[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

ES2270420T3 - Genes receptores de la transferrina de haemophilus. - Google Patents

Genes receptores de la transferrina de haemophilus. Download PDF

Info

Publication number
ES2270420T3
ES2270420T3 ES95900031T ES95900031T ES2270420T3 ES 2270420 T3 ES2270420 T3 ES 2270420T3 ES 95900031 T ES95900031 T ES 95900031T ES 95900031 T ES95900031 T ES 95900031T ES 2270420 T3 ES2270420 T3 ES 2270420T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
tbp2
seq
tbp1
influenzae
lane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES95900031T
Other languages
English (en)
Inventor
Sheena Loosmore
Robin Harkness
Anthony Schryvers
Pele Chong
Scott Gray-Owen
Yan-Ping Yang
Andrew Murdin
Michel Klein
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Pasteur Ltd
Original Assignee
Sanofi Pasteur Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Pasteur Ltd filed Critical Sanofi Pasteur Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2270420T3 publication Critical patent/ES2270420T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

SE PRESENTA UN ACIDO NUCLEICO PURIFICADO Y AISLADO QUE CODIFICA UNA PROTEINA RECEPTORA DE LA TRANSFERRINA DE UNA CEPA DE HAEMOPHILUS O UN FRAGMENTO O UN ANALOGO DE LA PROTEINA RECEPTORA DE TRANSFERRINA. LA SECUENCIA DE ACIDOS NUCLEICOS SE PUEDE UTILIZAR PARA LA PRODUCCION DE PEPTIDOS SIN CONTAMINANTES DERIVADOS DE BACTERIAS QUE NORMALMENTE CONTIENEN LAS PROTEINAS TBP1 O TBP2 CON FINES DE DIAGNOSTICO Y DE TRATAMIENTO MEDICO. ADEMAS, LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO SE PUEDE UTILIZAR EN EL DIAGNOSTICO DE INFECCIONES. TAMBIEN SE PRESENTAN TBP1 O TBP2 RECOMBINANTES Y METODOS PARA LA PURIFICACION DE LAS MISMAS. SE PRESENTAN EPITOPES QUE EXPRESAN VECTORES VIVOS DE UNA PROTEINA RECEPTORA DE TRANSFERRINA PARA VACUNACIONES.

Description

Genes receptores de la transferrina de Haemophilus.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a péptidos que contienen una secuencia de aminoácidos conservada de una proteína receptora de la transferrina y a composiciones inmunógenas y a antisueros o anticuerpos derivados de la misma.
Antecedentes de la invención
Las cepas de Haemophilus influenzae del tipo b encapsuladas son la principal causa de la meningitis bacteriana y de otras infecciones invasoras en los niños. Sin embargo, los H. influenzae no tipificables (NTHi, por sus siglas en inglés) y sin encapsular son responsables de un amplio abanico de enfermedades humanas, incluidas la otitis media, la epiglotitis, la neumonía y la traqueobronquitis. Las vacunas se basan en un polisacárido capsular del H. influenzae de tipo b conjugado al toxoide de la difteria (Berkowitz et al., 1987). A lo largo de esta solicitud, se citan varias referencias entre paréntesis para describir más completamente el estado de la técnica al que pertenece esta invención. La información bibliográfica completa para cada cita se encuentra al final de la memoria descriptiva, inmediatamente antes de las reivindicaciones. El toxoide del tétanos (Classon et al., 1989 y la patente de los EE. UU. n.º 4.496.538) o la proteína de la membrana externa de Neisseria meningitidis (Black et al., 1991) han sido eficaces a la hora de reducir la meningitis inducida por el H. influenzae de tipo b, pero no la enfermedad inducida por el NTHi (Bluestone, 1982).
La otitis media es la enfermedad más común de la infancia temprana ya que un 60% al 70% de los niños menores de 2 años sufren de una a tres infecciones de oído. La otitis media es la responsable de los deterioros cognitivos, del oído y del habla en los niños. Las infecciones de H. influenzae explican aproximadamente el 30% de los casos de otitis media aguda y aproximadamente el 60% de las otitis medias crónicas. Sólo en los Estados Unidos, el tratamiento de la otitis media cuesta entre 1000 y 2000 millones de dólares al año en antibióticos y procedimientos quirúrgicos como tonsilectomías, adenoidectomías e introducción de tubos de timpanostomía. Además, muchos de los organismos causantes de la otitis media están convirtiéndose en resistentes al tratamiento antibiótico. or lo tanto, es deseable una vacuna profiláctica eficaz contra la otitis media. Las cepas del H. influenzae no tipificables también son patógenos importantes responsables de la pneumonía en los ancianos y otros individuos que son particularmente sensibles a infecciones respiratorias. Por lo tanto, se necesitan antígenos del H. influenzae que sean útiles como componentes de preparaciones inmunógenas que proporcionen protección contra los muchos serotipos de H. influenzae.
El hierro es un nutriente esencial para el crecimiento de muchas bacterias. Varios patógenos humanos, como algunas cepas de H. influenzae, Branhamella catarrhalis, N. meningitidis, N. gonorrhoeae y la comensal no patógena Neisseria, pueden utilizar la transferrina humana como una fuente de hierro (Schryvers, 1988; Schryvers y Lee, 1989; Mickelsen y Sparling, 1981). El receptor bacteriano de la transferrina (TfR) se compone de dos cadenas: Tbp1 y Tbp2. En las cepas de H. influenzae, la masa molecular de Tbp1 es aproximadamente 100.000 mientras que la masa molecular de Tbp2 es variable, y oscila de 60.000 a 90.000, según la cepa (Schryvers y Gray-Owen, 1992; Holland et al., 1992). Se cree que la expresión del receptor de la transferrina del H. influenzae está regulada por el hierro y/o el grupo hemo (Morton et al., 1993) y se ha identificado un posible sitio de unión fur (Braun y Hantke, 1991) cadena arriba de Tbp2. Esta secuencia se encuentra en la región del promotor de los genes que están regulados negativamente por el hierro, incluido el TfR de N. meningitidis (Legrain et al., 1993). El promotor está seguido por los genes Tbp2 y Tbp1, una ordenación que se encuentra en otros operones del TfR bacteriano (Legrain et al., 1993; Wilton et al., 1993). Los anticuerpos que bloquean el acceso del receptor de la transferrina a su fuente de hierro pueden prevenir el crecimiento bacteriano. Además, los anticuerpos contra el TfR que son opsonizantes o bactericidas también pueden proporcionar protección mediante mecanismos alternativos. Así, el receptor de la transferrina, fragmentos del mismo, sus cadenas constituyentes o los péptidos derivados de él son candidatos para una vacuna que proteja contra la infección del H. influenzae. Los ratones inmunizados con proteínas del TfR de N. meningitidis en el adyuvante de Freund quedaron protegidos a partir de la prueba de provocación homóloga, y los antisueros contra el TfR resultaron bactericidas y protectores en un análisis de transferencia pasiva (Danve et al., 1993). Los cerdos inmunizados con la Tbp2 de A. pleuropneumoniae recombinante quedaron protegidos frente a la prueba de provocación homóloga pero no frente a la prueba de la provocación heteróloga (Rossi-Campos et al., 1992). Estos datos indican la eficacia de las vacunas sobre la base del TfR a la hora de proteger frente a la enfermedad. Sería deseable proporcionar la secuencia de la molécula de ADN que codifica el receptor de la transferrina y los péptidos que corresponden a porciones del receptor de la transferrina y los vectores que contienen tales secuencias para el diagnóstico, la inmunización y la generación de los reactivos diagnósticos e inmunitarios.
El virus de la poliomielitis es un enterovirus, un género de la familia Picornaviridae. Hay tres serotipos distintos del virus y numerosas cepas dentro de cada serotipo. Las cepas virulentas causan la poliomielitis paralítica. Como vacunas, se utilizan cepas atenuadas que han reducido su capacidad de causar la enfermedad paralítica y cepas virulentas inactivadas. La infección con el virus induce la inmunidad protectora y duradera de la mucosa. La inoculación con vacunas del virus de la poliomielitis inactivado también puede inducir una respuesta inmunitaria en la mucosa.
Se conoce la estructura del virus de la poliomielitis y está muy conservada entre cepas y serotipos. También se han determinado las estructuras de otros varios picornavirus (virus que pertenecen a los géneros de la familia Picornaviridae), y se ha demostrado que están estrechamente relacionados con la estructura del virus de la poliomielitis. Es posible expresar epítopos foráneos en la cápsida o en los virus de la poliomielitis (Murdin et al., 1992), y este trabajo se ha extendido a otros picornavirus. Los epítopos que se han expresado normalmente son cortos, bien definidos y contiguos, y la mayoría se han expresado dentro del sitio I antigénico de neutralización del virus de la poliomielitis (NAgI) o el sitio equivalente en otros picornavirus. Este sitio incluye las hojas beta B y C que unen el bucle (el bucle BC) de la proteína VP1 de la cápsida del virus de la poliomielitis. El bucle BC de la VP1 es un bucle expuesto a la superficie con nueve aminoácidos que se pueden reemplazar y extender con, al menos, veinticinco aminoácidos heterólogos (Murdin et al., 1991). Los virus de la poliomielitis híbridos o quiméricos que expresan epítopos del receptor de la transferrina, que crecen con una gran titulación y que son inmunógenos, serían útiles como vacunas y como herramientas para generar reactivos inmunitarios.
En Gray-Owen, S.D. et al. (1993), Microbial Pathogenesis, Vol. 14, páginas 389-398 se describen anticuerpos monoclonales específicos contra la transferrina humana.
En Stevenson, P. et al. (1992) Infection & Immunity Vol. 60, n.º 6, páginas 2391-2396 se describe un antisuero contra la TBP-2 purificada de una cepa de N. meningitidis que reacciona de forma cruzada con todos los aislados meningocócicos examinados y con la TBP-2 de varias cepas del H. influenzae de tipo b.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona péptidos que tienen no menos de siete aminoácidos y no más de 150 aminoácidos, y que contienen una secuencia de aminoácidos que se conserva entre las bacterias que producen una proteína receptora de la transferrina que comprende TBP-2, y dicha secuencia conservada de TBP-2 es:
LEGGFYG (SEQ ID n.º 85)
y contiene una secuencia de aminoácidos que es:
LEGGFYGP (SEQ ID n.º 74).
El péptido puede incluir una secuencia de aminoácidos que se selecciona de la SEQ ID n.º 95 y la SEQ ID n.º 74. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunógena que comprende tal péptido como un componente activo. La composición puede comprender, al menos, un péptido sintético, como el que se proporciona en la presente memoria, y un excipiente farmacéuticamente aceptable para la misma. Al menos, un componente activo produce una respuesta inmunitaria cuando se administra a un huésped.
Las composiciones inmunógenas que se proporcionan en la presente memoria se pueden formular como una vacuna para la administración in vivo para proteger de las enfermedades causadas por los patógenos bacterianos que producen receptores de la transferrina. Para tal propósito, se pueden formular las composiciones como una preparación de micropartículas, cápsulas o liposomas. Alternativamente, se pueden proporcionar las composiciones en combinación con una molécula de diana para administrar a las células específicas del sistema inmunitario o a las superficies mucosas. La composición immunógena puede comprender una multitud de componentes activos para proporcionar protección contra la enfermedad causada por numerosas especies de bacterias que producen el receptor de la transferrina. Además, las composiciones inmunógenas pueden comprender un adyuvante.
Se pueden utilizar las composiciones en un método para inducir la protección contra la infección o la enfermedad causada por Haemophilus u otras bacterias que producen la proteína del receptor de la transferrina, que comprende la etapa de administrar a un huésped susceptible, como un humano, una cantidad eficaz de la composición inmunógena como se expuso anteriormente.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un antisuero o un anticuerpo específico para una cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID n.º 85, SEQ ID n.º 74 o SEQ ID n.º 50.
Se puede proporcionar un vector vivo para administrar el receptor de la transferrina a un huésped, que comprende un vector que contiene la molécula de ácido nucleico como se describe anteriormente. El vector se puede seleccionar de Salmonella, BCG, adenovirus, virus de la viruela, virus de la variolovacuna y virus de la poliomielitis. El vector puede ser específicamente el virus de la poliomielitis y la molécula de ácido nucleico puede codificar un fragmento del receptor de la transferrina que tiene una secuencia de aminoácidos de LEGGFYGP (SEQ ID n.º 74) o LEGGFYG (SEQ ID n.º 85). En la presente memoria describimos los vectores pT7TBP2A, pT7TBP2B, pT7TBP2C y PT7TBP2D (los n.º de designación de la ATCC son 75931, 75932, 75933, 75934).
Breve descripción de los dibujos
La presente invención se comprenderá mejor a partir de la siguiente descripción con referencia a los dibujos, en los que:
La figura 1A muestra el mapa de restricción de dos clones plasmídicos (pBHT1 y pBHT2) del operón del receptor de la transferrina de la cepa DL63 del Haemophilus influenzae de tipo b.
La figura 1B muestra el mapa de restricción de los clones S-4368-3-3 y JP-901-5-3 que contienen genes del TfR de la cepa Eagan del H. influenzae de tipo b.
La figura 1C muestra el mapa de restricción de los clones DS-712-1-3 que contienen el gen del receptor de la transferrina de la cepa MinnA del H. influenzae de tipo b.
La figura 1D muestra el mapa de restricción del clon JB-1042-7-6 que contiene el gen del receptor de la transferrina de la cepa PAK 12085 del H. influenzae no tipificable.
La figura 2 ilustra la organización y los mapas de restricción de los genes clonados Tbp1 y Tbp2 de las cepas identificadas y la organización genética del operón del TfR con dos genes (Tbp1 y Tbp2) en tándem que forman un operón bajo la regulación transcripcional de un solo promotor y también representa el fragmento de ADN de 3,0 kb de pBHIT2 utilizado como sonda para rastrear en las genotecas los genes del TfR de las cepas de Haemophilus.
La figura 3 muestra las secuencias de nucleótidos de los genes del receptor de la transferrina (SEQ ID n.º 1) y sus secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID n.º 5 para Tbp1 y la SEQ ID n.º 6 para Tbp2) de la cepa DL63 del H. influenzae de tipo b. Las secuencias de aminoácidos subrayadas corresponden a péptidos de Tbp1 identificados mediante secuenciación de aminoácidos. Las posibles secuencias señales se indican mediante doble superrayado y corresponden a los residuos 1 a 17 para Tbp1 y 1 a 25 para Tbp2.
La figura 4 muestra las secuencias de nucleótidos de los genes del receptor de la transferrina (SEQ ID n.º 2) y sus secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID n.º 7 para Tbp1 y SEQ ID n.º 8 para Tbp2) de la cepa Eagan del H. influenzae de tipo b. Las posibles secuencias de los sitios -35, -10 y de unión del ribosoma están superrayadas.
La figura 5 muestra las secuencias de nucleótidos de los genes del receptor de la transferrina (SEQ ID n.º 3) y sus secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID n.º 9 para Tbp1 y SEQ ID n.º 10 para Tbp2) de la cepa MinnA del H. influenzae de tipo b. Las posibles secuencias de los sitios -35, -10 y de unión del ribosoma están superrayadas.
La figura 6 muestra las secuencias de nucleótidos de los genes del receptor de la transferrina (SEQ ID n.º 4) y sus secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID n.º 11 para Tbp1 y SEQ ID n.º 12 para Tbp2) de la cepa PAK 12085 del H. influenzae no tipificable. Las posibles secuencias de los sitios -35, -10 y de unión del ribosoma están superrayadas.
La figura 7 muestra las secuencias de nucleótidos de los genes del receptor de la transferrina (SEQ ID n.º 105) y sus secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID n.º 106 para Tbp1 y SEQ ID n.º 107 para Tbp2) de la cepa SB33 del H. influenzae no tipificable.
La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos del gen Tbp2 (SEQ ID n.º 108) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID n.º 109 para Tbp2) de la cepa SB12 del H. influenzae no tipificable.
La figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos del gen Tbp2 (SEQ ID n.º 110) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID n.º 111 para Tbp2) de la cepa SB29 del H. influenzae no tipificable.
La figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos del gen Tbp2 (SEQ ID n.º 112) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID n.º 113 para Tbp2) de la cepa SB30 del H. influenzae no tipificable.
La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos del gen Tbp2 (SEQ ID n.º 114) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID n.º 115 para Tbp2) de la cepa SB32 del H. influenzae no tipificable.
La figura 12A muestra las secuencias de nucleótidos de las regiones del promotor y el extremo 5' de los genes Tbp2 de las cepas Eagan (SEQ ID n.º 116), MinnA (SEQ ID n.º 117), PAK 12085 (SEQ ID n.º 118) y SB33 (SEQ ID n.º 119) del H. influenzae. El cebador de la cadena codificante utilizado para amplificar los genes Tbp2 por PCR está subrayado (SEQ ID n.º 120).
La figura 12B muestra la secuencia de nucleótidos de la región intergénica y el extremo 5' de los genes Tbp1 de las cepas Eagan (SEQ ID n.º 121), MinnA (SEQ ID n.º 122), DL63 (SEQ ID n.º 123), PAK 12085 (SEQ ID n.º 124), SB12 (SEQ ID n.º 125), SB29 (SEQ ID n.º 126), SB30 (SEQ ID n.º 127) y SB32 (SEQ ID n.º 128) del H. influenzae. El cebador de la cadena no codificante utilizado para amplificar los genes Tbp2 por PCR está subrayado (SEQ ID n.º 129).
La figura 13 muestra el análisis en gel de agarosa de los genes Tbp2 amplificados por PCR de las cepas SB12, SB29, SB30, SB32 y SB33 del H. influenzae no tipificable. La calle 1 es SB33, la calle 2 es SB12, la calle 3 es SB29, la calle 4 es SB30 y la calle 5 es SB32.
La figura 14 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de Tbp1 de las cepas Eagan, DL63, PAK 12085 y SB33 (SEQ ID n.º 7, 5, 11 y 106) del H. influenzae, las cepas B16B6 y M982 (SEQ ID n.º 94 y 95) de N. meningitidis y la cepa FA19 (SEQ ID n.º 96) de N. gonorrhoeae.
\newpage
La figura 15 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de Tbp2 de las cepas Eagan, DL63, PAK 12085, SB12, SB29, SB30 y SB32 (SEQ ID n.º 8, 6, 12, 109, 110, 112, 114) del H. influenzae, las cepas B16B6 y M982 (SEQ ID n.º 97 y 98) de N. meningitidis, la cepa FA19 de N. gonorrhoeae y las cepas AP205 y AP37 (SEQ ID n.º 99 y 100) de Actinobacillus pleuropneumoniae.
La figura 16A muestra la estructura secundaria predicha para la proteína Tbp1 del H. influenzae y la figura 16B muestra la estructura secundaria predicha para la proteína Tbp2 del H. influenzae.
La figura 17 muestra el esquema para la construcción del plásmido JB-1468-29 que expresa la Tbp1 de la cepa Eagan del H. influenzae de tipo b en E. coli.
La figura 18 muestra el esquema para la construcción del plásmido JB-1424-2 -8 que expresa la Tbp2 de la cepa Eagan del H. influenzae de tipo b en E. coli.
La figura 19 muestra los pares de oligonucleótidos (SEQ ID n.º 130, 131) utilizados para construir el plásmido JB-1424-2-8.
La figura 20 muestra la secuencia de los pares de oligonucleótidos A (SEQ ID n.º 86, 87), B (SEQ ID n.º 88, 89), C (SEQ ID n.º 90, 91) y D (SEQ ID n.º 92, 93) para construir los plásmidos de expresión de Tbp1 y Tbp2.
La figura 21 muestra el esquema para la construcción del plásmido JB-1600-1 que expresa la Tbp2 de la cepa SB12 del H. influenzae en E. coli.
La figura 22 muestra los geles de SDS-PAGE con los productos de expresión de la proteína Tbp1 de la cepa Eagan del Haemophilus de tipo b, de la proteína Tbp2 de la cepa Eagan del mismo organismo y una proteína Tpb2 de la cepa SB12 del H. influenzae no tipificable en E. coli. Calle 1: JB-1476-2-1 (T7/Tbp1 de Eagan) a t_{0}; calle 2: JB-1476-2-1 a una inducción de t = 4 h; calle 3: marcadores de masa molecular de 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa y 31 kDa; calle 4: JB-1437-4-1 (T7/Tbp2 de Eagan) a t_{0}; calle 5: JB-1437-4-1 a una inducción de t = 4 h; calle 6: JB-1607-1-1 (T7/Tbp2 de SB12) a t_{0}; calle 7: JB-1607-1-1 a una inducción de t = 4 h.
La figura 23 muestra un esquema de purificación para las Tbp1 y Tbp2 recombinantes expresadas de E. coli.
La figura 24 muestra un análisis de la pureza de las Tbp1 y Tbp2 recombinantes purificadas mediante el esquema de la figura 23. La calle 1 contiene los marcadores de tamaño de masa molecular (106, 80, 49,5, 32,5, 27,5 y 18,5 kDa), la calle 2 es un lisado de células enteras de E. coli. La calle 3 son cuerpos de inclusión solubilizados. La calle 4 es la Tbp1 o Tbp2 purificada.
La figura 25 muestra la inmunogenia de la rTbp1 (panel superior) y de la rTbp2 (panel inferior) en los ratones.
La figura 26 muestra la reactividad de los antisueros contra la rTbp1 de Eagan con varias cepas del H. influenzae en un análisis de inmunotransferencia Western. Calle 1: BL21/DE3; calle 2: SB12 - EDDA; calle 3: SB12 + EDDA; calle 4, SB29 - EDDA; calle 5: SB29 + EDDA; calle 6, SB33 - EDDA; calle 7: SB33 + EDDA; calle 8: Eagan - EDDA; calle 9: Eagan + EDDA; calle 10: B. catarrhalis 4223 - EDDA; calle 11: B. catarrhalis 4223 + EDDA; calle 12: N. meningitidis 608 - EDDA; calle 13: N. meningitidis 608 + EDDA; calle 14: JB-1476-2-1 inducido que expresa la Tbp1 de Eagan recombinante; calle 15: marcadores de masa molecular. Bandas de 95 kDa específicas que reaccionan con los antisueros contra Tbp1 en las calles 3, 4, 5, 7, 8 y 9, que corresponden a las cepas SB12, SB29, SB33 y Eagan del H. influenzae; - bandas de 110 kDa específicas en las calles 10 y 11, que corresponden a la cepa 4223 de B. catarrhalis; y - bandas de 80 kDa específicas en las calles 12 y 13, que corresponden a la cepa 608 de N. meningitidis.
La figura 27 muestra la reactividad de los antisueros contra la rTbp2 de Eagan con varias cepas del H. influenzae en unos análisis de inmunotransferencia. Calle 1: marcadores de masa molecular; calle 2: JB-1437-4-1 inducido que expresa la Tbp2 de Eagan recombinante; calle 3: SB12 - EDDA; calle 4: SB12 + EDDA; calle 5: SB29 - EDDA; calle 6: SB29 + EDDA; calle 7: SB30 - EDDA; calle 8: SB30 + EDDA; calle 9: SB32 - EDDA; calle 10: SB33 - EDDA; calle 11: SB33 + EDDA; calle 12: PAK - EDDA; calle 13: PAK + EDDA; calle 14: Eagan - EDDA; calle 15: Eagan + EDDA. Las bandas específicas de 60 a 70 kDa presentaron reacción con los antisueros contra la Tbp2 en las calles 3, 6, 7, 8, 13, 14 y 15, a saber, las cepas SB12, SB29, SB30, PAK y Eagan.
La figura 28 muestra la construcción de los plásmidos pUHIT1KFH y pUHIT1KFP utilizados para generar cepas del H. influenzae que no producen el receptor de la transferrina.
La figura 29 muestra la construcción de los plásmidos que codifican virus de la poliomielitis quiméricos que expresan un epítopo derivado de la proteína del receptor de la transferrina que está conservado en las bacterias que producen la proteína receptora de la transferrina.
La figura 30 es un análisis de inmunotransferencia que muestra la reactividad de los antisueros producidos mediante la inmunización de los conejos con quimeras del virus de la poliomielitis que expresan un epítopo derivado de la proteína del receptor de la transferrina que se conserva entre las bacterias que producen la proteína receptora de la transferrina. El panel A muestra un gel teñido con azul brillante de Coomassie que muestra la Tbp2 recombinante purificada de la cepa SB12 del H. influenzae expresada en E. coli (calle 1), la Tbp2 purificada de la cepa 4223 de Branhamella catarrhalis (calle 2), un lisado de células enteras de la cepa 4223 de B. catarrhalis cultivadas con poco hierro (calle 3), un lisado de células enteras de la E. coli JM109 cultivada en unas condiciones no limitantes de hierro (calle 5). El panel B muestra los resultados de un análisis de inmunotransferencia de un gel replicado usando un conjunto de sueros recogidos en el día 27 de los conejos inmunizados con PV1TBP2A (conejos 40, 41 y 42). El panel C muestra los resultados de un conjunto de sueros presangrados de lo mismo, que demuestran una mínima reactividad específica.
En algunas de las figuras anteriores se han utilizado las siguientes abreviaturas para designar determinadas endonucleasas de restricción específicas de sitio: R, EcoRI; Ps, PstI; H, HindIII; Bg, BglII; Nde, NdeI; Ear, EarI; y Sau, Sau3AI.
En la figura 28, se han utilizado las siguientes abreviaturas para designar determinadas endonucleasas de restricción específicas de sitio: A, AccI; B BamHI; E, EcoRI; O, XhoI; H, HindIII; Ps, PstI; V, EcoRV; X, XbaI; G, BglII; S, SalI; K, KpnI; y S*, SacI.
Descripción general de la invención
Se puede utilizar convenientemente cualquier cepa de Haemophilus para proporcionar el ácido nucleico aislado y purificado que puede estar en forma de moléculas de ADN, que comprenden, al menos, una porción del ácido nucleico que codifica un receptor de la transferrina tal y como se tipifica mediante las realizaciones de la presente invención. Tales cepas generalmente están disponibles a partir de fuentes clínicas y de colecciones de cultivos bacterianos, como la American Type Culture Collection (ATCC).
De acuerdo con un aspecto de la invención, se puede aislar la proteína del receptor de la transferrina a partir de cepas de Haemophilus mediante los métodos descritos en Schryvers (1989), Ogunnaviwo y Schryvers (1992) y en la patente de los EE. UU n.º 5.141.743. Aunque se proporcionan los detalles de un procedimiento adecuado en la patente de los EE. UU. n.º 5.141.743, a continuación se presenta un breve compendio de tal procedimiento. El aislamiento del receptor de la transferrina se consigue aislando una fracción de membranas de una cepa bacteriana que expresa la actividad de unión de la transferrina y purificando el receptor de la transferrina mediante un método de afinidad que implica las etapas secuenciales de unir previamente la transferrina al receptor de la transferrina en la fracción de las membranas, solubilizar las membranas, inmovilizar la transferrina y separar el receptor de la transferrina y la transferrina inmovilizada. Alternativamente, se pueden aislar las proteínas del receptor mediante una modificación del método anterior, en la que se evita la etapa de unión previa y se incluye una gran concentración de sal en el tampón de solubilización para permitir el aislamiento directo con la transferrina inmovilizada tal y como se describe en Ogunnariwo y Schryvers (1992).
En esta solicitud, la terminología "receptor de la transferrina" se utiliza para definir una familia de proteínas Tbp1 y/o Tbp2 que incluye aquéllas que tienen variaciones en su secuencia de aminoácidos, incluidas las que se producen de forma natural en varias cepas, por ejemplo, de Haemophilus. Otras fuentes bacterianas del receptor de la transferrina incluyen, pero sin limitarse a ellas, especies de Neisseria, Branhamella, Pasteurella y Actinobacillus. Algunas, si no todas, de estas bacterias contienen tanto Tbp1 como Tbp2. Las moléculas de ADN aislado y purificado que comprenden, al menos, una porción que codifica el receptor de la transferrina de la presente invención también incluyen las que codifican los análogos funcionales del receptor de la transferrina. En esta solicitud, una primera proteína o primer péptido es un "análogo funcional" de una segunda proteína si la primera proteína está relacionada inmunológicamente con ella y/o tiene la misma función que la segunda proteína o péptido. El análogo funcional puede ser, por ejemplo, un fragmento de la proteína o un mutante de sustitución, adición o deleción de la misma.
En una determinada realización, se aisló el receptor de la transferrina a partir de la cepa DL63 del H. influenzae de tipo b y se purificó mediante los métodos de cromatografía de afinidad, como se describe en Schryvers (1989), Ogunnariwo y Schryvers (1992) y en la patente de los EE. UU. n.º 5.141.743. Se utilizó el receptor de la transferrina aislado y purificado para generar antisueros contra el TfR en los conejos. El ADN cromosómico de la cepa DL63 del H. influenzae de tipo b se cizalló mecánicamente, se añadieron conectores con EcoRI, y se construyó una genoteca de expresión en \lambdaZAP. Se detectó la genoteca con el antisuero de conejo contra el TfR y se obtuvieron dos clones positivos (pBHIT1 y pBHIT2) que tenían mapas de restricción que se solapaban (figura 1A y figura 2). Se secuenciaron los clones y se identificaron dos grandes marcos de lectura abiertos (figura 2). En la figura 3 se muestran las secuencias de nucleótidos de los genes Tbp1 y Tbp2 del receptor de la transferrina (SEQ ID n.º 1) de la cepa DL63 del H. influenzae y sus secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID n.º 5 para Tbp1 y SEQ ID n.º 6 para Tbp2). El análisis de la secuencia mostró que el operón del TfR consiste en dos genes (Tbp1 y Tbp2) dispuestos en un tándem y transcritos a partir de un único promotor (como se muestra particularmente en la figura 2 y la figura 3). La proteína Tbp2 tiende a variar su masa molecular según la especie, mientras que la proteína Tbp1 tiende a tener una masa molecular más coherente, con alguna variabilidad entre las distintas bacterias que tienen los genes del TfR. La masa molecular de la Tbp1 normalmente se encuentra en el margen de 94.000 a 106.000 mientras que la masa molecular de la Tbp2 varía considerablemente de 58.000 a 98.000.
Se realizó la secuenciación de los aminoácidos de los extremos amino y los fragmentos obtenidos con bromuro de cianógeno del receptor de la transferrina de la cepa DL63 del H. influenzae. El extremo amino de la Tbp2 estaba bloqueado pero se identificó la secuencia de aminoácidos mediante la secuenciación de la Tbp1, y éstas se indican subrayadas en la secuencia de la proteína de la figura 3. Estas secuencias peptídicas son Glu Thr Gln Ser lle Lys Asp Thr Lys Glu Ala Ile Ser Ser Glu Val Asp Thr (tal y como se muestra en la figura 3, SEQ ID n.º 101) y Leu Gln Leu Asn Leu Glu Lys Lys lle Gln Gln Asn Trp Leu Thr His Gln lle Ala Phe (tal y como se muestra en la figura 3; SEQ ID n.º 102). El péptido señal de Tbp1 y el posible péptido señal de Tbp2 se indican mediante doble superrayado en la figura 3. El posible péptido señal de la Tbp1 es Met Thr Lys Lys Pro Tyr Phe Arg Leu Ser Ile Ile Ser Cys Leu Leu Ile Ser Cys Tyr Val Lys Ala (SEQ ID n.º 103). El posible péptido señal de la Tbp2 es Met Lys Ser Val Pro Leu Ile Ser Gly Gly Leu Ser Phe Leu Leu Ser Ala (SEQ ID n.º 104). La secuencia de aminoácidos derivada de la región del extremo amino de la Tbp2 indica que es una lipoproteína.
El ADN cromosómico se preparó a partir de la cepa Eagan del H. influenzae de tipo b y se generaron genotecas. La primera genoteca se construyó a partir del ADN parcialmente digerido con Sau3AI, se fraccionó por tamaño para seleccionar los fragmentos de aproximadamente 5 a 10 kb, y se clonó en un plásmido sobre la base del pUC. La segunda genoteca se construyó a partir de fragmentos de ADN cromosómico digeridos con EcoRI y clonados en \lambdaZAP. Se rastrearon ambas genotecas con un fragmento 5' del clon pBHIT tal y como se muestra en la figura 2 y se obtuvieron clones parciales de los genes del TfR de la cepa Eagan del H. influenzae denominados S-4368-3-3 y JB-901-5-3. Así, refiriéndose a las figuras 1B y 2, se ilustran, de acuerdo con aspectos adicionales de la presente invención, los clones plasmídicos S-4368-3-3 y JB-901-5-3 que codifican las Tbp1 y Tbp2 de la cepa Eagan del H. influenzae de tipo b. En la figura 4 se muestran las secuencias de ADN de los genes Tbp1 y Tbp2 (SEQ ID n.º 2) de la cepa Eagan del H. influenzae de tipo b y sus secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID n.º 7 y 8), siendo la secuencia de la Tbp2 el primer gen en el operón. En la figura 4, las posibles secuencias de los sitios -35, -10 y de unión del ribosoma están superrayadas.
Se preparó ADN cromosómico a partir de la cepa MinnA del H. influenzae de tipo b y el ADN se digirió parcialmente con Sau3AI, se fraccionó por tamaños para obtener los fragmentos de 10 a 20 kb y se clonó en el sitio BamHI del EMBL3. Se rastreó la genoteca con el fragmento 5' del clon pBHIT (figura 2) y se obtuvo un clon que codifica el TfR completo (DS-712-1-3). Respecto a las figuras 1C y 2, en ellas se ilustra, de acuerdo con aspectos adicionales de la presente invención, codificando el clon plasmídico DS 712-1-3 las Tbp1 y Tbp2 de la cepa MinnA del H. influenzae de tipo b. En la figura 5 se muestran las secuencias de ADN de Tbp1 y Tbp2 (SEQ ID n.º 3) y sus secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID n.º 9 para Tbp1 y SEQ ID n.º 10 para Tbp2) de la cepa MinnA del H. influenzae de tipo b donde la secuencia de Tbp2 va primero en el operón. En la figura 5, las posibles secuencias de los sitios -35, -10 y de unión del ribosoma están superrayadas.
Se preparó ADN cromosómico de la cepa PAK 12085 del H. influenzae no tipificable. El ADN se digirió parcialmente con Sau3AI, se fraccionó por tamaños para obtener los fragmentos de 10 a 20 kb y se clonó en el sitio BamHI del EMBL3. La genoteca se rastreó con los fragmentos del clon pBHIT (figura 2) y se obtuvo un clon que codifica el TfR completo (JB-1042-7-6). En las figuras 1D y 2 se muestra el mapa de restricción del clon JB-1042-7-6 y en la figura 6 se muestran las secuencias de nucleótidos de los genes Tbp1 y Tbp2 (SEQ ID n.º 4) del H. influenzae PAK 12085 y sus secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID n.º 11, 12), siendo la secuencia de Tpb2 la primera. En la figura 6, las posibles secuencias de los sitios -35, -10 y de unión del ribosoma están superrayadas.
Se preparó ADN cromosómico a partir de la cepa SB33 del H. influenzae no tipificable obtenida de una otitis media. El ADN se digirió parcialmente con Sau3AI, se fraccionó por tamaños para obtener los fragmentos de 10 a 20 kb y se clonó en el sitio BamHI del EMBL3. La genoteca se rastreó con los fragmentos del clon pBHIT (figura 2) y se obtuvo un clon que codifica el TfR completo (JB-1031-2-9). En la figura 2 se muestra el mapa de restricción del clon JB-1031-2-9 y en la figura 7 se muestran las secuencias de nucleótidos de los genes Tbp1 y Tbp2 (SEQ ID n.º 4) del H. influenzae SB33 y sus secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID n.º 11, 12), siendo la secuencia de Tpb2 la primera. Se encontró que el gen Tbp2 de la SB33 tiene una deleción de una sola base que dio lugar a un cambio de marco de lectura en el residuo 126 y al truncamiento prematuro de la proteína resultante en el residuo 168.
Se realizó la amplificación por PCR de los genes Tbp2 de las cepas SB12, SB29, SB30 y SB32 de los NTHi obtenidos de otitis medias, y se secuenciaron los genes.
En las figuras 8, 9, 10 y 11 se muestran, respectivamente, la secuencia de nucleótidos de los genes Tbp2 de las cepas SB12 (SEQ ID n.º 105), SB29 (SEQ ID n.º 108), SB30 (SEQ ID n.º 110) y SB32 (SEQ ID n.º 112) del H. influenzae no tipificable.
Se encontró que todos los genes Tbp2 amplificados codifican proteínas Tbp2 completas lo que indica que el gen tbp2 defectuoso de la cepa SB33 era atípico.
Las tres cepas del H. influenzae b tenían secuencias intergénicas cortas idénticas de sólo 13 pb entre Tbp2 y Tbp1, pero las cepas PAK 12085 y SB33 de NTHi tenían secuencias intergénicas mayores, de 27 pb (figura 12).
La cepa SB12 tenía una secuencia intergénica de 13 pb idéntica a la encontrada en las cepas del H. influenzae b, mientras que las cepas SB29, SB30 y SB32 contenían secuencias intergénicas mayores (de 27 a 30 pb) que las encontradas en las otras cepas del NTHi PAK 12085 y SB33 (figura 2B). Las nueve cepas tienen una secuencia central común de 13 pb conservada entre sus genes Tbp2 y Tbp1.
\newpage
Se identificó una secuencia pentapeptídica cerca del extremo amino de Tbp1 del H. influenzae (figura 12) que es similar a la caja de TonB. Recientemente, se ha clonado y secuenciado el gen TonB del H. influenzae (Jarosik et al., 1994).
En la figura 14 se comparan las secuencias de aminoácidos de Tbp1 de las cepas Eagan/MinnA, DL63, PAK 12085 y SB33 del H. influenzae. Las proteínas Tbp1 de Eagan y MinnA son idénticas y tienen 912 aminoácidos de longitud, la de DL63 tiene 914 residuos, y la de SB33 tiene 914 residuos. Las proteínas Tbp1 del H. influenzae están muy conservadas, con una identidad de secuencia del 95 al 100%. En la figura 15 se comparan las secuencias de aminoácidos de Tbp2 de las cepas Eagan/MinnA, DL63, PAK 12085, SB12, SB29, SB30 y SB32 del H. influenzae. Las proteínas Tbp2 de Eagan y MinnA son idénticas y contienen 660 aminoácidos, la de DL63 tiene 644 residuos y la de PAK 12085 tiene 654 residuos. Existe una delección de una sola base en el gen tbp2 de la SB33 que da lugar a un cambio de marco de lectura en el residuo 126 y al truncamiento prematuro de la proteína resultante en el residuo 168. La ausencia de la base se confirmó mediante la secuenciación directa del ADN cromosómico amplificado por PCR. Con la excepción de Eagan y MinnA, que son idénticas, las secuencias de la proteína Tbp2 están menos conservadas, con una identidad de sólo el 66 al 70%, pero hay varios segmentos cortos de secuencia conservada que se pueden identificar en la figura 15. Se encontró que todos los genes Tbp2 amplificados por PCR de las cepas SB12, SB29, SB30 y SB32 codifican proteínas Tbp2 completas. Se observó heterogeneidad en la secuencia y en el tamaño entre las proteínas Tbp2 deducidas, en las que SB12 tenía 648 aminoácidos, SB29 tenía 631 residuos, SB30 tenía 630 residuos y SB32 tenía 631 residuos.
Se determinaron las posibles estructuras secundarias de Tbp1 y Tbp2 de Eagan (figuras 16A y 16B). Ambas proteínas tenían varios dominios transmembranarios, atravesando Tbp1 20 veces la membrana y Tbp2 cruzándola 12 veces. Se identificaron tres epítopos conservados y expuestos en la región del extremo amino de Tbp1 (DNEVTGL
GK - SEQ ID n.º 43, EQVLN/DIRDLTRYD - SEQ ID n.º 139 y 140, y GAINEIEYENVKAVEISK - SEQ ID n.º 141) y uno en la región del extremo carboxilo (GI/VYNLF/LNYRYVTWE - SEQ ID n.º 142 y 143). Se pueden identificar sólo tres pequeñas regiones conservadas dentro de las proteínas Tbp2 de los patógenos humanos: CS/LGGG (G)
SFD - SEQ ID n.º 75, 144 y 145 en el extremo amino, LE/SGGFY/FGP - SEQ ID n.º 74 y 146 ubicada internamente, y WFGAR/K - SEQ ID n.º 83 y 84 en el extremo carboxilo.
El descubrimiento de que la secuencia de aminoácidos de Tbp2 varía entre las cepas de Haemophilus permite la posibilidad de agrupar los Haemophilus en subgrupos definidos por la misma secuencia de aminoácidos de Tbp2. Este descubrimiento permite seleccionar racionalmente un número mínimo de secuencias de Tbp1 y/o Tbp2 o de péptidos sintéticos que representan epítopos compartidos por tales subtipos en las cepas de Haemophilus a utilizar en las composiciones inmunógenas para, por ejemplo, inmunizar frente a las enfermedades causadas por los Haemophilus y otras bacterias que producen el receptor de la transferrina con similitudes de secuencia con las Tbp1 y Tbp2 de especies de Haemophilus. Así, se puede utilizar un número mínimo de análogos, fragmentos y/o de péptidos del receptor de la transferrina para inmunizar frente a muchas o todas las cepas de Haemophilus y otros patógenos bacterianos que producen el receptor de la transferrina.
Además, se compararon las secuencias de aminoácidos del receptor de la transferrina de un abanico de patógenos bacterianos [H. influenzae de tipo b, H. influenzae no tipificable, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae y Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae], tal y como se muestra en las figuras 14 y 15. Este análisis reveló regiones de Tbp1 y Tbp2 que se conservan en todas estas bacterias. Algunas de estas secuencias conservadas aparecen en los péptidos en las tablas 2 y 3. En particular, las secuencias DNEVTGLGK (SEQ ID: n. 43), EQVL
NIRDLTRYDPGI (SEQ ID n.º 44), EQVLNIRDLTRYDPGISVVEQG RGASSGYSIRGMD (SEQ ID n.º 45), GAI
NEIEYENVKAVEISKG (SEQ ID n.º 46) y GALAGSV (SEQ ID n.º 47) están conservadas en Tbp1 (tabla 1 y figura 14). Secuencias particularmente conservadas en Tbp2 incluyen LEGGFYGP (SEQ ID n.º 74), CSGGGSFD (SEQ ID n.º 75), YVYSGL (SEQ ID n.º 76), CCSNLSY - VKFG (SEQ ID n.º 77), FLLGHRT (SEQ ID n.º 78), EFNVOF (SEQ ID n.º 79), NAFTGTA (SEQ ID n.º 80), VNGAFYG (SEQ ID n.º 81), ELGGYF (SEQ ID n.º 82), VVFGAR (SEQ ID n.º 83) y VVFGAK (SEQ ID n.º 84) (tabla 2 y figura 15).
El descubrimiento de las secuencias conservadas en el receptor de la transferrina de un abanico de patógenos bacterianos permite seleccionar un número mínimo de antígenos que tienen determinadas secuencias de aminoácidos (incluidas en forma de péptidos sintéticos) para inmunizar frente a la enfermedad causada por los patógenos que tienen receptores de la transferrina. Además de las citadas anteriormente, tales bacterias incluyen otras especies de Neisseria, como Neisseria gonorrhoeae, y Branhamella, incluida Branhamella catarrhalis. Tales secuencias de aminoácidos conservadas entre muchos patógenos bacterianos permiten generar anticuerpos específicos contra el TfR, incluidos los anticuerpos monoclonales, que reconocen la mayoría de los receptores de la transferrina, cuando no todos. El antisuero se generó contra loas péptidos que corresponden a las porciones conservadas del receptor de la transferrina. Este antisuero reconoció el receptor de la transferrina en Branhamella catarrhalis. Estos antisueros son útiles para detectar y neutralizar la mayoría de las bacterias, cuando no todas, que producen la proteína del TfR y son también útiles para la inmunización pasiva contra la enfermedades causadas por tales patógenos. Los análisis diagnósticos y los kits que utilizan tales secuencias de aminoácidos conservadas son útiles para detectar muchas de las bacterias, cuando no todas, que producen el receptor de la transferrina.
Se pueden administrar epítopos que contienen las secuencias de aminoácidos arriba mencionadas a las células del sistema inmunitario mediante el uso de los péptidos sintéticos que contienen tales secuencias, o mediante el uso de vectores vivos que expresan tales secuencias, o mediante la administración directa de moléculas de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos.
En la tabla 2 se muestran algunos de los péptidos que contienen secuencias de aminoácidos conservadas en las proteínas Tbp1 de las cepas Eagan, MinnA y DL63 del H. influenzae de tipo b, y de la cepa PAK 12085 no tipificable. Se generaron anticuerpos contra algunos de estos péptidos en conejillos de indias (tabla 4). En la tabla 3 se muestran péptidos que contienen las secuencias de aminoácidos conservadas en las proteínas Tbp2 de las cepas Eagan, MinnA y DL63 del H. influenzae de tipo b, y de la cepa PAK 12085 no tipificable. Se generaron anticuerpos contra algunos de estos péptidos en conejillos de indias (tabla 4).
Se pueden clonar las secuencias codificantes de los genes Tbp1 y Tbp2 en los vectores de expresión adecuados para producir proteínas recombinantes. Se expresaron los genes Tbp1 y Tbp2 recombinantes en E. coli con el sistema de expresión de T7. Se clonó el gen Tbp1 que codifica la proteína Tbp1 madura de Eagan en fase detrás del promotor de T7, lo que generó el plásmido JB-1468-29, tal y como se muestra en la figura 17. Cuando se introdujo en las células BL21/DE3 y se indujo con IPTG o lactosa, se expresó la proteína Tbp1 de Eagan tal y como se muestra en la figura 22.
Se clonó el gen Tbp2 que codifica la proteína Tbp2 madura en fase detrás del promotor de T7, lo que generó el plásmido JB-1424-2-8, tal y como se muestra en la figura 18. Cuando se introdujo en las células de E. coli y se indujo como anteriormente, se expresó la proteína Tbp2 tal y como se muestra en la figura 22.
Se amplificó por PCR el gen Tbp2 a partir de la cepa SB12 del NTHi. El ADN amplificado resultante contiene el auténtico péptido señal de Tbp2 del H. influenzae delante de la proteína madura. Se clonó el gen Tbp2 de SB12 que codifica el péptido señal y la proteína madura en el sistema de expresión pT7-7, tal y como se muestra en la figura 21. Cuando se introdujo el plásmido resultante (JB-1600-1) en las células de E. coli BL21/DE3 y se indujo, se expresó la Tbp2 de SB12, tal y como se muestra en la figura 22.
Las proteínas recombinantes Tbp1 y Tbp2 producidas en E. coli como cuerpos de inclusión se purificaron mediante el esquema mostrado en la figura 23. Las proteínas purificadas eran, al menos, puras aproximadamente al 70%, tal y como se muestra en la figura 24. Se realizaron estudios de inmunogenia en ratones con las proteínas Tbp1 y Tbp2 recombinantes purificadas. Ambas proteínas desencadenaron una buena respuesta inmunitaria en los ratones a dosis de 3 a 10 \mug (figura 25).
Los antisueros generados contra las Tbp1 o Tbp2 recombinantes obtenidas a partir de una cepa de H. influenzae reaccionan de forma cruzada con otras cepas, lo que los convierte en reactivos diagnósticos posiblemente útiles (figuras 26 y 27).
Los plásmidos pUHIT1KFH y pUHITKFP que se muestran en la figura 28 contienen un marcador de selección de resistencia a antibióticos clonado dentro del operón del receptor de la transferrina y se construyeron para inactivar por inserción el operón del receptor de la transferrina. Estos plásmidos se utilizaron para transformar Haemophilus para generar cepas que no producen las Tbp1 y/o Tbp2 del receptor de la transferrina tal y como se describe en el ejemplo 19. Tales cepas son útiles como controles negativos (ya que no producen el TfR) en las realizaciones de detección in vitro e in vivo y de diagnóstico. Se espera atenuar estas cepas para el crecimiento in vivo y son útiles como vacunas vivas para proporcionar protección contra las enfermedades causadas por Haemophilus.
Tal y como se explicó anteriormente, se pueden administrar epítopos de proteínas del receptor de la transferrina a las células del sistema inmunitario mediante el uso de vectores vivos que expresan tales secuencias de aminoácidos, y el vector vivo puede ser el virus de la poliomielitis. En cuanto a la figura 29, se ilustra la construcción de virus de la poliomielits híbridos que expresan un epítopo de la proteína del receptor de la transferrina, incluido el epítopo conservado LEGGFYGP de Tbp2 (SEQ ID n.º 74). Estos virus fueron reconocidos por los anticuerpos generados contra un péptido que incorpora la secuencia de aminoácidos LEGGFYGP (SEQ ID n.º 74) (tabla 5), lo que indica que los virus expresaron esta secuencia de una forma antigénicamente reconocible. PV1TBP2A y PV1TBP2B también fueron neutralizados por los antisueros de conejo generados contra la Tbp2 de la cepa DL63 del H. influenzae, lo que indica que, al menos, estos dos virus expresaron la secuencia de una forma reconocible por los anticuerpos generados contra la proteína. Todos los virus eran neutralizables mediante sueros contra PV1, lo que indica que los cambios en el sitio I antigénico de neutralización del virus de la poliomielitis no habían afectado significativamente otros sitios antigénicos de los virus. Además, el antisuero de conejo producido mediante inmunización con los virus de la poliomielitis quiméricos PV1TBP2A o PV1TBP2B reconoció un péptido que incorpora la secuencia de aminoácidos LEGGFYGP (SEQ ID n.º 74). Esto indica que las secuencias expresadas por PV1TB2A y PV1TBP2B son inmunógenas y que desencadenan anticuerpos capaces de reconocer la misma secuencia en el contexto de un péptido sintético.
En cuanto a la figura 30, el panel A muestra un gel de SDS PAGE que muestra la Tbp2 recombinante purificada de la cepa SB12 del H. influenzae expresada en E. coli (calle 1), la Tbp2 de la cepa 4223 de Branhamella catarrhalis (calle 2), un lisado de células enteras de la cepa 4223 de B. catarrhalis dependiente de hierro (calle 3), un lisado de células enteras de la E. coli JM109 con limitación de hierro (calle 4) y un lisados de células enteras de la E. coli JM109 cultivada en unas condiciones con exceso de hierro (calle 5). El panel B muestra los resultados de un análisis de inmunotransferencia de un gel de réplica con un conjunto de sueros de conejos inmunizados con PV1TBP2A. Hubo una fuerte reacción con las proteínas de unión a la transferrina purificadas en las calles 1 y 2, y con una banda de tamaño similar en la calle 3. No hubo una reacción significativa con ninguna de las proteínas de E. coli (calles 4 y 5). El panel C muestra los resultados de un conjunto de sueros presangrados de los mismos conejos, que muestran una reactividad específica mínima. Estos resultados demuestran que el PV1TBP2A es capaz de inducir antisueros específicos contra las proteínas que se unen a la transferrina en H. influenzae y B. catarrhalis, y que los antisueros pueden distinguir B. catarrhalis de E. coli, que no expresa una proteína equivalente.
Las moléculas de ADN aisladas y purificadas que comprenden, al menos, una porción que codifica un receptor de la transferrina de una especie de Haemophilus tipificada mediante las realizaciones descritas en la presente memoria son ventajosas como:
- sondas de ácido nucleico para la identificación específica de las cepas de Haemophilus in vitro o in vivo.
- los productos codificados por las moléculas de ADN son útiles como reactivos diagnósticos, antígenos para la producción de antisueros específicos contra Haemophilus, para la vacunación contra las enfermedades causadas por especies de Haemophilus y, por ejemplo, para detectar la infección por Haemophilus.
- los péptidos que corresponden a porciones del receptor de la transferrina tal y como se tipifica mediante las realizaciones descritas en la presente memoria son ventajosas como reactivos diagnósticos, antígenos para la producción de antisueros específicos contra Haemophilus, para la vacunación contra las enfermedades causadas por especies de Haemophilus y, por ejemplo, para detectar la infección por Haemophilus.
El receptor de la transferrina codificado por las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, fragmentos y análogos de las mismas, y los péptidos que contienen secuencias que corresponden a porciones del receptor de la transferrina que se conservan entre varios aislados de Haemophilus y otras bacterias que producen el receptor de la transferrina son útiles para el diagnóstico de, y para la inmunización contra, las enfermedades causadas por cualquier cepa bacteriana que produce el receptor de la transferrina. En particular, los péptidos que contienen las secuencias LEGGFYGP se conservan en las proteínas del receptor de la transferrina de muchos patógenos bacterianos que producen el receptor de la transferrina y son adecuados para el diagnóstico de enfermedades causadas por bacterias que producen el receptor de la transferrina, y la inmunización contra las mismas. Tales bacterias incluyen, pero sin limitarse a ellas, especies de Haemophilus, Neisseria (incluidas N. meningitidis y N. gonorrhoeae) y Branhamella (incluida B. catarrhalis).
Para el experto en la técnica es perfectamente obvio que las distintas realizaciones de la presente invención tienen muchas aplicaciones en los campos de la vacunación, el diagnóstico, el tratamiento de, por ejemplo, infecciones por Haemophilus, e infecciones con otros patógenos bacterianos que producen el receptor de la transferrina y la generación de reactivos inmunitarios. Además, más abajo se presenta una explicación no limitante de tales usos.
1. Preparación y uso de la vacuna
Se pueden preparar composiciones inmunógenas, adecuadas para utilizarlas como vacunas, a partir del receptor de la transferrina inmunógeno, de análogos y fragmentos del mismo y/o de péptidos tal y como se describe en la presente memoria. La vacuna desencadena una respuesta inmunitaria que produce anticuerpos, incluidos los anticuerpos contra el receptor de la transferrina y los anticuerpos que son opsonizantes o bactericidas. Al someterse el sujeto vacunado a una prueba de provocación con Haemophilus u otras bacterias que producen un receptor de la transferrina, los anticuerpos se unen al receptor de la transferrina y, por lo tanto, previenen el acceso de las bacterias a una fuente de hierro que se necesita para la viabilidad. Además, los anticuerpos contra el TfR opsonizantes o bactericidas también pueden proporcionar protección mediante mecanismos alternativos.
Las vacunas que contienen péptidos generalmente se conocen bien en la técnica, como se ejemplifica mediante las patentes de los EE. UU. n.º 4.601.903, 4.599.231, 4.599.230 y 4.596.792. Se pueden preparar composiciones inmunógenas, incluidas las vacunas, como inyectables, como disoluciones líquidas o emulsiones. Se puede mezclar el receptor de la transferrina, análogos y fragmentos del mismo y/o péptidos con excipientes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con el receptor de la transferrina, fragmentos, análogos o péptidos. Tales excipientes pueden incluir agua, disolución salina, dextrosa, glicerol, etanol y sus combinaciones. Además, las composiciones inmunógenas y las vacunas pueden contener sustancias auxiliares como humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores del pH o adyuvantes que potencian la eficacia de las vacunas. Las composiciones inmunógenas y las vacunas se pueden administrar por vía parenteral, mediante inyección subcutánea o por vía intramuscular. Alternativamente, las composiciones inmunógenas formadas de acuerdo con la presente invención se pueden formular y administrar de una manera que provoque una respuesta inmunitaria en las superficies mucosas. Por lo tanto, la composición inmunógena se puede administrar en las superficies mucosas a través de, por ejemplo, las vías nasal u oral (intragástrica). Se pueden proporcionar las composiciones inmunógenas en combinación con una molécula de diana para administrarla a las células específicas del sistema inmunitario o a las superficies mucosas. Algunas de estas moléculas de diana incluyen la cepa B12 y los fragmentos de toxinas bacterianas, tal y como se describe en la solicitud de patente internacional WO 92/17167 (Biotech Australia Pty. Ltd.), y anticuerpos monoclonales, tal y como se describe en la patente de los EE. UU. n.º 5.194.254 (Barber et al). Alternativamente, pueden ser deseables otros modos de administración, incluidos los supositorios y las formas farmacéuticas orales. Para los supositorios, los aglutinantes y excipientes pueden incluir, por ejemplo, polialcalenglicoles y triglicéridos. Las formas farmacéuticas orales pueden incluir los excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, sacarina, celulosa y carbonato de magnesio de calidad farmacéutica. Estas composiciones toman la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formas farmacéuticas de liberación lenta o polvos, y contienen del 10 al 95% del receptor de la transferrina, fragmentos, análogos y/o péptidos.
Las vacunas se administran de un modo compatible con la posología de la forma farmacéutica y en tal cantidad que serán terapéuticamente eficaces, protectoras e inmunógenas. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, incluida, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos y, si fuera necesario, para producir una respuesta inmunitaria celular. Las cantidades precisas del ingrediente activo que hay que administrar dependen del juicio del médico. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuados los puede determinar fácilmente el experto en la técnica y pueden estar en el orden de microgramos del receptor de la transferrina, análogos y fragmentos del mismo y/o péptidos. Las posologías adecuadas para la administración inicial y la dosis de recuerdo también son variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida de administraciones posteriores. La dosis de la vacuna también puede depender de la vía de administración y variará según el tamaño del huésped.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican el receptor de la transferrina de la presente invención también se pueden utilizar directamente para inmunizar mediante la administración del ADN directamente, por ejemplo, mediante inyección para la inmunización genética o mediante la construcción de un vector vivo como Salmonella, BCG, adenovirus, virus de la viruela, virus de la variolovacuna o virus de la poliomielitis. Algunos vectores vivos que se han utilizado para transportar antígenos heterólogos al sistema inmunitario se explican, por ejemplo, en O'Hagan (1992). Los procedimientos para la inyección directa de ADN en los sujetos de prueba para la inmunización genética se describen en, por ejemplo, Ulmer et al., 1993.
El uso de los péptidos in vivo puede requerir, primero, su modificación química ya que los péptidos por sí mismos no tienen una semivida suficientemente extensa en el suero y/o el tejido y/o suficiente inmunogenia. Tales péptidos modificados químicamente se citan en la presente memoria como "análogos de péptidos". La terminología "análogo de péptido" se extiende a cualquier equivalente químico funcional de un péptido caracterizado por su aumento de la estabilidad y/o eficacia e inmunogenia in vivo o in vitro con relación a la práctica de la invención. La terminología "análogo de péptido" también se usa en la presente memoria para extenderlo a cualquier derivado de aminoácido de los péptidos tal y como se describe en la presente memoria. Los análogos de péptidos contemplados en la presente memoria se producen mediante procedimientos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, modificaciones de las cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante la síntesis de los péptidos y el uso de interconectores y otros métodos que imponen una restricción conformacional sobre los péptidos o sus análogos.
Ejemplos de modificaciones de cadenas laterales contempladas por la presente invención incluyen la modificación de los grupos amino como la alquilación reductora mediante la reacción con un aldehído seguida de la reacción con NaBH_{4}; la amidación con metilacetimidato; la acetilación con anhídrido acético; la carbamilación de los grupos amino con cianato; la trinitrobencilación de los grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS); la alquilación de los grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y la piridoxilación de la lisina con piridoxal-5'-fosfato seguida de la reducción con NaBH_{4}.
El grupo guanidino de los restos de arginina se puede modificar mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos como la 2,3-butanodiona, el fenilglioxal y el glioxal.
El grupo carboxilo se puede modificar mediante la activación con carbodiimida a través de la formación de o-acilisourea seguida por la posterior derivación, por ejemplo, a la amida correspondiente.
Se pueden modificar grupos sulfhidrilo mediante métodos como la carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; la oxidación del ácido perfórmico a ácido cisteico; la formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiólicos; la reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; la formación de derivados mercuriales utilizando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercúrico-4-nitrofenol y otros productos con mercurio; la carbamilación con cianato a pH alcalino.
Los restos de triptófano se pueden modificar, por ejemplo, mediante la oxidación con N-bromosuccinimida o mediante la alquilación del anillo indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfonilo. Los residuos de tirosina se pueden alterar mediante la nitración con el tetranitrometano para formar un derivado de la 3-nitrotirosina.
La modificación del anillo imidazol de un resto histidina se puede llevar a cabo mediante la alquilación con derivados del ácido yodoacético o mediante la N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato.
Ejemplos de la incorporación de aminoácidos no naturales y derivados durante la síntesis de los péptidos incluyen, pero sin limitarse a ellos, el uso de norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienilanalina y/o los isómeros D de los aminoácidos.
Se puede mejorar significativamente la inmunogenia si los antígenos se coadministran con adyuvantes, habitualmente utilizados como una disolución del 0,05 al 1,0% en disolución salina tamponada con fosfato. Los adyuvantes potencian la inmunogenia de un antígeno pero no son necesariamente inmunógenos por sí mismos. Los adyuvantes pueden actuar reteniendo el antígeno localmente cerca del sitio de administración para producir un efecto prolongado que facilita una liberación sostenida y lenta del antígeno hacia células del sistema inmunitario. Los adyuvantes también pueden atraer las células del sistema inmunitario a un depósito de antígenos y estimular estas células para desencadenar respuestas inmunitarias.
Los agentes inmunoestimulantes o los adyuvantes se han utilizado durante muchos años para mejorar las respuestas inmunitarias del huésped para, por ejemplo, las vacunas. Los adyuvantes intrínsecos, como los lipopolisacáridos, normalmente son los componentes de las bacterias muertas o atenuadas utilizadas como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son los inmunomoduladores que, por regla general, están unidos no covalentemente a los antígenos y que se formulan para potenciar las respuestas inmunitarias del hospedador. Así, se han identificado adyuvantes que mejoran la respuesta inmunitaria frente a los antígenos administrados por vía parenteral. Sin embargo, algunos de estos adyuvantes son tóxicos y pueden causar unos efectos secundarios indeseables, lo que los hace inutilizables en los humanos y en muchos animales. De hecho, solamente el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (citados colectivamente comúnmente como alumbre) se utilizan sistemáticamente como adyuvantes en las vacunas para humanos y animales. La eficacia del alumbre a la hora de aumentar la respuesta de los anticuerpos a los toxoides de la difteria y del tétanos está bien establecida y, más recientemente, se ha añadido el adyuvante alumbre a una vacuna de HBsAg. Aunque la utilidad del alumbre está bien establecida para algunas aplicaciones, tiene sus limitaciones. Por ejemplo, el alumbre es ineficaz para la vacunación de la gripe y, de manera incoherente, desencadena una respuesta inmunitaria celular. Los anticuerpos desencadenados por los antígenos que llevan alumbre como adyuvante son principalmente del isotipo IgG1 en el ratón, lo que puede no ser lo óptimo para la protección mediante algunos agentes vacunales.
Un amplio abanico de adyuvantes extrínsecos pueden provocar potentes respuestas inmunitarias a antígenos. Estos incluyen las saponinas complejadas a los antígenos de las proteínas de la membrana (complejos estimulantes inmunitarios), los polímeros plurónicos con aceite mineral, las microbacterias muertas y el aceite mineral, el adyuvante completo de Freund, los productos bacterianos, como el dipéptido de muramilo (MDP) y el lipopolisacárido (LPS) así como el lípido A, y los liposomas.
Para inducir de manera eficaz respuestas inmunitarias humorales (RIH) e inmunidad celular (IMC), los inmunógenos se emulsionan en adyuvantes. Muchos adyuvantes son tóxicos e inducen granulomas, inflamaciones agudas y crónicas (adyuvante completo de Freund, ACF), citólisis (saponinas y polímeros plurónicos) y pirogenia, artritis y uveítis anterior (LPS y MDP). Aunque el ACF es un excelente adyuvante ampliamente utilizado en investigación, no está autorizado su uso en vacunas humanas o de animales debido a su toxicidad.
Las características deseables de los adyuvantes ideales incluyen:
1) Ausencia de toxicidad;
2) Capacidad para estimular una respuesta inmunitaria perdurable;
3) Simplicidad en la fabricación y estabilidad en el almacenamiento a largo plazo;
4) Capacidad para desencadenar la IMC y la RIH contra antígenos administrados por diferentes vías, si fuera necesario;
5) Sinergia con otros adyuvantes;
6) Capacidad de interaccionar selectivamente con las poblaciones de células presentadoras de antígeno (CPA);
7) Capacidad para desencadenar específicamente unas adecuadas respuestas inmunitarias específicas de linfocitos T_{H}1 o T_{H}2; y
8) Capacidad para aumentar selectivamente la cantidad de isotipos de los anticuerpos adecuados (por ejemplo, IgA) contra los antígenos.
La patente de los EE. UU. n.º 4.855.283 concedida a Lockhoff et al. el 8 de agosto de 1989 instruye sobre los análogos glucolipídicos, entre ellos las glucosilamidas, las N-glucosilureas y los N-glucosilcarbamatos, cada uno de los cuales está sustituido en el residuo del azúcar con un aminoácido, como inmunomoduladores o adyuvantes. Así, en Lockhoff et al. 1991 se describió que los análogos N-glucolipídicos que muestran unas similitudes estructurales con los glucolípidos que se producen de forma natural, como los glucoesfingolípidos y los glucoglicerolípidos, son capaces de desencadenar respuestas inmunitarias fuertes tanto en las vacunas del virus del herpes simple como en las del virus de la seudorrabia. Se han sintetizado algunos glucolípidos a partir de alquilaminas de cadena larga y de ácidos grasos que están unidos directamente a los azúcares a través del átomo de carbono anomérico, para imitar las funciones de los residuos lipídicos que se producen de forma natural.
La patente de los EE. UU. n.º 4.258.029 concedida a Moloney, cedida al cesionario de esta memoria, enseña que el hidrocloruro de octadecil-tirosina (OTH) funciona como un adyuvante cuando se compleja con el toxoide del tétanos y la vacuna del virus de la poliomielitis de tipo I, II y III inactivado con formol. También, Nixon-George et al., 1990, describieron que los ésteres de octadecilo de los aminoácidos aromáticos complejados con un antígeno recombinante de la superficie de la hepatitis B aumentaba las respuestas inmunitarias del huésped contra el virus de la hepatitis B.
También se ha utilizado la lipidación de péptidos sintéticos para aumentar su inmunogenia. Así, Wiesmuller 1989, describe un péptido con una secuencia homóloga a una proteína vírica de la glosopeda acoplada a una tripalmitil-S-gliceril-cisteinilserilserina adyuvante, que es un análogo sintético de la parte aminoterminal de la lipoproteína de las bacterias gramnegativas. Además, en Deres et al. 1989 se describió la sensibilización in vivo de los linfocitos T citotóxicos específicos del virus con la vacuna del lipopéptido sintético que comprende péptidos sintéticos modificados obtenidos de la nucleoproteína del virus de la gripe mediante la unión a un lipopéptido, la N-palmitil-S-[2,3-bis (palmitilxi)-(2RS)-propil-[R]-cisteína (TPC).
2. Inmunoensayos
El receptor de la transferrina, los análogos y fragmentos del mismo y/o péptidos de la presente invención son útiles como inmunógenos, como antígenos en los inmunoensayos incluidos los análisis inmunoenzimáticos de adsorción (ELISA), los RIA y otros análisis de unión a anticuerpos que no están unidos a enzimas o los procedimientos que se conocen en la técnica para la detección de anticuerpos antibacterianos contra Haemophilus, el TfR y/o péptidos. En los análisis de ELISA, el receptor de la transferrina, los análogos, los fragmentos y/o péptidos que corresponden a porciones de la proteína del TfR se inmovilizan en una superficie seleccionada, por ejemplo, una superficie capaz de unirse a proteínas o péptidos como los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno. Después del lavado para retirar el receptor de la transferrina, los análogos y/o péptidos adsorbidos de manera incompleta, se puede unir a la superficie seleccionada una proteína inespecífica, como una disolución de la seroalbúmina bovina (SAB) o la caseína, que se sabe que es antigénicamente neutra respecto a la muestra de prueba. Esto permite bloquear los sitios de absorción inespecíficos en la superficie inmovilizada y, de esta forma, reducir el nivel basal causado por las uniones inespecíficas de los antisueros sobre la superficie. Preferiblemente, los péptidos seleccionados son de las regiones conservadas de la tabla 2 o la tabla 3 para mejorar la detección de distintas especies relacionadas a menos que se vaya a detectar una determinada especie bacteriana. En ese caso, se selecciona un polipéptido que es único para el TfR de la especie en particular. Normalmente, los péptidos se encuentran en el intervalo de 12 residuos o más y, preferiblemente, 14 a 30 residuos. Sin embargo, se entiende que se puede utilizar una mezcla de péptidos bien como un inmunógeno en una vacuna o como un agente diagnóstico. Pueden existir circunstancias en las que se utilice una mezcla de péptidos de las regiones conservadas y/o de las regiones no conservadas para proporcionar la protección y/o el diagnóstico de distintas especies relacionadas. En este caso, la mezcla de los inmunógenos peptídicos se citan habitualmente como una preparación "combinada" para utilizarla como una vacuna o un agente diagnóstico.
Luego, la superficie inmovilizante se hace entrar en contacto con una muestra, como materiales clínicos o biológicos a probar, de manera que conduzca a la formación del complejo inmunitario (antígeno/anticuerpo). Esto puede incluir la dilución de la muestra con diluyentes tales como la SAB, la gammaglobulina bovina (GGB) y/o una disolución salina tamponada con fosfato (PBS)/Tween. A continuación, se deja incubar la muestra durante 2 a 4 horas a temperaturas en el orden de 25ºC a 37ºC. Después de la incubación, se lava la superficie en contacto con la muestra para retirar el material sin inmunocomplejar. El procedimiento de lavado puede incluir el lavado con una disolución como PBS/Tween o un tampón de borato.
Después de la formación de los complejos inmunitarios específicos entre la muestra a comprobar y el receptor de la transferrina, los análogos, los fragmentos y/o péptidos unidos y del posterior lavado, se puede determinar la aparición, e incluso la cantidad, de la formación del inmunocomplejo presentando el inmunocomplejo a un segundo anticuerpo que tiene especificidad para el primer anticuerpo. Si la muestra a comprobar es de origen humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo específico contra las inmunoglobulinas humanas y, en general, la IgG. Para proporcionar medios de detección, el segundo anticuerpo puede tener una actividad asociada, como una actividad enzimática, que generará, por ejemplo, la aparición de color después de incubar con un sustrato cromógeno adecuado. Luego, se puede realizar la cuantificación midiendo el grado de generación de color utilizando, por ejemplo, un espectrofotómetro del espectro visible.
3. Utilización de secuencias como sondas de hibridación
A continuación, las secuencias de nucleótidos de la presente invención, que comprenden la secuencia del gen del receptor de la transferrina, permitirán identificar y clonar genes del receptor de la transferrina de cualquier especie de Haemophilus y de otras bacterias que tengan genes del receptor de la transferrina.
Las secuencias de nucleótidos que comprenden la secuencia de los genes del receptor de la transferrina de la presente invención son útiles por su capacidad para formar selectivamente moléculas híbridas con tramos complementarios de otros genes del TfR. Según la aplicación, se puede emplear una serie de condiciones de hibridación para lograr diferentes grados de selectividad de la sonda frente a los otros genes del TfR. Para un modo de gran selectividad, se utilizan condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos, como condiciones de baja sal y/o una elevada temperatura, como las proporcionadas por NaCl de 0,02 M a 0,15 M a unas temperaturas de entre unos 50ºC a 70ºC. Para algunas aplicaciones, se necesitan unas condiciones de hibridación menos rigurosas, como sal de 0,15 M a 0,9 M, a temperaturas que oscilan de entre unos 20ºC a 55ºC. También se pueden conseguir unas condiciones de hibridación más rigurosas añadiendo cantidades crecientes de formamida para desestabilizar las moléculas hibridadas. Por lo tanto, se pueden manipular fácilmente determinadas condiciones de hibridación, y será un método de elección dependiendo de los resultados deseados. En general, las temperaturas de hibridación adecuadas en presencia de formamida al 50% son: 42ºC para una sonda que es homóloga del 95 al 100% al fragmento de diana, 37ºC para una homología del 90 al 95% y 32ºC para una homología del 85 al 90%.
En una realización diagnóstica clínica, las secuencias del ácido nucleico de los genes del TfR de la presente invención se pueden utilizar en combinación con unos medios adecuados, como una marcación, para determinar la hibridación. En la técnica se conocen una gran variedad de medios indicadores adecuados, incluidos los ligandos radiactivos, enzimáticos u otros ligandos, como la avidina/biotina, que son capaces de proporcionar una señal detectable. En algunas realizaciones diagnósticas, se puede utilizar una marcación enzimática, como la ureasa, la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, en lugar de una marcación radiactiva. En el caso de las marcaciones enzimáticas, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que se pueden utilizar para proporcionar unos medios visibles al ojo humano o visibles al espectrofotómetro, para identificar la hibridación específica con las muestras que contienen las secuencias del gen del TfR.
Las secuencias del ácido nucleico de los genes del TfR de la presente invención son útiles como sondas de hibridación en hibridaciones en disolución y en realizaciones que emplean procedimientos de fase sólida. En las realizaciones que implican los procedimientos de fase sólida, el ADN (o ARN) a comprobar de las muestras, como muestras clínicas, incluidos los exudados, los líquidos corporales (p. ej., suero, líquido amniótico, derrame del oído medio, esputo, líquido del lavado broncoalveolar) o incluso tejidos, se adsorbe, o si no, se fija a una matriz o una superficie determinada. Luego, el ácido nucleico monocatenario fijado se somete a una hibridación específica con sondas determinadas que comprenden las secuencias del ácido nucleico de los genes del TfR, o fragmentos de los mismos, de la presente invención en las condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares sobre la base de los criterios particulares requeridos que dependen de, por ejemplo, el contenido de G+C, el tipo de ácido nucleico destinatario, la fuente del ácido nucleico, el tamaño de la sonda de hibridación, etc. Después de lavar la superficie de hibridación para retirar las moléculas de la sonda unidas inespecíficamente, se detecta la hibridación específica, o incluso se cuantifica, por medio de la marcación. Al igual que con la selección de los péptidos, se prefiere seleccionar las porciones de la secuencia del ácido nucleico que están conservadas entre especies de Haemophilus, como las secuencias del ácido nucleico que codifican la secuencia peptídica conservada de las figuras 8, 9, 13 y 14 y, particularmente, las enumeradas en las tablas 2 y 3. La sonda seleccionada puede ser, al menos, de 18 pb y puede estar en el intervalo de 30 pb a 90 pb de longitud.
4. Expresión de los genes del receptor de la transferrina
Se pueden utilizar vectores plasmídicos que contienen el replicón y secuencias de control que se obtienen de especies compatibles con la célula hospedadora para la expresión de los genes del receptor de la transferrina en los sistemas de expresión. Normalmente, el vector lleva un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo, se puede transformar E. coli con el pBR322 que contiene los genes de resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y, así, proporcionar un medio sencillo de identificar las células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido o fago microbiano, también debe contener, o se puede modificar para contenerlos, promotores que la célula hospedadora puede utilizar para expresar sus propias proteínas.
Además, los vectores fágicos que contienen el replicón o las secuencias de control que son compatibles con el huésped se pueden utilizar como un vector transformador en conexión con estos huéspedes. Por ejemplo, el fago en el lambda GEM^{TM}-11 se puede utilizar para fabricar vectores fágicos recombinantes que se pueden utilizar para transformar las células hospedadoras, como la E. coli LE392.
Los promotores utilizados habitualmente en la construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas del promotor de la \beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979; Goeddel et al., 1980) y otros promotores microbinanos como el sistema del promotor de T7 (patente de los EE. UU. n.º 4.952.496). Se conocen los detalles referentes a las secuencias de nucleótidos de los promotores, lo que permite que un trabajador experto las ligue funcionalmente a los genes. El promotor determinado utilizado generalmente será una cuestión de elección que dependerá de los resultados deseados. Se pueden utilizar huéspedes que son adecuados para la expresión de los genes del receptor de la transferrina, fragmentos, análogos o variantes de los mismos incluidos el sistema de expresión en E. coli, especies de Bacillus, Haemophilus, hongos, levadura o baculovirus.
De acuerdo con esta invención, se prefiere construir la proteína mediante métodos recombinantes, particularmente cuando la proteína del TfR que se produce, tanto de forma natural como la purificada a partir de un cultivo de una especie de Haemophilus, puede incluir cantidades minúsculas de sustancias tóxicas u otros contaminantes. Este problema se puede evitar utilizando la proteína del TfR producida recombinantemente en sistemas heterólogos que se puede aislar del huésped de manera que se minimizen los contaminantes en el material purificado. Hospedadores particularmente deseables para la expresión en este sentido incluyen las bacterias grampositivas que no tienen el LPS y que, por lo tanto, no tienen la endotoxina. Tales huéspedes incluyen especies de Bacillus y pueden ser particularmente útiles para la producción del receptor de la transferrina apirógeno, de fragmentos o de análogos del mismo. Además, los métodos de producción recombinantes permiten la fabricación de Tbp1 o Tbp2 o de fragmentos de las mismas, separados de cualquier otro, que se diferencian de las proteínas combinadas normales presentes en Haemophilus.
Archivos biológicos
Algunos plásmidos que contienen, al menos, una porción que codifica para un receptor de la transferrina de las cepas de Haemophilus influenzae que se describen y se citan en la presente memoria se han archivado en la American Type Culture Collection (ATCC) ubicada en Rockville, Maryland (EE. UU.) en conformidad con el Tratado de
Budapest y antes del registro de esta solicitud. Las muestras de los plásmidos archivados estarán disponibles al público cuando se conceda una patente sobre la base de esta solicitud de patente en los Estados Unidos. La invención descrita y reivindicada en la presente memoria no está limitada en su alcance por los plásmidos archivados, ya que la realización archivada sólo pretende ser una ilustración de la invención.
Compendio del archivo
Clon Designación de la ATCC Fecha de archivo
DS-712-1-3 75603 4 de noviembre de 1993
JB-1042-7-6 75607 4 de noviembre de 1993
JB-1424-2-8 75937 27 de octubre de 1994
JB-1600-1 75935 27 de octubre de 1994
JB-1468-29 75936 27 de octubre de 1994
pT7TBP2A 76931 27 de octubre de 1994
pT7TBP2B 76932 27 de octubre de 1994
pT7TBP2C 76933 27 de octubre de 1994
pT7TBP2D 76934 27 de octubre de 1994
Cepas de Haemophilus
La cepa Eagan del Hib está disponible en Connaught Laboratories Limited, 1755 Steeles Ave. W., Willowdale, Ontario, Canadá M2R 3T4.
La cepa MinnA del Hib se obtuvo de la colección del Dr. Robert Munson, Department of Microbiology and Immunology, Washington University School of Medicine, Children's Hospital, St. Louis, Missouri 63110 (EE. UU.).
La cepa DL63 del Hib se obtuvo de la colección del Dr. Eric Hansen, Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center, 5323 Harry Hines Boulevard, Dallas, Texas 75235-9048 (EE. UU.).
La PAK 12085 se obtuvo de la colección del Dr. Robert Munson (véase más arriba).
Las cepas SB12, 29, 30, 32 y 33 se obtuvieron de la colección del Dr. Stephen Barenkamp, Department of Pediatrics, School of Medicine, Saint Louis University Medical Centre, St. Louis, Missouri 63104 (EE. UU.).
Ejemplos
La descripción anterior describe de forma general la presente invención. Se puede obtener una comprensión más completa por referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen exclusivamente con propósitos de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención. Los cambios en la forma y la sustitución de equivalentes se contemplan como circunstancias que pueden sugerir o acabar en un expediente. Aunque se ha utilizado una terminología específica en la presente memoria, tal terminología pretende tener un sentido descriptivo y no propósitos limitadores.
Los métodos de la genética molecular, la bioquímica de proteínas, la inmunología y la tecnología de fermentación usados pero no descritos de manera explícita en esta descripción y estos ejemplos se dan a conocer ampliamente en la bibliografía científica y son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra la preparación del ADN cromosómico de las cepas DL63, Eagan, MinnA, PAK 12085 y SB33 del H. influenzae. Se cultivaron cepas del H. influenzae en agar de Mueller-Hinton o en caldo de infusión del corazón del cerebro tal y como se describe en Harkness et al., 1992.
A. Extracción del ADN cromosómico del Haemophilus influenzae de tipo b DL63
Se preparó el ADN cromosómico como sigue. Se sedimentaron por centrifugación 250 ml de cultivo a 8000 rpm en un rotor Beckman J14 durante 15 minutos. Se lavó el sedimento con 200 ml de Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0, se centrifugó como anteriormente, se resuspendió en 12,5 ml de Tris-HCl a 50 mM, EDTA a 50 mM, pH 8,0, y se congeló a -20ºC. A continuación, al sedimento de células congeladas se le añadieron 1,25 ml de una disolución de 10 mg/ml de lisozima en Tris-HCl a 0,25 M, pH 8,0. Se descongeló el sedimento y se incubó en hielo durante 45 minutos. Seguidamente, se añadieron 2,5 ml de una disolución de proteinasa K a 1 mg/ml en SDS al 0,5%, EDTA a 0,4 M, Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5, y se incubó la mezcla a 50ºC durante 1 hora, mezclándola ocasionalmente. Se extrajo el lisado una vez con 15 ml de Tris-fenol tamponado y luego, se añadieron 1,5 ml de acetato de sodio a 3 M y 30 ml de etanol para precipitar el ADN. El ADN se enrolló alrededor de una varilla de cristal y después se disolvió en 12,5 ml de Tris-HCl a 50 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,5 que contenía ARNsa A a 0,2 mg/ml, agitándolo por oscilación durante una noche. La muestra se extrajo una vez con un volumen igual de cloroformo, se precipitó y se enrolló como anteriormente. Se disolvió el ADN en 2 ml de Tris-HCl a 50 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,5 y se almacenó a 4ºC.
B. Extracción del ADN cromosómico del Haemophilus influenzae de tipo b Eagan
Se sedimentaron 50 ml de cultivo mediante centrifugación, se resuspendió el sedimento en 25 ml de TE (Tris a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,5) y se utilizaron 2 alícuotas de 5 ml para preparar el ADN cromosómico. A cada alícuota se le añadieron 0,6 ml de sarcosil al 10% y 0,15 ml de proteinasa K a 20 mg/ml, y las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se extrajo el lisado una vez con fenol saturado de Tris y tres veces con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1). Se agruparon las fases acuosas para conseguir un volumen final de 7 ml. Luego, se añadieron 0,7 ml de acetato de sodio a 3 M (pH 5,2) y 4,3 ml de isopropanol para precipitar el ADN que se había enrollado, se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en 1 ml de agua.
C. Extracción del ADN cromosómico de los Haemophilus influenzae Eagan, MinnA, PAK 12085 y SB33
Se sedimentaron las células de 50 ml de cultivo por centrifugación a 5000 rpm durante 15 a 20 minutos, a 4ºC. Se resuspendió el sedimento celular en 10 ml de TE (Tris-HCl a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,5), se añadieron pronasa y SDS para conseguir unas concentraciones finales de 500 \mug/ml y 1%, respectivamente. La muestra se incubó a 37ºC durante 4 horas hasta obtener un lisado claro. Se extrajo el lisado una vez con fenol saturado de Tris, una vez con fenol saturado de Tris/cloroformo (1:1) y una vez con cloroformo. La fase acuosa final se dializó durante 24 horas frente a 2 x 500 ml de NaCl a 1 M a 4ºC, cambiando el tampón una vez, y durante 24 horas frente a 2 x 500 ml de TE a 4ºC, cambiando el tampón una vez. El dializado final se repartió en alícuotas para su uso.
Ejemplo 2
Este ejemplo ilustra la preparación de genotecas cromosómicas.
A. Genoteca del H. influenzae DL63 en \lambdaZAP
Se trocearon mecánicamente 100 \mug de ADN cromosómico del H. influenzae DL63 en TE con una jeringuilla de 1 ml con una aguja de 25 galgas. Los extremos del ADN cortado se hicieron romos añadiéndole agua hasta un volumen final de 405 \mul, 45 \mul del tampón de la nucleasa S1 a 10x (NaCl a 2 M, NaOAc a 500 mM, pH 4,5, ZnSO_{4} a 10 mM, glicerol al 5%), y 1,7 \mul de nucleasa S1 a 100 U/\mul y se incubó a 37ºC durante 15 minutos. La muestra se extrajo una vez con fenol/cloroformo y una vez con cloroformo, y se añadió 1 ml de etanol para precipitar el ADN. Se incubó la muestra en hielo durante 10 minutos o a -20ºC durante una noche, y se recogió el ADN por centrifugación en una microcentrífuga durante 30 minutos. Se lavó el ADN con etanol al 70% y se secó. Los sitios EcoRI en la secuencia del ADN se metilaron utilizando procedimientos estándares. A este ADN metilado se le añadieron 5 \mul de MgCl_{2} a 100 mM, 8 \mul de una mezcla de dNTP (2,5 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y 4 \mul de Klenow a 5 U/\mul. Se incubó la mezcla a 12ºC durante 30 minutos. Se añadieron 450 \mul de STE (NaCl a 0,1 M, Tris-HCl a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 8,0) y se extrajo la mezcla una vez con fenol/cloroformo y una vez con cloroformo, antes de añadir un 1 ml de etanol para precipitar el ADN. Se incubó la muestra en hielo durante 10 minutos o a - 20ºC durante una noche. Se recogió el ADN por centrifugación en una microcentrífuga durante 30 minutos, se lavó con etanol al 70% y se secó.
Se resuspendió el ADN en 7 \mul de TE y, a la disolución, se le añadieron 14 \mul de conectores fosforilados EcoRI (200 ng/\mul), 3 \mul de tampón de ligación a 10x, 3 \mul de ATP a 10 mM y 3 \mul de la ADN ligasa de T4 (4 U/\mul). Se incubó la muestra a 4ºC durante una noche y, luego, se incubó a 68ºC durante 10 minutos para inactivar la ligasa. A la mezcla, se le añadieron 218 \mul de H_{2}O, 45 \mul del tampón universal a 10x y 7 \mul de EcoRI a 30 U/\mul. Después de la incubación a 37ºC durante 1,5 horas, se añadieron 1,5 \mul de EDTA a 0,5 M y se colocó la mezcla en hielo.
Se fraccionó el ADN según el tamaño en un gradiente de sacarosa, y se agruparon las fracciones que contenían el ADN de 6 a 10 kb. El ADN agrupado se precipitó con etanol y se resuspendió en 5 \mul del tampón de TE. Se ligaron 200 ng del ADN a insertar durante 2 a 3 días a 4ºC con 1 \mug de un vector ZAP II en un volumen final de 5 \mul. La mezcla de ligación se empaquetó utilizando Gigapack II Gold (Stratagene) y se sembró en placas sobre células de E. coli SURE en placas con NZY. La genoteca se tituló, se amplificó y se guardó a 4ºC en cloroformo al 0,3%.
B. Genoteca del H. influenzae Eagan en pUC
El ADN cromosómico del H. influenzae Eagan preparado por el método en el ejemplo 1C se digirió con Sau3AI durante 2, 5 y 10 minutos, y las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa preparativo. Se cortaron las porciones del gel que incluían los fragmentos de ADN de entre 3 a 10 kb de longitud y el ADN se extrajo mediante el procedimiento estándar de congelar-descongelar. El ADN plasmídico del pUC 8:2 (pUC 8 con sitios adicionales para las enzimas de restricción BglII y XbaI en el sitio de clonación múltiple) se digirió con BamHI y BglII, y se desfosforiló con la fosfatasa alcalina de ternera (FAT). Los fragmentos del ADN del H. influenzae Eagan se ligaron al pUC y la mezcla se utilizó para transformar las células JM109 de E. coli.
C. Genoteca del H. influenzae Eagan en \lambdaZAP
El ADN cromosómico del H. influenzae Eagan preparado como en el ejemplo 1B se digirió con EcoRI y se fraccionó por tamaños sobre un gel de agarosa preparativo. Se escindieron las porciones del gel que corresponden a los fragmentos de ADN de 7 a 23 kb, y el ADN se electroeluyó durante una noche en un tubo de diálisis que contenía 3 ml de TAE (Tris-acetato a 40 mM, EDTA a 1 mM) a 14 V. Se precipitó el ADN dos veces y se resuspendió en agua antes de ligarlo durante una noche con ADN de \lambdaZAP II digerido con EcoRI. La mezcla de ligación se empaquetó utilizando el kit de empaquetamiento Gigapack II Gold (Stratagene) y se sembró sobre las células XL1-Blue de E. coli. La genoteca se tituló, se amplificó y se guardó a 4ºC en cloroformo al 0,3%.
D. Genotecas en EMBL3
El ADN cromosómico del H. influenzae MinnA (10 \mug) se preparó como en el ejemplo 1C y se digirió con Sau3AI (40 unidades) durante 2, 4 y 6 minutos y luego se fraccionó por tamaños en un gradiente de sacarosa al 10-30% en el tampón TNE (Tris-HCl a 20 mM, NaCl a 5 mM, EDTA a 1 mM, pH 8). Las fracciones que contienen fragmentos de ADN mayores de 5 kb se agruparon y se precipitaron. En un segundo experimento, el ADN cromosómico (2,6 \mug) se digirió con Sau3AI (4 unidades) durante 1, 2 y 3 minutos y se fraccionó por tamaños por electroforesis preparativa en gel de agarosa. Las porciones del gel que contenían los fragmentos de ADN de 10 a 20 kb se cortaron y el ADN se extrajo mediante una técnica estándar de congelar-descongelar. El ADN fraccionado por tamaños de los dos experimentos se agrupó para la ligación con los brazos BamHI de EMBL3 (Promega). La mezcla de ligación se empaquetó utilizando el kit de empaquetamiento Gigapack II y se sembró en placas sobre células LE392 de E. coli. La genoteca se tituló y, luego, se amplificó y se guardó a 4ºC en cloroformo al 0,3%.
El ADN cromosómico del H. influenzae PAK 12085 o SB33 preparado como en el ejemplo 1C se digirió con Sau3AI (0,5 unidades/10 \mug de ADN) a 37ºC durante 15 minutos y se fraccionó por tamaños en una electroforesis en gel de agarosa. Se escindieron las porciones del gel que corresponden a los fragmentos de ADN de 15 a 23 kb y el ADN se electroeluyó durante una noche en un tubo de diálisis que contenía 3 ml de TAE a 14 V. El ADN se precipitó dos veces y se resuspendió en agua antes de la ligación durante una noche con los brazos BamHI de EMBL3 (Promega). La mezcla de ligación se empaquetó utilizando el kit de empaquetamiento in vitro de Lambda (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se sembró en placas sobre células NM539 de E. coli. La genoteca se tituló y, luego, se amplificó y se guardó a 4ºC en presencia de cloroformo al 0,3%.
Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra el rastreo de las genotecas
A. Genoteca de expresión del H. influenzae DL63 en \lambdaZAP
Las proteínas Tbp1 y Tbp2 se purificaron por afinidad con transferrina humana (Tfh) en fase sólida. Brevemente, se preparó una columna de 20 ml de Tfh-Sefarosa de acuerdo con el protocolo del fabricante para unir los ligandos de las proteínas a la Sefarosa activada con CNBr (Sigma). La matriz resultante se lavó con 3 volúmenes de la columna de Tris-HCl a 50 mM, NaCl a 1 M, guanidina-HCl a 6 M, pH 8,0 para retirar la Tfh unida no covalentemente. Luego, la columna se equilibró con Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0 y la Tfh unida se cargó con hierro utilizando 1 ml de FeCl_{3} a 10 mg/ml en un tampón que contiene 100 mM tanto de citrato de sodio como de bicarbonato de sodio, pH 8,6, seguida de 2 volúmenes de la columna de Tris-HCl a 50 mM, NaCl a 1 M, pH 8,0. Se prepararon membranas bacterianas completas (300 mg de proteínas totales) de la cepa DL63 del H. influenzae cultivada en unos medios deficientes en hierro como se describió previamente (Schryvers et al., 1989). Las membranas se diluyeron hasta 2 mg/ml en Tris-HCl a 50 mM, NaCl a 1 M, pH 8,0 y se solubilizaron añadiendo EDTA hasta 15 mM y sarcosil NL97 al 1,5%. Después de la centrifugación a 40,000 x g durante 1 hora, se aplicó el sobrenadante a la columna con Tfh y se lavó la columna con 10 volúmenes de la columna de Tris-HCl a 50 mM, NaCl a 1 M, EDTA a 10 mM, sarcosil al 0,5%, pH 8,0. Las proteínas del receptor se eluyeron utilizando GnHCl a 2 M en el mismo tampón, y las fracciones eluidas se dializaron extensivamente frente a un tampón de bicarbonato de amonio a 25 nM (5 cambios de tampón), se liofilizaron y se guardaron a -20ºC. Se utilizaron proteínas aisladas para generar antisueros específicos contra el receptor de la transferrina en conejos blancos de Nueva Zelanda utilizando las técnicas estándares. Brevemente, se inmunizó a los conejos 3 veces por vía subcutánea, en intervalos de dos semanas, utilizando el adyuvante completo de Freund para la primera inyección y el adyuvante incompleto de Freund para las posteriores
inyecciones.
La genoteca de la DL63 en \lambdaZAP se sembró en placas sobre células SURE de E. coli y las calvas se transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa que se habían empapado previamente en IPTG a 10 mM para inducir la expresión desde el promotor lacZ del pBluescript. Los filtros se bloquearon utilizando leche desnatada al 0,5% en Tris-HCl a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,5, antes de rastrearlos con los antisueros policlonales contra la Tfh e IgG contra conejo de cabra con la peroxidasa de rábano picante conjugada. Las calvas se purificaron con tres rondas de detección y los plásmidos pBluescript recombinantes (pBHIT1 y pBHIT2; figuras 1A y 2) se recuperaron mediante el procedimiento de excisión in vivo (Short et al., 1988).
B. Genotecas que no son de expresión de Eagan, MinnA, y PAK 12085 1) Rastreo de la genoteca del H. influenzae Eagan en pUC
Se realizaron réplicas de colonias sobre nitrocelulosa utilizando las técnicas estándares y se rastrearon los filtros con la sonda 5'pBHIT2 del gen del receptor de la transferrina que se ilustra en la figura 2. Se marcó la sonda con digoxigenina (dig, Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante. Varios clones posibles se transfirieron localizados sobre nitrocelulosa y se sometieron a una segunda ronda de detección utilizando la misma sonda 5'pBHIT2. Se analizaron los posibles clones de la segunda ronda cartografiando con enzimas de restricción y se seleccionó el clon S-4368-3-3 (figura 1B, figura 2) para el análisis de la secuencia.
2) Detección de la genoteca del H. influenzae Eagan en \lambdaZAP
Se sembró en placas la genoteca de fagos utilizando las técnicas estándares sobre células XLI Blue (Stratagene) utilizado placas de LB y una capa recubridora de agarosa al 0,7%. Se replicaron las calvas en nitrocelulosa con los protocolos estándares y se calentaron los filtros a 80ºC, durante 2 horas, al vacío, para fijar el ADN. La sonda 5'pBHIT2 del gen del receptor de la transferrina (figura 2) se marcó con digoxigenina, los filtros se prehibridaron durante 4 horas a 42ºC y, luego, se hibridaron durante una noche a 42ºC con la sonda marcada. Se lavaron los filtros a 68ºC y, después de la autorradiografía, se seleccionaron varias calvas para una segunda ronda de detección. Se realizó una escisión in vivo del ADN fagómido de los posibles clones de la segunda ronda de acuerdo con los protocolos proporcionados por el sistema \lambdaZAP (Promega). Se obtuvieron cuatro clones con unos insertos EcoRI de \sim2,5 kb idénticos, de los cuales, el JB-901-5-3 en la figura B y la figura 2 es un ejemplo. También se amplificaron las posibles calvas y se purificó el ADN del fago a partir de 500 ml de cultivo. Se cortó el ADN del inserto por digestión con XbaI y se clonó en el pUC 8:2 (un pUC 8 que contiene los sitios adicionales BglII y XbaI en su sitio de clonación múltiple) que se había digerido con XbaI y se había desfosforilado. El clon JB-911-3-2 (figura 17) contiene la mitad del lado 3' del operón de la Tfh del H. influenzae Eagan.
3) Rastreo de las genotecas en EMBL3
La genoteca del H. influenzae MinnA se sembró en placas de NZCYM sobre células LE392 utilizando como recubrimiento agarosa de cobertera al 0,7% en NZCYM. Se realizaron réplicas de las calvas en filtros de nitrocelulosa siguiendo los procedimientos estándares, y los filtros se procesaron y se rastrearon con la sonda 5'pBHIT2 (figura 2) marcada con digoxigenina. Las posibles calvas se sembraron y se sometieron a una segunda y tercera ronda de detección utilizando los mismos procedimientos. Se preparó el ADN del fago a partir de 500 ml de cultivo utilizando las técnicas estándares, se escindió el ADN del inserto por digestión con SalI y se clonó en el pUC para generar el clon DS-712-1-3 (figuras 1C y 2).
La genoteca del H. influenzae PAK 12085 se sembró en placas de NZCYM sobre células LE392 utilizando como recubrimiento agarosa de cobertera al 0,7% en NZCYM. Se replicaron las calvas en nitrocelulosa, y los filtros se procesaron y se rastrearon con la sonda 5'pBHIT2 marcada con digoxigenina (figura 2). Las posibles calvas se sembraron y se sometieron a una segunda ronda de detección utilizando los mismos procedimientos. Se preparó el ADN del fago a partir de 500 ml de cultivo mediante las técnicas estándares, se escindió el ADN del inserto por digestión con SalI y se clonó en pUC para generar el clon JB-1042-7-6 (figuras 1D y 2).
La genoteca del H. influenzae SB33 se sembró en placas de NZCYM sobre células LE392 utilizando como recubrimiento agarosa de cobertera al 0,7% en NZCYM. Se replicaron las calvas en nitrocelulosa y los filtros se procesaron y se rastrearon con la sonda 5'pBHIT2 marcada con digoxigenina (figura 2). Las posibles calvas se sembraron en placas y se sometieron a una segunda ronda de detección utilizando los mismos procedimientos. Se preparó el ADN del fago a partir de 500 ml de cultivos mediante técnicas estándares, se cortó el ADN del inserto mediante la digestión con SalI y se clonó en pUC para generar el clon JB-1031-2-9 (figura 2).
Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra la secuenciación de los genes Tbp1 y Tbp2 del operón del TfR.
Se preparó el ADN plasmídico de los clones pBHIT 1, pBHIT 2, S-4368-3-3, JB-901-5-3, DS-712-1-3, JB-1042-7-6 y JB-1031-2-9 utilizando las técnicas estándares. Se sintetizaron cebadores para la secuenciación de oligonucleótidos de 17 a 25 bases de longitud en el sintetizador de ADN de ABI modelo 380B y se purificaron mediante cromatografía utilizando cartuchos OPC obtenidos de Applied Biosystems Inc., y se utilizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las muestras se secuenciaron con el secuenciador de ADN modelo 370A de ABI y la reacción del terminador teñido de acuerdo con los protocolos del fabricante. La secuencia del operón del TfR de la cepa DL63 se ilustra en la figura 3, la de la cepa Eagan en la figura 4, la de la cepa MinnA en la figura 5, la de la PAK 12085 en la figura 6 y la de la SB33 en la figura 7.
Ejemplo 5
Este ejemplo ilustra la amplificación por PCR de los genes Tbp2 de las cepas SB12, SB29, SB30 y SB32 del H. influenzae no tipificable.
Se preparó el ADN cromosómico de las cepas SB12, SB29, SB30 y SB32 del H. influenzae no tipificable tal y como se describió anteriormente. Los genes del TfR se distribuyen como un operón con tbp2 seguido de tbp1 (véanse las figuras 12A y 12B). Se sintetizaron los oligonucleótidos para el extremo 5' del tbp2 y el complementario inverso del extremo 5' de la secuencia codificante del tbp1. Los cebadores fueron: GGATCCATATGAAATCTGT ACCTCTTATCTCTGGT (SEQ ID n.º 120) que corresponde a MKSVPLISGS (SEQ ID n.º 147) de la secuencia líder de Tbp2, y TCTAGAAGCTTTTTTAGTCATTTTTAG TATTCCAT (SEQ ID n.º 137) que es el complementario inverso de la secuencia líder MTKK (SEQ ID n.º 138) de Tbp1 y una parte de la secuencia intergénica (figuras 12A y 12B). La amplificación por PCR se realizó en un tampón que contiene Tris/HCl a 10 mM, pH 8,3, cloruro de potasio a 50 mM y cloruro de magnesio a 1,5 mM. Cada 100 \mul de la mezcla de reacción contenía 5 ng de ADN cromosómico, 1 \mug de cada cebador, 5 unidades de la ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus) y dNTP a 0,4 mM (Perkin Elmer Cetus). Las condiciones de ciclación eran 25 ciclos de 94ºC durante 1,0 minuto, 45ºC durante 2,0 minutos y 72ºC durante 1,5 minutos. Se ampliaron fragmentos específicos de 2 kb para cada muestra (figura 13). Se utilizó el ADN de SB33 como un control positivo (calle 1). El ADN cromosómico utilizado para la amplificación del gen Tbp2 era de SB33 en la calle 1; de SB12 en la calle 2; de SB29 en la calle 3; de SB30 en la calle 4; y de SB32 en la calle 5. Se clonaron los fragmentos en el vector de clonación TA (Invitrogen) y se determinaron las secuencias de sus nucleótidos. Las secuencias del ácido nucleico de Tbp2 de las cepas SB12 (SEQ ID n.º 108), SB29 (SEQ ID n.º 110), SB30 (SEQ ID NO: 112) y SB32 (SEQ ID n.º 114) se muestran en las figuras 8, 9, 10 y 11, respectivamente.
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra la comparación de las secuencias de aminoácidos de la transferrina y la identificación de los posibles epítopos expuestos de las proteínas del receptor de la transferrina mediante el análisis de la estructura secundaria.
En cuanto a la figura 14, se muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de Tbp1 de las cepas Eagan y DL63 del H. influenzae de tipo b, de las cepas PAK 12085 y SB33 del H. influenzae no tipificable, de las cepas B16B6 y M982 de la N. meningitidis (Legrain et al., 1993) y de la cepa FA19 de la N. gonorrhoeae FA19 (Cornelissen et al., 1992). Este análisis reveló regiones de Tbp1 y Tbp2 que se conservan en todas estas bacterias.
En cuanto a la figura 15, se muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de Tbp2 de las cepas Eagan y DL63 del H. influenzae de tipo b, PAK 12085, SB12, SB29, SB30 y SB32 del H. influenzae no tipificable, B16B6 y M982 de la N. meningitidis, FA19 de la N. gonorrhoeae y 205 y 37 del Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae (Gerlach et al., 1992). Este análisis reveló regiones de Tbp2 que se conservan en todas estas bacterias.
Se realizaron análisis de la estructura secundaria de las proteínas utilizando los algorimos de Chou and Fasman (1978) y se realizaron gráficos de hidrofilia/hidrofobia utilizando el algoritmo de Hopp (1986). Los valores se derivaron de los promedios de las ventanas heptapeptídicas y se representan en el punto medio de cada fragmento. La figura 16A ilustra la estructura secundaria predicha para la Tbp1 de la cepa Eagan del H. influenzae de tipo b y la figura 16B ilustra la estructura secundaria predicha para la Tbp2 de la cepa Eagan del H. influenzae de tipo b. Se llegó a las estructuras secundarias predichas representadas en las figuras 16A y 16B utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Sin embargo, los inventores no han podido verificar que la estructura secundaria esté representada con precisión en estas figuras.
Se identificaron epítopos conservados de las proteínas Tbp1 y Tbp2 de varias bacterias diferentes mediante el alineamiento de secuencias, tal y como se muestra en las figuras 14 y 15, respectivamente. Algunos de tales epítopos conservados incluyen:
TBP1
DNEVTGLGK SEQ ID n.º 43
TBP1
EQVLNIRLTRYDPGI SEQ ID n.º 44
TBP1
GAINEIEYENVKAVEISKG SEQ ID n.º 45
TBP1
GALAGSV SEQ ID n.º 46
TBP2
LEGGFYGP SEQ ID n.º 74
TBP2
CSGGGSFD SEQ ID n.º 75
TBP2
YVYSGL SEQ ID n.º 76
TBP2
CCSNLSYVKFG SEQ ID n.º 77
TBP2
FLLGHRT SEQ ID n.º 78
TBP2
EFNVDF SEQ ID n.º 79
TBP2
NAFTGTA SEQ ID n.º 80
TBP2
VNGAFYG SEQ ID n.º 81
TBP2
LEGGYF SEQ ID n.º 82
TBP2
VVFGAR SEQ ID n.º 83
Además, en combinación con las estructuras secundarias predichas, se identificaron cuatro epítopos conservados expuestos en Tbp1 y dos en Tbp2. Estos son:
Tbp1
DNEVTGLGK SEQ ID n.º 43
Tbp1
EQVLN/DIRDLTRYD SEQ ID n.º 139 y 140
Tbp1
GAINEIEYENVKAVEISK SEQ ID n.º 141
Tbp1
GI/VYNLF/LNYRYVTWE SEQ ID n.º 142 y 143
Tbp2
CS/LGGG(G)SFD SEQ ID n.º 75, 144 y 145
Tbp2
LE/SGGFY/FGP SEQ ID n.º 74 y 146
Las proteínas, los polipéptidos o los péptidos que contienen las secuencias de aminoácidos conservadas antes mencionadas son particularmente útiles como medios de detección en las realizaciones diagnósticas y como inmunógenos para detectar o proteger de las enfermedades causadas por las bacterias que producen la proteína del receptor de la transferrina. Para la inmunización, las secuencias de aminoácidos particularmente indicadas se pueden presentar al sistema inmunitario como proteínas o péptidos, o se puede usar un vehículo de administración vivo, como Salmonella, BCG, adenovirus, virus de la viruela, virus de la variolovacuna o virus de la poliomielitis.
Ejemplo 7
Este ejemplo ilustra la construcción del plásmido JB-1468-29 que expresa la Tbp1 de Eagan en E. coli.
Los plásmidos S-4368-3-3 (figuras 1B y 2) y JB-911-3-2 (figura 17) contienen las partes 5' y 3' del gen tbp1 de Eagan, respectivamente. La figura 17 ilustra el esquema de construcción del plásmido JB-1468-29. Las secuencias de oligonucleótidos utilizadas en la construcción del JB-1468-29 se muestran en la figura 20, (SEQ ID n.º 86 y 87). Se introdujo el plásmido JB-1468-29 en la cepa BL21/DE3 de E. coli por electroporación para generar la cepa JB-1476-2-1.
La JB-1476-2-1 se cultivó en el medio YT y se indujo con IPTG siguiendo los protocolos estándares. Para la preparación de la Tbp1 para la inmunogenia y otros estudios, se cultivó la cepa JB-1476-2-1 durante una noche en el medio NZCYM que contiene glucosa al 3%. Se añadió un inóculo a 1:40 a los medios NZCYM nuevos sin glucosa, y el cultivo se dejó crecer hasta que A_{578} = 0,3. Se añadió lactosa al 1% y se indujo el cultivo durante 4 horas. El análisis por SDS-PAGE de los lisados totales de las células con el JB-1476-2-1 se muestra en la figura 22. Calle 1: JB-1476-2-1 (T7/Tbp1 de Eagan) a t_{0}; calle 2: JB-1476-2-1 a la inducción de t = 4 horas; calle 3: marcadores de masa molecular de 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa y 31 kDa; calle 4: JB-1437-4-1 (T7/Tbp2 de Eagan) a t_{0}; calle 5: JB-1437-4-1 a la inducción de t = 4 horas; calle 6: JB-1607-1-1 (T7/Tbp1 de SB12) a t_{0}; calle 7: JB-1607-1-1 1 a la inducción de 4 horas.
Ejemplo 8
Este ejemplo ilustra la construcción del plásmido JB-1424-2-8 que expresa Tbp2 de Eagan en E. coli.
En cuanto a la figura 18, se muestra el plásmido S-4368-3-3 que contiene el gen completo tbp2 de la cepa Eagan del H. influenzae de tipo b. La figura 18 ilustra el plásmido JB-1424-2-8 y la figura 19 muestra los oligonucleótidos utilizados. Se introdujo el plásmido JB-1424-2-8 en la cepa BL21/DE3 de E. coli mediante electroporación para generar la cepa JB-4-1437-1 de E. coli. Tras la inducción con IPTG o lactosa, se expresó la Tbp2 en la JB-1437-4-1 de E. coli tal y como se muestra en la figura 22. Calle 1: JB-1476-2-1 (T7/Tbp1 de Eagan) a t_{0}; calle 2: JB-1476-2-1 a la inducción de t = 4 horas; calle 3: marcadores de masa molecular de 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa y 31 kDa; calle 4: JB-1437-4-1 (T7/Tbp2 de Eagan) a t_{0}; calle 5: JB-1437-4-1 a la inducción de t = 4 horas; calle 6: JB-1607-1-1 (T7/Tbp1 de SB12) a t_{0}; calle 7: JB-1607-1-1 a la inducción de t = 4 horas.
Ejemplo 9
Este ejemplo ilustra la construcción de los plásmidos que codifican una secuencia líder de una lipoproteína delante de la secuencia de Tbp2.
Los oligonucleótidos utilizados para la construcción de los plásmidos con secuencias líderes de lipoproteínas derivadas de E. colil pp (SEQ ID n.º 88 y 89), rlpB (SEQ ID n.º 90 y 91), y pal (SEQ ID n.º 92 y 93) que anteceden Tbp2 se muestran en la figura 20. Los plásmidos construidos y las correspondientes cepas generadas se ilustran en la tabla 1 de más abajo.
Ejemplo 10
Este ejemplo ilustra la construcción del plásmido JB-1600-1 que expresa la Tbp2 de la SB12 en E. coli.
El plásmido DS-1047-1-2 (figura 21) contiene el gen tbp2 de la SB12 amplificado por PCR. Se escindió el gen tbp2 como un fragmento de restricción NdeI-EcoRI y se insertó en el vector de expresión pT7-7 para generar el plásmido JB-1600-1. La electroporación en las células BL21/DE3 produjo la cepa JB-1607-1-1 de E. coli que expresa la Tbp2 de la SB12. Tras la inducción con IPTG o lactosa, se expresó la Tbp2 de la SB12, tal y como se muestra en la figura 22. Calle 1: JB-1476-2-1 (T7/Tbp1 de Eagan) a t_{0}; calle 2: JB-1476-2-1 a una inducción de t = 4 horas; calle 3: marcadores de masa molecular de 200 kDa, 116 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 45 kDa y 31 kDa; calle 4: JB-1437-4-1 (T7/Tbp2 de Eagan) a t_{0}; calle 5: JB-1437-4-1 a una inducción de t = 4 horas; calle 6: JB-1607-1-1 (T7/Tbp1 de SB12) a t_{0}; calle 7, JB-1607-1-1 a una inducción de t = 4 horas.
Ejemplo 11
Este ejemplo ilustra la extracción y purificación de Tbp1 y Tbp2.
El esquema de purificación para Tbp1 y Tbp2 se muestra en la figura 23. Ambas proteínas recombinantes se expresan como cuerpos de inclusión en E. coli y los esquemas de purificación son idénticos. Las células de un cultivo de 500 ml, preparadas tal y como se describió en el ejemplo 7 para Tbp1 y en el ejemplo 8 para Tbp2 se resuspendieron en 50 ml de Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0 y se rompieron por sonicación (3 x 10 min, potencia al 70%). Se centrifugó el extracto a 20.000 x g durante 30 minutos y se descartó el sobrenadante resultante que contenía más del 95% de proteínas solubles de E. coli.
Además, el sedimento restante (figura 33, PPT_{1}) se extrajo con 50 ml de Tris a 50 mM, pH 8,0 que contiene Triton X-100 al 0,5% y EDTA a 10 mM. Después de la centrifugación a 20.000 x g durante 30 minutos, se descartó el sobrenadante que contenía las proteínas solubles residuales y la mayoría de las proteínas de la membrana. El sedimento resultante (figura 23, PPT_{2}) obtenido después de la extracción anterior contenía los cuerpos de inclusión. Se solubilizaron las proteínas Tbp1 y Tbp2 en Tris a 50 mM, pH 8,0, que contiene SDS al 0,1% y DTT a 5 mM. Después de la centrifugación, se purificó adicionalmente el sobrenadante resultante en una columna de filtración en gel Superdex 200 equilibrada con Tris a 50 mM, pH 8,0, que contiene SDS al 0,1% y DTT a 5 mM. Se analizaron las fracciones mediante SDS PAGE y las que contenían la Tbp1 o la Tbp2 purificada se dializaron durante una noche a 4ºC frente a Tris a 50 mM, pH 8,0 y, luego, se centrifugaron a 20.000 x g durante 30 minutos. La proteína permaneció soluble en estas condiciones y las Tbp1 y Tbp2 purificadas se guardaron a -20ºC.
El análisis por SDS-PAGE del procedimiento de purificación se muestra en la figura 24. Calles 1: marcadores de masa molecular de proteínas preteñidos (106, 80, 49,5, 32,5, 27,5, 18,5 kDa); calles 2: lisados de células completas de E. coli; calles 3: cuerpos de inclusión solubilizados; calles 4: Tbp1 o Tbp2 purificada.
Ejemplo 12
Este ejemplo ilustra los estudios de inmunogenia de Tbp1 y Tbp2 recombinantes en los ratones.
Se inyectó rTbp1 o rTbp2 purificada (de 1 \mug a 10 \mug) por vía subcutánea (s. c.) a grupos de cinco ratones Balb/c en los días 1, 29 y 43, que se prepararon tal y como se describió en el ejemplo 11 en presencia de AlPO_{4} (1,5 mg por dosis). Se tomaron muestras de sangre los días 14, 28, 42 y 56 para analizar los títulos de los anticuerpos contra rTbp1 y contra rTbp2 mediante EIA. Los resultados de los estudios de inmunogenia se ilustran en la figura 25.
Ejemplo 13
Este ejemplo ilustra el revelado de los EIA para determinar los anticuerpos contra rTbp1 y contra rTbp2 en los sueros de ratón.
Los títulos de los anticuerpos contra rTbp1 y contra rTbp2 se determinaron esencialmente tal y como describen Panezutti et al. (1993). Los pocillos de microtitulación se recubrieron con 0,5 \mug de rTbp1 o rTbp2, preparadas tal y como se describió en el ejemplo 11, durante 16 horas a temperatura ambiente y, luego, se bloquearon con SAB al 0,1% (p/v) en PBS. Los sueros se diluyeron seriadamente, se añadieron a los pocillos y, luego, se incubaron una hora a temperatura ambiente. Se utilizaron fragmentos F(ab')_{2} purificados por afinidad de anticuerpos IgG anti-ratón (específico de Fc) de ternera conjugados a la peroxidasa de rábano picante como anticuerpo secundario. Las reacciones se revelaron utilizando tetrametilbencidina (TMB/H_{2}O_{2}) y la absorbencia se midió a 450 nm (utilizando 540 nm como la longitud de onda de referencia) en un lector de microplacas Flow Multiskan MCC. El título del reactivo de un antisuero se definió como la inversa de la dilución que muestra de manera coherente un aumento del doble en la absorbencia sobre la obtenida con la muestra de suero preinmunitario.
Ejemplo 14
Este ejemplo ilustra la reactividad cruzada de los antisueros contra Tbp1, producidos mediante la inmunización con la Tbp1 de la Eagan recombinante, con varias cepas del H. influenzae.
Los lisados de células completas de las cepas del H. influenzae cultivadas en medios BHI complementados con NAD y hemo (Harkness et al., 1992) \pm EDDA se separaron mediante gel de SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se rastrearon con antisueros contra la Tbp1 de conejillos de indias generados contra la Tbp1 de la Eagan recombinante purificada (figura 26). Calle 1: BL21/DE3; calle 2: SB12 - EDDA; calle 3: SB12 + EDDA; calle 4, SB29 - EDDA; calle 5: SB29 + EDDA; calle 6, SB33 - EDDA; calle 7: SB33 + EDDA; calle 8: Eagan - EDDA; calle 9: Eagan + EDDA; calle 10: B. catarrhalis 4223 - EDDA; calle 11: B. catarrhalis 4223 + EDDA; calle 12: N. meningitidis 608 - EDDA; calle 13: N. meningitidis 608 + EDDA; calle 14: JB-1476-2-1 inducida que expresa la Tbp1 de la Eagan recombinante; calle 15: marcadores de masa molecular. Bandas de 95 kDa específicas que reaccionaron con el antisuero contra Tbp1 en las calles 3, 4, 5, 7, 8 y 9, que corresponden a las cepas SB12, SB29, SB33 y Eagan del H. influenzae; bandas de 110 kDa específicas en las calles 10 y 11, que corresponden a la cepa 4223 del B. catarrhalis; y bandas de 80 kDa específicas en las calles 12 y 13, que corresponden a la cepa 608 de N. meningitidis.
Ejemplo 15
Este ejemplo ilustra la reactividad cruzada de los antisueros contra Tbp2, producidos mediante la inmunización con la Tbp2 de la Eagan recombinante, con varias cepas del H. influenzae.
Los lisados de células completas de las cepas del H. influenzae cultivadas en medios de BHI complementado con NAD y hemo (Harkness et al., 1992) \pm EDDA se separaron en un gel de SDS PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se rastrearon con antisueros contra Tbp2 de conejillos de indias generados contra la Tbp2 de la Eagan recombinante purificada (figura 27). Calle 1: marcadores de masa molecular; calle 2: JB-1437-4-1 inducida que expresa la Tbp2 de la Eagan recombinante; calle 3: SB12 - EDDA; calle 4: SB12 + EDDA; calle 5: SB29 - EDDA; calle 6: SB29 + EDDA; calle 7: SB30 - EDDA; calle 8: SB30 + EDDA; calle 9: SB32 - EDDA; calle 10: SB33 - EDDA; calle 11: SB33 + EDDA; calle 12: PAK - EDDA; calle 13: PAK + EDDA; calle 14: Eagan - EDDA; calle 15: Eagan + EDDA. Las bandas específicas de aproximadamente 60 a 70 kDa reaccionaron con los antisueros contra la Tbp2 en las calles 3, 6, 7, 8, 13, 14 y 15, que corresponden a las cepas SB12, SB29, SB30, PAK y Eagan de Haemophilus.
Ejemplo 16
Este ejemplo ilustra la síntesis de los péptidos sintéticos que corresponden a las regiones conservadas en Tbp2 y Tbp1.
Se compararon las secuencias de aminoácidos deducidas de Tbp1 y Tbp2 tal y como se muestra en las figuras 14 y 15, respectivamente. Esta comparación identificó las regiones donde se conserva la secuencia de aminoácidos del receptor de la transferrina descrito anteriormente y, tal y como se muestra en las tablas 2 y 3, se sintetizaron péptidos que contienen una porción del receptor de la transferrina. Se puede efectuar tal síntesis mediante la expresión en un hospedador adecuado de vectores recombinantes que contienen un ácido nucleico que codifica dichos péptidos o mediante la síntesis estándar de péptidos.
Brevemente, se sintetizaron péptidos utilizando un sintetizador de péptidos ABI 430A y química de t-Boc optimizada utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante, y se escindieron los péptidos de la resina con ácido fluorhídrico (HF). Los péptidos se purificaron mediante cromatografía líquida de gran resolución de fase inversa (RP-HPLC) en una columna semipreparativa Vydac C4 (1 x 30 cm) con un gradiente de acetonitrilo del 15 al 55% en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% desarrollado durante aproximadamente 40 minutos con una velocidad de flujo de 2 ml/minuto. Todos los péptidos sintéticos utilizados en los estudios bioquímicos e inmunológicos fueron puros a > 95% a juzgar por la HPLC analítica. Los análisis de la composición de aminóacidos se realizaron en un sistema Pico-Tag de Waters y concordaban bien con las composiciones teóricas.
Ejemplo 17
Este ejemplo ilustra la inmunogenia de los péptidos sintéticos en los animales de prueba.
Se inmunizaron conejillos de indias por vía intramuscular con 100 \mug de péptido, se prepararon tal y como se describió en el ejemplo 16, se emulsionaron en el adyuvante completo de Freund el día 0 seguidas de inyecciones de refuerzo los días +14 y + 28 con la misma cantidad de péptido emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. Las muestras de sueros se obtuvieron el día +42 y los títulos de los anticuerpos se determinaron mediante análisis inmunoenzimático (ELISA). Brevemente, los pocillos de microtitulación (Nunc-Immunoplate, Nunc, Dinamarca) se recubrieron con 500 ng de cualquier péptido determinado en 50/\mul de tampón de recubrimiento (Na_{2}CO_{3} a 15 mM, NaHCO_{3} a 35 mM, pH 9,6) durante 16 horas a temperatura ambiente. Luego, las placas se bloquearon con SAB al 0,1% (p/v) en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los antisueros se diluyeron seriadamente, se añadieron a los pocillos y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. Después de retirar los antisueros, se lavaron las placas cinco veces con PBS que contiene Tween-20 al 0,1% (p/v) y SAB al 0,1% (p/v). Los anticuerpos F(ab')_{2} IgG de ternero contra conejillos de indias conjugados con la peroxidasa de rábano picante (Jackson Immuno Research Labs Inc., PA, EE. UU.) se diluyeron (1/8000) con tampón de lavado y se añadieron a las placas de microtitulación. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se lavaron las placas cinco veces con el tampón de lavado. Se revelaron las placas utilizando la tetrametilbencidina (TMB) de sustrato en H_{2}O_{2} (ADI, Toronto, Canada), se paró la reacción con H_{2}SO_{4} a 1 N y se midió la densidad óptica a 450 nm utilizando un Titretek Multiskan II (Flow Labs., Virginia, EE. UU.). Se incluyeron dos péptidos irrelevantes de 32 restos de aminoácidos como controles negativos en estos ELISA. Los análisis se realizaron por triplicado, y el título reactivo de cada antisuero se definió como la dilución que muestra de manera repetitiva un aumento del doble en el valor de la absorbencia sobre los obtenidos a partir de los controles negativos. Los antisueros generados en los conejilos de indias eran monoespecíficos contra el péptido utilizado para la inmunización. Los títulos de los sueros obtenidos después de la inmunización se muestran en la tabla 4.
Los péptidos de la presente invención comprenden copias únicas de cualquiera de los mostrados en las tablas 2 y 3 o péptidos que contienen muchas copias de análogos de los mismos. Además, un péptido puede comprender numerosos péptidos diferentes seleccionados entre los que se muestran en las tablas 2 y 3 o análogos de los mismos e incluye moléculas de vehículo adecuadas. Se prefiere utilizar los péptidos de las regiones conservadas para revelar anticuerpos porque, a continuación, se puede utilizar un inmunoanálisis de unión u otro tipo de análisis de unión para detectar varias especies de Haemophilus. Por lo tanto, las tablas 2 y 3 exponen algunas otras regiones conservadas del receptor de la transferrina para identificar otros péptidos que podrían ser útiles en el diagnóstico, la inmunización y el tratamiento médico.
Ejemplo 18
Este ejemplo describe la capacidad que tienen los antisueros generados contra péptidos que corresponden a las porciones conservadas del receptor de la transferrina para reconocer el receptor de la transferrina de Branhamella catarrhalis.
Se inmunizaron conejillos de indias con el péptido, que corresponde a las porciones conservadas del receptor de la transferrina, y los antisueros obtenidos se describen en el ejemplo 17. Se inmunotransfirió un extracto de células completas de Branhamella catarrhalis con el antisuero específico del péptido que reconoció específicamente el receptor de la transferrina de esta bacteria. El antisuero contra el péptido obtenido de un conejillo de indias inmunizado con el péptido del extremo amino de Tbp1 y con el péptido TBP2-25 reconoció específicamente la proteína Tbp2 de Branhamella catarrhalis y la Tbp2 recombinante expresada por el clon plasmídico pBHIT2 en E. coli. El clon pBHIT2 expresa una versión truncada de Tbp2 que comienza en el aminoácido 80. (a saber, NKKFYSG SEQ ID n.º 105). Por lo tanto, la proteína Tbp2 de pBHIT2 sólo puede ser reconocida por los anticuerpos generados contra el segundo epítopo LEGGFYGP (TBP2-25). Este análisis muestra que los péptidos que corresponden a las secuencias conservadas entre los receptores de la transferrina son útiles para detectar la mayoría, cuando no todas, las bacterias que producen el receptor de la transferrina y como componentes de las composiciones inmunógenas, incluidas las vacunas para producir una respuesta inmunitaria contra el receptor de la transferrina y para proteger frente a las enfermedades causadas por tales bacterias.
Los sueros de estos conejos se probaron mediante ELISA frente a un péptido que incorpora la secuencia LEGGFY
GP (SEQ ID n.º 74) o frente a la Tbp2 de la cepa DL63 del H. influenzae. Se cubrieron las placas de ELISA con el péptido o la proteína y, luego, se bloquearon con leche desnatada al 5%. Varias diluciones seriadas a la mitad de una disolución salina tamponada con fosfato, Tween-20 al 0,05% y leche en polvo al 1% se incubaron en las placas durante dos horas a 37ºC, tras lo cual, se lavaron las placas cinco veces con una disolución salina tamponada con fosfato con Tween-20 al 0,05%. Se rastrearon las placas lavadas con IgG contra conejo, de burro, conjugado con peroxidasa de rábano picante (HR-PO) durante 30 minutos a temperatura ambiente y, luego, se lavaron cinco veces en una disolución salina tamponada con fosfato con Tween-20 al 0,05%. Se añadió el sustrato del HRPO a todos los pocillos durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y, luego, se detuvo la aparición del color añadiendo 50 \mul de ácido sulfúrico a 1 M. Se midió el color determinando la absorbencia a 450 nm.
Ejemplo 19
Este ejemplo ilustra la generación de las cepas del H. influenzae que no producen el receptor de la transferrina.
Se subclonó un fragmento EcoRI de 2,55 kb del inserto de pBHIT1 en el sitio EcoRI de pUC4K, lo que dio lugar a la retirada del casete de la resistencia a la kanamicina de Tn903 (kan) de este vector (pUHIT1; figura 28). Esta etapa de subclonación facilitó la inserción posterior de un fragmento HincII o PstI de pUC4K que contenía el casete kan entre los sitios HindIII o PstI del pUHIT1, puesto que ambos son sitios únicos en esta construcción, para producir pUHIT1KFH y pUHITIKFP (figura 28). Después de la digestión con EcoRI para retirar las secuencias génicas interrumpidas, se introdujeron las construcciones en el genoma del H. influenzae de tipo salvaje mediante transformación, utilizando los medios M-IV tal y como se describió previamente (Barcak et al., 1991), y se seleccionaron los transformantes en agar BHINH que contenían 20 \mug/ml de kanamicina.
Ejemplo 20
Este ejemplo ilustra la construcción de virus de la poliomielitis que expresan un epítopo de un receptor de la transferrina.
Un clon de ADNc con las bases 1175 a 2956 del virus de la poliomielitis de tipo 1, genoma de la cepa Mahoney (PV1-M), se cortó con las enzimas de restricción Saudi y HindIII. Estas enzimas escinden un fragmento que contiene las bases 2754 a 2786, que codifica los aminoácidos de PV1-M 1094 a 1102, tal y como se muestra en la figura 29. En esta solicitud, utilizamos el código de cuatro dígitos para los aminoácidos del virus de la poliomielitis; por ejemplo, 1095 es el aminoácido 95 de la proteína de la cápsida VP1. Se construyeron nuevos clones de ADNc híbrido que codifican tanto secuencias de aminoácidos del virus de la poliomielitis como del receptor de la transferrina mediante el reemplazo del fragmento escindido con oligonucleótidos sintéticos que codifican los aminoácidos de la Tbp2 del H. influenzae. Los nuevos clones de ADNc híbrido se cortaron con las enzimas de restricción NheI y SnaBI, que escinden un fragmento híbrido, incluida la secuencia del ADN del receptor de la transferrina, desde la base 2471 a la 2956 del virus de la poliomielitis. Un clon de ADNc, por ejemplo, pT7XLD o pT7CMCB, del genoma entero de PV1-M se cortó con NheI y SnaBI para escindir un fragmento de la base 2471 a la base 2956 del virus de la poliomielitis. Luego, se reemplazó éste por un fragmento híbrido que incluye la secuencia del ADN del receptor de la transferrina para producir un clon de ADNc híbrido del genoma de PV1-M con las bases 2754 a 2786 reemplazadas por las bases que codifican un bucle BC híbrido que incluye aminoácidos del receptor de la transferrina, tal y como se muestra en la figura 29.
El plásmido pT7XLD y los clones derivados del pT7XLD, como pT7CMCB, contienen una secuencia promotora para la enzima ARN polimerasa de T7 en el extremo 5' del ADNc de PV1-M. Se prepararon transcritos del ARN del ADNc del PV1-M, que incluyían cualesquiera bases que condificaran aminoácidos del receptor de la transferrina, utilizando la ARN polimerasa de T7 tal y como describieron van der Werf et al. La transfección de las células Vero con estos transcritos de ARN produjo cuatro virus híbridos viables, llamados PV1TBP2A, PV1TBP2B, PV1TBP2C y PV1TBP2D. La transfección con transcritos de pT7CMCB produjo un virus de la poliomielitis de tipo salvaje derivado por transfección llamado PV1XLD (figura 29).
Las características antigénicas de PV1TBP2A, PV1TBP2B, PV1TBP2C y PV1TBP2D se muestran en la tabla 5. Todos se neutralizaron con antisueros de conejillos de indias generados contra un péptido que incorpora la secuencia LEGGFYGP (SEQ ID n.º 74), lo que indica que los virus expresaron esta secuencia de una forma antigénicamente reconocible. Para producir los antisueros, se inmunizaron conejillos de indias hembra por vía i. m. con un volumen de 500 \mul que contenían 200 \mug del péptido formulado en fosfato de aluminio (3 mg/ml). Los animales se inmunizaron los días 1, 14, 28 y 42 y se sangraron los días 0, 28, 42 y 56. Los sueros eran del sangrado del día 56. También se neutralizaron PV1TBP2A y PV1TBP2B con los antisueros de conejo generados contra la Tbp2 de la cepa DL63 del H. influenzae, lo que indica que, al menos, estos dos virus expresaron la secuencia de una forma reconocible por los anticuerpos generados contra la proteína. Todos los virus eran neutralizables mediante sueros contra PV1, lo que indica que los cambios en el sitio I antigénico de neutralización del virus de la poliomielitis no habían afectado significativamente otros sitios antigénicos de los virus.
Ejemplo 21
Este ejemplo ilustra el uso de híbridos del virus de la poliomielitis para inducir antisueros de gran titulación contra la Tbp2.
Se inocularon conejos con PV1TBP2A purificado por CsCl (conejos n.º 40, 41, 42). Obsérvese que, aunque los virus utilizados estaban vivos, el virus de la poliomielitis no se replica en los conejos, y que cualquier respuesta observada es realmente la respuesta a un antígeno inactivado. El día 1 se inocularon los conejos por vía subcutánea en la espalda con 1 \mug del virus en adyuvante completo de Freund y, el día 14, se les administró una vacuna de refuerzo con 1 \mug del virus en adyuvante incompleto de Freund inoculada por vía subcutánea en la espalda. Se sangraron los conejos el día 0 (presangrado) y el día 27. La dosis del virus por inoculación era de 2,5 x 10^{8} ufp, que se determinó que era de aproximadamente 3,0 x 10^{11} viriones a partir de los valores de A_{260}. Esto equivale a 0,5 pmol de virus o 30 pmol del epítopo de LEGGFYG (SEQ ID n.º 74), ya que cada virión expresa 60 copias del epítopo.
Compendio de la descripción
En el compendio de esta descripción, la presente invención proporciona moléculas de ADN purificadas y aisladas que contienen genes del receptor de la transferrina, las secuencias de estos genes del receptor de la transferrina y las secuencias de aminoácidos derivadas de las mismas. La invención también proporciona péptidos que corresponden a porciones del receptor de la transferrina. Los genes, secuencias de ADN, proteínas recombinantes y péptidos son útiles para el diagnóstico, la inmunización y la generación de reactivos diagnósticos e inmunitarios. Se pueden preparar vacunas a base de Tbp1 y/o Tbp2 recombinantes expresadas, porciones de las mismas o péptidos derivados de las secuencias proporcionadas para la prevención de enfermedades causadas por patógenos bacterianos que producen el receptor de la transferrina.
TABLA 1
1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Péptidos antigénicos predichos de Tbp1
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Péptidos antigénicos conservados predichos de Tbp2
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Respuestas de los anticuerpos de conejillos de indias frente a los péptidos de Tbp1 y Tbp2
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5 Actividad neutralizante de los sueros contra Tbp2 y contra péptido frente al virus de la poliomielitis híbrido con Tbp2
9
TABLA 6 Títulos de IgG específicos del péptido de los conejos inmunizados con PV1TBP2A o PV1TBP2B
10 
\global\parskip0.900000\baselineskip
Lista de referencias
Barcak et al., (1991) Methods Enzymol. 204: 321-342.
Berkowitz et al., (1987) J. Pediatr. 110: 509.
Black et al., (1991) Pediatr. Infect. Dis. J. 10: 97.
Bluestone, N. (1982) Engl. J. Med. 306: 1399.
Chang et al., (1978) Nature 375: 615.
Chou, et al., (1978). Annual Reviews of Biochemistry 47, 251-276.
Claesson et al., (1989) J. Pediatr. 114: 97.
Cornelissen et al., (1992) J. Bacteriol. 174: 5788.
Danve, et al., (1993). Vaccine 11, 1214-1220.
Deres et al., (1989) Nature 342: 651.
Gerlach, et al., (1992) Infect. Immun. 608: 325.
Goeddel et al., (1979) Nature 281: 544.
Goeddel et al., (1980) Nucl. Acids Res. 8: 4057.
Harkness et al., (1992) J. Bacteriol. 174: 2425.
Holland et al., (1992) Infect. Immun. 60: 2986.
Hopp, T.P. (1986) Journal of Immunological Methods 88, 1-18.
Itakura et al., (1977) Science 198: 1056.
Jarosik et al., (1994). Infection and Immunity 62, 2470-2477.
Legrain et al., (1993). Gene 130: 73.
Lockhoff et al., (1991) Chem. Int. Ed. Engl. 30: 1611.
Mickelsen and Sparling, (1981) Infect. Immun. 33: 555.
Morton et al., (1993) Infection and Immunity 61, 4033-4037.
Murdin et al., (1992) J. Gen. Viral 73: 607.
Murdin et al., (1991) Microbial Pathogenesis 10: 27.
Nixon-George et al., (1990) J. Immunol. 14: 4798.
Ogunnariwo y Schryvers, (1992) Avian Dis. 36: 655.
O'Hagan (1992) Clin Pharmokinet. 22: 1.
Panezutti et al., (1993) Infection and Immunity 61, 1867-1872.
Roosi-Campos et al., (1992) Vaccine 10, 512-518.
Schryvers, (1988) Molec. Microbiol. 2: 467.
Schryvers y Lee, (1989) Can. J. Microbiol. 35: 409.
Schryvers y Gray-Owen, (1992) J. Infect. Dis. 165 supl 1: S103.
Schryvers (1989) Med. Microbiol. 29: 121.
Short et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16: 7583.
Ulmer et al., (1993) Curr. Opinion Invest. Drugs. 2 (9): 983-989.
Van der Werf et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 2330.
Weismuller et al., (1989) Vaccine 8: 29.
Wilton et al., (1993) FEMS Microbiology Letters 107, 59-66.
Patente de los EE.UU n.º 4855283
Patente de los EE.UU n.º 4258029
Patente de los EE.UU n.º 4496538
Patente de los EE.UU n.º 4599230
Patente de los EE.UU n.º 4599231
Patente de los EE.UU n.º 4601903
Patente de los EE.UU n.º 5141743
Patente de los EE.UU n.º 4596792
Patente de los EE.UU n.º 4952496
Patente de los EE.UU n.º 5194254
Solicitud de patente internacional WO 92/17167.

Claims (9)

1. Un péptido que tiene no menos de siete aminoácidos y no más de 150 aminoácidos y que contiene una secuencia de aminoácidos que se conserva entre las bacterias que producen una proteína receptora de la transferrina que comprende TBP-2, siendo dicha secuencia de TBP-2 conservada:
LEGGFYG (SEQ ID n.º 85).
2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y que contiene una secuencia de aminoácidos que es:
LEGGFYGP (SEQ ID n.º 74).
3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho péptido es:
LEGGFYGP (SEQ ID n.º 74) o
LEGGFYG (SEQ ID n.º 85).
4. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho péptido es:
LEGGFYGPKGEELGFRFLAGDKKVFGVFSAK (SEQ ID n.º 50).
5. Una composición inmunógena, que comprende como un componente activo un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
6. Un composición inmunógena de acuerdo con la reivindicación 5, formulada como una vacuna para la administración in vivo para proteger frente a las enfermedades causadas por patógenos bacterianos que producen proteínas receptoras de la transferrina.
7. Una composición inmunógena de acuerdo con la reivindicación 6, formulada como una composición de micropartículas, cápsulas o liposomas.
8. Una composición inmunógena de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que comprende una gran variedad de dichos componentes activos para proporcionar protección frente a las enfermedades causadas por una gran variedad de especies de bacterias que producen la proteína receptora de la transferrina.
9. Un antisuero o un anticuerpo específico contra una secuencia de aminoácidos
LEGGFYG (SEQ ID n.º 85),
LEGGFYGP (SEQ ID n.º 74) o
LEGGFYGPKGEELGFRFLAGDKKVFGVFSAK (SEQ ID n.º 50).
ES95900031T 1993-11-08 1994-11-07 Genes receptores de la transferrina de haemophilus. Expired - Lifetime ES2270420T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14896893A 1993-11-08 1993-11-08
US148968 1993-11-08
US17511693A 1993-12-29 1993-12-29
US175116 1993-12-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2270420T3 true ES2270420T3 (es) 2007-04-01

Family

ID=26846343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES95900031T Expired - Lifetime ES2270420T3 (es) 1993-11-08 1994-11-07 Genes receptores de la transferrina de haemophilus.

Country Status (15)

Country Link
US (8) US6358727B1 (es)
EP (1) EP0728200B1 (es)
JP (1) JPH09506247A (es)
CN (2) CN1267553C (es)
AT (1) ATE338113T1 (es)
AU (1) AU705998B2 (es)
BR (1) BR9408006A (es)
CA (1) CA2175332C (es)
DE (1) DE69434839T2 (es)
DK (1) DK0728200T3 (es)
ES (1) ES2270420T3 (es)
NZ (1) NZ275772A (es)
PT (1) PT728200E (es)
RU (1) RU2194757C2 (es)
WO (1) WO1995013370A1 (es)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5141743A (en) * 1989-04-27 1992-08-25 University Technologies International, Inc. Method for isolating and purifying transferrin and lactoferrin receptor proteins and vaccines containing the same
US6361779B1 (en) 1993-11-08 2002-03-26 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor genes
CA2175332C (en) 1993-11-08 2009-04-07 Sheena M. Loosmore Haemophilus transferrin receptor genes
US6290970B1 (en) * 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US6610506B1 (en) 1995-12-01 2003-08-26 University Technologies International, Inc. Transferrin binding proteins of Pasteurella haemolytica and vaccines containing same
WO1997020934A1 (en) * 1995-12-01 1997-06-12 Lo Reggie Y C Transferrin binding proteins of pasteurella haemolytica and vacc ines containing same
US6440701B1 (en) 1996-03-08 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor genes of Moraxella
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
US6391316B1 (en) 1999-03-10 2002-05-21 University Of Saskatchewan Vaccine compositions comprising Haemophilus somnus transferrin-binding proteins and methods of use
US7241449B1 (en) 1999-04-12 2007-07-10 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor genes of moraxella
US6329178B1 (en) * 2000-01-14 2001-12-11 University Of Washington DNA polymerase mutant having one or more mutations in the active site
KR100673419B1 (ko) * 2000-12-28 2007-01-24 엘지전자 주식회사 전송 시스템 및 데이터 처리 방법
EP1487965A4 (en) 2002-02-25 2006-11-15 Mpex Pharmaceuticals Inc MINI COMPOSITIONS AND METHODS
NZ587398A (en) 2002-08-02 2012-03-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Neisserial bleb preparations and vaccines comprising them
CA2792689A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
PT2646470T (pt) 2010-11-30 2017-05-03 Hoffmann La Roche Anticorpos anti-recetor da transferrina de baixa afinidade e a sua utilização na transferência de scfv terapêuticos através da barreira hematoencefálica
CN103160539A (zh) * 2012-04-13 2013-06-19 郜发宝 一种双报告基因重组腺病毒载体及其构建方法与应用
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
WO2024084497A1 (en) * 2022-10-18 2024-04-25 Serum Institute Of India Pvt. Ltd., Method for manufacturing recombinant transferrin binding proteins and vaccine compositions comrpising same
CN117025462B (zh) * 2023-08-04 2024-02-23 西湖大学 一种降解杀虫剂的肠球菌菌株及其用途

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4258029A (en) 1979-04-23 1981-03-24 Connaught Laboratories Limited Synthetic adjuvants for stimulation of antigenic responses
US4596792A (en) 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
US4496538A (en) 1982-07-06 1985-01-29 Connaught Laboratories, Inc. Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine
US4599230A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599231A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4601903A (en) 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
DE3521994A1 (de) 1985-06-20 1987-01-02 Bayer Ag N-(2-aminoacylamido-2-desoxy-hexosyl)-amide-, -carbamate und -harnstoffe, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in arzneimitteln
US5194254A (en) 1986-05-06 1993-03-16 Connaught Laboratories Limited Enhancement of antigen immunogenicity
US4952498A (en) 1988-05-06 1990-08-28 Waters John R Method and apparatus for detecting microorganism activity
US5141743A (en) 1989-04-27 1992-08-25 University Technologies International, Inc. Method for isolating and purifying transferrin and lactoferrin receptor proteins and vaccines containing the same
AU664365B2 (en) * 1991-04-02 1995-11-16 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Oral delivery systems for microparticles
FR2682041B1 (fr) * 1991-10-03 1994-01-14 Pasteur Merieux Serums Vaccins Vaccin contre les infections a neisseria meningitidis.
FR2682114B1 (fr) * 1991-10-03 1996-02-23 Pasteur Merieux Serums Vacc Vaccin de sous-unite contre les infections a neisseria meningitidis et sous-unites correspondantes a l'etat purifie.
US5417971A (en) * 1991-10-22 1995-05-23 University Of Saskatchewan Vaccines for Actinobacillus pleuropneumoniae
GB9224584D0 (en) * 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
CA2175332C (en) * 1993-11-08 2009-04-07 Sheena M. Loosmore Haemophilus transferrin receptor genes

Also Published As

Publication number Publication date
DE69434839D1 (de) 2006-10-12
PT728200E (pt) 2006-12-29
US5922562A (en) 1999-07-13
US6262016B1 (en) 2001-07-17
US6015688A (en) 2000-01-18
EP0728200B1 (en) 2006-08-30
US6008326A (en) 1999-12-28
ATE338113T1 (de) 2006-09-15
CA2175332A1 (en) 1995-05-18
US5708149A (en) 1998-01-13
CN1990503A (zh) 2007-07-04
CA2175332C (en) 2009-04-07
WO1995013370A1 (en) 1995-05-18
US6358727B1 (en) 2002-03-19
DE69434839T2 (de) 2007-10-25
US5922323A (en) 1999-07-13
DK0728200T3 (da) 2007-01-08
US5922841A (en) 1999-07-13
NZ275772A (en) 1998-04-27
AU8102094A (en) 1995-05-29
BR9408006A (pt) 1996-12-03
CN1141060A (zh) 1997-01-22
AU705998B2 (en) 1999-06-03
CN1267553C (zh) 2006-08-02
EP0728200A1 (en) 1996-08-28
JPH09506247A (ja) 1997-06-24
RU2194757C2 (ru) 2002-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2270420T3 (es) Genes receptores de la transferrina de haemophilus.
RU2141528C1 (ru) Очищенная и изолированная молекула нуклеиновой кислоты, рекомбинантная плазмида, рекомбинантный вектор, очищенный и изолированный белок, очищенный и изолированный белок d 15 наружной мембраны или его часть, синтетический пептид, химерная молекула, иммуногенная композиция и антисыворотка или антитело
JP5566684B2 (ja) Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する、組換え毒素Ａ／毒素Ｂワクチン
ES2199938T3 (es) Fragmentos de adn codificante de las subunidades del receptor de la meningitis neisseria.
US7118749B2 (en) Transferrin receptor genes
US6994854B1 (en) Protective epitopes of adenyl cyclase-haemolysin (AC-Hly), their application to the treatment or to the prevention of bordetella infections
ES2255488T3 (es) Clonacion y expresion de proteinas de union a transferrina de haemophilus somnus.
ES2199460T3 (es) Polipeptidos del virus de la hepatitis b.
KR100394454B1 (ko) 트랜스페린수용체유전자들
JP3516688B6 (ja) トランスフェリン受容体遺伝子
JP2004529601A (ja) 組換えインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質
KR100216390B1 (ko) 헤모필루스 외부막 단백질
THOMAS et al. Sommaire du brevet 2149319
CHONG et al. Patent 2149319 Summary