencia al receptor
de agente añadido.
Si el derivado es inestable en la solución de
inundación de almacenamiento, el derivado se puede almacenar por
separado de la solución de inundación de almacenamiento en forma
estable y mezclarlo con la solución de inundación de almacenamiento
inmediatamente antes de que el órgano sea perfundido con la
preparación.
En un modo de realización preferido de la
invención, se diluyen derivados solubles de polipéptidos solubles
descritos en la Patente estadounidense 5833989 y WO 98/39433 en
solución Soltran de perfusión de riñón. También en un modo de
realización preferido de la invención, se diluyen los derivados
solubles descritos en WO 98/02454 en solución de perfusión de riñón
Soltran.
En otro modo de realización preferido de la
invención, se diluyen derivados solubles de los pelipéptidos
solubles, descritos en WO 98/02454 y WO 98/39433 que contienen
la(s) secuencia(s) de "cambio electrostático de
miristoilo" como se definen en WO 98/02454 y después, en solución
Soltran de perfusión de riñón. Se ha encontrado que la unión a
membrana está asociada con modificación limitada (en un solo punto)
con grupos acilo graso cuando se combina con un racimo de
aminoácidos básicos en la secuencia de proteína que puede
interactuar con grupos ácidos de cabeza de fosfolípido y
proporcionar la energía adicional para unión dirigida a la membrana
diana. Esta combinación de efectos se conoce como "cambio
electrostático de miristoilo" (S. McLaughlin y A. Aderem TIBS,
20 272-276, 1994; J.F. Hancock y col. Cell,
63, 133-139, 1990). Según esto, otro ejemplo de
elementos de unión a membrana adecuados son secuencias de
aminoácidos básicos tales como las que se encuentran en proteínas
como Rad y MARCKS (substrato de C-cinasa rico en
alanina miristoilado), P. J. Blckshear, J. Biol. Chem. 268,
1501-1504, 1993) que median el "cambio"
electrostático a través de fosforilación reversible de radicales
de serina dentro de la secuencia y una neutralización concomitante
de la carga positiva neta. Estas secuencias incluyen, sin que
quede restringido a ellas, secuencias consecutivas de lisina o
arginina tales como (Lys)n donde n es de 3 a 10,
preferiblemente 4 a 7.
Ejemplos adecuados de secuencias de aminoácidos
que comprenden aminoácidos básicos incluyen,
- (i)
- DGPKKKKKKSPSKSSG
- (ii)
- GSSKSPSKKKKKKPGD
- (iii)
- SPSNETPKKKKKRFSEKKSG
- (iv)
- DGPKKKKKXSPSKSSK
- (v)
- SKDGKKKKKKSKTK
(Terminal N a la izquierda)
Las secuencias (i) a (v) son ejemplos de
secuencias de cambio electrostático.
En un modo de realización más preferido de la
invención, se diluye el derivado soluble que corresponde a SEQ ID
No. 8 de WO 98/02454 (dado aquí como vía de referencia como SEQ ID
No. 1) en solución Soltran de perfusión de riñón.
En otros modos de realización de la invención,
derivados de polipéptidos a los que se incorporan nuevos elementos
peptídicos de unión a membrana confieren una alta afinidad a tipos
de células encontradas en el órgano diana. Ejemplos de tales tipos
de células incluyen células glomerulares epiteliales y endoteliales
de riñón humano. Estos elementos peptídicos de unión a membrana W
son ligandos para proteínas de superficie celular que actúan como
marcadores para el órgano o tejido particular.
A cualquier especialista en esta área le
resultará evidente que se pueden formular diferentes proteínas con
diferentes soluciones de inundación de almacenamiento que las dadas
antes como ejemplo. Por ejemplo, WO 98/02454 y WO 98/394333
describen varios nuevos inhibidores de complemento que pueden
modificarse para formar un derivado soluble y formularse en
diluyente Soltran.
Las formulaciones de la invención son útiles en
la prevención, tratamiento o mejora de muchos trastornos mediados
por complemento o relacionados con complemento que incluyen, sin que
quede limitado a ellos, rechazo hiperagudo o agudo de aloinjerto
de órganos transplantados tales como riñón, corazón, hígado o
pulmones (en particular en individuos sensibilizados por órganos
transplantados previamente), lesión de reperfusión- isquémia en
órganos transplantados, rechazo de xenoinjerto y rechazo de injerto
corneal.
La Figura 1 muestra datos de nitrógeno de urea
en sangre (BUN) en receptores de iso-injerto renal
DA-DA (n=6) a 2 semanas del transplante. El grupo de
control es significativamente diferente (p<0,0001) del normal,
mientras que el grupo tratado no es significativamente diferente del
normal (p=0,0530). Los datos muestran que los órganos perfundidos
con un compuesto de la invención tenían mejorada la función renal
después del transplante durante la primera semana
post-transplante.
La invención se describe además por vía de
ejemplos.
SDS-PAGE se llevó a cabo SDS
PAGE utilizando por lo general el sistema Novex (Novex, Alemania)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Los geles
pre-empaquetados de concentraciones de acrilamida
4-20% fueron los más frecuentemente utilizados. Las
muestras para electroforesis, incluyendo patrones de peso molecular
de proteína (por ejemplo LMW Kit, Pharmacia o Novex Merk 12) se
diluyeron norrmalmente en tampón que contenía SDS al 1% (peso/peso)
(con o sin 2-mercaptoetanol al 5% (volumen/volumen)
y se dejaron a temperatura ambiente durante aproximadamente media
hora antes de la aplicación al gel.
Existen una serie de métodos empleados para
alcanzar los objetivos del título. La razón de que puede ser
necesario llevar a cabo reducción selectiva de disulfuros es que
durante el reduplicado, concentración y posterior purificación de
proteínas multi-tioalcohol puede tener lugar un
emparejamiento inapropiado de disulfuros. Además, incluso si ocurre
un emparejamiento correcto de disulfuros, puede resultar bloqueada
una cisteína libre de la proteína con el agente reductor, por
ejemplo glutation. Estos derivados son generalmente bastante
estables. Con el fin de hacerlos más reactivos, por ejemplo para
subsiguiente conjugación a otro grupo funcional, necesitan ser
reducidos selectivamente, con ditiotreitol (DTT) por ejemplo o con
Tris(2-carboxietil)fosfina.HCl
(TCEP), modificados opcionalmente luego con una función que sea
moderadamente inestable. Un ejemplo de esto último es el reactivo
Ellmans (DTNB) que da un disulfuro mixto. En el caso en que se omita
el tratamiento con DTNB, se necesita una atención cuidadosa al
diseño experimental para asegurar que la dimerización de la
proteína que contiene tioalcohol libre es mínima. El término
"reducido selectivamente" anterior significa que las
condiciones de reacción, por ejemplo, duración, temperatura,
relaciones molares de reactivos, han sido cuidadosamente
controladas de manera que los puentes disulfuro dentro de la
arquitectura natural de la proteína no se han reducido. Todos los
reactivos están comercialmente disponibles, por ejemplo de Sigma o
Pierce.
Los siguientes ejemplos generales ilustran el
tipo de condiciones que se pueden utilizar y que son útiles para la
generación de tioalcoholes libres y su modificación opcional. Las
condiciones de reacción específicas para alcanzar una reducción
óptima del tioalcohol y/o modificación se determinan teóricamente
para cada partida de proteínas
La TCEP se puede preparar como una solución 20
mM en Hepes 50 mM (aproximadamente pH 4,5) y puede almacenarse a
-40ºC. El DTT se puede preparar a 10 mM en fosfato de sodio, pH
7,0, y puede almacenarse a -40ºC. El reactivo DTNB se puede
preparar a 10 mM en fosfato de sodio, pH 7,0, y puede almacenarse
a -40ºC. Todos los reactivos anteriores se utilizan típicamente a
equivalencia molar o exceso molar, identificándose idealmente de
forma experimental las concentraciones precisas. La duración y la
temperatura de reacción se determinan asimismo experimentalmente.
Por lo general la duración estará en el intervalo 1 a 24 horas y la
temperatura en el intervalo de 2 a 30ºC. El exceso de reactivo se
puede separar convenientemente por intercambio de tampón, por
ejemplo utilizando Sephadex G 25. Un tampón adecuado es fosfato de
sodio 0,1 M pH 7,0.
La actividad funcional de inhibidores de
complemento se comprobó por medida de la inhibición de lisis
mediada por complemento de eritrocitos de oveja sensibilizados con
anticuerpos de conejo (Diamedix Corporation, Miami, EEUU). El
ensayo se diseñó como específico para el camino clásico de
activación del complemento. Se diluyó suero humano 1:100
(concentración final en mezcla de ensayo) en Hepes 0,1 M/NaCl 0,15
M/gelatina 0,1%, pH 7,4, que se utilizó como fuente del
complemento. El suero se preparó del reunido del donado por un grupo
de voluntarios de la manera como se describe esencialmente en
Dacie & Lewis, 1975. En breves palabras, se calentó la sangre a
37ºC durante 5 minutos, se separó el coágulo y se clarificó el suero
remanente por centrifugación. Se dividió la fracción de suero en
pequeñas partes alícuotas y se almacenó a 196ºC ó -80ºC. Se dejaron
descongelar las partes alícuotas según se requerían y se diluyeron
en el tampón Hepes inmediatamente antes de su uso. Se midió la
inhibición de la lisis mediada por complemento de los eritrocitos de
oveja sensibilizados utilizando un ensayo hemolítico convencional
empleando un formato de placa de microvaloración de fondo en v como
sigue:
Se mezclaron 50 \mul de un intervalo de
concentraciones de inhibidor diluido en tampón Hepes con 50 \mul
del suero diluido y 100 \mul de eritrocitos de oveja
sensibilizados y se incubaron entonces durante 1 hora a 37ºC. Se
centrifugaron las muestras a 1600 rpm a temperatura ambiente durante
3 minutos antes de transferir 150 \mul del sobrenadante a una
placa de microvaloración de fondo plano y determinar la absorción a
405 o 410 nm. Se determinó la lisis máxima (A max) por incubación
del suero con eritrocitos en ausencia de inhibidor. La lisis de
fondo (Ao) se determinó por incubación de eritrocitos en la ausencia
de suero o inhibidor. La inhibición se expresó como una fracción
del total de lisis de células de manera que IH50 representa la
concentración de inhibidor requerida para dar un 50% de inhibición
de lisis.
%\ de\
inhibición\ = [1-[(\underbar{A – Ao})/ (Amax -Ao)]]\ x\
100
Se comprobó la actividad funcional de
inhibidores de complemento por medida de la inhibición de lisis
mediada por complemento de eritrocitos de cobaya esencialmente como
describen Scesney, S. M. y col. (1996) J. Immunol. 26
1729-1735. El ensayo se diseñó para que fuera
específico para el camino alternativo de activación de
complemento. El suero humano preparado con el donado por un grupo de
voluntarios esencialmente como se describe en Dacie & Lewis,
1975, se utilizó como fuente del complemento. En resumen, se calentó
sangre a 37ºC durante 5 minutos, se separó el coágulo y el suero
remanente se clarificó por centrifugación. Se dividió la fracción
de suero en pequeñas partes alícuotas y se almacenó a -196ºC. Las
partes alícuotas se descongelaron según se requerían y se diluyeron
en Hepes 0,1 M/NaCl 0,15 M// gelatina al 0,1%/ EGTA 8 mM/ MgCl_{2}
5 mM, pH 7,4, (tampón A) inmediatamente antes del uso.
Los eritrocitos de cobaya se compraron en TCS
Microbiology y se almacenaron a +4ºC. Se utilizaron en dos semanas.
Se mezclaron 50 \mul de un intervalo de concentraciones de
inhibidor diluidas en tampón A en una placa de microvaloración de
fondo en v primero con 100 \mul de suero que había sido diluido
1:3 (en tampón A) y, segundo, con 50 \mul de eritrocitos de
cobaya (diluidos 1:49 en tampón A) y se incubó durante 1 hora a
37ºC. Se centrifugó la placa a 1600 rpm durante 3 minutos antes de
transferir 150 \mul de cada sobrenadante a una placa de
microvaloración de fondo plano y determinar la absorción a 405 nm,
que refleja la cantidad de lisis en cada solución de ensayo. La
lisis máxima (A max)) se determinó por incubación de suero con
eritrocitos en ausencia de inhibidor. La lisis de fondo (Ao) se
determinó por incubación de eritrocitos en ausencia de suero o
inhibidor. Para comprobar si el propio inhibidor tenía algún efecto
sobre la lisis, se incubaron eritrocitos con inhibidor solo;
ninguno de los compuestos tenía efecto directo sobre la lisis de las
células rojas de la sangre. La dilución final del suero utilizado
en el ensayo absorbía a 405 nm pero el nivel de absorbancia
(aproximadamente 10% de A max) se consideró que solo tenía un efecto
insignificante sobre los resultados de ensayo globales y se ignoró
en los cálculos. La inhibición se expresó como una fracción de la
lisis celular total de manera que IH50 representa la concentración
de inhibidor requerida para dar 50% de inhibición de lisis.
%\ de\
inhibición\ = [1-[\underbar{A – Ao})/ (Amax -Ao)]]\ x\
100
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se trató proteína SCR1-3/cys
purificada tal como se define en WO 98/02454, Ejemplo 6,
(aproximadamente 90 micromolar en solución salina tamponada con
fosfato (PBS); 87 ml) con Triscarboxietilfosfina (0,315 ml de
material de reserva 50 mM en Hepes 50 mM, pH 5) durante 18 horas a
25ºC. Se añadió etanolamina a la solución a una concentración final
0,05 M por adición de 0,26 ml de reactivo de reserva sin diluir (que
se supone 16,6 M). Se añadió MSWP-1 (Ejemplo 2 en
WO 98/02454) (2,35 ml de material de reserva 10 mM en fosfato de
sodio 0,1 M pH 7,0) y la solución se incubó durante otras tres
horas a 25ºC y después se colocó sobre hielo durante 15 minutos. Se
añadieron 40 g de Toyopearl Butil, lavado y secado por succión y la
mezcla se agitó en torbellino y se dejó durante 5 minutos sobre
hielo. Se agitó en torbellino de nuevo la mezcla y se vertió en
columna de vidrio de diámetro interior de 41 mm y la matriz se
reveló como cromatografía normal, todo a aproximadamente 4ºC. La
columna se reveló primero con fosfato de sodio 0,1 M y después con
etanolamina 0,3 M. Eluyó un pico mayor A280 desde la matriz
utilizando el tampón de etanolamina. Se recogió como fracción única
(40 ml) y se aplicó a una columna Sephadex G 25 (Vt 160 ml) que
había sido equilibrada con PBS. La fracción se extrajo con tampón
de equilibrio. Se registró la fracción Vo (70 ml) como producto y se
almacenó a -40ºC. Según SDS PAGE seguido de teñido con Azul
Brillante Coomassie, la fracción Vo contenía un polipéptido
individual mayor de pureza estimada >90% con un peso molecular
aparente de 24000.
\newpage
El método era esencialmente como se ha descrito
en el apartado a) anterior pero el tampón para la etapa de Sephadex
G25 era PBS/manita de 50 mg ml^{-1} USP (Farmacopea
EEUU)/L-arginina 0,1M BP (Farmacopea Británica) pH
7,4. El ajuste del pH se llevó a cabo por adición de HCl a la
solución hasta que el pH alcanzaba 7,4.
N-(Miristoil)-Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala-(S-2-Tiopiridil)Cys-NH_{2}.
El péptido
Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Leu-Se-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala-Cys-NH_{2}
(SEQ ID NO:4)
se preparó utilizando síntesis en
fase sólida a través de la estrategia general Fmoc/tBu desarrollada
por Shephard y Atherton (E. Atherton y R.C. Sheppard, Síntesis en
Fase Sólida, IRL Press, Oxford, 1989). Se utilizó resina de
polidimetilacrilamida sobre soporte de kieselgur (Macrosorb 100)
como soporte sólido y se obtuvo el derivado con etilen
diamina.
Se llevaron a cabo reacciones de copulación
empleando reactivos
N-\alpha-Fmoc-protegidos
preactivados con
N,N'-diisopropilcarbodiimida/N-hidroxibenzotriazol
(en exceso de cuatro veces molar) haciendo seguimiento con azul de
bromofenol. Para las escisiones de Fmoc se utilizó piperidina al 20%
en DMF. Se llevaron a cabo reacciones para estructurar la cadena de
péptido por ciclos repetidos de copulación y desprotección
incluyendo la unión del reactivo de unión Rink modificado ácido
(p-[(R,S)-\alpha-[1-(9H-fluoren-9-il-metoxi-formamido]2,4
dimetoxibencil]-fenoxi acético) diseñado para
producir una amida de terminal en C en la escisión final. Las
funcionalidades de la cadena lateral de los aminoácidos individuales
se protegieron como sigue:
Ser (tButilo), Lys (Boc), Asp
(O-tButilo), Cys
(Tritilo)
Al completar la estructura del péptido y con el
péptido aún unido a la resina, el grupo miristoilo se enlazó al
grupo amino de la glicina de terminal N por copulación directa de
ácido mirístico por el mismo procedimiento de activación. Este
péptido modificado se escindió entonces de la resina y se separaron
los grupos protectores de la cadena lateral al mismo tiempo por
tratamiento con ácido trifluoroacético que contenía 2,5% de agua y
2,5% de triisopropil silano.
El producto bruto se trató con
2,2'-ditiopiridina en solución de acetato de amonio
0,01 M a pH 8-9 durante aproximadamente 2 horas, se
aciduló entonces con ácido acético y se purificó por cromatografía
de líquidos preparativa de alto rendimiento (HPLC) en ácido
trifluoroacético al 0,1% (TFA)/agua y TFA al 0,1%/acetonitrilo como
componente de gradiente. Después de liofilización, el péptido era un
polvo blanco amorfo soluble a al menos 10 mg/ml en
dimetilsulfóxido. La espectrometría de masas de bombardeo atómico
rápido dio picos principales a m/e 2433,6 Daltons y 2455,6 Daltons
que corresponden a los iones moleculares
mono-protonados y mono-sodiados del
péptido. Se midió el contenido de 2-tiopiridilo del
péptido por disolución del mismo a 0,02 mM en fosfato de sodio 0,1
M, pH 7,0, y reducción de 0,003 ml por adición de ditiotreitol 1mM
(1,0 ml). El cambio en la densidad óptica a 343 nm se utilizó para
calcular la cantidad de piridina 2-tiona liberada
utilizando un coeficiente de extinción a esta longitud de onda de
8080 cm^{-1} M^{-1}. Esto indicó que el contenido de péptido era
aproximadamente 47% del peso seco. Los dos elementos peptídicos de
unión a membrana en esta molécula corresponden a la secuencia
catiónica
Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro
[SEQ ID No. 5] y la secuencia de unión a célula
Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala
[SEQ ID No. 6].
- a)
- La síntesis y aislamiento de SCR1-3/cys ha sido descrita antes con detalle en WO 98/02454, Ejemplo 6. Se han llevado a cabo métodos alternativos para el aislamiento de proteína purificada. Los cambios eran principalmente los del proceso de reduplicado y se describen en este Ejemplo (a continuación).
- b)
- El aislamiento de SCR1-3/cys de cuerpos de inclusión de E. coli incluye la solubilización del aglomerado de células seguido de cromatografía en una matriz de intercambio de cationes, por ejemplo Macroprep High S. El proceso alternativo para reduplicado al que se ha citado en a) anterior era:
- El producto de la columna de intercambio de iones (aproximadamente 3 mg de proteína total por ml; 400 ml) se intercambió en tampón a temperatura ambiente utilizando medio Sephadex G 25 en etanolamina 0,3 M/EDTA 1 mM/cisteína 1 mM/L-cistina 1 nmM.2HCl (no se requiere ajuste del pH), recogiendo un volumen Vo de 600 ml. Se diluyó entonces el eluato Vo más en tampón duplicado frío para dar una dilución final de 10-veces el volumen original aplicado a la columna G25. Se añadió L-cistina 1 mM.2HCl adicional a las 3 horas y la solución se dejó reposar a aproximadamente 2-3ºC durante 3 días. Los últimos experimentos se repitieron utilizando la concentración 2 mM de L-cistína.2HCl directamente en lugar de dos adiciones separadas de 1 mM).
- La solución se ultrafiltró entonces utilizando membrana YM10 hasta un volumen de retentato final de aproximadamente 200 ml, que se mezcló con 9 volúmenes de NaH_{2}PO_{4} 0,1 M/(NH4)_{2}SO_{4} 1 M, pH 7,0, (Tampón A) a temperatura ambiente e inmediatamente se centrifugó a 3000 rpm durante 20 minutos. Se cromatografió entonces el sobrenadante de la centrifugación a temperatura ambiente en Toyopearl Butyl 650 M y la proteína diana se eluyó utilizando un gradiente (revelada sobre 1 volumen de lecho) de tampón A a fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,0. Fue evidente un pico único mayor A280 durante la elución de gradiente y este se recogió por separado y se consideró como producto.
- c)
- Conjugación de SCR1-3/cys y reactivo MSWP
- La síntesis del conjugado se siguió con la misma metodología que se ha descrito previamente para conjugados similares utilizando reactivos MSWP alternativos, por ejemplo, como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior, excepto en que se empleó el reactivo MSWP descrito en el Ejemplo 2. La síntesis se juzgó un éxito sobre la base del análisis de las muestras de post-reacción por SDS PAGE seguido de teñido para proteína con Azul Brillante Coomassie, que mostró un desplazamiento en la movilidad de SCR1-3/cys (peso molecular aparente 22000) a un peso molecular ligeramente más alto (24000), lo que se corresponde con la adición de reactivo MSWP en una relación molar 1:1. El producto de reacción se formuló por intercambio de tampón a PBS/50 mg por ml de manita/L-arginina.HCl 0,1 M, ajustado a pH 7, con ácido clorhídrico. El producto tenía una concentración de proteína de 2,3 mg/ml, basado en A280 y un coeficiente molar de extinción de 30000. El producto presentaba actividad anti-hemolítica en ensayos hemolíticos in vitro de camino clásico (IH50 = 0,3 nM) y camino alternativo (IC50 = 100 nM). Detalles de los dos ensayos hemolíticos han sido descritos previamente y se dan en Métodos generales.
- d)
- Más purificación y formulación inicial en tampón PBS/manita/arginina
- Se diluyó la proteína diana (63 mg) sintetizada de manera similar a la descrita en el anterior c), pero sin intercambio de tampón, 20 veces (volumen total 700 ml) en fosfato de sodio 0,1 M//sulfato de amonio 1 M, pH 7,0. Se mezcló entonces la solución diluida, de manera discontinua, a 4ºC con 35 g de Macroprep Metil, secado por succión y después se vertió directamente en columna de cristal y se reveló la matriz como una cromatografía normal. Se lavó la matriz con fosfato de sodio 0,1 M/sulfato de amonio 1 M, pH 7,0, hasta que se estabilizó la línea de referencia y después se eluyó la proteína diana utilizando etanolamina 0,3 M. Se recogió el pico A280 que contenía la proteína e, inmediatamente, se intercambió de tampón ácido empleando Sephadex G25 a PBS/manita 50 mg por ml (Farmacopea EEUU)/ L-arginina 0,1 M (Farmacopea EEUU), se ajustó el pH a 7 con ácido clorhídrico. El producto tenía una concentración de proteína de 0,3 mg/ml, basado en A280 y un coeficiente molar de extinción de 30000. La fracción Vo de la columna G25 se acumuló con un producto similar y se ultrafiltró (membrana YM10; Amicon) a un concentrado de aproximadamente 15 veces. El retentato se hizo pasar entonces a través de un filtro de 0,2 micras (Sartorius, NMWL) y el filtrato se dividió en partes alícuotas y se congeló. Este material se consideró como el producto. El producto tenía una concentración de proteína de 4,0 mg/ml, basado en A280 y un coeficiente molar de extinción de 30000. La pureza determinada por SDS PAGE no reducido seguido de teñido para proteína utilizando Azul Brillante Coomassie mostró que aproximadamente el 95% de la proteína que podía teñirse tenía un peso molecular aparente de aproximadamente 23000, siendo esta proteina diana modificada. Los contaminantes visibles incluían dímero de proteína, con un peso molecular aparente de aproximadamente 37000, y proteína sin modificar con un peso molecular aparente de aproximadamente 21000. El producto presentaba actividad antihemolítica en ensayos hemolíticos in vitro por el camino clásico (IH50 = 0,1 nM) y camino alternativo (IC50 = 100 nM). Los detalles de los dos ensayos hemolíticos se han descrito previamente y se dan en los Métodos generales.
El material preparado como se ha descrito en el
Ejemplo 1b) anterior se liofilizó desde tampón PBS/manita/ arginina
descrito en el Ejemplo 3d anterior. Se re-disolvió
al volumen original en agua y después se diluyó en perfusato de
Soltran dando lugar a una solución con una concentración de
aproximadamente 200 \mug/ml (\sim8 \muM). La solución se
utilizó inmediatamente.
El material preparado como se ha descrito en el
Ejemplo 3c anterior (0,01 ml) se diluyó en perfusato de Soltran
(0,99 ml). Se obtuvo con ello una solución con una concentración de
aproximadamente 0,2 mg/ml (0,87\muM). La solución se almacenó
entonces congelada a -40ºC. Cinco días después se descongeló y se
ensayó en un ensayo hemolítico por el camino clásico (Método
general No. 3); Presentaba un IH50 de 0,2 nM, lo que indicaba que
había retenido la actividad completa.
Se aisló un riñón de rata donante y se extrajo
del animal utilizando procedimientos anestésicos y quirúrgicos
convencionales. El órgano se extrajo con la arteria renal completa
y una porción de la aorta intacta pero ligada al extremo anterior.
Se cortó la vena renal a un punto apropiado para el subsiguiente
proceso de transplante. Se administraron entonces inhibidores del
complemento diluidos en soluciones vehículo como se ha descrito
antes (aproximadamente 2 ml) a través del órgano aislado por
inyección lenta en el lumen de la aorta. Se tuvo cuidado de evitar
la introducción de burbujas de aire en la vasculatura del órgano
durante el proceso. Las soluciones administradas de esta forma
perfunden el hígado y emergen desde la vena renal.
Se extirpó el riñon de una rata receptora y se
colocó en su lugar el riñón de la donante preparado como en el
Ejemplo 6. El segmento de aorta utilizado para poder hacer la
perfusión del órgano se separó y se cortó la arteria renal a una
longitud apropiada. La arteria, vena y uréter de donante y receptora
se unieron entonces extremo con extremo por técnicas quirúrgicas
microvasculares convencionales, retornando el flujo de sangre al
órgano de la donante y permitiendo el drenaje de orina. Para evaluar
la retención de inhibidores del complemento dentro del órgano, los
órganos transplantados perfundidos se extrajeron en varios puntos
de tiempo post-transplante y se congelaron
inmediatamente a -196ºC. Se prepararon secciones congeladas de 4
\mum de grueso de tales tejidos y se incubaron a 4ºC durante 1
hora con los volúmenes apropiados de un anticuerpo monoclonal
murínico con marcador fluorescente (3E10 conjugado a
C-3 a 0,47 mg/ml en solución salina tamponada con
fosfato) elicitado frente a las 3 primeras repeticiones cortas de
coincidencia expresadas bacterianamente de CR1 humano. La
fotomicrografía de secciones bajo luz ultravioleta reveló que la
exposición de riñones de rata a compuestos tales como los del
Ejemplo 3 anterior y el Ejemplo 8 de WO 98/02454 daba por resultado
delineación inmunofluorescente de las estructuras vasculares y
parenquimales del órgano y que este marcado persistía cuando los
riñones se transplantaron a animales receptores.
Se extirpó el riñón de una rata receptora y se
puso en su lugar el riñón de donante preparado como en el Ejemplo
6. Se separó el segmento de aorta utilizado para permitir la
perfusión del órgano y se cortó la arteria renal a una longitud
apropiada. La arteria, vena y uréter de donante y receptora se
unieron entonces extremo con extremo por técnicas quirúrgicas
microvasculares convencionales volviendo el flujo de sangre al
órgano de la donante y permitiendo el drenado de orina. Para evaluar
el efecto de los compuestos como en el Ejemplo 1 anterior dentro
del órgano, se extrajeron los órganos transplantados perfundidos en
varios puntos de tiempo post-transplante, porciones
de los cuales se congelaron a -196ºC o se fijaron en una solución
de formaldehido al 4% en solución salina. Se tiñeron secciones de
tejidos congelados de 4\mum de grueso con un anticuerpo de
neoantígeno C5b-9 anti-rata de ratón
(cortesía del Dr. W. Couser, Universidad de Washington, Seattle,
EEUU; publicado en Nangaku M. Pippin J. Couser WG. Journal of
American Society of Nephrology,
10(11):2323-31, nov 1999) y se visualizó con
un conjugado de anticuerpo Ig anti-ratón para FITC
(Dako) Se trataron tejidos fijados con formaldehido/solución
salina y se embebieron en bloques de cera de parafina utilizando
métodos convencionales. Se tiñeron secciones de estos tejidos de 2
\mum de grueso con hematoxilina y eosina, y tintura de Schiffs de
ácido peryódico empleando métodos convencionales ("Teoría y
Práctica de técnicas histológicas", Ed. John D. Bancroft y Alan
Stevens, 3ª Edición, Churchill Livingstone, Londres, 1990). Este
teñido reveló la evidencia histopatlógica de que órganos
perfundidos con el compuesto del Ejemplo 1 a una concentración de
40 microgramos/ml y utilizando el método de perfusión del Ejemplo 6
y el método de transplante del Ejemplo 7, anteriores, habían
reducido la activación del complemento y reducido la lesión de
tejido comparado con órganos no perfundidos con inhibidores de
activación del complemento insertados dirigidamente a membrana. Las
muestras de sangre tomadas de la punta de la cola de animales
receptores de riñones de donadores, perfundidos y transplantados se
analizaron cada día post-transplante en cuanto a
contenido de nitrógeno de urea como marcador de función renal
utilizando un estuche de equipo (kit) comercialmente disponible
(Sigma, Reino Unido). Los datos de análisis de estas muestras
llevaron a la evidencia de que los órganos perfundidos con el
compuesto del Ejemplo 1 habían mejorado su función renal
post-transplante durante la primera semana
post-transplante.
Se extirpó el primer riñón de una rata receptora
y se colocó en su lugar el riñón de la donante preparado como en el
Ejemplo 6. El segmento de aorta utilizado para permitir la perfusión
del órgano se separó y la arteria renal se cortó a una longitud
apropiada. La arteria, vena y uréter de donante y receptora se
unieron entonces extremo con extremo por técnicas quirúrgicas
microvasculares convencionales, retornando el flujo de sangre al
órgano de la donante y permitiendo el drenado de orina. Siete días
después del transplante primario, se extrajo el primer riñón de la
rata receptora volviendo así a la receptora dependiente de la
función renal del órgano de ensayo transplantado. Para evaluar el
efecto del compuesto del Ejemplo 1 dentro del órgano, se
extrajeron, a las 20 semanas post-transplante, los
órganos perfundidos transplantados, porciones de los cuales se
fijaron en una solución de formaldehido al 4% en solución salina.
Los tejidos fijados en formaldehido/solución salina se trataron y
embebieron en bloques de cera de parafina utilizando métodos
convencionales. Se tiñeron secciones de estos tejidos de 2 \mum
de grueso con hematoxilina y eosina y tintura de Schiffs de ácido
peryódico utilizando los métodos convencionales indicados en el
Ejemplo 8. Estos teñidos revelaron evidencia histopatológica de que
los órganos perfundidos con el compuesto del Ejemplo 1 y
transplantados como en los Ejemplos 6 y 7 anteriores tenían
lesiones de tejido reducidas comparanrlo con los órganos perfundidos
con una solución que carece de inhibidor del complemento insertado
dirigidamente en la membrana. Las muestras de sangre tomadas de las
receptoras de riñones de donantes perfundidos y transplantados a
intervalos de tiempo regulares a lo largo de 20 semanas
post-transplante se analizaron en cuanto a contenido
de nitrógeno de urea como marcador de función renal utilizando un
estuche de equipo (kit) comercial (Sigma Reino Unido). Los datos de
análisis de tales muestras mostraron la evidencia de que los
órganos perfundidos con el compuesto del Ejemplo 1 habían mejorado
la función renal post transplante a lo largo de 20 semanas
post-transplante.
NOTA: La numeración de aminoácidos mostrada a
continuación para las construcciones SCR (SEQ ID Nos. 1 a 2) supone
que la metionina de terminal en N (utilizada para expresión de E.
coli) es M1. Esto contrasta con la numeración en los Ejemplos
donde se utiliza MO. Por tanto, para la numeración de las secuencias
mostrada después, hay que deducir "1" de la numeración para
hacer corresponder con los Ejemplos.
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 215 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: terminal N
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID No. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID No. 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE SECUENCIA.
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 218 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: terminal en N
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID No. 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID No. 3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- N-(Miristoil)-Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala-(S-2-tiio-piridil-Cys-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID No. 4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- Gly-Ser-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Gly-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala-Cys-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID No. 5)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID No. 6)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Asp-Ala
Claims (11)
1. Una preparación de prevención de lesión
de reperfusión isquémica para perfusión de un órgano antes del
transplante o almacenamiento del órgano que comprende:
- un derivado soluble de un polipéptido soluble, comprendiendo el citado derivado dos o más elementos de unión a membrana heterólogos con baja afinidad a membrana asociados covalentemente con el polipéptido elementos que son capaces de interactuar, independientemente y con aditividad termodinámica, con componentes de membranas del órgano expuesto a fluidos de perfusión extracelulares; y
- una solución de inundado de almacenamiento fisiológicamente aceptable, donde el citado derivado consiste en un fragmento de CRI (las tres Primeras Repeticiones de Coincidencia Cortas, SCRI-3) conjugado a miristoilo y una secuencia de aminoácidos básicos, como SEQ ID No. 1; y la citada solución de inundado de almacenamiento fisiológicamente aceptable es Soltran, que contiene los siguientes constituyentes por 1 litro de solución, citrato de potasio (8,6 g), citrato de sodio (8,2 g), manita (33,8 g) sulfato de magnesio (10,0 g) y tiene un pH de 7,1 y una osmolaridad de 486 mOsm/l.
2. Una preparación según la reivindicación
1 donde el polipéptido tiene actividad inmunoreguladora.
3. Una preparación según la reivindicación
1 o la 2 donde el polipéptido tiene actividad inhibidora del
complemento.
4. Una preparación según la reivindicación
1 donde el polipéptido tiene actividad anticoagulante o
antitrombótica.
5. Una preparación según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes donde el derivado se disuelve en la
solución de almacenamiento.
6. Un método para producir una preparación
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende.
- expresión de ADN que codifica la porción del polipéptido del derivado en una célula huésped recombinante; que modifica post-traduccionalmente el polipéptido para introducir químicamente los elementos de unión a membrana para formar el derivado;
- recuperación de los derivados; y
- mezclado de los derivados con la solución de almacenamiento de inundación.
7. Un método según la reivindicación 6 que
comprende además:
- preparación de un vector de expresión replicable capaz, en la célula huésped recombinante, de expresar el ADN que codifica el polipéptido;
- transformación de la célula huésped recombinante con el vector; y
- cultivo de la célula huésped transformada bajo condiciones que permiten la expresión de polímero de ADN para producir el polipéptido,
8. Un método para producir una preparación
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende la
mezcla del derivado con la solución de inundación de
almacenamiento.
9. Un método para preparar un órgano
in vitro antes del transplante o almacenamiento del órgano que
comprende:
- hacer una preparación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y perfundir el órgano con la preparación.
10. Utilización de una preparación según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la manufactura de un
agente para preparación de un órgano antes de su transplante o
almacenamiento.
11. Utilización de una preparación según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la manufactura de un
agente para la prevención, tratamiento o mejora de una lesión de
reperfusión isquémica asociada con inflamación o activación del
complemento inapropiada de un órgano, antes, durante o después del
almacenamiento o antes o durante el transplante.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9905503.0A GB9905503D0 (en) | 1999-03-10 | 1999-03-10 | Novel compound formulations and methods of delivery |
GB9905503 | 1999-03-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2273668T3 true ES2273668T3 (es) | 2007-05-16 |
Family
ID=10849347
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES00907842T Expired - Lifetime ES2273668T3 (es) | 1999-03-10 | 2000-03-08 | Soluciones para el trasplante de organos que contienen conjugados de compuestos peptidicos solubles que aseguran la union de la membrana. |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7888318B1 (es) |
EP (1) | EP1158854B1 (es) |
JP (1) | JP4873784B2 (es) |
AT (1) | ATE340504T1 (es) |
AU (1) | AU773516B2 (es) |
CA (1) | CA2367073A1 (es) |
DE (1) | DE60030960T2 (es) |
ES (1) | ES2273668T3 (es) |
GB (1) | GB9905503D0 (es) |
WO (1) | WO2000053007A1 (es) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK2656854T3 (en) * | 2003-02-04 | 2015-07-06 | Cornell Res Foundation Inc | Applications of an aromatic-cationic peptide |
US20060160062A1 (en) * | 2005-01-14 | 2006-07-20 | Young Lindon H | Perfusion and/or preservation solution for organs |
ES2330404B1 (es) * | 2008-05-19 | 2010-09-22 | Universidad De Barcelona | Solucion acuosa para la preservacion de tejidos y organos. |
WO2012078968A2 (en) * | 2010-12-10 | 2012-06-14 | Lifeline Scientific, Inc. | Machine perfusion with complement inhibitors |
WO2019036790A1 (en) | 2017-08-21 | 2019-02-28 | Precisionos Technology Inc. | MEDICAL VIRTUAL REALITY, MIXED REALITY OR SURGICAL SYSTEM IN INCREASED REALITY |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL89790A (en) | 1988-04-01 | 2002-05-23 | Johns Hopking University | Sequences of nucleic acids encoding and cells producing CR1 protein and methods for its production and purification |
US5256642A (en) | 1988-04-01 | 1993-10-26 | The Johns Hopkins University | Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof |
CA2050346A1 (en) | 1989-03-15 | 1990-09-16 | Mark L. Tykocinski | Cd8-based pharmaceuticals |
NZ248153A (en) | 1989-10-12 | 1997-07-27 | Imutran Ltd | Performing animal tissue transplants involving use of homologous complement restriction factors (hcrf) to prevent rejection |
JP3939747B2 (ja) | 1992-06-24 | 2007-07-04 | アドプロテック・リミテッド | 可溶性cr1誘導体 |
AU6409594A (en) | 1993-03-16 | 1994-10-11 | Alliance Pharmaceutical Corporation | Preservation solution and method for warm organ preservation |
CA2162600C (en) * | 1993-05-17 | 2000-07-11 | Chrales W. Rittershaus | Compositions comprising complement related proteins and carbohydrates, and methods for producing and using said compositions |
JPH09510088A (ja) | 1994-03-03 | 1997-10-14 | アレクション・ファーマシューティカル・インク | 最終補体インヒビター融合遺伝子およびタンパク質 |
US5554497A (en) | 1994-12-12 | 1996-09-10 | Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority | Cardioplegic solution for arresting an organ |
AU7386796A (en) * | 1995-09-28 | 1997-04-17 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Method for prevention of xenograft rejection by transplant recipients |
GB9523469D0 (en) | 1995-11-16 | 1996-01-17 | Sandoz Ltd | Organic compounds |
WO1997047321A1 (en) | 1996-06-14 | 1997-12-18 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Use of chimeric vaccinia virus complement control proteins to inhibit complement |
GB9614871D0 (en) * | 1996-07-15 | 1996-09-04 | Smithkline Beecham Plc | Compounds |
GB9704519D0 (en) * | 1997-03-05 | 1997-04-23 | Smithkline Beecham Plc | Compounds |
-
1999
- 1999-03-10 GB GBGB9905503.0A patent/GB9905503D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-03-08 EP EP00907842A patent/EP1158854B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-08 WO PCT/GB2000/000834 patent/WO2000053007A1/en active IP Right Grant
- 2000-03-08 DE DE60030960T patent/DE60030960T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-08 AT AT00907842T patent/ATE340504T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-08 CA CA002367073A patent/CA2367073A1/en not_active Abandoned
- 2000-03-08 US US09/936,205 patent/US7888318B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-08 JP JP2000603506A patent/JP4873784B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-08 ES ES00907842T patent/ES2273668T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-08 AU AU29306/00A patent/AU773516B2/en not_active Ceased
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2000053007A1 (en) | 2000-09-14 |
AU2930600A (en) | 2000-09-28 |
CA2367073A1 (en) | 2000-09-14 |
US7888318B1 (en) | 2011-02-15 |
GB9905503D0 (en) | 1999-05-05 |
AU773516B2 (en) | 2004-05-27 |
ATE340504T1 (de) | 2006-10-15 |
EP1158854A1 (en) | 2001-12-05 |
JP2002538184A (ja) | 2002-11-12 |
JP4873784B2 (ja) | 2012-02-08 |
EP1158854B1 (en) | 2006-09-27 |
DE60030960T2 (de) | 2007-06-14 |
DE60030960D1 (de) | 2006-11-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2523640T3 (es) | Direccionamiento del factor H del complemento para el tratamiento de enfermedades | |
ES2788075T3 (es) | Uso terapéutico sinérgico de concentrados de complejo de protrombina con concentrados de FVIII | |
US7645739B2 (en) | Modified annexin compositions and methods of using same | |
ES2348230T3 (es) | Prevención y reducción de la isquemia. | |
ES2709103T3 (es) | Métodos para conservar órganos y tejidos | |
JP2009514553A (ja) | 修飾アネキシンタンパク質および臓器移植における該タンパク質の使用法 | |
ES2949977T3 (es) | Tratamiento de órganos ex vivo con moléculas de PEG-fosfolípido | |
ES2371038T3 (es) | Péptidos y derivados peptídicos así como composiciones farmacéuticas que contienen los mismos. | |
US20050222030A1 (en) | Modified annexin proteins and methods for preventing thrombosis | |
JP2004528025A (ja) | 修飾されたアネキシン蛋白質及び血栓症を防ぐための方法 | |
ES2333374T3 (es) | Peptidos y derivados de peptidos, la produccion de los mismos asi como su uso para preparar una composicion farmaceutica terapeutica y/o preventivamente activa. | |
van Heerde et al. | Annexin V inhibits the procoagulant activity of matrices of TNF-stimulated endothelium under blood flow conditions. | |
RU2582247C2 (ru) | Ингибиторы апоптоза и их применение | |
ES2273668T3 (es) | Soluciones para el trasplante de organos que contienen conjugados de compuestos peptidicos solubles que aseguran la union de la membrana. | |
US20090291086A1 (en) | Compositions and Methods for Treating Cerebral Thrombosis and Global Cerebral Ischemia | |
JP2012254992A (ja) | 修飾アネキシンタンパク質および血栓症を防止するための方法 | |
US20080241233A1 (en) | Targeted delivery and expression of procoagulant hemostatic activity | |
US9255263B2 (en) | Antithrombotic compounds | |
ES2199468T3 (es) | Direccionamiento nuclear por medio de proteina h estreptococica. | |
Pierre | The effect of complement inhibition with soluble complement receptor 1 (sCR1) on pig allo-transplant lung function | |
TSUCHIDA et al. | Hemorrhagic Shock Resuscitation With an Artificial Oxygen Carrier, Hemoglobin Vesicle, Maintains Intestinal Perfusion and Suppresses the lncrease in Plasma Tumor Necrosis | |
LEÓN | Criopreservación de progenitores hematopoyéticos | |
JPH07242552A (ja) | 輸血用血小板保護剤 |