ES2268763T3 - Seleccion de proteinas usando fusiones de arn-proteina. - Google Patents
Seleccion de proteinas usando fusiones de arn-proteina. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2268763T3 ES2268763T3 ES98904574T ES98904574T ES2268763T3 ES 2268763 T3 ES2268763 T3 ES 2268763T3 ES 98904574 T ES98904574 T ES 98904574T ES 98904574 T ES98904574 T ES 98904574T ES 2268763 T3 ES2268763 T3 ES 2268763T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- rna
- baselineskip
- fusion
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1048—SELEX
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
- C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
- C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Se describen procedimientos y reactivos para la selección de moléculas proteicas que utilizan fundidos de ARN-proteínas.
Description
Selección de proteínas usando fusiones de
ARN-proteína.
La presente invención se refiere a métodos de
selección de proteínas.
La invención se llevó a cabo con el apoyo
gubernamental bajo la concesión F32 GM17776-01 y F32
GM17776-02. El Gobierno tiene determinados derechos
en la invención.
Actualmente existen métodos para el aislamiento
de moléculas de ARN y ADN basados en sus funciones. Por ejemplo, los
experimentos de Ellington y Szostak (Nature 346:818 (1990); y
Nature 355:850 (1992)), y de Tuerk y Gold (Science
249:505 (1990); y J. Mol. Biol. 222:739 (1991)), han
demostrado que se pueden aislar moléculas de ácidos nucleicos muy
raras (es decir, menos de 1 en 10^{13}) con propiedades deseadas a
partir de conjuntos complejos de moléculas mediante rondas repetidas
de selección y amplificación. Estos métodos ofrecen ventajas con
respecto a las selecciones genéticas tradicionales en las que (i) se
pueden identificar sistemáticamente conjuntos candidatos muy grandes
(> 10^{15}), (ii) la viabilidad del hospedante y las
condiciones in vivo no son preocupantes, y (iii) las
selecciones se pueden llevar a cabo incluso si no existe una
identificación sistemática genética in vivo. Además, el
documento EP0962527A describe una molécula que homóloga genotipo y
fenotipo y sus utilizaciones. El poder de la selección in
vitro se ha demostrado definiendo nuevas secuencias de ARN y ADN
con funciones de unión a proteínas muy específicas (véase, por
ejemplo, Tuerk y Gold, Science 249:505 (1990); Irvine et
al., J. Mol. Biol. 222:739 (1991); Oliphant et
al., Mol. Cell Biol. 9:2944 (1989); Blackwell et
al., Science 250:1104 (1990); Pollock y Treisman, Nuc.
Acids Res. 18:6197 (1990); Thiesen y Bach, Nuc. Acids Res.
18:3203 (1990); Bartel et al., Cell 57:529
(1991); Stormo y Yoshioka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5699
(1991); y Bock et al., Nature 355:564 (1992)),
funciones de unión a moléculas pequeñas (Ellington y Szostak, Nature
346:818 (1990); Ellington y Szostak, Nature 355:850
(1992)), y funciones catalíticas (Green et al., Nature
347:406 (1990); Robertson y Joyce, Nature 344:467
(1990); Beaudry y Joyce, Science 257:635 (1992); Bartel y
Szostak, Science 261:1411 (1993); Lorsch y Szostak, Nature
371:31-36 (1994); Cuenoud y Szostak, Nature
375:611-614 (1995); Chapman y Szostak,
Chemistry and Biology 2:325-333 (1995); y
Lohse y Szostak, Nature 381:442-444 (1996)).
No se ha demostrado un esquema similar para la selección y
amplificación de proteínas.
El objetivo de la presente invención es permitir
que se apliquen los principios de selección in vitro y de
evolución in vitro a las proteínas. La invención facilita el
aislamiento de proteínas con propiedades deseadas a partir de
grandes conjuntos de secuencias de aminoácidos parcial o
completamente al azar. Además, la invención resuelve el problema de
recuperar y amplificar la información de la secuencia proteínica
uniendo covalentemente la secuencia que codifica ARNm a la molécula
de proteína.
En general, el método de la invención consiste
en un protocolo de transcripción/traducción in vitro o in
situ que genera una proteína enlazada covalentemente al extremo
3' de su propio ARNm, es decir, una fusión de
ARN-proteína. Esto se logra mediante la síntesis y
la traducción in vitro o in situ de una molécula de
ARNm con un aceptor de péptidos unido a su extremo 3'. Un aceptor
de péptidos preferido es puromicina, un análogo nucleosídico que se
añade al término C de una cadena peptídica en crecimiento, y que
termina la producción. En un diseño preferido, se incluye una
secuencia de ADN entre el extremo del mensaje y el aceptor de
péptidos que se diseña para que el ribosoma se detenga en el
extremo del marco de lectura abierto, proporcionando tiempo
adicional para que el aceptor peptídico (por ejemplo, puromicina)
acepte la cadena peptídica naciente antes de la hidrólisis del
enlace peptidil-
ARNt.
ARNt.
Si se desea, la fusión de
ARN-proteína resultante permite rondas repetidas de
selección y amplificación, debido a que la información de secuencia
proteínica se puede recuperar mediante transcripción inversa y
amplificación (por ejemplo, mediante amplificación por PCR, así
como también mediante cualquier otra técnica de amplificación,
incluyendo técnicas de amplificación a base de ARN, tales como 3SR o
TSA). Después, el ácido nucleico amplificado se puede transcribir,
modificar y traducir in vitro o in situ para generar
fusiones de ARNm-proteína para la siguiente ronda
de selección. La capacidad para llevar a cabo múltiples rondas de
selección y amplificación permite el enriquecimiento y aislamiento
de moléculas muy raras, por ejemplo, una molécula deseada de un
conjunto de 10^{15} miembros. Esto, a su vez, permite el
aislamiento de nuevas proteínas, o proteínas mejoradas, que
reconocen específicamente, de forma virtual, cualquier diana, o que
catalizan reacciones químicas deseadas.
En consecuencia, en un primer aspecto, la
invención se refiere a un método para la selección de una proteína
deseada, que implica las etapas siguientes: (a) proporcionar una
población de moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales
incluye una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de
partida enlazado funcionalmente a una secuencia codificante
proteínica candidata, y cada una de las cuales está enlazada
covalentemente a un aceptor peptídico en el extremo 3' de una
secuencia codificante de proteína candidata; (b) traducir in
vitro o in situ las secuencias codificantes de proteínas
candidatas para producir una población de fusiones de
ARN-proteína candidatas; y (c) seleccionar una
fusión de ARN-proteína deseada, seleccionando de
este modo la proteína deseada.
En un aspecto relacionado, la invención se
refiere a un método para la selección de una molécula de ADN que
codifica una proteína deseada, que implica las etapas siguientes:
(a) proporcionar una población de moléculas de ARN candidatas, cada
una de las cuales incluye una secuencia de iniciación de la
traducción y un codón de partida enlazado funcionalmente a una
secuencia codificante de proteína candidata, y cada una de las
cuales está enlazada covalentemente a un aceptor peptídico en el
extremo 3' de la secuencia codificante de proteína candidata; (b)
traducir in vitro o in situ las secuencias
codificantes de proteínas candidatas para producir una población de
fusiones de ARN-proteína candidatas; (c) seleccionar
una fusión de ARN-proteína deseada; y (d) generar,
a partir de la porción de ARN de la fusión, una molécula de ADN que
codifica la molécula deseada.
En otro aspecto relacionado, la invención se
refiere a un método para la selección de una proteína que tiene una
función alterada con relación a una proteína de referencia, que
implica las etapas siguientes: (a) producir una población de
moléculas de ARN candidatas a partir de una población de moldes de
ADN, teniendo cada uno de los moldes de ADN candidatos una
secuencia codificante de proteína candidata que difiere de la
secuencia codificante de proteína de referencia, comprendiendo cada
una de las moléculas de ARN una secuencia de iniciación de la
traducción y un codón de partida enlazado funcionalmente a la
secuencia codificante de proteína candidata, y estando cada una
enlazada covalentemente a un aceptor peptídico en el extremo 3'; (b)
traducir in vitro o in situ las secuencias
codificantes de proteínas candidatas para producir una población de
fusiones de ARN-proteína candidatas; y (c)
seleccionar una fusión de ARN-proteína que tiene una
función alterada, seleccionando de ese modo la proteína que tiene
la función
alterada.
alterada.
En aún otro aspecto relacionado, la invención se
refiere a un método para la selección de una molécula de ADN que
codifica una proteína que tiene una función alterada con relación a
una proteína de referencia, que implica las etapas siguientes: (a)
producir una población de moléculas de ARN candidatas a partir de
una población de moldes de ADN candidatos, teniendo cada uno de los
moldes de ADN candidatos una secuencia codificante de proteína
candidata que difiere de la secuencia codificante de proteína de
referencia, comprendiendo cada una de las moléculas de ARN una
secuencia de iniciación de la traducción y un codón de partida
enlazado funcionalmente a la secuencia codificante de proteína
candidata, y estando cada una enlazada covalentemente a un aceptor
peptídico en el extremo 3'; (b) traducir in vitro o in
situ las secuencias codificantes de proteínas candidatas para
producir una población de fusiones de ARN-proteína;
(c) seleccionar una fusión de ARN-proteína que tiene
una función alterada; y (d) generar, a partir de la porción de ARN
de la fusión, una molécula de ADN que codifica la proteína que
tiene la función alterada.
En aún otro aspecto relacionado, la invención se
refiere a un método para la selección de un ARN deseado, que
implica las etapas siguientes: (a) proporcionar una población de
moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales incluye una
secuencia de iniciación de la traducción y un codón de partida
enlazado funcionalmente a una secuencia codificante de proteína
candidata, y cada una de las cuales está enlazada covalentemente a
un aceptor peptídico en el extremo 3' de la secuencia codificante de
proteína candidata; (b) traducir in vitro o in situ
las secuencias codificantes de proteínas candidatas para producir
una población de fusiones de ARN-proteínas
candidatas; y (c) seleccionar una fusión de
ARN-proteína deseada, seleccionando de ese modo el
ARN deseado.
En realizaciones preferidas de los métodos
anteriores, el aceptor peptídico es puromicina; cada una de las
moléculas de ARN candidatas incluye además una secuencia de pausa, o
incluye además una secuencia de ADN o de un análogo de ADN enlazada
covalentemente al extremo 3' del ARN; la población de moléculas de
ARN candidatas incluye al menos 10^{9}, preferentemente al menos
10^{10}, más preferentemente al menos 10^{11}, 10^{12}, o
10^{13}, y más preferentemente al menos 10^{14}, moléculas de
ARN diferentes; la reacción de traducción in vitro se lleva
a cabo en un lisado preparado a partir de una célula eucariota o una
porción de la misma (y, por ejemplo, se lleva a cabo en un lisado
reticulocítico o lisado de germen de trigo); la reacción de
traducción in vitro se lleva a cabo en un extracto preparado
a partir de una célula procariota (por ejemplo, E. coli) o
una porción de la misma; la etapa de selección implica unir la
proteína deseada a una pareja de unión inmovilizada; la etapa de
selección implica ensayar una actividad funcional de la proteína
deseada; la molécula de ADN se amplifica; el método implica además
repetir las etapas de los métodos de selección anteriores; el
método implica además transcribir una molécula de ARN a partir de la
molécula de ADN, y repetir las etapas (a) a (d); tras la etapa de
traducción in vitro, el método implica además una etapa de
incubación llevada a cabo en presencia de 50-100 mM
de Mg^{2+}; y la fusión de ARN-proteína incluye
además una secuencia de ácidos nucleicos o una secuencia de
análogos de ácidos nucleicos situada próxima al aceptor peptídico,
lo que aumenta la flexibilidad.
En otros aspectos relacionados, la invención se
refiere a una fusión de ARN-proteína seleccionada
mediante cualquiera de los métodos de la invención; un ácido
ribonucleico enlazado covalentemente a través de un enlace amídico
a una secuencia de aminoácidos, codificándose la secuencia de
aminoácidos mediante el ácido ribonucleico; y un ácido ribonucleico
que incluye una secuencia de iniciación de la traducción y un codón
de partida enlazado funcionalmente a una secuencia codificante de
proteína candidata, estando el ácido ribonucleico enlazado
covalentemente a un aceptor peptídico (por ejemplo, puromicina) en
el extremo 3' de la secuencia codificante de proteína
candidata.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a
un método para la selección de una proteína deseada o de un ARN
deseado a través del enriquecimiento de un conjunto de secuencias.
Este método implica las etapas siguientes: (a) proporcionar una
población de moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales
incluye una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de
partida enlazado funcionalmente a una secuencia codificante de
proteína candidata, y cada una de las cuales está enlazada
covalentemente a un aceptor peptídico en el extremo 3' de la
secuencia codificante de proteína candidata; (b) traducir in
vitro o in situ las secuencias codificantes de proteínas
candidatas para producir una población de fusiones de
ARN-proteína candidatas; (c) poner en contacto la
población de fusiones de ARN-proteína con una pareja
de unión específica para la porción de ARN o para la porción
proteínica de la fusión de ARN-proteína, en
condiciones que separen sustancialmente los complejos de fusión de
ARN-proteína-pareja de unión de los
miembros no unidos de la población; (d) liberar las fusiones de
ARN-proteína unidas de los complejos; y (e) poner en
contacto la población de fusiones de ARN-proteína
de la etapa (d) con una pareja de unión específica para la porción
proteínica de la fusión de ARN-proteína deseada, en
condiciones que separen sustancialmente el complejo de pareja de
unión-fusión de ARN-proteína de
miembros no unidos de dicha población, seleccionando de ese modo la
proteína deseada y el ARN deseado.
En realizaciones preferidas, el método implica
además repetir las etapas (a) a (e). Además, para estas etapas
repetidas, se pueden usar las mismas parejas de unión o diferentes,
en cualquier orden, para el enriquecimiento selectivo de la fusión
de ARN-proteína deseada. En otra realización
preferida, la etapa (d) implica el uso de una pareja de unión (por
ejemplo, un anticuerpo monoclonal) específico para la porción
proteínica de la fusión deseada. Esta etapa se lleva a cabo
preferentemente tras la transcripción inversa de la porción de ARN
de la fusión para generar un ADN que codifica la proteína deseada.
Si se desea, este ADN se puede aislar y/o amplificar mediante PCR.
Esta técnica de enriquecimiento se puede usar para seleccionar una
proteína deseada, o se puede usar para seleccionar una proteína que
tiene una función alterada con relación a una proteína de
referencia.
En otras realizaciones preferidas de los métodos
de enriquecimiento, el aceptor peptídico es puromicina; cada una de
las moléculas de ARN candidatas incluye además una secuencia de
pausa, o incluye además una secuencia de ADN o de análogo de ADN
enlazada covalentemente al extremo 3' del ARN; la población de
moléculas de ARN candidatas incluye al menos 10^{9},
preferentemente al menos 10^{10}, más preferentemente al menos
10^{11}, 10^{12} ó 10^{13}, y más preferentemente al menos
10^{14}, moléculas diferentes de ARN; la reacción de producción
in vitro se lleva a cabo en un lisado preparado a partir de
una célula procariota o una porción de la misma (y, por ejemplo, se
lleva a cabo en un lisado reticulocítico o lisado de germen de
trigo); la reacción de traducción in vitro se lleva a cabo
en un extracto preparado a partir de una célula procariota o una
porción de la misma (por ejemplo, E. coli); se amplifica la
molécula de ADN; al menos una de las parejas de unión se inmoviliza
sobre un soporte sólido; tras la etapa de traducción in
vitro, el método implica además una etapa de incubación llevada
a cabo en presencia de 50-100 mM de Mg^{2+}; y la
fusión de ARN-proteína incluye además una secuencia
de ácidos nucleicos o análogo de ácido nucleico situada próxima al
aceptor peptídico, lo que aumenta la flexibilidad.
En un aspecto relacionado, la invención se
refiere a kits para llevar a cabo cualquiera de los métodos de
selección descritos en la presente memoria.
En un tercer aspecto y último, la invención se
refiere a un microchip que incluye un conjunto de ácidos nucleicos
monocatenarios inmovilizados, hibridándose los ácidos nucleicos con
las fusiones de ARN-proteína. Preferentemente, el
componente proteínico de la fusión de ARN-proteína
está codificado por el ARN.
Como se utiliza en la presente memoria, el
término "población" se refiere a más de una molécula (por
ejemplo, más de una molécula de ARN, ADN, o molécula de fusión de
ARN-proteína). Debido a que los métodos de la
invención facilitan selecciones que comienzan, si se desea, con
grandes números de moléculas candidatas, una "población" según
la invención significa preferentemente más de 10^{9} moléculas,
más preferentemente más de 10^{11}, 10^{12} ó 10^{13}
moléculas, y más preferentemente más de 10^{13} moléculas.
Mediante el término "seleccionar" se hace
referencia sustancialmente a una molécula de otras moléculas en una
población. Como se utiliza en la presente memoria, una etapa de
"selección" proporciona al menos un enriquecimiento de 2
veces, preferentemente un enriquecimiento de 30 veces, más
preferentemente un enriquecimiento de 100 veces, y más
preferentemente un enriquecimiento de 1000 veces, de una molécula
deseada con relación a moléculas no deseadas en una población tras
la etapa de selección. Como se indica en la presente memoria, una
etapa de selección se puede repetir cualquier número de veces, y en
un enfoque dado se pueden combinar diferentes tipos de etapas de
selección.
Mediante el término "proteína" se hace
referencia a cualquiera de dos o más aminoácidos naturales o
modificados, unidos mediante uno o más enlaces peptídicos.
"Proteína" y "péptido" se usan en la presente memoria de
forma intercambiable.
Mediante el término "ARN" se hace
referencia a una secuencia de dos o más ribonucleótidos de origen
natural o modificados, enlazados covalentemente. Un ejemplo de un
ARN modificado, incluido en este término, es ARN fosforotioato.
Mediante la expresión "secuencia de iniciación
de la traducción" se hace referencia a cualquier secuencia que
sea capaz de proporcionar un sitio de entrada de ribosoma funcional.
En sistemas bacterianos, esta región se denomina algunas veces como
una secuencia de Shine-Dalgarno.
Mediante la expresión "codón de partida" se
hace referencia a tres bases que señalan el comienzo de una
secuencia codificante de proteínas. Generalmente, estas bases son
AUG (o ATG); sin embargo, se puede sustituir por cualquier otro
triplete de bases capaz de ser utilizado de esta manera.
Mediante la expresión "enlazado
covalentemente" a un aceptor peptídico se hace referencia a que
el aceptor peptídico está unido a una "secuencia codificante de
proteínas", ya sea directamente a través de un enlace covalente,
o indirectamente a través de otra secuencia enlazada covalentemente
(por ejemplo, ADN que corresponde a un sitio de pausa).
Mediante la expresión "aceptor peptídico"
se hace referencia a cualquier molécula capaz de ser añadida al
término C de una cadena proteínica creciente mediante la actividad
catalítica de la función ribosómica de peptidiltransferasa.
Típicamente, tales moléculas contienen (i) un resto nucleotídico o
similar a nucleótido (por ejemplo, adenosina o un análogo de
adenosina (la dimetilación en la posición amino N-6
es aceptable)), (ii) un resto de aminoácido o similar a aminoácido
(por ejemplo, cualquiera de los 20 aminoácidos D o L, o cualquier
análogo de aminoácido de los mismos (por ejemplo,
O-metiltirosina o cualquiera de los análogos
descritos por Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301,
1991), y (iii) un enlace entre los dos (por ejemplo, un enlace de
éster, de amida o de cetona en la posición 3' o, menos
preferentemente, en la posición 2'); preferentemente, este enlace
no perturba significativamente el plegamiento del anillo de la
conformación del ribonucleótido natural. Los aceptores peptídicos
también pueden poseer un nucleófilo, el cual puede ser, sin
limitación, un grupo amino, un grupo hidroxilo, o un grupo
sulfidrilo. Además, los aceptores peptídicos pueden estar compuestos
de miméticos de nucleótidos, miméticos de aminoácidos, o miméticos
de la estructura combinada de
nucleótido-aminoácido.
Mediante un aceptor peptídico colocado "en el
extremo 3'" de una secuencia codificante de proteínas, se hace
referencia a la molécula del aceptor peptídico está situada tras el
codón final de esa secuencia codificante de proteínas. Este término
incluye, sin limitación, una molécula de aceptor peptídico que está
situada precisamente en el extremo 3' de la secuencia codificante
de proteínas, así como una que está separada del codón final
mediante una secuencia codificante o no codificante interventora
(por ejemplo, una secuencia que corresponde a un sitio de pausa).
Este término también incluye constructos en los que las secuencias
codificantes o no codificantes siguen (esto es, están en 3' con
respecto a) la molécula del aceptor peptídico. Además, este término
comprende, sin limitación, una molécula de aceptor peptídico que
está enlazada covalentemente (ya sea directa o indirectamente a
través de una secuencia de ácidos nucleicos interventora) a la
secuencia codificante de proteínas, así como una que está unida a
la secuencia codificante de proteínas mediante algún medio no
covalente, por ejemplo, a través de la hibridación usando una
segunda secuencia de ácidos nucleicos que se une a o está próxima
al extremo 3' de la secuencia codificante de proteínas, y que ella
misma está unida a una molécula del aceptor peptídico.
Mediante la expresión "función alterada",
se hace referencia a un cambio cualitativo o cuantitativo en la
función de una molécula.
Mediante la expresión "secuencia de pausa",
se hace referencia a una secuencia de ácidos nucleicos que provoca
que un ribosoma ralentice o detenga su velocidad de traducción.
Por la expresión "pareja de unión", tal
como se utiliza en la presente memoria, se hace referencia a
cualquier molécula que tiene una afinidad específica, covalente o
no covalente, por una porción de una fusión de
ARN-proteína deseada. Los ejemplos de parejas de
unión incluyen, sin limitación, miembros de pares
antígeno/anticuerpo, pares proteína/inhibidor, pares
receptor/ligando (por ejemplo, pares receptor de superficie
celular/ligando, tales como pares receptor hormonal/hormona
peptídica), pares enzima/sustrato (por ejemplo, pares
quinasa/sustrato), pares lectina/carbohidrato, agregados
proteínicos oligoméricos o heterooligoméricos, pares proteína de
unión a ADN/sitio de unión a ADN, pares ARN/proteína, y dúplex de
ácidos nucleicos, heterodúplex, o hebras ligadas, así como
cualquier molécula que sea capaz de formar uno o más enlaces
covalentes o no covalentes (por ejemplo, enlaces de disulfuro) con
cualquier porción de una fusión de ARN-proteína. Las
parejas de unión incluyen, sin limitación, cualquiera de los
"motivos de selección" presentados en la Figura 2.
Mediante la expresión "soporte sólido" se
hace referencia, sin limitación, a cualquier columna (o material de
columna), perla, tubo de ensayo, placa de microtitulación, partícula
sólida (por ejemplo, agarosa o sefarosa), microchip (por ejemplo,
silicio, silicio-vidrio, o chip de oro), o membrana
(por ejemplo, la membrana de un liposoma o vesícula), a los que se
puede unir un complejo de afinidad, ya sea directa o indirectamente
(por ejemplo, a través de otros intermedios de parejas de unión
tales como otros anticuerpos o Proteína A), o en los que se puede
embeber el complejo de afinidad (por ejemplo, a través de un
receptor o canal).
La invención reivindicada actualmente
proporciona un número de ventajas significativas. En primer lugar,
es el primer ejemplo de este tipo de esquema para la selección y
amplificación de proteínas. Esta técnica supera el punto muerto
creado por la necesidad de recuperar secuencias nucleotídicas que
corresponden a proteínas aisladas deseadas (puesto que sólo se
pueden replicar los ácidos nucleicos). En particular, muchos métodos
previos que permitían el aislamiento de proteínas a partir de
conjuntos parcial o totalmente aleatorizados lo hacían así a través
de una etapa in vivo. Los métodos de esta clase incluyen
tecnología de anticuerpos monoclonales (Milstein, Sci. Amer.
243:66 (1980); y Schultz et al., J. Chem. Engng. News
68:26 (1990)), la presentación de fagos (Smith, Science
228:1315 (1985); Parmley y Smith, Gene 73:305 (1988);
y McCafferty et al., Nature 348:552 (1990)), las
fusiones de péptido-represor de lac (Cull et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 (1992)), y
selecciones genéticas clásicas. A diferencia de la técnica presente,
cada uno de estos métodos descansa en un enlace topológico entre la
proteína y el ácido nucleico de forma que la información de la
proteína es retenida y se puede recuperar en una forma de ácido
nucleico
legible.
legible.
Además, la presente invención proporciona
ventajas con respecto al método de traducción retrasado (Tuerk y
Gold, Science 249:505 (1990); Irvine et al., J. Mol.
Biol. 222:739 (1991); Korman et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79:1844-1848 (1982); Mattheakis
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:9022-9026 (1994); Mattheakis et
al., Meth. Enzymol. 267:195 (1996); y Hanes y Pluckthun,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937 (1997)), una técnica en
la que la selección se realiza por alguna propiedad de una cadena
proteínica naciente que está aún complejada con el ribosoma y su
ARNm. A diferencia de la técnica de traducción retrasada, el
presente método no descansa en mantener la integridad de un
complejo ternario de ARNm:ribosoma:cadena naciente, un complejo que
es muy frágil y por lo tanto muy limitante con respecto a los tipos
de selecciones que son técnicamente factibles.
El presente método también proporciona ventajas
con respecto al enfoque de síntesis ramificada propuesto por
Brenner y Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:5381-5383 (1992)), en el que se generan
fusiones de ADN-péptido, y la información genética
se recupera teóricamente después de una ronda de selección. A
diferencia del enfoque de síntesis ramificada, el presente método
no requiere la regeneración de un péptido a partir de la porción de
ADN de una fusión (que, en el enfoque de síntesis ramificada,
generalmente se logra mediante rondas individuales de síntesis
química). En consecuencia, el presente método permite rondas
repetidas de selección usando poblaciones de moléculas candidatas.
Además, a diferencia de la técnica de síntesis ramificada, que
generalmente está limitada a la selección de secuencias bastante
cortas, el presente método es aplicable a la selección de moléculas
de proteína de longitud considerable.
En aún otra ventaja, la presente técnica de
selección y de evolución dirigida puede hacer uso de librerías muy
grandes y complejas de secuencias candidatas. Por el contrario, los
métodos de selección de proteínas existentes, que se basan en una
etapa in vivo, están limitados típicamente a librerías
relativamente pequeñas de una complejidad en cierto modo limitada.
Esta ventaja es particularmente importante cuando se seleccionan
secuencias de proteínas funcionales, considerando que, por ejemplo,
existen 10^{13} secuencias posibles para un péptido de sólo 10
aminoácidos de longitud. En las técnicas genéticas clásicas, los
enfoques de fusión del represor de lac, y los métodos de
presentación de fagos, las complejidades máximas generalmente caen
dentro de órdenes de magnitud por debajo de 10^{13} miembros. Un
gran tamaño de librería también proporciona una ventaja para
aplicaciones de evolución dirigida, en las que el espacio de
secuencias se puede explorar hasta una mayor profundidad alrededor
de una secuencia de partida dada.
La presente técnica también difiere de enfoques
anteriores en cuanto a la etapa de selección que depende del
contexto. En muchos otros esquemas de selección, en el contexto en
el que, por ejemplo, está presente una proteína expresada puede
influir profundamente en la naturaleza de la librería generada. Por
ejemplo, una proteína expresada puede que no se exprese
apropiadamente en un sistema particular, o puede que no se presente
apropiadamente (por ejemplo, sobre la superficie de una partícula
fágica). Como alternativa, la expresión de una proteína puede
interferir realmente con una o más etapas críticas en el ciclo de
selección, por ejemplo, viabilidad o infectividad del fago, o unión
al represor de lac. Estos problemas pueden dar como resultado la
pérdida de moléculas funcionales, o limitaciones en la naturaleza de
los procedimientos de selección que se pueden aplicar.
Finalmente, el presente método es ventajoso
debido a que proporciona un control sobre el repertorio de proteínas
que se pueden ensayar. En ciertas técnicas (por ejemplo, selección
de anticuerpos), existe muy poco o ningún control sobre la
naturaleza del conjunto de partida. En aún otras técnicas (por
ejemplo, fusiones de lac y presentación de fagos), el conjunto
candidato se debe de expresar en el contexto de una proteína de
fusión. Por el contrario, los constructos de fusión de
ARN-proteína proporcionan un control sobre la
naturaleza de los conjuntos candidatos disponibles para la
identificación sistemática. Además, el tamaño del conjunto candidato
tiene el potencial de ser tan elevado como los conjuntos de ARN o
ADN (\sim 10^{15} miembros), limitado sólo por el tamaño de la
reacción de traducción in vitro realizada. Y la estructura
del conjunto candidato depende completamente del diseño
experimental; se pueden identificar sistemáticamente regiones al
azar en aislamiento o en el contexto de una proteína de fusión
deseada, y la mayoría, si no todas, de las posibles secuencias se
pueden expresar en conjuntos candidatos de fusiones de
ARN-
proteína.
proteína.
Otras características y ventajas de la invención
se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción
detallada, y a partir de las reivindicaciones.
En primer lugar, se describirán brevemente los
dibujos.
Las Figuras 1A-1C son
representaciones esquemáticas de etapas implicadas en la producción
de fusiones de ARN-proteína. La Figura 1A ilustra
un constructo de ADN de muestra para la generación de una porción de
ARN de una fusión. La Figura 1B ilustra la generación de un
conjugado de ARN/puromicina. Y la Figura 1C ilustra la generación
de una fusión de ARN-proteína.
La Figura 2 es una representación esquemática de
un protocolo de selección generalizado según la invención.
La Figura 3 es una representación esquemática de
un protocolo de síntesis para moldes de traducción mínimos que
contienen 3'-puromicina. La etapa (A) muestra la
adición de grupos protectores a los grupos funcionales reactivos en
la puromicina (5'-OH y NH_{2}); a medida que se
modifican, estos grupos se protegen adecuadamente para uso en la
síntesis de oligonucleótidos a base de fosforamidito. La puromicina
protegida se une a vidrio de poro controlado de aminohexilo (CPG),
a través del grupo 2'OH, usando el protocolo estándar para la unión
de ADN a través de su 3'OH (Gait, Oligonucleotide Synthesis, A
Practical Approach, The Practical Approach Series (IRL Press,
Oxford, 1984)). En la etapa (B), se sintetizó un molde de traducción
mínimo (denominado "43-P"), que contenía 43
nucleótidos, usando una química estándar de ARN y ADN (Millipore,
Bedford, MA), se desprotegió usando NH_{4}OH y TBAF, y se
purificó en gel. El molde contenía 13 bases de ARN en el extremo
5', seguido de 29 bases de ADN unidas a la
3'-puromicina en su 5'OH. La secuencia de ARN
contenía (i) una secuencia de consenso de
Shine-Dalgarno, complementaria a las cinco bases de
16S ARNr (Stormo et al., Nucleic Acids Research
10:2971-2996 (1982); Shine y Dalgarno, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346 (1974); y
Steitz y Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
72:4734-4738 (1975)); (ii) un espaciador de
cinco bases, y (iii) un único codón de partida AUG. La secuencia de
ADN fue dA_{27}dCdCP, en la que "P" es puromicina.
La Figura 4 es una representación esquemática de
un método preferido para la preparación de puromicina enlazada a
CPG protegida.
La Figura 5 es una representación esquemática
que muestra posibles modos de incorporación de metionina en un
molde de la invención. Como se muestra en la reacción (A), el molde
se une al ribosoma, permitiendo la formación del complejo de
iniciación 70S. El ARNt Fmet se une al sitio de P, y su base se
empareja con el molde. La puromicina en el extremo 3' del molde
entra en el sitio A de manera intramolecular, y forma un enlace de
amida con la N-formilmetionina vía el centro de
peptidiltransferasa, desacilando de ese modo el ARNt. La extracción
con fenol/cloroformo de la reacción conduce al molde que tiene la
metionina unida covalentemente. Se muestra en la reacción (B) una
reacción intermolecular no deseada del molde con oligonucleótidos
que contienen puromicina. Como antes, el molde mínimo estimula la
formación del ribosoma 70S que contiene ARNt fmet unido al sitio de
P. Esto es seguido por la entrada de un segundo molde en trans para
dar una metionina unida covalentemente.
Las Figuras 6A-6H son
fotografías que muestran la incorporación de
^{35}S-metionina (^{35}S met) en moldes de
traducción. La Figura 6A demuestra la dependencia de la reacción con
respecto al magnesio (Mg^{2+}). La Figura 6B demuestra la
estabilidad de bases del producto; el cambio en la movilidad
mostrado en esta figura corresponde a una pérdida de la secuencia
5' de ARN de 43-P (también denominado "molde de
Met"), para producir la porción de
ADN-puromicina, denominada 30-P. La
retención del marcador, después del tratamiento con una base, fue
consistente con la formación de un enlace peptídico entre
^{35}S-metionina y la
3'-puromicina del molde. La Figura 6C demuestra la
inhibición de la formación del producto en presencia de inhibidores
de peptidiltransferasa. La Figura 6D demuestra la independencia de
la incorporación de ^{35}S-metionina en una
secuencia que codifica el molde. La Figura 6E demuestra la
dependencia de la longitud del molde de ADN con respecto a la
incorporación de ^{35}S-metionina. La Figura 6F
ilustra la formación del producto cis frente a trans usando moldes
43-P y 25-P. La Figura 6G ilustra la
formación del producto cis frente a trans usando moldes
43-P y 13-P. La Figura 6H ilustra la
formación del producto cis frente a trans usando moldes
43-P y 30-P en un sistema de lisado
reticulocítico.
Las Figuras 7A-7C son
ilustraciones esquemáticas de constructos para ensayar la formación
y selección de fusiones de péptidos. La Figura 7A muestra LP77
("producto ligado", "77" nucleótidos de longitud) (también
denominado "molde myc corto") (SEC ID nº: 1). Esta secuencia
contiene el marcador del epítopo del anticuerpo monoclonal
c-myc EQKLISEEDL (SEC ID nº: 2) (Evan et al.,
Mol. Cell Biol. 5:3610-3616 (1985)), flanqueado por
un codón de partida en 5' y un ligador en 3'. La región de 5'
contiene una secuencia bacteriana de Shine-Dalgarno,
idéntica a la de 43-P. La secuencia codificante se
optimizó para la traducción en sistemas bacterianos. En particular,
las 5'UTR de 43-P y LP77 contenían una secuencia de
Shine-Dalgarno complementaria a cinco bases de ARNr
16S (Steitz y Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
72:4734-4738 (1975)), y espaciada de forma
similar a las secuencias proteínicas ribosómicas (Stormo et
al., Nucleic Acids Res. 10:2971-2996
(1982). La Figura 7B muestra LP154 (producto ligado, 154
nucleótidos de longitud) (también denominado "molde myc largo")
(SEC ID nº: 3). Esta secuencia contiene el código para la
generación del péptido usado para aislar el anticuerpo
c-myc. El extremo 5' contiene una versión truncada
de la secuencia en dirección 5' de TMV (denominada "TE"). Esta
5'UTR contenía una secuencia de 22 nucleótidos derivada de TMV 5'UTR
que comprende dos repeticiones directas ACAAAUUAC (Gallie et
al., Nucl. Acids Res. 16:883 (1988)). La Figura 7C
muestra el conjunto nº 1 (SEC ID nº: 4), una secuencia ejemplar a
usar para la selección de péptidos. Los siete aminoácidos finales
del péptido myc original se incluyeron en el molde para que sirvan
como la región constante 3' requerida para la amplificación
mediante PCR del molde. Esta secuencia no se muestra como parte del
epítopo de unión al anticuerpo.
La Figura 8 es una fotografía que demuestra la
síntesis de fusiones de ARN-proteína usando moldes
43-P, LP77, y LP154, y sistemas de traducción
reticulocíticos ("Retic") y de germen de trigo ("Trigo").
La mitad izquierda de la figura ilustra la incorporación de
^{35}S-metionina en cada uno de los tres moldes.
La mitad derecha de la figura ilustra los productos resultantes
después del tratamiento con ARNasa A de cada uno de los tres moldes
para eliminar la región codificante de ARN; se muestran las fusiones
de ADN-proteína marcadas con
^{35}S-metionina. La porción de ADN de cada una
fue idéntica al oligo 30-P. De este modo, las
diferencias en la movilidad fueron proporcionales a la longitud de
las regiones codificantes, consistente con la existencia de
proteínas de diferente longitud en cada caso.
La Figura 9 es una fotografía que demuestra la
sensibilidad a proteasas de una fusión de
ARN-proteína sintetizada a partir de LP154, y
analizada desnaturalizando mediante electroforesis con gel de
poliacrilamida. La línea 1 contiene 30-P marcada
con ^{32}P. Las líneas 2-4, 5-7 y
8-10 contienen los moldes de traducción marcados
con ^{35}S, recuperados de reacciones con lisados reticulocíticos,
ya sea sin tratamiento, con tratamiento con ARNasa A, o con
tratamiento con ARNasa A y proteinasa K, respectivamente.
La Figura 10 es una fotografía que muestra los
resultados de reacciones de inmunoprecipitación usando la proteína
del epítopo myc de 23 aminoácidos traducida in vitro. Las
líneas 1 y 2 muestran los productos de traducción de la proteína
del epítopo myc y los moldes de \beta-globina,
respectivamente. Las líneas 3-5 muestran los
resultados de la inmunoprecipitación del péptido del epítopo myc
usando un anticuerpo monoclonal c-myc, y tampones
de lavado de PBS, DB y PBSTDS, respectivamente. Las líneas
6-8 muestran las mismas reacciones de
inmunoprecipitación, pero usando el producto de la traducción con
\beta-globina.
La Figura 11 es una fotografía que demuestra la
inmunoprecipitación de la fusión de ARN-proteína a
partir de una reacción de traducción in vitro. Se indican
los picomoles de molde usados en la reacción. Las líneas
1-4 muestran ARN 124 (la porción de ARN de la fusión
LP154), y las líneas 5-7 muestran la fusión de
ARN-proteína LP154. Después de la
inmunoprecipitación usando un anticuerpo monoclonal
c-myc y proteína G-sefarosa, las
muestras se trataron con ARNasa A y con T4 polinucleótido quinasa, y
después se cargaron en un gel de poliacrilamida con urea
desnaturalizante, para visualizar la fusión. En las líneas
1-4, con muestras que no contienen molde o que sólo
contienen la porción de ARN del molde myc largo (RNA124), no se
observó ninguna fusión. En las líneas 5-7, se
visualizan claramente las bandas que corresponden a la fusión. Se
indica la posición de 30-P marcada con ^{32}P, y
se indica en la parte superior de la figura la cantidad de molde
introducido.
La Figura 12 es una gráfica que muestra la
cuantificación del material de fusión obtenido a partir de una
reacción de traducción in vitro. La intensidad de las bandas
de fusión mostradas en las líneas 5-7 de la Figura
11, y la banda de 30-P (aislada de manera paralela
en dT_{25}, no mostrada) se cuantificaron en placas formadoras de
fosfoimágenes, y se representaron gráficamente como una función de
la concentración de entrada de LP154. La 30-P
modificada recuperada (eje y izquierdo) fue linealmente proporcional
al molde de entrada (eje x), mientras que la fusión del
ligador-péptido (eje y derecho) fue constante. A
partir de este análisis, se calculó que se habían formado \sim
10^{12} fusiones por ml de muestra de reacción de traducción.
La Figura 13 es una representación esquemática
de tiopropilsefarosa y dT_{25} agarosa, y la capacidad de estos
sustratos para interactuar con las fusiones de
ARN-proteína de la invención.
La Figura 14 es una fotografía que muestra los
resultados del aislamiento secuencial de fusiones de la invención.
La línea 1 contiene 30-P marcada con ^{32}P. Las
líneas 2 y 3 muestran LP154 aislada de reacciones de traducción y
tratada con ARNasa A. En la línea 2, se aisló secuencialmente LP154
usando tiopropilsefarosa, seguido de dT_{25} agarosa. La línea 3
muestra el aislamiento usando sólo dT_{25} agarosa. Los resultados
indicaron que el producto contenía un tiol libre, probablemente la
penúltima cisteína en la secuencia codificante del epítopo myc.
Las Figuras 15A y 15B son fotografías que
muestran la formación de productos de fusión usando moldes de
\beta-globina según se ensaya mediante
SDS-tricina-PAGE (electroforesis en
gel de poliacrilamida). La Figura 15A muestra la incorporación de
^{35}S sin usar molde (línea 1), usando un molde de
syn-\beta-globina (líneas
2-4), o un molde de
LP-\beta-globina (líneas
5-7). La Figura 15B (líneas etiquetadas como la Fig.
15A) muestra el material marcado con ^{35}S, aislado mediante
cromatografía de afinidad oligonucleotídica. No se aisló ningún
material en ausencia de la cola de 30-P (líneas
2-4).
Las Figuras 16A-16C son
diagramas y fotografías que ilustran el enriquecimiento de ADNds myc
frente a ADNds del conjunto mediante selección in vitro. La
Figura 16A es una representación esquemática del protocolo de
selección. Se tradujeron in vitro cuatro mezclas de los
moldes de myc y del conjunto, y se aislaron en dT_{25} agarosa,
seguido de TP sefarosa para purificar las fusiones del molde de los
moldes no modificados. Las fusiones de ARNm-péptido
se transcribieron de forma inversa entonces para suprimir cualquier
estructura secundaria o terciaria presente en los moldes. Se
retiraron alícuotas de cada mezcla tanto antes (Figura 16B) como
después (Figura 16C) de la selección por afinidad, se amplificaron
mediante PCR en presencia de un cebador marcado, y se digirieron
con una enzima de restricción que rompió sólo el ADN de myc. Las
mezclas de entrada de los moldes fueron myc puro (línea 1), o una
mezcla myc:conjunto 1:20, 1:200 o 1:2000 (líneas
2-4). El material sin seleccionar se desvió de las
relaciones de entrada debido a la traducción preferente y a la
transcripción inversa del molde de myc. El enriquecimiento del
molde de myc durante la etapa selectiva se calculó a partir del
cambio en la relación de conjunto:myc antes y después de la
selección.
La Figura 17 es una fotografía que ilustra la
traducción de moldes de ARN de myc. Se usaron los siguientes
ligadores: líneas 1-4, dA_{27}dCdCp; líneas
5-8, dA_{27}rCrCP; y líneas 9-12,
dA_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP. En cada línea, la
concentración del molde de ARN fue 600 nM, y se usó
^{35}S-Met para el marcaje. Las condiciones de
reacción fueron las siguientes: líneas 1, 5 y 9, 30ºC durante 1
hora; líneas 2, 6 y 10, 30ºC durante 2 horas; líneas 3, 7 y 11,
30ºC durante 1 hora, -20ºC durante 16 horas; y líneas 4, 8 y 12,
30ºC durante 1 hora, -20ºC durante 16 horas con 50 mM de Mg^{2+}.
En esta Figura, "A" representa un péptido libre, y "B"
representa la fusión de ARNm-péptido.
La Figura 18 es una fotografía que ilustra la
traducción de moldes de ARN de myc marcados con ^{32}P. El
ligador utilizado fue dA_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP. La
traducción se realizó a 30ºC durante 90 minutos, y se llevaron a
cabo incubaciones a -20ºC durante 2 días sin Mg^{2+} adicional.
Las concentraciones de los moldes de ARNm fueron 400 nM (línea 3),
200 nM (línea 4), 100 nM (línea 5), y 100 nM (línea 6). La línea 1
muestra la fusión de ARNm-péptido marcada con
^{35}S-Met. La línea 2 muestra ARNm marcado con
^{32}P. En la línea 6, la reacción se llevó a cabo en presencia
de 0,5 mM de análogo de cap.
La Figura 19 es una fotografía que ilustra la
traducción del molde de ARN de myc usando un lisado obtenido de
Ambion (línea 1), Novagen (línea 2), y Amersham (línea 3). El
ligador utilizado fue dA_{27}dCdCP. La concentración del molde
fue 600 nM, y se usó ^{35}S-Met para el marcaje.
Las traducciones se realizaron a 30ºC durante 1 hora, y las
incubaciones se llevaron a cabo a -20ºC toda la noche en presencia
de 50 mM de Mg^{2+}.
Se describe en la presente memoria un método
general para la selección de proteínas con funciones deseadas,
usando fusiones en las que estas proteínas están enlazadas
covalentemente a sus propios ARN mensajeros. Estas fusiones de
ARN-proteína se sintetizan mediante traducción in
vitro o in situ de conjuntos de ARNm que contienen un
aceptor peptídico unido en sus extremos 3' (Figura 1B). En una
realización preferida, después de la lectura del marco de lectura
abierta del mensaje, el ribosoma se detiene cuando alcanza el sitio
de pausa diseñado, y el resto del aceptor ocupa el sitio ribosómico
A y acepta la cadena peptídica naciente procedente del ARNt
peptidílico en el sitio P, para generar la fusión de
ARN-proteína (Figura 1C). El enlace covalente entre
la proteína y el ARN (en forma de un enlace amídico entre el
extremo 3' del ARNm y el término C de la proteína que purifica)
permite que se recupere y amplifique (por ejemplo, mediante PCR) la
información genética en la proteína, seguido de la selección
mediante transcripción inversa del ARN. Una vez que se genera la
fusión, se lleva a cabo la selección o enriquecimiento basándose en
las propiedades de la fusión de ARNm-proteína, o,
como alternativa, se puede llevar a cabo una transcripción inversa
usando el molde de ARNm mientras está unido a la proteína, para
evitar cualquier efecto del ARN monocatenario sobre la selección.
Cuando se usa el constructo de ARNm-proteína, se
pueden estudiar fusiones seleccionadas para determinar qué resto (la
proteína, el ARN, o ambos) proporciona la función deseada.
En una realización preferida, la puromicina (que
se asemeja a la tirosiladenosina) actúa como el aceptor para unir
el péptido en crecimiento a su ARNm. La puromicina es un antibiótico
que actúa terminando el alargamiento del péptido. Como mimético de
aminoacil-ARNt, actúa como un inhibidor universal de
la síntesis de proteínas uniéndose al sitio A, aceptando la cadena
peptídica en crecimiento, y desprendiéndose del ribosoma (a una Kd
= 10^{-4} M) (Traut y Monro, J. Mol. Biol. 10:63 (1964);
Smith et al., J. Mol. Biol. 13:617 (1965)). Una de
las características más atractivas de la puromicina es el hecho de
que forma un enlace amídico estable con la cadena peptídica en
crecimiento, permitiendo de este modo fusiones más estables que los
aceptores potenciales que forman enlaces ésteres inestables. En
particular, la molécula de peptidil-puromicina
contiene una unión amídica estable entre el péptido y la porción de
O-metiltirosina de la puromicina. A su vez, la
O-metiltirosina está enlazada a un enlace amídico
estable al grupo amino en 3' de la porción de adenosina modificada
de puromicina.
Otras elecciones posibles para aceptores
incluyen estructuras semejantes a ARNt en el extremo 3' del ARNm,
así como otros compuestos que actúan de manera similar a la
puromicina. Tales compuestos incluyen, sin limitación, cualquier
compuesto que posea un aminoácido enlazado a una adenina o a un
compuesto similar a adenina, tal como los nucleótidos aminoácidos,
fenilalanil-adenosina (A-Phe),
tirosil-adenosina (A-Tyr), y
alanil-adenosina (A-Ala), así como
estructuras enlazadas mediante amida, tal como
fenilalanil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina,
alanil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina,
y
tirosil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina;
en cualquiera de estos compuestos, se puede utilizar cualquiera de
los L-aminoácidos de origen natural, o sus análogos.
Además, también se puede usar en la invención un conjugado de
puromicina con estructura de 3' similar a ARNt combinado.
Se muestra en la Figura 2 un esquema de
selección preferido según la invención. Las etapas implicadas en
esta selección se llevan a cabo generalmente según lo
siguiente.
Etapa
1
Como una etapa para generar las fusiones de
ARN-proteína de la invención, se sintetiza la
porción de ARN de la fusión. Esto se puede lograr mediante síntesis
de ARN química directa, o, más habitualmente, se logra
transcribiendo un molde de ADN bicatenario apropiado.
Tales moldes de ADN se pueden crear mediante
cualquier técnica estándar (incluyendo cualquier técnica de
tecnología de ADN recombinante, síntesis química, o ambas). En
principio, para este fin, se puede usar cualquier método que
permita la producción de uno o más moldes que contenga una secuencia
conocida, aleatoria, aleatorizada, o mutagenizada. En un enfoque
particular, se sintetiza un oligonucleótido (por ejemplo, que
contiene bases al azar), y se amplifica (por ejemplo, mediante PCR)
antes de la transcripción. También se puede usar la síntesis
química para producir un casete aleatorio que se inserta entonces en
el centro de una secuencia codificante de proteína conocida (véase,
por ejemplo, el capítulo 8.2, Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons y Greene
Publising Company, 1994). Este último enfoque produce una densidad
de mutaciones elevada alrededor de un sitio específico de interés
en la proteína.
Una alternativa a la aleatorización total de una
secuencia de molde de ADN es la aleatorización parcial, y un
conjunto sintetizado de este modo generalmente se denomina como
conjunto "dopado". Un ejemplo de esta técnica, realizada sobre
una secuencia de ARN, se describe, por ejemplo, por Ekland et
al. (Nucl. Acids Research 23:3231 (1995)). La
aleatorización parcial se puede realizar químicamente inclinando las
reacciones de síntesis de tal forma que cada mezcla de reacción de
adición de bases contenga un exceso de una base y pequeñas
cantidades de cada una de las otras; mediante el control cuidadoso
de las concentraciones de las bases, se puede lograr mediante este
enfoque una frecuencia de mutación deseada. Los conjuntos
aleatorizados parcialmente también se pueden generar usando
técnicas de PCR con tendencia al error, por ejemplo como se describe
en Beaudry y Joyce (Science 257:635 (1992)) y Bartel y
Szostak (Science 261:1411 (1993)).
También existen numerosos métodos para generar
un constructo de ADN que comience con una secuencia conocida, y
creando después un conjunto de ADN mutagenizado. Los ejemplos de
tales técnicas se describen en Ausubel et al. (citado
anteriormente, capítulo 8) y Sambrook et al. (Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, capítulo 15, Cold Spring Harbor
Press, Nueva York, 2ª ed. (1989)). Las secuencias al azar también se
pueden generar mediante la técnica de "barajado" representada
en Stemmer (Nature 370:389 (1994)).
Para optimizar un esquema de selección de la
invención, también se pueden alterar las secuencias y estructuras
en los extremos 5' y 3' de un molde. Preferentemente, esto se lleva
a cabo en dos selecciones separadas, que implican cada una la
inserción de dominios al azar en el molde, próximos al extremo
apropiado, seguido de la selección. Estas selecciones pueden servir
(i) para maximizar la cantidad de fusión obtenida (y de este modo
para maximizar la complejidad de una librería), o (ii) para
proporcionar secuencias de traducción optimizadas. Además, el
método puede ser aplicable generalmente, combinada con PCR
mutagénica, a la optimización de moldes de traducción tanto en las
regiones codificantes como no codificantes.
Etapa
2
Como se ha señalado anteriormente, la porción de
ARN de una fusión de ARN-proteína se puede
sintetizar químicamente usando técnicas estándares de síntesis de
oligonucleótidos. Como alternativa, y en particular si se utilizan
secuencias de ARN más largas, la porción de ARN se genera mediante
transcripción in vitro de un molde de ADN. En un enfoque
preferido, se usa T7 polimerasa para generar enzimáticamente la
cadena de ARN. Otras ARN polimerasas apropiadas para este uso
incluyen, sin limitación, las SP6, T3 y ARN de E.coli
polimerasas (descritas, por ejemplo, en Ausubel et al.
(citado anteriormente, capítulo 3). Además, el ARN sintetizado
puede ser, en todo o en parte, ARN modificado. En un ejemplo
particular, se puede producir ARN de fosforotioato (por ejemplo,
mediante transcripción con T7) usando ribonucleótidos modificados y
técnicas estándares. Tal ARN modificado proporciona la ventaja de
ser estable frente a nucleasas.
Etapa
3
Seguidamente, la puromicina (o cualquier otro
aceptor de péptidos apropiado) se enlaza covalentemente a la
secuencia del molde. Esta etapa se puede lograr usando T4 ARN
ligasa, para unir la puromicina directamente a la secuencia de ARN,
o preferentemente la puromicina se puede unir por medio de una
"tablilla" de ADN, usando T4 ADN ligasa o cualquier otra enzima
que sea capaz de unir juntas a dos secuencias nucleotídicas (véase
la Figura 1B) (véase también, por ejemplo, Ausubel et al.,
citado anteriormente, capítulo 3, secciones 14 y 15). También se
pueden usar ARNt sintetasas para unir compuestos similares a
puromicina al ARN. Por ejemplo, la fenilalanil ARNt sintetasa en
laza la fenilalanina a moléculas de fenilalanil-ARNt
que contienen un grupo amino en 3', generando moléculas de ARN con
extremos en 3' similares a puromicina (Fraser y Rich, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 70:2671 (1973)). Otros aceptores peptídicos que se
pueden usar incluyen, sin limitación, cualquier compuesto que posea
un aminoácido enlazado a una adenina o a un compuesto similar a
adenina, tal como los nucleótidos de aminoácidos,
fenilalanil-adenosina (A-Phe),
tirosil-adenosina (A-Tyr), y
alanil-adenosina (A-Ala), así como
estructuras enlazadas mediante amida, tales como
fenilalanil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina,
alanil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina,
y
tirosil-3'-desoxi-3'-aminoadenosina;
en cualquiera de estos compuestos, se puede utilizar cualquiera de
los L-aminoácidos de origen natural, o sus análogos.
En Krayevsky y Kukhanova, Progress in Nucleic Acids Research and
Molecular Biology 23:1 (1979), por ejemplo, se describe un
número de aceptores de péptidos.
Etapa
4
Para generar fusiones de
ARN-proteína, se puede utilizar cualquier sistema de
traducción in vitro o in situ. Como se muestra a
continuación, se prefieren sistemas eucariotas, y dos sistemas
particularmente preferidos incluyen los sistemas de germen de trigo
y de lisado reticulocítico. En principio, sin embargo, en la
invención es útil cualquier sistema de traducción que permita la
formación de una fusión de ARN-proteína, y que no
degrade significativamente la porción de ARN de la fusión. Además,
para reducir la degradación del ARN en cualquiera de estos sistemas,
se pueden incluir en la mezcla de reacción de la traducción
oligonucleótidos antisentido que bloqueen la degradación; tales
oligonucleótidos se hibridan específicamente a, y cubren, secuencias
dentro de la porción de ARN de la molécula que disparan la
degradación (véase, por ejemplo, Hanes y Pluckthun, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94:4937
(1997)).
(1997)).
Como se señala anteriormente, existe, para uso
en la invención, cualquier número de sistemas de traducción
eucariotas. Estos incluyen, sin limitación, lisados de levadura,
ascitis, células tumorales (Leibowitz et al., Meth. Enzymol.
194:536 (1991)), y huevos oocíticos de Xenopus. Los sistemas
de traducción in vitro útiles, procedentes de sistemas
bacterianos, incluyen, sin limitación, aquellos descritos en Zubay
(Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973)); Chen y Zubay (Meth. Enzymol.
101:44 (1983)); y Ellman (Meth. Enzymol. 202:301
(1991)).
Además, las reacciones de traducción se pueden
llevar a cabo in situ. En un ejemplo particular, la
traducción se puede llevar a cabo inyectando ARNm en huevos de
Xenopus, usando técnicas estándares.
Una vez generadas, las fusiones de
ARN-proteína se pueden recuperar de la mezcla de
reacción de la traducción mediante cualquier técnica estándar de
purificación de proteínas o de ARN. Típicamente, se utilizan
técnicas de purificación de proteínas. Como se muestra a
continuación, por ejemplo, la purificación de una fusión se puede
facilitar mediante el uso de reactivos cromatográficos adecuados,
tales como dT_{25} agarosa o tiopropilsefarosa. Sin embargo, la
purificación puede implicar también, o como alternativa, la
purificación a base de la porción de ARN de la fusión; en Ausubel
et al. (citado anteriormente, capítulo 4), por ejemplo, se
describen técnicas para tal purificación.
Etapa
5
La selección de una fusión de
ARN-proteína deseada se puede lograr mediante
cualquier medio disponible para separar o aislar selectivamente una
fusión deseada de una población de fusiones candidatas. Los ejemplos
de técnicas de aislamiento incluyen, pero sin limitación, la unión
selectiva, por ejemplo, a una pareja de unión que se inmoviliza
directa o indirectamente en una columna, perla, membrana, u otro
soporte sólido, y la inmunoprecipitación, usando un anticuerpo
específico para el resto de proteína de la fusión. La primera de
estas técnicas hace uso de un motivo de selección inmovilizado que
consiste en cualquier tipo de molécula a la que es posible unirse.
En la Figura 2 se presenta una lista de posibles moléculas del
motivo de selección. La selección también se puede basar en el uso
de moléculas sustrato unidas a un marcador de afinidad (por ejemplo,
sustrato-biotina), que reacciona con una molécula
candidata, o en cualquier otro tipo de interacción con una molécula
de fusión. Además, las proteínas se pueden seleccionar basándose en
su actividad catalítica, de manera análoga a la descrita por Bartel
y Szostak para el aislamiento de enzimas de ARN (citado
anteriormente); según esa técnica particular, las moléculas deseadas
se seleccionan basándose en su capacidad para unir una molécula
diana a ellas mismas, y las moléculas funcionales se aíslan entonces
basándose en la presencia de esa diana. Mediante la presente
invención, son posibles los esquemas de selección para aislar nuevas
proteínas catalíticas o proteínas catalíticas mejoradas, usando este
mismo enfoque o cualquier otra selección funcional.
Además, como se describe en la presente memoria,
la selección de una fusión de ARN-proteína deseada
(o su copia de ADN) puede estar facilitada mediante el
enriquecimiento para esa fusión en un conjunto de moléculas
candidatas. Para llevar tal enriquecimiento opcional, se pone en
contacto una población de fusiones candidatas de
ARN-proteína con una pareja de unión (por ejemplo,
una de las parejas de unión descritas anteriormente), que es
específica para la porción de ARN o para la porción de proteína de
la fusión, en condiciones que separen sustancialmente el complejo
de pareja de unión-fusión de los miembros no unidos
en la muestra. Esta etapa se puede repetir, y la técnica incluye
preferentemente al menos dos etapas de enriquecimiento secuenciales,
una en la que se seleccionan las fusiones usando una pareja de unión
específica para la porción de ARN, y otra en la que se seleccionan
las fusiones usando una pareja de unión específica para la porción
de proteína. Además, si se repiten las etapas de enriquecimiento que
van dirigidas a la misma porción de la fusión (por ejemplo, la
porción de proteína), preferentemente se utilizan diferentes parejas
de unión. En un ejemplo particular descrito en la presente memoria,
se enriquece una población de moléculas para fusiones deseadas,
usando en primer lugar una pareja de unión específica para la
porción de ARN de la fusión, y, después, en dos etapas
secuenciales, usando dos parejas de unión diferentes, las cuales son
específicas para la porción de proteína de la fusión. Nuevamente,
estos complejos se pueden separar de los componentes de la muestra
mediante cualquier técnica de separación estándar, incluyendo, sin
limitación, la cromatografía de afinidad en columna, la
centrifugación o la inmunoprecipitación.
Además, la elución de una fusión de
ARN-proteína a partir de un complejo de
enriquecimiento (o de selección), se puede lograr mediante un número
de enfoques. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria,
se puede utilizar una etapa de elución química desnaturalizante o no
específica, para aislar una fusión deseada de
ARN-proteína. Tal etapa facilita la liberación de
los componentes del complejo entre sí, o a partir de un soporte
sólido asociado, de una manera relativamente no específica,
rompiendo enlaces no covalentes entre los componentes y/o entre los
componentes y el soporte sólido. Como se describe en la presente
memoria, un reactivo de elución química desnaturalizante o no
específico ejemplar es 4% de HOAc/H_{2}O. Otros reactivos de
elución química desnaturalizantes o no específicos ejemplares
incluyen guanidina, urea, alta concentración de sal, detergente, o
cualquier otro medio mediante el cual se pueden generalmente
eliminar los aductos no covalentes. Como alternativa, se puede
utilizar un enfoque de elución química específico, en el que se
explota un producto químico que provoca la liberación específica de
una molécula de fusión. En un ejemplo particular, si el brazo
ligador de una proteína de fusión deseada contiene uno o más enlaces
de disulfuro, los aptámeros de fusión unidos se pueden eluir
mediante adición, por ejemplo, de DTT, dando como resultado la
reducción del enlace de disulfuro y la liberación de la diana
unida.
Como alternativa, la elución se puede lograr
destruyendo específicamente los complejos de afinidad; tales
técnicas liberan selectivamente los componentes del complejo
mediante adición de un exceso de un miembro del complejo. Por
ejemplo, en una selección de unión a ATP, la elución se realiza
mediante adición de ATP en exceso a la mezcla de incubación.
Finalmente, se puede llevar a cabo una etapa de elución enzimática.
Mediante este enfoque, la propia molécula unida, o una proteasa
añadida exógenamente (u otra enzima hidrolítica apropiada), rompe y
libera la diana o la enzima. En un ejemplo particular, se puede
incluir un sitio de diana de proteasa en cualquiera de los
componentes del complejo, y las moléculas unidas se pueden eluir
mediante adición de la proteasa. Como alternativa, en una selección
catalítica, se puede usar una elución como una etapa de selección
para aislar moléculas capaces de liberarse (por ejemplo, de
escindirse) a partir de un soporte sólido.
Si se desea, se dispone fácilmente de una copia
de ADN de una secuencia de fusión de ARN seleccionada,
transcribiendo de forma inversa esa secuencia de ARN usando
cualquier técnica estándar (por ejemplo, usando transcriptasa
inversa Superscript). Esta etapa se puede llevar a cabo antes de la
etapa de selección o de enriquecimiento (por ejemplo, como se
describe en la Figura 16), o después de esa etapa. Como alternativa,
el proceso de transcripción inversa se puede llevar a cabo antes del
aislamiento de la fusión a partir de la mezcla de traducción in
vitro o in situ.
Después, el molde de ADN se amplifica, ya sea
como una secuencia bicatenaria de longitud parcial o total.
Preferentemente, en esta etapa, se generan moldes de ADN de longitud
total, usando oligonucleótidos apropiados y una amplificación
mediante PCR.
Estas etapas, y los reactivos y técnicas para
llevar a cabo estas etapas, se describe ahora con detalle usando
ejemplos particulares. Estos ejemplos se proporcionan con el fin de
ilustrar la invención, y no se deben de interpretar como
limitantes.
Como se muestra en las Figuras 1A y 2, el
esquema de selección de la presente invención hace uso
preferentemente de moldes de ADN bicatenario que incluyen un número
de elementos de diseño. El primer de estos elementos es un promotor
para ser usado en conjunción con una ARN polimerasa deseada para la
síntesis de ARNm. Como se muestra en la Figura 1A, y como se
describe en la presente memoria, se prefiere el promotor T7, aunque
se puede usar cualquier promotor capaz de dirigir la síntesis a
partir de un ADN bicatenario lineal.
El segundo elemento del molde mostrado en la
Figura 1A se denomina la región no traducida 5' (o 5'UTR), y
corresponde al ARN en dirección 5' del sitio de partida de la
traducción. Se muestra en la Figura 1A una 5'UTR preferida
(denominada "TE"), que es un mutante de supresión de la región
no traducida de 5' del virus del mosaico del tabaco, y, en
particular, corresponde a las bases directamente en 5' del comienzo
de la traducción de TMV; la secuencia de esta UTR es la siguiente:
rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rA (estando
los primeros 3 nucleótidos G insertados para aumentar la
transcripción) (SEC ID nº: 5). Se puede utilizar cualquier otra
5'UTR apropiada (véase, por ejemplo, Kozak, Microbiol. Rev.
47:1 (1983)).
El tercer elemento mostrado en la Figura 1A es
el sitio de partida de la traducción. En general, éste es un codón
AUG. Sin embargo, existen ejemplos en los que se utilizan codones
distintos de AUG en secuencias codificantes de origen natural, y
estos codones también se pueden usar en el esquema de selección de
la invención.
El cuarto elemento en la Figura 1A es el marco
de lectura abierta de la proteína (denominado ORF), que codifica la
secuencia de la proteína. Este marco de lectura abierta puede
codificar cualquier secuencia proteínica de origen natural,
aleatoria, aleatorizada, mutagenizada, o totalmente sintética.
El quinto elemento mostrado en la Figura 1A es
la región constante 3'. Esta secuencia facilita la amplificación
mediante PCR de las secuencias del conjunto, y la ligación del
oligonucleótido que contiene puromicina al ARNm. Si se desea, esta
región puede incluir también un sitio de pausa, una secuencia que
hace que el ribosoma se detenga y permita de ese modo un tiempo
adicional para que un resto aceptor (por ejemplo, puromicina) acepte
una cadena peptídica naciente procedente del
peptidil-ARNt; este sitio de pausa se expone con más
detalle más abajo.
Para desarrollar la presente metodología, se
generaron inicialmente fusiones de ARN-proteína
usando moldes de ARNm muy simplificados, que contienen
1-2 codones. Este enfoque se tomó por dos razones.
En primer lugar, los moldes de este tamaño se podrían obtener
fácilmente mediante síntesis química. Y, en segundo lugar, un marco
de lectura abierta pequeño permitiría que se evaluasen fácilmente
características críticas de la reacción, incluyendo la eficacia del
enlace, la heterogeneidad del extremo, la dependencia del molde, y
la exactitud de la traducción.
Diseño del constructo. Se usó un
constructo básico para generar fusiones de
ARN-proteína de ensayo. La molécula consistió en un
ARNm que contiene una secuencia de Shine-Dalgarno
(SD) para la iniciación de la traducción que contenía una supresión
de 3 bases de la secuencia de SD a partir de la proteína ribosómica
L1 y que fue complementaria con 5 bases del 16S ARNr (es decir,
rGrGrA rGrGrA rCrGrA rA (SEC ID nº: 6) (Stormo et al.,
Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (1982);
Shine y Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
71:1342-1346 (1974); y Steitz y Jakes, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738 (1975)),
(ii) un codón de partida de AUG, (iii) un ligador de ADN que actúa
como un sitio de pausa (es decir, 5'-(dA)_{27}), (iv)
dCdC-3', y (v) una 3'-puromicina
(P). La secuencia poli dA se escogió debido a que se sabe que amolda
mal el ARNt en el sitio A (Morgan et al., J. Mol. Biol.
26:477-497 (1967); Ricker y Kaji, Nucleic
Acid Research 19:6573-6578 (1991)), y se diseñó para
actuar como un buen sitio de pausa. La longitud del ligador de oligo
dA se escogió para expandirse una distancia de
\sim60-70 \ring{A} entre el sitio descodificante
y el centro de transferencia peptidílico del ribosoma. El dCdCP
imitó el extremo de CCA de un ARNt, y se diseñó para facilitar la
unión de la puromicina al sitio A del ribosoma.
Síntesis química del molde mínimo
43-P. Para sintetizar el constructo
43-P (mostrado en la Figura 3), primero se unió
puromicina a un soporte sólido, de tal forma que fuese compatible
con la química de síntesis de oligonucleótidos mediante
fosforamidito estándar. El protocolo de síntesis para este oligo se
esquematiza en la Figura 3, y se describe con más detalle a
continuación. Para unir la puromicina a un soporte sólido de vidrio
de poro controlado (CPG), se protegió el grupo amino con un grupo
trifluoroacetilo como se describe en Applied Biosystems User
Bulletin #49 para el modelo 380 de sintetizador de ADN (1988).
Después, se llevó a cabo la protección del 5'-OH,
usando un enfoque de DMT-Cl estándar (Gait,
Oligonucleotide Synthesis a practical approach The Practical
Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)), y la unión al aminohexil
CPG a través del 2'OH se efectuó exactamente de la misma forma como
se usaría el 3'OH para la unión de un desoxinucleósido (véase la
Fig. 3 y Gait, citado anteriormente, p. 47). La puromicina
protegida enlazada a 5'DMR-CPG es entonces adecuada
para la extensión de la cadena con monómeros de fosforamidito. La
síntesis del oligo transcurrió en la dirección 3' \rightarrow 5'
en el orden: (i) 3' puromicina, (ii) pdCpdC, (iii) \sim27 unidades
de dA como ligador, (iv) AUG, y (v) la secuencia de
Shine-Dalgarno. Más abajo se muestra la secuencia
del constructo de 43-P.
Síntesis de CPG puromicina. La síntesis
de CPG puromicina protegida siguió la ruta general usada para
desoxinucleósidos como se esquematiza previamente (Gait,
Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, The Practical
Approach Series (IRL Press, Oxford, 1984)). Las desviaciones
principales incluyeron la selección de un grupo bloqueante de N
apropiado, la unión en el 2'OH al soporte sólido, y la reacción de
ligación al soporte sólido. En el caso de esta última, la reacción
se llevó a cabo a concentraciones muy bajas de nucleótido activado,
puesto que este material fue significativamente más precioso que el
soporte sólido. El rendimiento resultante (\sim20 \mumoles/g de
soporte) fue bastante satisfactorio, considerando las condiciones de
reacción diluidas.
Síntesis de
N-trifluoroacetil-puromicina.
Primero se convirtieron 267 mg (0,490 mmoles) de puromicina*HCl en
la base libre, disolviendo en agua, añadiendo tampón de carbonato de
pH 11, y extrayendo (3 X) en cloroformo. La fase orgánica se
evaporó hasta sequedad y se pesó (242 mg, 0,513 mmoles). La base
libre se disolvió entonces en 11 ml de piridina seca y 11 ml de
acetonitrilo seco, y se añadieron con agitación 139 \mul (2,0
mmoles) de trietilamina (TEA) y 139 \mul (1,0 mmoles) de
anhídrido trifluoroacético (TFAA). Después se añadió TFAA a la
disolución turbia en alícuotas de 20 \mul, hasta que no quedase
nada del material de partida, según se determina mediante
cromatografía de capa fina (tlc) (93:7, cloroformo/MeOH) (un total
de 280 \mul). La reacción se dejó transcurrir durante una hora.
En este punto, se revelaron dos bandas mediante cromatografía de
capa fina, ambas de una movilidad mayor que el material de partida.
El tratamiento de la reacción con NH_{4}OH y agua redujo el
producto hasta una sola banda. La cromatografía sobre sílice (93:7,
cloroformo/MeOH) produjo 293 mg (0,515 mmoles) del producto,
N-TFA-Pur. En la Figura 4 se muestra
esquemáticamente el producto de esta reacción.
Síntesis de N-trifluoroacetil
5'-DMT puromicina. El producto de la reacción
anterior se dividió en partes alícuotas y se coevaporó 2 X con
piridina seca para eliminar el agua. Se prepararon múltiples tubos
para estudiar las múltiples condiciones de reacción. En una
reacción a pequeña escala, se disolvieron 27,4 mg (48,2 \mumoles)
de N-TFA-Pur en 480 \mul de
piridina que contiene 0,05 eq. de DMAP y 1,4 eq. de TEA. A esta
mezcla se añadieron 20,6 mg de cloruro de tritilo (60 \mumoles),
y la reacción se dejó transcurrir hasta su terminación, con
agitación. La reacción se detuvo mediante adición de un volumen
igual de agua (aproximadamente 500 \mul) a la disolución. Debido
a que esta reacción parece exitosa, se realizó una versión a gran
escala. En particular, se disolvieron 262 mg (0,467 mmoles) de
N-TFA-Pur en 2,4 ml de piridina,
seguido de la adición de 1,4 eq. de TEA, 0,05 eq. de DMAP, y 1,2
eq. de cloruro de tritilo. Después de aproximadamente 2 horas, se
añadieron 50 mg (0,3 eq.) adicionales de dimetoxitritilo*Cl
(DMT*Cl), y la reacción se dejó transcurrir durante 20 minutos
adicionales. La reacción se detuvo mediante adición de 3 ml de agua,
y se coevaporó 3 X con CH_{3}CN. La reacción se purificó mediante
95:5 de cloroformo/MeOH en una columna de sílice (seca) de 100 ml y
2 mm de diámetro. Debido a la purificación incompleta, se utilizó
una segunda columna idéntica con 97,5:2,5 de cloroformo/MeOH. El
rendimiento total fue 325 mg o 0,373 mmoles (o un rendimiento de
72%). En la Figura 4 se muestra esquemáticamente el producto de
esta reacción.
Síntesis de
N-trifluoroacetil, 5'-DMT, 2'
succinilpuromicina. En una reacción a pequeña escala, se
combinaron 32 mg (37 \mumoles) del producto sintetizado
anteriormente con 1,2 eq. de DMAP disuelto en 350 \mul de
piridina. A esta disolución se añadieron 1,2 equivalentes de
anhídrido succínico en 44 \mul de CH_{3}CN seco, y se dejó
agitar toda la noche. La cromatografía de capa fina reveló que
quedaba poco material de partida. En una reacción a gran escala, se
combinaron 292 mg (336 \mumoles) del producto previo con 1,2 eq.
de DMAP en 3 ml de piridina. A esto, se añadieron 403 \mul de
anhídrido succínico 1 M en CH_{3}CN seco, y la mezcla se dejó
agitar toda la noche. La cromatografía de capa fina reveló
nuevamente que quedaba poco material de partida. Las dos reacciones
se combinaron, y se añadieron 0,2 eq. adicionales de DMAP y de
succinato. El producto se coevaporó con tolueno 1 X, y se secó
hasta una espuma amarilla a alto vacío. Se añadió CH_{2}Cl_{2}
(20 ml), y esta disolución se extrajo dos veces con 15 ml de ácido
cítrico al 10% enfriado en hielo, y después dos veces con agua
pura. El producto se secó, se redisolvió en 2 ml de
CH_{2}Cl_{2}, y se precipitó mediante adición de 50 ml de
hexano con agitación. Después, el producto se sometió a remolino, y
se centrifugó a 600 rpm durante 10 minutos en la centrífuga
clínica. La mayoría del eluyente se extrajo por eliminación, y el
resto del producto se secó, primero a bajo vacío, y después a alto
vacío en un secador. El rendimiento de esta reacción fue
aproximadamente 260 micromoles para un rendimiento por etapas de
\sim70%.
Síntesis de N-trifluoroacetil
5'-DMT, 2' succinil, CPG puromicina. El producto
de la etapa previa se disolvió después con 1 ml de dioxano, seguido
de 0,2 ml de dioxano/0,2 ml de piridina. A esta disolución, se
añadieron 40 mg de p-nitrofenol y 140 mg de
diciclohexilcarbodiimida (DCC), y la reacción se dejó transcurrir
durante 2 horas. La ciclohexilurea insoluble producida por la
reacción se eliminó por centrifugación, y la disolución del
producto se añadió a 5 g de vidrio de poro controlado aminohexílico
(CPG) suspendido en 22 ml de DMF seca, y se agitó toda la noche. La
resina se lavó entonces con DMF, con metanol y con éter, y se secó.
Se vio que la resina resultante contenía 22,6 \mumoles de tritilo
por g, una cantidad bastante bien dentro del intervalo aceptable
para este tipo de soporte. El soporte se encapsuló entonces mediante
incubación con 15 ml de piridina, 1 ml de anhídrido acético, y 60
mg de DMAP, durante 30 minutos. El material de columna resultante
produjo un ensayo negativo de ninhidrina (sin color), en contraste
con los resultados obtenidos antes de bloquear, en los que el
material produjo una reacción de color azul oscuro intenso. En la
Figura 4 se muestra esquemáticamente el producto de esta
reacción.
Síntesis del conjugado de
ARNm-puromicina. Como se explica anteriormente,
se puede usar un oligo restringido con puromicina en cualquiera de
dos formas, para generar un conjugado de
ARNm-puromicina que actúa como un molde de
traducción. Para marcos de lectura abierta extremadamente cortos, el
oligo de puromicina típicamente se extiende químicamente con
monómeros de ARN o ADN para crear un molde totalmente sintético.
Cuando se desean marcos de lectura abierta más grandes, el oligo de
ARN o de ADN generalmente se liga al extremo 3' de un ARNm usando
una tablilla de ADN y una T4 ADN ligasa como se describe por Moore y
Sharp (Science 256:992 (1992)).
Los moldes generados anteriormente se tradujeron
in vitro usando sistemas de traducción in vitro tanto
bacterianos como eucariotas, según lo siguiente.
Traducción in vitro de moldes
mínimos. Se añadieron 43-P y conjugados
relacionados de ARN-puromicina a varios sistemas de
traducción in vitro diferentes, incluyendo: (i) el sistema
S30 derivado de E.coli MRE600 (Zubay, Ann. Rev. Genet. 7:267
(1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen y Zubay, Methods
Enzymol. 101:44 (1983); Pratt, en Transcription and
Translation: A Practical Approach, B. D. Hammes, S. J. Higgins, Eds.
(IRL Press, Oxford, 1984) p. 179-209; y Ellman
et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991), preparado
como se describe por Ellman et al. (Methods Enzymol.
202:301 (1991); (ii) la fracción ribosómica derivada de la
misma cepa, preparada como se describe por Kudlicki et al.
(Anal. Chem. 206:389 (1992)); y (iii) el sistema S30 derivado
de E.coli BL21, preparado como se describe por Lesley et
al. (J. Biol. Chem. 266:2632 (1991)). En cada caso, la
premezcla usada fue la de Lesley et al. (J. Biol. Chem.
266:2632 (1991)), y las incubaciones tuvieron 30 minutos de
duración.
Ensayo de la naturaleza de la fusión. El
molde de 43-P se evaluó primero usando extractos de
traducción de S30 a partir de E.coli. La Figura 5 (reacción
"A") demuestra la reacción intramolecular (cis) deseada, en la
que 43-P se une al ribosoma y actúa como un molde
para, y como un aceptor de, fMet, al mismo tiempo. En primer lugar,
se estudió la incorporación de ^{35}S-metionina y
su posición en el molde, y los resultados se muestran en las
Figuras 6A y 6B. Después de la extracción de la mezcla de reacción
de traducción in vitro con fenol/cloroformo, y el análisis
de los productos mediante SDS-PAGE, apareció una
banda marcada con ^{35}S con la misma movilidad que el molde de
43-P. La cantidad de este material sintetizado
dependió de la concentración de Mg^{2+} (Figura 6A). Parece que
la concentración de Mg^{2+} óptima está entre 9 y 18 mM, que fue
similar al óptimo para la traducción en este sistema (Zubay, Ann.
Rev. Genet. 7:267 (1973); Collins, Gene 6:29 (1979); Chen y
Zubay, Methods Enzymol, 101:44 (1983); Pratt, en
Transcription and Translation: A Practical Approach, B. D. Hammes,
S. J. Higgins, Eds. (IRL Press, Oxford, 1984) p.
179-209; Ellman et al., Methods Enzymol.
202:301 (1991); Kudlicki et al., Anal. Chem.
206:389 (1992); y Lesley et al., J. Biol. Chem.
266:2632 (1991)). Además, el marcador incorporado fue
estable al tratamiento con NH_{4}OH (Figura 6B), indicando que el
marcador estaba localizado en la mitad 3' de la molécula (la
porción de ADN estable a bases), y que
estaba unido mediante un enlace estable a bases, como es de esperar para un enlace amídico entre puromicina y fMet.
estaba unido mediante un enlace estable a bases, como es de esperar para un enlace amídico entre puromicina y fMet.
Dependencia del ribosoma y del molde.
Para demostrar que la reacción observada anteriormente ocurrió en el
ribosoma, se estudiaron (Figura 6C) los efectos de inhibidores
específicos de la función de peptidiltransferasa del ribosoma, y se
examinó el efecto del cambio de la secuencia que codifica la
metionina (Figura 6D). La Figura 6C demuestra claramente que la
reacción se inhibió fuertemente mediante los inhibidores de
peptidiltransferasa, virginiamicina, gougerotina, y cloranfenicol
(Monro y Vazquez, J. Mol. Biol. 28:161-165
(1967); y Vazquez y Monro, Biochemica et Biophysical Acta
142:155-173 (1967)). La Figura 6D demuestra
que el cambio de una única base en el molde, de A a C, abolió la
incorporación de ^{35}S-metionina a 9 mM de
Mg^{2+}, y la redujo enormemente a 18 mM (consistente con el
hecho de que niveles elevados de Mg^{2+} permiten que se
interprete mal el mensaje). Estos experimentos demostraron que la
reacción ocurrió en el ribosoma, de una manera dependiente del
molde.
Longitud del ligador. También se estudió
la dependencia de la reacción con la longitud del ligador (Figura
6E). El molde original se diseñó de forma que el ligador se extendió
la distancia desde el sitio descodificante (ocupado por el AUG del
molde) hasta el sitio del aceptor (ocupado por el resto de
puromicina), una distancia que fue aproximadamente la misma
longitud que la distancia entre el bucle anticodón y el tallo del
aceptor en un ARNt, o alrededor de 60-70
\ring{A}. El primer ligador estudiado tenía 30 nucleótidos de
longitud, basado en un mínimo de 3,4 \ring{A} por base (\geq
102 \ring{A}). En el intervalo entre 30 y 21 nucleótidos (n =
27-18; longitud \geq102-71
\ring{A}), se observó poco cambio en la eficacia de la reacción.
En consecuencia, se puede variar la longitud del ligador. Aunque un
ligador entre 21 y 30 nucleótidos representa una longitud preferida,
también se pueden utilizar en la invención ligadores más cortos de
80 nucleótidos, y, preferentemente, más cortos de 45
nucleótidos.
Reacciones intramoleculares frente a las
intermoleculares. Finalmente, se estudió si la reacción ocurrió
de una manera intramolecular (Figura 5, Reacción "A"), según
se desea, o intermolecularmente (Figura 5, Reacción "B"). Esto
se estudió añadiendo oligonucleótidos con 3' puromicina, pero sin la
secuencia de unión a ribosoma (es decir, los moldes
25-P, 13-P y 30-P) a
las reacciones de traducción que contienen el molde de
43-P (Figuras 6F, 6G y 6H). Si la reacción ocurrió
mediante un mecanismo intermolecular, también se deberían de marcar
los oligos más cortos. Como se demuestra en las Figuras
6F-H, hubo muy poca incorporación de
^{35}S-metionina en los tres oligos más cortos,
indicando que la reacción ocurrió principalmente de manera
intramolecular. A continuación se muestran las secuencias de
25-P (SEC ID nº: 10), 13-P (SEC ID
nº: 9), y 30-P (SEC ID nº: 8).
Lisado reticulocítico. La Figura 6H
demuestra que la ^{35}S-metionina se puede
incorporar en el molde de 43-P usando un lisado
reticulocítico de conejo (véase más abajo) para la traducción in
vitro, además de los lisados de E.coli usados
anteriormente. Esta reacción ocurrió principalmente en un mecanismo
intramolecular, según se desea.
También se generaron fusiones ejemplares que
contenían, dentro de la porción proteínica, el marcador del epítopo
para el anticuerpo monoclonal c-myc 9E10 (Evan et
al., Mol. Cell Biol. 5:3610 (1985)).
Diseño de los moldes. Se diseñaron tres
moldes de marcador de epítopo iniciales (es decir, LP77, LP154, y
el Conjunto nº 1), y se muestran en las Figuras
7A-C. Los dos primeros moldes contenían la secuencia
EQKLISEEDL (SEC ID nº: 2) del marcador del epítopo de
c-myc, y el tercer molde fue el diseño usado en la
síntesis de un conjunto de selección al azar. LP77 codificó una
secuencia de 12 aminoácidos, con los codones optimizados para la
traducción bacteriana. LP154 y sus derivados contenían una secuencia
de ARNm de 33 aminoácidos, en la que los codones se optimizaron
para la traducción eucariota. La secuencia de aminoácidos codificada
de MAEEQKLISEEDLLRKRREQKLKHKLEQLRNSCA (SEC ID nº: 7) correspondió
al péptido original usado para aislar el anticuerpo 9E10. El
Conjunto nº 1 contenía 27 codones de NNG/C (para generar péptidos al
azar) seguido de una secuencia que corresponde a los últimos 7
aminoácidos del péptido myc (que no son parte de la secuencia del
epítopo de myc). Más abajo se muestran estas secuencias.
Sistemas de traducción in vitro
reticulocítico frente a germen de trigo. Los moldes
43-P, LP77 y LP154 se evaluaron en sistemas de
traducción tanto de reticulocito de conejo como de extracto de
germen de trigo (Promega, Boehringer Mannheim) (Figura 8). Las
traducciones se realizaron a 30ºC durante 60 minutos. Los moldes se
aislaron usando dT_{25} agarosa a 4ºC. Los moldes se eluyeron a
partir de la agarosa usando 15 mM de NaOH, 1 mM de EDTA, se
neutralizaron con tampón de NaOAc/HOAc, se precipitaron
inmediatamente con etanol (2,5-3 vol.), se lavaron
(con etanol al 100%), y se secaron en un concentrador Speedvac. La
Figura 8 muestra que la ^{35}S-metionina se
incorporó en los tres moldes, tanto en el sistema de germen de trigo
como en el reticulocítico. Se observó menos degradación del molde
en las reacciones de fusión del sistema reticulocítico y, en
consecuencia, se prefiere este sistema para la generación de
fusiones de ARN-proteína. Además, en general, se
prefieren los sistemas eucariotas con respecto a los sistemas
bacterianos. Debido a que las células eucariotas tienden a contener
niveles más bajos de nucleasas, la vida media del ARNm generalmente
es 10-100 veces más larga en estas células que en
las células bacterianas. En los experimentos que usan un sistema de
traducción de E. coli particular, no se observó generación de
fusiones usando un molde según el epítopo de c-myc;
el marcaje del molde en diversos lugares demostró que esto es
probablemente debido a la degradación tanto de las porciones de ARN
como de ADN del molde.
Para examinar la porción peptídica de estas
fusiones, las muestras se trataron con ARNasa para eliminar las
secuencias codificantes. Tras este tratamiento, el producto de
43-P tuvo una movilidad casi idéntica a la del
oligo 30-P marcado con ^{32}P, consistente con un
péptido muy pequeño (quizá sólo metionina) añadido a
30-P. Para LP77, la eliminación de la secuencia
codificante produjo un producto con una movilidad menor que la del
oligo 30-P, consistente con la noción de que se
añadió a la puromicina un péptido de 12 aminoácidos. Finalmente,
para LP154, la eliminación de la secuencia codificante produjo un
producto de una movilidad aún menor, consistente con una secuencia
de 33 aminoácidos unida al oligo de 30-P. No se
observó ningún oligo en la línea de reticulocito de LP154 tratado
con ARNasa, debido a un error de carga. En la Figura 9, se observa
que la movilidad de este producto es la misma que la del producto
generado en el extracto de germen de trigo. En resumen, estos
resultados indican que los productos resistentes a ARNasa se
añadieron a los extremos de los oligos de 30-P, que
los tamaños de los productos fueron proporcionales a la longitud de
las secuencias codificantes, y que los productos fueron bastante
homogéneos en tamaño. Además, aunque ambos sistemas produjeron
productos de fusión similares, el sistema reticulocítico parece ser
superior debido a una mayor estabilidad del molde.
Sensibilidad a ARNasa A y a proteinasa K.
En la Figura 9, se estudió la sensibilidad a ARNasa A y proteinasa
K usando la fusión LP154. Como se muestra en las líneas
2-4, se demostró la incorporación de
^{35}S-metionina para el molde de LP154. Cuando
este producto se trató con ARNasa A, disminuyó la movilidad de la
fusión, pero aún fue significativamente mayor que la del
oligonucleótido de 30-P marcado con ^{32}P,
consistente con la adición de un péptido de 33 aminoácidos al
extremo 3'. Cuando este material también se trató con proteinasa K,
la señal de ^{35}S desapareció completamente, nuevamente
consistente con la noción de que el marcador estaba presente en un
péptido en el extremo 3' del fragmento de 30-P. Se
han obtenido resultados similares en experimentos equivalentes
usando las fusiones de 43-P y LP77.
Para confirmar que el marcaje del molde mediante
^{35}S-Met fue una consecuencia de la traducción,
y más específicamente resultó de la actividad de
peptidiltransferasa del ribosoma, se examinó el efecto de diversos
inhibidores sobre la reacción de marcaje. Los inhibidores
específicos de peptidiltransferasa eucariota, anisomicina,
gougerotina y esparsomicina (Vazquez, Inhibitors of Protein
Biosynthesis (Springer-Verlag, Nueva York), p.
312 (1979)), así como los inhibidores de la translocación
cicloheximida y emetina (Vazquez, Inhibitors of Protein
Biosynthesis (Springer-Verlag, Nueva York), p.
312 (1979)), disminuyeron todos la formación de la fusión de
ARN-péptido en un \sim95% usando el molde de myc
largo y un extracto de traducción de lisado de reticulocito.
Experimentos de inmunoprecipitación. En
un experimento diseñado para ilustrar la eficacia de
inmunoprecipitar una fusión de ARNm-péptido, se
hizo el intento de inmunoprecipitar un péptido de
c-myc libre generado mediante traducción in
vitro. La Figura 10 muestra los resultados de estos experimentos
evaluados en un gel peptídico de SDS-PAGE. Las
líneas 1 y 2 muestran el material marcado procedente de las
reacciones de traducción que contiene RNA124 (la porción de ARN de
LP154) o ARNm de \beta-globina. Las líneas
3-8 muestran la inmunoprecipitación de estas
muestras de reacción usando el anticuerpo monoclonal de
c-myc 9E10, en varias condiciones de tampón
diferentes (descritas más abajo). Las líneas 3-5
muestran que el péptido derivado de RNA124 fue inmunoprecipitado de
forma eficaz, siendo el mejor caso la línea 4, en la que se aislaron
el \sim83% de los recuentos precipitables de TCA totales. Las
líneas 6-8 muestran poca proteína de
\beta-globina, indicando una purificación de
>100 veces. Estos resultados indicaron que el pép-
tido codificado por RNA124 (y por LP154) se aisló cuantitativamente mediante este protocolo de inmunoprecipitación.
tido codificado por RNA124 (y por LP154) se aisló cuantitativamente mediante este protocolo de inmunoprecipitación.
Inmunoprecipitación de la fusión. Después
se estudió la capacidad para inmunoprecipitar un producto de
ARN-péptido quimérico, usando una reacción de
traducción de LP154 y el anticuerpo monoclonal de
c-myc 9E10 (Figura 11). Los productos de la
traducción procedentes de una reacción reticulocítica se aislaron
mediante inmunoprecipitación (como se describe en la presente
memoria), y se trataron con 1 \mug de ARNasa A a temperatura
ambiente durante 30 minutos, para eliminar la secuencia
codificante. Esto generó un 5'OH, que se marcó con ^{32}P con T4
polinucleótido quinasa, y se evaluó mediante PAGE desnaturalizante.
La Figura 11 demuestra que se aisló un producto con una movilidad
similar a la observada para la fusión del epítopo de
c-myc con 30-P generado mediante
tratamiento con ARNasa de la fusión de LP154 (véase lo anterior),
pero no se obtuvo ningún producto correspondiente cuando se tradujo
sólo la porción de ARN del molde (RNA124). En la Figura 12, se
determinó la cantidad de proteína de fusión aislada, y se
representó gráficamente frente a la cantidad de 30-P
no modificado (no mostrado en esta figura). La cuantificación de la
relación de ligador no modificado a fusión de
ligador-péptido de myc muestra que
0,2-0,7% del mensaje de entrada se convirtió en
producto de fusión. Una fracción mayor del ARN de entrada se
convirtió en producto de fusión en presencia de una mayor relación
de ribosoma/molde; del intervalo de concentraciones de ARNm de
entrada que se estudiaron, se obtuvieron aproximadamente
0,8-1,0 x 10^{12} moléculas de fusión por ml de
extracto de traducción.
Además, los resultados indicaron que los
péptidos unidos a la especie de ARN fueron codificados por ese ARNm,
es decir, el péptido naciente no se transfirió a la puromicina de
algún otro ARNm. No se observó ninguna indicación de transferencia
cruzada cuando se coincubó un ligador (30-P) con el
molde de myc largo en extractos de traducción en relaciones tal
altas como 20:1, ni la presencia del ligador libre disminuyó
significativamente la cantidad de fusión de myc larga producida. De
forma similar, la cotraducción de los moldes corto y largo,
43-P y LP154, produjo sólo los productos de fusión
observados cuando los moldes se tradujeron solos, y no se observaron
productos de movilidad intermedia, como sería de esperar para la
fusión del molde corto con el péptido de myc largo. Ambos
resultados sugieren que la
formación de la fusión se produjo principalmente entre un péptido naciente y un ARNm unido al mismo ribosoma.
formación de la fusión se produjo principalmente entre un péptido naciente y un ARNm unido al mismo ribosoma.
Aislamiento secuencial. Como una
confirmación adicional de la naturaleza del producto del molde de
LP154 traducido in vitro, se examinó el comportamiento de
este producto en dos tipos diferentes de medios cromatográficos. La
tiopropil (TP) sefarosa permite el aislamiento de un producto que
contiene una cisteína libre (por ejemplo, el producto de LP154 que
tiene un resto de cisteína adyacente al término C) (Figura 13). De
forma similar, dT_{25} agarosa permite el aislamiento de moldes
que contienen una secuencia poli dA (por ejemplo,
30-P) (Figura 13). La Figura 14 demuestra que el
aislamiento secuencial en TP sefarosa, seguido de dT_{25} agarosa,
produjo el mismo producto que el aislamiento en dT_{25} agarosa
solo. El hecho de que el producto de la traducción in vitro
contenía tanto un tramo poli-A y un tiol libre
indica fuertemente que el producto de traducción era la fusión
deseada de ARN-péptido.
Los resultados anteriores son consistentes con
la capacidad para sintetizar fusiones de
ARNm-péptido, y para recuperarlas intactas a partir
de extractos de traducción in vitro. Las porciones peptídicas
de las fusiones así sintetizadas parece que tienen las secuencias
pretendidas, según se demuestra mediante inmunoprecipitación y
aislamiento usando técnicas cromatográficas apropiadas. Según los
resultados presentados anteriormente, las reacciones son
intramoleculares y ocurren de una manera dependiente del molde.
Finalmente, incluso con una modificación del molde de menos de 1%,
el presente sistema facilita selecciones basadas en complejidades
candidatas de alrededor de 10^{13} moléculas.
Selección de la recuperación del epítopo
c-myc. Para seleccionar epítopos de
c-myc adicionales, se generó una gran librería de
moldes de traducción (por ejemplo, 10^{15} miembros), que contiene
una región aleatorizada (véase la Figura 7C, y a continuación).
Esta librería se usó para generar
\sim10^{12}-10^{13} fusiones (como se
describe en la presente memoria), que se tratan con el anticuerpo
anti-c-myc (por ejemplo, mediante
inmunoprecipitación o usando un anticuerpo inmovilizado en una
columna u otro soporte sólido) para enriquecer los moldes que
codifican c-myc en rondas repetidas de la selección
in vitro.
Modelos para la formación de fusiones.
Sin estar ligados a una teoría particular, se propone un modelo para
el mecanismo de la formación de la fusión, en el que la traducción
se inicia normalmente y el alargamiento transcurre hasta el extremo
del marco de lectura abierta. Cuando el ribosoma alcanza la porción
de ADN del molde, la traducción empieza a caer. En este punto, el
complejo se puede dividir en dos destinos: la disociación del
péptido naciente, o la transferencia del péptido naciente a la
puromicina en el extremo 3' del molde. La eficacia de la región de
transferencia probablemente está controlada por un número de
factores que influyen la estabilidad del complejo de traducción
detenido, y la entrada del resto de 3'-puromicina en
el sitio A del centro de peptidiltransferasa. Después de la
reacción de transferencia, probablemente la fusión de
ARNm-péptido permanece complejada con el ribosoma,
puesto que los factores de liberación conocidos no pueden hidrolizar
el enlace amídico estable entre los dominios de ARN y
peptídico.
Tanto el modelo clásico para el alargamiento
(Watson, Bull. Soc. Chim. Biol. 46:1399 (1964)) como el
modelo de estado intermedio (Moazed y Noller, Nature 342:142
(1989)) requieren que el sitio A esté vacío para la entrada de
puromicina en el centro de peptidiltransferasa. Para que la
puromicina entre en el sitio A vacío, el ligador debe formar un
bucle alrededor del exterior del ribosoma, o debe pasar directamente
desde el sitio descodificante a través del sitio A hasta el centro
de peptidiltransferasa. Los datos descritos en la presente memoria
no distinguen claramente entre estas alternativas, debido a que el
ligador más corto ensayado (21 nucleótidos) es aún suficientemente
largo para pasar alrededor del exterior del ribosoma. En algunos
modelos de estructura ribosómica (Frank et al., Nature
376:441 (1995)), el ARNm se enrosca a través de un canal que
se extiende a cada lado del sitio descodificante, en cuyo caso se
requeriría el desenroscamiento del ligador a partir del canal para
permitir que la puromicina alcanzase el centro de
peptidiltransferasa a través del sitio A.
Parece que la transferencia del péptido naciente
a la puromicina es lenta con relación al proceso de alargamiento,
según se demuestra mediante la homogeneidad y longitud del péptido
unido al ligador. Si la puromicina compite efectivamente con los
aminoacil ARNt durante el alargamiento, sería de esperar que las
fusiones de ligador-péptido presentes en los
productos de fusión tuviesen un tamaño heterogéneo. Además, no
parece que el ribosoma leyese en la región del ligador, según se
indica mediante la similitud en las movilidades en gel entre la
fusión de Met-molde y el ligador no modificado.
dA_{3n} debería de codificar (lisina)_{n}, lo que
ciertamente disminuiría la movilidad del ligador. La velocidad
lenta de desenroscamiento del ARNm puede explicar la velocidad
lenta de la formación de la fusión, con relación a la velocidad de
translocación. Los resultados preliminares sugieren que la cantidad
de producto de fusión formado aumenta notablemente tras la
incubación post-traducción prolongada a baja
temperatura, quizá debido al incremento de tiempo disponible para la
transferencia del péptido naciente a la puromicina.
A continuación se describen los materiales
detallados y los métodos que se refieren a la traducción in
vitro y al estudio de las fusiones de
ARN-proteína, incluyendo fusiones que tienen un
marcador de epítopo de myc.
Secuencias. Se usó un número de
oligonucleótidos como antes para la generación de las fusiones de
ARN-proteína. Estos oligonucleótidos tienen las
siguientes secuencias.
Todos los oligonucleótidos están enumerados en
la dirección 5' a 3'. Las bases ribonucleotídicas están indicadas
mediante la minúscula "r" antes del nombre del nucleótido; P es
puromicina; rN indica cantidades iguales de rA, rG, rC y rU; rS
indica cantidades iguales de rG y rC; y todas las otras
denominaciones de las bases indican oligonucleótidos de ADN.
Productos químicos. La puromicina HCl, el
vidrio de poro controlado alquilamínico de cadena larga,
gougerotina, cloranfenicol, virginiamicina, DMAP, cloruro de
dimetiltritilo, y el anhídrido acético se obtuvieron de Sigma
Chemical (St. Louis, MO). La piridina, dimetilformamida, tolueno,
anhídrido succínico, y para-nitrofenol se
obtuvieron de Fluka Chemical (Ronkonkoma, NY). El ARNm
beta-globina se obtuvo de Novagen (Madison, WI). El
ARN TMV se obtuvo de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN).
Enzimas. La proteinasa K se obtuvo de
Promega (Madison, WI). La ARNasa libre de ADNasa se produjo mediante
el protocolo de Sambrook et al. (citado anteriormente), o se
adquirió de Boehringer Mannheim. La T7 polimerasa se obtuvo
mediante el protocolo publicado de Grodberg y Dunn (J. Bacteriol.
170:1245 (1988)) con las modificaciones de Zawadzki y Gross
(Nucl. Acids Res. 19:1948 (1991)). La T4 ADN ligasa se obtuvo
de New England Biolabs (Beverly, MA).
Cuantificación de la incorporación del
radiomarcador. Para bandas de geles radioactivos, se determinó
la cantidad de radiomarcador (^{35}S o ^{32}P) presente en cada
banda mediante cuantificación en un analizador de transferencia
Betagen 603 (Betagen, Waltham, MA), o usando placas de formación de
fosfoimágenes (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Para muestras
líquidas y sólidas, la cantidad de radiomarcador (^{35}S o
^{32}P) presente se determinó mediante recuento por centelleo
(Beckman, Columbia, MD).
Imágenes de geles. Las imágenes de geles
se obtuvieron mediante autorradiografía (usando una película Kodak
XAR), o usando placas de formación de fosfoimágenes (Molecular
Dynamics).
Síntesis de CPG puromicina. Más arriba se
esquematizan los protocolos detallados para la síntesis de
CPG-puromicina.
Reacciones enzimáticas. En general, la
preparación de ácidos nucleicos para las reacciones de quinasa, de
transcripción, mediante PCR, y de traducción, usando extractos de
E.coli, fue la misma. Cada protocolo preparativo comenzó con
la extracción usando un volumen igual de 1:1 de fenol/cloroformo,
seguido de la centrifugación y aislamiento de la fase acuosa. Se
añadieron acetato de sodio (pH 5,2) y espermidina hasta una
concentración final de 300 mM y 1 mM, respectivamente, y la muestra
se precipitó mediante adición de 3 volúmenes de etanol al 100% y
mediante incubación a -70ºC durante 20 minutos. Las muestras se
centrifugaron a >12.000 g, se retiró el sobrenadante, y los
peletes se lavaron con un exceso de etanol al 95%, a 0ºC. Los
peletes resultantes se secaron entonces a vacío, y se
resuspendieron.
Oligonucleótidos. Tanto el ADN como el
ARN sintéticos se sintetizaron en un sintetizador Millipore
Expedite, usando una química estándar para cada uno, según se
suministra por el fabricante (Milligen, Bedford, MA). Los
oligonucleótidos que contienen 3' puromicina se sintetizaron usando
columnas de CPG-puromicina empaquetadas con
30-50 mg de soporte sólido (\sim20 \mumoles de
puromicina/gramo). Los oligonucleótidos que contienen una 3'
biotina se sintetizaron usando 1 \mumol de columnas bioteg CPG de
Glen Research (Sterling, VA). Los oligonucleótidos que contienen
una 5' biotina se sintetizaron mediante adición de fosforamidito de
bioteg (Glen Research) como la base en 5'. Los oligonucleótidos a
ligar en los extremos 3' de las moléculas de ARN se fosforilaron
químicamente en el extremo 5' (usando un reactivo de fosforilación
químico de Glen Research) antes de la desprotección, o se
fosforilaron enzimáticamente usando ATP y T4 polinucleótido quinasa
(New England Biolabs) después de la desprotección. Las muestras que
contienen sólo ADN (y 3' puromicina o 3' biotina) se desprotegieron
mediante adición de NH_{4}OH al 25%, seguido de la incubación
durante 12 horas a 55ºC. Las muestras que contienen monómeros de
ARN (por ejemplo, 43-P) se desprotegieron mediante
adición de etanol (25% (v/v)) a la disolución de NH_{4}OH, e
incubación durante 12 horas a 55ºC. El 2'OH se desprotegió usando 1
M de TBAF en THF (Sigma), durante 48 horas a temperatura ambiente.
El TBAF se eliminó usando una columna NAP-25
Sephadex (Pharmacia, Piscataway, NJ).
Las muestras de ADN y ARN desprotegidas se
purificaron entonces usando PAGE desnaturalizante, seguido de
empapamiento o electroelución a partir del gel usando un Elutrap
(Schleicher y Schuell, Keene, NH) y desalando usando una columna
NAP-25 Sephadex o precipitación con etanol, como se
describe anteriormente.
Construcción de ADN de myc. Se
construyeron dos moldes de ADN que contienen el marcador del epítopo
de c-myc. El primer molde se obtuvo a partir de una
combinación de los oligonucleótidos 64.27 (5'-GTT
CAG GTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT TTC GTC CTC CCT ATA GTG
AGT CGT ATT A-3') (SEC ID nº: 18) y 18.109
(5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG) (SEC ID nº: 19). La
transcripción usando este molde produjo ARN 47.1 que codificó el
péptido MEQKLISEEDLN (SEC ID nº: 20). La ligación de ARN 47.1 a
30-P produjo LP77, mostrado en la Figura 7A.
El segundo molde se obtuvo primero como un único
oligonucleótido de 99 bases de longitud, que tiene la denominación
RWR 99.6, y la secuencia 5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG
CTG TTC CAG TTT GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTC
TTC AGA GAT CAG TTT CTG TTC TTC AGC CAT-3' (SEC ID
nº: 21). Se construyeron mediante PCR moldes de transcripción
bicatenarios que contienen esta secuencia con los oligos RWR 21.103
(5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-3')
(SEC ID nº: 22) y RWR 63.26 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA
TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA GAA CAG AAA
CTG-3') (SEC ID nº: 23), según los protocolos
publicados (Ausubel et al., citado anteriormente, capítulo
15). La transcripción usando este molde produjo un ARN denominado
como RNA124 que codificó el péptido
MAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHK
LEQLRNSCA (SEC ID nº: 24). Este péptido contenía la secuencia usada para producir el anticuerpo monoclonal 9E10 cuando se conjugó a una proteína portadora (Oncogene Science Technical Bulletin). El RNA124 tenía 124 nucleótidos de longitud, y la ligación de RNA124 a 30-P produjo LP154 mostrado en la Figura 7B. La secuencia de RNA124 es la siguiente (SEC ID nº: 32): 5'-rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrG rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA rGrArA rGrArC rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG rCrUrG rArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGrCrU-3'.
LEQLRNSCA (SEC ID nº: 24). Este péptido contenía la secuencia usada para producir el anticuerpo monoclonal 9E10 cuando se conjugó a una proteína portadora (Oncogene Science Technical Bulletin). El RNA124 tenía 124 nucleótidos de longitud, y la ligación de RNA124 a 30-P produjo LP154 mostrado en la Figura 7B. La secuencia de RNA124 es la siguiente (SEC ID nº: 32): 5'-rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrG rGrCrU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA rGrArA rGrArC rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG rCrUrG rArArA rCrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGrCrU-3'.
Construcción del conjunto aleatorizado.
El conjunto aleatorizado se construyó como un único oligonucleótido
de 130 bases de longitud, denominado RWR 130.1. Comenzando en el
extremo 3', la secuencia fue
3'-CCCTGTTAAT
GATAAATGTTAATGTTAC (NNS)_{27} GTC GAC GCA TTG AGA TAC CGA-5' (SEC ID nº: 25). N representa una posición al azar, y esta secuencia se generó según el protocolo del sintetizador estándar. S representa una mezcla igual de bases de dG y dC. La PCR se realizó con los oligonucleótidos 42.108 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA) (SEC ID nº: 26) y 21.103 (5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG) (SEC ID nº: 27). La transcripción de este molde produjo un ARN denominado conjunto 130.1. La ligación del conjunto 130.1 a 30-P produjo el Conjunto nº 1 (también denominado como LP160), mostrado en la Figura 7C.
GATAAATGTTAATGTTAC (NNS)_{27} GTC GAC GCA TTG AGA TAC CGA-5' (SEC ID nº: 25). N representa una posición al azar, y esta secuencia se generó según el protocolo del sintetizador estándar. S representa una mezcla igual de bases de dG y dC. La PCR se realizó con los oligonucleótidos 42.108 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA) (SEC ID nº: 26) y 21.103 (5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG) (SEC ID nº: 27). La transcripción de este molde produjo un ARN denominado conjunto 130.1. La ligación del conjunto 130.1 a 30-P produjo el Conjunto nº 1 (también denominado como LP160), mostrado en la Figura 7C.
Se realizaron siete ciclos de PCR según los
protocolos publicados (Ausubel et al., citado anteriormente),
con las siguientes excepciones: (i) la concentración de partida de
RWR 130.1 fue 30 nanomolar, (ii) cada cebador se usó a una
concentración de 1,5 \muM, (iii) la concentración de dNTP fue 400
\muM para cada base, y (iv) se usó la Taq polimerasa (Boehringer
Mannheim) a 5 unidades por 100 \mul. El producto bicatenario se
purificó en PAGE no desnaturalizante, y se aisló mediante
electroelución. La cantidad de ADN se determinó tanto mediante
absorbancia de UV a 260 nm como mediante comparación de la
fluorescencia con bromuro de etidio con patrones conocidos.
Síntesis enzimática de ARN. Las
reacciones de transcripción a partir de ADN de PCR bicatenario y
oligonucleótidos sintéticos se llevó a cabo como se describe
previamente (Milligan y Uhlenbeck, Meth. Enzymol. 180:51
(1989)). El ARN de longitud completa se purificó mediante PAGE
desnaturalizante, se electroeluyó, y se desaló como se describe
anteriormente. La concentración de ARN del conjunto se estimó usando
un coeficiente de extinción de 1300 O.D./\mumol; RNA124, 1250
O.D./\mumol; RNA 47.1, 480 O.D./\mumol. La transcripción a
partir del ADN del conjunto bicatenario produjo \sim90 nanomoles
de ARN del conjunto.
Síntesis enzimática de conjugados de
ARN-puromicina. La ligación de las secuencias de
ARN mensajero de myc y del conjunto al oligonucleótido que contiene
puromicina se realizó usando una tablilla de ADN, denominada 19.35
(5'-TTT TTT TTT TAG CGC AAG A) (SEC ID nº: 28),
usando un procedimiento análogo al descrito por Moore y Sharp
(Science 250:992 (1992)). La reacción constó de ARNm, la tablilla, y
oligonucleótido que contiene puromicina (30-P,
dA27dCdCP), en una relación en moles de 0,8:0,9:1,0, y
1-2,5 unidades de ADN ligasa por picomol de ARNm
del conjunto. Las reacciones se realizaron durante una hora a
temperatura ambiente. Para la construcción de las fusiones de ARN
del conjunto, la concentración de ARNm fue \sim6,6 \mumolar.
Después de la ligación, el conjugado de
ARN-puromicina se preparó como se describe
anteriormente para reacciones enzimáticas. El precipitado se
resuspendió, y las fusiones de longitud completa se purificaron en
PAGE desnaturalizante, y se aislaron mediante electroelución como
se describe anteriormente. La concentración de ARN del conjunto se
estimó usando un coeficiente de extinción de 1650 O.D./\mumol, y
el molde de myc de 1600 O.D./\mumol. De esta manera, se generaron
2,5 nanomoles de conjugado.
Preparación de dT_{25} estreptavidina
agarosa. Se incubó dT_{25} que contiene una 3' biotina
(sintetizada en columnas de fosforamidito de bioteg (Glen
Research)), a 1-10 \muM, con una suspensión de
estreptavidina-agarosa (agarosa al 50% en volumen,
Pierce, Rockford, IL), durante 1 hora a temperatura ambiente en TE
(10 mM de Tris-cloruro pH 8,2, 1 mM de EDTA), y se
lavó. Después, se estimó ópticamente la capacidad de unión de la
agarosa mediante la desaparición de
biotina-dT_{25} de la disolución, y/o mediante
titulación de la resina con cantidades conocidas de oligonucleótido
complementario.
Reacciones de traducción usando extractos y
ribosomas derivados de E.coli . En general, las reacciones
de traducción se realizaron con kits comprados (por ejemplo,
E.coli S30 Extract for Linear Templates, Promega, Madison,
WI). Sin embargo, también se usó E.coli MRE600 (obtenido del
ATCC, Rockville, MD) para generar extractos de S30 preparados según
los protocolos publicados (por ejemplo, Ellman et al., Meth.
Enzymol. 202:301 (1991)), así como una fracción ribosómica
preparada como se describe por Kuclicki et al. (Anal.
Biochem. 206:389 (1992)). La reacción estándar se realizó en
un volumen de 50 \mul con 20-40 \muCi de
^{35}S-metionina como marcador. La mezcla de
reacción consistió en 30% de extracto v/v, 9-18 mM
de MgCl_{2}, 40% de premezcla menos metionina (Promega) v/v, y 5
\muM de molde (por ejemplo, 43-P). Para los
experimentos de coincubación, se añadieron los oligos
13-P y 25-P, a una concentración de
5 \muM. Para experimentos que usen ribosomas, se añadieron 3
\mul de disolución ribosómica por reacción, en lugar del lisado.
Todas las reacciones se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Los
moldes se purificaron como se describe anteriormente en condiciones
enzimáticas.
Reacciones de traducción con germen de
trigo. Las reacciones de traducción en la Figura 8 se realizaron
usando kits comprados que carecen de metionina (Promega), según las
recomendaciones del fabricante. Las concentraciones del molde
fueron 4 \muM para 43-P, y 0,8 \muM para LP77 y
LP154. Las reacciones se llevaron a cabo a 25ºC con 30 \muCi de
^{35}S-metionina en un volumen total de 25
\mul.
Reacciones de traducción con
reticulocitos. Las reacciones de traducción se realizaron con
kits comprados (Novagen, Madison, WI), o usando un extracto
preparado según protocolos publicados (Jackson y Hunt, Meth.
Enzymol. 96:50 (1983)). Se obtuvo sangre rica en reticulocitos a
partir de Pel-Freez Biologicals (Rogers, AK). En
ambos casos, las condiciones de reacción fueron aquellas
recomendadas para uso con Red Nova Lysate (Novagen). Las reacciones
consistían en 100 mM de KCl, 0,5 mM de MgOAc, 2 mM de DTT, 20 mM de
HEPES pH 7,6, 8 mM de fosfato de creatina, 25 \muM en cada
aminoácido (con la excepción de metionina si se usó
^{35}S-Met), y 40% v/v de lisado. La incubación
se realizó a 30ºC durante 1 hora. Las concentraciones del molde
dependen del experimento, pero generalmente oscilaron desde 50 nM
hasta 1 \muM, con la excepción de 43-P (Figura
6H), que fue de 4 \muM.
Para la generación del conjunto aleatorizado, se
llevaron a cabo 10 ml de una reacción de traducción a una
concentración de molde de \sim0,1 \muM (1,25 nanomoles de
molde). Además, el molde marcado con ^{32}P se incluyó en la
reacción para permitir la determinación de la cantidad de material
presente en cada etapa del procedimiento de purificación y de
selección. Después de la traducción a 30ºC durante una hora, la
reacción se enfrió en hielo durante 30-60
minutos.
Aislamiento de la fusión con dT_{25}
estreptavidina agarosa. Después de la incubación, la reacción de
traducción se diluyó aproximadamente 150 veces en tampón de
aislamiento (1,0 M de NaCl, 0,1 M de Tris cloruro pH 8,2, 10 mM de
EDTA, 1 mM de DTT) que contiene más de un exceso molar de 10 X de
dT_{25}-biotina-estreptavidina
agarosa, cuya concentración de dT_{25} fue \sim10 \muM
(volumen de la suspensión igual o mayor que el volumen del lisado),
y se incubó con agitación a 4ºC durante una hora. Después, la
agarosa se eliminó de la mezcla mediante filtración (filtros MC
ultralibres de Millipore), o mediante centrifugación, y se lavó con
tampón de aislamiento frío, 2-4 veces. El molde se
liberó entonces de la dT_{25} estreptavidina agarosa mediante
lavado repetido con alícuotas de 50-100 \mul de 15
mM de NaOH, 1 mM de EDTA. El eluyente se neutralizó inmediatamente
en 3 M de NaOAc pH 5,2, 10 mM de espermidina, y se precipitó
mediante etanol. Para la reacción del conjunto, la radioactividad
total recuperada indicó aproximadamente que se recuperó un
50-70% del molde de entrada.
Aislamiento de la fusión con
tiopropilsefarosa. Las fusiones que contienen cisteína se pueden
purificar usando tiopropilsefarosa 6B, como en la Figura 13
(Pharmacia). En los experimentos descritos en la presente memoria,
el aislamiento se llevó a cabo directamente a partir de la reacción
de traducción, o tras el aislamiento inicial de la fusión (por
ejemplo, con estreptavidina agarosa). Para las muestras purificadas
directamente, se usó una relación de 1:10 (v/v) de lisado a
sefarosa. Para el conjunto, se usaron 0,5 ml de suspensión de
sefarosa para aislar todo el material de fusión a partir de 5 ml de
la mezcla de reacción. Las muestras se diluyeron en una suspensión
50:50 (v/v) de tiopropilsefarosa en 1 X TE 8.2 (10 mM de
Tris-Cl, 1 mM de EDTA, pH 8,2) que contiene ARNasa
libre de ADNasa (Boehringer Mannheim), y se incubó con rotación
durante 1-2 horas a 4ºC para terminar la reacción.
Se eliminó el líquido en exceso, y la sefarosa se lavó repetidamente
con tampón de aislamiento que contiene 20 mM de DTT, y se recuperó
mediante centrifugación o mediante filtración. Las fusiones se
eluyeron de la sefarosa usando una disolución de
25-30 mM de ditiotreitol (DTT) en 10 mM de Tris
cloruro pH 8,2, 1 mM de EDTA. Después, la fusión se concentró
mediante combinación de evaporación a alto vacío y precipitación
con etanol como se describe anteriormente. Para la reacción del
conjunto, la radioactividad total recuperada indicó que
aproximadamente el 1% del molde se convirtió en la fusión.
Para ciertas aplicaciones, se añadió dT_{25} a
este eluato, y se hizo girar durante 1 hora a 4ºC. La agarosa se
enjuagó tres veces con tampón de aislamiento frío, se aisló vía
filtración, y el material unido se eluyó como antes. Se añadió ARNt
portador, y el producto de fusión se precipitó mediante etanol. La
muestra se resuspendió en TE pH 8,2 que contiene ARNasa A libre de
ADNasa, para eliminar la porción de ARN del molde.
Reacciones de inmunoprecipitación. Se
realizaron inmunoprecipitaciones de péptidos a partir de reacciones
de traducción (Figura 10) mezclando 4 \mul de reacción de
traducción de reticulocitos, 2 \mul de suero de ratón normal, y
20 \mul de proteína G + A agarosa (Calbiochem, La Jolla, CA) con
200 \mul de PBS (58 mM de Na_{2}HPO_{4}, 17 mM de
NaH_{2}PO_{4}, 68 mM de NaCl), tampón de dilución (10 mM de Tris
cloruro pH 8,2, 140 mM de NaCl, 1% v/v de Tritón
X-100), o PBSTDS (PBS + 1% de Tritón
X-100, 0,5% de desoxicolato y 0,1% de SDS). Las
muestras se hicieron girar entonces durante una hora a 4ºC, seguido
de la centrifugación a 2500 rpm durante 15 minutos. Se eliminó el
eluyente, y se añadieron 10 \mul de anticuerpo monoclonal
c-myc 9E10 (Calbiochem, La Jolla, CA) y 15 \mul
de proteína G + A agarosa, y se hizo girar durante 2 horas a 4ºC.
Después, las muestras se lavaron con dos volúmenes de 1 ml de PBS,
tampón de dilución, o PBSTDS. Se añadieron a la mezcla 40 \mul de
tampón de carga de gel (Calbiochem Product Bulletin), y se cargaron
20 \mul en un PAGE desnaturalizante como se describe por Schagger
y von Jagow (Anal. Biochem. 166:368 (1987)).
Las inmunoprecipitaciones de las fusiones (como
se indican en la Figura 11) se realizaron mezclando 8 \mul de
reacción de traducción de reticulocitos con 300 \mul de tampón de
dilución (10 mM de Tris cloruro pH 8,2, 140 mM de NaCl, 1% v/v de
Tritón X-100), 15 \mul de proteína G sefarosa
(Sigma), y 10 \mul (1 \mug) de anticuerpo c-myc
9E10 (Calbiochem), seguido de la rotación durante varias horas a
4ºC. Después del aislamiento, las muestras se lavaron, se trataron
con ARNasa A libre de ADNasa, se marcaron con polinucleótido quinasa
y con ^{32}P gamma ATP, y se separaron mediante
urea-PAGE desnaturalizante (Figura 11).
Transcripción inversa del conjunto de
fusión. Se llevaron a cabo reacciones de transcripción inversa
según las recomendaciones del fabricante para Superscript II,
excepto que el molde, el agua y el cebador se incubaron a 70ºC
durante sólo dos minutos (Gibco BRL, Grand Island, NY). Para
monitorizar la extensión, se incluyeron 50 \muCi de alfa ^{32}P
dCTP en algunas reacciones; en otras reacciones, la transcripción
inversa se monitorizó usando cebadores marcados con ^{32}P en 5',
que se prepararon usando ^{32}P \alphaATP (New England Nuclear,
Boston, MA) y T4 polinucleótido quinasa (New England Biolabs,
Beberly, MA).
\newpage
Preparación de proteína G y anticuerpo
sefarosa. Se lavaron dos alícuotas de 50 \mul de suspensión
de proteína G sefarosa (50% de sólido en volumen) (Sigma) con tampón
de dilución (10 mM de Tris cloruro pH 8,2, 140 mM de NaCl, 0,025%
de NaN_{3}, 1% v/v de Tritón X-100), y se aislaron
mediante centrifugación. La primera alícuota se reservó para uso
como una precolumna antes de la matriz de selección. Tras la
resuspensión de la segunda alícuota en tampón de dilución, se
añadieron 40 \mug de anticuerpo monoclonal AB-1
c-myc (Oncogene Science), y la reacción se incubó
toda la noche a 4ºC con rotación. El anticuerpo sefarosa se purificó
entonces mediante centrifugación durante 15 minutos a
1500-2500 rpm en una microcentrífuga, y se lavó
1-2 veces con tampón de dilución.
Selección. Tras el aislamiento de la
fusión, y la síntesis de la hebra complementaria, la reacción de
transcriptasa inversa completa se usó directamente en el proceso de
selección. Se perfilan aquí dos protocolos. Para la ronda 1, la
reacción de transcriptasa inversa se añadió directamente al
anticuerpo sefarosa preparado como se describe anteriormente, y se
incubó 2 horas. Para rondas subsiguientes, la reacción se incubó
\sim2 horas con proteína G sefarosa lavada, antes de la columna
de anticuerpo, para disminuir el número de aglutinantes que
interactúan con la proteína G en lugar de con el anticuerpo
inmovilizado.
Para eluir el conjunto de la matriz, se pueden
tomar varios enfoques. El primero es lavar la matriz de selección
con ácido acético al 4%. Este procedimiento libera el péptido de la
matriz. Como alternativa, se puede usar un lavado más restrictivo
(por ejemplo, usando urea u otro desnaturalizante) en lugar o además
del enfoque con ácido acético.
PCR de fusiones seleccionadas. Las
moléculas seleccionadas se amplifican mediante PCR usando protocolos
estándares como se describe anteriormente para la construcción del
conjunto.
Para sintetizar un constructo de fusión de
\beta-globina, se generó un ADNc de
\beta-globina a partir de 2,5 \mug de ARNm de
globina mediante transcripción inversa con 200 pmoles del cebador
18.155 (5'-GTG GTA TTT GTG AGC CAG) (SEC ID nº: 29)
y transcriptasa inversa Superscript (Gibco BRL), según el protocolo
del fabricante. La secuencia del cebador fue complementaria a los 18
nucleótidos de la beta-globina 5' del codón de
parada. Para añadir un promotor T7, se eliminaron 20 \mul de la
reacción de transcripción inversa, y se sometieron a 6 ciclos de
PCR con los cebadores 18.155 y 40.54 (5'-TAA TAC GAC
TCA CTA TAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C) (SEC ID nº: 30). El ARNm
de la "syn-\beta-globina"
resultante se generó entonces mediante transcripción de desempate
con T7 según Milligan y Uhlenbeck (Methods Enzymol. 180:51
(1989)), y el gel de ARN se purificó, se electroeluyó y se desaló
como se describe. Después, se generó la
"LP-\beta-globina" a partir
del constructo de
syn-\beta-globina, mediante
ligación de ese constructo a 30-P según el método
de Moore y Sharp (Science 256:992 (1992)) usando el cebador
20.262 (5'-TTTT TTT TTT T GTG GTA TTT G) (SEC ID
nº: 31) como la tablilla. El producto de la reacción de ligación se
purificó entonces en gel, se electroeluyó y se desaló como antes.
La concentración del producto final se determinó mediante
absorbancia a 260 nm.
Estos moldes de \beta-globina
se tradujeron entonces in vitro como se describe en la Tabla
1 en un volumen total de 25 \mul cada uno. Se añadió Mg^{2+} a
partir de una disolución madre de 25 mM. Todas las reacciones se
incubaron a 30ºC durante una hora, y se colocaron a -20ºC toda la
noche. Los CPM precipitables mediante dT_{25} se determinaron
entonces dos veces usando 6 \mul de lisado, y se promediaron
restando el fondo.
Reacción | Molde | Mg^{2+} (mM) | ^{35}S Met (\mul) | TCA CPM (2 \mul) | dT_{25}CPM (6 \mul) |
1 | - - - | 1,0 | 2,0 (20 \muCi) | 3312 | 0 |
2 | 2,5 \mug syn-\beta-globina | 0,5 | 2,0 (20 \muCi) | 33860 | 36 |
3 | 2,5 \mug syn-\beta-globina | 1,0 | 2,0 (20 \muCi) | 22470 | 82 |
4 | 2,5 \mug syn-\beta-globina | 2,0 | 2,0 (20 \muCi) | 15696 | 86 |
5 | 2,5 \mug LP-\beta-globina | 0,5 | 2,0 (20 \muCi) | 32712 | 218 |
6 | 2,5 \mug LP-\beta-globina | 1,0 | 2,0 (20 \muCi) | 24226 | 402 |
7 | 2,5 \mug LP-\beta-globina | 2,0 | 2,0 (20 \muCi) | 15074 | 270 |
Para preparar las muestras para el análisis de
gel, se mezclaron 6 \mul de cada reacción de traducción con 1000
\mul de tampón de aislamiento (1 M de NaCl, 100 mM de
Tris-Cl pH 8,2, 10 mM de EDTA, 0,1 mM de DTT), 1
\mul de ARNasa A (libre de ADNasa, Boehringer Mannheim), y 20
\mul de 20 \muM de dT_{25} estreptavidina agarosa. Las
muestras se incubaron a 4ºC durante una hora con rotación. Se
eliminó el exceso de tampón de aislamiento, y las muestras se
añadieron al filtro de MC de Millipore para eliminar cualquier
tampón de aislamiento que quede. Las muestras se lavaron entonces
cuatro veces con 50 \mul de H_{2}O, y dos veces con 50 \mul
de 15 mM de NaOH, 1 mM de EDTA. La muestra (300 \mul) se
neutralizó con 100 \mul de TE pH 6,8 (100 mM de
Tris-Cl, 1 mM de EDTA), se añadió 1 \mul de 1
mg/ml de ARNasa A (como antes), y las muestras se incubaron a 37ºC.
Después se añadieron 10 \mul de 2 X de tampón de carga de SDS (125
mM de Tris-Cl pH 6,8, 2% de SDS, 2% de
\beta-mercaptoetanol, 20% de glicerina, 0,001% de
azul de bromofenol), y la muestra se liofilizó hasta sequedad y se
resuspendió en 20 \mul de H_{2}O y 1% de
\beta-mercaptoetanol. Las muestras se cargaron
entonces sobre un gel que resuelve los péptidos, como se describe
por Schagger y von Jagow (Analytical Biochemistry 166:368 (1987)),
y se visualizaron mediante autorradiografía.
Los resultados de estos experimentos se muestran
en las Figuras 15A y 15B. Según se indica en la Figura 15A, y 15B.
Según se indica en la Figura la ^{35}S-metionina
se incorporó en la parte proteínica de la
syn-\beta-globina y en las
fusiones de LP-\beta-globina. La
proteína fue heterogénea, pero una banda fuerte mostró la movilidad
esperada para el ARNm de \beta-globina. También,
como se muestra en la Figura 15B, tras el aislamiento con dT_{25}
y la digestión con ARNasa A, no quedó ningún material marcado con
^{35}S en las líneas de
syn-\beta-globina (Figura 15B,
líneas 2-4). Por el contrario, en las líneas de
LP-\beta-globina, se observó un
producto marcado con ^{35}S de tamaño homogéneo.
Estos resultados indicaron que, como
anteriormente, se aisló un producto de fusión mediante cromatografía
de afinidad oligonucleotídica sólo cuando el molde contenía una 3'
puromicina. Esto se confirmó mediante recuento por centelleo (véase
la Tabla 1). Es de esperar que el material obtenido contenga el
ligador de 30-P fusionado a alguna parte de la
\beta-globina. El producto de fusión parece
bastante homogéneo en tamaño, según se juzga mediante análisis de
gel. Sin embargo, puesto que el producto mostró una movilidad muy
similar a la \beta-globina natural (Figuras 15A y
15B, líneas de control), fue difícil determinar la longitud precisa
de la porción proteínica del producto de fusión.
Se ha encontrado que ciertos factores aumentan
adicionalmente la eficacia de la formación de las fusiones de
ARN-péptido. La formación de la fusión, es decir, la
transferencia de la cadena peptídica naciente desde su ARNt al
resto de puromicina en el extremo 3' del ARNm, es una reacción lenta
que sigue a la traducción inicial, relativamente rápida, del marco
de lectura abierto, para generar el péptido naciente. El grado de
formación de fusión se puede potenciar sustancialmente mediante una
incubación tras la traducción, en condiciones de Mg^{2+} elevado
(preferentemente, en un intervalo de 50-100 mM), y/o
mediante el uso de un ligador más flexible entre el ARNm y el resto
de puromicina. Además, las incubaciones largas
(12-48 horas) a temperaturas bajas
(preferentemente, -20ºC) también dan como resultado rendimientos
crecientes de fusiones, con menor degradación del ARNm que la que
se produce durante la incubación a 30ºC. Combinando estos factores,
se puede convertir hasta el 40% del ARNm de entrada a los productos
de fusión de ARNm-péptido, según se muestra a
continuación.
Síntesis de conjugados de
ARNm-puromicina. En estos experimentos de
optimización, se ligaron oligonucleótidos ligadores que contienen
puromicina a los extremos 3' de los ARNm, usando T4 ADN ligasa de
bacteriófago en presencia de tablillas de ADN complementarias,
generalmente como se describe anteriormente. Puesto que la T4 ADN
ligasa prefiere un emparejamiento de bases precisa cerca de la unión
de la ligación, y los productos de la transcripción de empate con
T7, T3 o SP6 ARN polimerasa a menudo son heterogéneos en sus
extremos 3' (Nucleic Acids Research 15:8783 (1987)), sólo
aquellos ARN que contienen el nucleótido 3'-terminal
correcto se ligaron eficientemente. Cuando se usó una tablilla
estándar de ADN, se ligaron aproximadamente el 40% de los productos
de transcripción de empate al oligo de puromicina. La cantidad de
producto de ligación se aumentó usando un exceso de ARN, pero no se
aumentó usando un exceso de oligonucleótido que contiene puromicina.
Sin estar atados a una teoría particular, parece que el factor
limitante para la ligación fue la cantidad de ARN que fue totalmente
complementaria a la región correspondiente de la tablilla de
ADN.
Para permitir la ligación de esos transcritos
que terminan con un nucleótido no moldeado extra en el término 3'
(denominados "productos N + 1"), se usó una mezcla de la
tablilla de ADN estándar con una nueva tablilla de ADN que contiene
una base al azar adicional en la unión de ligación. La eficacia de
la ligación aumentó en más del 70% para un molde de ARN de myc
ejemplar (esto es, RNA124) en presencia de tal tablilla de ADN
mixta.
Además de este enfoque de tablilla de ADN
modificado, se optimizó adicionalmente la eficacia de la formación
del conjugado de ARNm-puromicina teniendo en cuenta
los siguientes tres factores. En primer lugar, se diseñaron o
utilizaron preferentemente ARNm que carecían de términos en 3' que
tienen cualquier estructura secundaria estable significativa que
podría interferir con la hibridación al oligonucleótido de la
tablilla. Además, debido a que la elevada concentración de sal
provocó algunas veces fallo de la reacción de ligación, se incluyó
preferentemente, como una etapa en el procedimiento, una desalación
a conciencia de los oligonucleótidos usando una columna de
NAP-25. Finalmente, debido a que la reacción de
ligación fue relativamente rápida y estaba generalmente completa en
los 40 minutos a temperatura ambiente, no se utilizaron generalmente
períodos de incubación significativamente más largos, y a menudo
dio como resultado la degradación innecesaria del ARN.
Usando las condiciones anteriores, se
sintetizaron los conjugados de ARNm-puromicina según
lo siguiente. La ligación de la secuencia de ARN myc (RNA124) al
oligonucleótido que contiene puromicina se realizó usando una
tablilla de ADN estándar (por ejemplo,
5'-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA), o una tablilla que contiene
una base al azar (N) en la unión de ligación (por ejemplo, 5'-
TTTTTTTTTTNAGCGCAAGA). Las reacciones consistieron en ARNm, la
tablilla de ADN, y el oligonucleótido que contiene puromicina, en
una relación molar de 1,0:1,5-2,0:1,0. En primer
lugar, se calentó a 94ºC durante 1 minuto una mezcla de estos
componentes, y después se enfrió en hielo durante 15 minutos. Las
reacciones de ligación se realizaron durante una hora a temperatura
ambiente en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM de
MgCl_{2}, 10 mM de DTT, 1 mM de ATP, 25 \mug/ml de BSA, 15
\muM de oligo de puromicina, 15 \muM de ARNm,
22,5-30 \muM de tablilla de ADN, inhibidor de
ARNsin (Promega) a 1 U/\mul, y 1,6 unidades de T4 ADN ligasa por
picomol de oligo de puromicina. Tras la incubación, se añadió EDTA
hasta una concentración final de 30 mM, y las mezclas de reacción se
extrajeron con fenol/cloroformo. Los conjugados de longitud
completa se purificaron mediante PAGE desnaturalizante, y se
aislaron mediante electroelución.
Condiciones de traducción reticulocítica
general. Además de mejorar la síntesis del conjugado de
ARNm-puromicina, las reacciones de traducción
también se optimizaron adicionalmente según lo siguiente. Las
reacciones se realizaron en lisados de reticulocitos de conejo a
partir de diferentes fuentes comerciales (Novagen, Madison, WI;
Amersham, ARlington Heights, IL; Boehringer Mannheim, Indianapolis,
IN; Ambion, Austin, TX; y Promega, Madison, WI). Una mezcla de
reacción típica (25 \mul de volumen final) constó de 20 mM de
HEPES pH 7,6, 2 mM de DTT, 8 mM de fosfato de creatina, 100 mM de
KCl, 0,75 mM de Mg(OAc)_{2}, 1 mM de ATP, 0,2 mM de
GTP, 25 \muM de cada aminoácido (0,7 \muM de metionina si se
usó ^{35}S-Met), ARNsin a 1 U/\mul, y 60% (v/v)
de lisado. La concentración final del molde estuvo en el intervalo
de 50 nM a 800 nM. Para cada incubación, todos los componentes
excepto el lisado se mezclaron cuidadosamente en hielo, y el lisado
congelado se descongeló inmediatamente antes del uso. Tras la
adición del lisado, la mezcla de reacción se mezcló a conciencia
pipeteando suavemente, y se incubó a 30ºC para comenzar la
traducción. Las concentraciones óptimas de Mg^{2+} y K^{+}
variaron en los intervalos de 0,25 mM-2 mM y 75
mM-200 mM, respectivamente, para diferentes ARNm, y
se determinaron preferentemente en experimentos preliminares.
Particularmente para ARNm pobremente traducidos, también se
optimizaron algunas veces la concentración de hemina, de fosfato de
creatina, de ARNt, y de aminoácidos. Generalmente se prefirió
cloruro de potasio sobre el acetato de potasio para reacciones de
fusión, pero algunas veces una mezcla de KCl y KOAc produjo mejores
resultados.
Después de la traducción a 30ºC durante 30 hasta
90 minutos, la reacción se enfrió en hielo durante 40 minutos, y se
añadió Mg^{2+}. La concentración final de Mg^{2+} añadida en
esta etapa también se optimizó para diferentes moldes de ARNm, pero
generalmente estuvo en el intervalo de 50 mM hasta 100 mM (usándose
preferentemente 50 mM para conjuntos de moldes mixtos). La mezcla
resultante se incubó a -20ºC durante 16 hasta 48 horas. Para
visualizar los productos de fusión marcados, se mezclaron 2 \mul
de la mezcla de reacción con 4 \mul de tampón de carga, y la
mezcla se calentó a 75ºC durante 3 minutos. La mezcla resultante se
cargó entonces sobre un gel de poliacrilamida-SDS
con glicina al 6% (para moldes marcados radioactivamente con
^{32}P), o un gel de SDS-poliacrilamida con 8% de
tricina (para moldes marcados radioactivamente con
^{35}S-Met). Como una alternativa a este enfoque,
los productos de fusión también se pueden aislar usando dT_{25}
estreptavidina agarosa o tiopropilsefarosa (o ambas), generalmente
como se describe en la presente memoria.
Para eliminar la porción de ARN del conjugado de
ARN-ligador-puromicina-péptido,
para el análisis subsiguiente mediante SDS-PAGE, se
añadió una cantidad apropiada de EDTA tras la incubación
post-traduccional, y la mezcla de reacción se
desaló usando una columna microcon-10 (o
microcon-30). Se mezclaron 2 \mul de la mezcla
resultante (aproximadamente 25 \mul total) con 18 \mul de
tampón de ARNasa H (30 mM de Tris-HCl, pH 7,8, 30 mM
de (NH_{4})_{2}
SO_{4}, 8 mM de MgCl_{2}, 1,5 mM de \beta-mercaptoetanol, y una cantidad apropiada de tablilla de ADN complementaria), y la mezcla se incubó a 4ºC durante 45 minutos. Después se añadió ARNasa H, y la digestión se realizó a 37ºC durante 20 minutos.
SO_{4}, 8 mM de MgCl_{2}, 1,5 mM de \beta-mercaptoetanol, y una cantidad apropiada de tablilla de ADN complementaria), y la mezcla se incubó a 4ºC durante 45 minutos. Después se añadió ARNasa H, y la digestión se realizó a 37ºC durante 20 minutos.
Calidad del oligo de puromicina. La
calidad del oligonucleótido de puromicina también fue importante
para la generación eficaz de productos de fusión. El acoplamiento
de 5'-DMT, 2'-succinil,
N-trifluoroacetilpuromicina con CPG no fue tan
eficaz como el acoplamiento de los nucleótidos estándares. Como tal,
la reacción de acoplamiento se monitorizó cuidadosamente para
evitar la formación de CPG con una concentración demasiado baja de
puromicina acoplada, y los aminoácidos sin reaccionar en el CPG se
paralizaron completamente para evitar la síntesis subsiguiente de
oligonucleótidos que carecen de una puromicina
3'-terminal. También fue importante evitar el uso
de CPG que contiene partículas de malla muy fina, puesto que éstas
fueron capaces de provocar problemas con la obturación de válvulas
durante las etapas de síntesis automatizada subsiguientes de los
nucleótidos.
Además, el oligo de puromicina sintetizado se
evaluó preferentemente antes del uso a gran escala para asegurar la
presencia de puromicina en el extremo 3'. En los experimentos, no se
detectó fusión si se sustituye la puromicina con una
desoxiadenosina que contiene un grupo amino primario en el extremo
3'. Para estudiar la presencia de grupos
3'-hidroxilo (es decir, la síntesis indeseada de
oligos que carecen de una puromicina 3'-terminal),
se radiomarcó en primer lugar el oligo de puromicina (por ejemplo,
mediante 5'-fosforilación), y después se usó como
un cebador para la extensión con desoxinucleotidiltransferasa
terminal. En presencia de un resto de puromicina
3'-terminal, no se debería de observar producto de
extensión.
Transcurso de tiempo de la traducción y de la
incubación post-traduccional. La reacción de
traducción fue relativamente rápida y se completó generalmente en
25 minutos a 30ºC. Sin embargo, la reacción de fusión fue más
lenta. Cuando se usó un ligador estándar (dA_{27}dCdCP) a 30ºC, la
síntesis de la fusión alcanzó su máximo nivel en 45 minutos
adicionales. La incubación post-traduccional se
podría llevar a cabo a temperaturas menores, por ejemplo a
temperatura ambiente, 0ºC, o -20ºC. Se observó una menor degradación
del molde de ARNm a -20ºC, y los mejores resultados de la fusión se
obtuvieron después de la incubación a -20ºC durante 2 días.
El efecto de la concentración de
Mg^{2+}. Una concentración elevada de Mg^{2+} en la
incubación post-traduccional estimuló enormemente
la formación de la fusión. Por ejemplo, para el molde de ARN de myc
descrito anteriormente, se observó una estimulación de
3-4 veces en la formación de la fusión usando un
ligador estándar (dA_{27}dCdCP) en presencia de 50 mM de
Mg^{2+} durante la incubación de 16 horas a -20ºC (Figura 17,
compárense las líneas 3 y 4). De forma similar, también se observó
una formación eficaz de la fusión usando una incubación
post-traduccional en presencia de una concentración
de Mg^{2+} de 50-100 mM cuando las reacciones se
llevaron a cabo a temperatura ambiente durante
30-45 minutos.
Longitud y secuencia del ligador. También
se examinó la dependencia de la reacción de fusión con respecto a
la longitud del ligador. En el intervalo entre 21 y 30 nucleótidos
(n = 18-27), se observó poco cambio en la
eficiencia de la reacción de fusión (como se describió
anteriormente). Los ligadores más cortos (por ejemplo, 13
nucleótidos de longitud) dieron como resultado una menor fusión.
Además, aunque los ligadores particulares de mayor longitud (esto
es, de 45 nucleótidos y 54 nucleótidos) también dieron en cierto
modo menores eficacias de la fusión, parece probable que también se
podrían usar ligadores aún más largos para optimizar la eficacia de
la reacción de fusión.
Con respecto a la secuencia del ligador, la
sustitución de los restos de desoxirribonucleótido cerca del extremo
3' por restos de ribonucleótido no cambia significativamente la
eficacia de la fusión. La secuencia de dCdCP (o rCrCP) en el
extremo 3' del ligador fue, sin embargo, importante para la
formación de la fusión. La sustitución de dCdCP por dUdUP redujo la
eficacia de la formación de la fusión significativamente.
Flexibilidad del ligador. También se
estudió la dependencia de la reacción de fusión con respecto a la
flexibilidad del ligador. En estos experimentos, se determinó que
la eficacia de la fusión fue baja si se incrementaba la rigidez del
ligador mediante hibridación con un oligonucleótido complementario
próximo al extremo 3'. De forma similar, cuando se usó un ligador
más flexible (por ejemplo, dA_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP,
en el que C_{9} representa
HO(CH_{2}CH_{2}O)_{3}
PO_{2}), se mejoró significativamente la eficacia de la fusión. En comparación con el ligador estándar (dA_{27}dCdCP), el uso del ligador más flexible (dA_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP) mejoró la eficacia de la fusión para RNA124 en más de 4 veces (Figura 17, compárense las líneas 1 y 9). Además, en contraste con el molde, con el ligador estándar cuya fusión post-traducción transcurrió pobremente en ausencia de una concentración elevada de Mg^{2+} (Figura 17, línea 3 y 4), el molde con el ligador flexible no requirió una concentración elevada de Mg^{2+} para producir un buen rendimiento del producto de fusión en una incubación post-traduccional prolongada a -20ºC (Figura 17, compárense las líneas 11 y 12). Por lo tanto, este ligador fue muy útil si no se desearon adiciones post-traduccionales de concentraciones elevadas de Mg^{2+}. Además, el ligador flexible también produjo rendimientos óptimos de la fusión en presencia de Mg^{2+} elevada.
PO_{2}), se mejoró significativamente la eficacia de la fusión. En comparación con el ligador estándar (dA_{27}dCdCP), el uso del ligador más flexible (dA_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP) mejoró la eficacia de la fusión para RNA124 en más de 4 veces (Figura 17, compárense las líneas 1 y 9). Además, en contraste con el molde, con el ligador estándar cuya fusión post-traducción transcurrió pobremente en ausencia de una concentración elevada de Mg^{2+} (Figura 17, línea 3 y 4), el molde con el ligador flexible no requirió una concentración elevada de Mg^{2+} para producir un buen rendimiento del producto de fusión en una incubación post-traduccional prolongada a -20ºC (Figura 17, compárense las líneas 11 y 12). Por lo tanto, este ligador fue muy útil si no se desearon adiciones post-traduccionales de concentraciones elevadas de Mg^{2+}. Además, el ligador flexible también produjo rendimientos óptimos de la fusión en presencia de Mg^{2+} elevada.
Cuantificación de la eficacia de la
fusión. La eficacia de la fusión se puede expresar como la
fracción de péptido traducido convertido a producto de fusión, o la
fracción de molde de entrada convertido a producto de fusión. Para
determinar la fracción de péptido traducido convertido a producto de
fusión, se utilizó el marcaje con ^{35}S-Met del
péptido traducido. En estos experimentos, cuando se usó un ligador
de dA_{27}dCdCP o dA_{27}rCrCP, alrededor del 3,5% del péptido
traducido se fusionó a su ARNm después de una incubación de la
traducción de 1 hora a 30ºC. Este valor aumentó hasta 12% después de
la incubación toda la noche a -20ºC. Cuando la incubación
post-traduccional se llevó a cabo en presencia de
una concentración elevada de Mg^{2+}, más del 50% del péptido
traducido se fusionó al molde.
Para un molde con el ligador flexible,
aproximadamente el 25% del péptido traducido se fusionó al molde
después de 1 hora de traducción a 30ºC. Este valor aumentó hasta
alrededor de 50% tras la incubación toda la noche a -20ºC, y hasta
más del 75% si la incubación post-traduccional se
realizó en presencia de 50 mM de Mg^{2+}.
Para determinar el porcentaje del molde de
entrada convertido a producto de fusión, las traducciones se
realizaron usando molde de ARNm-ligador marcado con
^{32}P. Cuando se usó el ligador flexible y la incubación
post-traduccional se realizó a -70ºC sin adición de
Mg^{2+}, alrededor del 20%, 40%, 40%, 35% y 20% del molde de
entrada se convirtió en fusión de ARNm-péptido
cuando la concentración del molde de ARN de entrada fue 800, 400,
200, 100 y 50 nM respectivamente (Figura 18). Se obtuvieron
resultados similares cuando la incubación
post-traduccional se realizó en presencia de 50 mM
de Mg^{2+}. Los mejores resultados se lograron usando lisados
obtenidos de Novagen, Amersham, o Ambion (Figura 19).
Las diferencias de movilidad entre las fusiones
de ARNm-péptido y los ARNm, según se miden mediante
SDS-PAGE, pueden ser muy pequeñas si el molde de
ARNm es largo. En tales casos, el molde se puede marcar en el
extremo 5' del ligador con ^{32}P. La porción de ARN larga se
puede digerir entonces con ARNasa H en presencia de una tablilla de
ADN complementario después de la traducción/incubación, y la
eficacia de la fusión se puede determinar mediante cuantificación
de la relación de ligador no modificado a fusión de
ligador-péptido. En comparación con la digestión
con ARNasa A, que produce 3'-P y
5'-OH, este enfoque tiene la ventaja de que no se
elimina el ^{32}P en el extremo 5' del ligador.
Fusión intramolecular frente a intermolecular
durante la incubación post-traduccional. Además
de los experimentos anteriores, se estudió si la reacción de fusión
que ocurría a -20ºC en presencia de Mg^{2+} tenía una naturaleza
intra- o intermolecular. Se coincubó ligador libre (dA_{27}dCdCP o
dA_{21}C_{9}C_{9}C_{9}dAdCdCP, en el que C_{9} es
-O(CH_{2}CH_{2}O)_{3}PO_{2}-), con un molde
que contiene un ligador de ADN, pero sin puromicina en el extremo
3', en las condiciones de traducción y de incubación
post-traduccional descritas anteriormente. En estos
experimentos, no se incorporó en el producto de
ligador-péptido ninguna cantidad detectable (esto
es, menos de 2% del nivel normal) de ^{35}S-Met,
sugiriendo que la fusión post-traduccional se
produjo principalmente entre el péptido naciente y el ARNm unido al
mismo ribosoma.
Resultados de optimización. Como se
ilustró anteriormente, usando el ligador flexible y/o realizando la
incubación post-traduccional en presencia de una
concentración elevada de Mg^{2+}, se aumentó las eficacias de la
fusión hasta aproximadamente el 40% del ARNm de entrada. Estos
resultados indicaron que se pudieron generar tantas como 10^{14}
moléculas de fusión de ARNm-péptido por ml de mezcla
de reacción de traducción in vitro, produciendo conjuntos de
fusiones de ARNm-péptido de complejidad muy elevada
para uso en experimentos de selección in vitro.
Se ha demostrado la factibilidad del uso de
fusiones de ARN-péptido en experimentos de selección
y de evolución enriqueciendo una fusión particular de
ARN-péptido a partir de un conjunto complejo de
fusiones de secuencias al azar en base al péptido codificado. En
particular, se preparó una serie de mezclas en las que se combinó
una pequeña cantidad de secuencia conocida (en este caso, el molde
de myc largo, LP154) con cierta cantidad de conjunto de secuencia
al azar (esto es, LP160). Estas mezclas se tradujeron, y los
productos de la fusión de ARN-péptido se
seleccionaron mediante cromatografía de afinidad de disulfuro y de
oligonucleótidos como se describe en la presente memoria. Las
fusiones de molde de myc se inmunoprecipitaron selectivamente con
anticuerpo monoclonal anti-myc (Figura 16A). Para
medir en enriquecimiento obtenido en esta etapa selectiva, se
amplificaron mediante PCR, en presencia de un cebador marcado
radioactivamente, alícuotas de la mezcla de fusiones de
ADNc/ARNm-péptido procedentes antes y después de la
inmunoprecipitación. El ADN amplificado se digirió con endonucleasa
de restricción que cortó la secuencia del molde de myc, pero no el
conjunto (Figuras 16B y 16C). La cuantificación de la relación de
ADN cortado y sin cortar indicó que la secuencia de myc estaba
enriquecida unas 20-40 veces con relación a la
librería aleatoria mediante inmunoprecipitación.
Estos experimentos se llevaron a cabo según lo
siguiente.
Reacciones de traducción. Las reacciones
de traducción se realizaron generalmente como se describe antes.
Específicamente, las reacciones se realizaron a 30ºC durante una
hora según las especificaciones del fabricante (Novagen) y se
congelaron toda la noche a -20ºC. Se obtuvieron dos versiones de
seis muestras, una que contiene ^{35}S-metionina
y una que contiene metionina fría añadida hasta una concentración
final de 52 \muM. Las reacciones 1-6 contenían
las cantidades de moldes descritas en la Tabla 2. Todos los números
en la Tabla 2 representan picomoles de molde por 25 \mul de
mezcla de reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
Reacción | LP154 | LP160 |
1 | - - - | - - - |
2 | 5 | - - - |
3 | 1 | 20 |
4 | 0,1 | 20 |
5 | 0,01 | 20 |
6 | - - - | 20 |
Preparación de dT_{25} estreptavidina
agarosa. La estreptavidina agarosa (Pierce) se lavó tres veces
con TE 8.2 (10 mM de Tris·Cl pH 8,2, 1 mM de EDTA), y se
resuspendió como una suspensión 1:1 (v/v) en TE 8.2. Después se
añadió 3' biotinil T_{25}, sintetizado usando Bioteg CPG (Glen
Research), hasta la concentración final deseada (generalmente 10 ó
20 \muM), y la incubación se llevó a cabo con agitación durante 1
hora. La dT_{25} estreptavidina agarosa se lavó entonces tres
veces con TE 8.2, y se almacenó a 4ºC hasta el uso.
Purificación de moldes a partir de reacciones
de traducción. Para purificar moldes procedentes de reacciones
de traducción, se eliminaron 25 \mul de cada reacción y se
añadieron a 7,5 ml de tampón de aislamiento (1 M de NaCl, 100 mM de
Tris-Cl pH 8,2, 10 mM de EDTA, 0,1 mM de DTT), y 125
\mul de 20 \muM de dT_{25} estreptavidina agarosa. Esta
disolución se incubó a 4ºC durante una hora con rotación. Los tubos
se centrifugaron, y se eliminó el eluyente. Se añadió un ml de
tampón de aislamiento, la suspensión se resuspendió, y las mezclas
se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Las muestras
se lavaron entonces cuatro veces con alícuotas de 1 ml de tampón de
aislamiento enfriado con hielo. Después se combinaron las muestras
caliente y fría procedentes de reacciones idénticas en un filtro
Millipore MC de una unidad de filtro, y se eluyeron a partir de la
dT_{25} agarosa lavando con 2 volúmenes de 100 \mul de
H_{2}O, 0,1 mM de DTT, y 2 volúmenes de 15 mM de NaOH, 1 mM de
EDTA.
A este eluyente se añadieron 40 \mul de una
suspensión al 50% de tiopropilsefarosa (Pharmacia) lavada, y la
incubación se llevó a cabo a 4ºC con rotación durante 1 hora. Las
muestras se lavaron entonces con tres volúmenes de 1 ml de TE 8.2,
y se eliminó el eluyente. Se añadió un \mul de 1 M de DTT al
sólido (volumen total de aproximadamente 20-30
\mul), y la muestra se incubó durante varias horas, se eliminó, y
se lavó cuatro veces con 20 \mul de H_{2}O (volumen total 90
\mul). El eluyente contenía 2,5 mM de tiopiridona, según se pudo
comprobar mediante absorbancia por UV. Se precipitaron con etanol 50
\mul de esta muestra añadiendo 6 \mul de 3 M de NaOAc pH 5,2,
10 mM de espermina, 1 \mul de glicógeno (10 mg/ml, Boehringer
Mannheim), y 170 \mul de EtOH al 100%, incubando durante 30
minutos a -70ºC, y centrifugando durante 30 minutos a 13.000 rpm en
una microcentrífuga.
Reacciones de transcriptasa inversa. Las
reacciones de transcriptasa inversa se realizaron sobre las muestras
de eluyente tanto precipitadas con etanol como la que contiene
tiopiridona, según lo siguiente. Para las muestras precipitadas con
etanol, se hibridaron a 70ºC durante 5 minutos 30 \mul de molde
resuspendido, H_{2}O hasta 48 \mul, y 200 picomoles de cebador
21.103 (SEC ID nº: 22), y se enfrió en hielo. A esta muestra, se
añadieron 16 \mul del primer tampón de hebra (250 mM de Tris·Cl pH
8,3, 375 mM de KCl, y 15 mM de MgCl_{2}; disponible de Gibco BRL,
Grand Island, NY), 8 \mul de 100 mM de DTT, y 4 \mul de 10 mM de
NTP, y se equilibró a 42ºC, y se añadieron 4 \mul de
transcriptasa inversa Superscript II (Gibco BRL, Grand Island, NY).
Se añadió H_{2}O (13 \mul) al eluyente de TP sefarosa (35
\mul), y las reacciones se realizaron como antes. Después de la
incubación durante una hora, se combinaron un número igual de
muestras (volumen total 160 \mul). Se reservaron 10 \mul de
muestra para la PCR de cada muestra no seleccionada, y se reservaron
150 \mul de muestra para la inmunoprecipitación.
Inmunoprecipitación. Para llevar a cabo
las inmunoprecipitaciones, se añadieron 170 \mul de reacción de
transcriptasa inversa a 1 ml de tampón de dilución (10 mM de
Tris·Cl, pH 8,2, 140 mM de NaCl, 1% v/v de Tritón
X-100) y 20 \mul de conjugado de proteína G/A
(Calbiochem, La Jolla, CA), y se preaclaró mediante incubación a
4ºC con rotación durante 1 hora. Se eliminó el eluyente, y se
añadieron 20 \mul de conjugado de G/A y 20 \mul de anticuerpo
monoclonal (2 \mug, 12 picomoles), y la muestra se incubó con
rotación durante dos horas a 4ºC. El conjugado se precipitó
mediante microcentrifugación a 2500 rpm durante 5 minutos, se
eliminó el eluyente, y el conjugado se lavó tres veces con
alícuotas de 1 ml de tampón de dilución enfriado con hielo. La
muestra se lavó entonces con 1 ml de 10 mM de Tris·Cl, pH 8,2,
enfriado en hielo, 100 mM de NaCl. Los fragmentos unidos se
eliminaron usando 3 volúmenes de HOAc al 4% congelado, y las
muestras se liofilizaron hasta sequedad.
PCR de muestras seleccionadas y no
seleccionadas. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo
añadiendo 20 \mul de NH_{4}OH concentrado a 10 \mul del
material no seleccionado y a la totalidad del material seleccionado,
e incubando durante 5 minutos cada uno a 55ºC, 70ºC y 90ºC, para
destruir cualquier ARN presente en la muestra. Las muestras se
evaporaron entonces hasta sequedad usando un Speedvac. Se añadieron
a cada muestra 200 \mul de mezcla de PCR (1 \muM de cebadores
21.103 y 42.108, 200 \muM de dNTP en tampón de PCR más Mg^{2+}
(Boehringer Mannheim), y 2 \mul de Taq polimerasa (Boehringer
Mannheim)). Se realizaron 16 ciclos de PCR sobre el número 2 de las
muestras no seleccionadas, y se realizaron 19 ciclos sobre todas las
otras muestras.
Las muestras se amplificaron entonces en
presencia de cebador 21.103 marcado con ^{32}P en 5', según la
Tabla 3, y se purificaron dos veces individualmente usando kits de
purificación mediante PCR directa Wizard (Promega), para eliminar
todo el cebador y los fragmentos más cortos.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestra | Tipo | Volumen | Ciclos |
1 | No seleccionado | 20 \mul | 5 |
2 | No seleccionado | 5 \mul | 4 |
3 | No seleccionado | 20 \mul | 5 |
4 | No seleccionado | 20 \mul | 5 |
5 | No seleccionado | 20 \mul | 5 |
6 | No seleccionado | 20 \mul | 5 |
Muestra | Tipo | Volumen | Ciclos |
1 | Seleccionado | 20 \mul | 5 |
2 | Seleccionado | 5 \mul | 4 |
3 | Seleccionado | 20 \mul | 5 |
4 | Seleccionado | 20 \mul | 7 |
5 | Seleccionado | 20 \mul | 7 |
6 | Seleccionado | 20 \mul | 7 |
Digestiones de restricción. El ADN
marcado con ^{32}P, preparado a partir de cada una de las
reacciones de PCR anteriores, se añadió en cantidades iguales (por
cpm de muestra) a reacciones de digestión de restricción, según la
Tabla 4. El volumen total de cada reacción fue 25 \mul. Se añadió
a cada reacción 0,5 \mul de Alwnl (5 unidades, New England
Biolabs). Las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 hora, y la
enzima se inactivó por calor mediante una incubación de 20 minutos
a 65ºC. Las muestras se mezclaron entonces con 10 \mul de tampón
de carga desnaturalizante (1 ml de formamida ultrapura (USB), 20
\mul de 0,5 M de EDTA, y 20 \mul de 1 M de NaOH), se calentaron
hasta 90ºC durante 1 minuto, se enfriaron y se cargaron en un gel de
poliacrilamida desnaturalizante al 12% que contiene urea 8 M.
Después de la electroforesis, el gel se fijó con 10% (v/v) de HOAc,
10% (v/v) de MeOH, H_{2}O.
Muestra | Tipo | Volumen ADN añadido | Volumen |
a la reacción | total | ||
1 | No seleccionado | 20 \mul | 25 \mul |
2 | No seleccionado | 4 \mul | 25 \mul |
3 | No seleccionado | 20 \mul | 25 \mul |
4 | No seleccionado | 20 \mul | 25 \mul |
5 | No seleccionado | 4 \mul | 25 \mul |
6 | No seleccionado | 20 \mul | 25 \mul |
1 | Seleccionado | 20 \mul | 25 \mul |
2 | Seleccionado | 8 \mul | 25 \mul |
3 | Seleccionado | 12 \mul | 25 \mul |
4 | Seleccionado | 12 \mul | 25 \mul |
5 | Seleccionado | 20 \mul | 25 \mul |
6 | Seleccionado | 20 \mul | 25 \mul |
Cuantificación de la digestión. La
cantidad de ADN de myc frente a ADN del conjunto presente en la
muestra se cuantificó usando un formador de fosfoimágenes
(Molecular Dynamics). La cantidad de material presente en cada
banda se determinó como el volumen integrado de rectángulos
idénticos dibujados alrededor de las bandas de gel. El cpm total
presente en cada banda se calculó como el volumen menos el fondo. Se
usaron tres valores de fondo: (1) una media de cuadrados idénticos
fuera del área en la que se produjeron los recuentos en el gel; (2)
el cpm presente en la línea del conjunto sin seleccionar en la que
debería de aparecer la banda de myc (en esta posición no aparece
ninguna banda en el gel); y (3) un valor normalizado que reprodujo
el valor más próximo a los incrementos del molde de 10 veces entre
las líneas no seleccionadas. Las líneas 2, 3 y 4 de las Figuras 16B
y 16C demuestran en enriquecimiento de la secuencia diana frente a
la secuencia del conjunto. El enriquecimiento demostrable en la
línea 3 (no seleccionado/seleccionado) produjo los valores más
elevados (17, 43 y 27 veces usando los métodos 1-3,
respectivamente) debido a la optimización de la relación de señal a
ruido para esta muestra. Estos resultados se resumen en la Tabla
5.
Método | Línea 2 (20) | Línea 3 (200) | Línea 4 (2000) |
1 | 7,0 | 16,6 | 5,7 |
2 | 10,4 | 43 | 39 |
3 | 8,7 | 27 | 10,2 |
En un segundo conjunto de experimentos, estos
mismos productos de PCR se purificaron una vez usando kits de
purificación de PCR directa Wizard, y las digestiones se
cuantificaron mediante el método (2) anterior. En estos
experimentos, se obtuvieron resultados similares; se midieron
enriquecimientos de 10,7, 38 y 12 veces, respectivamente, para
muestras equivalentes a aquellas en las líneas 2, 3 y 4
anteriores.
Los sistemas de selección de la presente
invención tienen aplicaciones comerciales en cualquier área en la
que se use la tecnología de proteínas para resolver problemas
terapéuticos, de diagnóstico o industriales. Esta tecnología de
selección es útil para mejorar o alterar proteínas existentes, así
como para aislar nuevas proteínas con funciones deseadas. Estas
proteínas pueden ser secuencias de origen natural, pueden ser formas
alteradas de secuencias de origen natural, o pueden ser secuencias
parcial o totalmente sintéticas.
Aislamiento de nuevos reactivos de unión.
En una aplicación particular, la tecnología de la fusión de
ARN-proteína descrita en la presente memoria es
útil para el aislamiento de proteínas con propiedades de unión
específicas (por ejemplo, unión a ligandos). Las proteínas que
muestran interacciones de unión muy específicas se pueden usar como
reactivos de reconocimiento que no son anticuerpos, permitiendo que
la tecnología de la fusión de ARN-proteína burle a
la tecnología tradicional de anticuerpos monoclonales. Los reactivos
de tipo anticuerpo aislados mediante este método se pueden usar en
cualquier área en la que se utilicen anticuerpos tradicionales,
incluyendo aplicaciones de diagnóstico y terapéutico.
Mejora de los anticuerpos humanos. La
presente invención también se puede usar para mejorar anticuerpos
humanos o humanizados para el tratamiento de cualquiera de un
número de enfermedades. En esta aplicación, se desarrollan
librerías de anticuerpos y se seleccionan sistemáticamente in
vitro, eliminando la necesidad de técnicas tales como la fusión
celular o la presentación de fagos. En una aplicación importante, la
invención es útil para mejorar librerías de anticuerpos de una sola
cadena (Ward et al., Nature 341:544 (1989); y Goulot
et al., J. Mol. Biol. 213:617 (1990)). Para esta
aplicación, la región variable se puede construir a partir de una
fuente humana (para minimizar posibles reacciones inmunitarias
adversas del receptor), o puede contener un casete totalmente
aleatorizado (para maximizar la complejidad de la librería). Para
detectar sistemáticamente moléculas de anticuerpos mejoradas, se
ensaya un conjunto de moléculas candidatas para determinar la unión
a una molécula diana (por ejemplo, un antígeno inmovilizado como se
muestra en la Figura 2). Después se aplican niveles mayores de
restricción a la etapa de unión a medida que transcurre la selección
desde una ronda a la siguiente. Para aumentar la restricción, se
alteran las condiciones tales como el número de etapas de lavado,
la concentración de competidor en exceso, las condiciones del
tampón, la duración del tiempo de reacción de unión, y la elección
de la matriz de inmovilización.
Los anticuerpos monocatenarios se pueden usar
directamente para terapia, o indirectamente para el diseño de
anticuerpos estándares. Tales anticuerpos tienen un número de
aplicaciones potenciales, incluyendo el aislamiento de anticuerpos
anti-autoinmunitarios, supresión inmunitaria, y en
el desarrollo de vacunas para enfermedades víricas tales como
SIDA.
Aislamiento de nuevos catalizadores. La
presente invención también se puede usar para seleccionar nuevas
proteínas catalíticas. La selección in vitro y la evolución
se han usado previamente para el aislamiento de nuevos ARN y ADN
catalíticos, y, en la presente invención, se usan para el
aislamiento de nuevas enzimas proteínicas. En un ejemplo particular
de este enfoque, se puede aislar indirectamente un catalizador
seleccionando la unión a un análogo químico del estado de
transición del catalizador. En otro ejemplo particular, el
aislamiento directo se puede llevar a cabo seleccionando la
formación del enlace covalente con un sustrato (por ejemplo, usando
un sustrato enlazado a un marcador de afinidad), o mediante escisión
(por ejemplo, seleccionando la capacidad para romper un enlace
específico y de ese modo liberar miembros catalíticos de una
librería a partir de un soporte sólido).
Este enfoque para el aislamiento de nuevos
catalizadores tiene al menos dos ventajas importantes con respecto
a la tecnología de anticuerpos catalíticos (repasada en Schultz
et al., J. Chem. Engng. News 68:26 (1990)). En primer lugar,
en la tecnología de anticuerpos catalíticos, el conjunto inicial
está limitado generalmente al plegamiento de la inmunoglobulina;
por el contrario, la librería de partida de las fusiones de
ARN-proteína pueden ser completamente aleatorias,
pueden constar, sin limitación, de variantes de estructuras
enzimáticas conocidas o estructuras proteínicas. Además, el
aislamiento de anticuerpos catalíticos generalmente descansa en una
selección inicial de la unión a análogos de la reacción del estado
de transición, seguido de una identificación sistemática laboriosa
de anticuerpos activos; nuevamente, por el contrario, la selección
directa de catalizadores es posible usando un enfoque de librería
de fusión de ARN-proteína, como se demostró
previamente usando librerías de ARN. En un enfoque alternativo para
aislar enzimas proteínicas, se pueden combinar los enfoques del
análogo del estado de transición con el de selección directa.
Las enzimas obtenidas mediante este método son
muy valiosas. Por ejemplo, actualmente existe una necesidad
imperiosa de catalizadores industriales nuevos y eficaces que
permitan que se desarrollen procedimientos químicos mejorados. Una
ventaja principal de esta invención es que las elecciones se pueden
llevar a cabo en condiciones arbitrarias y no están limitadas, por
ejemplo, a condiciones in vivo. Por lo tanto, la invención
facilita el aislamiento de nuevas enzimas o variantes mejoradas de
enzimas existentes que pueden llevar a cabo transformaciones muy
específicas (y de ese modo minimicen la formación de subproductos
indeseados), a la vez que funcionen en entornos predeterminados
como por ejemplo entornos de temperatura, presión, o concentración
de disolvente elevados.
Una trampa de interacción in
vitro . La tecnología de fusión de
ARN-proteína también es útil para identificar
sistemáticamente librerías de ADNc y clonar nuevos genes en base a
las interacciones proteína-proteína. Mediante este
método, se genera una librería de ADNc a partir de una fuente
deseada (por ejemplo, mediante el método de Ausubel et al.,
citado anteriormente, capítulo 5). A cada uno de los ADNc
candidatos, se liga (por ejemplo, usando las técnicas descritas
anteriormente para la generación de LP77, LP154 y LP160) un aceptor
de péptidos (por ejemplo, como una cola de puromicina). Después,
las fusiones de ARN-proteína se generan como se
describe en la presente memoria, y entonces se estudia como se
describe anteriormente la capacidad de estas fusiones (o de
versiones mejoradas de las fusiones) para interactuar con moléculas
particulares. Si se desea, se pueden evitar en este procedimiento
codones de parada y regiones de 3'UTR (i) añadiendo ARNt supresor
para permitir la lectura de las regiones de parada, (ii) eliminando
el factor de liberación de la reacción de traducción mediante
inmunoprecipitación, (iii) una combinación de (i) y (ii), o (iv) la
eliminación de los codones de parada y 3'UTR de las secuencias de
ADN.
El hecho de que la etapa de interacción tiene un
lugar in vitro permite el control cuidadoso de la restricción
de la reacción, usando condiciones iónicas, de temperatura y de
competidor no específico. La alteración de moléculas pequeñas
normales con análogos no hidrolizables (por ejemplo, ATP frente a
ATPgS) proporciona selecciones que discriminan entre diferentes
confórmeros de la misma molécula. Este enfoque es útil tanto para la
clonación como para la identificación funcional de muchas
proteínas, puesto que la secuencia de ARN de la pareja de unión
seleccionada se une covalentemente y por lo tanto se puede aislar
fácilmente. Además, la técnica es útil para identificar funciones e
interacciones de los \sim50-100.000 genes humanos,
cuyas secuencias están siendo determinadas actualmente mediante el
proyecto de Genoma Humano.
Los "chips de ADN" constan de conjuntos
espacialmente definidos de oligonucleótidos inmovilizados o
fragmentos clonados de ADNc o ADN genómico, y tienen aplicaciones
tales como la secuenciación rápida y la obtención del perfil del
transcripto. Hibridando una mezcla de fusiones de
ARN-proteína (por ejemplo, generadas a partir de un
conjunto de ADN o ARN celular), a tal chip de ADN, es posible
generar un "chip de presentación de proteína", en el que cada
punto que corresponde a una secuencia inmovilizada es capaz de
hibridarse a su secuencia de ARN correspondiente en el conjunto de
fusiones de ARN-proteína. Mediante este enfoque, la
proteína correspondiente se inmoviliza de una manera espacialmente
definida debido a su enlace a su propio ARNm, y los chips que
contienen conjuntos de secuencias de ADN presentan el conjunto
correspondiente de proteínas. Como alternativa, los fragmentos
peptídicos de estas proteínas se pueden presentar si la librería de
fusión se genera a partir de fragmentos más pequeños de ADNc o ADN
genómicos.
Dichas presentaciones ordenadas de proteínas y
péptidos tienen muchos usos. Por ejemplo, representan herramientas
poderosas para la identificación de interacciones
proteína-proteína previamente desconocidas. En un
formato específico, se marca de forma detectable una proteína sonda
(por ejemplo, con un colorante fluorescente), y la proteína marcada
se incuba con un chip de presentación de proteína. Mediante este
enfoque, se determina la identidad de proteínas que son capaces de
unirse a la proteína sonda, a partir de la localización de las
manchas en el chip que se marcan debido a la unión de la sonda. Otra
aplicación es la determinación rápida de proteínas que se modifican
químicamente mediante la acción de enzimas modificadoras (por
ejemplo, proteinaquinasas, aciltransferasas, y metiltransferasas).
Incubando el chip de presentación de proteína con la enzima de
interés y con un sustrato marcado radioactivamente, después del
lavado y la autorradiografía, se pueden determinar fácilmente la
localización y por tanto la identidad de aquellas proteínas que son
sustratos para la enzima modificadora. Además, el uso de este
enfoque con presentaciones ordenadas de pequeños péptidos permite la
localización adicional de tales sitios de modificación.
La tecnología de presentación de proteínas se
puede llevar a cabo usando conjuntos de ácidos nucleicos (incluyendo
ARN, pero preferentemente ADN) inmovilizados sobre cualquier
soporte sólido apropiado. Los soportes sólidos ejemplares pueden
estar hechos de materiales tales como vidrio (por ejemplo, placas de
vidrio), silicio o vidrio de silicio (por ejemplo, microchips), u
oro (por ejemplo, placas de oro). Los métodos para unir ácidos
nucleicos a regiones precisas en tales superficies sólidas, por
ejemplo métodos fotolitográficos, son bien conocidos en la técnica,
y se pueden usar para generar soportes sólidos (tales como chips de
ADN) para uso en la invención. Los métodos ejemplares para este fin
incluyen, sin limitación, Schena et al., Science
270:467-470 (1995); Kozal et al.,
Nature Medicine 2:753-759 (1996); Cheng et
al., Nucleic Acids Research 24:380-385
(1996); Lipshutz et al., BioTechniques
19:442-447 (1995); Pease et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026 (1994);
Fodor et al., Nature 364:555-556
(1993); Pirrung et al., patente U.S. nº 5.143.854; y Fodor
et al., documento WO 92/10092.
<110> Szostak, Jack W.
\hskip1cmRoberts, Richard W.
\hskip1cmLiu, Rihe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SELECCIÓN DE PROTEÍNAS USANDO
FUSIONES DE ARN-PROTEÍNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C29610EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/035,963
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 21/02/1997
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/064,491
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 06/11/1997
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Windows NT, Word 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido aleatorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es cualquier aminoácido.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}
\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Gln Leu Arg Asn Ser}
\sac{Cys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del mosaico del tabaco
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiprgrgrgrarc rararurura rcruraruru rurarcrara rururarcra
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiprgrgrargrg rarcrgrara
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211>34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
Asp Leu Leu Arg Lys}
\sac{Arg Arg Glu Gln Lys Leu Lys His Lys Leu
Glu Gln Leu Arg Asn Ser}
\sac{Cys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaaaaa cc
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggttttt atttttttt ttcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiprgrgrargrg rarcrgrara rarurugaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaacc
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiprgrgrargrg rarcrgrara rcrurgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaacc
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiprgrgrargrg rarcrgrara rarurgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaacc
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiprgrgrargrg rarcrgrara rcrurgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaacc
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiprgrgrargrg rarcrgrara rcrurgaaaa aaaaaaaaaa aaaacc
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiprgrgrargrg rarcrgrara rcrurgaaaa aaaaaaaaaa acc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 289
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Molde de traducción
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(289)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttcaggtct tcttgagaga tcagtttctg ttccatttcg tcctccctat agtgagtcgt
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatta
\hfill64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactatag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgcaagag ttacgcagct g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caatggctga agaacagaaa
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctg
\hfill63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
Asp Leu Leu Arg Lys}
\sac{Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu
Gln Leu Arg Asn Ser Cys}
\sac{Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores para el conjunto de
ARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgttaat gataaatgtt aatgttacgt cgacgcattg agataccga
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores para el conjunto de
ARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta ca
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebadores para el conjunto de
ARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgcaagag ttacgcagct g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tablilla de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttttttt agcgcaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtatttg tgagccag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Fago T7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactataggg acacttgctt ttgacacaac
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tablilla de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttttttt gtggtatttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homosapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tablilla de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttttttttt agcgcaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Método para la selección de un ARN proteínico
deseado, o molécula de ADN, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- proporcionar una población de moléculas de ARN candidatas, cada una de las cuales comprende una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de partida enlazado funcionalmente a una secuencia codificante de proteína candidata, y cada una de las cuales está enlazada covalentemente a un aceptor peptídico en el extremo 3' de dicha secuencia codificante de proteína candidata;
- b)
- traducir in vitro o in situ dichas secuencias codificantes de proteínas candidatas, para producir una población de fusiones de candidatas ARN-proteína; y
- c)
- seleccionar una fusión de deseada ARN-proteína, seleccionando de ese modo dicha proteína deseada o dicho ARN deseado;
o generar, a partir de dicha molécula de ARN de
dicha fusión, una molécula de ADN que codifica dicha proteína
deseada, seleccionando de ese modo dicha molécula de ADN
deseada.
2. Método para la selección de una proteína que
tiene una función alterada, o una molécula de ADN que codifica una
proteína que tiene una función alterada con relación a una proteína
de referencia, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- producir una población de moléculas de ARN candidatas a partir de una población de moldes de ADN candidatos, teniendo cada uno de dichos moldes de ADN candidatos una secuencia codificante de proteína candidata que difiere de dicha secuencia codificante de proteína de referencia, comprendiendo cada una de dichas moléculas de ARN una secuencia de iniciación de la traducción y un codón de partida enlazado funcionalmente a dicha secuencia codificante de proteína candidata, y estando cada una enlazada covalentemente a un aceptor peptídico en el extremo 3';
- b)
- traducir in vitro o in situ dichas secuencias codificantes de proteínas candidatas, para producir una población de fusiones candidatas de ARN-proteína; y
- c)
- seleccionar una fusión de ARN-proteína que tiene una función alterada, seleccionando de ese modo dicha proteína que tiene dicha función alterada;
o generar a partir de dicha molécula de ARN de
dicha fusión una molécula de ADN que codifica dicha proteína
deseada, seleccionando de ese modo dicha molécula de ADN
deseada.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha proteína deseada o dicho ARN deseado en la etapa (c) se
selecciona mediante
la puesta en contacto de dicha población de
fusiones de ARN-proteína con una pareja de unión
específica para la porción de ARN o para la porción proteínica de
dicha fusión de ARN-proteína, en condiciones que
separan sustancialmente dicho complejo de pareja de
unión-fusión de ARN-proteína de los
miembros no unidos de dicha población;
la liberación de dichas fusiones unidas de
ARN-proteína a partir de dicho complejo; y
la puesta en contacto de dicha población de
fusiones de ARN-proteína de la etapa (c) con una
pareja de unión específica para la porción proteínica de dicha
fusión deseada de ARN-proteína, en condiciones que
separen sustancialmente dicho complejo de pareja de
unión-fusión de ARN-proteína de los
miembros no unidos de dicha población, seleccionando de ese modo la
proteína deseada o el ARN deseado.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
dicho método comprende además repetir las etapas (a) a (c) de la
reivindicación 1.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho aceptor peptídico es
puromicina.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que cada una de dichas moléculas de
ARN candidatas comprende además una secuencia de pausa, o comprende
además una secuencia de ADN o de análogo de ADN enlazada
covalentemente al extremo 3' de dicha molécula de ARN.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha población de moléculas de
ARN candidatas comprende al menos 10^{13} moléculas diferentes de
ARN.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha reacción de traducción in
vitro se lleva a cabo en un lisado preparado a partir de una
célula eucariota o porción de la misma.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
dicha reacción de traducción in vitro se lleva a cabo en un
lisado reticulocítico o en un lisado de germen de trigo.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha reacción de traducción in
vitro se lleva a cabo en un lisado preparado a partir de una
célula bacteriana o una porción de la misma.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha etapa de selección comprende
unir dicha proteína deseada a una pareja de unión inmovilizada.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha etapa de selección comprende
evaluar una actividad funcional de dicha proteína deseada.
13. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que dicha molécula de ADN se amplifica.
14. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que dicho método comprende además repetir la etapa (a) a (c).
15. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que dicho método comprende además transcribir una molécula de ARN
a partir de dicha molécula de ADN, y repetir las etapas (a) a
(c).
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho ARN está enlazado
covalentemente a través de un enlace de amida a dicha proteína en
dicha fusión de ARN-proteína.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho ARN está enlazado
covalentemente a dicha proteína en dicha fusión de
ARN-proteína, siendo dicho enlace covalente
resistente a la ruptura mediante un ribosoma.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que, después de la etapa de traducción
in vitro, se lleva a cabo una incubación en presencia de
50-100 mM de Mg^{2+}.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha fusión de
ARN-proteína comprende además un ácido nucleico o
secuencia de análogo de ácido nucleico situada próxima a dicho
aceptor peptídico que aumenta la flexibilidad.
20. Fusión de ARN-proteína
seleccionada mediante cualquiera de los métodos según las
reivindicaciones 1 a 4.
21. Molécula que comprende un ácido ribonucleico
enlazado covalentemente a través de un enlace de amida a una
proteína.
22. Molécula según la reivindicación 21, en la
que dicha proteína está codificada por dicho ácido ribonucleico.
23. Molécula según la reivindicación 21, en la
que dicho ácido ribonucleico es un ARN mensajero.
24. Molécula que comprende un ácido ribonucleico
enlazado covalentemente a una proteína, siendo dicha proteína
codificada completamente por dicho ácido ribonucleico.
25. Molécula según la reivindicación 24, en la
que dicho ácido ribonucleico es ARN mensajero.
26. Molécula que comprende un ácido ribonucleico
enlazado covalentemente a una proteína, siendo dicho enlace
covalente resistente a la ruptura mediante un ribosoma.
27. Molécula según la reivindicación 26, en la
que dicho ácido ribonucleico es ARN mensajero.
28. Ácido ribonucleico que comprende una
secuencia de iniciación de la traducción y un codón de partida
enlazado funcionalmente a una secuencia codificante de proteína
candidata, estando dicho ácido ribonucleico enlazado covalentemente
a un aceptor peptídico en el extremo 3' de dicha secuencia
codificante de proteína candidata.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US3596397P | 1997-01-21 | 1997-01-21 | |
US35963P | 1997-01-21 | ||
US6449197P | 1997-11-06 | 1997-11-06 | |
US64491P | 1997-11-06 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2268763T3 true ES2268763T3 (es) | 2007-03-16 |
Family
ID=26712662
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES98904574T Expired - Lifetime ES2268763T3 (es) | 1997-01-21 | 1998-01-14 | Seleccion de proteinas usando fusiones de arn-proteina. |
ES06013825T Expired - Lifetime ES2373110T3 (es) | 1997-01-21 | 1998-01-14 | Selección de proteínas usando fusiones de arn-proteína. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES06013825T Expired - Lifetime ES2373110T3 (es) | 1997-01-21 | 1998-01-14 | Selección de proteínas usando fusiones de arn-proteína. |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6258558B1 (es) |
EP (2) | EP1712623B1 (es) |
JP (1) | JP3692542B2 (es) |
KR (1) | KR100566859B1 (es) |
CN (1) | CN1238366C (es) |
AT (2) | ATE332368T1 (es) |
AU (1) | AU738328B2 (es) |
CA (1) | CA2278786C (es) |
DE (1) | DE69835143T2 (es) |
DK (2) | DK1712623T3 (es) |
ES (2) | ES2268763T3 (es) |
HK (1) | HK1027577A1 (es) |
IL (1) | IL131016A (es) |
PT (2) | PT971946E (es) |
RU (1) | RU2233878C2 (es) |
TW (1) | TW589323B (es) |
WO (1) | WO1998031700A1 (es) |
Families Citing this family (434)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR0184860B1 (ko) * | 1988-11-11 | 1999-04-01 | 메디칼 리써어치 카운실 | 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법) |
WO1998016636A1 (fr) * | 1996-10-17 | 1998-04-23 | Mitsubishi Chemical Corporation | Molecule permettant d'homologuer un genotype et un phenotype, et utilisation de celle-ci |
US8207093B2 (en) | 1997-01-21 | 2012-06-26 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
US6261804B1 (en) * | 1997-01-21 | 2001-07-17 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
EP1908832B1 (en) | 1997-07-07 | 2012-12-26 | Medical Research Council | A method for increasing the concentration of a nucleic acid molecule |
WO2003070984A1 (en) * | 2002-02-15 | 2003-08-28 | Somalogic, Inc. | Methods and reagents for detecting target binding by nucleic acid ligands |
US20070166741A1 (en) | 1998-12-14 | 2007-07-19 | Somalogic, Incorporated | Multiplexed analyses of test samples |
US6242246B1 (en) | 1997-12-15 | 2001-06-05 | Somalogic, Inc. | Nucleic acid ligand diagnostic Biochip |
DE69933369D1 (en) * | 1998-04-03 | 2006-11-09 | Compound Therapeutics Inc | Adressierbare protein arrays |
US6440695B1 (en) * | 1998-04-17 | 2002-08-27 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Method for producing diverse libraries of encoded polypeptides |
US20030170820A1 (en) * | 1998-05-08 | 2003-09-11 | Gregory Coia | Continuous in- vitro evolution |
JP4240574B2 (ja) * | 1998-05-15 | 2009-03-18 | 三菱化学株式会社 | タンパク質のラベル化組成物およびタンパク質のラベル化方法 |
US6287765B1 (en) * | 1998-05-20 | 2001-09-11 | Molecular Machines, Inc. | Methods for detecting and identifying single molecules |
AU2004200998B2 (en) * | 1998-08-17 | 2007-01-11 | Compound Therapeutics, Inc. | Methods for producing nucleic acids lacking 3'-untranslated regions and optimizing cellular RNA-protein fusion formation |
WO2000009737A1 (en) * | 1998-08-17 | 2000-02-24 | Phylos, Inc. | Methods for producing nucleic acids lacking 3'-untranslated regions and optimizing cellular rna-protein fusion formation |
PT1105360E (pt) * | 1998-08-17 | 2009-09-30 | Bristol Myers Squibb Co | Identificação de interacções entre compostos-proteínas, utilizando bibliotecas de moléculas de fusão entre proteínas-ácidos nucleicos |
AU775997B2 (en) * | 1998-12-02 | 2004-08-19 | Bristol-Myers Squibb Company | DNA-protein fusions and uses thereof |
DE69941267D1 (de) * | 1998-12-10 | 2009-09-24 | Bristol Myers Squibb Co | Proteingerüste für antikörper-nachahmer und andere bindende proteine |
US6818418B1 (en) * | 1998-12-10 | 2004-11-16 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
US7115396B2 (en) | 1998-12-10 | 2006-10-03 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
GB9900298D0 (en) * | 1999-01-07 | 1999-02-24 | Medical Res Council | Optical sorting method |
AU2004242526B2 (en) * | 1999-01-07 | 2007-08-30 | United Kingdom Research And Innovation | Optical Sorting Method |
AU4231000A (en) | 1999-04-12 | 2000-11-14 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | In vitro ribosome evolution |
WO2004009618A2 (en) * | 2002-07-18 | 2004-01-29 | Crucell Holland B.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
DE19923966C2 (de) * | 1999-05-25 | 2003-04-24 | Phylos Inc | Erkennungssystem zur Auftrennung von Probenbestandteilen, seine Herstellung und Verwendung |
US6623926B1 (en) | 1999-06-01 | 2003-09-23 | Phylos, Inc. | Methods for producing 5′-nucleic acid-protein conjugates |
EP1194594A4 (en) * | 1999-07-12 | 2005-06-01 | Compound Therapeutics Inc | MARKING OF PROTEINS AT C-TERMINUS |
PT1196637E (pt) * | 1999-07-27 | 2007-07-04 | Adnexus Therapeutics Inc | Métodos de ligação de aceitadores de péptidos. |
AU2008200974B2 (en) * | 1999-07-27 | 2012-05-03 | Bristol-Myers Squibb Company | Peptide acceptor ligation methods |
EP1212452B1 (en) * | 1999-08-27 | 2013-07-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for encoding and sorting in vitro translated proteins |
AU7721100A (en) * | 1999-10-01 | 2001-05-10 | Zhongping Yu | Compositions and methods for identifying polypeptides and nucleic acid molecules |
DE19959857C1 (de) * | 1999-12-10 | 2001-06-28 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Testsystem zum Nachweis von Analyten sowie ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung |
AU2788101A (en) * | 2000-01-11 | 2001-07-24 | Maxygen, Inc. | Integrated systems and methods for diversity generation and screening |
AU783689B2 (en) * | 2000-01-24 | 2005-11-24 | Adnexus Therapeutics, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
US7022479B2 (en) * | 2000-01-24 | 2006-04-04 | Compound Therapeutics, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
CA2399241A1 (en) * | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Phylos, Inc. | Improved methods for generating catalytic proteins |
US6489106B1 (en) * | 2000-03-10 | 2002-12-03 | Nec Research Institute, Inc. | Control of the expression of anchored genes using micron scale heaters |
US8288322B2 (en) | 2000-04-17 | 2012-10-16 | Dyax Corp. | Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries |
AU2001261233A1 (en) * | 2000-05-05 | 2001-11-12 | Selegen | Identification of polypeptides and nucleic acid molecules using linkage between dna and polypeptide |
US20040229271A1 (en) * | 2000-05-19 | 2004-11-18 | Williams Richard B. | Compositions and methods for the identification and selection of nucleic acids and polypeptides |
US7410761B2 (en) | 2000-05-19 | 2008-08-12 | Proteonova, Inc. | System for rapid identification and selection of nucleic acids and polypeptides, and method thereof |
US6962781B1 (en) | 2000-05-19 | 2005-11-08 | Proteonova, Inc. | In vitro evolution of nucleic acids and encoded polypeptide |
JP2003533995A (ja) * | 2000-05-19 | 2003-11-18 | リチャード、 ビー. ウィリアムズ、 | 核酸およびコードされたポリペプチドのinvitroでの展開 |
AU2001271636A1 (en) | 2000-06-29 | 2002-01-14 | Abbott Laboratories | Dual specificity antibodies and methods of making and using |
DE10033194C2 (de) * | 2000-07-07 | 2002-07-18 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Biosonden und deren Verwendung |
JP4719403B2 (ja) * | 2000-08-15 | 2011-07-06 | ディサーナ リミテッド | 機能的タンパク質アレイ |
DE10041238A1 (de) * | 2000-08-22 | 2002-03-07 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Verfahren zur Identifizierung spezifisch spaltbarer peptide und Verwendung solcher Peptidsequenzen |
DE60143959D1 (de) | 2000-08-25 | 2011-03-10 | Basf Plant Science Gmbh | En kodieren |
EP1356075A4 (en) | 2000-10-16 | 2005-04-13 | Compound Therapeutics Inc | PROTEIN EQUIPMENT FOR ANTIBODY MIMETICS AND OTHER TIE PROTEINS |
US6841359B2 (en) | 2000-10-31 | 2005-01-11 | The General Hospital Corporation | Streptavidin-binding peptides and uses thereof |
JP4516273B2 (ja) * | 2000-11-15 | 2010-08-04 | ミナーヴァ・バイオテクノロジーズ・コーポレーション | オリゴヌクレオチド識別子 |
JP3750020B2 (ja) * | 2000-12-07 | 2006-03-01 | 学校法人慶應義塾 | C末端修飾タンパク質およびその製造方法、ならびに、c末端修飾タンパク質の製造に用いる修飾剤および翻訳テンプレート、ならびに、c末端修飾タンパク質を用いたタンパク質相互作用の検出方法 |
JP4963142B2 (ja) * | 2000-12-14 | 2012-06-27 | 学校法人慶應義塾 | 遺伝子型と表現型の対応付け分子とその構成要素、および対応付け分子の製造方法と利用方法 |
US7273923B2 (en) * | 2001-01-22 | 2007-09-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
WO2002059601A1 (en) | 2001-01-23 | 2002-08-01 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleic-acid programmable protein arrays |
WO2002074929A2 (en) * | 2001-03-19 | 2002-09-26 | President And Fellows Of Harvard College | Evolving new molecular function |
US20040253578A1 (en) * | 2001-04-02 | 2004-12-16 | Roberts Radclyffe L. | Dynamic action reference tools |
AU2002256076A1 (en) * | 2001-04-10 | 2002-10-28 | Interlock Industries, Inc. | Water based adhesive |
JP2008099700A (ja) * | 2001-05-11 | 2008-05-01 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 任意のポリペプチドをコードするDNAの転写産物と翻訳産物との安定的な複合体を形成させる方法、該方法に用いる核酸構築物、該方法により形成される複合体、並びに該方法を利用した機能性タンパク質および該タンパク質をコードするmRNAまたはDNAのスクリーニング |
WO2004001042A2 (en) * | 2002-06-20 | 2003-12-31 | Nuevolution A/S | Microarrays displaying encoded molecules |
WO2002103008A2 (en) * | 2001-06-20 | 2002-12-27 | Nuevolution A/S | Templated molecules and methods for using such molecules |
WO2002102820A1 (en) | 2001-06-20 | 2002-12-27 | Nuevolution A/S | Nucleoside derivatives for library preparation |
US20060234231A1 (en) * | 2001-06-20 | 2006-10-19 | Nuevolution A/S | Microarrays displaying encoded molecules |
US9777312B2 (en) | 2001-06-30 | 2017-10-03 | Enzo Life Sciences, Inc. | Dual polarity analysis of nucleic acids |
US20040161741A1 (en) * | 2001-06-30 | 2004-08-19 | Elazar Rabani | Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification |
US20030143612A1 (en) * | 2001-07-18 | 2003-07-31 | Pointilliste, Inc. | Collections of binding proteins and tags and uses thereof for nested sorting and high throughput screening |
JP2004537312A (ja) * | 2001-07-31 | 2004-12-16 | フィロス インク. | 核酸−蛋白質融合多量体のモジュラーアッセンブリ |
US7172905B2 (en) | 2001-08-07 | 2007-02-06 | The University Of Chicago | Polypeptide immobilization |
DE10147074A1 (de) * | 2001-09-25 | 2003-05-08 | Beru Ag | Verfahren zum Betreiben einer aus mehreren Heizelementen bestehenden mehrstufigen elektrischen Heizung |
GB0127564D0 (en) | 2001-11-16 | 2002-01-09 | Medical Res Council | Emulsion compositions |
CA2467836A1 (en) | 2001-11-20 | 2003-09-04 | Duke University | Interfacial biomaterials |
US7125669B2 (en) | 2001-11-27 | 2006-10-24 | Compound Therapeutics, Inc. | Solid-phase immobilization of proteins and peptides |
US7262054B2 (en) * | 2002-01-22 | 2007-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
DE20200926U1 (de) * | 2002-01-23 | 2002-04-18 | Hegenscheidt-MFD GmbH & Co. KG, 41812 Erkelenz | Festwalzgerät einer Festwalzmaschine für Kurbelwellen |
JP2003299489A (ja) * | 2002-02-08 | 2003-10-21 | Mitsubishi Chemicals Corp | 核酸構築物 |
CN101006177B (zh) * | 2002-03-15 | 2011-10-12 | 纽韦卢森公司 | 改善的用于合成模制分子的方法 |
AU2003218629A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-29 | Nuevolution A/S | A building block forming a c-c or a c-hetero atom bond uponreaction |
AU2003214033A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-29 | Nuevolution A/S | A building block capable of transferring a functional entity |
NO20021298L (no) * | 2002-03-15 | 2003-09-16 | Bjoern H Lindqvist | Metoder for peptid og protein påvisning i nukleinsyre chip- arrays |
WO2003078050A2 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Nuevolution A/S | A building block forming a c-c bond upon reaction |
WO2003089454A2 (en) * | 2002-04-19 | 2003-10-30 | California Institute Of Technology | Unnatural amino acid containing display libraries |
US20030198967A1 (en) * | 2002-04-23 | 2003-10-23 | Matson Robert S. | Multi-functional microarrays and methods |
US20030198973A1 (en) * | 2002-04-23 | 2003-10-23 | The Molecular Sciences Institute, Inc. | Chimeric fusion molecule for analyte detection and quantitation |
US20060073481A1 (en) * | 2002-04-23 | 2006-04-06 | The Molecular Sciences Institute | Formation and use of site specific nucleic acid coupled binding polypeptides |
US9321832B2 (en) | 2002-06-28 | 2016-04-26 | Domantis Limited | Ligand |
WO2004005918A2 (en) * | 2002-07-05 | 2004-01-15 | University Of Chicago | Characterization of biochips containing self-assembled monolayers with maldi-tof-ms |
USRE47770E1 (en) | 2002-07-18 | 2019-12-17 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
EP1539980B1 (en) * | 2002-08-01 | 2016-02-17 | Nuevolution A/S | Library of complexes comprising small non-peptide molecules and double-stranded oligonucleotides identifying the molecules |
CA2495881C (en) * | 2002-08-19 | 2014-07-08 | The President And Fellows Of Harvard College | Evolving new molecular function |
US20040043384A1 (en) * | 2002-08-28 | 2004-03-04 | Oleinikov Andrew V. | In vitro protein translation microarray device |
US7361635B2 (en) * | 2002-08-29 | 2008-04-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Simultaneous modulation of multiple genes |
AU2003286514A1 (en) * | 2002-10-18 | 2004-05-04 | Promega Corporation | Composition for separating molecules |
DK2348125T3 (en) | 2002-10-30 | 2017-10-02 | Nuevolution As | Process for the synthesis of a bifunctional complex |
AU2011226815B2 (en) * | 2002-10-30 | 2014-09-25 | Nuevolution A/S | Enzymatic encoding |
WO2004056994A2 (en) | 2002-12-19 | 2004-07-08 | Nuevolution A/S | Quasirandom structure and function guided synthesis methods |
US7083948B1 (en) * | 2002-12-24 | 2006-08-01 | Immunex Corporation | Polypeptide purification reagents and methods for their use |
CA2727850C (en) | 2003-01-29 | 2013-04-30 | 454 Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
KR100858081B1 (ko) * | 2003-02-14 | 2008-09-10 | 삼성전자주식회사 | 유전정보 코딩장치 및 방법 |
WO2004074501A2 (en) * | 2003-02-21 | 2004-09-02 | Nuevolution A/S | A method for obtaining structural information about an encoded molecule |
US20070026397A1 (en) | 2003-02-21 | 2007-02-01 | Nuevolution A/S | Method for producing second-generation library |
US20100022414A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-28 | Raindance Technologies, Inc. | Droplet Libraries |
US7915201B2 (en) | 2003-03-20 | 2011-03-29 | Nuevolution A/S | Ligational encoding of small molecules |
US8017323B2 (en) * | 2003-03-26 | 2011-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Free reactant use in nucleic acid-templated synthesis |
WO2004087730A2 (en) * | 2003-03-27 | 2004-10-14 | The Johns Hopkins University | Method for producing diverse libraries of encoded polymers |
GB0307428D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Compartmentalised combinatorial chemistry |
GB0307403D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Selection by compartmentalised screening |
US20060078893A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Medical Research Council | Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control |
US20050079546A1 (en) * | 2003-05-01 | 2005-04-14 | Dasa Lipovsek | Serum albumin scaffold-based proteins and uses thereof |
US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
EP2395016A3 (en) | 2003-05-30 | 2012-12-19 | Merus B.V. | Design and use of paired variable regions of specific binding molecules |
WO2004110964A2 (en) * | 2003-06-16 | 2004-12-23 | Nuevolution A/S | Encoded molecules by translation (emt) |
EP2532745B1 (en) | 2003-07-05 | 2015-09-09 | The Johns Hopkins University | Method and Compositions for Detection and Enumeration of Genetic Variations |
AU2004286198C1 (en) | 2003-08-18 | 2011-02-24 | Medimmune, Llc | Humanization of antibodies |
EP1670939B1 (en) | 2003-09-18 | 2009-11-04 | Nuevolution A/S | A method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds |
SG149004A1 (en) | 2003-12-05 | 2009-01-29 | Bristol Myers Squibb Co | Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors |
US20080220049A1 (en) * | 2003-12-05 | 2008-09-11 | Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company | Compositions and methods for intraocular delivery of fibronectin scaffold domain proteins |
JP5912211B2 (ja) | 2004-01-20 | 2016-04-27 | メルス ビー.ヴィー. | 結合タンパク質の混合物 |
WO2005078122A2 (en) * | 2004-02-17 | 2005-08-25 | Nuevolution A/S | Method for enrichment involving elimination by mismatch hybridisation |
US7704925B2 (en) | 2004-03-22 | 2010-04-27 | Nuevolution A/S | Ligational encoding using building block oligonucleotides |
US20050221339A1 (en) | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Medical Research Council Harvard University | Compartmentalised screening by microfluidic control |
US20060008844A1 (en) | 2004-06-17 | 2006-01-12 | Avidia Research Institute | c-Met kinase binding proteins |
CA2575446C (en) * | 2004-08-03 | 2014-03-25 | Becton, Dickinson And Company | Use of magnetic material to direct isolation of compounds and fractionation of multipart samples |
US7968287B2 (en) | 2004-10-08 | 2011-06-28 | Medical Research Council Harvard University | In vitro evolution in microfluidic systems |
ATE464381T1 (de) * | 2004-12-23 | 2010-04-15 | Ge Healthcare Bio Sciences | Rna-amplifikation auf ligationsbasis |
US10206998B2 (en) | 2005-01-12 | 2019-02-19 | Proteonova, Inc. | Modular targeted therapeutic agents and methods of making same |
JP2008526973A (ja) | 2005-01-12 | 2008-07-24 | プロテオノヴァ、 インコーポレイテッド | 標的治療薬を作製する方法 |
WO2006102095A2 (en) | 2005-03-18 | 2006-09-28 | Medimmune, Inc. | Framework-shuffling of antibodies |
WO2007011722A2 (en) | 2005-07-15 | 2007-01-25 | President And Fellows Of Harvard College | Reaction discovery system |
EP2500359A3 (en) | 2005-08-19 | 2012-10-17 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
TWI323734B (en) | 2005-08-19 | 2010-04-21 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
US7612181B2 (en) | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
ES2542501T3 (es) | 2005-09-30 | 2015-08-06 | Abbvie Deutschland Gmbh & Co Kg | Dominios de unión de proteínas de la familia de proteínas de moléculas de orientación repulsiva (RGM) y fragmentos funcionales de las mismas, así como su uso |
EP1785434A1 (en) | 2005-11-11 | 2007-05-16 | Ludwig-Maximilians-Universität München | Targeting and tracing of antigens in living cells |
CN101405295A (zh) | 2005-11-11 | 2009-04-08 | 沃泰克斯药物股份有限公司 | 丙型肝炎病毒变种 |
US7705138B2 (en) * | 2005-11-11 | 2010-04-27 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Hepatitis C virus variants |
JP2009520949A (ja) | 2005-11-16 | 2009-05-28 | アンブルックス,インコーポレイテッド | 非天然アミノ酸を含んでいる組成物および方法 |
RU2432362C2 (ru) | 2005-11-30 | 2011-10-27 | Эбботт Лэборетриз | Моноклональные антитела и их применения |
RU2442793C2 (ru) | 2005-11-30 | 2012-02-20 | Эбботт Лэборетриз | АНТИТЕЛА ПРОТИВ ГЛОБУЛОМЕРА Аβ, ИХ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ ЧАСТИ, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ГИБРИДОМЫ, НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, ВЕКТОРЫ, КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ, КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННЫЕ АНТИТЕЛА, ПРИМЕНЕНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ И СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УКАЗАННЫХ АНТИТЕЛ |
PT3305900T (pt) | 2005-12-01 | 2021-10-27 | Nuevolution As | Métodos de codificação enzimática para síntese eficaz de bibliotecas grandes |
US20080305559A1 (en) * | 2005-12-15 | 2008-12-11 | Gualberto Gonzalez-Sapienza | Non-Competitive Immunoassays to Detect Small Molecules |
EP3913375A1 (en) | 2006-01-11 | 2021-11-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors |
AU2007205974A1 (en) * | 2006-01-17 | 2007-07-26 | Somalogic, Incorporated | Multiplexed analyses of test samples |
WO2007087673A1 (en) | 2006-02-01 | 2007-08-09 | Arana Therapeutics Limited | Domain antibody construct |
US20070186296A1 (en) * | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Wyeth | Cloning, characterization, and application of tnfrsf19 in neurological disorders |
US7749957B2 (en) | 2006-04-06 | 2010-07-06 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Clay-binding peptides and methods of use |
US9074242B2 (en) | 2010-02-12 | 2015-07-07 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
EP2481815B1 (en) | 2006-05-11 | 2016-01-27 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic devices |
US9562837B2 (en) | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
US8178316B2 (en) | 2006-06-29 | 2012-05-15 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluating proteins |
WO2008005310A2 (en) * | 2006-06-30 | 2008-01-10 | Ambit Biosciences Corp. | Detectable nucleic acid tag |
US7572618B2 (en) | 2006-06-30 | 2009-08-11 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants |
WO2008016680A1 (en) * | 2006-08-02 | 2008-02-07 | California Institute Of Technology | Methods and systems for detecting and/or sorting targets |
EP2077912B1 (en) | 2006-08-07 | 2019-03-27 | The President and Fellows of Harvard College | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
CN101512008B (zh) | 2006-09-08 | 2015-04-01 | 艾伯维巴哈马有限公司 | 白介素-13结合蛋白 |
US20090252745A1 (en) * | 2006-09-15 | 2009-10-08 | Duke University | Amino acids in the HCV core polypeptide domain 3 and correlation with steatosis |
MX2009005466A (es) | 2006-11-22 | 2009-08-17 | Adnexus A Bristol Myers Sqibb | Terapeuticos dirigidos a base de proteinas manipuladas para receptores de tirosina cinasas, incluyendo receptor de factor de crecimiento tipo insulina-i. |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
WO2008082651A2 (en) | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Abbott Laboratories | Dual-specific il-1a/ il-1b antibodies |
US20110136099A1 (en) | 2007-01-16 | 2011-06-09 | Somalogic, Inc. | Multiplexed Analyses of Test Samples |
US7855054B2 (en) * | 2007-01-16 | 2010-12-21 | Somalogic, Inc. | Multiplexed analyses of test samples |
ATE516814T1 (de) | 2007-02-02 | 2011-08-15 | Bristol Myers Squibb Co | 10fn3 domain zur behandlung von krankheiten begleitet von unerwünschter angiogenese |
US8772046B2 (en) | 2007-02-06 | 2014-07-08 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
US9080256B2 (en) | 2007-02-12 | 2015-07-14 | Proteonova, Inc. | Generation of library of soluble random polypeptides linked to mRNA |
WO2008104386A2 (en) | 2007-02-27 | 2008-09-04 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Method for the treatment of amyloidoses |
US8592221B2 (en) | 2007-04-19 | 2013-11-26 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
US7829311B2 (en) | 2007-07-25 | 2010-11-09 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Ketosteroid isomerase inclusion body tag engineered to be acid-resistant by replacing aspartates with glutamate |
US7678883B2 (en) | 2007-07-25 | 2010-03-16 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Solubility tags for the expression and purification of bioactive peptides |
US7951559B2 (en) * | 2007-07-25 | 2011-05-31 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant peptide production using a cross-linkable solubility tag |
US8470966B2 (en) | 2007-08-10 | 2013-06-25 | Protelica, Inc. | Universal fibronectin type III binding-domain libraries |
JP5781762B2 (ja) * | 2007-08-10 | 2015-09-24 | プロテリックス、インク | ユニバーサルiii型フィブロネクチン結合ドメインのライブラリ |
US8680019B2 (en) * | 2007-08-10 | 2014-03-25 | Protelica, Inc. | Universal fibronectin Type III binding-domain libraries |
CA2964398C (en) | 2007-09-14 | 2023-03-07 | Adimab, Llc | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
US8877688B2 (en) | 2007-09-14 | 2014-11-04 | Adimab, Llc | Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor |
AU2008320823B2 (en) | 2007-11-02 | 2013-01-17 | Novartis Ag | Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6) |
US7794963B2 (en) | 2007-11-02 | 2010-09-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Use of tetracysteine tags in fluorescence-activated cell sorting analysis of prokaryotic cells producing peptides or proteins |
US8906700B2 (en) | 2007-11-06 | 2014-12-09 | Ambergen, Inc. | Methods and compositions for phototransfer |
US8883146B2 (en) | 2007-11-30 | 2014-11-11 | Abbvie Inc. | Protein formulations and methods of making same |
TW200938221A (en) | 2007-11-30 | 2009-09-16 | Abbott Lab | Protein formulations and methods of making same |
WO2009075773A2 (en) * | 2007-12-07 | 2009-06-18 | Goldstein Steven A | Identification of toxin ligands |
CN102007145A (zh) | 2008-02-14 | 2011-04-06 | 百时美施贵宝公司 | 基于结合egfr的工程化蛋白质的靶向治疗剂 |
US8962803B2 (en) | 2008-02-29 | 2015-02-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Antibodies against the RGM A protein and uses thereof |
WO2009114815A1 (en) | 2008-03-13 | 2009-09-17 | Dyax Corp | Libraries of genetic packages comprising novel hc cdr3 designs |
US9459249B2 (en) | 2008-03-27 | 2016-10-04 | Promega Corporation | Protein labeling with cyanobenzothiazole conjugates |
JP5780951B2 (ja) * | 2008-04-24 | 2015-09-16 | ダイアックス コーポレーション | 新規のhccdr1、cdr2、およびcdr3設計、ならびに新規のlccdr1、cdr2、およびcdr3設計を含む、遺伝子パッケージのライブラリ |
CN102149729B (zh) | 2008-04-25 | 2014-08-20 | 戴埃克斯有限公司 | 针对fcrn的抗体及其用途 |
SG190572A1 (en) | 2008-04-29 | 2013-06-28 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
JP2011521626A (ja) | 2008-05-02 | 2011-07-28 | エピセンター テクノロジーズ コーポレーション | Rnaポリホスファターゼの組成物、キットおよびそれらの使用 |
EP2500361B1 (en) | 2008-05-09 | 2016-03-30 | AbbVie Deutschland GmbH & Co KG | Antibodies to receptor of advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof |
CN102099373A (zh) | 2008-05-22 | 2011-06-15 | 百时美施贵宝公司 | 基于纤连蛋白的多价支架结构域蛋白 |
WO2009149189A2 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-10 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
AR072000A1 (es) | 2008-06-03 | 2010-07-28 | Abbott Lab | Proteinas de union multivalentes con capacidad de unir dos o mas antigenos y usos de la misma |
KR101711472B1 (ko) | 2008-06-30 | 2017-03-02 | 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 | 기능화 폴리펩티드 |
NZ603698A (en) | 2008-07-08 | 2014-03-28 | Abbvie Inc | Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
TW201014602A (en) | 2008-07-08 | 2010-04-16 | Abbott Lab | Prostaglandin E2 binding proteins and uses thereof |
US12038438B2 (en) | 2008-07-18 | 2024-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enzyme quantification |
ES2752025T3 (es) | 2008-07-25 | 2020-04-02 | Wagner Richard W | Métodos de cribado de proteínas |
CA2736430A1 (en) * | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Abbott Laboratories | Improved antibody libraries |
CA2740440A1 (en) | 2008-10-14 | 2010-04-22 | Dyax Corp. | Use of igf-ii/igf-iie binding proteins for the treatment and prevention of systemic sclerosis-associated pulmonary fibrosis |
TWI496582B (zh) | 2008-11-24 | 2015-08-21 | 必治妥美雅史谷比公司 | 雙重專一性之egfr/igfir結合分子 |
US20100158846A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-06-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Hair-binding peptides |
US8697654B2 (en) * | 2008-12-18 | 2014-04-15 | E I Du Pont De Nemours And Company | Peptide linkers for effective multivalent peptide binding |
US8287845B2 (en) * | 2008-12-18 | 2012-10-16 | E I Du Pont De Nemours And Company | Hair-binding peptides |
US20100158822A1 (en) | 2008-12-18 | 2010-06-24 | E .I. Du Pont De Nemours And Company | Peptides that bind to silica-coated particles |
US20100158837A1 (en) | 2008-12-18 | 2010-06-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Iron oxide-binding peptides |
CN101768213B (zh) | 2008-12-30 | 2012-05-30 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用 |
CA3015312C (en) | 2009-02-13 | 2022-02-08 | X-Chem, Inc. | Methods of creating and screening dna-encoded libraries |
CN101817879A (zh) | 2009-02-26 | 2010-09-01 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 金属硫蛋白及其编码基因与应用 |
NZ594514A (en) | 2009-03-05 | 2013-06-28 | Abbott Lab | Interleukin-17 BINDING PROTEINS |
EP2411148B1 (en) | 2009-03-23 | 2018-02-21 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulation of microfluidic droplets |
CN102596155A (zh) * | 2009-03-30 | 2012-07-18 | 庄臣消费者有限公司 | 用于递送美容试剂的基于肽的系统 |
US8481678B2 (en) | 2009-03-30 | 2013-07-09 | E I Du Pont De Nemours And Company | Peptide-based tooth whitening reagents |
US8067201B2 (en) | 2009-04-17 | 2011-11-29 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for protein refolding |
EP2421989B1 (en) | 2009-04-24 | 2015-10-14 | DiscoveRx Corporation | Cellular assay employing detectable protein |
US9085798B2 (en) | 2009-04-30 | 2015-07-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
CN102741288B (zh) | 2009-08-29 | 2015-08-19 | Abbvie公司 | 治疗用dll4结合蛋白 |
CA2772628A1 (en) | 2009-09-01 | 2011-03-10 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
JP2013504602A (ja) * | 2009-09-14 | 2013-02-07 | ダイアックス コーポレーション | 新しく設計したhccdr3を含む遺伝子パッケージライブラリー |
CA2775765A1 (en) * | 2009-10-05 | 2011-04-14 | Opsonic Therapeutics Inc. | High affinity adaptor molecules for redirecting antibody specifity |
US10520500B2 (en) | 2009-10-09 | 2019-12-31 | Abdeslam El Harrak | Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof |
TW201119676A (en) | 2009-10-15 | 2011-06-16 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
JP5174971B2 (ja) | 2009-10-22 | 2013-04-03 | ペプチドリーム株式会社 | ペプチド翻訳合成におけるrapidディスプレイ法 |
UY32979A (es) | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
ES2691717T3 (es) | 2009-10-30 | 2018-11-28 | Novartis Ag | Bibliotecas universales del dominio de unión del lado inferior de tipo iii de la fibronectina de tipo III |
WO2011053707A1 (en) | 2009-10-31 | 2011-05-05 | Abbott Laboratories | Antibodies to receptor for advanced glycation end products (rage) and uses thereof |
CN102640001A (zh) | 2009-11-05 | 2012-08-15 | 诺瓦提斯公司 | 预测纤维化进展的生物标记物 |
CA2780024A1 (en) | 2009-11-11 | 2011-05-19 | Gentian As | Immunoassay for assessing related analytes of different origin |
AU2010326024A1 (en) | 2009-12-02 | 2012-07-05 | Amgen Inc. | Binding proteins that bind to human FGFR1c, human beta-Klotho and both human FGFR1c and human beta-Klotho |
JP2013512691A (ja) * | 2009-12-07 | 2013-04-18 | プログノシス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | ペプチド提示アレイ |
BR112012013734A2 (pt) | 2009-12-08 | 2017-01-10 | Abbott Gmbh & Co Kg | anticorpos monoclonais contra a proteína rgm a para uso no tratamento da degeneração da camada de fibras nervosas da retina. |
EP2517025B1 (en) | 2009-12-23 | 2019-11-27 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods for reducing the exchange of molecules between droplets |
PT3459564T (pt) | 2010-01-06 | 2022-01-31 | Takeda Pharmaceuticals Co | Proteínas de ligação à calicreína plasmática |
BR112012019902A2 (pt) | 2010-02-10 | 2019-09-24 | Novartis Ag | "método e compostos para o crescimento muscular" |
US10351905B2 (en) | 2010-02-12 | 2019-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
CA2790329A1 (en) | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold domain proteins that bind il-23 |
JP5964249B2 (ja) | 2010-03-02 | 2016-08-03 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 治療用dll4結合タンパク質 |
US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
CN102834526B (zh) | 2010-04-05 | 2015-12-02 | 普罗格诺西斯生物科学公司 | 空间编码的生物学测定 |
US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
EA022983B1 (ru) | 2010-04-13 | 2016-04-29 | Бристол-Майерс Сквибб Компани | Белки на основе структурного домена фибронектина, связывающие pcsk9 |
MX360403B (es) | 2010-04-15 | 2018-10-31 | Abbvie Inc | Proteinas de union a amiloide beta. |
WO2011127933A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Nuevolution A/S | Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes |
TW201138808A (en) | 2010-05-03 | 2011-11-16 | Bristol Myers Squibb Co | Serum albumin binding molecules |
LT2571532T (lt) | 2010-05-14 | 2017-08-10 | Abbvie Inc. | Il-1 surišantys baltymai |
WO2011150133A2 (en) | 2010-05-26 | 2011-12-01 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold proteins having improved stability |
WO2012006500A2 (en) | 2010-07-08 | 2012-01-12 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies against hepatitis c virus core protein |
UY33492A (es) | 2010-07-09 | 2012-01-31 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
AU2011279073B2 (en) | 2010-07-16 | 2016-06-09 | Adimab, Llc | Antibody libraries |
JP6092773B2 (ja) | 2010-07-30 | 2017-03-08 | ノバルティス アーゲー | フィブロネクチンクレードル分子及びそのライブラリ |
EP3252072A3 (en) | 2010-08-03 | 2018-03-14 | AbbVie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
CA2807552A1 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
US9062101B2 (en) | 2010-08-14 | 2015-06-23 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Amyloid-beta binding proteins |
HRP20220405T1 (hr) | 2010-08-19 | 2022-05-27 | Zoetis Belgium S.A. | Protutijela protiv ngf i njihova upotreba |
RU2013113225A (ru) | 2010-08-26 | 2014-10-10 | Эббви Инк. | Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение |
WO2012045012A2 (en) | 2010-09-30 | 2012-04-05 | Raindance Technologies, Inc. | Sandwich assays in droplets |
SG190679A1 (en) | 2010-10-01 | 2013-07-31 | Jason Schrum | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
WO2012052391A1 (en) | 2010-10-19 | 2012-04-26 | Glaxo Group Limited | Polypeptide with jmjd3 catalytic activity |
WO2012061759A2 (en) | 2010-11-05 | 2012-05-10 | Morphotek Inc. | Folate receptor alpha as a diagnostic and prognostic marker for folate receptor alpha-expressing cancers |
US9657289B2 (en) | 2010-12-03 | 2017-05-23 | The University Of Tokyo | Peptide with safer secondary structure, peptide library, and production methods for same |
EP2647720B1 (en) * | 2010-12-03 | 2019-06-19 | The University of Tokyo | Peptide library production method, peptide library, and screening method |
AU2011361720B2 (en) | 2010-12-21 | 2017-04-27 | Abbvie Inc. | IL-1 -alpha and -beta bispecific dual variable domain immunoglobulins and their use |
WO2012088094A2 (en) | 2010-12-21 | 2012-06-28 | Abbott Laboratories | Il-1 binding proteins |
US9260496B2 (en) | 2010-12-22 | 2016-02-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold domain proteins that bind IL-23 |
DE102010056289A1 (de) | 2010-12-24 | 2012-06-28 | Geneart Ag | Verfahren zur Herstellung von Leseraster-korrekten Fragment-Bibliotheken |
EP3412778A1 (en) | 2011-02-11 | 2018-12-12 | Raindance Technologies, Inc. | Methods for forming mixed droplets |
EP3736281A1 (en) | 2011-02-18 | 2020-11-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
US9746475B2 (en) | 2011-03-14 | 2017-08-29 | University Of Southern California | Antibody and antibody mimetic for visualization and ablation of endogenous proteins |
ES2873375T3 (es) | 2011-03-15 | 2021-11-03 | X Body Inc | Métodos de cribado de anticuerpos |
DE12722942T1 (de) | 2011-03-31 | 2021-09-30 | Modernatx, Inc. | Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren |
EP3150750B1 (en) | 2011-04-08 | 2018-12-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Peptide constructs and assay systems |
EP3896083B1 (en) | 2011-04-13 | 2023-03-01 | Bristol-Myers Squibb Company | Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements |
GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
WO2012148497A2 (en) | 2011-04-28 | 2012-11-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Identification of polynucleotides associated with a sample |
WO2012158678A1 (en) | 2011-05-17 | 2012-11-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for maintaining pegylation of polypeptides |
US9347058B2 (en) | 2011-05-17 | 2016-05-24 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for the selection of binding proteins |
WO2012167011A1 (en) | 2011-06-02 | 2012-12-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Dsrna/dna hybrid genome replication intermediate of metakaryotic stem cells |
DE202012013668U1 (de) | 2011-06-02 | 2019-04-18 | Raindance Technologies, Inc. | Enzymquantifizierung |
US8841071B2 (en) | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
SG10201604493TA (en) | 2011-06-02 | 2016-07-28 | Dyax Corp | Fc RECEPTOR BINDING PROTEINS |
CA2841970A1 (en) | 2011-07-13 | 2013-01-17 | Abbvie Inc. | Methods and compositions for treating asthma using anti-il-13 antibodies |
US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
EP2742153B1 (en) | 2011-08-01 | 2018-09-05 | The General Hospital Corporation | Protein and peptide libraries |
CA2848023C (en) | 2011-09-07 | 2022-03-15 | X-Chem, Inc. | Methods for tagging dna-encoded libraries |
US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
SG11201401196WA (en) | 2011-10-03 | 2014-05-29 | Moderna Therapeutics Inc | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
AR088512A1 (es) | 2011-10-24 | 2014-06-18 | Abbvie Inc | Anticuerpos dirigidos contra el tnf |
TW201323440A (zh) | 2011-10-24 | 2013-06-16 | Abbvie Inc | 抗骨硬化素(sclerostin)之免疫結合物 |
US9522951B2 (en) | 2011-10-31 | 2016-12-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin binding domains with reduced immunogenicity |
CN107353342B (zh) | 2011-12-05 | 2021-08-10 | X 博迪生物科学公司 | PDGF受体β结合多肽 |
CA2855840C (en) | 2011-12-14 | 2023-08-29 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders |
JP6336397B2 (ja) | 2011-12-14 | 2018-06-06 | アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー | 鉄関連障害を診断および治療するための組成物および方法 |
CA3018046A1 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions |
WO2013100132A1 (ja) * | 2011-12-28 | 2013-07-04 | 中外製薬株式会社 | ペプチド化合物の環化方法 |
WO2013102042A2 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Abbvie Inc. | Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17 |
CN104487455A (zh) | 2012-01-27 | 2015-04-01 | 艾伯维德国有限责任两合公司 | 用于诊断和治疗与神经突变性相关的疾病的组合物和方法 |
GB2500243A (en) * | 2012-03-15 | 2013-09-18 | Isogenica Ltd | Identifying members of immobilised peptide libraries comprising protein-DNA complexes |
US9878056B2 (en) | 2012-04-02 | 2018-01-30 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides |
WO2013151670A2 (en) | 2012-04-02 | 2013-10-10 | modeRNA Therapeutics | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
RS59260B1 (sr) | 2012-04-20 | 2019-10-31 | Merus Nv | Postupci i sredstva za proizvodnju heterodimernih ig-sličnih molekula |
ES2755104T3 (es) | 2012-05-17 | 2020-04-21 | Ra Pharmaceuticals Inc | Inhibidores peptídicos y peptidomiméticos |
ES2894852T3 (es) | 2012-06-06 | 2022-02-16 | Zoetis Services Llc | Anticuerpos anti-NGF caninizados y métodos de los mismos |
WO2014011955A2 (en) | 2012-07-12 | 2014-01-16 | Abbvie, Inc. | Il-1 binding proteins |
NZ739931A (en) | 2012-07-13 | 2019-08-30 | X Chem Inc | Dna-encoded libraries having encoding oligonucleotide linkages not readable by polymerases |
SI3835310T1 (sl) | 2012-09-13 | 2024-07-31 | Bristol-Myers Squibb Company | Proteini skafold domene na osnovi fibronektina, ki se vežejo na miostatin |
USRE50065E1 (en) | 2012-10-17 | 2024-07-30 | 10X Genomics Sweden Ab | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
MX2015005593A (es) | 2012-11-01 | 2016-02-05 | Abbvie Inc | Inmunoglobulinas de dominio variable dual anti-vegf/dll4 y usos de las mismas. |
PT2922554T (pt) | 2012-11-26 | 2022-06-28 | Modernatx Inc | Arn modificado nas porções terminais |
US9550986B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-01-24 | Abbvie Inc. | High-throughput antibody humanization |
EP2952582A4 (en) | 2013-01-30 | 2016-11-16 | Peptidream Inc | FLEXIBLE DISPLAY METHOD |
US20150361159A1 (en) | 2013-02-01 | 2015-12-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold proteins |
ES2689372T3 (es) | 2013-02-06 | 2018-11-13 | Bristol-Myers Squibb Company | Proteínas de dominio de fibronectina tipo III con solubilidad mejorada |
EP2956467B1 (en) | 2013-02-12 | 2017-09-27 | Bristol-Myers Squibb Company | High ph protein refolding methods |
CA3175634A1 (en) | 2013-02-28 | 2014-09-04 | Caprion Proteomics Inc. | Tuberculosis biomarkers and uses thereof |
EP2968587A2 (en) | 2013-03-13 | 2016-01-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or a moiety binding thereto |
US10132816B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-11-20 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Measurement of FGF21 as a biomarker of fructose metabolism |
CN105228649B (zh) | 2013-03-14 | 2019-01-18 | 雅培制药有限公司 | Hcv抗原-抗体组合测定和方法以及用在其中的组合物 |
MX2015012825A (es) | 2013-03-14 | 2016-06-10 | Abbott Lab | Anticuerpos monoclonales del dominio de union de lipido del núcleo del virus de la hepatitis c vhc. |
BR112015023355A8 (pt) | 2013-03-14 | 2018-01-30 | Abbott Lab | antígenos recombinantes ns3 de hcv e mutantes dos mesmos para detecção de anticorpos aprimorada. |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
CN111233978B (zh) | 2013-03-15 | 2024-08-16 | 普罗格诺西斯生物科学公司 | 用于检测肽/mhc/tcr结合的方法 |
AU2014227732A1 (en) | 2013-03-15 | 2015-09-17 | Abbvie Inc. | Dual specific binding proteins directed against IL-1 beta and IL-17 |
US9469686B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-10-18 | Abbott Laboratories | Anti-GP73 monoclonal antibodies and methods of obtaining the same |
EP3567123B1 (en) | 2013-05-20 | 2021-11-10 | BioVentures, LLC | Gep5 model for multiple myeloma |
EP3632467B1 (en) | 2013-06-07 | 2023-09-27 | Duke University | Inhibitors of complement factor h |
EP3013983B1 (en) | 2013-06-25 | 2023-02-15 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays using a microfluidic device |
MX2015017714A (es) | 2013-06-28 | 2016-08-18 | X-Body Inc | Selecciones fenotipicas, descubrimiento del antigeno objetivo y uso de los mismos para la identificacion de epitopes objetivo especificos de celulas objetivo. |
EP3041934A1 (en) | 2013-09-03 | 2016-07-13 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
CN110058023B (zh) | 2013-09-23 | 2022-10-14 | X博迪公司 | 用于生成对抗细胞表面抗原的结合剂的方法和组合物 |
EP3052106A4 (en) | 2013-09-30 | 2017-07-19 | ModernaTX, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
KR20160067219A (ko) | 2013-10-03 | 2016-06-13 | 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 | 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 |
US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
WO2015070037A2 (en) | 2013-11-08 | 2015-05-14 | Prognosys Biosciences, Inc. | Polynucleotide conjugates and methods for analyte detection |
US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
RU2714902C2 (ru) | 2013-12-19 | 2020-02-20 | Новартис Аг | Химерные рецепторы антигена против мезотелина человека и их применение |
GB201322692D0 (en) | 2013-12-20 | 2014-02-05 | Philochem Ag | Production of encoded chemical libraries |
WO2015103367A1 (en) | 2013-12-31 | 2015-07-09 | Raindance Technologies, Inc. | System and method for detection of rna species |
JP6814634B2 (ja) | 2014-02-05 | 2021-01-20 | モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. | リボ毒性の一時的な減少に基づき、細胞毒性組換えポリペプチドをスクリーニングし、選択し、同定する方法 |
SG11201607818WA (en) | 2014-03-20 | 2016-10-28 | Bristol Myers Squibb Co | Stabilized fibronectin based scaffold molecules |
EP3572424B1 (en) | 2014-03-20 | 2022-04-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Serum albumin-binding fibronectin type iii domains |
PL3154561T3 (pl) | 2014-06-12 | 2019-12-31 | Ra Pharmaceuticals, Inc. | Modulowanie aktywności dopełniacza |
EP3157945A4 (en) | 2014-06-20 | 2017-11-22 | F. Hoffmann-La Roche AG | Chagasin-based scaffold compositions, methods, and uses |
CA2955250A1 (en) | 2014-07-16 | 2016-01-21 | Moderna Therapeutics, Inc. | Chimeric polynucleotides |
EP3172234B1 (en) | 2014-07-21 | 2020-04-08 | Novartis AG | Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor |
WO2016025880A1 (en) | 2014-08-14 | 2016-02-18 | Novartis Ag | Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor |
TW202140557A (zh) | 2014-08-19 | 2021-11-01 | 瑞士商諾華公司 | 使用cd123嵌合抗原受體治療癌症 |
MA40772A (fr) | 2014-10-02 | 2017-08-08 | Vertex Pharma | Variants du virus de la grippe a |
MA40773A (fr) | 2014-10-02 | 2017-08-08 | Vertex Pharma | Variants du virus influenza a |
MX2017006785A (es) | 2014-11-25 | 2017-09-05 | Bristol Myers Squibb Co | Metodos y composiciones para radioetiquetado con 18f de productos biologicos. |
BR112017010137A2 (pt) | 2014-11-25 | 2018-02-06 | Bristol-Myers Squibb Company | polipeptídios fixadores de pd-l1 para imagem |
US10093733B2 (en) | 2014-12-11 | 2018-10-09 | Abbvie Inc. | LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins |
WO2016123371A1 (en) | 2015-01-28 | 2016-08-04 | Ra Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of complement activity |
EP3061826A1 (en) | 2015-02-27 | 2016-08-31 | Novartis AG | Flavivirus replicons |
US10815489B2 (en) | 2015-03-13 | 2020-10-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Modified aminoacyl-tRNA synthetase and use thereof |
JP6962819B2 (ja) | 2015-04-10 | 2021-11-05 | アディマブ, エルエルシー | 親ホモ二量体抗体種からのヘテロ二量体多重特異性抗体の精製方法 |
DK3530752T3 (da) | 2015-04-10 | 2021-04-26 | Spatial Transcriptomics Ab | Rumligt adskilt, multipleks nukleinsyreanalyse af biologiske prøver |
CN104774801A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-07-15 | 云南农业大学 | 一种核酸核糖体结合体系构建方法及应用 |
WO2016171980A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Bristol-Myers Squibb Company | Polypeptides targeting hiv fusion |
KR20240093813A (ko) | 2015-04-24 | 2024-06-24 | 제넨테크, 인크. | 다중특이적 항원-결합 단백질 |
KR102661078B1 (ko) | 2015-05-29 | 2024-05-23 | 애브비 인코포레이티드 | 항-cd40 항체 및 그의 용도 |
TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗vegf、pdgf及/或其受體之結合蛋白 |
WO2017019935A1 (en) * | 2015-07-30 | 2017-02-02 | Modernatx, Inc. | Multimeric mrna |
US10647981B1 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleic acid library generation methods and compositions |
JP6893504B2 (ja) | 2015-09-23 | 2021-06-23 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company | 速い解離速度を有する血清アルブミン結合フィブロネクチンタイプiiiドメイン |
KR20180057657A (ko) | 2015-09-23 | 2018-05-30 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 글리피칸-3-결합 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자 |
CA3007772A1 (en) | 2015-12-16 | 2017-06-22 | Ra Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of complement activity |
EP3433275A1 (en) | 2016-03-24 | 2019-01-30 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in immune oncology treatments |
WO2017165742A1 (en) | 2016-03-24 | 2017-09-28 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in anti-ctla4 anti-pd-1 combination treatments |
MX2018013341A (es) * | 2016-05-02 | 2019-09-18 | Encodia Inc | Analisis de macromoleculas que emplea la codificacion de acido nucleico. |
EP3463486A1 (en) | 2016-06-01 | 2019-04-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Pet imaging with pd-l1 binding polypeptides |
WO2017210335A1 (en) | 2016-06-01 | 2017-12-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Imaging methods using 18f-radiolabeled biologics |
MA45491A (fr) | 2016-06-27 | 2019-05-01 | Juno Therapeutics Inc | Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés |
WO2018005559A1 (en) | 2016-06-27 | 2018-01-04 | Juno Therapeutics, Inc. | Method of identifying peptide epitopes, molecules that bind such epitopes and related uses |
CN110461315A (zh) | 2016-07-15 | 2019-11-15 | 诺华股份有限公司 | 使用与激酶抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗和预防细胞因子释放综合征 |
US20180106818A1 (en) | 2016-10-03 | 2018-04-19 | Abbott Laboratories | Methods of assessing gfap status in patient samples |
TW202340473A (zh) | 2016-10-07 | 2023-10-16 | 瑞士商諾華公司 | 利用嵌合抗原受體之癌症治療 |
CN110087668A (zh) | 2016-12-07 | 2019-08-02 | Ra制药公司 | 补体活性的调节剂 |
CN110312530A (zh) | 2017-01-13 | 2019-10-08 | 中央研究院 | 用以治疗心肌梗塞的可重复装载的水胶系统 |
WO2018130661A1 (en) | 2017-01-13 | 2018-07-19 | Academia Sinica | Reloadable hydrogel system for treating brain conditions |
SG11201908579PA (en) * | 2017-03-17 | 2019-10-30 | Cubicstars Inc | Method for producing complex of rna molecule and peptide, and utilization thereof |
JP7346300B2 (ja) | 2017-03-23 | 2023-09-19 | アボット・ラボラトリーズ | 早期バイオマーカーであるユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼl1を使用する、ヒト対象における外傷性脳損傷の程度の診断及び決定の一助となるための方法 |
EP3610268A1 (en) | 2017-04-15 | 2020-02-19 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in the hyperacute diagnosis and determination of traumatic brain injury in a human subject using early biomarkers |
JP7080899B2 (ja) | 2017-04-28 | 2022-06-06 | アボット・ラボラトリーズ | 同じヒト対象に由来する少なくとも2つの試料に対して早期バイオマーカーを使用する、外傷性脳損傷の超急性の診断及び決定の一助となるための方法 |
US10865238B1 (en) | 2017-05-05 | 2020-12-15 | Duke University | Complement factor H antibodies |
CN110651190A (zh) | 2017-05-25 | 2020-01-03 | 雅培实验室 | 用早期生物标记物帮助确定是否对已遭受或可能已遭受头部损伤的人受试者执行成像的方法 |
EP3631471A4 (en) | 2017-05-30 | 2021-06-30 | Nant Holdings IP, LLC | ENRICHMENT OF CIRCULATING TUMOR CELLS USING NEO-EPITOPIA |
AU2018275235B2 (en) | 2017-05-30 | 2024-07-18 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in diagnosing and evaluating a mild traumatic brain injury in a human subject using cardiac troponin I and early biomarkers |
CN118772227A (zh) | 2017-06-09 | 2024-10-15 | 中外制药株式会社 | 用于合成含有n-取代氨基酸的肽的方法 |
WO2019010131A1 (en) | 2017-07-03 | 2019-01-10 | Abbott Laboratories | IMPROVED METHODS FOR MEASURING CARBOXY TERMINATION HYDROLASE LEVELS OF UBIQUITIN L1 IN BLOOD |
CN112020648A (zh) | 2017-10-04 | 2020-12-01 | 赫斯佩瑞克斯股份公司 | 针对癌症个体化疗法的制品和方法 |
MX2020004559A (es) * | 2017-10-31 | 2020-10-05 | Encodia Inc | Kits para análisis utilizando codificación y/o etiqueta de ácido nucleico. |
WO2019112860A1 (en) | 2017-12-09 | 2019-06-13 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of gfap and uch-l1 |
WO2019113525A2 (en) | 2017-12-09 | 2019-06-13 | Abbott Laboratories | Methods for aiding in the diagnosis and evaluation of a subject who has sustained an orthopedic injury and that has or may have sustained an injury to the head, such as mild traumatic brain injury (tbi), using glial fibrillary acidic protein (gfap) and/or ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 (uch-l1) |
EP3725796A4 (en) | 2017-12-15 | 2021-09-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | METHOD FOR MANUFACTURING PEPTIDE AND METHOD FOR PROCESSING BASES |
EP3728310A1 (en) | 2017-12-18 | 2020-10-28 | VIIV Healthcare UK (No.5) Limited | Antigen binding polypeptides |
MX2020009526A (es) | 2018-03-12 | 2020-10-28 | Zoetis Services Llc | Anticuerpos anti-ngf y metodos de estos. |
WO2019190954A1 (en) | 2018-03-26 | 2019-10-03 | Rootpath Genomics, Inc. | Target binding moiety compositions and methods of use |
JP7568510B2 (ja) | 2018-11-30 | 2024-10-16 | 中外製薬株式会社 | ペプチド化合物、またはアミド化合物の脱保護法および固相反応における脱樹脂方法、並びにペプチド化合物の製造方法 |
EP3914269B1 (en) | 2019-01-23 | 2024-07-17 | New York University | Antibodies specific to delta 1 chain of t cell receptor |
SG11202108645YA (en) * | 2019-02-15 | 2021-09-29 | Atreca Inc | Antibodies that bind tumor tissue, and their diagnostic and therapeutic uses |
WO2020189540A1 (ja) | 2019-03-15 | 2020-09-24 | 中外製薬株式会社 | 芳香族アミノ酸誘導体の製造方法 |
WO2020198731A2 (en) | 2019-03-28 | 2020-10-01 | Danisco Us Inc | Engineered antibodies |
SG11202110525QA (en) | 2019-05-09 | 2021-10-28 | Genentech Inc | Methods of making antibodies |
US20230002466A1 (en) | 2019-08-13 | 2023-01-05 | Elpis Biopharmaceuticals | Engineered interleukin-2 receptor beta agonists |
EP4055185A1 (en) | 2019-11-08 | 2022-09-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing |
CA3167027A1 (en) | 2020-02-05 | 2021-08-12 | Larimar Therapeutics, Inc. | Tat peptide binding proteins and uses thereof |
US20240277878A1 (en) | 2020-02-28 | 2024-08-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Radiolabeled fibronectin based scaffolds and antibodies and theranostic uses thereof |
EP4136459A1 (en) | 2020-04-13 | 2023-02-22 | Abbott Laboratories | Methods, complexes and kits for detecting or determining an amount of a ss-coronavirus antibody in a sample |
EP4188949A1 (en) | 2020-07-31 | 2023-06-07 | NantBio, Inc. | Chimeric t cell receptors, nucleic acids, and methods of making and using the same |
CA3188349A1 (en) | 2020-08-04 | 2022-02-10 | A. Scott Muerhoff | Improved methods and kits for detecting sars-cov-2 protein in a sample |
WO2022104001A1 (en) | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Expanded protein libraries and uses thereof |
CA3198161A1 (en) | 2020-12-01 | 2022-06-09 | Beth MCQUISTON | Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi |
WO2023102384A1 (en) | 2021-11-30 | 2023-06-08 | Abbott Laboratories | Use of one or more biomarkers to determine traumatic brain injury (tbi) in a subject having received a head computerized tomography scan that is negative for a tbi |
AU2021409136A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-06-29 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
WO2022147147A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Abbott Laboratories | Methods for determining sars-cov-2 antigen and anti-sars-cov-2 antibody in a sample |
AU2022211410A1 (en) | 2021-01-22 | 2023-08-10 | Elpis Biopharmaceuticals | Anti-pd-l1 monoclonal antibodies and fusion proteins with interleukin-15 (il-15), interleukin-15 receptor 15 alpha or interleukin-2 |
US11792839B2 (en) | 2021-03-12 | 2023-10-17 | Eagle Technology, Llc | Systems and methods for controlling communications based on machine learned information |
WO2022198068A1 (en) | 2021-03-18 | 2022-09-22 | 10X Genomics, Inc. | Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample |
BR112023024169A2 (pt) | 2021-05-18 | 2024-02-06 | Abbott Lab | Métodos para avaliar lesão cerebral em um indivíduo pediátrico |
WO2022256503A1 (en) | 2021-06-03 | 2022-12-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis |
WO2022266034A1 (en) | 2021-06-14 | 2022-12-22 | Abbott Laboratories | Methods of diagnosing or aiding in diagnosis of brain injury caused by acoustic energy, electromagnetic energy, an over pressurization wave, and/or blast wind |
AU2022339759A1 (en) | 2021-08-31 | 2024-03-07 | Abbott Laboratories | Methods and systems of diagnosing brain injury |
CN118715440A (zh) | 2021-08-31 | 2024-09-27 | 雅培实验室 | 诊断脑损伤的方法和系统 |
JP2024538608A (ja) | 2021-09-30 | 2024-10-23 | アボット・ラボラトリーズ | 脳の損傷を診断する方法及びシステム |
CA3240822A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | Tony Lee | Systems and methods for determining uch-l1, gfap, and other biomarkers in blood samples |
AU2023216317A1 (en) | 2022-02-04 | 2024-09-05 | Abbott Laboratories | Lateral flow methods, assays, and devices for detecting the presence or measuring the amount of ubiquitin carboxy-terminal hydrolase l1 and/or glial fibrillary acidic protein in a sample |
WO2023220597A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Elpis Biopharmaceuticals | Engineered interleukin-2 receptor beta reduced-binding agonist |
WO2024006876A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Abbott Laboratories | Magnetic point-of-care systems and assays for determining gfap in biological samples |
WO2024059708A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Abbott Laboratories | Biomarkers and methods for differentiating between mild and supermild traumatic brain injury |
WO2024211475A1 (en) | 2023-04-04 | 2024-10-10 | Abbott Laboratories | Use of biomarkers to determine whether a subject has sustained, may have sustained or is suspected of sustaining a subacute acquired brain injury (abi) |
WO2024226971A1 (en) | 2023-04-28 | 2024-10-31 | Abbott Point Of Care Inc. | Improved assays, cartridges, and kits for detection of biomarkers, including brain injury biomarkers |
Family Cites Families (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4587044A (en) | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
CH0229046H1 (de) | 1985-03-30 | 1998-07-15 | Stuart Alan Kauffman | Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptinique. des or proteins by means of a dna recombinant tech |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5391723A (en) * | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US5800992A (en) * | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
AU638762B2 (en) | 1989-10-05 | 1993-07-08 | Optein Inc | Cell-free synthesis and isolation of novel genes and polypeptides |
US5270163A (en) | 1990-06-11 | 1993-12-14 | University Research Corporation | Methods for identifying nucleic acid ligands |
US5723286A (en) | 1990-06-20 | 1998-03-03 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening systems |
US5843701A (en) * | 1990-08-02 | 1998-12-01 | Nexstar Pharmaceticals, Inc. | Systematic polypeptide evolution by reverse translation |
WO1992002536A1 (en) | 1990-08-02 | 1992-02-20 | The Regents Of The University Of Colorado | Systematic polypeptide evolution by reverse translation |
US5264563A (en) | 1990-08-24 | 1993-11-23 | Ixsys Inc. | Process for synthesizing oligonucleotides with random codons |
ATE199054T1 (de) | 1990-12-06 | 2001-02-15 | Affymetrix Inc A Delaware Corp | Verbindungen und ihre verwendung in einer binären synthesestrategie |
US5795747A (en) | 1991-04-16 | 1998-08-18 | Evotec Biosystems Gmbh | Process for manufacturing new biopolymers |
DE4112440C1 (es) | 1991-04-16 | 1992-10-22 | Diagen Institut Fuer Molekularbiologische Diagnostik Gmbh, 4000 Duesseldorf, De | |
AU2313392A (en) * | 1991-08-01 | 1993-03-02 | University Research Corporation | Systematic polypeptide evolution by reverse translation |
US5639603A (en) | 1991-09-18 | 1997-06-17 | Affymax Technologies N.V. | Synthesizing and screening molecular diversity |
US5733731A (en) | 1991-10-16 | 1998-03-31 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening method |
US5270170A (en) | 1991-10-16 | 1993-12-14 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening method |
US5652094A (en) * | 1992-01-31 | 1997-07-29 | University Of Montreal | Nucleozymes |
US5541061A (en) | 1992-04-29 | 1996-07-30 | Affymax Technologies N.V. | Methods for screening factorial chemical libraries |
US5635602A (en) | 1993-08-13 | 1997-06-03 | The Regents Of The University Of California | Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates |
WO1995011922A1 (en) * | 1993-10-29 | 1995-05-04 | Affymax Technologies N.V. | In vitro peptide and antibody display libraries |
ATE243745T1 (de) | 1994-01-31 | 2003-07-15 | Univ Boston | Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern |
US5561043A (en) | 1994-01-31 | 1996-10-01 | Trustees Of Boston University | Self-assembling multimeric nucleic acid constructs |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
US5627024A (en) | 1994-08-05 | 1997-05-06 | The Scripps Research Institute | Lambdoid bacteriophage vectors for expression and display of foreign proteins |
US5559000A (en) | 1995-01-18 | 1996-09-24 | The Scripps Research Institute | Encoded reaction cassette |
DE19646372C1 (de) * | 1995-11-11 | 1997-06-19 | Evotec Biosystems Gmbh | Genotyp und Phänotyp koppelnde Verbindung |
WO1998016636A1 (fr) | 1996-10-17 | 1998-04-23 | Mitsubishi Chemical Corporation | Molecule permettant d'homologuer un genotype et un phenotype, et utilisation de celle-ci |
GB9703369D0 (en) | 1997-02-18 | 1997-04-09 | Lindqvist Bjorn H | Process |
GB9712512D0 (en) | 1997-06-16 | 1997-08-20 | Bioinvent Int Ab | A method for in vitro molecular evolution of protein function |
US5985575A (en) | 1998-05-20 | 1999-11-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Tethered function assay for protein function |
-
1998
- 1998-01-14 AU AU62419/98A patent/AU738328B2/en not_active Expired
- 1998-01-14 AT AT98904574T patent/ATE332368T1/de active
- 1998-01-14 PT PT98904574T patent/PT971946E/pt unknown
- 1998-01-14 PT PT06013825T patent/PT1712623E/pt unknown
- 1998-01-14 IL IL13101698A patent/IL131016A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-01-14 ES ES98904574T patent/ES2268763T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-14 DE DE69835143T patent/DE69835143T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-14 AT AT06013825T patent/ATE529509T1/de active
- 1998-01-14 CN CNB988035111A patent/CN1238366C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-14 WO PCT/US1998/000807 patent/WO1998031700A1/en active IP Right Grant
- 1998-01-14 ES ES06013825T patent/ES2373110T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-14 DK DK06013825.2T patent/DK1712623T3/da active
- 1998-01-14 JP JP53453498A patent/JP3692542B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-14 US US09/007,005 patent/US6258558B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-14 KR KR1019997006594A patent/KR100566859B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-01-14 CA CA2278786A patent/CA2278786C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-14 RU RU99118585/13A patent/RU2233878C2/ru active
- 1998-01-14 EP EP06013825A patent/EP1712623B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-14 DK DK98904574T patent/DK0971946T3/da active
- 1998-01-14 EP EP98904574A patent/EP0971946B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-15 TW TW087100513A patent/TW589323B/zh not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-01-28 US US09/238,710 patent/US6518018B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-05 US US09/244,794 patent/US6214553B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-05 US US09/244,796 patent/US6281344B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-29 US US09/430,049 patent/US6207446B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-10-24 HK HK00106756A patent/HK1027577A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2268763T3 (es) | Seleccion de proteinas usando fusiones de arn-proteina. | |
ES2324512T3 (es) | Seleccion de proteinas mediante el uso de fusiones de proteinas y arn. | |
US8207093B2 (en) | Selection of proteins using RNA-protein fusions | |
US5843701A (en) | Systematic polypeptide evolution by reverse translation | |
AU776478B2 (en) | Selection of proteins using RNA-protein fusions |