ES2271944T3 - Composiciones y metodos para la deteccion y cuantificacion simultaneas de multiples secuencias especificas de acidos nucleicos. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A METODOS PARA DETECTAR SIMULTANEA O SECUENCIALMENTE MULTIPLES SUSTANCIAS DE ANALISIS DE ACIDO NUCLEICO EN UN SOLO MEDIO MEDIANTE LA UTILIZACION DE SONDAS DE HIBRIDACION DE OLIGONUCLEOTIDOS ACOPLADAS A DIFERENTES REACTIVOS DE ETIQUETADO QUIMICOLUMINISCENTES. LOS METODOS SE PUEDEN UTILIZAR EN UN SISTEMA DE ENSAYO HETEROGENEO, HOMOGENEO O NO HOMOGENEO. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A COMBINACIONES ESPECIFICAS DE REACTIVOS DE ETIQUETADO QUIMICOLUMINISCENTES ADECUADOS, CUANDO SE ACOPLAN A UNA SONDA DE OLIGONUCLEOTIDOS, PARA SU USO EN METODOS PARA LA DETECCION DE MULTIPLES SUSTANCIAS DE ANALISIS DE ACIDO NUCLEICO. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A KITS UTILES PARA ESTOS METODOS.

Description

Composiciones y métodos para la detección y cuantificación simultáneas de múltiples secuencias específicas de ácidos nucleicos.

Ámbito de la invención

Esta invención se refiere a composiciones y métodos para la detección y cuantificación simultáneas de múltiples analitos de ácidos nucleicos en una muestra individual. La presente invención se refiere específicamente al uso de dos o más compuestos quimioluminiscentes diferentes, fijados sobre sondas de hibridación de ácidos nucleicos de una sola hebra. Cuando cada sonda se ha hibridado selectivamente con su ácido nucleico diana, entonces podrá distinguirse el compuesto quimioluminiscente o "marcador" fijado sobre la misma del marcador fijado sobre la sonda sin hibridar y de otro marcador distinto hibridado con un ácido nucleico diana diferente. Una vez iniciada la reacción de quimioluminiscencia, la luz emitida es una indicación de la presencia o de la cantidad de cada ácido nucleico diana. En la presente invención se describen además métodos para la detección y/o medición separadas de la luz emitida por cada marcador quimioluminiscente en un tubo individual como indicación de la presencia y/o de la cantidad de dos o más analitos de ácido nucleico.

Antecedentes de la invención

La emisión de la luz como resultado de una reacción química ya es conocida de los expertos en la materia, véase Schuster y Schmidt, Chemiluminescence of Organic Compounds, en: Advances in Physical Organic Chemistry 18, 187-238, 1982, Academic Press, coordinado por V. Gold & D. Bethel. La absorbancia o difusión de la luz en una o en varias longitudes de onda se ha aplicado adicionalmente a cuantificar las células bacterianas en suspensión, véase Manual of Methods for General Microbiology, 191, American Society for Microbiology, 1981; para la medición del ácido nucleico y la concentración de proteínas en solución, lugar citado, en las páginas 456 y 359, respectivamente; y como medio para el seguimiento de la purificación de varios compuestos por cromatografía y otras técnicas de purificación y de separación. Sin embargo, las técnicas mencionadas en último lugar no son específicas en lo que respecta a la identificación de un compuesto concreto, por ejemplo una proteína o una especie de ácido nucleico.

El uso de reactivos quimioluminiscentes como reactivos marcadores en ensayos inmunológicos específicos de analitos ya es conocido en la técnica, véase p.ej. W. Rudolf Seitz, Immunoassay Labels based on Chemiluminescence and Bioluminescence, en: Clin. Chem. 17, 120-126, 1984. El uso de derivados de acridinio como reactivos marcadores específicos se ha descrito por Weeks y col., Acridinium Esters as High Specicific Activity Labels in Immunoassays, en: Clin. Chem. 29, 1474-1478, 1983.

Los ensayos que emplean marcadores quimioluminiscentes o "grupos informantes" (reporter) se realizan con arreglo a un mecanismo generalizado. En este mecanismo, el compuesto emisor de luz reacciona con un segundo compuesto que provoca que el compuesto emisor de luz en un estado transitorio de alta energía. Cuando la molécula excitada vuelve después al estado de energía baja, lo hace emitiendo un fotón. La reacción puede implicar o no otros co-factores adicionales o catalizadores para facilitar o acelerar la reacción. En una población de moléculas de este tipo, la luz emitida puede medirse en un dispositivo de medición llamado luminómetro. La cantidad de luz medida es proporcional a la concentración de compuestos luminiscentes que hayan reaccionado dentro de la muestra a ensayar.

Por tanto, cuando el compuesto está asociado físicamente a un analito, la cantidad de luz generada es también proporcional a la cantidad de analito existente en la muestra, en el supuesto de que se haya eliminado de la muestra cualquier exceso de reactivo quimioluminiscente no asociado antes de iniciar la reacción y la medición. El compuesto puede fijarse directamente sobre el analito o puede unirse o fijarse sobre un compuesto, que por sí mismo sea capaz de asociarse físicamente al analito. Un ejemplo de esto último sería cuando el reactivo quimioluminiscente está unido a un anticuerpo específico del analito de interés o a un ácido nucleico de hebra simple que es complementario del ácido nucleico, cuya presencia se sospecha en la muestra a ensayar.

Se han descrito varios sistemas de ensayo para medir la presencia de más de un analito específico en una muestra individual a ensayar. Gorski y col., J. Histochem. and Cytochem. 25, 881-887, 1977, utilizan un marcador único, el anaranjado de acridina, como colorante vital fluorescente en cultivos mixtos de linfocitos. Después de teñir los cultivos se efectúa el seguimiento en dos longitudes de onda diferentes. Debido a que el colorante, que se intercala entre las bases de ácidos nucleicos, emitirá luz en la región verde si se asocia con el DNA y en la región roja si se asocia con el RNA, es posible medir simultáneamente el DNA y el RNA celulares totales efectuando el seguimiento de estas dos regiones de longitudes de onda.

Se han probado diversos sistemas de ensayo que emplean dos o más radioisótopos diferentes cada uno, incorporados a un componente de una pareja de fijación, por ejemplo un miembro de una pareja de anticuerpo-antígeno, o a una de dos hebras complementarias de ácido nucleico. Empleando radionúclidos que emiten diferentes tipos de energía, (por ejemplo radiación \gamma o emisión de partículas \beta), o energías de diferentes intensidades, es posible distinguir entre los dos radionúclidos y, de este modo, entre los compuestos a los que estos se hayan incorporado. Los contadores de centelleo y de rayos gamma son aparatos comerciales, que pueden medir la desintegración radiactiva simultáneamente en más de un canal.

Por consiguiente, en un radioinmunoensayo (RIA) de competición de múltiples analitos se marcan las moléculas de analito de dos o más poblaciones con diferentes radioisótopos de actividad específica conocida (mCi de radioisótopo/mmol de analito). Cuando se mezcla una muestra a ensayar con los analitos marcados, el analito sin marcar de la muestra de ensayo competirá con el analito marcado por fijarse sobre un reactivo de fijación específico no marcado. La cantidad de analito no marcado de la muestra a ensayar es proporcional a la disminución de la señal, comparada con la cantidad medida sin adición de la muestra a ensayar.

Los ensayos radiactivos tienen inconvenientes obvios. Los métodos no radiactivos para detectar y medir un analito en una muestra de ensayo ya son conocidos en la técnica. Se han descrito, por ejemplo, los inmunoensayos basados en enzimas que utilizan la biotina y la avidina, los hidratos de carbono y las lectinas como sistemas de ensayo que utilizan grupos informantes fluorescentes, por ejemplo la fluoresceína y la rodamina, así como grupos informantes quimioluminiscentes. Algunos de estos sistemas están limitados además de forma inherente en la sensibilidad con la que pueden detectar el analito de interés, debido a la sensibilidad inherente del marcador y/o por las características espectrales o cinéticas del compuesto fluorescente o quimioluminiscente concreto.

Los ensayos simultáneos de múltiples analitos, que utilizan grupos informantes fluorescentes que tienen rendimientos cuánticos elevados, resultan más difíciles debido a los espectros relativamente amplios y a las bases elevadas asociadas con estos reactivos.

Se han publicado sistemas de marcadores múltiples no radiactivos para la medición de proteínas, véase Vuori y col., Clin. Chem. 37, 2087-2092, 1991; y ácidos nucleicos, véase Iitia y col., Mol. and Cell. Probes 6, 505-512, 1992; en los que se unen quelatos de lantánidos fluorescentes (p. ej. europio, samario y terbio) a un componente de un par de fijación específico. Los componentes desconocidos se ensayan ya sea por un inmunoensayo de competición, ya sea por hibridación de ácido nucleico, después de lo cual se mide la fluorescencia. Los lantánidos fluorescentes tienen picos de emisión escasos y los componentes de los pares Eu^{3+}/Sm^{3+} y Eu^{3+}/Tb^{3+} tienen máximos de emisión lo suficientemente distanciados como para que puedan distinguirse entre sí. Además, la desintegración fluorescente posterior a la excitación del Eu tiene una vida relativamente larga, mientras que la del Sm y la del Tb son extremadamente cortas, lo cual proporciona otra manera de distinguir las señales: midiendo la fluorescencia de cada quelato en diferentes tiempos.

Un sistema de ensayo generalizado de analito múltiple utilizando derivados de éster de acridinio como grupo informante se ha descrito en Woodhead y col., solicitud PCT WO 91/00511, que no se admite como técnica anterior y que cuenta con una titularidad común con la presente solicitud. Khalil y col., solicitud PCT WO 92/12255, describen un sistema de inmunoensayo de analito dual en fase sólida que emplea un derivado acridinio o fenantridinio como primer reactivo quimioluminiscente y un 1,2-dioxetano, que se convierte en un compuesto intermedio de reacción quimioluminiscente por acción de la fosfatasa alcalina o \beta-galactosidasa, como segundo reactivo quimioluminiscente. El derivado de acridinio da lugar a una señal de fotón de vida corta después de reaccionar con una solución desencadenante, por ejemplo el H_{2}O_{2}. El dioxetano proporciona una señal de vida más larga cuando se desencadena por adición de una enzima apropiada. Cada uno de estos reactivos puede fijarse sobre un componente de un par específico de fijación y se utiliza en un inmunoensayo sándwich en fase sólida. Cada señal se mide durante un período de tiempo diferente.

En el documento WO-A-89/02476 se describen marcadores, cuya estabilidad cambia de forma detectable cuando la sonda, a la que están unidos, está hibridada, dando lugar de este modo un ensayo homogéneo.

Resumen de la invención

En la presente invención se describe la detección y cuantificación simultáneas de más de una secuencia específica de ácido nucleico en una muestra. Específicamente, cada uno de los reactivos marcadores de la presente invención se une a una sonda de ensayo de hibridación específica de oligonucleótido, se mezclan las sondas marcadas y se dejan hibridar con cualquier ácido nucleico existente en la muestra a ensayar que tenga una secuencia suficientemente complementaria de la secuencia de la sonda para permitir la hibridación en condiciones selectivas apropiadas. Entonces puede añadirse un reactivo a la solución, que alterará específicamente al reactivo marcador asociado con la sonda marcada no hibridada, dejando sustancialmente sin alterar al reactivo marcador asociado con las sondas hibridadas. Esto permite que cada compuesto marcador tenga una resistencia diferente a la pérdida de potencial quimioluminiscente en función de si el marcador está asociado a una sonda hibridada o sin hibridar. En una forma preferida de ejecución, el marcador asociado a una sonda hibridada está protegido de este modo.

Usualmente, pero no necesariamente, la reacción de por lo menos dos reactivos quimioluminiscentes se inicia simultáneamente y se detecta y se mide la luz resultante emitida por cada reactivo quimioluminiscente de forma esencialmente simultánea. Sin embargo, en algunos modos de la presente invención, por ejemplo en el modo de pH múltiple, que se discute a continuación, la detección y medición de uno o más reactivos quimioluminiscentes es un acontecimiento temporal separado de la detección y medición de uno o más reactivos quimioluminiscentes diferentes.

La luz emitida puede medirse de formas diferentes, en función del modo de detección de analitos múltiples deseado. Por lo tanto, la luz puede detectarse y medirse: 1) en dos o más longitudes de onda diferentes, 2) durante un período predeterminado de tiempo, 3) en más de un conjunto de condiciones de reacción (como son diferentes concentraciones de ion hidrógeno), o 4) en una combinación de estos métodos. En función del modo y de los reactivos quimioluminiscentes específicos elegidos, los datos obtenidos en esta medición de la luz permiten la detección y medición separadas de cada marcador quimioluminiscente en la muestra a ensayar como indicación de la cantidad de cada analito presente en ella.

Una característica importante de la presente invención es, pues, el diseño y la selección de pares o grupos de reactivos quimioluminiscentes que sean capaces de emitir señales suficientemente distintas entre sí o en condiciones suficientemente distintas para poder detectarse y medirse separadamente después de haberse producido uno o varios acontecimientos que desencadenan la reacción. Es igualmente importante que los miembros de cada par o grupo de reactivos de la presente invención tengan una susceptibilidad similar a la pérdida de su reactividad quimioluminiscente y una resistencia similar a dicha pérdida en función de si están unidos a una sonda hibridada o sin hibridar. En virtud de las propiedades citadas en último lugar, los reactivos marcadores de la presente invención son particularmente útiles, aunque no se limitan a ello, para un sistema homogéneo de ensayo, en el que la presencia y cuantificación de los analitos de interés puede detectarse y medirse sin necesidad de separar físicamente el marcador unido al analito del marcador no unido antes de la detección.

Sin embargo, el solicitante contempla que las composiciones y métodos de la presente invención puedan utilizarse en sistemas heterogéneos y también en combinaciones de sistemas de ensayo homogéneo y heterogéneo. A título meramente ilustrativo y no como limitación del alcance de la presente invención, tal sistema implicar realizar una hidrólisis diferentes de la sonda sin hibridar, fijando con preferencia el híbrido marcado (que contiene una sonda de oligonucleótido de hebra simple marcado y un ácido nucleico diana sin marcar) y no la sonda de oligonucleótido marcado sin hibridar sobre un soporte sólido, por ejemplo una microesfera policatiónica, separando la sonda hibridada de la sonda sin hibridar y después midiendo la quimioluminiscencia del marcador asociado al híbrido, ya sea mientras está unido al soporte, ya sea después de eluirlo del soporte. Los métodos para la hidrólisis diferencial de los marcadores de éster de acridinio unidos a la sonda sin hibridar con respecto al mismo compuesto fijado a la sonda hibridada se describen en Arnold y col., patente US 5,283,174, cuya titularidad es la misma que la de la presente invención.

Por lo tanto, el método y las composiciones de la presente invención sacan partido de la combinación de las dos propiedades ya mencionadas: la capacidad de cada componente de un grupo de compuestos marcadores de emitir una señal que puede distinguirse por separado (distinguibilidad) y la susceptibilidad de cada componente del grupo de perder la actividad quimioluminiscente o la protección contra tal pérdida, en función de si el marcador está unido a la sonda hibridada o sin hibridar (selectividad). Ambas propiedades dependen no solo de la estructura de los compuestos marcadores propiamente dichos, sino también del entorno molecular, en el que están ubicados durante el curso del ensayo. Los factores adicionales pueden incluir, pues, pero sin limitarse a ellos, el tipo y la ubicación de la unión del marcador con la sonda de ácido nucleico, la composición de la solución de ensayo, la naturaleza y reactividad de los restos químicos, las propiedades estéricas del compuesto marcador y cualquier cambio de la configuración molecular o conformación del marcador fijado con respecto a la sonda de ácido nucleico después de la hibridación de la sonda con su ácido nucleico diana.

Se describen aquí los reactivos marcadores ilustrativos que son derivados de acridinio capaces de emitir luz cuando reaccionan con un reactivo desencadenante, por ejemplo una solución alcalina de peróxido de hidrógeno. Sin embargo, el solicitante contempla que puedan utilizarse otros marcadores quimioluminiscentes o métodos (p.ej. electroquimioluminiscencia) y reactivos desencadenantes en el ensayo de analito múltiple de la presente descripción, tales compuestos y métodos resultarán obvios para los expertos en la materia a la luz de la descripción de esta solicitud. Por consiguiente, los ejemplos siguientes se facilitan para describir de forma clara y completa la presente invención según los conocimientos de que dispone el solicitante en el momento presente y en modo alguno se pretende limitar con ellos el alcance de la invención.

Es objeto de la presente invención proporcionar un método rápido, económico y sencillo para detectar simultáneamente dos o más secuencias de ácido nucleico distintas en una muestra a ensayar, dicho ensayo puede realizarse en un solo tubo de ensayo.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un ensayo no radiactivo rápido para la cuantificación simultánea de más de una secuencia de ácido nucleico en una muestra a ensayar, en el que por lo menos dos compuestos marcadores quimioluminiscentes se unen a diferentes sondas de hibridación de oligonucleótidos, cada una de ellas es capaz de hibridarse por lo menos con una de tales secuencias. Después de la hibridación se hacen reaccionar los marcadores quimioluminiscentes marcados, haciendo que emitan luz, que se mide en un luminómetro. Las longitudes de onda o la cinética de la reacción de emisión de luz de cada uno de los compuestos marcadores son suficientemente singulares para permitir la medición separada de la cantidad de cada reactivo marcador en la muestra a ensayar. Un luminómetro puede medir la luz emitida en un amplio intervalo de longitudes de onda en forma de acontecimiento individual o puede medir independientemente y de modo simultáneo cada uno de diversos intervalos estrechos de longitudes de onda. Los expertos en la materia ya conocen ejemplos de este último caso. Por ejemplo pueden utilizarse dos o más tubos multiplicadores (PMT), cada uno de los cuales mide una longitud de onda diferente o un intervalo de longitudes de onda, para medir simultáneamente una misma muestra, o de un detector de matriz de diodos (diode array detector), capaz de medir simultáneamente varias longitudes de onda de luz emitida.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un método para la selección de grupos de diferentes compuestos marcadores capaces de unirse a sondas de oligonucleótido, en el que cada compuesto es igualmente susceptible de la pérdida de potencial quimioluminiscente en función de si está asociado a una sonda hibridada o sin hibridar.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método rápido de ensayo para la detección de la presencia de más de una especie de organismo en una muestra a ensayar.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de ensayo sensible para detectar o cuantificar la presencia de más de un tipo de ácido nucleico en una muestra que contiene un pequeño número de cada tipo de molécula de ácido nucleico.

Otro objeto consiste en proporcionar reactivos marcadores quimioluminiscentes idóneos para el uso en un sistema de ensayo de hibridación de ácido nucleico de analitos múltiples, en el que cada uno de los reactivos es suficientemente estable hasta la reacción con un reactivo desencadenante que sea capaz de utilizarse en un ensayo cuantitativo de la presencia de analitos múltiples.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar reactivos marcadores quimioluminiscentes que tengan cinéticas de reacción suficientemente diferentes como para permitir la diferenciación de las señales de cada reacción y la medición separada de estas señales. A título de ejemplo, las características de apagado de luz (light-off) de un componente del grupo de dos miembros puede provocar virtualmente que toda la quimioluminiscencia se emita rápidamente después de mezclar el reactivo desencadenante con el marcador fijado. El segundo componente del grupo puede tener características de apagado de luz que impliquen un período de emisión de luz relativamente prolongado después de la adición del reactivo desencadenante. Midiendo la quimioluminiscencia en diferentes momentos después de la adición del reactivo desencadenante y realizando un análisis de la luz emitida durante este período, las señales podrán diferenciarse eficazmente y medirse por separado.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar reactivos marcadores quimioluminiscentes que emitan luz después del apagado de luz en longitudes de onda suficientemente estrechas y diferentes, de modo que eligiendo los intervalos apropiados de longitudes de onda para la medición, las señales pueden diferenciarse suficientemente para distinguir un reactivo marcador fijado de uno o otros varios reactivos marcadores fijados, incluso cuando las mediciones se realicen simultáneamente.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar reactivos quimioluminiscentes diseñados para el uso como grupos informantes, cada uno de estos reactivos está unido a una sonda de hibridación de oligonucleótido diferente, capaz de hibridarse específicamente a un ácido nucleico diana que tiene una secuencia suficientemente complementaria para permitir la detección del ácido nucleico diana en las condiciones de hibridación. Una característica de los reactivos quimioluminiscentes preferidos y método de ensayo consiste en que, cuando la sonda de hibridación de oligonucleótido, a la que se fija cada uno de tales reactivos, se hibrida con su ácido nucleico diana, cada uno de los reactivos de la presente invención se protege de igual manera de la degradación en las condiciones, que degradarían a esta población de reactivos unidos a la sonda de oligonucleótido sin hibridar. Una característica adicional de los reactivos quimioluminiscentes de la presente invención es que son igualmente susceptibles de degradación cuando se unen a sondas sin hibridar. Otra característica más del método preferido es que, aunque los marcadores estén protegidos contra la degradación, cuando están asociados con una región de ácido nucleico de doble hebra, cada uno de estos marcadores es igualmente susceptible de reaccionar con un reactivo desencadenante apropiado, provocando la puesta en marcha de una reacción quimioluminiscente.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un método para la detección y cuantificación de más de un analito en una muestra en un único recipiente de ensayo realizando la reacción de quimioluminiscencia en diferentes valores de pH y utilizando derivados de éster de acridinio, que tienen diferentes pH óptimos para la reacción de quimioluminiscencia. Esto se consigue marcando un componente de un par de unión analito-sonda con un primer éster de acridinio y marcando los componentes de uno o varios pares más de analito-sonda con ésteres de acridinio adicionales. Después de dejar que los componentes correspondientes se unan a su par de analito, si está presente, los marcadores no fijados se hidrolizan selectivamente para destruir el potencial quimioluminiscente del éster de acridinio fijado a ellos. El éster de acridinio restante, fijado sobre complejos de sonda-analito, se somete a un "apagado de luz" en el primer pH y se miden a lo largo del tiempo las características de emisión de luz de la mezcla reaccionante resultante. Se ajusta el pH a un valor de pH diferente y se miden de nuevo a lo largo del tiempo las características de emisión de luz. Este método no se limita al uso de dos valores de pH: se comprenderá fácilmente que pueden utilizarse dos o más compuestos quimioluminiscentes que tengan pH óptimos diferentes para la reacción de quimioluminiscencia. Además, este método puede utilizarse en combinación con otros métodos de discriminación descritos en esta solicitud, por ejemplo midiendo la luz emitida en longitudes de onda diferentes u observando la cinética de la reacción, empleando diferentes longitudes de onda o diferentes cinéticas de reacción para medir o para detectar la presencia de más de un analito en cada incremento de pH.

Breve descripción de las figuras

En la figura 1 se representan las estructuras de derivados representativos de éster de acridinio empleados como formas de ejecución preferidas de reactivos marcadores en la presente invención. Para la estructura de los compuestos 1- o 3-me-AE, 1- o 3-me-o-F-AE y 1- o 3-me-m-diF-AE, se representa un grupo metilo junto a la posición 2 del anillo acridinio; esto indica que el grupo metilo puede estar unido a la posición 1 ó a la 3.

La figura 2 es una tabla que representa los pares previstos de derivados de éster de acridinio que pueden utilizarse juntos en el ensayo de analito múltiple de la presente invención. La letra "Y" indica que los dos reactivos está previsto que sean pares compatibles en la invención, y una "N" indica que los compuestos estaría previsto que sean incompatibles en este ensayo. Los números de 1 a 3 de la columna izquierda de la tabla indican el tipo de sistema de ensayo: 1 significa un sistema de ensayo homogéneo de fase única, 2 indica la hidrólisis diferencial en fase acuosa y la separación física de complejos de sonda de oligonucleótido hibridada-diana, 3 indica un sistema de ensayo en el que no tiene lugar una hidrólisis diferencial y en el que se separan físicamente los complejos de sonda hidridada-diana. Los números separados por una barra inclinada debajo de cada uno de los derivados de éster de acridinio mencionados son el tiempo hasta alcanzar el pico y la duración de la reacción, respectivamente. Los números debajo de este renglón son la vida media de hidrólisis de cada reactivo marcador cuando está unido a una sonda de oligonucleótido no hibridada. Finalmente, los criterios de selección en los que se basa esta tabla se explican en la cabecera de la figura.

La figura 3 es una representación gráfica de un ejemplo utilizando dos reactivos marcadores en un modo de pH múltiple de la presente invención. En cada una de las figuras 3A-C se añade un reactivo desencadenante a la solución en un intervalo de 5 y las mezclas reaccionantes se desplazan de pH aproximadamente 12,1 a pH aproximadamente 13,0 en un intervalo de tiempo de 90, que se representa en el eje X de la gráfica. En la figura 3A se representa la luz emitida por una mezcla reaccionante que contiene solamente el AE estándar. En la figura 3B se representa la luz emitida por una mezcla reaccionante que contiene solamente el o-F-AE. En la figura 3C se representa la luz emitida por una mezcla reaccionante que contiene tanto el AE como el o-F-AE estándar.

La figura 4 es una representación gráfica de los perfiles de emisión de luz característicos de solapamiento de cinco combinaciones diferentes de reactivos marcadores quimioluminiscentes a lo largo del tiempo. Se añade un reactivo desencadenante a cada mezcla reaccionante en el tiempo cero. Los reactivos marcadores empleados en esta figura son: o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-Me-AE y o-diMe-AE.

La figura 5 es una representación gráfica de los perfiles de emisión de luz característicos de solapamiento de cinco combinaciones diferentes de reactivos marcadores quimioluminiscentes a lo largo del tiempo. Se añade un reactivo desencadenante a cada mezcla reaccionante en el tiempo cero. Los reactivos marcadores empleados en esta figura son: o-diBr-AE, una mezcla de 1- y 3-Me-AE, o-AE, o-Me-AE y o-diMe-AE.

La figura 6 es una representación gráfica de los perfiles de emisión de luz característicos de solapamiento de cinco combinaciones diferentes de reactivos marcadores quimioluminiscentes a lo largo del tiempo. Se añade un reactivo desencadenante a cada mezcla reaccionante en el tiempo cero. Los reactivos marcadores empleados en esta figura son: o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, una mezcla de 1- y 3-Me-AE, o-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-Me-AE y o-diMe-AE.

En la figura 7 se representan los perfiles de emisión de luz característicos de solapamiento de cuatro reactivos marcadores quimioluminiscentes en un modo de ensayo de pH múltiple a lo largo del tiempo. En la figura se pone de manifiesto la capacidad del presente ensayo para detectar cuatro analitos en un sistema de ensayo de modo múltiple.

En las figuras de 8A a 8I se pone de manifiesto gráficamente la correlación los perfiles esperados de emisión de luz de los reactivos marcadores quimioluminiscentes combinados frente a los perfiles reales de emisión de luz obtenidos. Los reactivos marcadores quimioluminiscentes que se emplean son: o-diBr-AE, o-F-AE, AE estándar y o-MeO-AE. Las reacciones quimioluminiscentes se realizan en un sistema de ensayo de pH múltiple en condiciones idénticas.

Las figuras de 9A a 9D son espectros de quimioluminiscencia de dos derivados de éster de acridinio; en las figuras 9A y 9B se representan los espectros separados del 2,7-diMe-AE y del AE estándar, respectivamente. En la figura 9C se representa un solapamiento generado por ordenador de cada espectro en una gráfica individual. En la figura 9D se representa la simulación generada por ordenador de los dos espectros.

Descripción detallada de las formas de ejecución preferidas

La presente invención comprende composiciones y métodos para la detección específica de múltiples analitos diferentes, con preferencia de ácidos nucleicos, en una misma muestra a analizar. Por lo tanto, en una forma preferida de ejecución, la invención puede utilizarse para detectar la presencia de más de una secuencia de ácido nucleico en una muestra de análisis o clínica. En una forma especialmente preferida de ejecución, dicha secuencia de ácido nucleico puede indicar una enfermedad o una infección concreta.

Definiciones

A menos que se indique explícitamente lo contrario, en la presente solicitud los términos siguientes tienen los significados siguientes.

Se entiende por "analito de ácido nucleico" por lo menos una región de la secuencia de ácido nucleico o nucleótido, cuya presencia y/o cantidad se considera que se detectará con un reactivo marcador único empleando los métodos y composiciones de la presente invención, si está presente en una muestra. El analito puede ser una molécula de un ácido nucleico individual que tenga una o varias regiones diana distintas o más de una molécula diferente, cada una de las cuales tiene una o varias regiones diana distintas. Como alternativa, un analito puede ser una secuencia de nucleótido concreto perteneciente a un ácido nucleico individual; por consiguiente, un ácido nucleico individual puede contener más de un analito de ácido nucleico. Sin embargo, el solicitante contempla que algunas veces puede ser deseable detectar más de una región diana, ya sea en una misma molécula de ácido nucleico, ya sea en moléculas diferentes, o en ambos casos, utilizando el mismo marcador de sonda. Esto permitirá, por ejemplo, alcanzar o impactar sobre el r-DNA cromosómico y el RNA ribosómico de un primer organismo con una o varias sondas que lleven un marcador y alcanzar o impactar sobre el r-DNA cromosómico y el RNA ribosómico de un segundo organismo con una o varias sondas que lleven otro marcador. En tal caso, el primer analito consta de todas las regiones diana de la secuencia de nucleótido del o de los ácido nucleico(s) del primer organismo, y el segundo analito consta de todas las regiones diana de la secuencia de nucleótido del o de los ácido nucleico(s) del segundo organismo.

Se entiende por "región diana" o "secuencia diana de nucleótido" la porción de una molécula de analito que se fija sobre una sonda o grupo de sondas determinado. Cuando el analito es una o varias moléculas de ácido nucleico, la región diana tiene una secuencia de nucleótido en una región por lo menos de uno de dichos ácidos nucleicos, que se fijará específicamente a una sonda de hibridación de oligonucleótido en condiciones de hibridación, que no favorecen la hibridación de dichas sondas sobre regiones de secuencia de ácido nucleico o de nucleótido que no son dianas. Una región diana concreta puede estar completamente separada de otras regiones diana, tanto si pertenecen a la misma o a diferentes moléculas de ácido nucleico. Como alternativa, una región diana determinada puede pertenecer, sin limitación, a la misma molécula de ácido nucleico que otra región diana y solapar a uno o varios nucleótidos de la otra región diana, resultar solapada por uno o varios nucleótidos de la otra región diana o puede estar completamente contenida dentro de la otra secuencia diana de nucleótidos.

Se entiende por "sonda", "sonda de ácido nucleico", "sonda de hibridación" o "sonda de oligonucleótido" un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótido suficientemente complementaria de una secuencia de nucleótido diana contenida en un analito de ácido nucleico para permitir que dicho oligonucleótido se hibride con él en condiciones de hibridación muy restrictivas. Cuando se emplea la palabra "sonda", los expertos en la materia entienden por ella que el término se aplica a una o varias moléculas de oligonucleótido, ya sean idénticas, ya sean no idénticas, que se han diseñado, elegido, y/o que de cualquier manera son capaces de hibridarse específicamente con una región diana de ácido nucleico. Además, una sonda definida aquí puede contener una colección de diferentes moléculas de oligonucleótido dirigida hacia una o varias regiones diana del mismo analito de ácido nucleico. Por lo tanto, el término "sonda" utilizados aquí pueden significar ya sea el singular, ya sea el plural, dicho significado resultará claro del contexto de uso de la presente descripción. Por definición, este término se refiere con preferencia a oligonucleótidos que tienen una longitud de 10 a 100 nucleótidos.

Se entiende por "ácidos nucleicos no diana" aquellos ácido nucleicos que no está previsto que se detecten en un ensayo determinado utilizando los métodos o composiciones de la presente invención.

Se entiende por "muestra" o "muestra de ensayo" cualquier solución acuosa o miscible con agua, suspensión o emulsión, de la que se sospecha que contiene uno o varios analitos de ácido nucleico. Tal muestra puede incluir, sin limitación, a los ácidos nucleicos purificados o sin purificar, partículas de virus y/o células de plantas, animales, protozoos o bacterias, y puede derivarse, sin limitación, del laboratorio, del medio ambiente, de la agricultura, de alimentos, de fuentes humanas, animales, excretorias y secretorias. Una muestra a analizar puede obtenerse como resultado de un tratamiento previo de una muestra anterior, por ejemplo, pero sin limitación, por homogeneización, concentración, suspensión, extracción, solubilización, digestión, lisado, dilución o molienda de una muestra anterior, para poner el presunto analito de ácido nucleico, si está presente, en un medio que contiene agua.

Se entiende por "marcador quimioluminiscente" cualquier entidad o compuesto químico, capaz de unirse a otra entidad o compuesto químico, que puede participar en una reacción de índole química, que produce la emisión de luz a través de un compuesto intermedio químico de alta energía. Los marcadores quimioluminiscentes preferidos de la presente invención son derivados de acridinio; son mayor preferencia son derivados de éster de acridinio.

Se entiende por "unido" que dos o más entidades o compuestos químicos se unen mediante un enlace químico o una asociación química. Por tanto, se entiende que el término abarca los enlaces covalentes y también los enlaces fuertes no covalentes, por ejemplo los formados entre la avidina y biotina, o un agente quelante y uno o varios iones secuestrados.

Se entiende por "tomado como diana" que una entidad química, física o biológica específica se toma como objetivo a identificar. Una entidad química definida de este modo puede incluir una porción de una entidad mayor, por ejemplo una región de secuencia de nucleótido de un ácido nucleico. Una entidad biológica puede incluir según esta definición un grupo de organismos, por ejemplo una o varias especies, géneros, clases, grupos, etcétera.

Se entiende por "reacción que emite luz" una reacción química desencadenable que produce una cantidad detectable de luz, emitida por uno o varios reactivos. Se entiende por desencadenable que la reacción química se inicia con la adición de un reactivo o de energía (por ejemplo una carga eléctrica) a la mezcla reaccionante, o que la cinética de la reacción se hace más favorable por ajuste de una o varias condiciones de reacción, por ejemplo la temperatura o el pH.

Se entiende por "suficientemente distinto" que la o las longitudes de onda de emisión de luz, el tiempo hasta alcanzar el pico, la duración de la reacción u otras características de la reacción de dos o más marcadores quimioluminiscentes distintos pueden distinguirse cuando se combinan en una mezcla reaccionante y provocan la emisión de luz en una mezcla reaccionante desencadenable y emisora de luz.

Se entiende por "hibridar específicamente" que un ácido nucleico de hebra simple puede formar un dúplex estable de unión por hidrógeno con una región de secuencia de ácido nucleico o de nucleótido tomada como diana en las condiciones de hibridación, que no favorecen la formación de dúplex estables de doble hebra entre el mismo ácido nucleico de hebra simple y las regiones de secuencias de ácidos nucleicos o de nucleótidos no tomadas como dianas.

Se entiende por "protegido de modo similar" que los porcentajes de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes unidos a sondas de ensayo de hibridación de nucleótidos disminuyen en función de si la sonda está hibridada con una región de secuencia de ácido nucleico o de nucleótido tomada como diana y que los porcentajes de dicha pérdida tienen un valor comprendido con preferencia dentro de un factor de hasta 250 entre sí en las mismas condiciones.

Se entiende por "susceptible de modo similar" que los porcentajes de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes unidos a sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido por exposición a un agente desestabilizante están situados dentro de un factor de aprox. 50 entre sí en condiciones idénti-
cas.

Se entiende por "potencial quimioluminiscente" la capacidad de un marcador quimioluminiscente determinado para reaccionar en una mezcla reaccionante desencadenable y emisora de luz. La pérdida de potencial quimioluminiscente se produce cuando tal marcador quimioluminiscente se degrada químicamente o se transforma en un compuesto no quimioluminiscente.

Se entiende por "pH de reacción óptimo" o "pH de reacción óptimos" el valor de pH, en el que progresará la reacción de quimioluminiscencia, en la que participa un marcador quimioluminiscente determinado, con la máxima emisión de luz en condiciones definidas. Si en la misma mezcla reaccionante están presentes varios compuestos quimioluminiscentes, entonces podrá haber dos o más pH óptimos para la mezcla reaccionante quimioluminiscente. El rendimiento de emisión de luz (como función del pH) puede aumentar gradualmente a medida que el pH se acerca a su valor óptimo, de modo que un marcador quimioluminiscente determinado puede que emita poca luz en el primer pH, mientras que el mismo marcador puede emitir mucha más luz en un valor de pH que difiere en 1,0 o en 0,5 unidades del primero.

Se entiende por "puesta en marcha" o "inicio" la adición de energía, de un catalizador o de uno o varios reactivos a una mezcla reaccionante que contiene los reactivos quimioluminiscentes que provocarán el comienzo de una reacción emisora de luz.

Se entiende por "derivado de acridinio" cualquier compuesto del grupo de compuestos quimioluminiscentes basados en el anillo de acridinio.

Se entiende por "derivado de éster de acridinio" cualquier compuesto del grupo de compuestos quimioluminiscentes basados en el anillo de acridinio y que tienen un enlace éster que parte de la posición C-9.

Se entiende por "cinética de reacción" la velocidad con que progresa una reacción emisora de luz, determinada por la cantidad de luz emitida por el compuesto o compuestos quimioluminiscentes que participan en ella en un intervalo determinado de tiempo, en función del tiempo. El término "cinética de reacción" incluye, pues, una referencia a la cantidad de tiempo entre el inicio de una reacción de quimioluminiscencia y la amplitud máxima de emisión de luz (tiempo hasta alcanzar el pico), así como la duración de emisión de luz después del inicio en una mezcla reaccionante determinada. La cinética de reacción de una mezcla reaccionante que contiene un marcador quimioluminiscente determinado puede representarse en forma de gráfica como cantidad de luz emitida en un período dado de tiempo frente al tiempo y la curva así obtenida es reproducible y característica de un reactivo quimioluminiscente determinado, en las mismas condiciones de reacción.

Los reactivos empleados en las formas de ejecución preferidas de la presente invención son derivados de acridinio, con preferencia derivados de éster fenilo de acridinio. En la figura 1 se representan ejemplos de derivados representativos de éster de fenilo de acridinio. Se da por supuesto que podrán encontrarse otros reactivos quimioluminiscentes y derivados de éster de acridinio idóneos, incluidos otros derivados de acridinio, que puedan utilizarse en la presente invención a la luz de la presente descripción después de realizar una exploración rutinaria. Los compuestos de éster fenilo de acridinio son derivados de acridina que poseen un centro de nitrógeno cuaternario y se derivatizan en la posición 9 para obtener un resto éster de fenilo. Los derivados de acridinio útiles para la presente invención, tanto si son ésteres de fenilo como no, tienen en común la propiedad de reaccionar con peróxido de hidrógeno para formar un anillo dioxetano provisional que contiene el carbono C-9 del anillo acridinio, con posterior formación de una acridona excitada. La relajación radiactiva de la acridona excitada se traduce en la producción de luz. La síntesis de ésteres de acridinio, así como una descripción general de su uso como reactivos marcadores quimioluminiscentes, se describe en Weeks y col., Acridinium Esters as High Specific Activity Labels in Immunoassays, Clin. Chem. 29, 1474-1478, 1984, ya citado previamente.

En una forma preferida de ejecución, los ésteres de acridinio pueden unirse, utilizando técnicas químicas estándar, a una unidad monómera no nucleótida, que tiene un "brazo de engarce" de amina primaria, disponible para la unión con el resto de éster de acridinio, que se inserta entre secuencias contiguas de nucleótidos durante la síntesis química de los oligonucleótidos, o se coloca en la posición terminal del oligonucleótido, véase, Arnold y col., Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes, publicación EPO nº 313219 cuya titularidad es la misma que la de la presente invención.

El resto del brazo de engarce, al que se unirá el marcador, está situado en una posición predeterminada dentro del oligonucleótido. Puede colocarse como inserción entre o como sustitución de uno o varios nucleótidos que contienen una secuencia de ácido nucleico lo suficientemente complementaria por lo menos con una porción de un ácido nucleico diana para que sea capaz de hibridarse en condiciones restrictivas de hibridación. La síntesis de oligonucleótidos en fase sólida es muy conocida en la técnica y se ha descrito en Brown & Brown, Modern Machine-Aided Methods of Oligodeoxiribonucleotide Synthesis, en: Oligonucleotides and Analogues - A Practiced Approach (1991).

Los derivados de éster de acridinio pueden unirse a un conjugado de brazo de engarce-sonda de hibridación utilizando métodos muy conocidos de la técnica. Los solicitantes emplean con preferencia los métodos descritos por Nelson y col., Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence in Non-Isotopic Probe Techniques (Academic Press, 1992); Arnold y col., Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes, publicación EPO nº 313219.

Por lo tanto, en un método preferido se sintetiza un éster de acridinio de N-hidroxisuccinimida (NHS) (p.ej. el 9-carboxilato-fluorsulfonato de 4-(2-succinimidiloxicarbonil-etil)-fenil-10-metilacridinio) del modo descrito por Weeks y col., lugar citado. Reacción del conjugado del brazo de engarce de amina primar-sonda de hibridación con el éster de acridinio NHS elegido se realiza del modo siguiente. Se sintetiza el conjugado de sonda de hibridación de oligonucleótido-brazo de engarce del modo descrito antes, se seca con vacío en un aparato secador del tipo Savant Speed-Vac™, después se disuelve en 8 \mul de tampón HEPES 0,125 M (pH 8,0) en DMSO del 50% (v/v). A esta solución se le añaden 2 \mul de una solución 25 mM de del éster de acridinio NHS deseado. Se mezcla la solución y se incuba a 37°C durante 20 minutos.

Se añaden otros 3 \mul de una solución 25 mM de éster de acridinio NHS en DMSO a la solución y se mezcla suavemente, después se le añaden 2 \mul de tampón HEPES 0,1 M (pH 8,0), se mezclan y se mantiene el tubo en incubación a 37ºC durante 20 minutos más. Se interrumpe la reacción con la adición de 5 \mul de lisina 0,125 M en tampón HEPES 0,1 M (pH 8,0) en DMSO, que se mezcla suavemente con la solución.

Se recupera de la solución el oligonucleótido marcado por adición de 30 \mul de tampón acetato sódico 3 M (pH 5,0), 245 \mul de agua y 5 \mul de glucógeno de 40 mg/ml. Se añaden al tubo seiscientos cuarenta microlitros de etanol del 100% enfriado y se mantiene el tubo en hielo seco durante un tiempo de 5 a 10 minutos. Se sedimentan los ácidos nucleicos marcados precipitados en una microcentrífuga refrigerada a 15.000 rpm utilizando un cabezal de rotor estándar. Se separa el líquido sobrenadante por aspiración y se disuelve de nuevo el culote en 20 \mul de acetato sódico 0,1 M (pH 5,0) que contiene un 0,1% (p/v) de dodecil-sulfato sódico (SDS).

A continuación puede purificarse el oligómero marcado, si se considera necesario o deseable; los métodos de purificación de oligonucleótidos marcados son bien conocidos en la técnica. En un método preferido descrito por Arnold y col., Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes, patente US-5,185,439 (cuyos titulares son los mismos que los de la presente solicitud), se purifica el oligómero realizando una cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC). Se introduce la muestra en una columna Vydac C4 de HPLC en fase inversa y se eluye con un gradiente lineal del 10% al 15% de tampón B en 25 minutos, en el que el tampón A es acetato de trietilamonio al 0,1% (p/v) (pH 7,0) en agua de calidad HPLC y el tampón B es acetonitrilo del 100%. Se mide la absorbancia del líquido saliente resultante a 260 nm y se recogen fracciones de 0,5 ml. Después se ensaya la quimioluminiscencia de las fracciones, las fracciones correspondientes al pico activo principal se precipitan con etanol y se suspenden de nuevo las sondas marcadas en acetato sódico 0,1 M (pH 5,0) que contiene un 0,1% de SOS.

Las composiciones y métodos de la presente invención son utilizan con preferencia en combinación con el ensayo de protección de hibridación (HPA) descrito por Nelson y col., Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence, en: Non-Isotopic Probe Techniques (Academic Press 1992) y Arnold y col., patente US-5,283,174. En este formato de ensayo, los reactivos marcadores de éster de acridinio son susceptibles de hidrólisis cuando están unidos a la sonda sin hibridar, pero están protegidos contra la hidrólisis si están unidos a una sonda hibridada. Las características de hidrólisis diferencial de este sistema permite un ensayo homogéneo en fase única, en el que la hibridación de una sonda con la diana, la discriminación entre sonda hibridada y sin hibridar y la detección y/o cuantificación de la sonda hibridada marcada pueden realizarse en un solo tubo de ensayo. Sin embargo, la hidrólisis diferencial no es el único método para diferenciar una sonda hibridada de otra sin hibridar; otras modificaciones químicas del marcador quimioluminiscente, por ejemplo la formación de aducto, pueden o podrían ser capaces de diferenciar entre un marcador quimioluminiscente unido a una sonda hibridada frente al unido a una sonda sin hibridar. Además, el formato de ensayo aquí descrito puede aplicarse también a un formato de ensayo de combinación de elementos de ensayos homogéneos y heterogéneos.

Los ejemplos siguientes son meramente ilustrativos y en modo alguno limitan el alcance de la presente invención, que se define en las reivindicaciones que siguen a esta descripción.

Ejemplo 1 Ensayo y exploración iniciales de varios derivados de éster de acridinio Síntesis de reactivos marcadores de AE

Los reactivos marcadores de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) de derivados de ésteres de acridinio (AE) se sintetizan en general del modo descrito por Weeks y col., lugar citado. Para estas síntesis se emplean materiales y reactivos de gran pureza que son productos comerciales suministrados por Aldrich, Lancaster Synthesis y Fisher Scientific. El ácido 9-acridinacarboxílico (ACA) o un derivado sustituido por metilo o dimetilo, obtenido del modo descrito a continuación, se convierte en el correspondiente cloruro de ácido de acridina por reflujo con cloruro de tionilo durante 4 horas. Los hidroxifenil- o hidroxinaftil-ácidos que son productos comerciales, a saber, el ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico, el ácido 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil) propiónico, el ácido 4-hidroxi-3-metoxicinámico y el ácido 6-hidroxi-2-naftoico se convierten en los ésteres de bencilo (Bz) por tratamiento de sus sales potásicas con bromuro de bencilo en una solución de etanol (EtOH) del 95% en las condiciones de reflujo durante unas 3 horas. Estos ésteres de bencilo se hacen reaccionar con los cloruros de ácido de acridina en piridina anhidra a temperatura ambiente durante unas 4 horas obteniéndose los ésteres de acridina. Los grupos protectores del éster de bencilo se hidrolizan por tratamiento de los ésteres de acridina con bromuro de hidrógeno (HBr) del 30% en peso en ácido acético (HOAc) a 60ºC durante unas 4 horas. Se convierte el ácido resultante en el reactivo éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) utilizando un catalizador de diciclohexilcarbodiimida (DCC) en tetrahidrofurano anhidro (THF). Finalmente se realiza la transformación en el reactivo marcador de metil-acridinio por metilación de la acridina mediante tratamiento con un exceso de trifluormetanosulfonato de metilo (triflato de metilo) en cloruro de metileno anhidro a temperatura ambiente durante un tiempo de 5 a 24 horas. Los reactivos marcadores de éster de NHS utilizados para los AE estándar, naftil-AE, o-MeO-AE y o-MeO-(cinamil)-AE se obtienen de esta manera. Los reactivos marcadores de ésteres de NHS utilizados para el 4,5-diMeAE, 2,7-diMe-AE y la mezcla de 1- y 3-Me-AE requieren la síntesis de los ACA sustituidos por metilo y dimetilo, descrita a continuación.

Los derivados del ácido 9-acridinacarboxílico (ACA) sustituidos por dimetilo en las posiciones 4,5 y 2,7 se obtienen por reacciones de cloruro de oxalilo con difenilaminas sustituidas por dimetilo para obtener los productos intermedios isatina, con posterior reordenamiento para obtener las acridinas oportunamente sustituidas, esencialmente del modo descrito para el ácido 4,5-dimetilacridina-9-carboxílico por M.S. Newman y W.H. Powell, J. Org. Chem. 26, 812-815, 1961. En primer lugar se obtienen la 2,2'-dimetildifenilamina y la 4,4'-dimetildifenilamina por reacción de la 2- y 4-metilformanilida con un ligero exceso de 2- y 4-bromotolueno, respectivamente, en presencia de carbonato sódico anhidro y trazas de cobre en nitrobenceno a 200°C durante 24 horas. La hidrólisis de las N,N-difenilformamidas resultantes se lleva a cabo por reflujo de las mismas en una mezcla 1:1 (v/v) de HCl concentrado y ácido acético (HOAc) durante 5 horas para obtener la dimetildifenil-aminas en buenos rendimientos después de la purificación a través de gel de sílice. Se preparan los ácidos acridinacarboxílico sustituidos por dimetilo a través de las isatinas, después se realiza la reacción de la 2,2'-dimetildifenilamina o 4,4'-dimetildifenilamina obtenida antes con cloruro de oxalilo en disulfuro de carbono a reflujo durante unas 3 horas. Después de la evaporación del disolvente y exceso de reactivos, se recoge el residuo amarillo en disulfuro de carbono fresco y se trata con cloruro de aluminio durante un período de unos 30 minutos, se mantiene en reflujo durante 4 horas y se deja en reposo a temperatura ambiente durante una noche. Después de la evaporación de los disolventes, se reparte el residuo entre cloruro de metileno y HCl concentrado del 10% (v/v) frío. De la fase orgánica se recuperan las isatinas anaranjadas. Finalmente, por tratamiento de las isatinas con hidróxido potásico (KOH) del 10% (p/v) a reflujo durante 12 horas se forman el ácido de 4,5-dimetilacridina-9-carboxílico (4,5-diMe-ACA) y el ácido 2,7-dimetilacridina-9-carboxílico (2,7-diMe-ACA), respectivamente. De manera similar se trata la 3-metildifenilamina con cloruro de oxalilo y cloruro de aluminio para obtener una mezcla de metilfenilisatinas, que después de un reordenamiento mediante tratamiento con KOH, del modo recién descrito, permite obtener una mezcla de ácidos 1- y 3-metilacridina-9-carboxílico (1- y 3-Me-ACA). Por esterificación del 4,5-diMe-ACA, 2,7-diMe-ACA, o la mezcla de 1- y 3-Me-ACA con el éster bencílico del 3-(4-hidroxifenil)-propionato y las reacciones ulteriores recién descritas se obtienen los reactivos marcadores ésteres de NHS empleados para el 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE y la mezcla de 1- y 3-Me-AE, respectivamente.

Diversos derivados de ácido hidroxifenilpropiónico sustituido, que no son productos comerciales, pueden obtenerse por métodos convencionales. Se obtiene el ácido 3-(4-hidroxi-3,5-dibromofenil)-propiónico por bromación del ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico con bromo en ácido acético glacial (HOAc). Se obtiene el ácido 3-(2-hidroxifenil)propiónico por hidrogenación de 2-hidroxicinámico con catalizador de paladio sobre carbón en etanol absoluto (EtOH). La obtención del éster de acridinio (AE) puede realizarse seguidamente por reacción del ACA con los ésteres bencílicos de estos ácidos, del modo indicado antes, obteniéndose los reactivos marcadores de ésteres de NHS empleados para el o-diBr-AE y orto-AE, respectivamente.

Se obtienen además los derivados de propionitrilo de varios fenoles sustituidos, a saber, el 2-metilfenol, 2,6-dimetilfenol, 3,5-dimetilfenol, 2-fluorfenol y 3,5-difluorfenol, por cianoetilación mediante la condensación, catalizada con cloruro de aluminio, del acrilonitrilo con el fenol y aislamiento del correspondiente 4-hidroxifenilpropionitrilo sustituido. Estos derivados de hidroxifenilpropionitrilo se hacen reaccionar después con los cloruros de ácido de acridina y se tratan los compuestos éster resultantes con cloruro de hidrógeno para hidrolizar los nitrilos y obtener los correspondientes derivados de ácido propiónico que pueden procesarse seguidamente del modo descrito anteriormente para obtener los correspondientes marcadores reactivos de ésteres de AE-NHS. Como alternativa, los propionitrilos podrían en primer lugar hidrolizarse y obtener los correspondientes derivados de ácido propiónico y la síntesis podría efectuarse a través de los ésteres bencílicos. Los pasos finales para obtener los reactivos AE-NHS serían los mismos que se han indicado antes. De este modo se obtienen los reactivos marcadores de ésteres de NHS empleados para el o-diMe-AE, m-diMe-AE, o-Me-AE, o-F-AE, 1- o 3-Me-o-FAE y 1- o 3-Me-m-diF-AE.

Los expertos en la materia comprenderán fácilmente que estos esquemas de síntesis pueden utilizarse de modo más general para obtener derivados de éster de acridinio adicionales y diferentes para la caracterización y exploración, tal como se describe a continuación.

Caracterización y exploración de derivados de AE

La quimioluminiscencia y las características de hidrólisis de estos derivados se comparan con las de los AE estándar (9-carboxilato-fluorsulfonato del 4-(2-succinimidiloxicarbonil-etil)fenil-10-metilacridinio).

Los derivados ilustrativos de AE empleados para ilustrar la presente invención son el naftil-AE, o-diBr-AE, una mezcla de 1- y 3-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE, o-diMe-AE, o-Me-AE, m-diMe-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-MeO-AE, o-AE (un derivado de éster de acridinio que tiene el brazo de engarce de unión al ácido nucleico fijado sobre el anillo fenilo en posición orto), o-F-AE, una mezcla de 1- y 3-Me-o-F-AE, el AE estándar y una mezcla de 1- y 3-Me-m-diF-AE (véase la figura 1). El 1-Me-AE, 1-Me-o-F-AE y 1-Me-m-diF-AE están presentes únicamente en una mezcla con sus isómeros 3-metilo; tal como se emplean en esta solicitud, estas nomenclaturas significan una mezcla de los correspondientes derivados 1- y 3-metilo. Tal como se representa en la figura 1, estos compuestos se emplean para marcar varios oligonucleótidos que se van a emplear como sondas de hibridación. Los expertos en la materia comprenderán fácilmente que la presente invención no depende del uso de ninguna combinación concreta de particular sonda-diana. Por consiguiente, elegir dos o más combinaciones sonda-diana recíprocamente excluyentes para el uso en el ensayo actualmente en cuestión sería un trabajo rutinario a la luz de la presente descripción.

Los oligonucleótidos se sintetizan para que contengan enlaces fosfodiéster utilizando la química estándar de fosforamidita en fase sólida, en un sintetizador del tipo Biosearch 8750 o ABI 380A DNA Synthesizer y se purifican por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida; la síntesis de oligonucleótidos y las técnicas de purificación son perfectamente conocidas de los técnicos (véase p.ej. Sambrook y col., lugar citado). También son conocidos en la técnica varios oligonucleótidos que no son de origen natural, por ejemplo los que tienen uniones entre nucleótidos modificadas, por ejemplo uniones de tipo fosforotioato, o los que tienen modificaciones de tipo azúcar o base, que pueden tener ventajas, por ejemplo una mejor estabilidad en ciertas aplicaciones; estos análogos de ácido nucleico están también contemplados para el uso como parte de la invención de la presente solicitud.

Tal como se ha descrito anteriormente, se incorpora un brazo de engarce terminado en amina primaria a cada estructura de oligonucleótido en una posición predeterminada de la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido, constituyendo de esto modo una inserción entre los nucleótidos de la secuencia, véase Arnold y col., Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes, lugar citado. Los derivados de AE se unen al oligonucleótido a través de la amina primaria del brazo de engarce, también detallado anteriormente. Las sondas marcadas se caracterizan y se comparan en lo que respecta a sus propiedades diferenciales de quimioluminiscencia, de hibridación y de hidrólisis:

Se transfieren partes alícuotas de diez microlitros de las sondas marcadas a tubos de poliestireno de 12 x 75 y se mide la quimioluminiscencia en un luminómetro LEADER® 50 (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) por inyección automática de una solución de 200 \mul de H_{2}O_{2} del 0,1% y HCl 0,4 N, un inyección automática, con una demora de 0,1 a 2 segundos, de 200 \mul de NaOH 1N y medición de la quimioluminiscencia durante 5 segundos. El pH final es de aproximadamente 13.

El luminómetro concreto, descrito aquí, mide longitudes de onda entre 300 y 650 nm; se entenderá que se necesita un luminómetro que detecte la luz emitida en este intervalo de longitudes de onda para que pueda ser útiles en los métodos y composiciones de la presente invención. De hecho, en ciertos modos del presente método, por ejemplo en un modo de múltiples longitudes de onda, puede ser útil o necesario para un luminómetro que mida la luz emitida en un intervalo más amplio o más estrecho de longitudes de onda que el descrito aquí o que de forma independiente y simultánea pueda leer más de una longitud de onda más estrecha. Por lo tanto, la amplitud de longitudes de onda detectadas en el ejemplo aquí descrito deberá tomarse meramente como ilustrativa y no como una limitación del alcance de la presente invención.

Las características de la reacción de quimioluminiscencia se determinan midiendo la luz emitida por los derivados de éster de acridinio que reaccionan. La luz emitida se cuantifica en el luminómetro utilizando unidades relativas de luz (RLU), una unidad de medida que indica el número relativo de fotones emitidos por la muestra la muestra a una longitud de onda o a una banda de longitudes de onda determinadas. Se detecta la luz en momentos múltiples durante un período de medición de 5 segundos. A partir de estos datos se determinan el período de tiempo requerido para que cada oligonucleótido marcado pueda alcanzar el pico de emisión de luz ("tiempo hasta alcanzar el pico") y la duración de la emisión de luz. Se define la "duración" arbitrariamente para indicar el tiempo requerido para que las RLU alcancen el 10% de la línea de base después de haberse producido el pico de emisión. Estos datos se recogen en la siguiente tabla 1.

TABLA 1 Características de apagado de luz

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

Además, el pH requerido para cada sonda marcada para emitir la cantidad máxima de luz se determina y define como "pH óptimo". En esta determinación se inicia la reacción del modo descrito antes, excepto que la primera solución reaccionante contiene HCl 0,5 N y en lugar de utilizar NaOH, la segunda solución reaccionante se valora con tampón borato sódico 0,24 M a varios valores de pH. El "tiempo hasta alcanzar el pico" y la duración se calculan para cada sonda marcada al pH óptimo. Estos datos se recogen también en la tabla 1.

Después de determinar la cinética de la reacción de quimioluminiscencia de los oligonucleótidos marcados, se investigan las características de hibridación e hidrólisis de cada oligonucleótido. Se investigan las características de hidrólisis de AE para cada oligonucleótido marcado, hibridado o sin hibridar, en un intervalo de temperaturas y de valores de pH del modo descrito por Nelson y col., lugar citado, y que se resumen brevemente en los ejemplos siguientes.

Ejemplo 2 Determinación de las características de hidrólisis de los derivados de éster de acridinio

En este ejemplo se ilustra un método preferido de exploración de marcadores quimioluminiscentes individuales para determinar sus características de hidrólisis, como es la velocidad de hidrólisis, cuando están unidos a sondas de ensayo de hibridación. El método es útil en particular para la determinación preliminar de la idoneidad de uno o varios derivados de ésteres de acridinio para utilizarse en un sistema de ensayo de analito múltiple. Aunque este método ilustra un método preferido para distinguir químicamente las sondas marcadas hibridadas de las sin hibridar, los expertos en la materia conocen bien otros métodos para separar química o físicamente ácidos nucleicos de hebra simple de ácidos nucleicos total o parcialmente de hebra doble, como son la adsorción sobre hidroxiapatita, la filtración a través de gel o la cromatografía en fase inversa.

Procedimiento general para medir la hidrólisis de sondas libres

En general, cada éster de acridinio potencial se une a una sonda de ensayo de oligonucleótido de hibridación de hebra simple y se purifica la sonda-éster de AE del modo descrito antes. Se añaden diez microlitros de cada éster de acridinio-sonda marcada en PSB (10 \muM succinato de litio (pH 5,2), 0,1% laurilsulfato de litio) a un tubo de ensayo de poliestireno de 12 x 75 mm. Se ensayan múltiples tubos de réplicas de cada sonda marcada; los solicitantes utilizan habitualmente 13 tubos de réplica de cada tubo marcado, tres se emplean como controles de "tiempo cero" (T_{0}). Se colocan los controles de T_{0} a temperatura ambiente en un soporte de tubos de ensayo. Se añaden a cada uno de estos tubos 200 \mul de HCl 0,4 N y un 0,1% (v/v) de H_{2}O_{2}, y después se añaden 100 \mul de tampón de hidrólisis (Na_{2}B_{4}O_{7} 0,13-0,19 M (pH 7,6-9,5)) y un 2-5% (v/v) de éter de polioxietileno (suministrado con el nombre de TRITON X-100 por Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Los solicitantes han descubierto que el orden de adición en este paso es importante. Los reactivos en blanco (controles negativos) contienen 10 \mul de PSB solo y se tratan como controles
T_{0}.

Se añaden cien microlitros de tampón de hidrólisis a cada uno de los 10 tubos restantes de réplica del soporte de tubos de ensayo y se agita el soporte para que se mezcle el contenido de los tubos. El soporte de tubos de ensayo se coloca inmediatamente después en un baño de agua circulante a 60ºC (o a cualquier otra temperatura de ensayo que se desee) y se pone en marcha el cronómetro que cuenta el tiempo.

En los momentos deseados (por ejemplo 1, 2, 4, 7, 10, 20, 30, 40 y 50 minutos) se añaden 200 \mul de una solución 0,4 N de HCl, 0,1% (v/v) de H_{2}O_{2} a un tubo de cada grupo y se retira inmediatamente el tubo del baño de agua, se deja a temperatura ambiente y se mezcla su contenido. Se deja el tubo en reposo a temperatura ambiente por lo menos durante 1 minuto.

Se mide la quimioluminiscencia de cada muestra en un luminómetro mediante la inyección única de una solución que contiene NaOH 1 N y se mide la quimioluminiscencia durante 5 segundos. Se restan las RLU de los controles negativos de las RLU experimentales. A continuación se dividen las RLU resultantes de cada muestra por las RLU de T_{0} promedio y se multiplican por 100; esto proporciona los valores de T_{0} en %; los datos pueden representarse en una gráfica con log (T_{0} en %) en el eje Y y el tiempo en el eje X.

Determinación del valor de hidrólisis diferencial (DH)

Sigue un procedimiento general para la medición de la proporción de la hidrólisis del marcador quimioluminiscente fijado sobre una sonda de oligonucleótido hibridado y la hidrólisis del mismo marcador fijado de igual manera sobre la misma sonda sin hibridar con su ácido nucleico diana.

La hibridación de la sonda de oligonucleótido de hebra simple marcado se realiza del modo siguiente. Se combinan los reactivos siguientes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada sonda marcada de éster de acridinio que se quiere ensayar: 15 \mul de una solución de PSB que contiene de 0,05 a 0,1 pmoles de la sonda marcada con AE (un potencial de RLU total calculado de 4-5 x 10^{6}), de 0,5 a 1,0 pmoles equivalentes de la secuencia de nucleótido diana (p.ej. de 0,25 a 0,5 pmoles de un ácido nucleico que tiene dos copias de la secuencia de nucleótido diana) y 5-10 pmoles de cada una de las sondas auxiliares (helper) deseadas para facilitar hibridación de la sonda con el ácido nucleico diana. Las sondas auxiliares, también llamadas oligonucleótidos auxiliares, son oligonucleótidos sin marcar empleados para aumentar la relación de hibridación mediante la rotura de la estructura secundaria del ácido nucleico diana en la zona de la secuencia del nucleótido diana (véase Hogan y col., patente US-5,030,557, cuyos propietarios son los mismos que los de la presente solicitud). Sin embargo, el uso de sondas auxiliares no es esencia para llevar a la práctica la presente invención.

Se introducen también en el tubo de microcentrífuga 15 \mul de 2 x tampón de hibridación (succinato de litio 200 mM (pH 5,2), 17% (p/v) de laurilsulfato de litio, EDTA 3 mM (ácido etilenediaminotetraacético) y EGTA 3 mM ([ácido etilenobis(oxietilenonitrilo)]-tetraacético)). Se incuba el tubo a una temperatura por lo menos 5ºC por debajo de la Tm del dúplex de sonda-diana durante por lo menos 30 minutos, después se le añaden 270 \mul de 1 x tampón de hibridación. Para cada combinación de marcador quimioluminiscente-sonda se prepararán tubos separados; un tubo para cada conjunto ("híbrido" marcado) debería contener la sonda marcada, el ácido nucleico diana y los reactivos; debería prepararse otro tubo ("control" marcado) que contenga la misma sonda y reactivos sin el ácido nucleico diana. Finalmente, para cada ensayo se preparará un conjunto en "blanco" compuesto por tubos idénticos de hibridación reactivos sin la sonda marcada o sin ácido nucleico diana.

Se pipetean a cada tubo de 12 x 75 mm de poliestireno partes alícuotas de diez microlitros; el número de tubos es igual al número de momentos que se toman para el análisis, más tres tubos para las determinaciones de T0, descritas anteriormente.

Se introducen en los tres tubos de réplica de T0 200 \mul de HCl 0,4 N, un 0,1% (v/v) de H_{2}O_{2} y después 100 \mul de tampón de hidrólisis. Después se lee la emisión de luz de los tubos en el luminómetro, realizando una sola inyección de NaOH 1 N, durante un período de 5 segundos. Se preparan los controles de reactivo en "blanco", que contienen 10 \mul de PSB solo, en un grupo de 3-6 tubos y se tratan de igual manera que los controles de T0.

Se introducen también en los tubos "híbrido" y "control" 100 \mul de tampón de hidrólisis, se mezcla su contenido y se colocan en un baño de agua circulante a la temperatura deseada, p.ej. 60ºC. Se pone en marcha el cronómetro.

En los momentos deseados, se añaden a un tubo de cada conjunto 200 \mul de HCl 0,4 N, un 0,1% (v/v) de H_{2}O_{2}, se retira del baño de agua y se mezcla su contenido. Se dejan los tubos en reposo a temperatura ambiente durante por lo menos un minuto.

Se mide la quimioluminiscencia de las muestras de cada grupo de tubos en un momento temporal deseado en un luminómetro realizando una inyección de NaOH 1 N. Se mide la luz emitida durante 5 segundos.

Los datos se analizan del modo descrito anteriormente. la proporción de hidrólisis de híbrido, expresada en forma de vida media (T1/2) en minutos, se divide por la razón de hidrólisis del control para obtener el valor de la hidrólisis diferencial (DH). Los resultados se recogen en la siguiente tabla 2.

TABLA 2 Características de hidrólisis

3

De los datos presentados en la tabla 1 se deduce que se pueden seleccionar grupos de compuestos, cuyos componentes tienen propiedades quimioluminiscente suficientemente distintas para poder utilizarse como reactivos marcadores para la detección simultánea de varios analitos en un mismo tubo. De modo sorprendente, tal como se ilustra en la tabla 2, los solicitantes han encontrado que algunos de estos grupos contienen también compuestos que presentan características similares de hidrólisis, es decir, el marcador AE hibridado no solo está protegido contra una posible hidrólisis, si se compara con el marcador sin hibridar, sino que las proporciones de hidrólisis de los componentes de algunos grupos potenciales son sustancialmente similares. En la figura 2 se representa una lista de ejemplos de grupos que contienen pares de dichos compuestos. En modo alguno se pretende limitar con los ejemplos aquí citados a la presente invención a estas formas de ejecución. Aunque en esta figura se ilustra la aplicabilidad potencial de los derivados de AE en forma de pares combinados de reactivos marcadores, los expertos comprenderán fácilmente que puedan diseñarse grupos de más de dos compuestos aplicando los criterios de selección enumerados en esta figura y descripción. Además, el hecho de que ciertos compuestos estén agrupados en conjuntos no implica en modo alguno que estos agrupamientos sean óptimos ni peculiares de los compuestos concretos, ni que otros compuestos no puedan actuar del modo indicado. La presente invención se define exclusivamente en las reivindicaciones. Los grupos de ésteres de acridinio enumerados en la figura 2 son aspirantes el uso en por lo menos un modo de la presente invención.

Ejemplo 3

Modo 1

pH constante, inicio simultáneo de reacción

Existen diversos modos de uso de las señales quimioluminiscentes de reactivos marcadores para detectar más de un analito de ácido nucleico en un tubo de ensayo único con arreglo a la presente invención. Este ejemplo y los siguientes son ilustraciones de tales modos. Sin embargo, por tales ejemplos, los solicitantes no pretenden limitar el número ni la descripción de los modos de ensayo posibles, ni la composición ni combinación de reactivos marcadores que pueden utilizarse en la presente invención.

En un primer ensayo se estudian las características de quimioluminiscencia de los reactivos marcadores de AE unidos a oligonucleótidos de hebra simple en ausencia de un ácido nucleico diana. Los oligonucleótidos de hebra simple se diseñan para que sean complementarios de los RNA diana derivados de la Escherichia coli o de la Chlamydia trachomatis. Se marcan los oligonucleótidos del modo descrito anteriormente: se une el derivado o-diBr a un oligonucleótido específicamente complementario del RNA diana de la E. coli y una mezcla de los derivados 1- y 3-Me se emplea para marcar un oligonucleótido específicamente complementario del RNA diana de la C. trachomatis. Se diluyen los oligonucleótidos marcados con succinato de litio 10 mM (pH 5,0) y un 0,1% (p/v) de laurilsulfato de litio, de modo que 10 \mul de la solución resultante contengan unas 200.000 RLU (aproximadamente 0.002 pmoles) de cada oligonucleótido. Se combinan diez microlitros de cada oligonucleótido con 10 \mul del mismo tampón de dilución en tubos separados; además, 10 \mul de cada oligonucleótido marcado se combinan en un solo tubo. Se añaden a cada tubo doscientos microlitros de una solución que contiene de HCl 0,1 N, se añade al tubo un 0,1% H_{2}O_{2} y después 100 \mul de una solución que contiene Na_{2}B_{4}O_{7} 0,19 M (pH 7,6) y un 5% (v/v) de TRITON® X-100. Se coloca la solución resultante en un luminómetro LEADER® 50 y se lee la quimioluminiscencia en varios intervalos después de la inyección de 200 \mul de NaOH 1 N a la solución de la muestra. Durante el ensayo se selecciona el modo "análisis cinético" del luminómetro; esto permite recoger datos puntuales de las RLU a intervalos temporales predeterminados después del inicio de la reacción de quimioluminiscencia.

En otro ensayo se hibridan los mismos oligonucleótidos marcados en cada caso con un exceso de sus RNA diana respectivos, del modo descrito por Nelson y col., lugar citado. Se realiza la hibridación en un volumen de reacción de 50 \mul y se incuban a 55ºC durante 60 minutos. La solución final para la hibridación contiene succinato de litio 100 mM (pH 5,2), un 8,5% (p/v) de laurilsulfato de litio, EDTA 1,5 mM EDTA y EGTA 1,5 mM. En los tubos, que contienen 50 \mul de cada mezcla de sonda individual-diana de hibridación sola, o una combinación de ambas mezclas de hibridación, se introducen 150 \mul de tetraborato sódico 0,19 M (pH 7,6) en un 5,0% (v/v) de TRITON® X-100. La cantidad final de cada oligonucleótido marcado es de unos 0,002 pmoles para cada tubo experimental. Se colocan las muestras en un luminómetro LEADER® 50 luminómetro y se inicia la quimioluminiscencia con la adición de 200 \mul de un 0,1% (v/v) de H_{2}O_{2} en HNO_{3} 1 mM y, después de una demora de 0,1 a 2 segundos, se efectúa la inyección automática de 200 \mul de NaOH 1 N. Se mide la quimioluminiscencia varias veces.

Se selecciona de nuevo el modo "análisis cinético" del luminómetro durante el ensayo; esto permite recoger los datos puntuales de las RLU en intervalos de tiempo predeterminados después del inicio de la reacción de quimioluminiscencia.

Los datos recogidos de los oligonucleótidos marcados no hibridados se presentan en la siguiente tabla 3.

TABLA 3

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

En este ensayo se mide la quimioluminiscencia durante un total de 2 segundos y las lecturas se realizan a intervalos de 0,04 segundos. Los resultados indican que el marcador o-diBr-AE tiene un pico agudo de emisión de luz, que aparece muy rápidamente después de iniciada la reacción de quimioluminiscencia. En estas condiciones el pico de emisión de luz se sitúa en el intervalo 4; unos 0,16 segundos después del inicio, y entonces la señal se atenúa rápidamente. En cambio, la luz emitida por la mezcla de los derivados 1- y 3-Me-AE tiene un pico de intervalo 8 (0,32 segundos después del inicio) y a continuación se atenúa lentamente. Además, en los intervalos posteriores (intervalos 14-50), la señal del derivado o-diBr-AE es casi cero, mientras que la señal de la mezcla 1- y 3-Me se mantiene significativamente mayor que la línea de base. Los datos de la muestra que contiene ambos marcadores se aproximan a los datos de los dos conjuntos individuales en cada punto.

Los datos obtenidos en los ensayos realizados son muestras hibridadas de los dos oligonucleótidos marcados se recogen en la siguiente tabla 4.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

8

9

Los intervalos de tiempo son los mismos que en la tabla 3. En este caso, la diferencia entre las características de emisión de los dos marcadores es distinguible incluso con mayor claridad que el ensayo previo: el pico del o-diBr-AE hibridado con la E. coli aparece de nuevo en torno al intervalo 4; sin embargo, el pico del 1-Me-AE hibridado con la C. trachomatis se sitúa aproximadamente en el intervalo 14. Una vez más, durante los últimos intervalos (en particular los intervalos 41-50), la señal emitida por el derivado o-diBr-AE está casi apagada, mientras que la señal del derivado 1-Me-AE continúa siendo significativa. Y una vez más el perfil de la muestra que contiene una mezcla de los 2 oligonucleótidos hibridados marcados se aproxima a la suma de los perfiles de las dos muestras individuales en cada punto.

Estos datos demuestran la aplicabilidad y la utilidad de un modo del método y de las composiciones de la presente invención. La señal obtenida en un solo tubo de ensayo que contiene dos oligonucleótidos diferentes marcados con derivados específicos del modo descrito en el presente ejemplo consta claramente de dos componentes, uno aportado por una especie que reacciona rápidamente y se atenúa rápidamente (por ejemplo, el o-diBr-AE) y el otro aportado por una especie que reacciona y se agota más lentamente (por ejemplo, la mezcla de 1- y 3-Me-AE). Mediante el diseño de dos tiempos de detección para el análisis, uno temprano (por ejemplo intervalos 1-6; 0,04 - 0,24 segundos) para la detección del analito asociado con la especie que reacciona rápidamente y otro tardío (por ejemplo, intervalos 41-50; 1,64 - 2,0 segundos) para la detección del analito asociado con la especie que reacciona lentamente, el método y reactivos de la presente invención permiten virtualmente la detección simultánea de diferentes secuencias de ácido nucleico en una sola muestra.

Los datos en bruto, que se obtienen en este ensayo, se tratan seguidamente aplicando el siguiente método de análisis reiterativo de datos. Las muestras que contienen solamente una sonda marcada se utilizan como patrones para el análisis de datos. Para cada patrón se determina la proporción entre la suma de los valores de las RLU obtenidos en los intervalos 1-10 y la suma de los valores de las RLU obtenidos en los intervalos 41-50 (\Sigma RLU 41-50/\Sigma RLU 1-10); para el o-diBr-AE, esta proporción es de 0,00267 y para el 1-Me-AE esta proporción es de 0,645. Las señales quimioluminiscentes medidas en los intervalos 41-50 (en RLU) se suman y después se dividen por 0,645, la proporción obtenida para el 1- y el 3-Me estándar. La figura resultante es la cantidad de RLU aportada en los intervalos 1-10 por la sonda marcada 1- y 3-Me-AE. Esta cantidad, restada de las RLU totales de los intervalos 1-10, da lugar a la cantidad de RLU aportada en estos intervalos por el o-diBr-AE. Cuando se multiplica el último número por 0,00267 (la proporción del o-diBr-AE), da las RLU dentro de los intervalos 41-50 aportados por la sonda marcada con o-diBr-AE. Si se resta esta figura del total de RLU de los intervalos 41-50, se obtiene un valor corregido de las RLU aportadas por el 1-Me-AE en este intervalo.

Se utiliza este número para repetir el cálculo descrito hasta que las RLU aportadas por el o-diBr-AE en los intervalos 41-50 no cambie dentro del número elegido de figuras significativas. La siguiente tabla 5 presenta una ilustración del método aplicado a los datos en bruto.

TABLA 5

10

Se programa un ordenador personal para realizar estos cálculos. Se alimentan los datos en bruto desde el luminómetro al ordenador empleando un puerto utilizando el puerto RS-232 de la máquina y se procesan los datos del modo descrito antes. Los intervalos empleados para el análisis anterior pueden diferir en función del reactivo marcador elegido y no es obligatorio emplear los intervalos específicos mencionados antes o en los ejemplos siguientes. Además, el método de análisis de datos descrito en este ejemplo se lleva a cabo con datos obtenidos en ensayos que emplean dos compuestos quimioluminiscentes, pero los expertos en la materia comprenderán fácilmente que estos métodos pueden aplicarse también a datos obtenidos en procesos con más de dos compuestos, con la condición de que las características de reacción de cada compuesto sean suficientemente diferentes de las de los demás.

Ejemplo 4

Modo 2

Reacción sucesiva en diferentes valores de pH

En otro modo, los reactivos y método de la presente invención pueden utilizarse para detectar y medir más de un analito en una muestra iniciando la reacción de quimioluminiscencia en diferentes valores de pH. En el primer pH pueden iniciarse las reacciones de quimioluminiscencia, por ejemplo con la adición de peróxido sódico y una base en un tampón apropiado, provocando que uno o varios de los reactivos marcadores emitan una luz medible, mientras que uno o varios reactivos marcadores adicionales no reaccionarán de forma apreciable a dicho pH. La cantidad de luz emitida en el primer pH puede medirse en un luminómetro. Además, la luz emitida puede medirse durante un período de tiempo y el período de tiempo puede dividirse en intervalos del modo detallado anteriormente para el análisis cinético de la reacción. Después de la medición a un pH determinado, podrá ajustarse el pH de la solución de análisis a un valor, en el que puedan reaccionar uno o varios reactivos marcadores quimioluminiscentes más.

Los datos aquí presentados ilustran este modo de la invención utilizando dos derivados de AE, pero los expertos en la materia comprenderán fácilmente a la luz de esta descripción que en este método de la invención pueden utilizarse más de dos valores de pH. Además, a la luz de esta descripción resultará también claro a los expertos en la materia que en un mismo sistema de ensayo pueden combinarse los aspectos de los diversos modos aquí descritos. Por ejemplo, a cada valor de pH del modo de "pH múltiple" descrito en este ejemplo puede detectarse un grupo de marcadores cinéticamente distintos de una manera descrita en el ejemplo anterior. Tal sistema permitirá entonces la detección de tres o más analitos existentes en un mismo tubo de ensayo. Otras combinaciones, que no se mencionan explícitamente, resultarán también obvias para los expertos en la materia. Todas las combinaciones en cuestión, tanto si se mencionan explícitamente como si no, se consideran contempladas dentro del alcance de la presente invención.

Dos oligonucleótidos, cada uno marcado con un derivado de AE que tienen diferentes pH óptimos para la reacción de quimioluminiscencia, se diluyen por separado en una dilución que contiene succinato de litio 10 mM (pH 5,0) y un 0,1% (p/v) de laurilsulfato de litio. El primer oligonucleótido, específico del rRNA 16S de la Chlamydia trachomatis, se une mediante un brazo de engarce al AE estándar. El segundo nucleótido oligonucleótido, específico del rRNA 23S de la Chlamydia trachomatis, se une mediante un brazo de engarce al o-F-AE. En tubos separados se combinan diez microlitros (unos 0,002 pmoles) de cada oligonucleótido con 10 \mul del mismo tampón de dilución; además, en un solo tubo se combinan 10 \mul de cada oligonucleótido marcado. Se introducen en cada tubo 40 \mul de HCl 0,4 N, 60 \mul agua y 200 \mul de una solución que contiene HNO_{3} 1 mM y un 0,1% de H_{2}O_{2}. Se colocan los tubos dentro un luminómetro LEADER® 50 (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA) y se mide la quimioluminiscencia por inyección automática de 200 \mul de ácido bórico 0,24 M (ajustado a pH 12,9 con NaOH). El pH aproximado de la solución en este momento es de 12,1. Se mide la quimioluminiscencia durante 8 segundos, después se realiza otra inyección automática de 200 \mul de NaOH 0,75 N para llegar a un pH final de 13,0. Se mide la quimioluminiscencia resultante durante 10 segundos. Durante la medición de la quimioluminiscencia se recogen los datos a intervalos de 0,1 segundos y se descargan inmediatamente en un ordenador PC compatible con IBM. Con estos datos se traza una gráfica de las RLU frente al tiempo (número de intervalo).

Los resultados se recogen en la figura 3. Estos datos indican que puede detectarse más de un reactivo marcador quimioluminiscente unido a un oligonucleótido como componente de un grupo de tales reactivos marcadores elegidos sobre la base de su pH óptimo para la reacción.

Ejemplo 5 Detección simultánea de los ácidos nucleicos de la Chlamydia trachomatis y de la Neisseria gonorrhoeae en un formato de ensayo homogéneo

El método y las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para detectar simultáneamente la presencia de ácido nucleicos derivados de la Chlamydia trachomatis (Ctr) y de la Neisseria gonorrhoeae (Ngo) en una misma muestra a ensayar, provistos de cantidades conocidas de ácidos nucleidos diana. En este ejemplo se realizan la formación, selección y detección de los conjugados marcados de analito-sonda exclusivamente en fase líquida.

Por conveniencia, las sondas específicas de la Ctr y de la Ngo son las que se emplean en el kit de ensayo comercial de Gen-Probe, llamado PACE® 2 Assay (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA). En este ensayo comercial, las sondas de la Ctr y de la Ngo se marcan en cada caso con AE estándar (véase la figura 1) y se someten a ensayo por separado. En cambio, en el ejemplo aquí descrito, se sustituyen las sondas de la Ctr comerciales por sondas idénticas, marcadas con 1- y 3-Me-AE, y las sondas estándar de la Ngo se sustituyen por sondas idénticas marcadas con una mezcla de 1- y 3-Me-m-diF-AE. Además, en el caso del kit comercial PACE® 2 Assay, las sondas marcadas se utilizan juntas en una "mezcla de sondas" con otras sondas auxiliares no marcadas diseñadas para acelerar la velocidad de hibridación y la estabilidad del ácido nucleico híbrido formado. El uso de sondas auxiliares se describe anteriormente y en la patente US-5,030,557. Tal como se ha mencionado antes, las sondas no son necesarias para la práctica de la presente invención a pesar de que las sondas auxiliares puedan ser necesarias en combinación con el uso de sondas de hibridación concretas. Además, tal como se ha indicado antes, la presente invención no depende de secuencias concretas de nucleótido del analito de ácido nucleico ni de la sonda del ensayo de hibridación; por lo tanto, las sondas específicas de oligonucleótido utilizadas en estos ejemplos no son una característica esencial de la presente invención. Los métodos y composiciones presentes pueden utilizarse en cualquier grupo de dos o más pares de ácido nucleico-sonda de hibridación que formen híbridos de doble hebra estables, mutuamente excluyentes.

Se preparan las muestras para el ensayo añadiendo cantidades diferentes de RNA ribosómicos diana de la Ctr y de la Ngo a una solución que contiene un 3% (p/v) de laurilsulfato de litio, tampón fosfato sódico 30 mM (pH 6,8), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM hasta un volumen final de 50 \mul. Se prepara el reactivo sonda combinando la sonda de la Ctr mercada con el 1-Me-AE con la sonda de la Ngo marcada con el 1-Me-m-diF-AE en una solución que contiene succinato de litio 200 mM (pH 5,1), un 17% (p/v) de laurilsulfato de litio, EDTA 3 mM y EGTA 3 mM. La cantidad total de las sondas marcadas con cada uno de los derivados de AE se sitúa en 0,2 pmoles.

Cada mezcla de reacción de hibridación contiene 50 \mul de los ácidos nucleicos diana (o en ensayos de control, sin diana) y 50 \mul del reactivo sonda. Se incuba cada mezcla reaccionante a 55°C durante una hora. Se añaden a cada muestra trescientos microlitros de tetraborato sódico 0,15 M (pH 8,5), un 2% (v/v) de TRITON® X-100 y se incuban las muestras a 55°C durante 20 minutos. Se mide la quimioluminiscencia de cada muestra en un luminómetro LEADER® 50 con inyección automática de 200 \mul de una solución que contiene un 0,1% de H_{2}O_{2}, HNO_{3} 1 mM y posteriormente, paso un lapso de 2 segundos, otra inyección de NaOH 1 N, un 2% (p/v) Zwittergent® 3-14 (1-propano-sulfonato del N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amonio; el Zwittergent® es una marca registrada de CalBiochem, La Jolla, CA).

Se hace el seguimiento de la quimioluminiscencia de cada muestra durante 2 segundos utilizando el modo cinético del luminómetro e intervalos de 0,04 segundos. Los datos se transfieren directamente del luminómetro al ordenador personal y se analizan utilizando métodos de cálculo similares a los descritos en el anterior ejemplo 3. Para estos cálculos se eligen los intervalos de tiempo 1-6 y 41-50.

Se saca el promedio de dos patrones de cada marcador diferente, también de dos muestras en blanco, que no contienen sonda ni ácidos nucleicos diana. El valor de las RLU obtenido en cada intervalo de tiempo para los patrones en blanco promedio se resta de los valores de las RLU del intervalo correspondiente para todas las demás muestras antes del cálculo. Cada muestra se analiza por duplicado; los valores recogidos son el promedio de mezclas reacciones duplicadas. Los resultados se recogen en la siguiente tabla 6.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Valores calculados

11

\vskip1.000000\baselineskip

Estos datos indican que pueden identificarse por lo menos dos analitos (el RNA ribosómico de la Ctr y de la Ngo de este ejemplo), ya sea solos, ya sea en una muestra, empleando el método de analito múltiple y los reactivos de la presente invención.

Ejemplo 6 Detección simultánea de los ácidos nucleicos de la Chlamydia trachomatis y de la Neisseria gonorrhoeae en un formato de ensayo mixto homogéneo/heterogéneo

El método de la presente invención se utiliza de nuevo para detectar simultáneamente la presencia de la Ctr y de la Ngo en un "sistema puro" (es decir, en el que no hay especies clínicas); esta vez en un sistema de ensayo mixto homogéneo/heterogéneo. El ensayo aplicado en este ejemplo tiene el formato PACE® 2 (ensayo comercial de Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA), modificado del modo aquí descrito. Las sondas empleadas en este ensayo son idénticas a las empleadas en el ejemplo 5 y se emplean en una mezcla con sondas auxiliares.

Para el ensayo se combinan en cada tubo cantidades diferentes ya sea del RNA ribosómico de la Ngo, ya sea de la Ctr, o ambos; las cantidades de la diana varían entre 0 y 12,5 fmoles. El volumen final de cada dilución de ácido nucleico diana es de 100 \mul; la diferencia de volumen se completa con una solución 30 mM de fosfato sódico (pH 6,8), un 3% (p/v) de laurilsulfato de litio, EDTA 1 mM y EGTA 1 mM. Se prepara el reactivo sonda por mezclado de la mezcla de sonda l-Me-AE y la mezcla de sonda l-Me-m-diF-AE en volúmenes iguales; al igual que en el ensayo anterior, los reactivos sonda contienen también sondas auxiliares. La mezcla de sondas contiene succinato de litio 190 mM (pH 5,1), un 17% (p/v) de laurilsulfato de litio, EDTA 3 mM, EGTA 3 mM y las sondas; a las soluciones de ácidos nucleicos diana se les añaden cien microlitros de esto para llegar a un volumen final de 200 \mul. Se agitan los tubos para que se mezclen sus contenidos y se incuban a 60°C durante 90 minutos. Se sacan los tubos del baño de agua y se les añade 1 ml de una solución 190 mM de tetraborato sódico (pH 7.6), un 6,89% (p/v) de TRITON® X-102 y un 0,01% (p/v) de gelatina que contiene 50 \mul de una suspensión al 1,25% (p/v) de partículas magnéticas Biomag™ 4100 (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) en un 0,02% (p/v) de azida sódica y EDTA 1 mM. Se continúa la incubación de los tubos a 60°C durante 10 minutos, después se sacan del baño de agua, se coloca inmediatamente el soporte de los tubos sobre una base de separación magnética y se deja en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos, después se separa la sonda sin fijar de la sonda hibridada fijadas sobre las esferillas magnéticas por decantación de la solución, véase Arnold y col., publicación de patente europea nº 281390, cuyos propietarios son los mismos que los de la presente invención.

Se lavan una vez las esferillas y la sonda hibridada adsorbida en ellas con una solución 20 mM de tetraborato sódico (pH 10,4), un 0,1% (p/v) de Zwittergent® 3-14, después se suspenden de nuevo en 300 \mul de una solución al 5% (v/v) de TRITON® X-100.

Se carga cada muestra en un luminómetro LEADER® 50. Se inicia la reacción de quimioluminiscencia con la inyección automática de 200 \mul de una solución que contiene un 0.1% (v/v) de H_{2}O_{2} y HNO_{3} 1 mM y después de una demora de 2 segundos se realiza otra inyección de 200 \mul de una solución que contiene NaOH 0,7 N y un 0.5% (v/v) de Zwittergent® 3-14. Se hace el seguimiento de la quimioluminiscencia de cada muestra durante 2 segundos utilizando el modo cinético del luminómetro e intervalos de 0,04 segundos. Se transfieren los datos directamente del luminómetro al ordenador personal y se analizan utilizando métodos de cálculo similares a los descritos en el anterior ejemplo 3. Los marcos temporales empleados para estos cálculos son los de los intervalos 1-7 y 34-50. Se saca el promedio de dos patrones de cada marcador diferente (utilizando 5 fmoles de RNA ribosómico para el control de la Ngo y 1,5 fmoles de RNA ribosómico para el control de la Ctr), como si fueran dos muestras en blanco, que no contienen sonda o ni ácidos nucleicos diana. El valor de las RLU obtenido para los patrones en blanco promedio en cada intervalo de tiempo se resta de los valores de las RLU de todas las muestras restantes para el intervalo correspondiente antes del cálculo. Se analiza cada muestra por duplicado; los valores recogidos en la tabla son promedios de los duplicados de las mezclas reaccionantes. Los resultados se recogen en la siguiente tabla 7.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7 Valores calculados

12

Estos datos demuestran que utilizando las composiciones y métodos de la presente invención puede identificarse claramente más de un analito (en este caso el RNA ribosómico de la Ctr y de la Ngo) que está solo o combinado en un mismo tubo de ensayo. Además, cuando las sondas que contienen los reactivos marcadores de la presente invención están combinadas en un mismo tubo de ensayo, es suficiente el mismo volumen de muestra para la identificación neta y simultánea de más de un analito utilizando la presente invención. Esto permite guardar la cantidad restante de muestra para otros fines (por ejemplo otros ensayos), aumentando de este modo el número de ensayos que pueden realizarse a partir de muestras de un volumen determinado.

Además, los datos recién presentados indican que un ensayo realizado con arreglo a esta forma de ejecución de la presente invención tiene una sensibilidad elevada, cuyo límite se sitúa en este ensayo por lo menos en 0,125 fmoles para la Ngo y 0,035 fmoles para la Ctr. Con la presentación de los datos de este ejemplo, el solicitante no pretende afirmar, sin embargo, que este sea el límite inferior de sensibilidad que puede obtenerse en todas las combinaciones de condiciones experimentales.

Ejemplo 7 Detección simultánea de los RNA ribosómicos de la Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae en una muestra clínica

El método y reactivos de la presente invención se utilizan simultáneamente para detectar la presencia de los RNA ribosómicos de la Ctr y de la Ngo en una muestra clínica. El formato de ensayo es el mismo que se ha descrito en el ejemplo 6, con las diferencias siguientes.

Se prepara cada muestra añadiendo la cantidad deseada de RNA ribosómico a 100 \mul de un conjunto de muestras clínicas de tapón (swab) endocervical; cada tapón se ha suspendido originalmente en un volumen de 1 ml de de medio de transporte de PACE® 2 de Gen-Probe (que se suministra como componente del kit de transporte STD de Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA). Se analizan estas muestras previamente, dando resultado negativo de la presencia de Ctr y Ngo. Si las muestras clínicas originales hubieran contenido células Ctr o Ngo, estas células se habrían lisado y habrían liberado sus ácidos nucleicos (incluido el RNA ribosómico) y los habrían entregado a la solución por acción de los componentes del medio de transporte.

La hibridación se realiza del modo descrito en el ejemplo 5, pero se alarga a 2,5 horas. Después de la hibridación se mide la quimioluminiscencia del modo descrito en el ejemplo 6, exceptuando los cambios siguientes. La solución 0,5 N de NaOH y el 0,5% de Zwittergent® se sustituyen por una solución 0,7 N de NaOH y un 0.5% de Zwittergent®; los patrones de RNA ribosómico de la Ngo y de la Ctr son 1,25 fmoles y 0,35 fmoles, respectivamente; y los intervalos elegidos para el marco temporal son los intervalos 1-5 y 41-50. Los resultados del ensayo se recogen en la siguiente tabla 8.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8 Valores calculados

13

Estos datos ponen de manifiesto que la capacidad del método y reactivos de la presente invención para permitir la detección y cuantificación de más de un analito en una muestra individual no resulta mermada por sustancias existentes dentro del conjunto de muestras clínicas.

Ejemplo 8 Detección de las regiones gag y pol del DNA del VIH

Se utiliza el método de la presente invención para detectar simultáneamente las regiones gag y pol del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Una ventaja de la detección de analito múltiple de la presente invención para la identificación del VIH consiste en que la detección de la presencia de la segunda región (ya sea gag o pol) del genoma del VIH puede utilizarse para confirmar la presencia del virus en un ensayo de diagnóstico en virtud de la escasa verosimilitud que tienen dos indicaciones de ensayo falso positivo simultáneas en un mismo ensayo. Además, la detección de más de una secuencia de nucleótido distinta del mismo analito de ácido nucleico puede ser útil para asegurar la detección de un virus o de una célula en los casos en los que haya variado o mutado una secuencia de nucleótido diana.

En el presente ejemplo se amplifica en primer lugar una región del genoma del VIH que contenga tanto la región gag como la pol por el método que se describe a continuación. Las regiones de secuencia de nucleótido gag y pol se detectan después simultáneamente utilizando el método y reactivos de la presente invención en un formato de ensayo de protección de hibridación (HPA).

Se sintetizan las sondas complementarias de las regiones gag y pol del genoma del HIV-1. Se marca la sonda específica de la gag (SEQ ID NO: 11) con una mezcla de 1- y 3-Me-AE y la sonda específica de la pol (SEQ ID NO: 5) con o-diBr-AE, también descrita anteriormente, utilizando un brazo de engarce no nucleótido incorporado como parte del oligonucleótido durante la síntesis para unir el marcador a la sonda. Se amplifica un fragmento del DNA del VIH-1 clonado, que contiene tanto las dos regiones de la secuencia diana en un volumen de 100 \mul del modo descrito por Kacian y col., publicación PCT nº WO 91/01384, cuyos propietarios son los mismos que los de la presente solicitud. Los cebadores de la amplificación empleados para amplificar la región pol tienen las secuencias de nucleótido de las SEQ ID NO: de 1 a 4. Las sondas y cebadores empleados para amplificar la región gag tienen las secuencias de nucleótido de las SEQ ID NO: de 5 a 10.

Después de la amplificación del DNA del VIH-1 se hibridan las sondas con las regiones diana de ácidos nucleicos gag y pol añadiendo a la mezcla reaccionante de amplificación 100 \mul de una solución que contiene 5,5 fmoles de la sonda de la gag marcada con 1-Me-AE y 16 fmoles de la sonda de la pol marcada con o-diBr-AE en una solución 0,2 M de succinato de litio (pH 5,0), un 17% (p/v) de laurilsulfato de litio, EDTA 3 mM EDTA y EGTA 3 mM EGTA. Para facilitar la amplificación de la región diana pol se utiliza también un oligonucleótido auxiliar (helper) sin marcar de la SEQ ID NO: 6. Después se incuba la mezcla reaccionante a 60ºC durante 30 minutos. Se realiza la hidrólisis de los derivados de acridinio en la sonda sin hibridar añadiendo 300 \mul de una solución 0,13 M de Na_{2}B_{4}O_{7} (pH 9,3), un 2% (v/v) de TRITON® X-100 y ácido yodoacético 13 mM e incubando la mezcla a 60ºC durante 20 minutos. A este pH se añade el ácido yodoacético a la mezcla reaccionante para impedir la formación de aductos de éster de acridinio, que no son reactivos para un ensayo quimioluminiscente.

Se mide la quimioluminiscencia en un luminómetro LEADER® 50. Se coloca cada muestra en el luminómetro y se inicia la reacción de quimioluminiscencia con la inyección automática de 200 \mul de 0,1% (v/v) de H_{2}O_{2} en HNO_{3} 1 mM, y después de una demora de 2 segundos se realiza la inyección automática de una solución 1,5 N de NaOH. Se mide la quimioluminiscencia durante 2 segundos utilizando el modo cinético del luminómetro e intervalos de 0,04 segundos. Se recogen los datos utilizando un ordenador personal y se analizan los datos en bruto aplicando los métodos de cálculo descritos en el ejemplo 3. El marco temporal empleado para los cálculos corresponde a los intervalos 1-10 y 41-50. En este caso se emplean 2 patrones de cada marcador (que consiste en ácidos nucleicos purificados que contiene la secuencia de nucleótido de cada diana; ya sea la gag sola o ya sea la pol sola) así como los 2 controles negativos que se tratan de igual manera que las demás muestras, pero que no contienen ácidos nucleicos diana ni sonda. Se saca el promedio de los datos obtenidos de muestras duplicadas del patrón y se corrigen todas las muestras respecto a la base del modo descrito anteriormente. Los resultados se recogen en la siguiente tabla 9. En este ensayo, un resultado negativo proporciona un valor de RLU inferior a 10.000. En todos los ensayos en los que se emplean las secuencias diana de ácido nucleico gag y pol (excepto los controles ya mencionados), las dianas gag y pol están presentes una vez en cada molécula de ácido nucleico diana.

TABLA 9 Valores calculados (RLU)

15

Estos datos indican que el método de la presente invención puede detectar la presencia simultánea de ácidos nucleicos que tengan secuencias correspondientes a las regiones gag y pol del VIH-1. Los números de copias mencionados de ácidos nucleicos molde es un valor promedio; es decir, el número de copias de entrada de molde es un número entero y no una fracción. Es cierto que los datos indican que algunas muestras no contienen copias del molde, como se desprende de los valores de las RLU inferiores a 10.000 que se producen en los dos conjuntos reaccionantes correspondientes a 2,5 y 1,25 copias del molde. La sensibilidad de este ensayo, que combina la amplificación de ácido nucleico con las composiciones y métodos de la presente invención, es aproximadamente de 1 a 2 copias de cada secuencia de ácido nucleico diana.

Ejemplo 9 Detección de las regiones gag y pol del DNA del VIH en una muestra que contiene material clínico

Se aplica el método de la presente invención para detectar simultáneamente tanto la región gag y como la región pol del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en un lisado de sangre humana. Se lisa sangre total, que previamente se ha determinado que es negativa de VIH, se recogen los leucocitos, se lavan y se lisan del modo descrito por Ryder, publicación PCT nº WO 93/25710, cuyos propietarios son los mismos que los de la presente solicitud. Para cada tubo de ensayo se emplean cincuenta microlitros del lisado de leucocitos. Se añade al lisado un plásmido de DNA que contiene las regiones gag y pol del VIH (véase el anterior ejemplo 8) y se amplifica el ácido nucleico añadido, se hibrida y se somete a hidrólisis diferencial del modo descrito en el ejemplo 8. Los resultados se recogen en la siguiente tabla 10.

TABLA 10 Valores calculados (RLU)

17

Estos datos indican que las dianas gag y pol pueden detectarse simultáneamente cuando el ácido nucleico diana se amplifica en presencia de un lisado celular de células mononucleadas de la sangre. En dicho sistema de detección, el ensayo de analitos múltiples es capaz de detectar menos de 2,5 de más de un ácido nucleico diana diferente que lleve una secuencia determinada de ácido nucleico.

Ejemplo 10 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La PCR es una técnica de amplificación de ácidos nucleicos bien conocida y empleada habitualmente por los expertos en la materia (véase, p.ej., American Society for Microbiology, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications'' 56-70 (1993) y es una tecnología patentada propiedad de Hoffman-LaRoche, Inc., Nutley, NJ, que la puede ceder en licencia.

Un procedimiento general de amplificación PCR de ácidos nucleicos es el descrito por Sambrook y col., lugar citado, en la página 14.18. En procedimiento descrito se mezclan los ingredientes siguientes en un tubo estéril de microcentrífuga de 0,5 ml para cada reacción: 30 \mul de agua estéril, 10 \mul de un tampón de amplificación 10X (tampón de amplificación 10X = 500 mM KCl, 100 mM Tris-Cl (pH 8,3), 15 mM MgCl y 0,1% (p/v) de gelatina), 1,25 mM de cada dNTP, 100 pmoles de cada cebador, hasta 2 \mug de DNA molde y agua hasta un volumen final de 100 \mul. Se calienta la mezcla reaccionante a 94°C durante 5 minutos. Se añaden a la mezcla reaccionante 5 \mul de un preparado de 5 unidades/\mul de polimerasa Taq DNA (Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT). Entonces se añaden a la mezcla reaccionante 100 \mul de un aceite mineral ligero y se incuba la mezcla reaccionante a 94ºC durante 5 minutos para desnaturalizar los ácidos nucleicos unidos por puente de hidrógeno, después a 50ºC durante 2 minutos para permitir la fusión de los cebadores con los ácidos nucleicos diana de hebra simple y a 72ºC durante 3 minutos para efectuar la extensión del cebador. Después se incuba la mezcla reaccionante sucesivamente a 94ºC durante 1 minuto, a 50ºC durante 2 minutos y a 72ºC durante 3 minutos, por este orden, a lo largo de 20 ciclos. Se incuba la muestra a 72°C durante 10 minutos en el último paso del último ciclo y después se almacena a -20°C hasta el momento de la utilización.

Ejemplo 11 Detección de las regiones gag y pol del DNA del VIH después de la amplificación por PCR

Se aplica el método de la presente invención para detectar la presencia simultánea de las regiones gag y pol del DNA del VIH. En este ensayo se amplifica el DNA vírico utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) antes de efectuar la detección.

Se utilizan las mismas sondas que en el ejemplo 8. Se amplifica el DNA del VIH-1 efectuando una PCR; los pares de cebadores empleados para amplificar la región pol por PCR tienen las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 2 y 4 y los cebadores empleados para amplificar la región gag tienen las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 7 y 10.

Después de la amplificación se efectúa la hibridación del ácido nucleico mediante el mezclado de 20 \mul de la mezcla reaccionante de la PCR con 80 \mul de agua y añadiendo después 100 \mul de la mezcla de sonda descrita en el ejemplo 8. Se incuban la sonda y los ácidos nucleicos diana juntos a 60ºC durante 30 minutos. La hidrólisis diferencial, la medición de la quimioluminiscencia y el cálculo de los resultados se realizan del modo descrito en el ejemplo 8. Los resultados se recogen en la siguiente tabla 11.

TABLA 11 Valores calculados (RLU)

19

Estos datos indican que método de ensayo de analito múltiple de la presente invención puede detectar la presencia simultánea de diferentes moléculas de ácido nucleico que tengan secuencias correspondientes a las regiones gag y pol de VIH-1, después de que las secuencias del VIH-1 se hayan amplificado utilizando la reacción en cadena de la polimerasa.

Ejemplo 12 Detección simultánea de más de dos analitos en una sola muestra a analizar

Para ilustrar la versatilidad de detección de más de dos analitos en una sola muestra se realizan los ensayos siguientes.

Los siguientes derivados de AE se unen individualmente a sondas separadas de oligonucleótido del modo descrito anteriormente: diBr-AE; 2,7-diMe-AE; o-MeO-(cinamil)-AE, o-Me-AE, y o-diMe-AE. Se introducen en cada tubo aproximadamente 0,003 pmoles de cada marcador quimioluminiscente fijado indicado en un volumen de 1,5 \mul por marcador del modo indicado en la siguiente tabla 12, después se añaden 200 \mul de una solución que contiene HCl 0,4 N, un 0,1% de H_{2}O_{2}. Se coloca cada tubo en un luminómetro LEADER® 50, se efectúa la inyección automática de NaOH 1 N y se mide la luz emitida resultante durante un período de 10 segundos a intervalos de 0,1 segundos.

TABLA 12

20

En la figura 4 se representan las gráficas de los perfiles de emisión de luz resultantes, obtenidos en estos ensayos. Las unidades del eje de las X se expresan en número de intervalo y las unidades del eje de las Y se expresan en RLU; los perfiles de emisión se representan en una gráfica de superposición simple. Esta gráfica demuestra claramente que el agotamiento de cada compuesto quimioluminiscente reaccionante de las muestras es lo suficientemente diferente de los demás compuestos quimioluminiscentes reaccionantes de modo que cada compuesto puede distinguirse de los demás. Por ejemplo, la emisión de luz del tubo 1 (o-diBr-AE y 2,7-diMe-AE) alcanza la línea base aproximadamente en el intervalo 50 (5,0 segundos). Por lo tanto, puede suponerse que la luz emitida en los intervalos 46-100 es la suma de las emitidas por los tubos 2, 3 y 4. (El tubo 1 contiene tanto al o-diBr-AE como al 2,7-diMe-AE; los expertos en la materia observarán fácilmente que el o-diBr-AE puede distinguirse claramente de los demás derivados de AE empleados en este ensayo y en particular del 2,7-diMe-AE, en una mezcla que contenga todos estos compuestos, ya que su emisión de luz alcanza la línea de base aproximadamente en el intervalo 10.) De igual manera, la luz emitida por los compuestos quimioluminiscentes del tubo 2 (o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE y o-MeO(cinamil)-AE) alcanza la línea base aproximadamente en el intervalo 80 (8,0 segundos); puede suponerse que la luz emitida en intervalos 69-100 es la suma de la luz emitida por los compuestos quimioluminiscentes de los tubos 3 y 4. Finalmente, la luz emitida por los compuestos del tubo 3 (o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, o-MeO(cinamil)-AE y o-Me-AE) alcanza la línea base en un algún momento después del intervalo 100. Aunque no se represente en la figura, en este momento posterior, los componentes del tubo 4 siguen emitiendo luz medible.

Por consiguiente, seleccionando los períodos de tiempo, durante los cuales se mide la luz emitida por los compuestos de cada tubo, se puede distinguir entre la luz emitida por cada compuesto utilizando un procedimiento de promedio reiterativo, similar al utilizado en el anterior ejemplo 3, para distinguir dos marcadores quimioluminiscentes. Utilizando como guía la descripción del presente ejemplo cabría esperar de modo razonable que los expertos en la materia pudieran distinguir en estas condiciones de reacción al o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-Me-AE y o-diMe-AE unidos a sondas. Además, los expertos en la materia podrían esperar de modo razonable que esta capacidad no resultara mermada cuando las sondas estén hibridadas con un ácido nucleico diana.

Ejemplo 13 Evaluación de reactivos quimioluminiscentes adicionales para usar en un ensayo de analitos múltiples

La evaluación de los siguientes reactivos quimioluminiscentes unidos a una sonda, se realiza del modo descrito en el ejemplo anterior, salvo que la luz emitida se mide durante un total de 10 segundos a intervalos de 0,1 segundos y se evalúa cada reactivo quimioluminiscente por separado y no en una mezcla como en el ejemplo 12. En la figura 5 se representa una gráfica de superposición de las emisiones de luz ensayadas por separado de 1) una combinación de o-diBr-AE y una mezcla de 1- y 3-Me-AE; 2) lo mismo que en 1) más el orto-AE; 3) lo mismo que en 2) más el o-Me-AE; y 4) lo mismo que 3) más el o-diMe-AE. De la gráfica se desprende que el o-diBr-AE/mezcla de 1- y 3-Me-AE reacciona rápidamente y emite poca luz después de aproximadamente el intervalo 40, pero en este momento hay otros derivados de AE que todavía emiten luz. El orto-AE emite poca luz después del intervalo 80. Aunque en este figura no se representa la resolución de línea base del derivado o-Me-AE, los ensayos adicionales han confirmado que la atenuación de la emisión de luz de este derivado progresa como es lógico con mayor rapidez que la reacción de del derivado AE restante, el o-diMe-AE. Las curvas de extrapolación de los dos últimos compuestos indican que los perfiles cinéticos de estos derivados podrían ser distinguibles en intervalos de tiempo posteriores a los representados en esta figura.

Aunque en este ensayo se combinan los marcadores o-diBr-AE y 1- y 3-Me-AE fijados, ya se ha demostrado que el o-diBr-AE y una mezcla de 1- y 3-Me-AE puede distinguirse en base a su cinética de reacción característica (véase el ejemplo 3).

Estos datos indican que, utilizando el mismo método de promedio reiterativo aplicado en el anterior ejemplo 3 para distinguir dos marcadores quimioluminiscentes, las señales de cada uno de los compuestos de este grupo de marcadores quimioluminiscentes fijados son susceptibles de distinguirse en una sola muestra cuando se inicia simultáneamente una reacción emisora de luz, en la que participan todos los compuestos mencionados y se detecta la luz emitida a lo largo de período de tiempo apropiado.

Ejemplo 14 Evaluación de siete marcadores quimioluminiscentes para el uso simultáneo en un ensayo de analitos múltiples

Se evalúa por separado la cinética de reacción de siete marcadores quimioluminiscentes diferentes (o-diBr-AE, 2,7-diMe-AE, una mezcla de 1- y 3-Me-AE, o-engarce-AE, o-MeO(cinamil)AE, o-Me-AE y o-diMe-AE) midiendo la luz emitida por cada compuesto después de iniciarse la reacción de quimioluminiscencia. Cada marcador quimioluminiscente se une a un oligonucleótido diferente. Las condiciones experimentales son las mismas que en el ejemplo 12, salvo las que se indican a continuación. Se mide la luz emitida durante un período total de tiempo de siete segundos a intervalos de 0,1 segundos y la detección y medición se realizan con un luminómetro.

En la figura 6 se representan las características de emisión de luz resultantes de estos compuestos en forma de gráfica única, generada por ordenador, que consiste en la superposición de las gráficas individuales de cada compuesto quimioluminiscente. De esta figura se desprende claramente que la atenuación de la luz emitida por cada compuesto reaccionante es suficientemente diferente y distinta de la emitida por los demás compuestos quimioluminiscentes de modo que cada una puede detectarse y medirse por separado en una sola muestra a analizar cuando la reacción se inicia simultáneamente. A la luz de la presente descripción, los expertos en la materia apreciarán que en este ejemplo se presentan datos recogidos por separado de cada uno de los compuestos, pero la cinética de la reacción y el agotamiento de la luz emitida no diferirá sustancialmente cuando estos compuestos se hallan presentes en una muestra única. Por lo tanto, los expertos en la materia se darán cuenta de que el presente ejemplo proporciona un conjunto de siete reactivos quimioluminiscentes que pueden utilizarse simultáneamente en un mismo ensayo para la detección de siete analitos de ácido nucleico con arreglo a las composiciones y métodos de la presente invención.

Ejemplo 15 Evaluación de reactivos quimioluminiscentes para el sistema de ensayo de modo múltiple, analito múltiple

Para un sistema de ensayo con cuatro analitos y dos pH se evalúan los siguientes reactivos quimioluminiscentes: o-diBr-AE, o-F-AE, AE estándar y o-MeO(cinamil)-AE. Al igual que en el ejemplo anterior, cada reactivo quimioluminiscente se une a un oligonucleótido diferente. Las condiciones experimentales son las mismas que en el ejemplo 4, excepto que a los oligonucleótidos se les añaden 74 \mul de HCl 0,4 N + 26 \mul de H_{2}O antes de la adición del H_{2}O_{2}. Cada reactivo quimioluminiscente se evalúa por separado.

En la figura 7 se representan los resultados de cada ensayo, combinados en una gráfica única generada por ordenador, en la que para mayor claridad se superponen los datos obtenidos de cada reacción de quimioluminiscencia. Como puede observarse, el o-diBr-AE y el o-F-AE participan en la reacción de quimioluminiscencia en el primer pH. Además, estos dos reactivos pueden distinguirse claramente entre sí porque la luz emitida por el o-diBr-AE se atenúa hasta la línea de base aproximadamente en el intervalo 25. La luz emitida entre los intervalos 25 y 75 representa la aportación del reactivo o-F-AE. Puede observarse además que el AE estándar y el o-MeO(cinamil)-AE son relativamente resistentes a la reacción en este pH, cada uno de estos compuestos emite una cantidad pequeña de luz entre los intervalos 0 y aproximadamente 85.

El pH de las mezclas reaccionantes se ajusta a 13 en este momento correspondiente aproximadamente al intervalo 85. Puede observarse que este desplazamiento de pH permite al AE estándar y al o-MeO(cinamil)-AE, en su mayor parte sin reaccionar, emitir luz en el tiempo, en el que virtualmente todos los derivados de o-diBr y o-F-AE ya han reaccionado en los pH previos. Los dos reactivos que reaccionan en el nuevo valor del pH pueden distinguirse también claramente en base al tiempo requerido por cada compuesto para reaccionar completamente; el AE estándar ha reaccionado caso por completo en el intervalo 120, mientras que el o-MeO(cinamil)-AE sigue emitiendo luz entre los intervalos 120 y aproximadamente 175.

Este ejemplo pone de manifiesto la versatilidad de las composiciones y métodos de la presente invención. Tal como se ha demostrado anteriormente, puede combinarse más de un modo de la presente invención para permitir la detección de dos o más analitos de ácidos nucleicos. Los expertos en la materia comprenderán fácilmente que, a pesar de que los datos presentados aquí se hayan recogido de compuestos evaluados en mezclas reaccionantes separadas, se espera razonablemente que estos compuestos tengan características de reacción sustancialmente similares cuando se combinan en una sola mezcla reaccionante; véase entre otros el ejemplo 16. Los expertos comprenderán también que las características de reacción de estos compuestos no se alterará materialmente cuando el oligonucleótido al que están unidos se hibride con una hebra complementaria de ácido nucleico.

Ejemplo 16 Correlación entre las características de reacción previstas y reales de los reactivos quimioluminiscentes combinados

Se efectúa el ensayo siguiente con el fin de demostrar que las características de reacción de los derivados preferidos de éster de acridinio ilustrados en los ejemplos anteriores se han previsto de forma cuidadosa mediante la superposición generada con un ordenador de las gráficas obtenidas a partir de los reactivos quimioluminiscentes ensayados por separado. Las mezclas reaccionantes individuales se componen con arreglo al método del ejemplo 15. Cada tubo contiene uno de los siguientes ésteres de acridinio: o-diBr-AE, o-F-AE, AE estándar y o-MeO(cinamil)-AE. Además, en los tubos individuales se combinan las mismas cantidades de cada compuesto que en un tubo único del modo siguiente: o-diBr y o-F-AE; AE estándar y o-MeO-AE; y o-diBr-AE, o-F-AE, AE estándar y o-MeO-AE. Todos los reactivos quimioluminiscentes se unen a oligonucleótidos separados, al igual que en los ejemplos previos. La reacción se inicia y se mide del modo descrito en el ejemplo 15. Los resultados se muestran en la figura 8 (A-I).

En la figura 8A se presenta la gráfica superpuesta generada con ordenador de la luz emitida por el o-diBr-AE y el o-F-AE, que se han ensayado por separado. En la figura 8B se presenta una gráfica generada con ordenador de la luz emitida combinada de ambos reactivos; esta gráfica es la suma de las gráficas individuales de la figura 8A, y representa una previsión de las características de reacción de una mezcla reaccionante individual que contenga ambos reactivos. En la figura 8C se presentan las características de reacción reales de una mezcla de estos dos compuestos en un tubo único. Estos datos demuestran claramente que no solo es la misma la atenuación de la emisión de luz que en la figura 8B (curva prevista) y en la figura 8C (curva real), sino que las curvas cinéticas son sustancialmente idénticas.

En la figura 8D se presenta igualmente una gráfica superpuesta, generada con ordenador, de la luz emitida por el AE estándar y el o-MeO(cinamil)-AE, que se han ensayado por separado. En la figura 8E se presenta la suma, generada con ordenador, de estas gráficas superpuestas y en la figura 8F se representa la luz realmente emitida por una mezcla de estos dos compuestos después de haberse iniciado la reacción de quimioluminiscencia. La comparación de las figuras E y F pone de manifiesto que las características de reacción de una mezcla del AE estándar y el o-MeO(cinamil)-AE se pueden prever cuidadosamente sumando las curvas obtenidas con los dos derivados de AE ensayados individualmente.

Finalmente, en la figura 8G se presentan los gráficos superpuestos de la luz emitida por los cuatro derivados de éster de acridinio ensayados individualmente. En la figura 8H se presenta la suma, generada con ordenador, de los gráficos de la figura 8G y en la figura 8I se presentan las características de emisión de luz de una mezcla de los cuatro compuestos mencionados a lo largo del tiempo. Por lo tanto, en la figura 8H se presentan las características previstas de emisión de luz de los cuatro compuestos y en la figura 8I los resultados reales. Una vez más se observa que existe prácticamente una correlación exacta entre el gráfico de la previsión de la figura 8H y el gráfico real de la figura 8I.

Este ensayo demuestra que la cinética característica de la reacción de cada marcador AE no es significativamente diferente cuando se mezcla con otros marcadores AE en una sola mezcla reaccionante. Por lo tanto, los marcadores AE descritos para el uso en los métodos y composiciones de la presente invención se ha demostrado que son idóneos para el sistema de ensayo de analitos múltiples.

Ejemplo 17

Modo tres

Longitudes de onda múltiples, inicio simultáneo

En una forma adicional de ejecución de la presente invención se pueden detectar simultáneamente analitos múltiples de una sola muestra utilizando diferentes sondas de oligonucleótido, cada una de ellas está marcada con un mar-
cador quimioluminiscente diferente, que emite luz a una longitud de onda diferente de la de los demás marcadores.

Como ejemplo de este modo de la invención se realiza el ensayo esencialmente del modo descrito en el ejemplo 6, pero con las modificaciones siguientes. Después de la hibridación se introducen en cada tubo 1 ml de una solución 60 mM de tetraborato sódico (pH 8,9), un 6.89% (v/v) de TRITON® X-102 y un 0,1% (p/v) de gelatina que contiene 50 \mul de una suspensión al 1.25% (p/v) de partículas magnéticas BIOMAG™ 4100 en un 0,02% (p/v) de azida sódica y EDTA 1 mM. Los pasos de incubación y lavado se realizan del modo descrito en el ejemplo 6.

Se equipa un luminómetro con 4 tubos fotomultiplicadores (PMT), uno para el seguimiento de la luz emitida en el intervalo de longitudes de onda de 300 nm a 700 nm, uno que tiene un filtro de corte de 375 a 415 nm, uno que tiene un filtro de corte de 400 nm a 435 nm y uno que tiene un filtro de corte de 500 nm a 575 nm. Se colocan en el luminómetro los patrones de cada marcador, que provoca que emitan luz y se hace el seguimiento de la luz emitida por cada PMT. Se determinan las proporciones de la quimioluminiscencia en cada ventana de quimioluminiscencia para cada marcador del modo ilustrado en el método de cálculo del ejemplo 3. En las figuras 9A y 9B se representan los espectros de quimioluminiscencia del 2,7-diMe-AE y del AE estándar; las porciones sombreadas de estos espectros representan las ventanas de longitudes de onda recién mencionadas. En la figura 9C se representa una superposición, generada con ordenador, de los espectros de 9A y 9B. Como puede observarse, la emisión máxima se produce en longitudes de onda diferentes para cada marcador y cada marcador puede ser distinguirse en una mezcla de dos. En la figura
9D se presenta la suma, generada por ordenador, de dos perfiles individuales de emisión según las longitudes de onda.

Después de haber determinado las proporciones estándar de los marcadores quimioluminiscentes específicos a utilizar, se coloca en el luminómetro cada una de las muestras experimentales, se inicia la reacción de emisión de luz y se efectúa el seguimiento de la luz emitida resultante exactamente igual que se efectuó con los patrones. Después pueden obtenerse los resultados utilizando el método de cálculo reiterativo del ejemplo 3.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Gen-Probe Incorporated

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 9880 Campus Point Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: San Diego

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

NACIÓN: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92121

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN SIMULTÁNEAS DE MÚLTIPLES SECUENCIAS ESPECÍFICAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEÍBLE CON ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete (floppy disk)

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: l:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: l:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTCCCTACA ATCCCCAAAG TCAA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACAA ATGGCAGTAT TCATCCACA

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCC TTCACCTTTC CAGAG

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTGTATGT CTGTTGCTAT TAT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTACTATTCT TTCCCCTGCA CTGTACCCC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAATCCCCC CTTTTCTTTT AAAATTGTGG ATG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGAAGT GACATAGCAG GAACTA

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCACCAGGC CAGATGAGAG AACCA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGATTG GACCAGCAAG GTTTCTGTC

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGATTTCTCC TACTGGGATA GGT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: l1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATCCATC CTATTTGTTC CTGAAGGGTA C

\hfill

31

Claims (48)

1. Una composición para el ensayo de una pluralidad de analitos de ácido nucleico en una sola muestra, que contiene:

(a) una pluralidad de diferentes sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótidos, en la que cada una de dichas sondas tiene una secuencia de nucleótido complementaria de la secuencia nucleótidos diana específica diferente de uno o varios analitos de ácido nucleico, de los que se sospecha que están presentes en la muestra a analizar,

(b) una pluralidad de diferentes marcadores quimioluminiscentes, cada uno de dichos marcadores está unido a una o varias de dichas sondas de hibridación mediante un engarce de modo que dos o más analitos de ácido nucleico son tomados como diana por las sondas de ensayo de hibridación unidas a diferentes marcadores quimioluminiscentes recién mencionados,

en la que cada una de dichas sondas de hibridación se hibridará específicamente con uno o varios analitos, si están presentes en dicha muestra, en condiciones que no favorecen la hibridación de dichas sondas a los ácidos nucleicos no diana,

en la que dichos marcadores quimioluminiscentes están igualmente protegidos contra la pérdida de potencial quimioluminiscente cuando están unidos a una sonda de hibridación que está hibridada con un ácido nucleico diana, con lo cual las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes unidos a las sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido disminuyen en función de si la sonda está hibridada con una región de la secuencia de ácido nucleico o de nucleótido tomada como diana y con lo cual las proporciones de dicha pérdida se sitúan dentro de un factor de hasta 250 entre sí en las mismas condiciones; y

en la que dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles de perder su potencial quimioluminiscente cuando se unen a una sonda sin hibridar, por lo cual las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes unidos a sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido por exposición a un agente desestabilizador se sitúan dentro de un factor de 50 entre sí en condiciones idénticas; y

en la que después de iniciada la reacción de emisión de luz y detectar selectivamente las sondas hibridadas marcadas, cada uno de dichos marcadores quimioluminiscentes emite luz en una o en varias longitudes de onda suficientemente distintas de la longitud de onda de emisión de luz de cada uno de los marcadores quimioluminiscentes restantes, de modo que dichos marcadores quimioluminiscentes pueden detectarse independientemente cuando la luz emitida se detecta simultáneamente en dichas longitudes de onda como indicación de la presencia de cada uno de los analitos de ácido nucleico en dicha muestra de ensayo.

2. Una composición para el ensayo de una pluralidad de analitos de ácido nucleico en una misma muestra, que contiene:

(a) una pluralidad de diferentes sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido, en la que cada una de dichas sondas tiene una secuencia de nucleótido complementaria de la secuencia de nucleótidos diana específica diferente de uno o varios analitos de ácido nucleico, cuya presencia se sospecha en dicha muestra a analizar,

(b) una pluralidad de diferentes marcadores quimioluminiscentes, cada uno de dichos marcadores está unido a una o varias sondas de hibridación mediante un engarce, de modo que dos o más analitos de ácido nucleico pueden tomarse como dianas de sondas de ensayo de hibridación unidas a diferentes marcadores quimioluminiscentes menciona-
dos,

en la que cada una de las sondas de hibridación se hibridará específicamente con dichos analitos de ácido nucleico, si están presentes en dicha muestras, en condiciones que no favorecen la hibridación de dichas sondas con ácidos nucleicos no diana, dichos marcadores quimioluminiscentes están igualmente protegidos contra la pérdida de su potencial quimioluminiscente cuando están unidos a una sonda de hibridación que está hibrida con un ácido nucleico diana y dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles de perder su potencial quimioluminiscente cuando están unidos a una sonda sin hibridar, y en la que, después de iniciarse una reacción desencadenable y emisora de luz en un primer valor de pH, por lo menos uno de dichos marcadores quimioluminiscentes fijados participará en dicha reacción en dichos valores de pH, y por lo menos uno de dichos marcadores quimioluminiscentes fijados reaccionará en la reacción emisora de luz cuando el pH de la mezcla reaccionante haya cambiado a uno o varios valores de pH diferentes; de este modo, dicha composición permite la identificación separada de dos o más marcadores quimioluminiscentes en una misma muestra a analizar como indicación de la presencia de dichos analitos de ácido nucleico en la muestra a ensayar.

3. La composición de la reivindicación 2 en la que los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción de emisión de luz detectable en dicho primer valor de pH, tienen pH óptimos de reacción que difieren por lo menos en 0,5 unidades de pH de los que tienen los demás marcadores quimioluminiscentes fijados que reaccionan a dicho valor de pH o a otros valores diferentes.

4. La composición de la reivindicación 2, en la que los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción que emite luz detectable en dicho primer valor de pH, tienen pH óptimos de reacción diferentes por lo menos en 0,7 unidades de pH a los que tienen los demás marcadores quimioluminiscentes fijados mencionados, que reaccionan a dicho valor pH o a otros valores de pH diferentes.

5. La composición de la reivindicación 2, en la que los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción que emite luz detectable en dicho primer valor de pH, tienen pH óptimos de reacción diferentes por lo menos en 1,0 unidad de pH a los que tienen los demás marcadores quimioluminiscentes fijados mencionados, que reaccionan a dicho valor pH o a otros valores de pH diferentes.

6. La composición de la reivindicación 2, en la que los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción que emite luz detectable en dicho primer valor de pH, tienen pH óptimos de reacción diferentes por lo menos en 1,5 unidades de pH a los que tienen los demás marcadores quimioluminiscentes fijados mencionados, que reaccionan a dicho valor pH o a otros valores de pH diferentes.

7. La composición de la reivindicación 2, en la que los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción que emite luz detectable en dicho primer valor de pH, tienen pH óptimos de reacción diferentes por lo menos en 2,0 unidades de pH a los que tienen los demás marcadores quimioluminiscentes fijados mencionados, que reaccionan a dicho valor pH o a otros valores de pH diferentes.

8. La composición de la reivindicación 2, en la que por lo menos dos de dichos marcadores luminiscentes son ésteres de acridinio.

9. La composición de la reivindicación 8, en la que uno de dichos ésteres de acridinio se elige entre el grupo formado por AE estándar, naftil-AE, o-diBr-AE, 1- o 3-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-MeO-AE, o-diMe-AE, m-diMe-AE, orto-AE, o-F-AE, 1- y 3-Me-o-F-AE y 1- o 3-Me-m-diF-AE, representados en las fórmulas siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

22

220

\vskip1.000000\baselineskip

10. La composición de la reivindicación 9, en la que un primer éster de acridinio se elige entre el grupo formado por el o-diBr-AE y el o-F-AE y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por el AE estándar y el o-MeO-AE.

11. La composición de la reivindicación 2, en la que por lo menos uno de los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho primer valor de pH, contiene el o-F-AE, y por lo menos uno de los demás marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho valor de pH o en otros valores diferentes de pH, contiene un reactivo quimioluminiscente elegido entre el grupo formado por el 1-Me-AE, el 3-Me-AE, una mezcla de 1- y 3-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE y AE estándar.

12. La composición de la reivindicación 2, en la que por lo menos uno de los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho primer valor de pH, contiene una mezcla de 1- y 3-Me-m-diF-AE y por lo menos uno de los demás marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho valor de pH o en otros valores diferentes de pH, contiene un reactivo quimioluminiscente elegido entre el grupo formado por el 1-Me-AE, 3-Me-AE, una mezcla de 1- y 3-Me-AE, y o-MeO(cinamil)-AE.

13. La composición de la reivindicación 2, en la que por lo menos uno de los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho primer valor de pH, contiene el 2,7-diMe-AE, y por lo menos uno de los demás marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho valor de pH o en otros valores diferentes de pH, contiene el o-Me-AE.

14. La composición de la reivindicación 2, en la que por lo menos uno de los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho primer valor de pH, contiene el naftil-AE, y por lo menos uno de los demás marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho valor de pH o en otros valores diferentes de pH, contiene el AE estándar.

15. La composición de la reivindicación 2, en la que por lo menos uno de los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho primer valor de pH, contiene el o-diBr-AE, y por lo menos uno de los demás marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho valor de pH o en otros valores diferentes de pH, contiene un reactivo quimioluminiscente elegido entre el grupo formado por el 1-Me-AE, 3-Me-AE, una mezcla de 1- y 3-Me-AE y o-MeO(cinamil)-AE.

16. La composición de la reivindicación 2, en la que por lo menos uno de los marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho primer valor de pH, contiene un primer reactivo quimioluminiscente elegido entre el grupo formado por el o-F-AE, el 1-Me-m-diF-AE, el 3-Me-m-diF-AE, una mezcla de 1-Me-m-diF-AE y 3-Me-m-diF-AE, 2,7-diMe-AE, naftil-AE y o-diBr-AE, y por lo menos uno de los demás marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz a dicho valor de pH o en otros valores diferentes de pH, contiene un reactivo quimioluminiscente elegido entre el grupo formado por el 1-Me-AE, 3-Me-AE, una mezcla de 1- y 3-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE, AE estándar y o-Me-AE.

17. La composición de la reivindicación 16, que contiene por lo menos tres marcadores quimioluminiscentes fijados diferentes.

18. La composición de la reivindicación 2, que contiene por lo menos tres marcadores quimioluminiscentes, en la que por lo menos uno de los que contiene por lo menos marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionan en dicha reacción emisora de luz en un primer valor de pH, contiene un primer reactivo quimioluminiscente elegido entre el grupo formado por el o-F-AE, l-Me-m-diF-AE, 3-Me-m-diF-AE, una mezcla de 1-m-diF-AE y 3-Me-m-diF-AE, 2,7-diMe-AE, naftil-AE y o-diBr-AE, y por lo menos uno de los demás marcadores quimioluminiscentes fijados, que reaccionante en dicho valor de pH o en otros valores de pH diferentes, contiene un segundo reactivo quimioluminiscente elegido entre el grupo formado por el 1-Me-AE, 3-Me-AE, una mezcla de 1- y 3-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE, AE estándar y o-Me-AE.

19. Una composición para el ensayo de una pluralidad de analitos de ácido nucleico en una sola muestra, que contiene:

(a) una pluralidad de diferentes sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido, en la que cada una de dichas sondas tiene una secuencia de nucleótido complementaria de una secuencia de nucleótidos diana diferentes específica de uno o varios analitos de ácido nucleico, cuya presencia se sospecha en la muestra;

(b) una pluralidad de diferentes marcadores quimioluminiscentes, cada uno de dichos marcadores está fijado sobre dichas sondas de hibridación mediante un engarce, de modo que dos o más analitos de ácido nucleico son tomados en cada caso como dianas por las sondas de ensayo de hibridación unidas a diferentes marcadores quimioluminiscentes mencionados, en la que cada una de dichas sondas de hibridación se hibridará específicamente con uno o varios analitos de ácido nucleico si están presentes en la muestra, en condiciones que no favorecen la hibridación de dichas sondas de ácidos nucleicos no diana, en la que dichos marcadores quimioluminiscentes están igualmente protegidos contra la pérdida de potencial quimioluminiscente cuando se fijan sobre una sonda de hibridación hibridada con un ácido nucleico diana, con lo cual las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de los diferentes marcadores quimioluminiscentes unidos a las sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido disminuyen en función de si la sonda está hibridada con un ácido nucleico diana o con una región de la secuencia de nucleótidos y con lo cual las proporciones de dicha pérdida se sitúan dentro de un factor de hasta 250 entre sí en las mismas condiciones; y

en la que dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles de perder su potencial quimioluminiscente cuando están unidos a una sonda sin hibridar, con lo cual las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido por exposición a un agente desestabilizador se sitúan dentro de un factor de 50 entre sí en condiciones idénticas; y

en la que después del inicio de una reacción de emisión de luz hasta alcanzar el pico y/o los valores de duración de la reacción de por lo menos un marcador quimioluminiscente reaccionante son suficientemente diferentes de los de por lo menos otro marcador quimioluminiscente reaccionante para permitir la detección separada de dichos marcadores quimioluminiscentes reaccionante en la misma muestra de ensayo, cuando la emisión de luz se detecta o mide durante intervalo predeterminados de tiempo después del acontecimiento inicial como indicación de cada uno de dichos analitos.

20. La composición de la reivindicación 19, en la que por lo menos uno de dichos marcadores quimioluminiscentes es un éster de acridinio.

21. La composición de la reivindicación 19, en la que por lo menos dos de dichos marcadores quimioluminiscentes son ésteres de acridinio.

22. La composición de la reivindicación 19, en la que todos dichos marcadores quimioluminiscentes son ésteres de acridinio.

23. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que por lo menos uno de dichos ésteres de acridinio se elige entre el grupo formado por el AE estándar, naftil-AE, o-diBr-AE, 1- o 3-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-MeO-AE, o-diMe-AE, m-diMe-AE, orto-AE, o-F-AE, 1- o 3-Me-o-F-AE y 1- o 3-Me-m-diF-AE.

24. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el AE estándar y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por: el naftil-AE, o-diBr-AE, o-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-MeO-AE, o-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE y 1-Me-m-diF-AE.

25. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el naftil-AE y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por: el 1-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE y o-AE.

26. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el o-diBr-AE y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por: el 1-Me- o 3-Me-AE, 3-Me-AE, 4,5-diMe-AE, 2,7-diMe-AE, o-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE y o-AE.

27. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el 1-Me- o el 3-Me-AE y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por: el o-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-MeO-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE y 1-Me-m-diF-AE.

28. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el 4,5-diMe-AE y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por: el O-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-MeO-AE, o-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE y 1-Me-m-diF-AE.

29. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el 2,7-diMe-AE y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por: el o-diMe-AE, o-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-MeO-AE, o-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE y 1-Me-m-diF-AE.

30. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el o-diMe-AE y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por: el o-Me-AE, o-MeO(cinamil)-AE, o-MeO-AE, o-AE, o-F-AE, 1-Me-o-F-AE y 1-Me-m-diF-AE.

31. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el o-Me-AE y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por: el o-MeO(cinamil)-AE, o-MeO-AE, o-AE, o-F-AE, l-Me-o-F-AE y l-Me-m-diF-AB.

32. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el o-MeO(cinamil)-AE y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por: el o-MeO-AE, o-F-AB, 1-Me-o-F-AE y l-Me-m-diF-AE.

33. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el o-MeO-AE y el segundo éster de acridinio es el o-AE.

34. La composición de la reivindicación 20 ó la reivindicación 21, en la que un primer éster de acridinio es el o-AE y un segundo éster de acridinio se elige entre el grupo formado por: o-F-AE, 1-Me-o-F-AE y 1-Me-m-diF-AE.

35. Una composición para el ensayo de una pluralidad de analitos de ácido nucleico en una misma muestra de ensayo, que contiene por lo menos dos marcadores quimioluminiscentes elegidos entre el grupo formado por:

(a)

o-diBr-AE,

(b)

2,7-diMe-AE,

(c)

una mezcla de 1- y 3-Me-AE,

(d)

o-AE,

(e)

o-MeO(cinamil)-AE,

(f)

o-Me-AE y

(g)

o-diMe-AE,

en la que cada uno de dichos marcadores quimioluminiscentes está unido por lo menos una sonda de ensayo de hibridación diferente, cada una de dichas sondas tiene una secuencia de nucleótido suficientemente complementaria de una región diana contenida en uno o en varios analitos de ácido nucleico para unirse a la misma en condiciones de hibridación que no favorecen la hibridación entre dichas sondas y las regiones no diana, y en la que después del inicio de una reacción desencadenable y emisora de luz, la cinética de reacción, la longitud de onda de la luz emitida y/o las características de pH óptimo de cada uno de dichos marcadores quimioluminiscentes es suficientemente distinta de las de los demás marcadores mencionados para que cada uno de dichos marcadores sea detectable por separado como indicación de la presencia de cada uno de dichos analitos de ácido nucleico en dicha muestras.

36. Un método para el ensayo de una pluralidad de analitos de ácido nucleico en una sola muestra, que consiste en los pasos siguientes:

(a) introducir en un medio

(i)

una pluralidad de diferentes sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido, cada una de dichas sondas tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una secuencia de nucleótidos diana de un analito de ácido nucleico, cuya presencia se sospecha en dicha muestra,

(ii)

una pluralidad de diferentes marcadores quimioluminiscentes, cada uno de dichos marcadores está fijado sobre una o varias de dichas sondas de hibridación, de modo que dos o más analitos de ácido nucleico son tomados en cada caso como dianas por lo menos por una sonda de ensayo de hibridación unida a un marcador quimioluminiscente diferente y

(iii)

dicha muestra y

(b) establecer las condiciones de hibridación en las que las diferentes sondas de ensayo de hibridación se hibridarán con preferencia con dichos analitos de ácido nucleico para formar híbridos de ácido nucleico de doble hebra marcados, dichas condiciones no favorecen la formación de híbridos de ácido nucleico de doble hebra entre dichas sondas marcadas y los ácidos nucleicos no diana,

(c) destruir o inhibir selectivamente el potencial quimioluminiscente de dichos marcadores quimioluminiscentes fijados sobre la sonda sin hibridar, dichos marcadores quimioluminiscentes están igualmente protegidos contra la pérdida del potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda de hibridación hibridada con un ácido nucleico diana, con lo cual las proporciones de pérdida del potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido disminuyen en función de si la sonda está hibridada con un ácido nucleico o una región de secuencia de nucleótidos y con ello las proporciones de dicha pérdida se sitúan dentro de un factor de hasta 250 entre sí en las mismas condiciones; y dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles de perder su potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda sin hibridar; las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido por exposición a un agente desestabilizador se sitúan dentro de un factor de 50 entre sí en condiciones idénticas;

(d) inducir a los marcadores quimioluminiscentes asociados a híbridos de ácidos nucleicos de doble hebra a emitir luz y

(e) detectar cada uno de dichos analitos de ácido nucleico, si está presente, midiendo la luz emitida por el marcador quimioluminiscente hibridado fijado a una longitud de onda de emisión de luz suficientemente distinta de la longitud de onda de emisión de luz de cada uno de los demás marcadores quimioluminiscentes para permitir la detección independiente de dichos analitos de una misma muestra a analizar.

37. Un método para el ensayo de una pluralidad de analitos de ácido nucleico en una sola muestra, que consiste en los pasos siguientes:

(a) introducir en un medio

(i)

una pluralidad de diferentes sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido, cada una de dichas sondas tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una secuencia de nucleótidos diana de un analito de ácido nucleico, cuya presencia se sospecha en dicha muestra a analizar,

(ii)

una pluralidad de diferentes marcadores quimioluminiscentes, cada uno de dichos marcadores está fijado sobre una o varias de dichas sondas de hibridación, de modo que dos o más analitos de ácido nucleico son tomados en cada caso como dianas por lo menos por una sonda de ensayo de hibridación unida a un marcador quimioluminiscente diferente y

(iii)

dicha muestra y

(b) establecer las condiciones de hibridación en las que las diferentes sondas de ensayo de hibridación se hibridarán con preferencia con dichos analitos de ácido nucleico, si están presentes, para formar híbridos de ácido nucleico de doble hebra marcados, dichas condiciones no favorecen la formación de híbridos de ácido nucleico de doble hebra entre dichas sondas marcadas y los ácidos nucleicos no diana,

(c) destruir o inhibir selectivamente el potencial quimioluminiscente del marcador quimioluminiscente fijado sobre la sonda sin hibridar, dichos marcadores quimioluminiscentes están igualmente protegidos contra la pérdida del potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda de hibridación hibridada con un ácido nucleico diana, con lo cual las proporciones de pérdida del potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido disminuyen en función de si la sonda está hibridada con un ácido nucleico o una región de secuencia de nucleótidos y con ello las proporciones de dicha pérdida se sitúan dentro de un factor de hasta 250 entre sí en las mismas condiciones; y dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles de perder su potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda sin hibridar; las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido por exposición a un agente desestabilizador se sitúan dentro de un factor de 50 entre sí en condiciones idénticas;

(d) inducir a los marcadores quimioluminiscentes asociados a híbridos de ácidos nucleicos de doble hebra a emitir luz y

(e) detectar cada analito de ácido nucleico hibridado midiendo, después de iniciada la reacción de emisión de luz, el tiempo hasta alcanzar el pico y/o los valores de duración de la reacción de los marcadores quimioluminiscentes marcados durante intervalos de tiempo predeterminados, después del acontecimiento de inicio.

38. Un método para el ensayo de una pluralidad de analitos de ácido nucleico en una misma muestra, que consiste en los pasos siguientes:

(a) introducir en un medio

(i)

una pluralidad de diferentes sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido, cada una de dichas sondas tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una secuencia de nucleótidos diana de un analito de ácido nucleico, cuya presencia se sospecha en dicha muestra,

(ii)

una pluralidad de diferentes marcadores quimioluminiscentes, cada uno de dichos marcadores está fijado sobre una o varias de dichas sondas de hibridación, de modo que dos o más analitos de ácido nucleico son tomados en cada caso como dianas por una sonda de ensayo de hibridación unida a un marcador quimioluminiscente diferente y

(iii)

dicha muestra y

(b) establecer las condiciones de hibridación en las que las diferentes sondas de ensayo de hibridación se hibridarán con preferencia con dichos analitos de ácido nucleico, si están presentes, para formar específicamente híbridos de ácido nucleico de doble hebra marcados, dichas condiciones no favorecen la formación de híbridos de ácido nucleico de doble hebra entre dichas sondas marcadas y los ácidos nucleicos no diana,

(c) destruir o inhibir selectivamente el potencial quimioluminiscente de dichos marcadores quimioluminiscentes fijados sobre la sonda sin hibridar, dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles de pérdida del potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre dicha y dichos marcadores quimioluminiscentes están igualmente protegidos contra la pérdida de su potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre dicha sonda hibridada,

(d) inducir por lo menos a uno de los marcadores quimioluminiscentes asociados a híbridos de ácidos nucleicos de doble hebra a participar en una reacción emisora de luz en un primer valor de pH y medir la luz emitida por dicho marcador durante la reacción,

(e) ajustar la solución de ensayo por lo menos a un valor diferente de pH,

(f) inducir por lo menos a un marcador quimioluminiscente fijado diferente, asociado con a uno o varios híbridos de ácido nucleico de doble hebra diferentes, a participar en una reacción de emisión en dicho(s) valor(es) diferentes de pH y

(g) medir la luz emitida por dichos marcadores diferentes durante un período de tiempo predeterminado, permitiendo de este modo la identificación separada de un marcador quimioluminiscente fijado diferente como medida de cada analito de ácido nucleico diferente hibridado con sondas de ensayo de hibridación marcadas, en una misma muestra de análisis.

39. Una composición para la detección de uno o varios organismos en una sola muestra, que contiene:

(a) una pluralidad de diferentes sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido, cada una de dichas sondas tiene una secuencia de nucleótido complementaria de la de uno o varios analitos de ácido nucleico, útiles para identificar por lo menos un organismo diana, cuya presencia se sospecha en dicha muestra a analizar,

(b) una pluralidad de diferentes marcadores quimioluminiscentes, cada uno de ellos está unido a una de dichas sondas de hibridación, de modo que dos o más analitos de ácido nucleico se toman como dianas por diferentes sondas de ensayo de hibridación marcadas con marcadores quimioluminiscentes, cada sonda de hibridación se hibridará específicamente a dichos analitos de ácido nucleico, si están presentes en dicha muestra, en condiciones que no favorecen la hibridación de dichas sondas con regiones de ácido nucleico no diana, dichos marcadores quimioluminiscentes están igualmente protegidos contra la pérdida de potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda de hibridación hibridada con un ácido nucleico diana, las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido disminuyen en función de si la sonda está hibridada con una región de secuencia de ácido nucleico o de nucleótido tomada como diana y de este modo las proporciones de pérdida se sitúan dentro de un factor de hasta 250 entre sí, en las mismas condiciones; y

dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles de perder su potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda sin hibridar, en este caso las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcados quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido por exposición a un agente desestabilizador se sitúan dentro de un factor de 50 entre sí, en condiciones idénticas; y

en la que, una vez iniciada la reacción emisora de luz, cada marcador quimioluminiscente emite luz en una o en varias longitudes de onda suficientemente distintas de la longitud de onda de emisión de luz de cada uno de los demás marcadores quimioluminiscentes para que dichos marcadores quimioluminiscentes puedan detectarse independientemente cuando se detecte la luz emitida a dichas longitudes de onda como indicación de la presencia de cada uno de dichos organismos diana en dicha muestra a analizar.

40. Una composición para la detección de uno o varios organismos en una misma muestra, que contiene:

(a) una pluralidad de diferentes sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótidos, cada una de dichas sondas tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de la de uno o de varios analitos de ácido nucleico, útiles para identificar por lo menos un organismo diana, cuya presencia se sospecha en dicha muestra de análisis,

(b) una pluralidad de diferentes marcadores quimioluminiscentes, cada uno unido a una sonda de hibridación diferente, de modo que dos o más analitos de ácido nucleico sean tomados como dianas por dichas sondas de ensayo de hibridación marcadas con marcadores quimioluminiscentes, cada una de dichas sondas de hibridación se hibridará específicamente con los analitos de ácido nucleico útiles para detectar dicho(s) organismo(s) diana, si están presentes en dicha muestra, en condiciones que no favorecen la hibridación de dichas sondas con regiones de ácidos nucleicos no diana, dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente resistentes a la pérdida de potencial quimioluminiscente cuando está fijados sobre una sonda de hibridación hibridada con un ácido nucleico diana, y dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles a la pérdida de potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda sin hibridar, y en la que, después de iniciarse una reacción desencadenable de emisión de luz en un primer valor de pH, por lo menos uno de dichos marcadores quimioluminiscentes participará en una reacción de emisión de luz a dicho valor de pH y por lo menos otro de dichos marcadores quimioluminiscentes no participará en dicha reacción emisora de luz hasta que la solución se ajuste por lo menos a un valor de pH diferente, con lo cual dicha composición permitirá la identificación separada de cada marcador quimioluminiscente en una sola muestra analítica como indicación de la presencia de cada uno de dichos organismos diana en la muestra.

41. Una composición para la detección de uno o varios organismos una sola muestra de análisis, que contiene:

(a) una pluralidad de diferentes sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido, cada una de dichas sondas tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de la de uno o varios analitos de ácido nucleico útiles para la identificación por lo menos de un organismo diana, cuya presencia se sospecha en la muestra analítica,

(b) una pluralidad de diferentes marcadores quimioluminiscentes, cada uno de ellos unido a una de dichas sondas de hibridación, de modo que dos o más analitos de ácido nucleico sean tomados como dianas por dichas sondas de ensayo de hibridación marcadas con marcadores quimioluminiscentes, cada una de dichas sondas de hibridación se hibridará específicamente con los analitos de ácido nucleico útiles para la identificación de dichos organismos diana, si están presentes en la muestra; en condiciones que no favorecen la hibridación de dichas sondas a las regiones de ácidos nucleicos no diana,

dichos marcadores quimioluminiscentes están igualmente protegidos contra la pérdida de potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda de hibridación hibridada con un ácido nucleico diana, con ello las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido disminuyen en función de si la sonda está hibridada con una región de secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos tomada como diana y con ello las proporciones de pérdida están comprendidas dentro de un factor de hasta 250 entre sí, en las mismas condiciones; y dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles de la pérdida de su potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda sin hibridar, con lo cual las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido por exposición a un agente desestabilizador se sitúan dentro de un factor de 50 entre sí en condiciones idénticas;

y en la que después de iniciada una reacción de emisión de luz, el tiempo hasta alcanzar el pico y/o los valores de duración de la reacción de cada marcador quimioluminiscente reaccionante son suficientemente diferentes de las de cada uno de los demás marcadores quimioluminiscentes reaccionantes para permitir la detección separada de cada marcador quimioluminiscente en presencia de los demás marcadores, cuando dicha emisión de luz se detecta o se mide durante un período de tiempo predeterminado después del acontecimiento inicial como indicación de la presencia de cada organismo diana en la muestra.

42. Un método para detectar la presencia simultánea o la cantidad de los ácidos nucleicos de la Chlamydia trachomatis y de la Neisseria gonorrhoeae en una misma muestra, que consiste en:

(a) poner en contacto dicha muestra por lo menos una sonda de ensayo de hibridación de oligonucleótido, que se hibridará preferentemente con los ácidos nucleicos de la Chlamydia trachomatis antes que con los ácidos nucleicos que no son de la Chlamydia trachomatis y por lo menos una sonda de ensayo de hibridación de oligonucleótido que se hibridará con preferencia con los ácidos nucleicos de la Neisseria gonorrhoeae antes que con los ácidos nucleicos que no son de Neisseria gonorrhoeae, en el que dichas sondas de ensayo de hibridación específicas de la Chlamydia trachomatis se fijan sobre un primer reactivo marcador quimioluminiscente y dichas sondas de ensayo de hibridación específicas de la Neisseria gonorrhoeae se fijan sobre un segundo reactivo marcador quimioluminiscente,

(b) establecer condiciones de hibridación suficientes para permitir la hibridación entre dichas sonda de ensayo de hibridación específicas de la Chlamydia trachomatis y los ácidos nucleicos de la Chlamydia trachomatis, si están presentes, y la hibridación de las sondas de ensayo específicas de la Neisseria gonorrhoeae con los ácidos nucleicos de la Neisseria gonorrhoeae, si están presentes, dichas condiciones de hibridación no facilitarán la hibridación no específica de dichas sondas de ensayo de hibridación con ácidos nucleicos que no sean diana,

(c) destruir o inhibir selectivamente el potencial quimioluminiscente del marcador quimioluminiscente fijado sobre una sonda sin hibridar, dichos marcadores quimioluminiscentes están igualmente protegidos contra la pérdida del potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda de hibridación hibridada con un ácido nucleico diana, con lo cual las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de los diferentes marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido disminuyen en función de si la sonda está hibridada con una región de secuencia de ácido nucleico o de nucleótidos tomada como diana y en el que las proporciones de dicha pérdida están comprendidas dentro de un factor de hasta 250 entre sí en las mismas condiciones; y dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles de perder su potencial quimioluminiscente cuando están unidos a una sonda sin hibridar, con lo cual las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido por exposición a agente desestabilizador se sitúan dentro de un factor de 50 entre sí, en condiciones idénticas;

(d) detectar dicho primer reactivo quimioluminiscente fijado sobre sondas específicas de la Chlamydia trachomatis hibridadas, como indicación de la presencia de los ácidos nucleicos de la Chlamydia trachomatis en dicha muestra, y dicho segundo reactivo quimioluminiscente fijado sobre sondas específicas de Neisseria gonorrhoeae hibridadas, como indicación de la presencia de los ácidos nucleicos de la Neisseria gonorrhoeae en dicha muestra, cada uno de los marcadores quimioluminiscente emite luz en una o en varias longitudes onda, suficientemente distintas de la longitud de onda de emisión de luz de cada uno de los demás marcadores quimioluminiscentes, para poder detectar independientemente cada uno de dichos marcadores quimioluminiscentes cuando la luz emitida se detecta simultáneamente en dichas longitudes de onda como indicación de la presencia de cada uno de los analitos de ácido nucleico en dicha muestra analítica.

43. Un método para el ensayo de una pluralidad de analitos en un ácido nucleico diana en una muestra que consiste en:

(a) poner en contacto dicha muestra con una pluralidad de diferentes sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido, cada una de dichas sondas se hibrida específicamente con una región diferente de un analito diana de dicho ácido nucleico y cada una de dichas sondas diferentes se fija sobre un marcador quimioluminiscente diferente,

(b) establecer las condiciones de hibridación de dicha muestra para que sean suficientes para permitir la hibridación específica entre cada una de dichas sondas de ensayo de hibridación con su analito, dichas condiciones de hibridación no facilitan la hibridación de dichas sondas de ensayo de hibridación con regiones de secuencia de nucleótidos no diana de dicho ácido nucleico,

(c) destruir o inhibir selectivamente el potencial quimioluminiscente del marcador quimioluminiscente fijado sobre una sonda sin hibridar, dichos marcadores quimioluminiscentes están igualmente protegidos contra la pérdida del potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda de hibridación hibridada con un ácido nucleico diana, con lo cual las proporciones de pérdida de potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes unidos a sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido disminuyen en función de si la sonda está hibrida con un ácido nucleico diana o una región de secuencia de nucleótidos diana y de este modo las proporciones de dicha pérdida se sitúan dentro de un factor de hasta 250 entre sí, en las mismas condiciones; y dichos marcadores quimioluminiscentes son igualmente susceptibles de perder su potencial quimioluminiscente cuando están fijados sobre una sonda sin hibridar, en este caso las proporciones de pérdida del potencial quimioluminiscente de diferentes marcadores quimioluminiscentes unidos a sondas de ensayo de hibridación de oligonucleótido por exposición a un agente desestabilizador se sitúan dentro de un factor de 50 entre sí, en condiciones idénticas;

(d) detectar dichos marcadores quimioluminiscentes fijados sobre diferentes sondas como indicación de la presencia de dichos analitos de ácido nucleico en dicha muestra, cada uno de dichos marcadores quimioluminiscentes emite luz en una o varias longitudes de onda suficientemente distintas de la longitud de onda de emisión de luz de de cada uno de los demás marcadores quimioluminiscentes, de modo que dichos marcadores quimioluminiscentes pueden detectarse independientemente cuando la luz emitida se detecta simultáneamente a dichas longitudes de onda como indicación de la presencia de cada uno de los analitos de ácido nucleico en dicha muestra analítica.

44. El método de la reivindicación 43, en el que dicho ácido nucleico se deriva del virus de la inmunodeficiencia humana.

45. El método de la reivindicación 44, en el que dichos analitos diferentes comprenden las regiones diana situadas en las regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana que contienen las regiones gag y pol.

46. Un kit que contiene una cualquiera de las composiciones de la reivindicación de 1 a 35, 39, 40 ó 41 para la detección de dos o más analitos de ácido nucleico en una muestra a ensayar.

47. El kit de la reivindicación 46 que contiene además un reactivo de discriminación, que contiene medios para destruir o inhibir selectivamente el potencial quimioluminiscente de dichos marcadores quimioluminiscentes fijados sobre sondas sin hibridar.

48. El kit de la reivindicación 46 ó 47, que comprende además un reactivo de detección, que contiene medios para provocar que los reactivos quimioluminiscentes emitan una luz detectable.