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ES2266251T3 - Metodo eficaz para producir composiciones enriquecidas con antocianinas. - Google Patents

Metodo eficaz para producir composiciones enriquecidas con antocianinas. Download PDF

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ES2266251T3
ES2266251T3 ES01968319T ES01968319T ES2266251T3 ES 2266251 T3 ES2266251 T3 ES 2266251T3 ES 01968319 T ES01968319 T ES 01968319T ES 01968319 T ES01968319 T ES 01968319T ES 2266251 T3 ES2266251 T3 ES 2266251T3
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ES
Spain
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anthocyanins
extract
resin
composition
enriched
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES01968319T
Other languages
English (en)
Inventor
Michael S. NatProd Consulting Services TEMPESTA
F. Joseph Daugherty
David T. Bailey
Delano R. Freeberg
Dennis Gertenbach
Gerald Gourdin
Steven Richheimer
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Phenolics LLC
Original Assignee
Phenolics LLC
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Publication date
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Abstract

Un método para preparar una composición enriquecida con antocianinas, que comprende: a) proporcionar un extracto crudo de una materia vegetal, en el que dicha materia vegetal contiene antocianinas; b) filtrar dicho extracto crudo; c) poner en contacto dicho extracto crudo con una resina de poliestireno brominado, en el que dicha resina adsorbe dichas antocianinas; d) lavar dicha resina; y e) eluir dichas antocianinas de dicha resina de poliestireno brominado para obtener una composición enriquecida con antocianinas.

Description

Método eficaz para producir composiciones enriquecidas con antocianinas.
Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención
La presente invención se dirige a procesos eficaces de una o dos etapas para producir composiciones enriquecidas con fenoles a partir de materia vegetal fresca o seca. Más particularmente, la presente invención proporciona métodos para producir composiciones enriquecidas con antocianinas y proantocianinas.
2. Descripción de la técnica anterior
Las antocianinas son compuestos que se encuentran de forma natural que son responsables de los colores azul, púrpura y rojo de muchas frutas, verduras, granos de cereales y flores. Por ejemplo, los colores de las frutas de baya, tales como arándanos negros, mirtilos, fresas, frambuesas, moras de Boysen, moras de Marion, arándanos rojos, se deben a antocianinas muy diferentes. En la naturaleza, se han identificado más de 300 antocianinas distintas estructuralmente. Debido a que las antocianinas se encuentran de forma natural, han atraído mucho interés para uso como colorantes para alimentos y bebidas.
Recientemente, el interés en los pigmentos de antocianina se ha intensificado debido a sus posibles beneficios para la salud como antioxidantes dietéticos. Por ejemplo, los pigmentos de antocianina de mirtilos (Vaccinium myrtillus) han sido usados durante mucho tiempo para mejorar la agudeza visual y para tratar trastornos circulatorios. Hay evidencia experimental de que ciertos flavonoides y antocianinas tienen propiedades anti-inflamatorias. Además, hay informes de que las antocianinas administradas oralmente son beneficiosas para tratar diabetes y úlceras y pueden tener actividades antivíricas y antimicrobianas. Se cree que la base química para estas propiedades deseables de los flavonoides está relacionada con su capacidad antioxidante. Así, las características antioxidantes asociadas con las bayas y otras frutas y verduras han sido atribuidas a su contenido de antocianina.
Las proantocianinas son otra clase de compuestos flavonoides que se encuentran en las frutas y verduras y, aunque no tienen color, tienen actividades antioxidantes.
Debido a los beneficios y características anteriores de las antocianinas y proantocianinas, se ha puesto mucho esfuerzo en la extracción de estos compuestos de frutas, verduras y otras fuentes de plantas. Además de las antocianinas, las plantas, frutas y verduras también pueden contener otros compuestos tales como sales minerales, ácidos orgánicos comunes tales como ácido cítrico o ácido tartárico, hidratos de carbono, glicósidos flavonoides y catequinas. A menudo es deseable aislar las antocianinas y proantocianinas de estos compuestos. Las antocianinas han sido extraídas de plantas y frutas por varios procedimientos. Un método de extracción de extracción de antocianinas de extracción emplea dióxido de azufre. El extracto se pasa a través de una columna de intercambio iónico para adsorber los materiales de antocianina, y las antocianinas adsorbidas se eluyen con acetona, álcali o dimetilformamida (DMF). Las desventajas de este procedimiento incluyen la presencia de dióxido de azufre, que interfiere con la adsorción de las antocianinas, por lo que se requieren múltiples adsorciones en columna. La elución con álcali degrada considerablemente las antocianinas, mientras que el DMF no es un aditivo alimenticio reconocido y por tanto se debe realizar la eliminación completa del DMF de las antocianinas antes de que las antocianinas puedan ser añadidas a cualesquiera productos alimenticios.
Shrikhande, en la patente de EE.UU. nº 4.452.822 divulga un método para la producción de un material coloreado rojo para uso como colorante para comida y bebidas, en el que se extrae con dióxido de azufre un material de origen vegetal que contiene antocianinas para formar un extracto de un material de antocianina. El extracto se trata primero enzimáticamente para reducir o eliminar material sólido presente en el extracto, y a continuación se trata por oxidación del dióxido de azufre con peróxido de hidrógeno. Después de reducir el pH, el extracto se carga en un medio de intercambio iónico (un copolímero de estireno y divinilbenceno polímero o polimetacrilato reticulado) que adsorbe las antocianinas. Sin embargo, es muy difícil eliminar todo el azufre una vez que ha sido introducido. Además, el peróxido de hidrógeno degrada las antocianinas en el producto final.
Gaveta y col., en la patente de EE.UU. nº 5.200.186, divulga un proceso para la preparación de extractos con alto contenido en antocianósidos que implica tratar un extracto crudo con iones bisulfito para proporcionar aductos antocianina-bisulfito. Después de ajustar el pH del extracto a 5-6 por la adición de un álcali acuoso, el extracto se carga sobre una resina de poliestireno no polar y se eluyen los aductos antocianina-bisulfito. La disolución obtenida se extrae múltiples veces con butanol o alcohol amílico. Tras la concentración y acidificación (pH 1-2) de la fase orgánica, el extracto con alto contenido de antocianina se aísla mediante liofilización o por precipitación con un disolvente aprótico tal como acetato de etilo. De nuevo, es difícil eliminar todo el azufre una vez que ha sido introducido. Además, es difícil eliminar el butanol, alcohol amílico o acetato de etilo una vez que estos disolventes han sido introducidos.
Lansgton, en la patente de EE.UU. nº 4.500.556, divulga un método de producción de un colorante de antocianina a partir de pulpa de uva poniendo en contacto un disolvente de extracción acuosa que contiene iones bisulfito para extraer un aducto de antocianina-ion bisulfito. El extracto se pone en contacto a continuación con un adsorbente no iónico para adsorber el aducto antocianina-bisulfito, y el adsorbente se lava para eliminar los azúcares solubles, ácidos orgánicos y otros materiales no pigmentados solubles en agua. Entonces las antocianinas se eluyen del adsorbente con un disolvente orgánico acidificado. De nuevo, es difícil eliminar todo el azufre una vez que ha sido introducido.
Lietti, en la patente de EE.UU. nº 4.413.004 divulga un método de extracción de antocianinas a partir de mirtilos extrayendo la fruta con un metanol anhídrido que contiene ácido clorhídrico, seguido por la adición de acetato de plomo para precipitar las antocianinas como sales de plomo. Sin embargo, el uso de plomo hace a los productos obtenidos por este proceso inadecuados para uso alimenticio.
Los ejemplos anteriores describen algunos procesos conocidos en la técnica para extraer y aislar antocianinas de varias materias vegetales. Sin embargo, cada uno de los procesos anteriores implica el uso de materiales tóxicos y/o medioambientalmente dañinos. Consecuentemente, los métodos actuales disponibles para aislar y purificar antocianinas no son fácilmente escalables a un proceso comercial eficiente en el que la consideración de eliminación de varios reactivos químicos y disolventes juega un papel importante en la viabilidad total del proceso. Además, las antocianinas deben ser aisladas de forma que se minimice su inestabilidad natural de degradación.
Aún hay una necesidad, por tanto, de un proceso eficaz para aislar y purificar composiciones que contienen antocianinas para usos en productos nutricionales y farmacéuticos que sea efectivo en coste, escalable, económicamente productivo, no requiera el uso de disolventes o reactivos tóxicos y aísle las antocianinas de modo que minimice su inestabilidad de degradación.
Sumario de la invención
Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos económicos y simplificados para la extracción, aislamiento y purificación de composiciones enriquecidas con antocianinas. Más específicamente, un aspecto de esta invención proporciona un método de preparación de composiciones enriquecidas con antocianinas que comprende: (a) extraer plantas o partes de plantas que se sabe que contienen antocianinas para formar un extracto crudo que comprende antocianinas y compuestos extraños; (b) añadir una fuente de iones bisulfito (HSO_{3}^{-}) para formar un extracto sulfitado que contiene aductos antocianina-bisulfito; (c) filtrar el extracto sulfitado; (d) poner en contacto el extracto sulfitado con una primera resina que retiene una porción de los materiales extraños; (e) lavar los aductos antocianina-bisulfito de la resina; (f) acidificar el extracto parcialmente purificado lavado de la primera resina para liberar las antocianinas de los aductos antocianina-bisulfito; (g) poner en contacto el extracto acidificado con una resina de poliestireno brominado que adsorbe las antocianinas pero no retiene los materiales extraños restantes; y (h) eluir las antocianinas de la resina de poliestireno brominado para obtener un extracto enriquecido con antocianinas.
Esta invención proporciona además métodos para preparar composiciones enriquecidas con antocianinas y proantocianinas útiles como productos nutricionales y farmacéuticos. Más específicamente, un aspecto de esta invención proporciona un método para preparar composiciones enriquecidas con antocianinas y proantocianinas que comprenden: (a) extraer plantas o partes de plantas que se sabe que contienen antocianinas para formar un extracto crudo que comprende antocianinas y compuestos extraños; (b) filtrar el extracto crudo; (c) poner en contacto el extracto crudo filtrado con una resina de poliestireno brominado que adsorbe las antocianinas pero no retiene los materiales extraños; (d) lavar dicha resina; y (e) eluir las antocianinas de la resina de poliestireno brominado para obtener un extracto enriquecido con antocianinas.
Esta invención proporciona además composiciones enriquecidas con antocianinas aisladas por los métodos de la invención. Las composiciones son útiles como productos nutricionales y farmacéuticos.
Las ventajas, utilidades y características precedentes y otras de la invención resultarán aparentes a partir de las siguientes descripciones más particulares de realizaciones preferidas de la invención y como se ilustra en los dibujos adjuntos y como se ha señalado de forma particular en las reivindicaciones anejas.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos, que se incorporan al presente documento y forman una parte de la memoria descriptiva, ilustran las realizaciones preferidas de la presente invención y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.
En los dibujos:
La figura 1 es un diagrama de flujo para preparar un extracto enriquecido según una realización de esta invención que comprende dos etapas de purificación separadas usando dos resinas diferentes.
La figura 2 es un diagrama de flujo para preparar un extracto enriquecido según otra realización de esta invención que comprende una purificación del extracto.
La figura 3 es un cromatograma de HPLC a 510 nm de un producto final de extracto de mirtilo enriquecido.
La figura 4 es un cromatograma de HPLC a 280 nm de un producto final de extracto de mirtilo enriquecido.
La figura 5 es un cromatograma de HPLC a 510 nm de un producto final de extracto de arándano negro enriquecido.
La figura 6 es un cromatograma de HPLC a 280 nm de un producto final de extracto de arándano negro enriquecido.
Descripción detallada de la invención
Los métodos de esta invención producen extractos purificados y composiciones enriquecidas con antocianinas a partir de materia vegetal que contiene de forma natural antocianinas. El método de esta invención proporciona además extractos y composiciones enriquecidas con antocianinas y proantocianinas totales. Como se usa en el presente documento, el término "extracto" se refiere a una sustancia derivada de una fuente vegetal que contiene de forma natural antocianinas, incluyendo extractos preparados a partir de la planta completa o de varias partes de la planta, tales como el fruto, hojas, tallos, raíces, etc. Por tanto, el método de esta invención no está limitado a la parte particular de la planta usada para preparar el extracto. Además, la materia vegetal puede ser materia vegetal seca o fresca. Ejemplos de plantas y frutas que se pueden usar en la preparación de extractos purificados de esta invención incluyen cualquier planta, incluyendo frutas y verduras, que contenga antocianinas, incluyendo arándanos negros, mirtilos, moras, fresas, grosellas rojas, grosellas negras, arándanos rojos, cerezas, frambuesas, uvas, grosellas, bayas del saúco, flores de hibisco, pimientos, lombarda, maíz morado, y patatas dulces violetas. Se sabe que la mayoría de frutas y verduras coloreadas contienen antocianinas.
Las composiciones enriquecidas con antocianinas descritas en el presente documento fueron ensayadas mediante determinación espectrofotométrica estándar frente a un estándar de cloruro de delfinidina. El cloruro de delfinidina es una aglicona, mientras que las antocianinas son glicósidos (es decir agliconas enlazadas a uno o más azúcares). Por tanto, el porcentaje total de antocianinas dado para las composiciones enriquecidas con antocianinas descritas en el presente documento está dado en realidad en términos de porcentaje total de agliconas. En consecuencia, como será entendido por aquellos expertos en la técnica, los porcentajes de antocianinas totales (glicósidos) en las composiciones enriquecidas con antocianinas son realmente al menos 1,4 veces mayores que las agliconas totales medidas. Así, como se usa a lo largo de la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, el término "porcentaje de antocianinas" se refiere al porcentaje total de agliconas determinado frente a un estándar de cloruro de delfinidina, medida que puede estar relacionada con las antocianinas totales.
Proceso de purificación en dos columnas
La figura 1 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de una realización de esta invención en la que se puede preparar un extracto purificado de esta invención enriquecido con antocianinas mediante un proceso de purificación en dos columnas. El proceso de purificación en dos columnas de esta invención incluye una etapa (etapa 60, figura 1) de purificación de un extracto parcialmente purificado usando una resina de poliestireno brominado. El método ilustrado en la figura 1 se basa en el descubrimiento de que sustituyendo una resina de poliestireno usada en la técnica por una resina de poliestireno brominado en la segunda etapa de purificación en columna (etapa 60) proporciona composiciones que tienen propiedades superiores que con otras resinas de poliestireno, como se discutirá en detalle a continuación.
Antes de los métodos de purificación descritos en el presente documento las antocianinas (típicamente junto con proantocianinas) son extraídas de una materia vegetal para formar un extracto crudo (etapa 5, figura 1). El experto en la técnica reconocerá que en la bibliografía están disponibles una variedad de métodos de extracción, tales como extracción en baño, percolación, extracción contracorriente, etc. El método particular de extracción empleado no es esencial al proceso de la presente invención. El grado de conminutación de la materia vegetal antes del proceso de extracción debería proporcionar área superficial de partícula suficiente para que el disolvente de extracción contacte.
En una realización preferida, el proceso de extracción (etapa 5, figura 1) se realiza colocando materia vegetal seca o fresca en una cantidad apropiada de disolvente de extracción para formar un extracto crudo. En una realización preferida, el disolvente de extracción comprende una disolución acuosa que comprende aproximadamente 0-95% de etanol en agua o 0-100% de metanol en agua. La materia vegetal se pone en contacto con la disolución de extracción durante una cantidad de tiempo apropiada a una temperatura entre aproximadamente temperatura ambiente y 75ºC, preferiblemente 40ºC, para formar el extracto crudo. La cantidad de materia vegetal en relación a disolvente de extracción usada en el proceso de extracción varía entre aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:20, sobre una base de un gramo a un mililitro, siendo preferido aproximadamente 1:4 a 1:8. El extracto crudo contiene tanto las antocianinas deseadas como materiales extraños (por ejemplo, esteroles vegetales, ácidos grasos, triglicéridos, azúcares, ácidos orgánicos y otros tipos de glicósidos flavonoides) disueltos en el disolvente de extracción. Los sólidos vegetales contenidos en el extracto crudo se separan de la porción líquida y los sólidos vegetales o bien se vuelven a extraer como se describió anteriormente o se desechan.
En una realización de la etapa 5 (figura 1), se añade pectinasa bien a la materia vegetal o al disolvente de extracción antes o durante el proceso de extracción. Alternativamente, la pectinasa se puede añadir al extracto crudo después de que el proceso de extracción esté completo. La pectinasa sirve para impedir que el extracto forme gel en cualquier momento durante o después del proceso de extracción de modo que permanecerá con capacidad de fluir durante la purificación en columna. La cantidad de pectinasa añadida dependerá, desde luego, de la cantidad de materia vegetal usada para preparar el extracto. Típicamente, la pectinasa se añade en una cantidad entre aproximadamente 0 y 0,12% en peso de la materia vegetal de partida.
La etapa 10 (figura 1) del proceso de purificación en dos columnas de esta invención comprende la adición de iones bisulfito (HSO_{3}^{-}) al extracto crudo para formar un extracto que contiene aductos antocianina-bisulfito. Las antocianinas son moléculas cargadas positivamente y por tanto reaccionan con los iones bisulfito cargados negativamente, mientras que los glicósidos flavonoides también presentes en el extracto crudo no reaccionan con los iones bisulfito. Los iones bisulfito se pueden añadir de cualquier forma conveniente, tal como mediante la adición de metabisulfito de sodio, bisulfito de sodio, ácido sulfuroso, gas SO_{2}, y similares. En una realización, se disuelve metabisulfito de sodio en agua y se añade al extracto crudo. La cantidad de iones bisulfito añadidos está preferiblemente entre aproximadamente 10-20 equivalentes, siendo preferido 15 equivalentes. El extracto crudo comprende ahora los aductos antocianina-bisulfito junto con los materiales extraños mencionados anteriormente disueltos en la disolución de extracción. La formación de los aductos antocianina-bisulfito permite la separación de las antocianinas de los compuestos neutros no complejados presentes en el extracto crudo como se describe a continuación.
Si se usó una disolución alcohólica de extracción para preparar el extracto crudo en la etapa 5 (figura 1), el extracto crudo sulfitado se concentra en la etapa 20 hasta que contenga menos del 6 por ciento de alcohol, preferiblemente manteniendo mientras una temperatura de 40ºC o menos durante la concentración. Se añade agua para diluir el extracto crudo sulfitado, concentrado y el extracto crudo sulfitado diluido o bien se concentra y se diluye de nuevo con agua antes de la etapa 30 o bien se lleva directamente a la etapa 30 sin realizar una segunda dilución. Desde luego, si se usó agua como la disolución de extracción en la preparación del extracto crudo, la etapa 20 de concentración no es necesaria, y en este caso el extracto crudo de la etapa 10 se lleva directamente a la etapa 30 como se muestra por la flecha discontinua en la figura 1.
La etapa 30 (figura 1) del proceso en dos columnas comprende filtrar el extracto crudo sulfitado de la etapa 20 para eliminar los sólidos que puedan haber precipitado del extracto crudo. La etapa 30 de filtración comprende añadir una cantidad medida de un adyuvante de filtrado al extracto crudo de la etapa 20. Ejemplos de adyuvantes de filtrado adecuados incluyen celulosa y tierra diatomácea. La mezcla de extracto crudo y adyuvante de filtrado preferiblemente se bate o se agita hasta homogeneidad. La mezcla se filtra en un lecho del adyuvante de filtrado y el lecho se lava con agua desionizada.
El extracto filtrado, sulfitado, que está a un pH de aproximadamente 3,5, se purifica a continuación en la primera etapa de purificación (etapa 40, figura 1) del proceso en dos columnas de esta invención. En la etapa 40, el extracto filtrado, sulfitado, de la etapa 30 se pone en contacto con la resina o material adsorbente que adsorbe glicósidos flavonoides no complejados, esteroles vegetales, ácidos grasos y triglicéridos, pero adsorbe muy poco del aducto antocianina-bisulfito contenido en el extracto filtrado, sulfitado. Las resinas usadas en la primera etapa 40 de puesta en contacto con resina son resinas reticuladas de fase inversa, no iónicas. Entre los materiales no iónicos útiles como adsorbentes para la primera etapa 40 de purificación se incluye cualquiera de los polímeros reticulados macroporosos conocidos obtenidos por polimerización de estireno, divinilbenceno, trivinilbenceno, alquilvinilbenceno, acrilvinilbenceno, metacrilato de metilo y similares. En una realización preferida, la resina es una resina de polimetacrilato tal como CG-71cd Amberchrom (TosoHaas; Montgomery, PA). Generalmente se necesita aproximadamente 1 litro de resina por 100 gramos de antocianinas totales presentes en el extracto filtrado, sulfitado. Aunque las etapas de poner en contacto los extractos parcialmente purificados o crudos con una resina se describen en el presente documentos en términos de poner en contacto los extractos con una resina que está cargada en una columna, dicha descripción es meramente para facilidad de la explicación. Por tanto, la resina no necesita estar envasada en un columna con el fin de realizar los métodos de esta invención.
En una realización, la primera resina de la etapa 40 (figura 1) se envasa en una columna y el extracto filtrado, sulfitado, se pasa a través de la primera resina a una velocidad de aproximadamente medio a un volumen de columna por minuto. Esto es, durante la etapa 40 el aducto antocianina-bisulfito para a través de la resina, mientras que los materiales extraños tales como los glicósidos flavonoides no complejados, esteroles vegetales, ácidos grasos y triglicéridos son retenidos por la resina. Después de que todo el extracto filtrado, sulfitado ha pasado a través de la resina, la resina se lava con aproximadamente 10 volúmenes de columna de agua desionizada para eluir el resto del aducto antocianina-bisulfito. El eluyente de la carga y el eluyente del agua de la etapa 40 se combinan para proporcionar una primer producto de extracto purificado, que comprende el aducto antocianina-bisulfito así como azúcares, sales, ácidos orgánicos y varios fenoles presentes en la materia vegetal además de las antocianinas que no fueron retenidas por la resina.
El primer producto de extracto purificado de la etapa 40 que contiene el aducto antocianina-bisulfito se acidifica con mezclado en la etapa 50 (figura 1) a pH aproximadamente 1,0 a 1,25 mediante la adición de ácido sulfúrico concentrado. El ácido funciona para romper el aducto antocianina-bisulfito para proporcionar antocianinas no complejadas. La disolución acidificada en la etapa 50 se concentra mediante evaporación parcial para eliminar el dióxido de azufre (SO_{2}) liberado del aducto durante la acidificación. La disolución acidificada de la etapa 50 se lleva entonces a la etapa 60 para la segunda purificación del extracto.
El propósito de la segunda etapa de purificación (etapa 60, figura 1) es separar las antocianinas de los azúcares, sales y ácidos orgánicos aún presentes en la disolución acidificada de la etapa 50 (figura 1). Los métodos convencionales usados para conseguir este nivel de purificación involucran típicamente la extracción de las antocianinas en un disolvente orgánico polar, por ejemplo extrayendo la disolución acidificada numerosas veces con un disolvente tal como butanol o alcohol amílico. Sin embargo, las extracciones con butanol o alcohol amílico no son deseables por muchas razones, incluyendo el hecho de que dichos disolventes tienen altos puntos de ebullición y por tanto son difíciles de eliminar mediante evaporación. Además, dichos disolventes se clasifican como irritantes y por tanto tienen requerimientos de eliminación especiales. Por consiguiente, la purificación de antocianinas realizando extracciones de butanol o alcohol amílico no es un proceso eficaz o deseable donde las consideraciones de eliminación de dichos disolventes juegan un papel importante en la viabilidad total del proceso.
En la etapa 60 (figura 1) de la presente invención, la disolución acidificada de la etapa 50 que comprende las antocianinas no complejadas se pone en contacto con una segunda resina o material adsorbente. La segunda resina usada en la etapa 60 es capaz de adsorber las antocianinas no complejadas pero retiene muy poco de los materiales extraños no deseados restantes en la disolución acidificada. Los presentes inventores descubrieron un proceso económico y eficaz para obtener una composición de antocianinas de pureza elevada purificando la disolución acidificada de la etapa 50 en una columna poniendo en contacto la disolución acidificada con una resina de poliestireno brominado, tal como SP207 (Supelco; Bellafonte, PA), fabricada por Mitsubishi Chemical America. La resina SP207 es una resina de tipo de lecho polimérico estirénico brominado, macroporosa diseñada para aplicaciones de cromatografía de fase inversa, y tiene una distribución de tamaño de partícula entre aproximadamente 250-600 micras y un intervalo de tamaño de poro entre aproximadamente 100-300 Angstroms. La bromación de los anillos aromáticos proporciona hidrofobicidad aumentada a la resina de poliestireno y está diseñada para proporcionar una resina que tiene selectividad aumentada para moléculas hidrófobas en relación a los soportes de fase inversa poliméricos convencionales de divinilbenceno o estireno. Debido a sus fuertes propiedades de enlace, la resina de poliestireno brominado no se usa típicamente en la purificación de productos naturales. Por tanto, puesto que se sabía que las resinas de poliestireno convencionales tienden a enlazar las antocianinas tan fuertemente que es muy difícil eluir las antocianinas de la resina de poliestireno, se esperaba que la resina de poliestireno brominado enlazaría las antocianinas incluso más fuertemente. Por tanto, no se esperaba que una resina de poliestireno brominado fuera adecuada para la purificación de antocianinas. Sin embargo, sorprendentemente e inesperadamente los inventores descubrieron que la resina de poliestireno brominado enlaza las antocianinas menos fuertemente que las resinas de poliestireno no brominado, pero permite aún la separación de las antocianinas de las impurezas extrañas no deseadas que son más polares que las antocianinas.
Para realizar la etapa 60 de purificación, el producto acidificado concentrado de la etapa 50 se pone en contacto con la resina de poliestireno brominado, tal como una resina que está envasada en una columna. Cuando se usa una resina envasada en columna para la etapa 60 de purificación, generalmente se cargan en la columna, 40 gramos de antocianinas por litro de resina. Puede ser necesaria la dilución con agua si la concentración de sólidos en el producto acidificado concentrado excede 200 gramos por litro.
Posteriormente a la carga del extracto filtrado acidificado en la resina de poliestireno brominado, los materiales no deseados tales como azúcares, sales y ácidos orgánicos, que tienen poca o ninguna afinidad por el adsorbente, se lavan específicamente de la resina con ácido acético acuoso al 0,1%. Preferiblemente se usan aproximadamente dos volúmenes de columna de ácido acético acuoso al 0,1% para eluir los materiales extraños. Las antocianinas deseadas se eluyen a continuación de la resina usando un disolvente orgánico polar tal como etanol/agua al 50-75% o metanol/agua al 50-100%. Aproximadamente se requieren de cuatro a diez volúmenes de columna de disolvente eluyente para eluir las antocianinas de la resina. La recuperación de las antocianinas del eluyente se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente tal como evaporación, destilación, congelado-secado, y similares, para proporcionar un extracto enriquecido de esta invención.
Las condiciones empleadas en el proceso de dos columnas de esta invención proporcionan extractos enriquecidos con antocianinas, donde los productos finales de extracto de arándanos negros contienen al menos 8% de antocianinas en peso del extracto. Por ejemplo, en una realización, el producto final de extracto de arándanos negros contiene entre aproximadamente 8-40% en peso de antocianinas. En otra realización, el producto final de extracto de arándanos negros enriquecido contiene aproximadamente 15% en peso de antocianinas. En ciertas realizaciones, el producto final de extracto de arándanos negros enriquecido contiene también al menos 5% de proantocianinas.
El método de dos columnas de esta invención también proporciona extractos de mirtilos que comprenden al menos 8% de antocianinas. En una realización, el extracto de mirtilos contiene entre aproximadamente 8-55% de antocianinas, más preferiblemente entre aproximadamente 28% y 45% de antocianinas totales. En algunas realizaciones, los extractos también contiene al menos 5% de proantocianinas. El método de dos columnas descrito anteriormente también permite ventajosamente la carga elevada tanto en una primera como en una segunda columnas.
Proceso de purificación en una columna
La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de una segunda realización de esta invención en la cual se puede preparar un extracto purificado de esta invención enriquecido con antocianinas mediante un proceso de purificación en una columna. El método de purificación en una columna de esta invención proporciona composiciones enriquecidas con antocianinas, en las que las composiciones comprenden concentraciones adecuadas de antocianinas totales para uso como agentes nutricionales. Aunque la presencia de proantocianinas es difícil de medir, se cree que las composiciones aisladas por el método de una columna también contienen proantocianinas. El proceso de una columna de esta invención permite la eliminación de la primera columna (etapa 40, figura 1) usado en el proceso de dos columnas descrito anteriormente. Además, el método de una columna de esta invención elimina la etapa de sulfitación (etapa 10, figura 1) del método de purificación en dos columnas de esta invención, eliminando por tanto ventajosamente la necesidad de usar un reactivo de sulfitación y además eliminando la etapa 50 de acidificación (figura 1) del proceso de dos columnas. Por tanto, el proceso de una columna de esta invención proporciona un método incluso más eficaz y económico de obtención de composiciones enriquecidas con antocianinas eliminando diversas etapas del proceso y reduciendo la cantidad de reactivos necesarios en el proceso, reduciendo por ello los costes de producción y las cuestiones de eliminación.
En una realización preferida del proceso de una columna de esta invención, como se ilustra en las etapas 105-160 en la figura 2, las antocianinas se extraen de una materia vegetal seca o fresca (etapa 105, figura 2). Como se describió en el proceso de dos columnas, están disponibles en la bibliografía una variedad de métodos de extracción, tal como extracción en baño, percolación, extracción contracorriente, etc. El método particular de extracción empleado no es esencial al proceso de la presente invención. El grado de conminutación de la materia vegetal antes del proceso de extracción debería proporcionar área superficial de partícula suficiente para que el disolvente de extracción contacte.
El proceso de extracción (etapa 105, figura 2) se lleva a cabo preferiblemente colocando materia vegetal seca o fresca en una cantidad apropiada de disolvente de extracción. En una realización preferida, el disolvente de extracción comprende una disolución de alcohol acidificada que tiene aproximadamente 0-95% de etanol en agua y un ácido adecuado en una cantidad de aproximadamente 0,5-3%, más preferiblemente aproximadamente 0,5-1,0% en peso. En otra realización preferida, el disolvente de extracción comprende una disolución de alcohol acidificada que tiene entre aproximadamente 0-100% de metanol en agua o entre aproximadamente 0-95% de etanol en agua y entre aproximadamente 0,5-3% en peso de un ácido adecuado. Los ácidos adecuados que pueden ser usados en la etapa de extracción incluyen ácido sulfúrico (H_{2}SO_{4}) o ácido clorhídrico (HCL). La materia vegetal se pone en contacto con la disolución de extracción durante una cantidad adecuada de tiempo a una temperatura entre aproximadamente temperatura ambiente y 75ºC, preferiblemente a 40ºC, para formar el extracto crudo. La cantidad de materia vegetal con relación a disolvente de extracción usada en el proceso de extracción varía entre aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:20 sobre la base de un gramo por milímetro, siendo preferido aproximadamente 1:4 a 1:8. El extracto crudo contiene antocianinas (y lo más probablemente proantocianinas) así como materiales extraños tales como esteroles vegetales, ácidos grasos, triglicéridos y compuestos no deseados que son más polares que las antocianinas, disueltos en el disolvente de extracción. El residuo sólido contenido en el extracto crudo se separa de la porción líquida y el residuo o bien se vuelve a extraer como se escribió anteriormente o se desecha.
En una realización de la etapa 105 (figura 2), se añade pectinasa bien a la materia vegetal o al disolvente de extracción antes o durante el proceso de extracción. Alternativamente, la pectinasa se puede añadir al extracto crudo después de que el proceso de extracción esté completo. La pectinasa sirve para impedir que el extracto forme gel en cualquier momento durante o después del proceso de extracción de modo que permanecerá con capacidad de fluir durante la purificación en columna. La cantidad de pectinasa añadida dependerá, desde luego, de la cantidad de materia vegetal usada para preparar el extracto. Típicamente, la pectinasa se añade en una cantidad entre aproximadamente 0 y 0,12% en peso de la materia vegetal de partida.
Si se usó una disolución alcohólica de extracción para preparar el extracto crudo, el extracto crudo se concentra hasta que el extracto crudo contenga menos del 6% de etanol o metanol, preferiblemente manteniendo una temperatura de 40ºC o menos durante la concentración. Se añade agua para diluir el extracto crudo concentrado y el extracto crudo diluido o bien se concentra y se diluye de nuevo con agua antes de la etapa 130 o bien se lleva directamente a la etapa 130 sin realizar una segunda dilución. Desde luego, si se usó agua como la disolución de extracción en la preparación del extracto crudo, la etapa 120 no es necesaria, y en este caso el extracto crudo de la etapa 105 se lleva directamente a la etapa 130 como se muestra por la flecha discontinua en la figura 2.
La etapa 130 (figura 2) del proceso en una columna comprende filtrar el extracto crudo de la etapa 120 para eliminar los sólidos que puedan haber precipitado del extracto crudo. Los inventores descubrieron que la cantidad de compuestos extraños no deseados que precipitan de la disolución de extracción podría incrementarse ajustando las condiciones de extracción en la etapa 105. Los compuestos extraños precipitados pueden ser fácilmente eliminados mediante filtración en la etapa 130. Se pueden emplear varios métodos de filtración en la etapa 130 de filtración del proceso de una columna de esta invención. Un método de filtración que puede ser empleado en la etapa 130 comprende añadir una cantidad medida de un adyuvante de filtrado tal como celulosa o tierra diatomácea al extracto crudo. La mezcla de extracto crudo y adyuvante de filtrado preferiblemente se bate o se agita hasta que se hace homogénea y a continuación la mezcla se filtra a través de un lecho de adyuvante de filtrado. El lecho se lava con una disolución ácida acuosa, preferiblemente aproximadamente ácido sulfúrico acuoso al 1%.
Otros métodos de filtración que pueden ser usados en la etapa 130 incluyen filtrar el extracto crudo a través de tierra o través de un filtro de prolipropileno de 30 \mum que se rellena preferiblemente con lana de vidrio. Aún otro método de filtración comprende usar un filtro de bolsa (un filtro de tela en forma de bolsa compuesto de polietileno o polipropileno), que ventajosamente se puede colocar alineado con la columna de purificación de la etapa 160 descrita a continuación.
En la etapa 160 (figura 2), el extracto filtrado de la etapa 130 que comprende las antocianinas deseadas y los compuestos extraños no deseados se pone en contacto con una resina o material absorbente de poliestireno brominado capaz de adsorber las antocianinas (y las proantocianinas). Como se discutió anteriormente en el proceso de dos columnas, sorprendentemente e inesperadamente los inventores descubrieron que la resina de poliestireno brominado enlaza las antocianinas menos fuertemente que la resina de poliestireno no brominado aunque permitiendo aún la separación limpia de las antocianinas de los compuestos extraños no deseados tales como azúcares, sales y ácidos orgánicos. De nuevo, aunque las etapas de poner en contacto los extractos parcialmente purificados o crudos con una resina se describen en el presente documento en términos de poner en contacto los extractos con una resina envasada en una columna, dicha descripción es meramente por facilidad de la explicación. Por tanto, la resina no necesita estar envasada en una columna con objeto de realizar el método de esta invención.
En una realización de la etapa 160 de purificación, el extracto crudo filtrado de la etapa 130 se carga en una columna envasada con resina de poliestireno brominado que tiene una distribución de tamaño de partículas entre aproximadamente 250-600 \mum y un intervalo de tamaño de poro entre aproximadamente 100-300 Angstroms. La cantidad de extracto crudo que se carga en la columna depende de la materia vegetal usada para preparar el extracto crudo. Por ejemplo, cuando se prepara el extracto crudo a partir de mirtilo, se pueden cargar aproximadamente 16-30 gramos de antocianinas por litro de resina. Cuando el extracto crudo se prepara a partir de arándano negro, se pueden cargar aproximadamente 9-25 gramos de antocianinas por litro de resina. El extracto crudo se puede diluir con agua antes de la carga si la concentración de sólidos en el extracto crudo concentrado excede de 200 gramos por litro de extracto crudo.
Posteriormente a la carga del extracto crudo filtrado sobre la resina, los materiales no deseados tales como azúcares, sales y ácidos orgánicos, que tienen poca o ninguna afinidad por el adsorbente, se lavan específicamente de la resina con ácido acético acuoso al 0,1%. Preferiblemente se usan aproximadamente dos volúmenes de columna de ácido acético acuoso al 0,1% para eluir los materiales extraños. Las antocianinas deseadas (y las proantocianinas) se eluyen a continuación de la resina usando un disolvente de elución orgánico polar tal como etanol/agua al 50-75% o metanol/agua al 50-100%. Aproximadamente se requieren de cuatro a diez volúmenes de columna de disolvente de elución para eluir las antocianinas de la resina. La recuperación de la antocianina del eluyente se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente tal como por evaporación, destilación, congelado-secado y similares, para proporcionar un extracto enriquecido de esta invención.
El proceso de una columna descrito anteriormente es adecuado para preparar composiciones suficientemente enriquecidas con antocianinas para uso como agentes nutricionales a partir de una variedad de materias vegetales que contienen antocianinas, tales como arándanos negros, mirtilos, moras, fresas, grosellas rojas, grosellas negras, arándanos rojos, cerezas, frambuesas, uvas, grosellas, bayas del saúco, flores de hibisco, pimientos, lombarda, maíz morado, y patatas dulces violetas. Por ejemplo, cuando se preparan extractos enriquecidos a partir de mirtilo seco, el producto final de extracto de mirtilo enriquecido preparado usando el proceso de una columna de esta invención contuvo al menos 8% en peso de antocianinas totales. Por ejemplo, en una realización los productos finales de extracto de mirtilo enriquecido contienen aproximadamente 8-50% en peso de antocianinas totales. En otro ejemplo, los extractos enriquecidos fueron preparados a partir de arándanos negros secos usando el proceso de una columna de esta invención, los productos finales de extracto de arándano seco enriquecido preparados usando el proceso de una columna de esta invención comprendían entre aproximadamente 8-35% de antocianinas totales. Como se estableció anteriormente, muchas de las materias vegetales que contienen antocianinas también contienen otros compuestos fenólicos además. Por consiguiente, los productos finales de extracto enriquecidos de esta invención también pueden contener al menos un 20% de fenoles totales. Por "fenoles totales" si se quiere decir la cantidad total de todos los diferentes compuestos fenólicos aislados en el extracto enriquecido preparado por el método de esta invención. Los tipos de compuestos fenólicos presentes en las materias vegetales usadas en el método de esta invención son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica y no necesitan ser descritos adicionalmente.
Si se desea purificar adicionalmente los extractos enriquecidos obtenidos bien por el proceso de dos columnas o por el proceso de una columna de esta invención, los extractos enriquecidos descritos anteriormente se pueden poner en contacto con una resina de intercambio aniónico para eliminar los ácidos orgánicos que pueden estar aún presentes en el extracto enriquecido. Un medio de intercambio aniónico adecuado para purificación adicional de los extractos enriquecidos incluye resinas de intercambio aniónico débil, por ejemplo, una resina de dietilaminoetanol tal como DEM-63 (Whatman) o Toyopearl DEAE-650M (TosoHaas). Alternativamente, se puede usar una resina de intercambio aniónico fuerte para purificar adicionalmente el extracto enriquecido con esta invención. Ejemplos de resinas de intercambio aniónico fuerte incluyen resinas de amonio cuaternario tales como Super Q-650M (TosoHass). Preferiblemente, la resina de intercambio aniónico es una resina de intercambio aniónico débil. Para realizar la purificación en columna de intercambio aniónico, el extracto enriquecido se disuelve en agua y se pone en contacto con la resina de intercambio aniónico, que puede estar envasada en una columna. La resina se lava con agua para eluir el extracto enriquecido adicional. Usando la etapa adicional de purificación de resina de intercambio aniónico, se enriqueció adicionalmente un extracto enriquecido conteniendo aproximadamente 24% de antocianinas totales aisladas a partir de arándanos negros secos a aproximadamente 38% de antocianinas totales.
Las figuras 3 y 4 son cromatogramas HPLC a 510 nm y 280 nm respectivamente, de extractos de mirtilo preparados según el proceso de una columna. La tabla 1 resume el porcentaje de cada antocianina en el extracto de mirtilo final identificado por el HPLC de la figura 3.
TABLA 1 Antocianinas porcentuales en extracto de mirtilo
Nombre Nº pico Composición porcentual
Delfinidina-3-O-galactósido 1 3,3
Delfinidina-3-O-glucósido 2 3,9
Cianidina-3-O-galactósido 3 2,1
Delfinidina-3-O-arabinósido 4 2,6
Cianidina-3-O-glucósido 5 2,8
Petunidina-3-O-galactósido 6 1,0
Petunidina-3-O-glucósido 7 2,5
Cianidina-3-O-arabinósido 8 1,7
Peonidina-3-O-galactósido 9 0,3
Petunidina-3-O-arabinósido 10 0,8
Malvidina-3-O-galactósido
Peonidina-3-O-glucósido 11 (co-eluidos) 2,1
Malvidina-3-O-glucósido 12 2,5
Peonidina-3-O-arabinósido 13 0,1
Malvidina-3-O-arabinósido 14 0,6
Total 26,3
Las figuras 5 y 6 son cromatogramas HPLC a 510 nm y 280 nm, respectivamente, de extractos de arándanos negros preparados según el proceso de una columna.
Los extractos enriquecidos de esta invención se pueden formular como pastillas, cápsulas o tinturas. En las composiciones de formulación según esta invención, se pueden utilizar una amplia variedad de excipientes, la naturaleza de los cuales dependerá, desde luego, del modo pretendido de aplicación de la composición. Ejemplos de excipientes incluyen conservantes, vehículos y agentes de tamponación, espesantes, de suspensión, estabilizantes, de humedad, emulsionantes, colorantes y aromatizantes, y en particular carboxivinil polímeros, propilenglicol, alcohol etílico, agua, alcohol cetílico, triglicéridos vegetales saturados, esteres de ácidos grasos de propilenglicol, trietanolamina, glicerol, almidón, sorbitol, carboximetilcelulosa, sulfato de laurilo, fosfato de dicalcio, lecitina, etc.
Los extractos enriquecidos de esta invención se pueden usar como suplementos alimenticios (por ejemplo, antioxidantes alimenticios) y para el tratamiento de trastornos en humanos y mamíferos. Por ejemplo, los extractos enriquecidos de esta invención se pueden usar para mejorar la agudeza visual y para tratar desórdenes circulatorios, diabetes y úlceras. Además, los extractos enriquecidos se pueden usar como agentes anti-inflamatorios, agentes antivíricos y agentes antimicrobianos.
La descripción anterior se sólo considera ilustrativa de los principios de la invención. Además, ya que rápidamente se le ocurrirán a aquellos expertos en la técnica numerosas modificaciones sin cambios, no se desea limitar la invención a la construcción y procesos exactos mostrados como se describió anteriormente. Por consiguiente, todas las modificaciones y equivalentes adecuados pueden sen forzados para caer dentro del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones que siguen.
Las palabras "comprenden", "que comprenden", "incluyen", "que incluyen" e "incluye" cuando se usan en esta memoria descriptiva y en las siguientes reivindicaciones están dirigidas a especificar la presencia de etapas, componentes, números enteros o características establecidos pero no excluyen la presencia o adición de uno o más etapas, componentes, números enteros o características o grupos de los mismos.
Ejemplos Ejemplo 1 Purificación en un proceso de una columna, de mirtilo con extracción en agua
Se realizaron tres extracciones de 1 kg de materia prima de mirtilo seco. Una extracción usó 6 litros de agua y las otras dos extracciones usaron cuatro litros de agua. Todas las extracciones fueron acidificadas con ácido sulfúrico a 5 g/l. Hubo aproximadamente una recuperación del 88% de antocianinas en el extracto. Exactamente, se filtraron 2,3 l de extracto crudo a través de un filtro de 30 \mum de polipropileno, con una capa de lana de vidrio sobre el filtro. La lana de vidrio se cambió una vez y el filtro se aclaró con agua desionizada. El volumen final de filtrado fue 2,43 l con una recuperación de antocianinas en el filtrado del 90,9%.
Se envasó una columna con resina SP207 de poliestireno brominado (Supleco; Belefonte, PA) y se llevó al equilibrio con ácido acético al 0,1%. La columna se cargó con 2,24 l del filtrado a una concentración de sólidos de 29,8 g/l y una velocidad de flujo de 2,2 ml/min. El exudado de la carga fue menor de 0,9% con una pérdida total de 4,7% de antocianinas en los primeros dos lavados de columna y en la carga. Hubo una recuperación del 88,4% de antocianinas en la etapa de elución y un balance de masas de antocianinas de 92,5%. Unos pocos cientos de milímetros del producto de elución se evaporaron hasta sequedad en un evaporador rotatorio y a continuación se liofilizaron. El ensayo final fue por determinación espectrométrica estándar de la absorbancia a 535 nm frente un estándar de cloruro de delfinidina (102 unidades de absorbancia/g/l a 1,0 cm) de producto seco. La composición enriquecida contenía 43% en peso de antocianinas totales.
Ejemplo 2 Purificación en un proceso de una columna, de mirtilo con extracción en etanol al 70%
Se extrajo por percolación biomasa de mirtilo seco (667 g), ensayada a 2,0% de antocianinas, usando etanol/agua al 70% conteniendo ácido sulfúrico al 3%. El extracto crudo contenía 3,9% de antocianinas totales. Un litro del primer volumen de extracción fue mezclado con 100 ml de agua desionizada y evaporado en vacío hasta aproximadamente 460 ml. Se añadió agua desionizada (300 ml) a la mezcla y se evaporaron 170 ml adicionales de líquido. Se añadió agua desionizada (210 ml) para hacer 800 ml de volumen final. A la mezcla acuosa se añadieron 150 g de Celite 512 (0,5 a 0,9 gramos de Celite por gramo de sólidos). La mezcla fue batida hasta homogeneidad. La mezcla extracto/Celite se vertió sobre un lecho de 30 g de Celite 512 mojado, en vacío. Después de terminar la filtración, el lecho se lavó con 1,20 l de ácido sulfúrico acuoso al 1% en incrementos de 200 ml. El volumen de filtrado fue 1855 ml. Al filtrado se añadieron 145 ml de agua desionizada para dar un volumen final de 2,0 l. El filtrado se cargó a 2,2 ml/minuto (1,3 ml/cm^{2}/min) en una columna cargada con 170 ml de resina de poliestireno brominado (Supleco). La cantidad cargada fue 695 ml, dando un valor de carga de 17 g de antocianinas por litro de medios de columna. La columna se lavó con un volumen de columna de ácido acético acuoso al 0,1% y con 2,5 volúmenes de columna de 0,1% HOAC/10% etanol/90% agua. Se eluyeron las antocianinas con 10 volúmenes de columna de etanol/agua al 70%. El producto se evaporó en vacío a 60ºC y 50 mbares hasta un sólido amorfo brillante, seco, negro. El ensayo final fue por determinación espectrofotométrica estándar de la absorbancia a 535 nm frente a un estándar de cloruro de delfinidina (102 unidades de absorbancia/g/l a 1,0 cm) del producto seco. El extracto enriquecido se ensayó conteniendo un 32% de pureza de antocianinas totales en peso.
Ejemplo 3 Purificación en dos columnas, de mirtilo
Se molió mirtilo seco (1,0 kg) hasta aproximadamente 2 mm en un molinillo Wiley. La biomasa molida se peso en un matraz de fondo redondo de 10 l. Al matraz se añadieron 4,00 l de etanol/agua al 90%. La mezcla se puso en un evaporador rotatorio, se rotó a 90 rpm a presión atmosférica y se mantuvo a una temperatura de 74ºC durante cuatro horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se filtró a través de papel de Whatman nº 1 y se almacenó. Se mezclaron exactamente 2,0 l del extracto con 150 ml de agua desionizada que contenía 17,1 g de metabisulfito de sodio, se concentraron en un evaporador rotatorio hasta 500 ml, se diluyeron con 750 ml de agua desionizada, se concentraron en un evaporador rotatorio hasta 400 ml, y se diluyeron a un volumen final de 1200 ml con agua desionizada. A la mezcla diluida se añadieron 110 g de Celite 512. La suspensión se mezcló vigorosamente y se filtró a través de un lecho de Celite 512. El pastel del filtro se lavó con 500 ml de agua desionizada.
El extracto filtrado, sulfitado se cargó en una columna de polimetacrilato (CG-71cd Amberchrom; TosoHaas; Montgomery, PA), volumen de columna 60 ml, a una velocidad de 30 ml por minuto. La columna se eluyó con 600 ml de agua desionizada y se limpió con metanol. El eluyente de carga y el eluyente de agua se combinaron para dar el primer producto de columna.
El primer producto de columna se acidificó hasta pH 1 con ácido sulfúrico, se concentró en un evaporador rotatorio para eliminar el dióxido de azufre y se cargó en una columna cargada con 80 ml de resina de poliestireno brominado (Supleco). Se continuó la carga hasta que el exudado de antocianina fue severo. A continuación se lavaron los medios de columna con aproximadamente 400 ml de HOAc acuoso al 0,1% y se eluyeron las antocianinas con 12 volúmenes de columna de metanol. El ensayo final fue por determinación espectrofotométrica estándar de absorbencia a 535 nm frente a un estándar de cloruro de delfinidina (102 unidades de absorbancia/g/l a 1,0 cm). Los sólidos se determinaron por residuo de gravimetría. El extracto enriquecido se ensayó a 41,6% de pureza de antocianinas totales en peso.
Ejemplo 4 Extractos enriquecidos de biomasa de arándano negro
A 940 g de arándano negro molido y seco (Van Drunen FutureCeuticals; Momence, IL) se añadieron 4,0 litros de disolvente de extracción (ácido sulfúrico al 1,0% p/v/etanol acuoso al 70%) en un matraz de fondo redondo de 10 litros. El matraz se rotó en un baño de agua a temperatura constante mantenido a 40ºC durante dos horas. La mezcla se dio vueltas y se filtró en un lecho de 150 g de Celite 512 en vacío. El pastel de biomasa de arándano negro seco se lavó con 500 ml de disolvente de extracción. El pastel se quitó del lecho de Celite raspando cuidadosamente, se vertió en un matraz de fondo redondo y se volvió a extraer siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. A continuación se realizó una tercera extracción. Se conminaron los tres extractos crudos.
Los extractos combinados (2,00 l) se evaporaron en vacío hasta 175 ml a una temperatura externa de 40ºC. El extracto evaporado se diluyó con agua desionizada para dar 675 ml de extracto de arándano negro crudo. El extracto crudo se cargó sin filtración en una columna previamente equilibrada y acondicionada (es decir, lavada con acetona) cargada con 170 l de resina de poliestireno brominado (Supleco). La columna se lavó con ácido acético acuoso al 0,1% y con HOAc acuoso al 0,1%/etanol acuoso al 10%. A continuación se eluyeron las antocianinas con etanol acuoso al 70%. La masa de producto se evaporó en vacío a 50 mbares de presión y 60ºC. El ensayo final fue por determinación espectrofotométrica estándar de absorbencia a 535 nm frente a un estándar de cloruro de delfinidina (102 unidades de absorbancia/g/l a 1,0 cm). El extracto de arándano negro purificado se ensayó a 41,6% de pureza de antocianinas totales en peso y la recuperación total de antocianinas fue del 95%.
Ejemplo 5 Purificación de un extracto enriquecido de arándano negro
En este ejemplo, se pasaron a través de una resina de intercambio aniónico bien débil o fuerte porciones de extracto de arándano negro enriquecido con 18% en peso total de antocianinas, preparadas como se describió en el ejemplo 4, para eliminar los ácidos residuales para incrementar la pureza del extracto enriquecido.
Se disolvieron en 50 ml de agua aproximadamente 1,0 g de extracto de arándano negro enriquecido y se pasaron a través de una columna de 9 l conteniendo bien una resina de intercambio aniónico fuerte (Super Q-650M; TosoHaas; Montgomery, PA) o una resina de intercambio aniónico débil (DEM-63; Whatman). La columna se lavó con 30-35 ml de agua. En el caso de la columna con resina de intercambio aniónico fuerte, la resina se lavó además con 25 ml de etanol al 20% y a continuación con etanol al 40%. La composición aislada de la columna de intercambio aniónico fuerte contenía 28,3% en peso de antocianinas totales y la recuperación fue del 88%. La composición aislada de la columna de intercambio aniónico débil contenía 30,6% en peso total de antocianinas y la recuperación fue del 88%.
Ejemplo 6 Extractos enriquecidos de biomasa de mirtilo usando tratamiento con pectinasa
Se añadieron 548 g de agua templada a 1024 g de mirtilos congelados. La mezcla se vertió en un mezclador y a continuación se calentó a 40ºC. Después de esto, se añadieron 150 \mul de pectinasa (Quest Super 7x) durante un tratamiento de 30 minutos a 40ºC con agitación. Se mezclaron aproximadamente 4 ml de ácido sulfúrico en la suspensión para dar una concentración de ácido del 0,5%. A continuación, la mezcla se calentó a 45ºC y se extrajo durante 15 minutos bajo agitación muy lenta. Se añadieron 160 g de Dicalite a la mezcla de extracto, que fue filtrada a continuación sobre un lecho de Dicalite de 26 g. El pastel se lavó tres veces con 400 ml de ácido sulfúrico acuoso templado al 0,1%. Este extracto se filtró a través de un filtro de presión de 25 \mum. Se cargó en una columna SP-207 (0,96 metros, 170 ml) todo el extracto filtrado (2,4 l). Después de la carga, se lavó la columna con ácido acético acuoso al 0,1% y a continuación se eluyó con etanol acuoso al 70%. El producto de la columna se evaporó hasta sequedad y a continuación se colocó en un liofilizador durante 48 horas. El producto final se ensayó en cuanto a antocianinas totales mediante determinación espectrofotométrica estándar de absorbancia a 535 nm. El extracto de mirtilo purificado se ensayó a 40% de pureza de antocianinas totales en peso y la recuperación total de antocianinas fue del 79%.

Claims (60)

1. Un método para preparar una composición enriquecida con antocianinas, que comprende:
a) proporcionar un extracto crudo de una materia vegetal, en el que dicha materia vegetal contiene antocianinas;
b) filtrar dicho extracto crudo;
c) poner en contacto dicho extracto crudo con una resina de poliestireno brominado, en el que dicha resina adsorbe dichas antocianinas;
d) lavar dicha resina; y
e) eluir dichas antocianinas de dicha resina de poliestireno brominado para obtener una composición enriquecida con antocianinas.
2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha composición comprende al menos un 8% de antocianinas.
3. El método de la reivindicación 2, en el que dicha composición comprende entre aproximadamente un 8-40% de antocianinas.
4. El método de la reivindicación 2, en el que dicha composición comprende aproximadamente un 25% de antocianinas.
5. El método de la reivindicación 1 en el que dicha composición comprende además proantocianinas.
6. El método de la reivindicación 5 en el que dicha composición comprende al menos un 5% de proantocianinas.
7. El método de la reivindicación 1, en el que dicha composición comprende además fenoles totales.
8. El método de la reivindicación 7, en el que dicha composición comprende al menos un 20% de fenoles totales.
9. El método de la reivindicación 1, en el que dicho extracto crudo se prepara por extracción de una materia vegetal fresca o seca con un disolvente de extracción acidificado.
10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho disolvente de extracción acidificado comprende una disolución acuosa que tiene entre aproximadamente un 0-95% de etanol y entre aproximadamente un 0,5-3% de ácido.
11. El método de la reivindicación 10, en el que dicho ácido es ácido sulfúrico o ácido clorhídrico.
12. El método de la reivindicación 9, en el que dicho disolvente de extracción acidificado comprende una disolución acuosa que tiene entre aproximadamente un 0-100% de metanol y entre aproximadamente un 0,5-3% de ácido.
13. El método de la reivindicación 12, en el que dicho ácido es ácido sulfúrico o ácido clorhídrico.
14. El método de la reivindicación 1, en el que dicho filtrado comprende añadir un adyuvante de filtrado a dicho extracto crudo para formar una suspensión y filtrar dicha suspensión en un lecho de dicho adyuvante de filtrado.
15. El método de la reivindicación 14, en el que dicho adyuvante de filtrado es celulosa o tierra diatomácea.
16. El método de la reivindicación 1, en el que dicho filtrado comprende pasar dicho extracto crudo a través de un filtro de bolsa.
17. El método de la reivindicación 1, en el que dicha resina se lava con agua que contiene al menos 0,1% de ácido.
18. El método de la reivindicación 17, en el que dicho ácido es ácido acético.
19. El método de la reivindicación 1, en el que dichas antocianinas se eluyen de dicha resina de poliestireno brominado con etanol/agua al 70:30.
20. El método de la reivindicación 1 en el que dicha materia vegetal se selecciona del grupo que consta de arándanos negros, mirtilos, moras, fresas, grosellas rojas, grosellas negras, arándanos rojos, cerezas, frambuesas, uvas, grosellas, bayas del saúco, flores de hibisco, pimientos, lombarda, maíz morado, y patatas dulces violetas.
21. El método de la reivindicación 20, en el que dicha materia vegetal es mirtilo.
22. El método de la reivindicación 20, en el que dicha materia vegetal es arándano negro.
23. El método de la reivindicación 1, que comprende además pasar dicha composición aislada en la etapa (e) a través de una columna de intercambio iónico.
24. El método de la reivindicación 1, en el que dicha composición se combina además con un excipiente.
25. El método de la reivindicación 24, en el que dicho excipiente se selecciona del grupo que consta de conservantes, vehículos y agentes de tamponación, espesantes, de suspensión, estabilizantes, de humedad, emulsionantes, colorantes y aromatizantes.
26. El método de la reivindicación 1, en el que dicho extracto crudo de la etapa (e) comprende además pectinasa.
27. El método de la reivindicación 26, en el que dicha pectinasa está presente en una cantidad entre aproximadamente 0 y 0,12% en peso de dicha materia vegetal.
28. El método de la reivindicación 1, en el que dicha composición es útil para tratar humanos y mamíferos.
29. Un método para preparar una composición enriquecida con antocianinas, que comprende:
a) proporcionar un extracto crudo de una materia vegetal, en el que dicha materia vegetal contiene antocianinas además de glicósidos flavonoides, esteroles vegetales, ácidos grasos, triglicéridos y otras impurezas que son más polares que dichas antocianinas;
b) filtrar dicho extracto crudo;
c) añadir una fuente de iones bisulfito a dicho extracto crudo, filtrado para formar un extracto sulfitado que comprende aductos antocianina – bisulfito;
d) poner en contacto dicho extracto sulfitado con una primera resina capaz de adsorber dichos glicósidos flavonoides, esteroles vegetales, ácidos grasos, triglicéridos;
e) eluir dichos aductos antocianina-bisulfito de dicha primera resina junto con dichas impurezas más polares para formar un primer producto que contiene dichos aductos antocianina-bisulfito;
f) acidificar dicho primer producto, por lo que dichos aductos antocianina-bisulfito se dividen para proporcionar antocianinas no complejadas;
g) poner en contacto dicha disolución acidificada de la etapa (f) con una resina de poliestireno brominado, en el que dicha resina adsorbe dichas antocianinas no complejadas;
h) lavar dicha resina de poliestireno brominado para eliminar dichas impurezas más polares; e
i) eluir dichas antocianinas de dicha resina de poliestireno brominado para obtener una composición enriquecida con antocianinas.
30. El método de la reivindicación 29, en el que dicha composición comprende al menos un 8% de antocianinas.
31. El método de la reivindicación 30, en el que dicha composición comprende entre aproximadamente un 8-55% de antocianinas.
32. El método de la reivindicación 30, en el que dicha composición comprende aproximadamente un 25% de antocianinas.
33. El método de la reivindicación 29, en el que dicho extracto crudo se prepara por extracción de una materia vegetal seca o fresca con un disolvente de extracción.
34. El método de la reivindicación 29, en el que dicho disolvente de extracción comprende una disolución que contiene aproximadamente un 0-95% de etanol en agua.
35. El método de la reivindicación 29, en el que dicho disolvente de extracción comprende una disolución que contiene aproximadamente un 0-100% de metanol en agua.
36. El método de la reivindicación 29, en el que dicho filtrado comprende añadir un adyuvante de filtrado a dicho extracto crudo para formar una suspensión y filtrar dicha suspensión en un lecho de dicho adyuvante de filtrado.
37. El método de la reivindicación 36, en el que dicho adyuvante de filtrado es celulosa o tierra diatomácea.
38. El método de la reivindicación 29, en el que dicha fuente de iones bisulfito es metabisulfito de sodio, bisulfito de sodio o ácido sulfuroso.
39. El método de la reivindicación 29, en el que dicha primera resina es una resina de fase inversa.
40. El método de la reivindicación 39, en el que dicha resina de fase inversa se selecciona del grupo que consta de polimetacrilato, estireno, divinilbenceno, trivinilbenceno, alquilvinilbenceno, acrilvinilbenceno y metacrilato de metilo.
41. El método de la reivindicación 29, en el que dichos aductos de antocianina-bisulfito se eluyen de la primera resina con agua.
42. El método de la reivindicación 29, en el que dicho primer producto se acidifica en la etapa (f) hasta pH 1,0-1,25.
43. El método de la reivindicación 29, en el que dichas antocianinas se eluyen de dicha resina de poliestireno brominado con etanol/agua al 70:30.
44. El método de la reivindicación 29, en el que dicha materia vegetal se selecciona del grupo que consta de arándanos negros, mirtilos, moras, fresas, grosellas rojas, grosellas negras, arándanos rojos, cerezas, frambuesas, uvas, grosellas, bayas del saúco, flores de hibisco, pimientos, lombarda, maíz morado, y patatas dulces violetas.
45. El método de la reivindicación 44, en el que dicha materia vegetal es mirtilo.
46. El método de la reivindicación 44, en el que dicha materia vegetal es arándano negro.
47. El método de la reivindicación 29, que comprende además pasar dicha composición aislada en la etapa (i) a través de una columna de intercambio aniónico.
48. El método de la reivindicación 29, que comprende además combinar la composición con un excipiente.
49. El método de la reivindicación 48, en el que dicho excipiente se selecciona del grupo que consta de conservantes, vehículos y agentes de tamponación, espesantes, de suspensión, estabilizantes, de humedad, emulsionantes, colorantes y aromatizantes.
50. El método de la reivindicación 29, en el que dicho extracto crudo de la etapa (a) comprende además pectinasa.
51. El método de la reivindicación 50, en el que dicha pectinasa está presente en una cantidad entre aproximadamente 0 y 0,12% en peso de dicha materia vegetal.
52. El método de la reivindicación 29, en el que dicha composición es útil para tratar humanos y mamíferos.
53. Un extracto de arándano negro purificado enriquecido con antocianinas y preparado según el método de la reivindicación 1.
54. El extracto de arándano negro de la reivindicación 53, en el que dicho extracto comprende entre aproximadamente un 8-35% en peso de antocianinas de dicho extracto.
55. Un extracto de mirtilo purificado enriquecido con antocianinas y preparado según el método de la reivindicación 1.
56. El extracto de mirtilo de la reivindicación 55, en el que dicho extracto comprende aproximadamente un 8-50% en peso de antocianinas de dicho extracto.
57. Un extracto de mirtilo preparado según el método de la reivindicación 1, comprendiendo dicho extracto 3,3% de delfinidina-3-O-galactósido, 3,9% de delfinidina-3-O-glucósido, 2,1% de cianidina-3-O-galactósido, 2,6% de delfinidina-3-O-arabinósido, 2,8% de cianidina-3-O-glucósido, 1,0% de petunidina-3-O-galactósido, 2,5% de petunidina-3-O-glucósido, 1,7% de cianidina-3-O-arabinósido, 0,3% de peonidina-3-O-galactósido, 0,8% de petunidina-3-O-arabinósido, 2,1% de malvidina-3-O-galactósido/peonidina-3-O-glucósido, 2,5% de malvidina-3-O-glucósido, 0,1% de peonidina-3-O-arabinósido y 0,6% de malvidina-3-O-arabinósido.
58. Una composición que comprende el extracto de arándano negro de la reivindicación 53 ó 54, o el extracto de mirtilo de la reivindicación 55 ó 56, que comprende además un excipiente.
59. La composición de la reivindicación 58, en la que dicho excipiente se selecciona del grupo que consta de conservantes, vehículos y agentes de tamponación, espesantes, de suspensión, estabilizantes, de humedad, emulsionantes, colorantes y aromatizantes.
60. Uso del extracto purificado de cualquiera de las reivindicaciones 53 a 56 para preparar un medicamento para mejorar la agudeza visual, para tratar desórdenes circulatorios, diabetes, úlceras o para tratar desórdenes inflamatorios, antivíricos o antimicrobianos.
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