ES2267541T3 - Medicion enzimatica del acido micofenolico. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar el ácido micofenólico en una muestra de fluido corporal que comprende las etapas de: a. combinar la muestra que se sospecha que contiene ácido micofenólico con cantidades eficaces de IMP, NAD e IMPH en unas condiciones adecuadas para la actividad del IMPDH y con ello obtener una mezcla de reacción b. combinar la producción de NADH en dicha mezcla de reac- ción por espectrofotometría, y c. comparar la producción de NADH con la producción de NADH mediante un ejemplo que contiene una cantidad conocida de ácido micofenólico después de haber sido tratada según las etapas (a) y (b).
Description
Medición enzimática del ácido micofenólico.
La presente invención se refiere en general al
campo de medición de fármacos terapéuticos en muestras biológicas.
Más específicamente, se refiere a un método para la medición
enzimática del ácido micofenólico en una muestra biológica.
La medición del ácido micofenólico tiene un
significado clínico. El ácido micofenólico es un fármaco
inmunodepresor empleado para prevenir el rechazo de los órganos
transplantados, y se ha sugerido que el control del ácido
micofenólico mejora la eficacia terapéutica y minimiza los efectos
secundarios adversos del fármaco.
El ácido micofenólico es producido por la
fermentación de varias especies de penicilina. Tiene un espectro
amplio de actividades, una forma específica de actuar y es tolerado
en grandes dosis con unos efectos secundarios mínimos, Epinette y
cols., Journal of the American Academy of Dermatology
17(6): 962-971 (1987). Se ha demostrado
que el ácido micofenólico tiene una actividad antitumoral,
antivírica, antipsoriátrica, inmunodepresora y antiinflamatoria,
Lee y cols., Pharmaceutical Research 7(2):
161-166 (1990), junto con unas actividades
antibacterianas y antifúngicas o antimicóticas, Nelson, P.H. y
cols., Journal of Medicine Chemistry 33(2):
833-838 (1990). El ácido micofenólico MPA actúa
inhibiendo la inosina-5'-monofosfato
deshidrogenasa (IMPDH), un enzima clave en la síntesis nueva de
nucleótidos de purina. Puesto que los linfocitos T y B dependen
considerablemente de está síntesis de novo, el ácido micofenólico
es capaz de inhibir la proliferación de linfocitos que es un factor
importante de la respuesta inmunitaria.
La
inosina-5'-monofosfato
deshidrogenasa (EC 1.1.1.205) cataliza la oxidación dependiente del
NAD(nicotinamida adenina dinucleótido) de la
inosina-5'-monofosfato (IMP) a la
xantosina-5'-monofosfato (XMP),
Magasanik, B. y cols., J. Biol. Chem.
226:339-350 (1957) y Jackson y cols., Nature
256:331-333 (1975). El enzima sigue una
secuencia de reacción ordenada Bi-Bi de enlace del
sustrato y cofactor y de la liberación del producto. Primero, la
IMP se une a la IMPDH. A esto sigue el enlace del cofactor NAD. El
cofactor reducido NADH es liberado seguidamente del producto,
seguido del producto XMP. Este mecanismo difiere del de la mayoría
de deshidrogenadas conocidas dependientes del NAD, que presentan o
bien un orden aleatorio de la adición del sustrato o requieren NAD
para enlazarse previamente al sustrato.
Dos formas iso de la IMPDH humana designadas
tipo I y tipo II han sido identificadas y secuenciadas, Collart y
cols., J. Biol. Chem. 263:15769-15772 (1988)
y Natsumeda y cols., J. Biol. Chem. 265:5292-5295
(1990). Cada forma iso son 514 aminoácidos, y ambas formas iso
comparten una identidad de secuencia del 84%. Ambos tetrámeros
activos forman IMPDH tipo I y tipo II en solución, con unos pesos
moleculares subunidad de 56 kDa, Yamada y cols., Biochemistry
27:2737-2745 (1988).
El éster morfolinoetílico del ácido
micofenólico, morfolinetil
E-6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-isobenzofuranil)-4-metil-4-hexenoato
(MPA-M) es hidrolizado in vivo para dar el
ácido micofenólico. La administración de ácido micofenólico en
forma de este éster, conocido también como micofenolato mofetilo
(MMF), mejora considerablemente la biodisponibilidad del ácido
micofenólico. La MPA-M tiene una serie de otras
características farmacéuticas favorables, incluyendo su estabilidad
a pH 2-5 y su buena solubilidad a un pH bajo lo que
indica una disolución rápida en el tracto gastrointestinal
superior, Lee, y cols., supra.
Si se utiliza en una terapia de combinación con
ciclosporina A, la MPA-M y la ciclosporina A pueden
tener un modo de acción sinérgico. La ciclosporina A tiene un
efecto selectivo en las células T, pero no elimina la actividad de
producción de anticuerpos de la célula B, mientras que el ácido
micofenólico tiene un efecto anti-proliferativo en
ambas células T y B. La terapia combinada de la ciclosporina
A/MPA-M puede incrementar el tiempo de
supervivencia y permitir el uso de dosis inferiores de ciclosporina
A, lo que reduciría los efectos secundarios asociados a la
ciclosporina A, básicamente la nefrotoxicidad.
El ácido micofenólico se metaboliza por
conjugación con el ácido glucurónico formando la glucoronida del
ácido micofenólico (MPAG). Schutz, E. y cols., Clinical
Chemistry 45(3):419-422 (1999) han
descrito dos metabolitos adicionales, la
7-O-glucosida de MPA
(M-1) y la acilglucuronida de MPA
(M-2). Schutz y cols. medían la inhibición de la
IMPDH-11 recombinante mediante MPA, MPAG,
M-1 y M-2 usando preparados
purificados de los metabolitos y descubrieron que la
M-2 presentaba una inhibición dependiente de la
concentración de IMPDH-II similar a la obtenida con
MPA. Sin embargo, los diferentes preparados de M-2
no eran capaces de inhibir la IMPDH-II. El
metabolito M-2 es probablemente una mezcla de
isómeros ya que se sabe que los acilglucuronidas sufren un reajuste
intramolecular a un pH fisiológico. Es decir, los acilglucuronidas
pueden hidrolizarse de nuevo a MPA. Hay que tener en cuenta que una
mezcla de isómeros de M-2 interaccionará del mismo
modo con un anticuerpo pero no inhibirá de la misma forma la
IMPDH. A la luz de los hallazgos de Schutz, quizás no resulte
sorprendente el que las mediciones de MPA usando el método de la
presente invención se correlacionen bien con los resultados
obtenidos mediante HPLC (r=0,994).
Debido a que el ácido micofenólico es un
material muy activo desde el punto de vista biológico, sería útil
realizar una valoración eficaz en el control de su
biodisponibilidad. Además, puede ser importante controlar los
niveles terapéuticos de fármaco, es decir los niveles de fármaco
óptimos y necesarios para una inmunosupresión adecuada. Puesto que
el MPA-M se hidroliza para dar el ácido
micofenólico, una valoración del ácido micofenólico permitiría el
control de las dosis de MPA-M.
El uso de cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC) para determinar la concentración de ácido
micofenólico en plasma humano se ha descrito en Jones, C.E.y cols.,
Journal of Chromatography B 708:229:234 (1998).
Jones y cols., J. Chem. Soc.
(C)1725-1737(1970) revela numerosas
transformaciones que el ácido micofenólico sufre cuando es incubado
con determinados microorganismos.
Nelson, P.H. y cols., Patente americana nº
4.753.935(1988) describe el éster morfolinoetílico del ácido
micofenólico, sus usos farmacéuticos y el control posterior a la
dosificación por HPLC de la concentración en plasma de ácido
micofenólico.
Un inmunoanálisis del ácido micofenólico que
utiliza anticuerpos monoclonales al ácido micofenólico se ha
descrito en Alexander, S y cols., PCT Publication Nº.WO 96/02004
(1996).
Los problemas de especificidad con el
inmunoanálisis se comentan en Tett, S.E. y cols., Clinical
Chemistry 44(6):A96-A97(1998).
Los autores compararon los resultados obtenidos en los pacientes
transplantados usando un inmunoanálisis comercial EMI® (Behring
Diagnostics) con los obtenidos mediante HPLC-UV y
descubrieron hasta una sobreestimación del 95% con el
inmunoanálisis entre concentraciones de rango medio.
La inhibición del IMPDH por el ácido
micofenólico ha sido descrita por Anderson, J.H y cols., Journal
of Biological Chemistry
243(18):4762-4768(1968). Los
inhibidores del IMPDH también se han descrito en las patentes
americanas, números 5.380.879, 5.444.072 y 5.807.876 y en las
publicaciones PCT wo/94/01105 y WO 94/12184.
Yatscoff, R.W. y cols., Clinical Chemistry
44(2):428-432(1998) informa sobre
el control farmacodinámico del ácido micofenólico en el plasma
humano midiendo el nivel residual de la actividad de IMPDH presente
en los propios linfocitos del paciente. Este método mide la propia
respuesta biológica del paciente al fármaco. No proporciona un
método para cuantificar directamente el fármaco en el plasma del
paciente.
La clonación y expresión del IMPDH humano en la
E. coli se ha descrito en Konno. Y y cols., J. Biol. Chem.
266(1):506-509(1991). Collart,
F.R. y cols., Patente americana nr. 5.665.583 (1997) también
describe la clonación y expresión en E. coli del IMPDH
humano.
La presente invención se basa en la inhibición
competitiva del enzima
inosina-5'-monofosfatodeshidrogenasa
(IMPDH) por parte del ácido micofenólico (MPA). La IMPDH cataliza
la siguiente reacción:
Monofosfato \
de \ inosina + NAD^{+} \xrightarrow{IMPDH} monofosfato \ de \
xantosina +
NADH
La velocidad de formación del NADH (nicotinamida
adenina dinucleótido reducido) se puede medir controlando el cambio
en la absorción a una longitud de onda de 340 nm, es decir, la
región de absorción característica del NADH, y este cambio en la
absorción puede correlacionarse luego con la concentración de
MPA.
El ácido micofenólico se enlaza al lugar activo
de IMPDH pero no compite con el sustrato. Uno de los metabolitos de
acilglucuronida del ácido micofenólico puede inhibir la reacción de
un modo similar al ácido micofenóli-
co.
co.
En una valoración conforme a la presente
invención, el ácido micofenólico presente en una muestra de suero o
plasma inhibe la reacción anterior, la medición de la cual es
controlada espectrofotométricamente a una longitud de onda de 340
nm. Por consiguiente, la concentración de ácido micofenólico en una
muestra es inversamente proporcional a la absorbancia de NADH a 340
nm.
Otro aspecto de la presente invención hace
referencia a un estuche para llevar a cabo un análisis para la
determinación de ácido micofenólico que comprende una primera
composición reactiva que consta de IMPDH e IMP y una segunda
composición reactivo que consta de NAD.
El enzima IMPDH que se prefiere utilizar es un
enzima IMPDH-11 recombinante de linfocitos T
humanos.
La figura 1 muestra las estructuras de MPA y los
metabolitos de glucuronida de MPA.
La figura 2 ilustra las vías de descomposición
metabólica para el MMF. La figura 2(a) muestra la
descomposición de MMF en MPA, MPAG y M1, y la figura 2(b)
muestra la descomposición de MMF en los metabolitos MPA, M1 y
M2.
La figura 3 es un gráfico de la concentración de
ácido micofenólico frente a la variación en la absorbancia a 340
nm.
La figura 4 es un gráfico de comparación de
métodos que muestra los valores obtenidos en las muestras de plasma
comparando el método de la presente invención frente a HPLC como un
método de referencia.
Las siguientes definiciones y parámetros
generales se establecen para ilustrar y definir el significado y el
objetivo de los diversos términos empleados para describir la
invención.
Muestra que se sospecha que contiene el producto
analizado: Cualquier muestra de la que se sospecha que
razonablemente contiene el producto analizado, es decir, el ácido
micofenólico o bien otro inhibidor de IMPDH, puede ser analizada
por el método de la presente invención. La muestra es claramente una
solución acuosa como un líquido corporal, por ejemplo, orina,
sangre entera o suero. La muestra puede ser tratada previamente si
se desea y puede prepararse en un medio conveniente que no
interfiera con el análisis. Se prefiere un medio acuoso.
Medición de la cantidad de ácido micofenólico:
Métodos cuantitativos, semi-cuantitativos y
cualitativos así como todos los demás métodos para determinar ácido
micofenólico son considerados métodos de medición de la cantidad de
ácido micofenólico. Por ejemplo, un método que detecta meramente la
presencia o ausencia de ácido micofenólico en una muestra que se
sospecha contiene ácido micofenólico se considera incluido dentro
del ámbito de la presente invención. Los términos "detectando"
y "determinando", así como otros sinónimos frecuentes para
medir, se contemplan dentro del objetivo de la presente
invención.
La determinación de MPA conforme a la presente
invención puede realizarse mediante un método de valoración en el
que se mide un cambio en absorbancia de NADH por unidad de tiempo o
bien mediante un método de punto final en el que la reacción se
extingue una vez transcurrido un cierto periodo de tiempo. El método
se puede aplicar fácilmente a analizadores automatizados para el
laboratorio o el análisis clínico.
El material de calibración equivale a cualquier
estándar de material de referencia que contenga una cantidad
conocida del producto analizado que va a ser medido. Las muestras
que se sospecha contienen el producto analizado y el material de
calibración se analizan en unas condiciones similares. Luego se
calcula la concentración del producto analizado comparando los
resultados obtenidos para la muestra desconocida con los resultados
obtenidos para el estándar. Esto se realiza frecuentemente trazando
una curva de calibración como la de la figura 3.
Materiales auxiliares: Se emplearán
frecuentemente varios materiales auxiliares en un análisis de
acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, normalmente las
soluciones tampón están presentes en el medio de análisis, así como
los estabilizadores para el medio de análisis y los componentes del
análisis. Frecuentemente, además de estos aditivos, se pueden
incluir proteínas adicionales como la albúmina o los tensoactivos,
en particular, los tensoactivos no iónicos, o similares.
La IMPDH se refiere al enzima
inosina-5'-monofosfato
deshidrogenasa, EC 1.1.1.205, que cataliza la formación de
xantina-5'-monofosfato de la
inosina-5'-monofosfato. La presente
invención contempla el uso de la IMPDH de fuentes naturales o
recombinantes, y se puede utilizar una forma iso o una mezcla de
formas iso.
Se tiene que entender que cualquier referencia
respecto a la especificación y a las reivindicaciones al ácido
micofenólico debe abarcar el ácido micofenólico así como sus
metabolitos biológica y terapéuticamente activos y los derivados
que se comportan en un sentido biológico, es decir, por la
inhibición de la IMPDH, como el ácido micofenólico.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a los estuches útiles para realizar de forma conveniente los
métodos de análisis de la invención para la determinación del ácido
micofenólico. Para incrementar la versatilidad de la
correspondiente invención, se puede disponer de reactivos útiles en
los métodos de la invención en una combinación envasada, en el
mismo recipiente o en distintos recipientes, en forma líquida o
liofilizada de manera que el porcentaje de reactivos permita la
optimización sustancial del método y del análisis. Los reactivos
podrán colocarse en recipientes separados o bien varios reactivos se
podrán combinar en uno o más recipientes dependiendo de la
reactividad cruzada y de la estabilidad de los reactivos.
El estuche de la presente invención se define en
la reivindicación 3 y contiene los reactivos, el enzima IMPDH, el
sustrato IMP, el sustrato NAD y un reactivo de calibración que
comprenda una cantidad conocida de ácido micofenólico. El IMPDH,
IMP y NAD se combinan frecuentemente con un tampón apropiado y con
los materiales auxiliares y luego se empaquetan. Los reactivos
pueden encontrarse en forma líquida o liofilizada.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
En los ejemplos siguientes, se preparaban dos
reactivos, uno que comprendía IMPDH y el otro NAD. En los ejemplos,
el IMP se combinaba con el reactivo IMPDH debido a los conocidos
efectos estabilizantes de un sustrato en un enzima; sin embargo,
alternativamente se podía incorporar el IMP al reactivo NAD.
Al hacer referencia a los ejemplos siguientes no
restrictivos se obtiene una comprensión más clara de la presente
invención.
Se preparaban 100 mililitros (ml) de una primera
composición de reactivo del modo siguiente. Aproximadamente se
vertían 80 ml de agua desionizada en un recipiente y se añadían 3,37
gramos de
3-[N-tris-(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxi-propanosulfonato,
Na(TAPSO) y se disolvían totalmente. A continuación, se
añadían 4,91 gramos de acetato sódico al recipiente y se disolvían,
luego 0,037 gramos de ditiotreitol (DTT), 0,019 gramos de
monofosfato de inosina (IMP), 0,134 gramos de Na_{2}EDTA y 0,134
gramos de Na_{2}EDTA y 0,10 gramos de SUTTOCIDE A (GAF Chemicals
Corp.). El pH se ajustaba a 8,0 con ácido clorhídrico 0,1 N (HCl).
El volumen se ajustaba a 100 ml con agua desionizada. Finalmente,
se añadían 0,034 unidades de IMPDH-II humano
recombinante altamente purificado y se disolvían totalmente.
El procedimiento usado para la clonación y
purificación del IMPDH-II se ha descrito en Carr,
S.F. y cols., J. Biological Chemistry 268(36):
27286-27290 (1993), y ese contenido se incorpora
al presente estudio. La clonación de la IMPDH se ha descrito
también en Collart, F.R. y cols., Patente americana, número
5.665.583 (1997). La IMPDH de fuentes naturales se encuentra
disponible en el comercio.
Cantidades efectivas de componentes reactivos
varían dependiendo de las necesidades específicas y se pueden
ajustar mediante simple experimentación en el laboratorio para
cumplir los requisitos particulares del análisis.
100 ml de una segunda composición reactiva se
preparaban del modo siguiente. Aproximadamente se vertían 80 ml de
agua desionizada en un recipiente y se añadían 1,82 gramos de ácido
N-[2-acetamido]-2-aminoetanosulfónico
(ACES) y se disolvían completamente. El pH se ajustaba a 6,0 con
hidróxido sódico 2N (NaOH). Luego se añadían 0,166 gramos de
nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), seguidos de 0,095 gramos
de azida sódica y 0,1 gramos de SUTTOCISE A. El volumen se ajustaba
a 100 ml de agua desionizada.
Los estándares de ácido micofenólico se
preparaban a partir del material disponible en el comercio (Sigma
Chemical). El MPA tenía aproximadamente una pureza del 98% según la
cromatografía de capa fina y la HPLC, y la identidad de MPA estaba
de acuerdo con la estructura según la RMN. Se preparaban un grupo
de estándares de MPA con plasma humano normal (potasio /EDTA)
recogidos de varios donantes. El MPA se pesaba y disolvía en el
volumen de plasma hasta unas concentraciones objetivo de 0,98
\mug/ml, 4,9 \mug/ml, 9,8 \mug/ml y 14,7 \mug/ml. Estos
estándares se utilizaban para calibrar el instrumento empleado en el
análisis que se indica a continuación.
Las determinaciones de ácido micofenólico se
hacían usando un analizador HITACHI 717 (Roche Diagnostics Corp.,
Indianapolis). La longitud de onda principal utilizada era de 340 nm
y la longitud de onda secundaria era de 700 nm. El analizador se
programaba para dispensar 3 \mul de muestra en una cubeta incubada
en un baño de agua a 37ºC. Luego se añadían 250 \mul de la
composición reactiva de IMPDH-II a la muestra, se
mezclaban y se dejaban incubar durante 5 minutos, y una vez
transcurrido ese tiempo se añadían y mezclaban 50 \mul de la
composición reactiva de NAD. La diferencia en la absorbancia a 340
nm se calculaba a partir de la adición inicial de la segunda
composición de reactivo hasta 5 minutos después de la adición de la
segunda composición de reactivo. El descenso en la velocidad de
absorbancia a 340 nm es inversamente proporcional a la concentración
de ácido micofenólico en la muestra. Las concentraciones de MPA se
calculan comparando la velocidad de producción de NADH por la
muestra desconocida con la velocidad de producción de NADH por los
estándares que contienen cantidades conocidas de MPA.
Se analizaba el contenido de ácido micofenólico
de las muestras de plasma de un grupo de 55 pacientes transplantados
humanos usando el método de la presente invención (Método Y). Los
resultados obtenidos se comparaban luego con los resultados
obtenidos cuando se analizaban las muestras de los pacientes usando
HPLC como método de referencia (método X). Las muestras de plasma
usadas se obtenían usando EDTA anticoagulante, y el procedimiento
usado para el Método era el descrito con anterioridad. El método
HPLC usado es el que conocen los expertos en la materia (Ver Jones,
C.E. y cols., Journal of Chromatography B
708:229-234(1998) para el método
representativo). Los resultados obtenidos por los dos métodos se
indican a continuación y en la figura 2 se muestra un gráfico
comparativo de los valores obtenidos por los dos métodos. El
análisis de regresión lineal de mínimos cuadrados daba un
coeficiente de correlación de 0,994 y una ecuación de Y =0,957X +
0,515
Si se deseaba una sensibilidad del análisis
elevada, una persona experimentada en el tipo de inmunoanálisis
podía usar una ciclación enzimática para amplificar la reacción
enzimática primaria de forma que el NADH producido en la reacción
primaria se utilizara como el sustrato en una reacción
secundaria.
Claims (3)
1. Un método para determinar el ácido
micofenólico en una muestra de fluido corporal que comprende las
etapas de:
a. combinar la muestra que se sospecha que
contiene ácido micofenólico con cantidades eficaces de IMP, NAD e
IMPH en unas condiciones adecuadas para la actividad del IMPDH y con
ello obtener una mezcla de reacción
b. combinar la producción de NADH en dicha
mezcla de reacción por espectrofotometría, y
c. comparar la producción de NADH con la
producción de NADH mediante un ejemplo que contiene una cantidad
conocida de ácido micofenólico después de haber sido tratada según
las etapas (a) y (b).
2. El método de la reivindicación 1, donde dicho
control de la producción de NADH se realiza usando un analizador
automatizado.
3. Un estuche para llevar a cabo el método de la
reivindicación 1 que comprenda en una combinación envasada:
a. un primer reactivo que conste de cantidades
efectivas de IMPDH, IMP y un tampón, y
b. un segundo reactivo que comprenda cantidades
efectivas de NAD y de un tampón, comprendiendo además dicho estuche
un reactivo de calibración que constará de una cantidad conocida de
ácido micofenólico.
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