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ES2264929T3 - Acidos nucleicos y polipeptidos del factor 19 de crecimiento fibroblastico (fgf-19) y procedimientos de utilizacion para el tratamiento de la obesidad. - Google Patents

Acidos nucleicos y polipeptidos del factor 19 de crecimiento fibroblastico (fgf-19) y procedimientos de utilizacion para el tratamiento de la obesidad. Download PDF

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ES2264929T3
ES2264929T3 ES00917878T ES00917878T ES2264929T3 ES 2264929 T3 ES2264929 T3 ES 2264929T3 ES 00917878 T ES00917878 T ES 00917878T ES 00917878 T ES00917878 T ES 00917878T ES 2264929 T3 ES2264929 T3 ES 2264929T3
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ES
Spain
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fgf
polypeptide
sequence
amino acid
acid sequence
Prior art date
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ES00917878T
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English (en)
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Timothy A. Stewart
Elizabeth Tomlinson
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Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
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Publication date
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Priority claimed from PCT/US1999/030999 external-priority patent/WO2001005836A1/en
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Abstract

Utilización de un polipéptido FGF-19, o de un ácido nucleico codificante de un polipéptido FGF-19, en la preparación de un medicamento, en el que el medicamento está destinado para: (a) el tratamiento de la obesidad o de una condición relacionada con la obesidad, o (b) reducir la masa corporal total de un individuo y/o reducir el nivel de grasa de un individuo, o (c) reducir el nivel de por lo menos uno de entre triglicéridos y ácidos grasos libres de un individuo, o (d) incrementar la tasa metabólica de un individuo, o (e) inducir la liberación de leptina de las células adiposas, o (f) inducir una reducción de la incorporación de glucosa en las células adiposas, en la que el polipéptido FGF-19:(i) comprende la secuencia de residuos aminoácidos entre 1 o X o 23 ñ 5 a 216 de la fig. 2 (SEC ID nº 2), o un fragmento biológicamente activo de la secuencia de aminoácidos de la fig. 2 (SEC ID nº 2), o (ii) comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de proteína humano depositadabajo el nº de acceso ATCC 209480, o (iii) consiste en la secuencia de aminoácidos de la fig. 2 (SEC ID nº 2) sin la secuencia N-terminal de señal y/o sinla metionina de iniciación, o (iv) presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos el 80% con la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 o X o 23 ñ 5 a 216 de la secuencia de aminoácidos de la fig. 2 (SEC ID nº 2) o con un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la fig. 2 (SEC ID nº 2) y es biológicamente activa; (v) presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos el 80% con la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de proteína humana depositada bajo el nº de acceso ATCC 209480, y es biológicamente activa, y en el que X es entre 17 y 27, y la actividad biológica es una o más de entre: (1) incrementar el metabolismo o la tasa metabólica de un individuo; (2) reducir el peso corporal de un individuo; (3) reducir la adiposidad de un individuo; (4) reducir la incorporación de glucosa por losadipocitos; (5) incrementar la liberación de leptina por los adipocitos; (6) reducir el nivel de triglicéridos de un individuo; y (7) reducir el nivel de ácidos grasos libres de un individuo.

Description

Ácidos nucleicos y polipéptidos del factor 19 de crecimiento fibroblástico (FGF-19) y procedimiento de utilización para el tratamiento de la obesidad.
Campo de la invención
La presente invención se refiere de manera general a la identificación y al aislamiento del ADN y a la producción recombinante de nuevos polipéptidos denominados en la presente memoria polipéptidos factor 19 del crecimiento fibroblástico (FGF-19), y a procedimientos, composiciones y ensayos que utilizan estos polipéptidos para el tratamiento terapéutico de la obesidad y para producir materiales farmacéuticamente activos con propiedades terapéuticas y farmacológicas, incluyendo aquéllas asociadas al tratamiento de la obesidad.
Antecedentes de la invención
La obesidad es una enfermedad crónica altamente prevalente en la sociedad moderna que lleva asociado no sólo un estigma social, sino que también comporta una menor duración de la vida y numerosos problemas médicos, incluyendo un desarrollo psicológico adverso, trastornos reproductivos, tales como la enfermedad ovárica poliquística, trastornos dermatológicos, tales como infecciones, venas varicosas, acantosis nigricans, y eccema, intolerancia al ejercicio, diabetes mellitus, resistencia a la insulina, hipertensión, hipercolesterolemia, colelitiasis, osteoartritis, lesión ortopédica, enfermedad tromboembólica, cáncer, y enfermedad cardíaca coronaria (Rissanen et al., British Medical Journal 301:835-837, 1990).
Entre las terapias existentes para la obesidad se incluyen dietas estándar y ejercicio, dietas de muy pocas calorías, terapia del comportamiento, farmacoterapia que incluye supresores del apetito, fármacos termogénicos, inhibidores de la absorción de los alimentos, dispositivos mecánicos, tales como el alambrado de mandíbula, cordones de cintura y balones, y la cirugía (Jung y Chong, Clinical Endocrinology 35:11-20, 1991; Bray, Am. J. Clin. Nutr. 55:538S-544S, 1992). Se ha informado de que el ayuno modificado en el que se conservan las proteínas resulta efectivo para reducir el peso en adolescentes (Lee et al., Clin. Pediatr. 31:234-236, abril de 1992). La restricción calórica como tratamiento para la obesidad causa el catabolismo de las reservas corporales de proteínas y produce un equilibrio negativo del nitrógeno. Las dietas suplementadas en proteínas, por lo tanto, han ganado popularidad como medios para reducir la pérdida de nitrógeno durante la restricción calórica. Debido a que estas dietas producen sólo una conservación modesta del nitrógeno, resulta necesaria una manera más efectiva de conservar una masa corporal magra y las reservas de proteínas. Además, el tratamiento de la obesidad mejoraría si este régimen también resultase en una pérdida acelerada de la grasa corporal. Entre los diversos enfoques de este tratamiento se incluyen aquellos comentados por Weintraub y Bray, Med. Clinics N. Amer. 73:237, 1989; Bray, Nutrition Reviews 49:33, 1991.
Considerando la elevada prevalencia de la obesidad en nuestra sociedad y las graves consecuencias asociadas con la misma, tal como se ha comentado anteriormente, cualquier fármaco terapéutico potencialmente útil para la reducción del peso de las personas obesas podría presentar un profundo efecto beneficioso sobre su salud. Existe una necesidad en la técnica de un fármaco que reduzca el peso corporal total de los sujetos obesos aproximándolo a su peso corporal ideal sin que provoque efectos secundarios adversos significativos y que ayude al sujeto obeso a mantener el nivel de peso reducido.
Por lo tanto, resulta deseable proporcionar un régimen de tratamiento que resulta útil para devolver el peso corporal de los sujetos obesos a un peso corporal ideal normal.
También resulta deseable proporcionar una terapia para la obesidad que resulte en el mantenimiento del peso corporal reducido a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.
Además, resulta deseable prevenir la obesidad y, tras iniciar el tratamiento, detener la progresión o prevenir la aparición de enfermedades que son la consecuencia o que son secundarias a la obesidad, tales como la arterioesclerosis y la enfermedad ovárica poliquística.
Estos procedimientos de tratamiento y las composiciones relacionadas se proporcionan en la presente invención. También se dan a conocer en la presente invención proteínas y ácidos nucleicos, y procedimientos de cribado para encontrar moduladores de los mismos. Otros procedimientos, tratamientos y composiciones proporcionadas en la presente invención resultarán evidentes para el experto en la materia.
Sumario de la invención
Se ha identificado un clon de ADNc (denominado en la presente memoria DNA49435-1219) que codifica un polipéptido que presenta cierta similitud de secuencia con elementos de la familia del factor de crecimiento fibroblástico, denominado en la presente solicitud "factor 19 de crecimiento fibroblástico" (FGF-19).
La invención da a conocer la utilización de FGF-19 y de ácidos nucleicos que codifican FGF-19 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de diversas condiciones, según se define en las reivindicaciones.
La molécula aislada de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de por lo menos aproximadamente el 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 98% y alternativamente de por lo menos aproximadamente el 99% con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido FGF-19 con la secuencia de residuos aminoácidos de 1 o X o 23 \pm 5 a 216, inclusive, de la figura 2 (SEC ID nº 2), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), en la que X abarca de 17 a 27.
La molécula aislada de ácidos nucleicos puede comprender (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido FGF-19 con la secuencia de residuos aminoácidos de 1 o X o 23 \pm 5 a 216, inclusive, de la figura 2 (SEC ID nº 2), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a), en la que X abarca de 17 a 27.
La molécula aislada de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente el 80%, alternativamente de aproximadamente el 81%, alternativamente de aproximadamente el 82%, alternativamente de aproximadamente el 83%, alternativamente de aproximadamente el 84%, alternativamente de aproximadamente el 85%, alternativamente de aproximadamente el 86%, alternativamente de aproximadamente el 87%, alternativamente de aproximadamente el 88%, alternativamente de aproximadamente el 89%, alternativamente de aproximadamente el 90%, alternativamente de aproximadamente el 91%, alternativamente de aproximadamente el 92%, alternativamente de aproximadamente el 93%, alternativamente de aproximadamente el 94%, alternativamente de aproximadamente el 95%, alternativamente de aproximadamente el 96%, alternativamente de aproximadamente el 97%, alternativamente de aproximadamente el 98% y alternativamente de aproximadamente el 99% con (a) una molécula de ADN con la secuencia de nucleótidos comprendida entre aproximadamente los nucleótidos nº 464 o aproximadamente nº 530 y aproximadamente nº 1.111, inclusive, de la figura 1 (SEC ID nº 1), o (b) el complemento e la molécula de ADN de (a).
La molécula aislada de ácidos nucleicos puede comprender (a) la secuencia de nucleótidos comprendida entre aproximadamente los nucleótidos nº 464 o aproximadamente nº 530 y aproximadamente nº 1.111, inclusive, de la figura 1 (SEC ID nº 1), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a).
La molécula aislada de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente el 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 98% y alternativamente de por lo menos aproximadamente el 99% con (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de proteína humana depositado en la ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el nº de depósito ATCC 209480 (DNA49435-1219), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a). En una realización preferente, la molécula aislada de ácidos nucleicos comprende (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de proteína humana depositado en la ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el nº de depósito ATCC 209480 (DNA49435-1219), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a).
La molécula aislada de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente el 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 98% y alternativamente de por lo menos aproximadamente el 99% con (a) la secuencia codificante del polipéptido de longitud completa del ADNc de proteína humana depositado en la ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el nº de depósito ATCC 209480 (DNA49435-1219), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a). En una realización preferente, la molécula aislada de ácidos nucleicos comprende (a) la secuencia codificante del polipéptido de longitud completa del ADN depositado en la ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el nº de depósito ATCC 209480 (DNA49435-1219), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a).
La molécula aislada de ácidos nucleicos que codifica un polipéptidos FGF-19 activo tal como se define posteriormente puede comprender una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos 1 o X o 23 \pm 5 a 216, inclusive, de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X abarca de 17 a 27. Preferentemente, la hibridación se produce bajo condiciones astringentes de hibridación y de lavado.
La molécula aislada de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido FGF-19 activo tal como se define posteriormente puede comprender una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento de la secuencia de ácidos nucleicos entre aproximadamente los nucleótidos nº 464 o aproximadamente nº 530 y aproximadamente nº 1.111, inclusive, de la figura 1 (SEC ID nº 1). Preferentemente, la hibridación se produce bajo condiciones astringentes de hibridación y de lavado.
La molécula aislada de ácidos nucleicos puede comprender: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con un resultado de por lo menos aproximadamente el 80% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 98% y alternativamente de por lo menos aproximadamente el 99%, en comparación con la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 o X o 23 \pm 5 a 216, inclusive, de la figura 2 (SEC ID nº 2), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a), en el que X abarca entre 17 y 27.
La molécula aislada de ácidos nucleicos puede comprender ADN que codifica un polipéptido FGF-19 sin la secuencia N-terminal de señal y/o sin la metionina de iniciación, o puede ser complementaria a esta molécula de ácidos nucleicos codificante. El péptido de señal se ha identificado tentativamente que se extiende entre aproximadamente la posición aminoácida nº 1 y aproximadamente la posición aminoácida nº 22, inclusive, en la secuencia de la figura 2 (SEC ID nº 2). Sin embargo se indica que el límite C-terminal del péptido de señal puede variar, pero muy probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada lado del límite C-terminal del péptido de señal tal como se identifica inicialmente en la presente memoria, en el que el límite C-terminal del péptido de señal puede identificarse siguiendo los criterios utilizados rutinariamente en la técnica para identificar este tipo de elemento de secuencia de aminoácidos (por ejemplo Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6, 1997, y von Heinje et al., Nucl. Acids Res. 14:4683-4690, 1986). Además, también se reconoce que, en algunos casos, el corte de una secuencia de señal de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, resultando en la secreción de más de una especie. La utilización de estos polipéptidos, y de los polinucleótidos que los codifican, está contemplada por la presente invención. Como tal, para los fines de la presente solicitud, el péptido de señal del polipéptido FGF-19 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2) se extiende entre los aminoácidos 1 y X de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es cualquier aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27 de la figura 2 (SEC ID nº 2). Por lo tanto, las formas maduras del polipéptido FGF-19 de los que hace uso la presente invención incluyen aquéllas que comprenden los aminoácidos X a 216 de la figura (SEC ID nº 2), en la que X es cualquier aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27 de la figura 2 (SEC ID nº 2) y las variantes de los mismos tal como se describe posteriormente. Las moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos también se encuentran contempladas.
También se da a conocer en la presente invención un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica FGF-19 o sus variantes. El vector puede comprender cualquiera de las moléculas aisladas de ácidos nucleicos identificadas anteriormente en la presente memoria.
También se da a conocer una célula huésped que comprende dicho vector. A título de ejemplo, las células huésped puede ser células CHO, E. coli, células de insecto infectadas por baculovirus, o levaduras. Se da a conocer adicionalmente un procedimiento para producir polipéptidos FGF-19 y comprende cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión de FGF-19 y recuperar FGF-19 del cultivo celular.
El polipéptido FGF-19 puede ser el polipéptido FGF-19 de secuencia nativa, que en determinadas realizaciones, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos de 1 o X o 23 \pm 5 a 216 de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es un aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27.
El polipéptido FGF-19 puede ser un polipéptido FGF-19 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente el 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 98% y alternativamente de por lo menos aproximadamente el 99%, con la secuencia de residuos aminoácidos entre 1 o X o 23 \pm 5 y 216, inclusive, de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es un aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27.
El polipéptido FGF-19 puede ser un polipéptido FGF-19 aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente el 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 98% y alternativamente de por lo menos aproximadamente el 99%, con una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de proteína humana depositada en la ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el nº de depósito ATCC 209480 (DNA49435-1219). En una realización preferente, el polipéptido FGF-19 aislado comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de proteína humana depositado en la ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el nº de depósito ATCC 209480 (DNA49435-1219).
El polipéptido FGF-19 puede ser un polipéptido FGF-19 aislado que comprende una secuencia de aminoácidos con una puntuación de por lo menos aproximadamente el 80% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 81% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 82% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 83% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 84% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 85% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 86% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 87% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 88% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 89% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 90% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 91% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 92% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 93% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 94% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 95% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 96% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 97% de positivos, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 98% de positivos y alternativamente de por lo menos aproximadamente el 99% de positivos en comparación con la secuencia de aminoácidos de residuos entre 1 o X o 23 \pm 5 y 216, inclusive, de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es un aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27.
El polipéptido FGF-19 puede ser un polipéptido FGF-19 aislado sin la secuencia N-terminal de señal y/o la metionina de iniciación y se encuentra codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos tal como la indicada anteriormente en la presente memoria. Los procedimientos para producir el mismo también se describen en la presente invención, en la que aquellos procedimientos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos codificante apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido FGF-19 y recuperar el polipéptido FGF-19 del cultivo celular.
El polipéptido FGF-19 puede ser un polipéptido FGF-19 aislado, comprendiendo la secuencia de residuos aminoácidos entre 1 o X o 23 \pm 5 y 216, inclusive, de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es un aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27, o un fragmento del mismo según las reivindicaciones, que es biológicamente activo, en el que la identificación de los fragmentos de polipéptido FGF-19 que poseen actividad biológica puede conseguirse de una manera rutinaria utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Preferentemente, el fragmento FGF-19 conserva una actividad biológica cualitativa de un polipéptido FGF-19 nativo, incluyendo la capacidad de tratar terapéuticamente la obesidad.
El polipéptido FGF-19 puede ser un polipéptido producido mediante (i) hibridación de una molécula de ensayo de ADN bajo condiciones astringentes con (a) una molécula de ADN codificante de un polipéptido FGF-19 con la secuencia de residuos aminoácidos de 1 o X o 23 \pm 5 a 216, inclusive, de la figura 2 (SEC ID nº 2), en la que X es un aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), y si la molécula de ADN de ensayo presenta una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente el 80%, preferentemente una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente el 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 98% y alternativamente de por lo menos aproximadamente el 99% con (a) o (b), (ii) cultivar una célula huésped que comprende la molécula de ADN de ensayo bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, e (iii) recuperar el polipéptido del cultivo celular.
En una realización, se proporciona un procedimiento, según las reivindicaciones, para el cribado para un agente bioactivo capaz de unirse a FGF-19. En un aspecto, el procedimiento comprende añadir un agente bioactivo candidato a una muestra de FGF-19 y determinar la unión de dicho agente candidato a dicho FGF-19, en el que la unión indica un agente bioactivo capaz de unirse a FGF-19.
En la presente invención se proporciona adicionalmente un procedimiento, según las reivindicaciones, para el cribado para un agente bioactivo capaz de modular la actividad de FGF-19. En una realización, se proporciona un procedimiento que comprende las etapas de añadir un agente bioactivo candidato a una muestra de FGF-19 y determinar una alteración en la actividad biológica de FGF-19, en el que una alteración indica un agente bioactivo capaz de modular la actividad de FGF-19. En una realización, la actividad de FGF-19 es la reducción de la incorporación de glucosa en las células. En otra realización, la actividad de FGF-19 es el incremento de la liberación de leptina de las células. En una realización preferente, la actividad de FGF-19 es la incorporación reducida de glucosa y la liberación incrementada de leptina de las células. Preferentemente las células son adipocitos. En todavía otra realización, la actividad de FGF-19 es el incremento de la oxidación de los lípidos y de los carbohidratos. Preferentemente las células son células hepáticas o musculares.
En un aspecto adicional de la invención, según las reivindicaciones, se proporciona un procedimiento para inducir la liberación de leptina de las células, preferentemente adipocitos. En una realización, el procedimiento comprende administrar FGF-19 a las células en una cantidad eficaz para inducir la liberación de leptina.
En los procedimientos que se proporcionan en la presente invención, FGF-19 puede administrarse como ácido nucleico que expresa FGF-19 o en forma de proteína. Tal como se describe adicionalmente después, FGF-19 puede administrarse mediante infusión o en una formulación de liberación sostenida.
También se proporciona en la presente invención un procedimiento, según las reivindicaciones, para inducir una reducción de la incorporación de glucosa en las células, preferentemente las células adipocitas. En una realización el procedimiento comprende administrar FGF-19 a las células en una cantidad eficaz para inducir una reducción de la incorporación de glucosa.
En todavía otro aspecto de la invención, según las reivindicaciones, la utilización de FGF-19 y de los ácidos nucleicos es en la preparación de un medicamento para la utilización en un procedimiento de tratamiento de un individuo para la obesidad, o condiciones relacionados con la obesidad, tales como las enfermedades cardiovasculares.
Asimismo según las reivindicaciones, la utilización de FGF-19 y de los ácidos nucleicos es en la preparación de un medicamento para la utilización en la reducción de la masa corporal total en un individuo, en una realización preferente, se reduce la adiposidad (grasa) en un individuo.
Además, según las reivindicaciones, la utilización de FGF-19 y de ácidos nucleicos es en la preparación de un medicamento para la utilización en la reducción del nivel de por lo menos uno de entre triglicéridos y ácidos grasos libres en un individuo, o en el incremento de la tasa metabólica en un individuo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 1) de un ADNc que contiene una secuencia de nucleótidos (nucleótidos 464-1.111) que codifican el FGF-19 de secuencia nativa, en la que la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 1) es un clon denominado en la presente memoria "DNA49435-1219". Asimismo, presentadas en fuente negrita y subrayadas se encuentran las posiciones de los codones respectivos de inicio y de parada.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 2) de un polipéptido FGF-19 de secuencia nativa tal como se deriva de la secuencia codificante de SEC ID nº 1. También se muestran las localizaciones aproximadas de una diversidad de otros dominios importantes de polipéptido.
Las figuras 3A y 3B muestran gráficos de columnas que demuestran que los ratones transgénicos MLC-FGF-19 pesan menos que sus compañeros de camada transgénicos (figura 3A) y presentan niveles circulantes de leptina más bajos (figura 3B). La figura 3A muestra el peso de ratones transgénicos para FGF-19 (columnas blancas) y compañeros de camada no transgénicos (de tipo salvaje) (columna punteada) a las 6 semanas de edad durante la alimentación ad libitum (extremo izquierdo) y tras 6 y 24 horas de ayuno, y 24 horas después de finalizar un ayuno de 24 horas (extremo derecho).
La figura 3B muestra los sueros de los mismos grupos de ratones representados en la figura 3A en un ensayo para la leptina (columna vertical).
Las figuras 4A-4D son gráficos de columnas que demuestran que los ratones transgénicos para FGF-19 manifiestan una ingesta de alimentos y producción de orina incrementados pero presentan un hematocrito normal. Se realizó un seguimiento de un grupo de ratones para la ingesta de alimentos durante la alimentación ad libitum y 24 horas después de finalizar el ayuno de 24 horas (figura 4A), para la ingesta de agua (figura 4B), para la producción de orina (figura 4C) y para el hematocrito (figura 4D), en las que los resultados para los ratones transgénicos para FGF-19 en cada gráfico se muestran en las columnas de color negro y los resultados para los ratones de tipo salvaje se muestran en las columnas punteadas.
La figura 5 es un gráfico de barras que demuestra que los ratones transgénicos para FGF-19 presentan una tasa incrementada de consumo de oxígeno. El consumo de oxígeno se muestra para los ratones transgénicos para FGF-19 (columnas de color negro) y para los ratones de tipo salvaje (columnas punteadas) durante ambos ciclos diurnos (oscuridad y luz), tras un ayuno de 24 horas y 24 horas después de finalizar un ayuno de 24 horas.
Las figuras 6A y 6B son gráficos de columnas que demuestran que los ratones transgénicos para FGF-19 (columnas de color negro) presentan un nivel reducido de triglicéridos (figura 6A) y de ácidos grasos libres (figura 6B) en comparación con los ratones de tipo salvaje (columnas punteadas).
Las figuras 7A y 7B son gráficos de columnas que demuestran que la infusión de ratones no transgénicos con FGF-19 (columnas de color negro) conduce a un incremento de la ingesta de alimentos (figura 7A) y a un incremento del consumo de oxígeno (figura 7B) en comparación con los ratones infusionados con vehículo sin FGF-19 (columnas punteadas), en la que "n" se refiere a "noche" y "d" se refiere a día.
Las figuras 8A y 8B son gráficos de columnas que indican que FGF-19 incrementa la liberación de leptina de los adipocitos (figura 8A) y reduce la incorporación de glucosa por los adipocitos (figura 8B).
La figura 9 es un gráfico de barras que muestra el peso de la almohadilla grasa de ratones transgénicos para FGF-19 (columnas rayada) o de tipo salvaje (columnas de color negro), ambos tipos bajo dietas altas en grasas (HFD), en el que a lo largo del eje horizontal, de izquierda a derecha, se muestran los resultados a las 6 semanas para la dieta alta en grasas en tejido epididimal (HFD Ep), para la retroperitoneal y perirenal (HFD RP/PR), a las 10 semanas para la epididimal, y para la retroperitoneal y perirenal.
La figura 10 es un gráfico de barras que muestra la tolerancia a la glucosa de ratones transgénicos para FGF-19 (barras rayadas) o de tipo salvaje (barras de color negro) a lo largo del tiempo (ambos tipos bajo dietas altas en grasas durante diez semanas).
Descripción detallada de las realizaciones preferentes I. Definiciones
Las expresiones "polipéptido FGF-19", "proteína FGF-19" y "FGF-19" en su uso en la presente memoria abarcan el FGF-19 de secuencia nativa y las variantes polipeptídicas de FGF-19 (que se definen adicionalmente en la presente memoria). El polipéptido FGF-19 puede aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tales como los tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o de síntesis.
Una "FGF-19 de secuencia nativa" comprende un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos que una FGF-19 derivada de la naturaleza. Esta FGF-19 de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse mediante medios recombinantes y/o sintéticos. La expresión "FGF-19 de secuencia nativa" abarca específicamente las formas truncadas o secretadas de origen natural (por ejemplo una secuencia de dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo formas alternativamente cortadas) y variantes alélicas naturales de FGF-19. En una realización de la invención, el FGF-19 de secuencia nativa es una FGF-19 de secuencia nativa madura o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 216 de la figura 2 (SEC ID nº 2). Además, aunque el polipéptido FGF-19 dado a conocer en la figura 2 (SEC ID nº 2) se demuestra que se inicia con el residuo metionina designado en la presente invención como aminoácido en la posición nº 1, resulta concebible y posible utilizar como residuo aminoácido de iniciación para el polipéptido FGF-19 otro residuo metionina situado más arriba o más abajo del aminoácido en posición nº 1 en la figura 2 (SEC ID nº 2).
La expresión "polipéptido FGF-19 variante" se refiere a un polipéptido FGF-19 activo tal como se define después con una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente el 80% con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 o 23 \pm 5 a 216 del polipéptido FGF-19 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), (b) X a 216 del polipéptido FGF-19 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), en el que X es cualquier residuo aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27 en la figura 2 (SEC ID nº 2), o (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2). Estos polipéptidos FGF-19 variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos FGF-19 en los que se añaden uno o más residuos aminoácidos, o se delecionan, en el extremo N-terminal y/o C-terminal, así como dentro de uno o más dominios internos, de la secuencia de la figura 2 (SEC ID nº 2). Habitualmente, un polipéptido FGF-19 variante presentará una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente el 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 98% y alternativamente de por lo menos aproximadamente el 99% con (a) los residuos 1 o 23 \pm 5 a 216 del polipéptido FGF-19 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), (b) X a 216 del polipéptido FGF-19 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), en el que X es cualquier residuo aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27 de la figura 2 (SEC ID nº 2), o (c) otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2). Los polipéptidos FGF-19 variantes no abarcan la secuencia nativa de polipéptidos de FGF-19. Habitualmente, los polipéptidos FGF-19 variantes presentan una longitud de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos, alternativamente de por lo menos 40 aminoácidos, alternativamente de por lo menos 40 aminoácidos, alternativamente de por lo menos 50 aminoácidos, alternativamente de por lo menos 60 aminoácidos, alternativamente de por lo menos 70 aminoácidos, alternativamente de por lo menos 80 aminoácidos, alternativamente de por lo menos 90 aminoácidos, alternativamente de por lo menos 100 aminoácidos, alternativamente de por lo menos 150 aminoácidos, alternativamente de por lo menos 200 aminoácidos, o más.
La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del polipéptido FGF-19 identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en una secuencia de FGF-19 tras alinear las secuencias e introducir los huecos, en caso necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas manteras que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo utilizando software informático disponible para el público, tal como los programas informáticos BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la máxima alineación a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los fines de la presente invención, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se obtienen tal como se describe posteriormente mediante la utilización del programa informático de comparación de secuencias llamado ALIGN-2, del que el código fuente completo del programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 posteriormente. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 ha sido creado por Genentech, Inc., y el código fuente se mostrado en la Tabla 1 ha sido presentado junto con la documentación para el usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde se encuentra registrado bajo el nº de registro de U.S. Copyright TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible para el público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debe compilarse para la utilización en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no son variables.
Para los fines de la presente invención, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, con, o contra, una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o que comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a, con, o contra, una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la manera siguiente:
100 multiplicado por la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoácidos puntuados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de este programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A o es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A. A título de ejemplos del cálculo de % de identidad de secuencias de aminoácidos, las Tablas 2 y 3 muestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos denominada "proteína de comparación" respecto a la secuencia de aminoácidos denominada "PRO".
A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente invención se obtienen tal como se ha descrito anteriormente utilizando el programa informativo ALIGN-2 de comparación de secuencias. Sin embargo, el % de identidad de secuencia de aminoácidos también puede determinarse utilizando el programa NCBI-BLAST2 de comparación de secuencias (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997). El programa NCBI-BLAST2 de comparación de secuencias puede descargarse de http://www.ncbi.nlm.nih.gov, u obtenerse, de otra manera, del National Institutes of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en el que todos los parámetros de búsqueda se fija en valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 y scoring matrix = BLOSUM62.
En las situaciones en las que se utiliza NCBI-BLAST2 para las comparaciones entre secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, con, o contra, una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o que comprende un % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a, con, o contra, una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la manera siguiente:
100 multiplicado por la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoácidos puntuado como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias llamado NCBI-BLAST2 en la alineación de este programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A.
La expresión "polinucleótido FGF-19 variante" o "secuencia de ácidos nucleicos de FGF-19 variante" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido FGF-19 activo tal como se define posteriormente y que presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente el 80% respecto a (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los residuos 1 o 23 \pm 5 a 216 del polipéptido FGF-19 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos X a 216 del polipéptido FGF-19 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), en el que X es cualquier residuo aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27 de la figura 2 (SEC ID nº 2), o (c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2). Habitualmente, un polinucleótido FGF-19 variante presentará una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente el 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente el 98% y alternativamente de por lo menos aproximadamente el 99% con (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los residuos 1 ó 23 \pm 5 a 216 del polipéptido FGF-19 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos X a 216 del polipéptido FGF-19 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2), en el que X es cualquier residuo aminoácido entre los aminoácidos 17 y 27 de la figura 2 (SEC ID nº 2), o (c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2). Las variantes del polinucleótido FGF-19 no abarcan la secuencia de nucleótidos nativa de FGF-19.
Habitualmente, los polinucleótidos variantes de FGF-19 presentan una longitud de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 60 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 180 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 210 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 240 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 270 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 300 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 450 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 600 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 900 nucleótidos, o más.
La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido FGF-19 identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido FGF-19 tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencias. La alineación con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede conseguirse de diversas maneras que se encuentran dentro de los conocimientos del experto en la materia, por ejemplo utilizando software informático disponible para el público, tal como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de la secuencias que se comparan. Para los fines de la presente invención, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se obtienen tal como se describe posteriormente mediante la utilización del programa informático ALIGN-2 de comparación de secuencias, del que el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 posteriormente. El programa informático ALIGN-2 de comparación de secuencias fue creado por Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 1 se ha presentado junto con la documentación para el usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, donde se ha registrado bajo el nº de registro U.S. Copyright TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible para el público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debe compilarse para la utilización en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no son variables.
Para los fines de la presente invención, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos dada C respecto a, con, o contra, una secuencia de ácidos nucleicos dada D (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de ácidos nucleicos dada C que presenta o que comprende un determinado % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos respecto a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos dada D) se calcula de la manera siguiente:
100 multiplicado por la fracción W/Z
donde W es el número de nucleótidos puntuado como correspondencias idénticas por el programa ALIGN-2 de alineación de secuencias en la alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que, donde la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleico de C respecto a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D respecto a C. Como ejemplos de los cálculos de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, las Tablas 4 y 5 muestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos denominada "ADN de comparación" respecto a la secuencia de ácidos nucleicos denominada "PRO-ADN".
A menos que se indique específicamente lo contrario, la totalidad de los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos utilizados en la presente invención se obtienen tal como se ha descrito anteriormente utilizando el programa informático ALIGN-2 de comparación de secuencias. Sin embargo, el % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos también puede determinarse utilizando el programa NCBI-BLAST2 de comparación de secuencias (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997). El programa NCBI-BLAST2 de comparación de secuencias puede descargarse de http://www.ncbi.nim.nih.gov u obtenerse de otra manera del National Institutes of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en los que la totalidad de dichos parámetros de búsqueda se fijan en valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 y scoring matrix = BLOSUM62.
En la situaciones en las que se utiliza NCBI-BLAST2 para las comparaciones de secuencias, el % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos dada C respecto a, con, o contra, una secuencia de ácidos nucleicos dada D (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de ácidos nucleicos dada C que presenta o que comprende un determinado % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos respecto a, con, o contra, una secuencia de ácidos nucleicos dada D) se calcula de la manera siguiente:
100 multiplicado por la fracción W/Z
donde W es el número de nucleótidos puntuados como correspondencias idénticas por el programa NCBI-BLAST2 de alineación de secuencias en la alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que, donde la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C respecto a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D respecto a C.
En otras realizaciones, los polinucleótidos variantes de FGF-19 son moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido FGF-19 activo y que son capaces de hibridarse, preferentemente bajo condiciones astringentes de hibridación y de lavado, con secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido FGF-19 de longitud completa mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2). Los polipéptidos variantes de FGF-19 pueden ser aquellos codificados por un polinucleótido variante de FGF-19.
El término "positivos" en el contexto de las comparaciones de identidad de secuencias de aminoácidos llevadas a cabo tal como se ha descrito anteriormente, incluye los residuos aminoácidos en las secuencias comparadas que no sólo son idénticas, sino también aquéllas que presentan propiedades similares. Los residuos aminoácidos que puntúan un valor positivo a un residuo aminoácido de interés son aquellos que son idénticos al residuo aminoácido de interés o son una sustitución preferente (tal como se define en la Tabla 6 posteriormente) del residuo aminoácido de
interés.
Para los fines de la presente invención, el valor de % de positivos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, con, o contra una secuencia de aminoácidos B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o que comprende un determinado % de positivos respecto a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la manera siguiente:
100 multiplicado por la fracción X/Y
donde X es el número de residuos aminoácidos que puntúan un valor positivo tal como ha definido anteriormente el programa ALIGN-2 de alineación de secuencias en la alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de positivos de A respecto a B no será igual al % de positivos de B respecto a A.
El término "aislado", cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos dados a conocer en la presente invención, se refiere a un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Preferentemente, el polipéptido aislado se encuentra libre de asociaciones con todos los componentes con los que se encuentra naturalmente asociado. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las realizaciones preferentes, el polipéptido se purifica (1) en grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia N-terminal o interna de aminoácidos mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in situ dentro de las células recombinantes, debido a que por lo menos un componente del ambiente natural de FGF-19 no se encuentra presente. Habitualmente, sin embargo, se prepara polipéptido aislado mediante por lo menos una etapa de purificación.
Una molécula "aislada" de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido FGF-19 es una molécula de ácidos nucleicos que se identifica y se separa de por lo menos una molécula contaminante de ácidos nucleicos con la que se encuentra habitualmente asociada en el ambiente natural de los ácidos nucleicos codificantes de FGF-19. Preferentemente, los ácidos nucleicos aislados se encuentran libre de asociación con la totalidad de los componentes con los que se encuentra naturalmente asociado. Una molécula de ácidos nucleicos aislada codificante de FGF-19 es diferente de la forma o contexto en la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácidos nucleicos aisladas se distinguen de la molécula de ácidos nucleicos codificante de FGF-19 existente en las células naturales. Sin embargo, entre las moléculas de ácidos nucleicos aisladas codificantes de polipéptido FGF-19 se incluyen las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de FGF-19 contenidas en las células que habitualmente expresan FGF-19 donde, por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos se encuentran en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.
La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Las células eucarióticas es conocido que utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.
Los ácidos nucleicos se encuentran "operablemente ligados" cuando se encuentran en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN para un polipéptido si se expresa en forma de preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si se sitúa de manera que facilita la traducción. Generalmente, "operablemente ligado" significa que las secuencias de ADN que se ligan son contiguas, y, en el caso de un líder secretorio, contiguas y en la misma fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no resulta necesario que sean contiguos. El ligamiento se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen estos sitios, los adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o línkers se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-FGF-19 únicos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizadores), composiciones de anticuerpo anti-FGF-19 con especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-FGF-19 de cadena única, y fragmentos de anticuerpos anti-FGF-19 (ver posteriormente). La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden encontrarse presentes en cantidades menores.
La "astringencia" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por un experto ordinario en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado, y de la concentración salina. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para la hibridación correcta, mientras que las sondas más cortas requieren temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado de rehibridarse cuando se encuentran presentes las cadenas complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Cuando más elevado es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se infiere que las temperaturas relativas más elevadas tienden a provocar que las condiciones de reacción sean más restrictivas, mientras que las temperaturas más bajas tienden a lo contrario. Para detalles adicionales y una explicación de la astringencia de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, 1995.
La expresión "condiciones astringentes" o "condiciones de elevada astringencia" tal como se define en la presente invención, pueden identificarse como aquéllas que: (1) utilizan una fuerza iónica reducida y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) utilizar formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de alta astringencia consistente en 0,1 x SSC que contenía EDTA a 55ºC.
La expresión "condiciones moderadamente astringentes" puede identificarse según se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York; Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluye la utilización de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que aquéllas indicadas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente astringentes es la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, dextrán sulfato al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37ºC a 50ºC. El experto en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según resulte necesario para ajustarse a factores tales como la longitud de sonda y similares.
La expresión "etiquetado con epítopo" cuando se utiliza en la presente memoria se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido FGF-19 fusionado a un "polipéptido de etiqueta". El polipéptido de etiqueta presenta suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que puede construirse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto para no interferir con la actividad del polipéptido con el que se encuentra fusionado. El polipéptido de etiqueta preferentemente también es bastante único, de manera que el anticuerpo no reacciona cruzadamente de manera sustancial con otros epítopos. Los polipéptidos de etiqueta adecuados generalmente presentan poro menos seis residuos aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos aminoácidos (preferentemente entre aproximadamente 10 y 20 residuos aminoácidos).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "inmunoadhesina" se refiere a moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente del sitio de reconocimiento y unión de antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o de un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o
IgM.
Los términos "activo" o "actividad" para los fines de la presente invención se refieren a una o más formas de FGF-19 que conservan una actividad biológica y/o una actividad inmunológica de FGF-19 nativa o de origen natural, en la que actividad "biológica" se refiere a una función biológica (inhibidora o estimuladora) causada por una FGF-19 nativa o de origen natural diferente de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que posee una FGF-19 nativa o de origen natural, y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que posee una FGF-19 nativa o de origen natural. Una actividad biológica preferente incluye una o más cualesquiera de entre las actividades siguientes: incrementa el metabolismo (o tasa metabólica) en un individuo, reduce el peso corporal de un individuo, reduce la adiposidad de un individuo, reduce la incorporación de glucosa en los adipositos, incrementa la liberación de leptina de los adipocitos, reduce los triglicéridos en un individuo, y reduce los ácidos grasos libres en un individuo. Se entiende que algunas de las actividades de FGF-19 resultan directamente inducidas por FGF-19 y algunas resultan inducidas indirectamente, sin embargo, cada una de ellas es el resultado de la presencia de FGF-19 y de otra manera no presentaría el resultado en ausencia de FGF-19.
El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea parcial o totalmente, inhibe, o neutraliza una actividad biológica de un polipéptido FGF-19 nativo dado a conocer en la presente invención. De una manera similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido FGF-19 nativo dado a conocer en la presente invención. Entre las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas se incluyen específicamente los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo agonistas o antagonistas, fragmentos o variantes de secuencias de aminoácidos de polipéptidos FGF-19 nativos, péptidos, pequeñas moléculas orgánicas, etc. Los procedimientos para identificar los agonistas o antagonistas de un polipéptido FGF-19 pueden comprender poner en contacto un polipéptido FGF-19 con una molécula candidata agonista o antagonista y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido FGF-19.
El término "tratamiento" se refiere a medidas tanto de tratamiento terapéutico como profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es prevenir o enlentecer (disminuir) la condición patológica o trastorno objetivo. Entre aquellos que necesitan un tratamiento se incluyen aquellos que ya presentan el trastorno, así como aquellos con una tendencia a presentar el trastorno o aquellos en los que debe prevenirse el trastorno.
La administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes de un modo continuo, y no agudo, para mantener el efecto (actividad) terapéutico inicial durante un periodo prolongado de tiempo. La administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino que es de naturaleza cíclica.
El termino "mamífero" para los fines del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo el ser humano, animales domésticos y de granza, y animales de zoológico, de competición, o de compañía, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente el mamífero es el ser humano.
El término "individuo" se refiere a cualquier sujeto, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano.
El término "obesidad" se refiere a una condición en la que el mamífero presenta un índice de masa corporal (IMC) que se calcula como peso (kg) por altura^{2} (metros), de por lo menos 25,9. Convencionalmente, aquellas personas con peso normal presentan un IMC de entre 19,9 y 25,9 como máximo. En la presente invención, la obesidad puede deberse a cualquier causa, sea genética o ambiental. Entre los ejemplos de trastornos que pueden resultar en obesidad o ser la causa de obesidad se incluyen la sobrealimentación y la bulimia, la enfermedad ovárica poliquística, el craniofaringioma, el síndrome de Prader-Willi, el síndrome de Frohlich, la diabetes de tipo II, los sujetos deficientes en GH, la variante normal de estatura corta, el síndrome de Turner, y otras condiciones patológicas que muestran actividad metabólica reducida o una reducción en el gasto energético en reposo como porcentaje de la masa total libre de grasa, por ejemplo niños con leucemia linfoblástica aguda.
La expresión "condiciones relacionadas con la obesidad" se refiere a condiciones que son el resultado o que se ven exacerbadas por la obesidad, tales como, aunque sin limitarse a ellas, trastornos dermatológicos, tales como infecciones, venas varicosas, acantosis nigricans, y eccema, intolerancia al ejercicio, diabetes mellitus, resistencia a la insulina, hipertensión, hipercolesterolemia, colelitiasis, osteoartritis, lesión ortopédica, enfermedad tromboembólica, cáncer, y enfermedad cardiovascular, incluyendo la enfermedad cardíaca coronaria (o cardiovascular), en particular aquellas condiciones cardiovasculares asociadas con niveles elevados de triglicéridos y de ácidos grasos libres en un individuo.
La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
Los "portadores" tal como se utilizan en la presente invención incluyen portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que resultan no tóxicos para la célula o mamífero que se expone a los mismos a las dosis y concentraciones utilizadas. Con frecuencia, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Entre los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables se incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptido de baso peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.
La expresión "fragmentos de anticuerpo" comprende una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión de antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2}; diacuerpos; anticuerpos linear (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995); moléculas de anticuerpo de cadena única, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión de antígeno, y un fragmento "Fc" residual, una denominación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina rinde un fragmento F(ab')_{2} que presenta dos sitios de combinación con antígeno y todavía es capaz de unirse cruzadamente a antígeno.
"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y de unión de antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera, en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración que las tres CDRJ de cada dominio variable interaccionan, definiendo un sitio de unión de antígeno sobre la superficie del dímero BH-LB. Colectivamente, las seis CDRJ proporcionan especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o medio Fv que comprende sólo tres CDRs específicas para un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y de unirse a un antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de unión entero.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente invención para Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que presentan cisteínas de bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a una de entre dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa y lambda, basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a clases diferentes. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} de anticuerpo, en los que estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena de polipéptido. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un línker polipéptido entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, editores, Springer-Verlag, New York, páginas 269-315, 1994.
El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión de antígeno, los cuales comprende un dominio variable (V_{H}) de cadena pesada conectado a un dominio variable (V_{L}) de cadena ligera en la misma cadena de polipéptido (V_{H}-V_{L}). Mediante la utilización de un línker excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena, creando dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, la patente EP nº 404.097, la patente WO nº 93/11161; y en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993.
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las realizaciones preferentes, el anticuerpo se purifica (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo según se determina mediante el procedimiento de Lowry, y más preferentemente hasta más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia N-terminal o interna de aminoácidos mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. Entre los anticuerpos aislados se incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes debido a que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se encontrará presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
El término "marcaje" cuando se utiliza en la presente memoria se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo de manera que genera un anticuerpo "marcado". El marcaje puede detectarse por sí mismo (por ejemplo los marcajes de isótopos radioactivos o los marcajes fluorescentes) o, en el caso de un marcaje enzimático, puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición de sustrato que resulta detectable.
La expresión "fase sólida" se refiere a una matriz no acuosa a la que el anticuerpo de la presente invención puede adherirse. Entre los ejemplos de fases sólidas abarcadas por la presente invención se incluyen aquéllas formadas parcial o enteramente de vidrio (por ejemplo vidrio de poro controlado), polisacárido (por ejemplo agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En determinadas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo una columna de cromatografía por afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tal como aquélla descrita en la patente US nº 4.275.149.
El término "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante que resulta útil para la administración de un fármaco (tal como un polipéptido FGF-19 o anticuerpo del mismo) a un mamífero. Los componentes del liposoma con frecuencia de disponen en una formación en bichaba, de manera similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas.
La expresión "molécula pequeña" se define en la presente invención como que presenta un peso molecular inferior a aproximadamente 500 daltons.
TABLA 1 
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1
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3
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16
17 
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TABLA 2 
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100 
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TABLA 3 
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101
TABLA 4 
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TABLA 5 
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103
II. Composiciones y procedimientos de la invención A. Polipéptido FGF-19 de longitud completa
El presente documento da a conocer secuencias aisladas de nucleótidos que codifican polipéptidos a los que se hace referencia en la presente solicitud como FGF-19 (o también como UNQ334). En particular, se ha identificado y aislado ADNc que codifica un polipéptido FGF-19, tal como se da a conocer en más detalle en los Ejemplos posteriormente. Se indica que las proteínas producidas en rondas separadas de expresión puede proporcionar diferentes números de PRO pero el número UNQ es único para cualquier ADN dado y para la proteína codificada, y no cambia. Sin embargo, por simplicidad, en la presente especificación la proteína codificada por DNA49435-1219, así como la totalidad de los homólogos y variantes nativas adicionales incluidos en la definición anterior de FGF-19 (también denominada en ocasiones PRO533), se denominará "FGF-19", con independencia de su origen o modo de preparación.
Tal como se da a conocer en los Ejemplos posteriormente, se ha depositado en la ATCC un clon de ADNc denominado en la presente memoria DNA49435-1219. El experto en la materia puede determinar con facilidad la secuencia de nucleótidos real del clon mediante la secuenciación del clon depositado utilizando procedimientos rutinarios de la técnica. La secuencia de aminoácidos teórica puede determinarse a partir de la secuencia de nucleótidos utilizando los conocimientos habituales. Para el polipéptido FGF-19 y ácidos nucleicos codificantes que se describen en la presente invención, los solicitantes han identificado lo que se cree que es el marco de lectura mejor identificable con la información de secuencia disponible en ese momento.
Utilizando el programa informático ALIGN-2 de alineación de secuencias, se ha descubierto que la secuencia nativa de longitud completa FGF-19 (mostrada en la figura 2 y en la SEC ID nº 2) presenta cierta identidad de secuencia de aminoácidos con AF007268_1. De acuerdo con ello, en la actualidad se cree que el polipéptido FGF-19 dado a conocer en la presente solicitud es un elemento nuevamente identificado de la familia del factor proteico de crecimiento fibroblástico y puede poseer una o más actividades o propiedades biológicas y/o inmunológicas de esa familia de proteínas.
B. Variantes de FGF-19
Además de los polipéptidos FGF-19 de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente invención, se contempla que puedan repararse variantes de FGF-19. Las variantes de FGF-19 pueden prepararse mediante la introducción de cambios apropiados de nucleótidos en el ADN de FGF-19, y/o mediante la síntesis del polipéptido FGF-19 deseado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácidos podrían alterar procesos post-traduccionales de FGF-19, tal como el cambio del número posición de los sitios de glicosilación o la alteración de las características de anclaje de la membrana.
Pueden llevarse a cabo variaciones en la secuencia de el FGF-19 nativo de longitud completa o en diversos dominios de FGF-19 descritos en la presente invención, utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para las mutaciones conservativas y no conservativas que se exponen, por ejemplo, en la patente US nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, una deleción o una inserción de uno o más codones que codifican la FGF-9 que resultan en un cambio en la secuencia de aminoácidos de FGF-19 en comparación con la secuencia nativa de FGF-19. Opcionalmente, la variación es mediante sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de FGF-19. Puede encontrarse guías para determinar qué residuo aminoácido puede insertarse, sustituirse o delecionarse sin afectar adversamente la actividad deseada, mediante la comparación de la secuencia de FGF-19 con la de las moléculas de proteína homólogas conocidas y minimizando el número de cambios de secuencia de aminoácidos realizado en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido con propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como la sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones conservativas de aminoácidos. Las inserciones o deleciones opcionalmente pueden ser de entre aproximadamente 1 y 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse sistemáticamente realizando inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y comprobando las variantes resultantes para la actividad mostrada por la secuencia de longitud completa o nativa madura.
Los fragmentos de polipéptido FGF-19 se dan a conocer en la presente invención. Estos fragmentos pueden truncarse en el extremo N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo cuando se comparan con una proteína nativa de longitud completa. Determinados fragmentos carecen de residuos aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido FGF-19.
Los fragmentos de FGF-19 pueden prepararse mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Los fragmentos deseados de péptidos pueden sintetizarse químicamente. Un enfoque alternativo implica generar fragmentos de FGF-19 mediante digestión enzimática, por ejemplo mediante tratamiento de la proteína con un enzima que es conocido que corta proteína en sitios definidos por residuos aminoácidos particulares, o mediante digestión del ADN con enzimas de restricción adecuados y aislando el fragmento deseado. Todavía otra técnica adecuada implica el aislamiento y la amplificación de un fragmento de ADN codificante de un fragmento deseado de polipéptido, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucléotidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se utilizan en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los fragmentos de polipéptido FGF-19 comparten por lo menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido FGF-19 nativo mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2).
En realizaciones particulares, se muestran en la Tabla 6 se muestran sustituciones conservativas de interés bajo el título de sustituciones preferentes. Si estas sustituciones resultan en un cambio de actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, denominadas sustituciones ejemplares en la Tabla 6, o tal como se describe adicionalmente después con referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los productos.
TABLA 6
Residuo original Sustituciones ejemplares Sustituciones preferentes
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn (N) gln; his; lys; arg gln
Asp (D) glu glu
Cys (C) ser ser
Gln (Q) asn asn
Glu (E) asp asp
Gly (G) pro; ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucina leu
Leu (L) norleucina; ile; val; met; ala; phe ile
TABLA 6 (continuación)
Residuo original Sustituciones ejemplares Sustituciones preferentes
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu
Se consiguen modificaciones sustanciales de función o identidad inmunológica del polipéptido FGF-19 mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de sustitución, por ejemplo, en conformación de hoja o de hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de la cadena lateral:
(1)
hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2)
hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
(3)
ácidos: asp, glu;
(4)
básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5)
residuos que influyen sobre la orientación de cadena: gly, pro; y
(6)
aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas conllevan intercambiar un elemento de una de estas clases por un elemento de otra clase. Estos residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservativa o, más preferentemente, en los sitios restantes (no conservados).
Las variaciones pueden llevarse a cabo utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (sitio-dirigida), escaneado de alaninas, y mutagénesis por PCR. La mutagénesis sitio-dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13:4331, 1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487, 1987], mutagénesis por inserción de casete [Wells et al., Gene 34:315, 1985], mutagénesis por selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415, 1986] u otras técnicas conocidas pueden llevarse a cabo en el ADN clonado para producir el ADN variante de FGF-19.
El análisis de escaneo de aminoácidos también puede utilizarse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de escaneo preferentes se encuentran los aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Entre estos aminoácidos se incluyen la alanina, la glicina, la serina y la cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de escaneo preferente de entere este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085, 1989]. La alanina también resulta típicamente preferente debido a que es el aminoácido más frecuente. Además, con frecuencia se encuentra en posiciones tanto enterradas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150:1, 1976]. Si la sustitución de la alanina no proporciona cantidades adecuadas de variante, puede utilizarse un aminoácido isotérico.
C. Modificaciones de FGF-19
Las modificaciones covalentes de FGF-19 se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos aminoácidos objetivo de un polipéptido FGF-19 con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N-terminales o C-terminales del FGF-19. La derivatización con agentes bifuncionales resulta útil, por ejemplo, para entrecruzar FGF-19 con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para la utilización en el procedimiento para la purificación de anticuerpos anti-FGF-19, y viceversa. Entre los agentes de entrecruzamiento utilizados comúnmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazocetil)-2-feniletano, glutaraldehído, N-hidroxisuccinimida ésteres, por ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo los disuccinimidil ésteres, tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimida bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes, tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Entre otras modificaciones se incluyen la desamidación de los residuos glutaminilo y asparaginilo para formar los residuo correspondientes glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de la prolina y de la lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86, 1983], la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del polipéptido FGF-19 incluido dentro del alcance de la presente invención comprende alterar el patrón nativo de glucosilación del polipéptido. La expresión "alteración del patrón nativo de glucosilación" pretende referirse, para los fines de la presente invención, a la deleción de uno o más grupos carbohidrato presentes en el FGF-19 de secuencia nativa (eliminando el sitio de glucosilación subyacente mediante deleción de la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilación que no se encuentran presentes en el FGF-19 de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos grupos carbohidrato presentes.
La adición de sitios de glucosilación al polipéptido FGF-19 puede conseguirse mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos. La alteración puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la adición, o la sustitución, de uno o más residuos serina o treonina a el FGF-19 de secuencia nativa (para los sitios de glucosilación O-ligados). La secuencia de aminoácidos de FGF-19 puede alterarse opcionalmente mediante cambios al nivel del ADN, particularmente mediante la mutación del ADN codificante del polipéptido FGF-19 en bases preseleccionadas de manera que se produzcan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios de incrementar el número de grupos carbohidrato en el polipéptido FGF-19 es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glucósidos con el polipéptido. Estos procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo en la patente WO nº 87/05330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259-306, 1981.
La eliminación de grupos carbohidrato presentes en el polipéptido FGF-19 puede conseguirse química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que codifican los residuos aminoácidos que sirven como dianas para la glucosilación. Son conocidas técnicas de glucosilación química y se describen, por ejemplo, en Hakiuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52, 1987, y en Edge et al., Anal. Biochem. 118:131, 1981. El corte enzimático de grupos carbohidrato de los polipéptidos puede conseguirse mediante la utilización de una diversidad de endoglucosidasas y exoglucosidasas tal como describen Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350, 1987.
Otro tipo de modificación covalente de FGF-19 comprende unir el polipéptido FGF-19 a una de entre una diversidad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337.
El FGF-19 de la presente invención también puede modificarse de manera que forme una molécula quimérica que comprende FGF-19 fusionado con otra secuencia heteróloga polipeptídica o de aminoácidos.
En una realización, esta molécula quimérica comprende una fusión de FGF-19 con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La presencia de estas formas etiquetas con epítopo de FGF-19 puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la provisión del epítopo etiqueta de FGF-19 puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la provisión del epítopo etiqueta permite que FGF-19 se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une al epítopo etiqueta. Son conocidas en la técnica diversos polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos. Entre los ejemplos se incluyen las etiquetas de polihistidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell Biol. 8:2159-2165, 1988]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos del mismo 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616, 1985], y la glucoproteína D (gD) del virus del herpes simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553, 1990]. Entre otros polipéptidos etiqueta se incluyen el péptido Flag [Hopp et al.., BioTechnology 6:1204-1210, 1988; el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science 255:192-194, 1992]; un péptido epítopo \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166, 1991] y el péptido etiqueta de la proteína del gen 10 de T7 [Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397, 1990].
En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de FGF-19 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada "inmunoadhesina"), esta fusión podría ser con la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la fusión de una forma soluble (dominio transmembranal delecionado o inactivado) de un polipéptido FGF-19 en lugar de por lo menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferente, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones de bisagra, CH2 y CH3, o las regiones de bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también la patente US nº 5.428.130 publicada el 27 de junio de 1995.
D. Preparación de FGF-19
La descripción posterior se refiere principalmente a la producción de FGF-19 mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácidos nucleicos de FGF-19. Evidentemente, se contempla que puedan utilizarse procedimientos alternativos, que son bien conocidos en la técnica, para preparar FGF-19. Por ejemplo, la secuencia de FGF-19, o partes de la misma, pueden producirse mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas en fase sólida (ver, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA, 1969; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963). La síntesis in vitro de proteínas puede llevarse a cabo utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Pueden sintetizarse químicamente diversas partes del FGF-19 de manera separada y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el FGF-19 de longitud completa.
1. Aislamiento del ADN que codifica FGF-19
El ADN que codifica FGF-19 puede obtenerse a partir de una biblioteca de ADNc preparada de tejido que se cree que posee el ARNm de GF-19 y que lo expresa a nivel detectable. De acuerdo con ello, el ADN de FGF-19 humano puede obtenerse convenientemente de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen codificante de FGF-19 también puede obtenerse a partir de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo mediante síntesis automatizada de ácidos nucleicos).
Las bibliotecas pueden cribarse con sondas (tales como anticuerpos contra FGF-19 u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20 a 80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del ADNc o de la biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estándares, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica GF-19 es utilizar metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenback et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995].
Los Ejemplos posteriormente describen técnicas para el cribado de una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente no ambiguas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido preferentemente se marca de manera que pueda detectarse tras la hibridación con el ADN en la biblioteca que se criba. Los procedimientos de marcaje son bien conocidos en la técnica, e incluyen la utilización de marcajes radioactivos, tales como ATP marcado con ^{32}P, la biotinilación o el marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la astringencia elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra.
Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de biblioteca pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas, tales como GenBank o en otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencias (a nivel de aminoácidos o de nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa puede determinarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en la presente invención.
Los ácidos nucleicos que presentan la secuencia codificante de proteína pueden obtenerse mediante el cribado de ADNc seleccionado o de bibliotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida que se da a conocer en la presente invención por primera vez, y, si resulta necesario, utilizando procedimientos convencionales de extensión de cebadores, tales como los descritos en Sambrook et al., supra, para detectar precursores y para procesar intermediarios de ARNm que pueden no haberse transcrito inversamente para formar ADNc.
2. Selección y transformación de células huésped
Las células huésped se transfectan o se transforman con vectores de expresión o de clonación descritos en la presente memoria para la producción de FGF-19 y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según resulte apropiado para la inducción de promotores, la selección de transformantes, o la amplificación de genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medios, temperatura, pH y similares, pueden ser seleccionadas por el experto en la materia sin experimentación innecesaria. En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, editor (IRL Press, 1991), y en Sambrook et al., supra.
Los procedimientos de transfección de células eucarióticas y de transformación de células procarióticas son conocidos por el experto ordinario en la materia, por ejemplo la mediada por CaCl_{2}, por CaPO_{4} y por liposomas, y la electroporación. Dependiendo de la célula huésped, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para la célula. El tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación, generalmente se utilizan para los procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de determinadas células vegetales, tal como describen Shaw et al., Gene 3:315, 1983, y en la patente WO nº 89/05859, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin estas paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology 52:456-457, 1978. Se describen los aspectos generales de las transfecciones de los sistemas de células huésped de mamífero en la patente US nº 4.399.216. Las transformaciones en las levaduras típicamente se llevan a cabo de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact. 130:946, 1977, e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829, 1979. Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para la introducción de ADN en las células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacteriano a células intactas, o policationes, por ejemplo polibreno, poliornitina. Para las diversas técnicas para la transformación de células de mamífero,
ver Keown et al., Methods in Enzymology 185:527-537, 1990, y Mansour et al., Nature 336:348-352, 1988.
Entre las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente invención se incluyen procariotas, levaduras o células eucarióticas superiores. Entre los procariotas adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, las eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo las enterobacteriáceas, tales como E. coli. Se encuentran disponibles para el público diversas cepas de E. coli, tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31.446), E. coli X1776 (ATCC 31.537); la cepa W3110 de E. coli (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Entre otras células huésped procarióticas adecuadas se incluyen las enterobacteriáceas, tales como Escherichia, por ejemplo E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serratia marcescans, y Shigella, así como bacilos, tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo B. licheniformis 41P, dada a conocer en la patente DD nº 266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos y no limitativos. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferente debido a que es una cepa huésped común para las fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para producir una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al huésped, incluyéndose entre los ejemplos de estos huéspedes, la cepa 1A2 de E. coli W3110, que presenta el genotipo completo tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110, que presenta el genotipo completo tonA ptr3; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244), que presenta el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan^{r}; la cepa 37D6 de E. coli W3110, que presenta el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan^{r}; la cepa 40B4 de E. coli W3110, que es la cepa 37D6 con una mutación por deleción dgP de no resistencia a la canamicina; y una cepa de E. coli que presenta una proteasa periplásmica mutante, dada a conocer en la patente US nº 4.946.783, publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, los procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo PCR u otras reacciones de polimerasa de ácidos nucleicos, resultan adecuados.
Además de los procariotas, los microbios eucarióticos, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, resultan huéspedes de clonación o de expresión adecuados para los vectores que codifican FGF-19. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado comúnmente. Entre otros organismos se incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature 290:140, 1981; patente EP nº 139.383, publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (patente US nº 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology 9:968-975, 1991), tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2):737-742, 1983), K. fragilis (ATCC nº 12.424), K. bulgaricus (ATCC nº 16.045), K. wickeramii (ATCC nº 24.178), K. waltii (ATCC nº 56.500), K. drosophilarum (ATCC nº 36.906, Van den Berg et al., Bio/Technology 8:135, 1990), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (patente EP nº 402.226); Pichia pastoris (patente EP nº 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278, 1988); Candida; Trichoderma ressia (patente EP nº 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. ACad. Sci. USA 76:5259-5263, 1979); Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis (patente EP nº 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990), y los hongos filamentosos, tales como, por ejemplo Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. ACad. Sci. USA 76:5259-5263, 1979), Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis (patente EP nº 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990), y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (patente WO nº 91/00357, publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289, 1983; Tilburn et al., Gene 26:205-221, 1983; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479, 1985). Las levaduras metilotróficas resultan adecuadas en la presente invención e incluyen, aunque sin limitarse a ellas, levaduras capaces de crecer en metanol, seleccionadas de entre los géneros consistentes en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Una lista de las especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs 269, 1982.
Las células huésped adecuadas para la expresión de FGF-12 glucosiladas se derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de insecto, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de las líneas útiles de células huésped de mamífero se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) y las células COS. Más ejemplos específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977); las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980), las células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980, la células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); las células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065), y el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de las células huésped apropiadas se considera que se encuentra dentro de los conocimientos del experto en la materia.
3. Selección y utilización de un vector replicable
Los ácidos nucleicos (por ejemplo ADNc o ADN genómico) que codifican FGF-19 pueden insertarse en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Se encuentran disponibles para el público diversos vectores. El vector puede encontrarse, por ejemplo, en la forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada puede insertarse en el vector mediante una diversidad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en uno o más sitios de restricción de endonucleasa utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los componentes del vector generalmente incluyen, aunque sin limitarse a ellos, uno o más de entre una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas estándar de ligación que son conocidas pro el experto en la materia.
El FGF-19 puede producirse recombinantemente no sólo directamente, sino también como polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido con un sitio de corte específico en el sitio N-terminal de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica FGF-19 que se inserta en el vector. La señal de secuencia puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo de los líderes de la fosfatasa alcalina, de la penicilinasa, de lpp, o de la enterotoxina II termoestable. Para la secreción en levaduras, la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, el líder invertasa de levadura, el líder del factor alfa (incluyendo los líderes de factor \alpha de Saccharomyces y de Kluyveromyces, estando descrito éste último en la patente US nº 5.010.182), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (patente EP nº 362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en la patente WO nº 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, las secuencias de señal de mamífero pueden utilizarse para dirigir la secreción de la proteína, tales como las secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, así como los líderes secretorios víricos.
Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Estas secuencias son bien conocidas en una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 resulta adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen de plásmido 2 \mu resulta adecuado para las levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan útiles para vectores de clonación en células de mamífero.
Los vectores de expresión y de clonación típicamente contienen un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) proporcionan resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de los medios complejos, por ejemplo el gen que codifica la D-alanina racemasa para los bacilos.
Un ejemplo de marcador seleccionable adecuado para las células de mamífero es aquél que permite la identificación de células competentes para incorporar los ácidos nucleicos que codifican FGF-19, tales como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza la DHFR de tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe en Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980. Un gen de selección adecuado para la utilización en las levaduras es el gen trp1 presentes en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature 282:39, 1979; Kingsman et al., Gene 7:141, 1979; Tschemper et al., Gene 10:157, 1980]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo la ATCC nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics 85:12, 1977].
Los vectores de expresión y de clonación habitualmente contienen un promotor ligado operablemente a una secuencia de ácidos nucleicos codificante de FGF-19 para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una diversidad de potenciales células huésped son bien conocidos. Los promotores adecuados para la utilización con huéspedes procarióticos incluyen los sistema de la \beta-lactamasa y de la lactosa [Chang et al., Nature 275:615, 1978; Goeddel et al., Nature 281:544, 1979], la fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057, 1980; la patente EP nº 36.776] y los promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983]. Los promotores para la utilización en sistemas bacterianos también contienen una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operablemente al ADN que codifica FGF-19.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para la utilización con huéspedes levaduras se incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980] u otros enzimas glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; Holland, Biochemistry 17:4900, 1978], tales como la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfatoisomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosa fosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, los cuales son promotores inducibles con la ventaja adicional de que la transcripción se encuentra controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y de la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en las levaduras se describen adicionalmente la patente EP nº 73.657.
La transcripción de FGF-19 a partir de vectores en células huésped de mamífero se encuentra controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de genomas de virus, tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente UK nº 2.211.50 publicada el 5 de julio de 1989), los adenovirus (tal como el adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus 40 del simio (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, con la condición de que estos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.
La transcripción de un ADN que codifica el FGF-19 en los eucariotas superiores puede incrementarse insertando una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos de ADN, habitualmente de aproximadamente entre 10 y 300 pb, que actúan en cis sobre un promotor incrementando su transcripción. En la actualidad se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente se utiliza un intensificador de un virus de célula eucariótica. Entre los ejemplos se incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100 a 270), el intensificador temprano del promotor de citomegalovirus, el intensificador del polioma en el la parte posterior del origen de replicación y los intensificadores de adenovirus. El intensificador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' respecto a la secuencia codificante de FGF-19, aunque preferentemente se sitúa en un sitio 5' respecto al promotor.
Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucarióticas (levaduras, hongos, células de insecto, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Estas secuencias se encuentran disponibles con frecuencia en las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de los ADNs o ADNcs eucarióticos o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica FGF-19.
Todavía otros procedimientos, vectores, y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de FGF-19 en cultivo de células de vertebrado recombinantes se describen en Gething et al., Nature 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature 281:40-46, 1979; patentes EP nº 117.060 y nº 117.058.
4. Detección de la amplificación/expresión génica
La amplificación y/o expresión génicas pueden medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante transferencia southern, transferencia northern convencional para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205, 1980], transferencia por puntos (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcad, basándose en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, pueden marcarse y el ensayo llevarse a cabo donde el dúplex se encuentra unido a una superficie, de manera que al formarse el dúplex sobre la superficie, pueda detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.
La expresión génica, alternativamente, puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejidos y el ensayo de cultivo celular o de líquidos corporales, con el fin de cuantificar directamente la expresión de producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de líquidos de muestra puede ser monoclonal o policlonal, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia nativa de polipéptido FGF-19 o contra un péptido sintético basándose en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención, o contra una secuencia exógenoa fusionada al ADN de FGF-19 y que codifica un epítopo específico de anticuerpo.
5. Purificación de polipéptido
Pueden recuperarse formas de FGF-19 del medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si se encuentran unidos a membrana, pueden liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton X-100) o mediante corte enzimático. Las células utilizadas en la expresión de FGF-19 pueden romperse con diversos medios físicos o químicos, tales como el ciclado congelación-descongelación, la sonicación, la rotura mecánica o los agentes de lisado celular.
Puede desearse la purificación de FGF-19 de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los procedimientos siguientes son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; la precipitación con etanol; la HPLC en fase inversa; la cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE; el cromatoenfoque; SDS-PAGE; la precipitación con sulfato amónico; la filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; las columnas de proteína A-sefarosa, para eliminar contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo del FGF-19. Pueden utilizarse diversos procedimientos de purificación de proteínas y estos procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182, 1990; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982. La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del procedimiento de producción utilizado y del FGF-19 particular producido.
E. Usos de FGF-19
Las secuencias de nucleótidos (o su complemento) que codifican FGF-19 presentan diversas aplicaciones en el campo de la biología molecular, incluyendo usos tales como las sondas de hibridación, en el mapaje de cromosomas y de genes, y en la generación de ARN y ADN antisentido. Los ácidos nucleicos de FGF-19 también resultan útiles para la preparación de polipéptidos de FGF-19 mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente memoria.
La secuencia nativa de longitud completa del gen de FGF-19 (SEC ID nº 1), o partes de la misma, pueden utilizarse como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc de FGF-19 de longitud completa, o para aislar todavía otros ADNcs (por ejemplo aquellos que codifican variantes de origen natural de FGF-19 o de FGF-19 de otras especies) que presentan una identidad de secuencia deseada con la secuencia de FGF-19 dada a conocer en la figura 1 (SEC ID nº 1). Opcionalmente, la longitud de las sondas es de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación pueden derivarse de por lo menos regiones parcialmente nuevas de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID nº 1, en la que aquellas regiones pueden determinarse sin experimentación innecesaria o a partir de secuencias genómicas, incluyendo promotores, elementos intensificadores e intrones del FGF-19 de secuencia nativa. A título de ejemplo, un procedimiento de cribado comprende aislar la región codificante del gen de FGF-19 utilizando la secuencia conocida de ADN para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse con una diversidad de marcajes, incluyendo radionucleótidos, tales como ^{32}P o ^{35}S, o marcajes enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda mediante sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas con una secuencia complementaria a la del gen FGF-19 de la presente invención pueden utilizarse para cribar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar a qué elementos de estas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen en más detalle en los Ejemplos, posteriormente.
De manera similar, puede utilizarse como sonda cualquier secuencia EST dada a conocer en la presente solicitud, utilizando los procedimientos que se dan a conocer en la presente invención.
Entre otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de FGF-19 se incluyen los oligonucleótidos antisentido o sentido que comprende una secuencia de cadena única de ácidos nucleicos (de ARN o de ADN) capaz de unirse a secuencias diana de ARNm de FGF-19 (sentido) o de ADN de FGF-19 (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificante del ADN de FGF-19. Este fragmento generalmente comprende por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferentemente entre aproximadamente 14 y 30 nucleótidos. La capacidad de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, basándose en una secuencia de ADNc codificante de una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y en van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).
La unión de oligonucléotidos antisentido o sentido a secuencias diana de ácidos nucleicos resulta en la formación de dúplex que bloquean la transcripción o la traducción de la secuencia diana mediante uno de entre varios medios, incluyendo la degradación intensificada de los dúplex, la terminación prematura de la transcripción o de la traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos antisentido de esta manera pueden utilizarse para bloquear la expresión de las proteínas FGF-19. Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además oligonucléotidos que presentan esqueletos de azúcar-fosfodiéster modificados (u otros enlaces sacáridos, tales como aquellos descritos en la patente WO nº 91/06629) y en los que estos enlaces sacáridos son resistentes a las nucleasas endógenas. Estos oligonucleótidos con enlaces sacáridos resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir a la degradación enzimática), pero conservan una especificidad de secuencia para poder unirse a secuencias diana de nucleótidos.
Entre otros ejemplos de oligonucleótidos sentido o antisentido se incluyen aquellos oligonucleótidos que se encuentran covalentemente unidos a grupos orgánicos, tales como aquellos descritos en la patente WO nº 90/10048, y otros grupos que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia diana de ácidos nucleicos, tal como poli(L-lisina). Además, los agentes intercalantes, tales como la elipticina, y los agentes alquilantes o complejos metálicos, pueden unirse a oligonucleótidos sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o sentido para la secuencia diana de nucleótidos.
Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia diana de ácidos nucleicos mediante cualquier procedimiento de transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, la transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, la electroporación, o mediante la utilización de vectores de transferencia génica, tales como el virus de Epstein-Barr. En un procedimiento preferente, se inserta un oligonucleótido antisentido o sentido en un vector retrovírico adecuado. Una célula que contiene la secuencia diana de ácidos nucleicos se pone en contacto con el vector retrovírico recombinante, sea in vivo o ex vivo. Entre los vectores retrovíricos adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, aquellos derivados del retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV), o los vectores de copia doble denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver la patente WO nº 90/13641).
Los oligonucleótidos sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia diana de nucleótidos mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión a ligando, tal como se describe en la patente WO nº 91/04753. Entre estas moléculas de unión a ligando adecuadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, los receptores de superficie celular, los factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a receptores de superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de unión a ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión a ligando de unirse a su molécula o receptor correspondiente, o de bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o de su versión conjugada en la célula.
Alternativamente, puede introducirse un oligonucleótido sentido o antisentido en una célula que contiene la secuencia diana de ácidos nucleicos mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, tal como se describe en la patente WO nº 90/10448. El complejo oligonucleótido-lípido de sentido o antisentido preferentemente resulta disociado dentro de la célula por una lipasa endógena.
Las sondas también pueden utilizarse en técnicas de PCR para generar un pool de secuencias para la identificación de secuencias codificantes de FGF-19 estrechamente relacionadas.
Las secuencias de nucleótidos que codifican un FGF-19 también pueden utilizarse para construir sondas de hibridación para el mapaje del gen que codifica FGF-19 y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente invención pueden localizarse en el mapa de un cromosoma y en regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, tales como la hibridación in situ, el análisis de ligamientos utilizando marcadores cromosómicos conocidos, y el cribado de bibliotecas por hibridación.
Cuando las secuencias codificantes de FGF-19 codifican una proteína que se une a otra proteína (ejemplo, cuando FGF-19 es un receptor), puede utilizarse el FGF-19 en ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la interacción de unión. Mediante estos procedimientos, pueden identificarse inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en estas interacciones de unión también pueden utilizarse para cribar para péptidos o moléculas pequeñas inhibidores o agonistas de la interacción de unión. Además, el receptor FGF-19 puede utilizarse para aislar uno o más ligandos correlativos. Los ensayos de cribado pueden diseñarse para encontrar compuestos líder que imitan la actividad biológica de un FGF-19 nativo o de un receptor de FGF-19. Entre estos ensayos de cribado se incluyen ensayos que pueden someterse a cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciendo que resulten particularmente adecuadas para la identificación de fármacos candidatos que son moléculas pequeñas. Entre las moléculas pequeñas contempladas se incluyen los compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos puede llevarse a cabo en una diversidad de formatos, incluyendo los ensayos de unión proteína-proteína, los ensayos de cribado bioquímico, los inmunoensayos y los ensayos basados en células, que se encuentran bien caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican FGF-19 o sus formas modificaciones también pueden utilizarse para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, resultan útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo un ratón o una rata) es un animal que presenta células que contiene un transgén, el cual se introduce en el animal o en un ancestro del animal en una etapa prenatal, pro ejemplo embrionaria. Un transgén es un ADN que se encuentra integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica FGF-19 puede utilizarse para clonar ADN genómico codificante de FGF-19 de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas pueden utilizarse par generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN codificante de FGF-19. Los procedimientos para producir animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes US nº 4.736.866 y nº 4.870.009. Típicamente, se reconocen células particulares para la incorporación del transgén de FGF-19 con intensificadores específicos de tejidos. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén codificante de FGF-19 introducida en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria pueden utilizarse para examinar el efecto de la expresión incrementada de ADN codificante de FGR-19. Estos animales pueden utilizarse como animales experimentales para reactivos que se cree que proporcionan protección frente a, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con este aspecto de la invención, se trata un animal con el reactivo y una incidencia reducida de la condición patológica, en comparación con los animales no tratados que portan el transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica para la condición patológica.
Alternativamente, pueden utilizarse homólogos no humanos de FGF-19 para construir un animal "knock out" de FGF-19, que presenta un gen defectivo o alterado codificante de FGF-19 y en el que se ha introducido ADN genómico alterado codificante de FGF-19 en una célula madre embrionaria del animal. Por ejemplo, puede utilizarse ADNc codificante de FGF-19 para clonar ADN genómico codificante de FGF-19 de acuerdo con las técnicas establecidas. Una parte del ADN genómico codificante de FGF-19 puede delecionarse o sustituirse por otro gen, tal como un gen codificante de un marcador seleccionable que puede utilizarse para monitorizar la integración. Típicamente, se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (en los extremos tanto 5' como 3') en el vector (ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell 51:503, 1987, para una descripción de los vectores de recombinación homólogos). El vector se introduce en una línea celular madre embrionaria (por ejemplo mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno (ver, por ejemplo, Li et al., Cell 69:915, 1992). A continuación, las células seleccionadas se inyectan en un blastocito de un animal (por ejemplo un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación (ver, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, editor, 1RL, Oxford, 1987, páginas 113-152). A continuación, puede implantarse un embrión quimérico en un animal hembra de adopción adecuado pseudoembarazado y llevar a término el embrión, creando un animal "knock out". La progenie que porta el ADN de recombinación homóloga en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y utilizarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales knockout pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de defenderse frente a determinadas condiciones patológicas y porque desarrollan condiciones patológicas debidas a la ausencia del polipéptido FGF-19.
Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos FGF-19 también pueden utilizarse para la terapia génica. En las aplicaciones de terapia génica, se introducen los genes en las células con el fin de conseguir la síntesis in vivo de un producto génico terapéuticamente efectivo, por ejemplo para la sustitución de un gen defectivo. La "terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional, en la que se consigue un efecto duradero mediante un tratamiento único, y la administración de agentes terapéuticos génicos, que implica la administración de una vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente efectivo. Los ARNs y ADNs antisentido pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de determinados genes in vivo. Se ha demostrado en el pasado que los oligonucleótidos antisentido pueden importarse hacia el interior de las células, donde actúan como inhibidores, a pesar de su baja concentración intracelular, debida a que la membrana celular restringe su incorporación por la célula (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146, 1986). Los oligonucléotidos pueden modificarse para intensificar su incorporación, por ejemplo mediante la sustitución de sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.
Existe una diversidad de técnicas disponibles para la introducción de ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere hacia el interior de células en cultivo in vitro, o in vivo en las células del huésped deseado. Entre las técnicas adecuadas para la transferencia de ácidos nucleicos hacia el interior de células de mamífero in vitro se incluyen la utilización de liposomas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio, etc. En la actualidad resultan preferentes las técnicas de transferencia génica in vivo, incluyendo la transfección con vectores víricos (típicamente retrovíricos) y la transfección mediada por proteína de cubierta vírica-liposoma (Dzau et al. Trends in Biotechnology 11:205-210, 1983). En algunas situaciones, resulta deseable proveer a la fuente de ácidos nucleicos de un agente que los dirija a las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína membranal de superficie celular o para la célula diana, un ligando de un receptor sobre la célula diana, etc. En el caso de que se utilicen liposomas, pueden utilizarse proteínas que se unen a una proteína membranal de superficie celular asociada a la endocitosis, para dirigir /o para facilitar la incorporación, por ejemplo proteínas de cápside o fragmentos de las mismas que son trópicas para un tipo celular particular, anticuerpos contra proteínas internalizadas durante el ciclado, proteínas que dirigen la localización intracelular y potenciar la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, en Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987; y en Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414, 1990. Para una revisión de los protocolos de marcaje y terapia génicos, ver Anderson et al., Science 256:808-813, 1992.
Los polipéptidos FGF-19 descritos en la presente invención también pueden utilizarse como marcadores de peso molecular para fines de electroforesis de proteínas.
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos FGF-19 o fragmentos de los mismos que se describen en la presente invención resultan útiles para la identificación cromosómica. En este aspecto, existe una necesidad continuada de identificar nuevos marcadores cromosómicos, debido a que en la actualidad se dispone de relativamente pocos reactivos marcadores cromosómicos, basados en los datos actuales de secuencias. Cada molécula de ácidos nucleicos de FGF-19 de la presente invención puede utilizarse como un marcador cromosómico.
Los polipéptidos FGF-19 y moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención también pueden utilizarse para el tipado de tejidos, en el que los polipéptidos FGF-19 de la presente invención pueden expresarse diferencialmente en un tejido en comparación con otro tejido. Las moléculas de ácidos nucleicos de FGF-19 resultarán útiles para producir sondas para PCR, análisis de transferencia northern, southern y western.
Los polipéptidos FGF-19 y moduladores de los mismos que se describen en la presente invención también pueden utilizarse como agentes terapéuticos. Los polipéptidos FGF-19 y moduladores de los mismo de la presente invención pueden formularse de acuerdo con procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, en las que el producto FGF-19 en las mismas se combina en una mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla del ingrediente activo al grado deseado de pureza, con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A., editor, 1980), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables resultan no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, la manosa o las dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como el manitol o el sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como el sodio; y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} oPEG.
Las formulaciones destinadas a la utilización en la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, previamente o después de la liofilización o reconstitución.
Las composiciones terapéuticas en la presente invención generalmente se introducen en un recipiente que presenta una abertura de acceso estéril, por ejemplo una bolsa o vial de solución intravenosa con un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica.
La vía de administración corresponde a los procedimientos conocidos, por ejemplo la inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, la administración tópica, o mediante sistemas de liberación sostenida.
Las dosis y concentraciones de fármaco deseadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular contemplado. La determinación de la dosis o vía de administración apropiadas se encuentra bien comprendida dentro de los conocimientos de un médico ordinario. Los experimentos animales proporcionar unas directrices fiables para la determinación de las dosis efectivas para la terapia humana. El escalado entre especies de las dosis efectivas puede llevarse a cabo siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W., "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", en: Toxicokinetis and New Drug Development, Yacobi et al., editores, Pergamon Press, New York, 1989, páginas 42-96.
Cuando se utiliza la administración in vivo de un polipéptido FGF-19, o agonista o antagonista del mismo, las dosis normales pueden variar entre aproximadamente 10 ng/kg y 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más al día, preferentemente entre aproximadamente 1 \mug/kg/día y 10 mg/kg/día, dependiendo de la vía de administración. En la literatura se proporcionan directrices respecto a las dosis y procedimientos particulares de administración; ver, por ejemplo, las patentes US nº 4.657.760, nº 5.206.344, o nº 5.225.212. Se prevé que diferentes formulaciones resulten efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y para diferentes trastornos; que la administración dirigida a un órgano o tejido, por ejemplo, puede exigir la administración de una manera diferente que la dirigida a otro órgano o tejido.
En el caso de que se desee la administración de liberación sostenida de un polipéptido FGF-19 o modulador en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que requiera la administración del polipéptido FGF-19 o modulador, se contempla la microencapsulación. La microencapsulación de proteínas recombinantes para la liberación sostenida se ha llevado a cabo con éxito con hormona del crecimiento humana (rhGH), interferón^{-} (rhIFN^{-}), interleuquina 2 y MN rgp 120 (Johnson et al., Nat. Med. 2:796-799, 1996; Yasuda, Biomed. Ther. 27:1221-1223, 1993; Hora et al., Bio/Technology 8:755-758, 1990; Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", en: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, editores (Plenum Press, New York, 1995), páginas 439-462; patentes WO nº 97/03692, nº 96/40072, nº 96/07399 y patente US nº 5.654.010.
Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteína se desarrollaron utilizando polímero poliláctico-ácido coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplio abanico de propiedades biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, ácidos láctico y glicólido, pueden eliminarse con rapidez en el cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse de meses a años dependiendo de su peso molecular y composición (Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin y R. Langer (editores), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker, New York, 1990, páginas 1-41).
Los agentes y composiciones terapéuticos que comprenden FGF-19 que se proporcionan en la presente invención pueden utilizarse en una serie de aplicaciones. Entre las aplicaciones se incluyen un individuo con obesidad o con una condición asociada a obesidad. En un aspecto, FGF-19 se administra a un individuo que lo necesita en una cantidad efectiva para tratar la condición. Preferentemente, la condición es una que requiere el tratamiento de por lo menos uno de entre: un incremento del metabolismo, una reducción del peso corporal, una reducción de la grasa corporal, una reducción de los triglicéridos, una reducción de los ácidos grasos libres, un incremento de la liberación de glucosa de los adipocitos y/o un incremento de la liberación de leptina de los adipocitos. Cada uno de estos parámetros puede medirse mediante procedimientos estándar, por ejemplo midiendo el consumo de oxígeno para determinar la tasa metabólica, utilizando escalas para determinar el peso, y midiendo el tamaño para determinar la grasa. Además, la presencia y cantidad de triglicéridos, ácidos grasos libres, glucosa y leptina puede determinarse mediante procedimientos estándar. Cada uno de estos parámetros se ejemplifica posteriormente en los ejemplos específicos.
FGF-19 y las composiciones que comprenden FGF-19 preferentemente están destinadas la utilización in vivo. Sin embargo, tal como se comenta posteriormente, la administración puede ser in vitro, tal como en los procedimientos descritos posteriormente para el cribado de moduladores de FGF-19. Aunque queda entendido que los moduladores de FGF-19 también pueden identificarse mediante la utilización de modelos animales y de muestras de pacientes.
La presente invención abarca procedimientos de cribado de compuestos para identificar aquellos que imitan o intensifican el polipéptido FGF-19 (agonistas) o previenen o inhiben el efecto del polipéptido FGF-19 (antagonistas). Los agonistas y antagonistas se denominan en la presente memoria moduladores. Los ensayos de cribado para los candidatos a fármacos antagonistas están diseñados para identificar compuestos que se unen o se acomplejan con los polipéptidos FGF-19 codificados por los genes identificados en la presente invención, o que de otra manera interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Estos ensayos de cribado incluyen ensayos que pueden someterse al cribado de alto rendimiento de bibliotecas química, de manera que resultan particularmente adecuadas para la identificación de candidatos a fármacos de molécula pequeña.
Los ensayos pueden llevarse a cabo en una diversidad de formatos, incluyendo los ensayos de unión proteína-proteína, los ensayos de cribado bioquímico, los inmunoensayos, y los ensayos basados en células, que se encuentran bien caracterizadas en la técnica.
Todos los ensayos para antagonistas presentan en común que requieren poner en contacto el candidato a fármaco con un polipéptido FGF-19 codificado por un ácido nucleico identificado en la presente invención bajo condiciones, y durante un tiempo suficiente, para permitir que estos dos componentes interaccionen.
En los ensayos de unión, la interacción es la unión, y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular, el polipéptido FGF-19 codificado por el gen identificado en la presente invención o el candidato para fármaco se inmoviliza sobre una fase sólida, por ejemplo sobre una placa de microtitulación, mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente generalmente se consigue mediante recubrimiento de la superficie sólida con una solución del polipéptido FGF-19 y secado. Alternativamente, puede utilizarse un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido FGF-19 que debe inmovilizarse, para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se lleva a cabo mediante la adición del componente no inmovilizado, que puede marcarse con un marcaje detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se ha completado la reacción, los componentes no reaccionados se eliminan, por ejemplo mediante lavado, y los complejos anclados sobre la superficie sólida se detectan. Cuando el componente originalmente no inmovilizado porta un marcaje detectable, la detección del marcaje inmovilizado sobre la superficie indica que se ha producido su acomplejamiento. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no porta un marcaje, puede detectarse el acomplejamiento, por ejemplo mediante la utilización de un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interacciona pero no se une a un polipéptido FGF-19 particular codificado por un gen identificado en la presente invención, su interacción con el polipéptido puede someterse a ensayo mediante procedimientos bien conocidos para la detección de interacciones proteína-proteína. Entre estos ensayos se incluyen enfoques tradicionales, tales como, por ejemplo, el entrecruzamiento, la coinmunoprecipitación, y la copurificación a través de gradientes o de columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína pueden seguirse mediante la utilización de un sistema genético basado en las levaduras descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (London) 340:245-246, 1989; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582, 1991), tal como dan a conocer Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5789-5793, 1991. Muchos activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, consisten de dos dominios moduladores físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de unión a ADN, y el otro que funciona como dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (generalmente denominado "sistema de dos híbridos") aprovecha esta propiedad, y utiliza dos proteínas híbridas, una en la que la proteína diana se encuentra fusionada con el dominio de unión a ADN de GAL4, y la otra, en la que las proteínas activadoras candidatas se encuentran fusionadas con el dominio de activación. La expresión de un gen informador GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 a través de la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos interaccionantes se detectan con un sustrato cromogénico para la \beta-galactosidasa. Un kit completo (MATCHMAKER^{TM}) para la identificación de interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando técnica de dos híbridos se encuentra disponible comercialmente de Clontech. Este sistema también puede extenderse al mapaje de dominios de proteína implicados en las interacciones específicas de proteínas, así como para identificar residuos aminoácidos que resultan cruciales para estas interacciones.
Los compuestos que interaccionan con la interacción de un gen codificante de un polipéptido FGF-19 identificado en la presente invención y otros componentes intracelulares y extracelulares puede someterse a ensayo de la manera siguiente: habitualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intracelular y extracelular bajo condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y unión de los dos productos. Con el fin de someter a ensayo la capacidad de un compuesto candidato de inhibir la reacción, la reacción se lleva a cabo en ausencia y en presencia del compuesto de ensayo. Además, puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción, que sirva como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto de ensayo y el componente intracelular o extracelular presente en la mezcla se monitoriza tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. La formación de un complejo en la reacción o reacciones de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo interfiere con la interacción del compuesto de ensayo con su pareja de reacción.
Para someter a ensayo los antagonistas, el polipéptido FGF-19 puede añadirse a una célula junto con el compuesto a cribar para una actividad particular, y la capacidad del compuesto de inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido FGF-19 indica que el compuesto es un antagonista del polipéptido FGF-19. Alternativamente, pueden detectarse antagonistas mediante la combinación del polipéptido FGF-19 y un antagonista potencial con receptores polipéptido o receptores recombinantes de FGF-19 unidos a membrana, bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido FGF-19 puede marcarse, tal como con radioactividad, de manera el número de moléculas de polipéptido FGF-19 unidas al receptor pueda utilizarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen codificante del receptor puede identificarse mediante numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo el reconocimiento y selección de ligandos y la separación por FACS (Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1(2):capítulo 5, 1991. Preferentemente, se utiliza la expresión de clonación, en el que se prepara ARN poliadenilado a partir de una célula sensible al polipéptido FGF-19 y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en pools y se utiliza para transfectar células COS u otras células que no son sensibles al polipéptido FGF-19. Las células transfectadas que se cultivan sobre portaobjetos de vidrio se exponen a polipéptido FGF-19 marcado. El polipéptido FGF-19 puede marcarse mediante una diversidad de medios, incluyendo la yodación o la inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica de sitio. Tras la fijación y la incubación, los portaobjetos se sometieron a análisis autorradiográfico. Se identificaron pools positivos y se prepararon subpools y se transfectaron nuevamente utilizando un subpooling interactivo y procedimiento de recribado, rindiendo finalmente un clon único que codificaba el receptor
putativo.
Como enfoque alternativo para la identificación de receptores, el polipéptido FGF-19 marcado puede ligarse por fotoafinidad con preparaciones de membranas celulares o de extracto que expresan la molécula de receptor. El material entrecruzado se resuelve mediante PAGE y se expone a película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede extraerse, resolverse en fragmentos de péptido, y someterse a microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la microsecuenciación se utilizaría para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos degenerados para cribar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica el receptor putativo.
En otro ensayo para antagonistas, las células de mamífero o una preparación de membranas que expresa el receptor se incuba con polipéptido FGF-19 marcado en presencia del compuesto candidato. La capacidad del compuesto de intensificar o de bloquear esta interacción seguidamente puede medirse.
Más ejemplos específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de inmunoglobulina con polipéptido FGF-19, y, en particular, anticuerpos que incluye, aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena única, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de estos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo una forma mutada del polipéptido FGF-19 que reconoce el receptor pero no proporciona ningún efecto, inhibiendo competitivamente de esta manera la acción del polipéptido FGF-19.
En una realización de la presente invención en la que se llevan a cabo ensayos de unión competitiva, se utiliza el receptor 4 de FGF o un anticuerpo contra FGF-19 como competidor.
Otro antagonista potencial de polipéptido FGF-19 es un constructo de ARN o ADN antisentido preparado utilizando tecnología antisentido, donde, por ejemplo, la molécula de ARN o ADN antisentido actúa bloqueando directamente la traducción del ARNm mediante la hibridación al ARNm diana evitando la traducción en proteína. La tecnología antisentido puede utilizarse para controlar la expresión génica a través de la formación de triple hélices o ADN o ARN antisentido, basándose ambos procedimientos en la unión de un polinucleótido a ADN o a ARN. Por ejemplo, la parte codificante 5' de la secuencia de polinucleótido, que codifica los polipéptidos FGF-19 maduros de la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de entre aproximadamente 10 y 40 pares de bases de longitud. Puede diseñarse un oligonucleótido de ADN para que sea complementario a una región del gen implicada en la transcripción (triple hélice, ver Lee et al., Nucl. Acids Res. 6:3073, 1979; Cooney et al., Science 241:456, 1988; Dervan et al., Science 251:1360, 1991), bloqueando de esta manera la transcripción y la producción del polipéptido FGF-19. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en polipéptido FGF-19 ((antisentido, Okan, Neurochem. 56:560, 1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden administrarse a las células de manera que pueda expresar el ARN o ADN antisentido in vivo para inhibir la producción del polipéptido FGF-19. Cuando se utiliza ADN antisentido, los oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de inicio de traducción, por ejemplo entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia de nucleótidos del gen diana, resultan preferentes.
Entre los antagonistas potenciales se incluyen moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, el sitio de unión de receptor, o factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante del polipéptido FGF-19, bloqueando de esta manera la actividad biológica normal del polipéptido FGF-19. Entre los ejemplos de moléculas pequeñas se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos, preferentemente péptidos solubles, y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptidilo sintéticos.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimático capaces de catalizar el corte específico del ARN. Los ribozimas actúan mediante la hibridación específica de secuencia con el ARN diana complementario, seguido del corte endonucleolítico. Los sitios de corte de ribozima específicos dentro de un ARN diana potencial puede identificarse mediante técnicas conocidas. Para más detalles ver, por ejemplo, Rossi, Current Biology 4:469-471, 1994, y la publicación PCT nº WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).
Las moléculas de ácidos nucleicos en formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deben ser de cadena única y estar compuestas de desoxinucleótidos. La composición de bases de estos oligonucleótidos se diseña de manera que promueva la formación de triple hélice a través de reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente requieren tramos considerables de purinas o pirimidinas en una cadena del dúplex. Para más detalles ver, por ejemplo, la publicación PCT nº WO 97/33551, supra.
Estas moléculas pequeñas pueden identificarse mediante uno o más cualesquiera de entre los ensayos de cribado comentados anteriormente en la presente memoria y/o mediante cualquier otra técnica de cribado bien conocida por los expertos en la materia.
Se aprecia que los ensayos que se proporcionan en la presente invención pueden utilizarse para cribar una amplia diversidad de agentes bioactivos candidatos. La expresión "agente bioactivo candidato", "agente candidato", "fármaco candidato", o equivalentes gramaticales tal como se utilizan en la presente memoria describen cualquier molécula, por ejemplo proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, análogo de purina, etc., a someter a ensayo para agentes bioactivos que son capaces de alterar directa o indirectamente el fenotipo de actividad celular o la expresión de una secuencia de FGF-19, incluyendo las secuencias tanto de ácidos nucleicos como de proteína.
Los agentes candidatos pueden abarcar a numerosas clases químicas, aunque típicamente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños con un peso molecular superior a 100 e inferior a aproximadamente 2.500 daltons (d). Las moléculas pequeñas se definen adicionalmente en la presente invención como presentando un peso molecular de entre 50 d y 2.000 d. En otra realización, las moléculas pequeñas presentan un peso molecular inferior a 1.500, o inferior a 1.200, o inferior a 1.000, o inferior a 750, o inferior a 500 d. En una realización, una molécula pequeña tal como se utiliza en la presente invención presenta un peso molecular de entre aproximadamente 100 y 200 d. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con las proteínas, particularmente para los puentes de hidrógeno, y típicamente incluyen por lo menos, un grupo amina, un carbonilo, un hidroxilo o un carboxilo, preferentemente por lo menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos con frecuencia comprenden estructuras cíclicas de carbono o estructuras heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas, incluyendo péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Resultan particularmente preferentes los
péptidos.
Los agentes candidatos se obtienen de una amplia diversidad de fuentes, incluyendo bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, se encuentran disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia diversidad de compuestos y biomoléculas orgánicos, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorizados. Alternativamente, se encuentran disponibles o se producen con facilidad bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Además, las bibliotecas y compuestos producidos natural o sintéticamente se modifican con facilidad por medios convencionales químicos, físicos y bioquímicos. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas aleatorias o dirigidas, tales como la acilación, la alquilación, la esterificación, la amidificación para producir análogos estructurales.
En una realización preferente, los agentes bioactivos candidatos son proteínas. El término "proteína" en la presente invención se refiere a por lo menos dos aminoácidos unidos covalentemente, que incluye proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. La proteína puede estar constituida de aminoácidos de origen natural y enlaces peptídicos, o de estructuras peptidomiméticas sintéticas. De esta manera, las expresiones "aminoácido" o "residuo péptido", tal como se utilizan en la presente invención se refieren a aminoácidos tanto de origen natural como sintéticos. Por ejemplo, homofenilalanina, citrulina y norleucina se consideran aminoácidos para los fines de la invención. El término "aminoácido" también incluye los residuos imino ácidos, tales como la prolina y la hidroxiprolina. Las cadenas laterales pueden encontrarse en configuración (R) o (S). En la realización preferente, los aminoácidos se encuentran en configuración (S) o (L). Si se utilizan cadenas naturales de origen no natural, pueden utilizarse sustituyentes no aminoácido, por ejemplo para prevenir o retrasar las degradaciones que se producen in vivo.
En una realización preferente, los agentes bioactivos candidatos son proteínas de origen natural o fragmentos de proteínas de origen natural. De esta manera, por ejemplo, pueden utilizarse extractos celulares que contienen proteínas, o digeridos aleatorios o dirigidos de extractos celulares proteináceos. De esta manera, resultan particularmente preferentes en esta realización las bibliotecas de proteínas bacterianas, fúngicas, víricas y de mamífero, siendo preferentes las últimas, y siendo especialmente preferentes las proteínas humanas.
En una realización preferente, los agentes bioactivos candidatos son péptidos de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30 aminoácidos, siendo preferentes entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 aminoácidos, siendo particularmente preferentes entre aproximadamente 7 y aproximadamente 15. Los péptidos pueden ser digeridos o proteínas de origen natural, tal como se ha indicado anteriormente, péptidos aleatorios, o péptidos aleatorios "sesgados". El término "aleatorizado" o equivalentes gramaticales en la presente invención se refiere a que cada ácido nucleico y cada péptido consiste esencialmente de nucleótidos y aminoácidos aleatorios, respectivamente. Debido a que generalmente estos péptidos aleatorios (o ácidos nucleicos, comentados después) se sintetizan químicamente, pueden incorporar cualquier nucleótido o aminoácido en cualquier posición. El procedimiento sintético puede diseñarse para generar proteínas o ácidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formación de la totalidad o la mayoría de las combinaciones posibles a lo largo de la secuencia, formando de esta manera una biblioteca de agentes proteináceos bioactivos candidatos aleatorizados.
En una realización, la biblioteca se encuentra completamente aleatorizado, sin preferencias ni constantes de secuencia en ninguna posición. Es decir, algunas posiciones dentro de la secuencia se mantienen constantes, o se seleccionan de entre un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, en una realización preferente, los nucleótidos o residuos aminoácidos se aleatorizan dentro de una clase definida, por ejemplo de aminoácidos hidrofóbicos, de residuos hidrofílicos, de residuos estéricamente predispuestos (grandes y pequeños), para crear un dominio de unión a ácidos nucleicos, para crear cisteínas, para el entrecruzamiento, de prolinas para dominios SH-3, de serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para sitios de fosforilación, etc., o de purinas, etc.
En una realización preferente, los agentes bioactivos candidatos son ácidos nucleicos. La expresión "ácido nucleico" u "oligonucleótido" o equivalentes gramaticales en la presente memoria se refieren a por lo menos dos nucleótidos unidos covalentemente entre sí. Un ácido nucleico de la presente invención generalmente contiene enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, tal como se indica posteriormente, incluye análogos de ácidos nucleicos que pueden presentar esqueletos alternativos, comprendiendo, por ejemplo, fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925, 1993, y referencias citadas en el mismo; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800, 1970; Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579, 1977; Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487, 1986; Sawai et al., Chem. Lett. 805, 1984, Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470, 1988; y Pauwels et al., Chemica Scripta 26:141:91986), fosforotioato (Mag et al., Nucl. Acids Res. 19:1437, 1991; y la patente US nº 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321, 1989), enlaces O-metilfosforoamidita (ver Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) y esqueletos y enlaces péptido-ácido nucleico (ver Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895, 1992; Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008, 1992; Nielsen, Nature 365:566, 1993; Carlsson et al., Nature 380:207, 1996, todos los cuales se incorporan en la presente invención como referencias). Entre otros ácidos nucleicos análogos se incluyen aquellos con esqueletos positivos (Denpcy et al., Proc. Natl. ACad. Sci. USA 92:6097, 1995; esqueletos no iónicos (patentes US nº 5.386.023, nº 5.602.240, nº 5.216.141 y nº 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423, 1991; Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470, 1988; Letsinger et al., Nucleoide & Nucleotide 13:1597, 1994; capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", editor Y.S. Sanghui y P. Dan Cook,; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395, 1994; Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17, 1994; Tetrahedron Lett. 37:743, 1996) y esqueletos no ribosa, incluyendo aquellos descritos en las patentes US nº 5.235.033 y nº 5.034.506, y en los capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", editores Y.S. Sanghui y P. Dan Cook. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se incluyen dentro de la definición de ácidos nucleicos (ver Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., 1995, páginas 169-176). E describen varios análogos de ácidos nucleicos en Rawls, C & E News, 2 de junio de 1997, página 35. Todas estas referencias se incorporan en la presente memoria como referencias. Estas modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato pueden realizarse para facilitar la adición de grupos adicionales, tales como marcajes, o para incrementar la estabilidad y vida media de estas moléculas en ambientes fisiológicos. Además, pueden prepararse mezcla de ácidos nucleicos y análogos de origen natural. Alternativamente, pueden prepararse mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos, y mezclas de ácidos nucleicos y análogos de origen natural. Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena única o de doble cadena, tal como se ha especificado, o pueden contener partes de secuencias tanto de doble cadena como de cadena única. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, en el que el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, y cualquier combinación de bases, incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, antanina, hipoxatanina, isocitosina, isoguanina, etc.
Tal como se ha descrito anteriormente de manera general para proteínas, los agentes bioactivos candidatos ácidos nucleicos pueden ser ácidos nucleicos de origen natural, ácidos nucleicos aleatorios, o ácidos nucleicos aleatorios "sesgados". Por ejemplo, pueden utilizarse digeridos de genomas procarióticos o eucarióticos, tal como se ha indicado de manera general para las proteínas.
En una realización preferente, los agentes bioactivos candidatos son grupos químicos orgánicos, una amplia diversidad de los cuales se encuentra disponible en la literatura.
En una realización preferente, tal como se ha indicado de manera general anteriormente, pueden realizarse cribados sobre genes individuos o productos génicos (proteínas). En una realización preferente, el gen o proteína ha sido identificado tal como se indica posteriormente en los Ejemplos como un gen expresado diferencialmente asociado a tejidos particulares y de esta manera a condiciones relacionadas con esos tejidos. De esta manera, en una realización, se diseñan los cribados para encontrar en primer lugar agentes candidatos que puedan unirse a FGF-19, y después estos agentes pueden utilizarse en ensayos que evalúan la capacidad del agente candidato de modular la actividad de FGF-19. De esta manera, como apreciarán los expertos en la materia, existe una variedad de ensayos diferentes que resulta posible llevar a cabo.
También puede realizarse el cribado de agentes que modulan la actividad de FGF-19. En una realización preferente, los procedimientos para el cribado de un agente bioactivo capaz de modular la actividad de FGF-19 comprende las etapas de adición de un agente bioactivo candidato a una muestra de FGF-19 y la determinación de una alteración en la actividad biológica de FGF-19. La expresión "modulación de la actividad de FGF-19" incluye un incremento de actividad, una reducción de actividad, o un cambio en el tipo o clase de actividad presente. De esta manera, en la presente realización, el agente candidato debe unirse tanto a FGF-9 (aunque ello puede no resultar necesario) y alterar su actividad biológico o bioquímica tal como se define en la presente invención. Entre los procedimientos se incluyen procedimientos de cribado tanto in vitro, tal como se ha indicado de manera general anteriormente, y de cribado in vivo de células para alteraciones de la presencia, expresión, distribución, actividad o cantidad de FGF-19.
De esta manera, en la presente realización, los procedimientos comprenden combinar una muestra y un agente bioactivo candidato, y evaluar el efecto sobre la actividad de FGF-19. La expresión "actividad de la proteína FGF-19" o equivalente gramatical, en la presente invención se refiere a por lo menos una de las actividades biológicas de FGF-19 tal como se ha descrito anteriormente.
En una realización preferente, la actividad de la proteína FGF-19 se incrementa; en otra realización preferente, la actividad de la proteína FGF-19 se reduce. De esta manera, los agentes bioactivos que son antagonistas resultan preferentes en algunas realizaciones, y los agentes bioactivos que son agonistas pueden resultar preferentes en otras realizaciones.
En un aspecto de la invención, las células que contienen secuencias de FGF-19 se utilizan en ensayos de cribado de fármacos mediante la evaluación del efecto de los candidatos a fármacos sobre FGF-19. El tipo celular incluye células normales, células tumorales y adipocitos.
Los procedimientos para evaluar la actividad de FGF-19, tales como cambios en la incorporación de glucosa, en la liberación de leptina, en el metabolismo, en los niveles de triglicéridos y de ácidos grasos libres, de peso corporal y de grasa corporal, son conocidos en la técnica y se ejemplifican posteriormente en los ejemplos.
En una realización preferente, los procedimientos comprende añadir un agente bioactivo candidato, tal como se ha definido anteriormente, a una célula que comprende FGF-19. Entre los tipos celulares preferentes se incluye prácticamente cualquier célula. Las células contienen un ácido nucleico, preferentemente recombinante, que codifica una proteína FGF-19. En una realización preferente, se somete a ensayo una biblioteca de agentes candidatos sobre una pluralidad de células.
En un aspecto, los ensayos se evalúan en presencia o en ausencia, o tras la exposición anterior o posterior a señales fisiológicas, por ejemplo hormonas, anticuerpos, péptidos, antígenos, citoquinas, factores de crecimiento, potenciales de acción, agentes farmacológicos, incluyendo quimioterapéuticos, radiación, carcinogénicos, u otras células (es decir, contactos célula-célula). En otro ejemplo, las determinaciones se llevan a cabo en diferentes etapas del proceso del ciclo celular.
Las secuencias de FGF-19 proporcionadas en la presente invención también pueden utilizarse procedimientos de diagnóstico. La sobreexpresión de FGF-19 puede indicar una tasa metabólica anormalmente elevada y la infraexpresión puede indicar una tendencia a la obesidad. Además, puede analizarse una muestra de un paciente para FGF-19 mutada o no funcional. Generalmente, estos procedimientos incluyen comparar una muestra de un paciente y comparar la expresión de FGF-19 con la de un control.
F. Anticuerpos anti-FGF-19
La presente invención proporciona además anticuerpos anti-FGF-19. Entre los anticuerpos ejemplares se incluyen los anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.
1. Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos anti-FGF-19 pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos por el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden cultivarse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizantes y, si se desea, un adyuvante. Típicamente el agente inmunizantes y/o adyuvante se inyectan en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido FGF-19 o una proteína de fusión del mismo. Puede resultar útil conjugar el agente inmunizante con una proteína conocida para ser inmunogénico en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de estas proteínas inmunogénicas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la hemocianina de lapa californiana, la albúmina sérica, la tiroglobulina bovina y el inhibidor de la tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse se incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil-lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintética). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia sin experimentación innecesaria.
2. Anticuerpos monoclonales
Alternativamente, los anticuerpos anti-FGF-19 pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos con hibridomas, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1976. En un procedimiento con hibridoma, típicamente se inmuniza un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante para inducir que los linfocitos produzcan o sean capaces de producir, anticuerpos que se unen específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
El agente inmunizante típicamente incluye el polipéptido FGF-19 o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, los linfocitos sanguíneos periféricos ("PBLs") se utilizan si se desean células de origen humana, o se utilizan células de bazo o células de nódulo linfático s se desean fuentes de mamífero no humano. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, páginas 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas habitualmente son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino o humano. Habitualmente se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferentes son aquéllas que se fusionan eficientemente, permiten una expresión de nivel elevado establemente de anticuerpos por parte de las células seleccionadas productoras de anticuerpos, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Son líneas celulares inmortalizadas más preferentes las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133:3011, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, 1987, páginas 51-63).
El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma seguidamente puede someterse a ensayo para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra FGF-19. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA). Estas técnicas y ensayos son conocidos en la técnica. La afinad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107:220, 1980.
Tras identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándar (Goding, supra). Entre los medios de cultivo adecuados para este fin se incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco, y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascites en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o del líquido ascites mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxiapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente US nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse fácilmente y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferente de este ADN. Tras su aislamiento, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otra manera no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas por las secuencias murinas homólogas (patente US nº 4.816.567; Morrison et al., supra) o mediante la unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. Este polipéptido no inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes del anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para la preparación de anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de cadena ligera de inmunoglobulina y cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc de manera que se evita el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se sustituyen por otro residuo aminoácido o se delecionan para evitar el entrecruzamiento.
Los procedimientos in vitro también resultan adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede conseguirse utilizando técnicas rutinarias conocidas en la técnica.
3. Anticuerpos humanos y humanizados
Los anticuerpos anti-FGF-19 de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Entre los anticuerpos humanizados se incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que se sustituyen residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo del donante), tal como ratón, rata o conejo, con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de marco de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni el en anticuerpo receptor ni en la CDR importada ni en las secuencias de marco. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y típicamente dos de ellos, en los que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones CDR corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones FR son aquéllas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprende por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992).
Los procedimientos para humanizar los anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, en un anticuerpo humanizado se han introducido uno o más residuos aminoácidos procedentes de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan residuos "de importación", que típicamente se obtienen de un dominio variable "de importación". La humanización esencialmente puede llevarse a cabo siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988), mediante la sustitución CDRs de roedor o secuencias de CDRs por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente US nº 4.816.567), en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos de FR se han sustituido por residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
Los anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo las bibliotecas de expresión fágica (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991). Las técnicas de Cole et al. y de Boerner et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985, y Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95, 1991). De manera similar, los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo ratones, en los que se han inactivado parcial o completamente genes de inmunoglobulina endógena. Tras el reto, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja estrechamente a la observada en los seres humanos en todos los aspectos, incluyendo la reorganización y ensamblaje génicos y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes US nº 5.545.807, nº 5.545.806, nº 5.569.825, nº 5.625.126, nº 5.633.425, nº 5.661.016 y en las publicaciones científicas siguientes: Marks et al., Bio/Technology 10:779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Morrison, Nature 368:812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14:826, 1996; Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995.
4. Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que presentan especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para FGF-19, siendo la otra por cualquier otro antígeno, y preferentemente para una proteína o receptor o subunidad de receptor de superficie celular.
Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas presentan diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature 305:537-539, 1983). Debido a que la colección de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina es aleatoria, estos hibridomas (cuadromas) producen una potencial mezcla de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de entre las que únicamente una presenta la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta habitualmente se consigue mediante etapas de cromatografía de afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en la patente WO nº 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991.
Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, comprendiendo por lo menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Resulta preferente que se encuentre presente la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para detalles adicionales sobre la producción de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986.
De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente WO nº 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede manipularse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz preferente comprende por lo menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales mayores (por ejemplo de tirosina o de triptófano). Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales mayores se crean en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de las cadenas laterales grandes de aminoácidos por más pequeñas (por ejemplo de alanina o de treonina). Esto proporciona una mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos en forma de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Se han descrito en la literatura técnicas para producir anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos utilizando el enlace químico. Brennan et al., Science 229:81, 1985, describen un procedimiento en el que se cortan proteolíticamente anticuerpos intactos para producir fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente acomplejante de ditiol arsenito sódico para estabilizar ditioles vecinos y para prevenir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' producidos seguidamente se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte en Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Estos anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Los fragmentos Fab' pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225, 1992, describe la producción de una molécula de anticuerpo biespecíficamente completamente humanizado F(ab')_{2}. Cada fragmento Fab' se secreta separadamente desde E. coli y se somete a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera es capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor mamario humano.
También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir de un cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553, 1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y después reoxidarse para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) con un línker que es excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerza que se apareen con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante la utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv) (ver Grubber et al., J. Immunol. 152:5368, 1994). Se encuentran contemplados anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos (Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991).
Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos epítopos diferentes en un polipéptido FGF-19 dado en la presente invención. Alternativamente, puede combinarse un brazo de anti-polipéptido FGF-19 con un brazo que se une a una molécula activadora en un leucocito, tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo CD2, CD3, CD28 o B7) o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tales como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16), de manera que se focalicen los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el polipéptido FGF-19 particular. También pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un polipéptido FGF-19 particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a FGF-19 y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelante radionucleido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido FGF-19 y se une adicionalmente a factor tisular (TF).
5. Anticuerpos heteroconjugados
Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunológico a células no deseadas (patente US nº 4.676.980), y para el tratamiento de la infección por VIH (patentes WO nº 91/00360, nº 92/200373, patente EP nº 03089). Se encuentra contemplado que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química de la síntesis de proteínas, incluyendo aquellos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuros o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de los reactivos adecuados para este fin se incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos dados a conocer, por ejemplo, en la patente US nº 4.676.980.
6. Manipulación de la función efectora
Puede resultar deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, de manera que se incrementa, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, pueden introducirse uno o más residuos cisteína en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico producido de esta manera puede presentar una capacidad de internalización mejorada y/o de eliminación celular mediada por complemento y de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) incrementadas (ver Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195, 1992, y Shopes, J. Immunol. 148:2918-2922, 1992). También pueden prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral incrementada utilizando entrecruzantes heterobifuncionales, tal como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565, 1993. Alternativamente, puede construirse un anticuerpo que presenta regiones Fc duales y de esta manera puede presentar lisis del complemento y capacidades de ADCC incrementadas (ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230, 1989).
7. Inmunoconjugados
La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, una toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).
Los quimioterapéuticos útiles en la producción de estos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas se incluyen la cadena A de la toxina de la difteria, fragmentos activos no ligantes de la toxina de la difteria, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, elonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Se encuentra disponible una diversidad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Entre los ejemplos se incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan utilizando una diversidad de agentes acoplantes de proteína bifuncional, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como HCl de dimetil adipimidato), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazo-niumbenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolieno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-diniobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina ricina, tal como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098, 1987. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilén triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo (ver la patente WO nº 94/11026).
En otra realización, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en el predireccionamiento tumoral, en el que se administra en el paciente el conjugado anticuerpo-receptor, seguido de la eliminación de conjugado no unido de la circulación utilizando un agente de eliminación y después la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que se encuentra conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido).
8. Inmunoliposomas
Los anticuerpos dados a conocer también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030, 1980, y en las patentes US nº 4.485.045 y nº 4.544545. Los liposomas con tiempo de circulación incrementada se dan a conocer en la patente US nº 5.013.556.
Los liposomas particularmente útiles pueden producirse mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extrusionan a través de filtros de tamaño de poro definido, rindiendo liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con liposomas, tal como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288, 1982, a través de una reacción de intercambio de disulfuros. Un agente quimioterapéutico (tal como doxorubicina) se contiene opcionalmente dentro del liposoma (ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484, 1989).
9. Composiciones farmacéuticas de anticuerpos
Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido FGF-19 identificados en la presente invención, así como otras moléculas identificadas mediante los ensayos de cribado dados a conocer en la presente invención, pueden administrarse para el tratamiento de diversos trastornos en la forma de composiciones farmacéuticas.
Si el polipéptido FGF-19 es intracelular y se utilizan anticuerpos completos como inhibidores, resultan preferentes los anticuerpos internalizantes. Sin embargo, también pueden utilizarse lipofecciones o liposomas para administrar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, en las células. En el caso de que se utilicen fragmentos de anticuerpos, resulta prerente el fragmento inhibitorio más pequeño posible que se una específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas de péptido que conserven la capacidad de unirse a la secuencia diana de proteína. Estos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología del ADN recombinante (ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. ACad. Sci. USA 90:7889-7893, 1993). La formulación en la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según resulte necesario para la indicación particular bajo tratamiento, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que incrementa su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, una citoquina, un agente quimioterapéutico, o un agente inhibitorio del crecimiento. Estas moléculas se encuentran convenientemente presentes en combinación en cantidades que resultan efectivas para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metilacrilato), respectivamente, en sistemas de administración farmacológica coloidales (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se dan a conocer en el Pharmaceutical Sciences de Remington, supra.
Las formulaciones que deben utilizarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril.
Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que se encuentran en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenidas e incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico), poliláctidos (patente US nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, copolímero no degradable de etileno-acetato de vinilo, copolímero degradable de ácido láctico-ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios de inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuros, puede conseguirse la estabilización mediante la modificación de los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones específicas de matriz de polímero.
G. Usos para los anticuerpos anti-FGF-19
Los anticuerpos anti-FGF-19 de la invención presentan diversas utilidades. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos anti-FGF-19 en ensayos diagnósticos para FGF-19, por ejemplo detectando su expresión en células, tejidos o suero específicos. Pueden utilizarse diversas técnicas de ensayo diagnósticas conocidas en la técnica, tales como los ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación que se llevan cabo en fases heterogéneas u homogéneas (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press Inc., 1987, páginas 147-158). Los anticuerpos utilizados en los ensayos diagnósticos pueden marcarse con un grupo detectable. El grupo detectable debe ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina, o un enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para la conjugación del anticuerpo con el grupo detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature 144:945, 1962; David et al., Biochemistry 13:1014, 1974; Pain et al., J. Immunol. Meth. 40:219, 1981, y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407, 1982.
Los anticuerpos anti-FGF-19 también resultan útiles para la purificación por afinidad de FGF-19 a partir de un cultivo celular recombinante o de fuentes naturales. En este procedimiento, los anticuerpos contra FGF-19 se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como resina Sephadex o papel de filtro, utilizando procedimiento bien conocidos en la técnica. A continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el FGF-19 que debe purificarse, y después el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todos el material en la muestra excepto FGF-19, que se encuentra unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado que liberará el FGF-19 del anticuerpo.
Los ejemplos siguientes se ofrecen únicamente a título ilustrativo, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en modo alguno.
Ejemplos
Se utilizaron reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos siguiendo las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. La fuente de las células identificadas en los ejemplos siguientes, y durante toda la especificación, con los números de acceso de la ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA.
Ejemplo 1 Aislamiento de clones de ADNc codificante de una FGF-19 humana
La secuencia EST número de acceso AF007268, un factor de crecimiento fibroblástico murino (FGF-15), se utilizó para buscar en diversas bases de datos públicas de EST (por ejemplo GenBank, Dayhoff, etc.). La búsqueda se llevó a cabo utilizando el programa informático BLAST o BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996) comparando las secuencias de proteína de ECD con la traducción de 6 marcos de las secuencias de EST. La búsqueda dio lugar al hallazgo de, con GenBank EST AA220994, que se ha identificado como el precursor neuronal NT2 nº 937230 de STRATAGENE. La secuencia de AA220994 también se denomina DNA47412 en la presente memoria.
Basándose en la secuencia DNA47412, se sintetizaron oligonucleótidos para: 1) identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenga la secuencia de interés, y 2) utilizarlos como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa de FGF-19. Los cebadores de PCR inversa y directa generalmente son de entre 20 y 30 nucleótidos y con frecuencia s diseñan para proporcionar un producto PCR de longitud comprendida entre 100 y 1.000 pb. Las secuencias de sondas típicamente son de una longitud comprendida entre 40 y 55 pb. En algunos casos, se sintetizan oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia de consenso es mayor de aproximadamente 1 a 1,5 kpb. Con el fin de cribar varias bibliotecas para un clon de longitud completa, se cribó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR, tal como en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par cebador de PCR. A continuación, se utilizó una biblioteca positiva para aislar los clones codificantes del gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los pares cebadores.
Se sintetizaron cebadores de PCR (directos e inversos):
cebador PCR directo: 5'-ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA-3' (SEC ID nº 3), y
cebador PCR inverso: 5'-CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA-3' (SEC ID nº 4).
Además, se construyó una sonda de hibridación oligonucleótida sintética a partir de la secuencia DNA47412, que presentaba la siguiente secuencia de nucleótidos:
sonda de hibridación
5'-GCCTCCCGGTCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGTGTA-3' (SEC ID nº 5).
Se aisló ARN para la construcción de las bibliotecas de ADNc a partir de tejido de retina fetal humana. Las bibliotecas de ADNc utilizadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándar utilizando reactivos disponibles comercialmente, tales como aquellos de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligodT que contenía un sitio NotI, se unió con extremo romo con adaptadores semifosforilados SaII, se cortó con NotI, se determinó su tamaño apropiadamente mediante electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio SfiI; ver Holmes et al., Science 253:1278-1280, 1991, en los sitios únicos XhoI y NotI.
La secuenciación del ADN de los clones aislados tal como se ha descrito anteriormente proporcionó la secuencia de ADN de longitud completa para un polipéptido FGF-19 de longitud completa [denominado en la presente memoria DNA49435-1219 (figura 1, SEC ID nº 1)] y la secuencia proteica derivada de dicho polipéptido FGF-19.
El clon de longitud completa identificado anteriormente contenía un solo marco de lectura abierto con un sitio de iniciación traduccional aparente en las posiciones nucleotídicas 464-466 y una señal de parada en las posiciones nucleotídicas 1112-1114 (figura 1, SEC ID nº 1). El precursor polipéptido teórico presentaba una longitud de 216 aminoácidos, un peso molecular calculado de aproximadamente 24.003 daltons y un pI estimado de aproximadamente 6,99. El análisis de la secuencia de longitud completa de FGF-19 mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 2) puso de manifiesto la presencia de una diversidad de importantes dominios de polipéptido, tal como se muestra en la figura 2, en el que las posiciones proporcionadas para estos dominios importantes de polipéptido son aproximadas, tal como se ha indicado anteriormente. El mapaje cromosómico pone de manifiesto que el ácido nucleico codificante de FGF-19 se localiza en el cromosoma 11q13.1, banda q13.1, en el ser humano. El clon DNA49435-1219 se ha depositado en la ATCC el 21 de noviembre de 1997, y se le ha asignado el nº de depósito de la ATCC 209480.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt 35) mediante el análisis de alineación de secuencias de ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa mostrada en la figura 2 (SEC ID nº 2) puso de manifiesto la identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos de FGF-19 y las secuencias de Dayhoff siguientes: AF007268_1, S54407, P_W52596, FGF2_XENLA, P_W53793, AB002097_1, P_R27966, HSU67918_1, S23595 y P_R70824.
Ejemplo 2 Utilización de FGF-19 como sonda de hibridación
El procedimiento siguiente describe la utilización de una secuencia de nucleótidos codificante de FGF-19 como sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante de FGF-19 de longitud completa o de FGF-19 maduro se utiliza como sonda para cribar para ADNs homólogos (tales como aquellos que codifican variantes naturales de FGF-19) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o en bibliotecas genómicas de tejido humano.
La hibridación y lavado de filtros que contienen ADNs de cualquiera de los dos tipos de biblioteca se lleva a cabo bajo las condiciones de alta astringencia siguientes. La hibridación de sonda derivada de FGF-19 marcada radioactivamente con los filtros se lleva a cabo en una solución de 50% formamida, 5 x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato sódico al 0,1%, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, 2x solución de Denhardt, y dextrán sulfato al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se llevó a cabo en una solución acuosa de 0,1 x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.
Los ADNs que presentaban una identidad de secuencia deseada con el ADN codificante de FGF-19 de secuencia nativa de longitud completa seguidamente pueden identificarse utilizando técnicas estándar conocidas en la
técnica.
Ejemplo 3 Expresión de FGF-19 en E. coli
El presente ejemplo ilustra la preparación de una forma no glucosilada de FGF-19 por expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN codificante de FGF-19 inicialmente se amplifica utilizando cebadores PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzima de restricción que se correspondan con los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Puede utilizarse una diversidad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al., Gene 2:95, 1977), que contiene genes para resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina. El vector se digiere con enzimas de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas por PCR seguidamente se ligan en el vector. El vector preferentemente incluye secuencias que codifican para un gen de resistencia a un antibiótico, un promotor trp, un líder polihis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia polihis, y sitio de corte de enteroquinasa), la región codificante de FGF-19, el terminador transcripcional lambda y un gen argU.
A continuación, la mezcla de ligación se utiliza para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad de crecer en placas LB y seguidamente se seleccionan las colonias resistentes a antibiótico. El plásmido de ADN puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Los clones seleccionados pueden cultivarse durante la noche en medio de cultivo líquido, tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de la noche posteriormente puede utilizarse para inocular un cultivo a escala mayor. Las células seguidamente se cultivan hasta una densidad óptica deseada, periodo durante el que se activan el promotor de expresión.
Tras cultivar las células durante varias horas más, las células pueden recolectarse mediante centrifugación. El pellet celular obtenido mediante centrifugación puede solubilizarse utilizando diversos agentes conocidos en la técnica, y la proteína FGF-19 solubilizada seguidamente puede purificarse utilizando una columna de metal quelante bajo condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.
FGF-19 puede expresarse en E. coli en una forma etiquetada con poli-His mediante el procedimiento siguiente. El ADN codificante de FGF-19 inicialmente se amplifica utilizando cebadores PCR seleccionados. Los cebadores contienen sitios de enzimas de restricción que se corresponden con los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado, proporcionando otras secuencias útiles una iniciación de traducción eficiente y fiable, una purificación rápida en una columna de metal quelante, y la eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con poli-His y amplificadas por PCR seguidamente se ligan en un vector de expresión, que se utiliza para transformar un huésped E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuh(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). En primer lugar los transformantes se cultivan en LB que contiene carbenicilina 50 mg/ml a 30ºC bajo agitación hasta alcanzar una D.O. a 600 de 3 a 5. A continuación, los cultivos se diluyen 50 a 100 veces en medio CRAP (preparado mediante mezcla de 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato sódico\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de hidrolizado de caseína SF Sheffield en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO_{4} 7 mM), y se cultivan durante aproximadamente 20 a 30 horas a 30ºC bajo agitación. Las muestras se retiran para verificar la expresión mediante análisis SDS-PAGE, y el cultivo madre se centrifuga para formar un pellet con las células. Los pellets celulares se congelan hasta su purificación y replegamiento.
Se resuspendió pasta de E. coli procedente de fermentaciones de 0,5 a 1 l (pellets de 6 a 10 g) en 10 volúmenes (p/v) de tampón guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8. Se añaden sulfito sódico sólido y tetrationato sódico hasta alcanzar concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agita durante la noche a 4ºC. Esta etapa resulta en una proteína desnaturalizada en la que todos los residuos cisteína se encuentran bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante se diluye con 3 a 5 volúmenes de tampón de columna de metal quelante (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micrómetros para clarificarlo. El extracto clarificado se carga en una columna de quelante metálico Ni-NTA de Qiagen de 5 ml equilibrada en el tampón de la columna de metal quelante. La columna se lava con tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada se agrupan y se almacena a 4ºC. La concentración de proteína se estima a partir de su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado basado en su secuencia de aminoácidos.
Las proteínas se plegaron nuevamente mediante dilución de la muestra lentamente en tampón de replegamiento preparado recientemente, consistente en Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes para el replegamiento se seleccionaron de manera que la concentración final de proteína se encontrase entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegamiento se agitó suavemente a 4ºC durante 12 a 36 horas. La reacción de replegamiento se refrescó mediante la adición de TFA hasta una concentración final del 0,4% (pH de aproximadamente 3). Previamente a la purificación adicional de la proteína, la solución se filtró a través de un filtro de 0,22 micrómetros y se añadió acetonitrilo hasta una concentración final de entre el 2% y el 10%. La proteína replegada se cromatografió en una columna de fase inversa Proso R1/H utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución en un gradiente de acetonitrilo entre el 10% y el 80%. Las alícuotas de fracciones con absorbancia A280 se analizaron en geles de SDS-poliacrilamida y las fracciones que contenían proteína replegada homogénea se agruparon. Generalmente, las especies correctamente plegadas de la mayoría de proteínas eluyeron a las concentraciones más bajas de acetonitrilo debido a que estas especies son las más compactas, al estar sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas habitualmente eluyeron a concentraciones más elevadas de acetonitrilo. Además de resolver las formas mal plegadas de las proteínas respecto a la forma deseada, la etapa de fase inversa también eliminó la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contenían el polipéptido FGF-19 plegado deseado se agruparon y el acetonitrilo se eliminó utilizando un flujo suave de nitrógeno introducido en la solución. Las proteínas se formularon en Hepes 20 mM, pH 6,8 con cloruro sódico 0,14 M y manitol al 4% mediante diálisis o mediante filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y se esterilizaron por filtración.
Ejemplo 4 Expresión de FGF-19 en células de mamífero
El presente ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glucosilada de FGF-19 mediante expresión recombinante en células de mamífero.
El vector, pRK5 (ver la patente EP nº 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989) se utilizó como el vector de expresión. Opcionalmente, se ligó el ADN de FGF-19 en pRK5 con enzimas de restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN de FGF-19 utilizando procedimientos de ligación tales como los descritos en Sambrook et al, supra. El vector resultante se denominó pK5-FGF-19.
En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se cultivan hasta la confluencia en placas de cultivo de tejidos en medios tales como DMEM suplementado con suero de feto bovino y opcionalmente componentes nutrientes y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-FGF-19 con aproximadamente 1 \mug de ADN codificante del gen ARN VA (Thmmappaya et al., Cell 31:543, 1982) y se disuelven en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se añade, gota a gota, 500 \mul de HEPES (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja que sedimente durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se retira por aspiración y se añaden a lo largo de 30 segundos 2 ml de glicerol al 20% en PBS. A continuación, se lavan las células 293 con medio libre de suero, se añade medio fresco y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, se retira el medio de cultivo y se sustituye por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro giratorio, y se carga en un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia de polipéptido FGF-19. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden someterse a una incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio someterse a ensayo en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, puede introducirse FGF-19 en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento del dextrán sulfato, descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. ACad. Sci. 12:7575, 1981. Las células 293 se cultivan hasta la densidad máxima en un matraz de centrifugación y se añaden 700 \mug de ADN pRK5-FGF-19. En primer lugar las células del matraz de centrifugación se concentran mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el pellet celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejidos, y se reintroducen en el matraz de centrifugación que contiene medio de cultivo de tejidos, insulina bovina 5 \mug/ml y transferrina bovina 0,1 \mug/ml. Tras aproximadamente 4 días, el medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y residuos. La muestra que contiene FGF-19 expresado seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante diálisis y/o cromatografía de columna.
En otra realización, FGF-19 puede expresarse en células CHO. El pRK5-FGF-19 puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio sustituirse por medio de cultivo (solo) o por medio que contiene un marcaje radioactivo, tal como ^{35}S-metionina. Tras determinar la presencia de polipéptido FGF-19, el medio de cultivo puede sustituirse por medio libre de suero. Preferentemente los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y después se recolecta el medio acondicionado. El medio que contiene el FGF-19 que se ha expresado seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El FGF-19 etiquetado con epítopo también puede expresarse en células huésped CHO. El FGF-19 puede subclonarse para sacarlo del vector pRK5. La inserción del subclón puede someterse a PCR para fusionar en el mismo marco con una etiqueta epítopo seleccionada, tal como una etiqueta poli-his, en un vector de expresión baculovirus. La inserción de FGF-19 etiqueta con poli-his seguidamente puede subclonarse en un vector controlado por SV40 que contiene un marcador de selección, tal como DHFR para la selección de los clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal como se ha descrito anteriormente) con el vector controlado por SV40. El marcaje puede llevarse a cabo, tal como se ha descrito anteriormente, para verificar que se ha producido la expresión. El medio de cultivo que contiene el FGF-19 etiquetado con poli-his que se ha expresado seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2+} quelato.
FGF-19 también puede expresarse en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitoria o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se lleva a acabo mediante el procedimiento siguiente. Las proteínas se expresan en forma de constructo de IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencia codificantes de las formas solubles (por ejemplo los dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan con una secuencia de región constante de IgG1 que contiene los dominios de bisagra, CH2 y dominios de CH2 y/o son una forma etiquetada con poli-His.
Tras la amplificación por PCR, los ADNs respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO utilizando técnicas estándar, tales como las descritas en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, unidad 3.16, John Wiley and Sons, 1997. Los vectores de expresión de CHO se construyen para que presenten sitios de restricción compatible situados en dirección 5' y 3' respecto al ADN de interés para permitir el transporte conveniente de los ADNc. El vector utilizado para la expresión en células CHO es tal como el descrito en Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779), 1996, y utiliza el promotor/intensificador temprano de SV40 para controlar la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.
Se introdujeron doce microgramos del plásmido de ADN deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando los reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect® (Qiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se cultivaron tal como se describe en Lucas et al., supra. Se congelaron aproximadamente 3 x 10^{-7} células en una ampolla para su cultivo y producción adicionales tal como se describe posteriormente.
Las ampollas que contenían el plásmido de ADN se descongelaron introduciéndolas en un baño de agua y se mezclaron con vórtex. Los contenidos se introdujeron con pipetas en un tubo de centrifugación que contenía 10 ml de medio y se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos. Se aspiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a través de un filtro de 0,2 \mum con suero de feto bovino al 5% diafiltrado a través de 0,2 \mum). A continuación, se prepararon alícuotas de las células en un centrifugador de 100 ml que contenía 90 ml de medio selectivo. Tras 1 a 2 días, las células se transfirieron a un centrifugador de 250 ml con 150 ml de medio de cultivo selectivo y se incubaron a 37ºC. Tras 2 a 3 días adicionales, se sembraron centrifugadores de 250 ml, de 500 ml y de 2.000 ml con 3 x 10^{5} células/ml. Se intercambiaron los medios celulares por medios frescos mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque puede utilizarse cualquier medio adecuado de CHO, de hecho puede utilizarse un medio de producción descrito en la patente US nº 5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. Se sembró un centrifugador de producción de 3 litros con 1,2 x 10^{6} células/ml. El día 0, se determinó el pH del número celular. El día 1, se muestreó el centrifugador y se inició la inyección de aire filtrado. El día 2, se muestreó el centrifugador, la temperatura se modificó a 33ºC, y se extrajeron 30 ml de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, emulsión de grado médico Dow Corning 365). Durante la producción, se ajustó el pH según resultase necesario para mantenerlo a aproximadamente 7,2. Tras 10 días, o hasta que la viabilidad cayese por debajo del 70%, se recolectó el cultivo celular mediante centrifugación y filtración a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se almacenó a 4ºC o se cargó inmediatamente en columnas para la purificación.
Para los constructos etiquetados con poli-His, las proteínas se purificaron utilizando una columna Ni-NTA (Qiagen). Previamente a la purificación se añadió imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombeó por una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada en tampón Hepes 20 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 m a un caudal de 4 a 5 ml/min a 4ºC. Tras la carga, la columna se lavó con tampón de equilibración adicional y la proteína se eluyó con tampón de equilibración que contenía imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada posteriormente se desaló en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se almacenó a -80ºC.
Se purificaron constructos de inmunoadhesina (que contenía Fc) a partir del medio acondicionado de la manera siguiente. El medio acondicionado se bombeó por una columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado en tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 6,8. Tras la carga, la columna se lavó extensivamente con tampón de equilibración antes de eluir con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente mediante la recolección de fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada posteriormente se desaló en tampón de almacenamiento tal como se ha descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-His. Se evaluó la homogeneidad utilizando geles de SDS-poliacrilamida y mediante secuenciación de aminoácidos N-terminales por degradación Edman.
Ejemplo 5 Expresión de FGF-19 en levaduras
El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de FGF-19 en levaduras.
En primer lugar, se construyen vectores de expresión levaduras para la producción o secreción intracelular de FGF-19 desde el promotor ADH2/GAPDH. Se inserta ADN codificante de FGF-19 y el promotor en sitios adecuados de enzimas de restricción en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de FGF-19. Para la secreción, el ADN codificante de FGF-19 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con ADN codificante del promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal de FGF-19 nativo u otro péptido de señal de mamífero, o por ejemplo, un factor alfa de levadura o una señal de secreción de invertasa/secuencia líder, y secuencias línker (en caso necesario) para la expresión de FGF-19.
Las células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, seguidamente pueden transformarse con los plásmidos de expresión indicados anteriormente y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levaduras transformadas pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguido de tinción de los geles con tinción de azul de Coomassie.
El FGF-19 recombinante seguidamente puede aislarse y purificarse extrayendo las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y después concentrando el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene FGF-19 además puede purificarse utilizando resinas seleccionadas de columna de cromatografía.
Ejemplo 6 Expresión de FGF-19 en células de insecto infectadas por baculovirus
El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de FGF-19 en células de insecto infectadas por baculovirus.
La secuencia codificante de FGF-19 se fusiona corriente arriba de una etiqueta de epítopo contenida dentro de un vector de expresión baculovirus. Estas etiquetas de epítopo incluyen etiquetas poli-his y etiquetas inmunoglobulina (por ejemplo regiones Fc de IgG). Puede utilizarse una diversidad de plásmidos, incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen). En resumen, la secuencia codificante de FGF-19 o la parte deseada de la secuencia codificante de FGF-19, tal como la secuencia codificante del dominio extracelular de una proteína transmembranal o la secuencia codificante de la proteína madura si la proteína es extracelular, se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios flanqueantes de enzimas de restricción (seleccionados). A continuación, el producto se digiere con esos enzimas de restricción seleccionados y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante cotransfección del plásmido anteriormente indicado y el virus ADN BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Tras 4 a 5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recolectan y se utilizan para amplificaciones adicionales. La infección vírica y la expresión de proteínas se llevan a cabo tal como describen O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press, 1994.
A continuación, FGF-19 etiquetado con poli-his que se ha expresado puede purificarse, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2+} quelante de la manera siguiente. Se preparan extractos a partir de células Sf9 recombinantes infectadas por virus, tal como describen Rupert et al., Nature 362:157-179, 1993. En resumen, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCl 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4 M) y se sonican dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se clarifican mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtran a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente de Qagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a una tasa de 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta la línea base a A280 utilizando tampón de carga, momento en el que se inicia la recolección de fracciones. A continuación, la columna e lava con un tampón secundario de lavado (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye proteína unida no específicamente. Tras alcanzar nuevamente la línea de base a A280, la columna se revela con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón secundario de lavado. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia Western con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contiene el FGF-19 etiquetado con His_{10} que eluyen se agrupan y se dializan frente a tampón de carga.
Alternativamente, puede llevarse a cabo la purificación del FGF-19 etiquetado con IgF (o etiquetado con Fc) utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo, cromatografía de columna con proteína A o con proteína G.
Ejemplo 7 Preparación de anticuerpos que se unen a FGF-19
El presente ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a FGF-19.
Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que pueden utilizarse se incluyen FGF-19 purificado, proteínas de fusión que contienen FGF-19, y células que expresan FGF-19 recombinante sobre la superficie celular. El experto en la materia puede llevar a cabo la selección del inmunógeno sin experimentación innecesaria.
Se inmunizan ratones, tales como ratones Balb/c con el inmunógeno FGF-19 emulsionado en adyuvante completo de Freund y se inyectan subcutánea o intraperitonealmente con una cantidad de entre 1 y 100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las almohadillas de las patas traseras de los animales. A continuación, los ratones inmunizados reciben refuerzos 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Después, durante varias semanas, los ratones también pueden recibir refuerzos con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras de suero pueden obtenerse periódicamente de los ratones mediante sangrado retroorbital para su análisis en ensayo ELISA para la detección de anticuerpos anti-FGF-19.
Tras la medición de un título adecuado de anticuerpo, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de FGF-19. Tres a cuatro días después, los ratones son sacrificados y se recolectan células del bazo. Seguidamente, las células de bazo se fusionan (utilizando polietilenglicol al 35%) con una línea celular de mieloma murino seleccionada, tal como P3X63AgU.1, disponible de ATCC, nº CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que después pueden sembrarse en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) con el fin de inhibir la proliferación de células no fusionadas, de híbridos de mieloma y de híbridos de células de bazo.
Las células de hibridoma pueden cribarse en una ELISA para reactividad contra FGF-19. La determinación de las células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra FGF-19 se encuentra dentro de los conocimientos del experto en la materia.
Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singeneicos para producir ascites que contiene los anticuerpos monoclonales anti-FGF-19. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse en matraces de cultivo de tejidos o botellas roller. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en el ascites puede conseguirse mediante la precipitación con sulfato amónico, seguido de la cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpo a proteína A o a proteína G.
Ejemplo 8 Purificación de polipéptidos FGF-19 utilizando anticuerpos específicos
Los polipéptidos FGF-19 recombinantes o nativos pueden purificarse mediante una diversidad de técnicas estándar en el campo de la purificación de proteínas. Por ejemplo, el polipéptido pro-FGF-19, el polipéptido FGF-19 maduro, o el polipéptido pre-FGF-19 se purifican mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido FGF-19 de interés. En general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante el acoplamiento covalente del polipéptido anti-FGF-19 a una resina cromatográfica activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de sueros inmunológicos mediante precipitación con sulfato amónico o mediante purificación sobre proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). De manera similar, se preparan anticuerpos monoclonales a partir de líquido ascites de ratón mediante precipitación con sulfato amónico o cromatografía sobre proteína A inmovilizada. Se une covalentemente inmunoglobulina parcialmente purificada a una resina cromatográfica, tal como Sepharose^{TM} activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea, y la resina derivada se lava siguiendo las instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polipéptido FGF-19 mediante la preparación de una fracción a partir de células que contiene polipéptido FGF-19 en una forma soluble. Este preparación se deriva mediante solubilización de la célula completa o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido FGF-19 soluble que contiene una secuencia de señal puede secretarse una cantidad útil en el medio en el que se cultivan las células.
Se pasa una preparación que contiene polipéptido FGF-19 soluble por la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava bajo condiciones que permiten la absorción preferente de polipéptido FGF-19 (por ejemplo con tampones de elevada fuerza iónica en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye bajo condiciones que interfieren en la unión anticuerpo/polipéptido FGF-19 (por ejemplo un tampón de pH reducido, tal como aproximadamente pH 2 a 3, o una concentración elevada de un agente caotrópico, tal como urea o ión tiocianato) y se recoge el polipéptido FGF-19.
Ejemplo 9 Cribado de fármacos
La presente invención resulta particularmente útil para el cribado de compuestos mediante la utilización de polipéptidos FGF-19 o fragmentos ligantes de los mismos en cualquiera de una diversidad de técnicas de cribado de fármacos. El polipéptido FGF-19 o fragmento del mismo utilizado en este ensayo puede encontrarse libre en solución, fijo a un soporte sólido, sobre una superficie celular, o dentro de la célula. Un procedimiento de cribado de fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas que se transforman establemente con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido FGF-19 o fragmento del mismo. Los fármacos se criban contra estas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Estas células, en forma viable o fijas, pueden utilizarse en ensayos estándar de unión. Puede medirse, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido FGF-19 o un fragmento del mismo y el agente que se somete a ensayo. Alternativamente, puede examinarse la disminución de formación de complejo entre el polipéptido FGF-19 y su célula diana o receptores diana causada por el agente que se somete a ensayo.
De esta manera, la presente invención proporciona procedimientos de cribado de fármacos o de cualquier otro agente que pueda afectar a una enfermedad o trastorno asociado al polipéptido FGF-19. Estos procedimientos comprenden poner en contacto este agente con un polipéptido FGF-19 o fragmento del mismo y ensayar para: (i) la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido FGF-19 o fragmento del mismo, o (ii) para la presencia de un complejo entre el polipéptido FGF-19 o fragmento del mismo y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. En estos ensayos de unión competitiva, el polipéptido FGF-19 o fragmento del mismo típicamente se encuentra marcado. Tras la incubación adecuada, el polipéptido FGF-19 o un fragmento del mismo se separa del que se encuentra presente en forma unida, y la cantidad de marcaje libre o no acomplejado constituye una medida de la capacidad del agente particular de ligar el polipéptido FGF-19 o de interferir con el complejo polipéptido FGF-19/célula.
Otra técnica para el cribado de fármacos proporciona el cribado de alto rendimiento para compuestos con una afinidad de unión adecuada con un polipéptido y se describe en detalle en la patente WO nº 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. En resumen, se sintetiza un gran número de diferentes compuestos de ensayo, péptidos de tamaño reducido, sobre un sustrato sólido, tal como clavos de plástico o alguna otra superficie. El polipéptido FGF-19 unido se detecta mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. El polipéptido FGF-19 purificado también puede recubrirse directamente sobre placas para la utilización en las técnicas de cribado de fármacos anteriormente indicadas. Además, pueden utilizarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.
La presente invención también contempla la utilización de ensayos competitivos de cribado de fármacos en los que anticuerpos neutralizantes capaces de ligar polipéptido FGF-19 compiten específicamente con un compuesto de ensayo para la unión al polipéptido FGF-19 o a fragmentos del mismo. De esta manera, los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido
FGF-19.
Ejemplo 10 Diseño racional de fármacos
El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales de polipéptidos de interés biológicamente activos (es decir, de un polipéptido FGF-19) o de moléculas de tamaño reducido con las que interaccionan, por ejemplo agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede utilizarse para diseñar fármacos que son formas más activas o más estables del polipéptido FGF-19 o que potencian o interfieren con la función del polipéptido FGF-19 in vivo (c.f., Hodgson, Bio/Technology 9:19-21, 1991).
En un enfoque, se determina la estructura tridimensional del polipéptido FGF-19, o de un complejo inhibidor deL polipéptido FGF-19, mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado informático o, más típicamente, mediante una combinación de los dos enfoques. Debe determinarse tanto la forma como las cargas del polipéptido FGF-19 para elucidar la estructura y para determinar el sitio o sitios activos de la molécula. Con menos frecuencia, puede obtenerse información útil sobre la estructura del polipéptido FGF-19 mediante modelado basado en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, se utiliza la información estructural relevante para diseñar moléculas análogas similares al polipéptido FGF-19 o para identificar inhibidores eficientes. Entre los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos se incluyen las moléculas que presentan una actividad o estabilidad mejoradas, tal como muestran Braxton y Wells, Biochemistry 31:7796-7801, 1992, o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos, tal como muestran Athauda et al., J. Biochem. 113:742-746, 1993.
También resulta posible aislar un anticuerpo específico de una diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal como se ha descrito anteriormente, y después resolver su estructura cristalina. Este enfoque, en principio, rinde un primer fármaco a partir del que puede basarse el posterior diseño de fármacos. Resulta posible evitar la cristalografía de proteínas completamente mediante la generación de anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) contra un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como imagen especular de una imagen especular, el sitio de unión de los anti-ids previsiblemente sería un análogo del receptor original. El anti-id seguidamente podría utilizarse para identificar y aislar péptidos a partir de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían después como fármaco seminal.
En virtud de la presente invención, pueden proporcionarse cantidades suficientes del polipéptido FGF-19 para llevar a cabo estudios analíticos tales como cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido FGF-19 proporcionada en la presente invención proporcionará directrices a aquellos que utilizan técnicas de modelado informático en lugar de, o además de, la cristalografía de rayos X.
Ejemplo 11 Investigación del peso, niveles de leptina, ingesta de alimento, producción de orina, consumo de oxígeno y niveles de triglicéridos y de ácidos grasos libres en ratones transgénicos para FGF-19
Tal como se describe en la presente invención, FGF-19 se ha identificado recientemente como un elemento de una familia creciente de proteínas secretadas relacionadas con el factor de crecimiento fibroblástico. FGF-19 se ha caracterizado en la presente invención como interaccionante con el receptor 4 de FGF y aparentemente no actúa como mitógeno. Con el fin de investigar adicionalmente las funciones de esta proteína, se han producido ratones transgénicos que expresan FGF-19 humano.
En particular, se ha clonado el ADNc codificante de FGF-19 humano en un plásmido que contiene el promotor para la cadena ligera de la miosina. Este promotor resulta suficiente para la transcripción específica de los músculos del transgén. También se ha incluido un aceptor y un donador de corte y empalme en dirección 5' respecto al ADNc de FGF-19 para incrementar el nivel de expresión, y un donante y un aceptor de corte y empalme con una señal de adición de poliA en dirección 3' respecto al ADNc de FGF-19 para incrementar el nivel de transcripción y para proporcionar un sitio de terminación de la transcripción.
El ADN que abarca el promotor MLC, el aceptor y el donante de corte y empalme 5', el ADNc de FGF-19 y el aceptor y donante de corte y empalme 3', y el sitio de terminación de transcripción (el transgén) se liberaron de las secuencias del vector bacteriano utilizando enzimas de restricción apropiados y se purificaron tras la fracción de tamaño en geles de agarosa. El ADN purificado se inyectó en un pronúcleo de huevos de ratón fertilizados y se generaron ratones transgénicos y se identificaron tal como se ha descrito (Genetic Modification of Animals; Tim Stewart; en: Exploring Genetic Mechanisms, páginas 565-598, 1997, editores M. Singer y P. Berg; University Science Books, Sausalito, Calif.). Los ratones eran de 6 semanas de edad para las mediciones comentadas posteriormente de ingesta de agua, consumo de alimento, producción de orina y hematocrito. Las mediciones de leptina, triglicéridos y ácidos grasos libres se realizaron en los mismos animales a las 8 semanas de edad.
Tal como demuestran los resultados comentados posteriormente, estos ratones demostraron una ingesta de alimento y una tasa metabólica incrementadas, tal como pone de manifiesto su tasa de consumo de oxígeno. A pesar de la ingesta de alimento incrementada, estos ratones pesaban significativamente menos que sus compañeros de camada no transgénicos. Este peso corporal reducido aparentemente es una consecuencia de la adiposidad reducida, debido a que la leptina se correlaciona estrechamente con la masa de tejido adiposo en el ser humano y en roedores, y se encontraba reducida en los ratones transgénicos. Esto se ve adicionalmente apoyado porque los ratones transgénicos presentaban un crecimiento lineal normal, según las mediciones de longitud de hocico a la grupa. Eran normales con respecto a la temperatura corporal, cuerpo (longitud de huesos) y valores hematológicos. En coincidencia con la ingesta de alimento incrementada, los ratones transgénicos presentaban una producción de orina incrementada. Debido a que los ratones aparentemente no bebieron más ni se encontraban deshidratados, según determinaba un hematocrito normal, la producción de orina incrementada podría derivarse del metabolismo de la ingesta de alimento incrementada. Debido a que FGF-19 reduce la adiposidad sin alterar la masa muscular ni la formación de los huesos largos, FGF-19 está indicada como compuesto terapéutico eficaz en el tratamiento de la obesidad y condiciones relacionadas.
Más particularmente, se pesaron los ratones transgénicos MLC-FGF-19 en diversos tiempos bajo diferentes condiciones de ayuno y de alimentación. Más particularmente, se pesaron grupos de ratones transgénicos para FGF-19 hembras y sus compañeros de camada no transgénicos a las 6 semanas de edad durante la alimentación ad libitum, tras ayunos de 6 y de 24 horas, y 24 horas después de finalizar un periodo de ayuno de 24 horas. Tal como se muestra en la figura 3A, bajo todas las condiciones, los ratones transgénicos para FGF-19 (columnas blancas) pesaban menos que sus compañeros de camada de tipo salvaje, no transgénicos (columnas punteadas).
La figura 3B muestra los sueros de los mismos grupos de ratones representados en la figura 3A, sometidos a ensayo para la leptina. El nivel reducido de leptina en los ratones transgénicos para FGF-19 es consistente con que los pesos corporales menores (figura 3A) se deban a una adiposidad reducida.
Se realizó un seguimiento de un grupo de ratones transgénicos de 6 semanas de edad para la ingesta de alimento (figura 4A), el consumo de agua (figura 4B), la producción de orina (figura 4C) y el hematocrito (figura 4D). Tal como puede observarse, los ratones transgénicos para FGF-19 (columnas blancas) consumieron más alimento que sus compañeros de camada de tipo salvaje, aunque no bebieron más. Aunque no se produjo ningún cambio en el consumo de agua, los ratones transgénicos produjeron más orina (figura 4C). A pesar del incremento de la producción de orina, los ratones transgénicos aparentemente no se encontraban más deshidratados, tal como pone de manifiesto el hematocrito normal (figura 4D).
La reducción del peso corporal (figura 3) con el incremento del consumo de alimento (figura 4) podría explicarse con un incremento de la tasa metabólica. Esta tasa metabólica se determinó midiendo el consumo de oxígeno. Tal como muestra la figura 5, los ratones transgénicos para FGF-19 presentaban una tasa metabólica incrementada durante ambos ciclos de luz, tras un ayuno de 24 horas y transcurridas 24 horas de la finalización de un ayuno de 24 horas.
La obesidad y los niveles incrementados de triglicéridos y de ácidos grasos libres son factores de riesgo de enfermedad cardiovascular. Debido a que FGF-19 reduce uno de los factores de riesgo de enfermedad cardiovascular (la obesidad, figura 3), se investigó si FGF-19 también podía reducir otros factores de riesgo. Tal como puede observarse en la figura 6, el nivel de triglicéridos y de ácidos grasos libres (FFA) también era menor en los ratones transgénicos para FGF-19.
Ejemplo 12 La infusión de FGF-19 conduce a un incremento de la ingesta de alimento y a un incremento del consumo de oxígeno
Con el fin de confirmar que los efectos observados en los ratones transgénicos para FGF-19 habían sido causados por la proteína FGF-19, se infusionaron grupos de ratones FvB no transgénicos con FGF-19 recombinante (1 mg/kg/día i.v.) administrados por una bomba implantada controlada osmóticamente. Tal como se muestra en las figuras 7A-7B, la administración de FGF-19 humana recombinante causa un incremento de la ingesta de alimento en comparación con los ratones infusionados con el portador solamente. Además, la infusión de FGF-19 conduce a un incremento de la tasa metabólica según la medición de consumo de oxígeno.
Ejemplo 13 FGF-19 rece la incorporación de glucosa e incrementa la liberación de leptina por los adipocitos
Con el fin de investigar adicionalmente el mecanismo por el que FGF-19 altera el metabolismo, se añadió FGF-19 humana a cultivos de adipocitos de rata primarios y se midió la incorporación de glucosa y la liberación de leptina por las células. Tal como se muestra en las figura 8A-B, FGF-19 incrementa la liberación de leptina y reduce la incorporación de glucosa por los adipocitos de rata primarios.
Ejemplo 14 Investigación de la tolerancia a la glucosa y pesos de las almohadillas grasas en ratones transgénicos para FGF-19 alimentados con dietas ricas en grasas
Generalmente, los ratones (y los seres humanos) bajo una dieta rica en grasas ganan peso y adiposidad y se convierten en intolerantes a la glucosa o diabéticos. Con el fin de examinar si la exposición a FGF-19 impacta sobre la adiposidad y la tolerancia a la glucosa, se sometieron a una dieta rica en grasas cohortes de ratones transgénicos y sus compañeros de camada no transgénicos (de edad y sexo correspondientes), esencialmente tal como describen Rebuffe-Scrive et al., Metabolism vol. 42, nº 11, 1993, páginas 1405-1409, y Surwit et al., Metabolism, vol. 44, nº 5, 1995, páginas 645-651, con la modificación de que el contenido de sodio se normalizó con respecto al alimento normal (dietas preparadas por Research Diets Inc., nº de catálogo D12330N).
Tras diez semanas con alimento normal para ratones o con una dieta rica en grasas, los ratones (hembra transgénicos y sus compañeros de camada no transgénicos) se sometieron a un ensayo de tolerancia a la glucosa. De esta manera, cada ratón se inyectó intraperitonealmente con 1,0 mg de glucosa por kg de peso corporal y se midió la concentración de glucosa presente en la sangre a intervalos tras la inyección. El gráfico en la figura 10 muestra los niveles de glucosa en los ratones y demuestra que 8/9 de los ratones hembra no transgénicos que se habían alimentado con una dieta rica en grasas podían definirse como diabéticos (niveles de glucosa a las 2 horas superior a 200 mg/dl; World Book of Diabetes in Practice, vol. 3, editor Krall, L.P., Elsevier), mientras que 0/5 de los ratones transgénicos alimentados con una dieta comparable podían considerarse diabéticos.
Los ratones macho alimentados con una dieta rica en grasas se sacrificaron tras estar bajo la dieta durante 6 ó 10 semanas, y la adiposidad se determinó midiendo los pesos de depósitos de grasa específicos. Tal como se muestra en la figura 9, los ratones transgénicos que se habían alimentado con una dieta rica en grasas eran significativamente menos obesos que los compañeros de camada no transgénicos.
Depósito de material
Los materiales siguientes se han depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
Material nº de dep. ATCC Fecha de depósito
DNA49435-1219 209480 21 de noviembre de 1997
Este depósito se ha llevado a cabo bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento correspondiente (Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de un cultivo viable en el depósito durante 30 años desde la fecha de depósito. El depósito será puesto a disposición del público por la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Genentech y ATCC, que asegura una disponibilidad permanente e ilimitada de la progenie del cultivo del depósito para el público tras la publicación de la patente US pertinente o tras abrir al público cualquiera de las solicitudes de patente US o extranjeras, dependiendo de lo que se produzca antes, y asegura la disponibilidad de la progenie para la persona que determine el comisario estadounidense de patentes y marcas que presenta el derecho para ello según la disposición 35 U.S.C. 122 y el Reglamento correspondiente del mismo (incluyendo la disposición 37 CFR 1.14, con referencia particular a 886 OG 638).
El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si muere, se pierde o resulta destruido un cultivo de los materiales bajo depósito en cultivo bajo las condiciones adecuadas, los materiales se sustituirán inmediatamente por otros iguales previo advertimiento. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una autorización para la puesta en práctica de la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con la legislación de patentes.
La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir al experto en la materia la puesta en práctica de la invención. La presente invención no debe limitarse en su alcance al constructo depositado, debido a que la realización depositada se pretende únicamente como una sola ilustración de determinados aspectos de la invención, y otros constructos que son funcionalmente equivalentes se encuentran dentro del alcance de la presente invención según las reivindicaciones. El depósito del material de la presente invención no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente memoria resulta inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe interpretarse como el alcance de las reivindicaciones se encuentra limitado a las ilustraciones específicas que representa. En efecto, resultarán evidentes para los expertos en la materia diversas modificaciones además de aquéllas mostradas y descritas en la presente memoria a partir de la descripción anterior y que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
<110> Genentech, Inc.
\hskip1cm Stewart, Timothy A.
\hskip1cm Tomlinson, Elizabeth
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> ÁCIDOS NUCLEICOS Y POLIPÉPTIDOS DEL FACTOR 19 DE CRECIMIENTO FIBROBLÁSTICO (FGF-19) Y PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA OBESIDAD
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<130> P1219P1PCT
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US00/06471
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2000-03-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US99/20594
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-09-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US99/21090
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-09-15
\vskip1.000000\baselineskip
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<150> PCT/US99/30999
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<151> 1999-12-20
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<150> PCT/US00/04414
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<151> 2000-02-22
\vskip1.000000\baselineskip
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<160> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2137
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
18
19 
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<210> 2
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<211> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\newpage
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<400> 2
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Sonda de oligonucleótidos sintéticos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atccgcccag atggctacaa tgtgta 
\hfill
26 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sonda de oligonucleótidos sintéticos
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccagtccggt gacaagccca aa 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 42
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Sonda de oligonucleótidos sintéticos
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcctcccggt ctccctgagc agtgccaaac agcggcagtg ta 
\hfill
42

Claims (15)

1. Utilización de un polipéptido FGF-19, o de un ácido nucleico codificante de un polipéptido FGF-19, en la preparación de un medicamento, en el que el medicamento está destinado para:
(a) el tratamiento de la obesidad o de una condición relacionada con la obesidad, o
(b) reducir la masa corporal total de un individuo y/o reducir el nivel de grasa de un individuo, o
(c) reducir el nivel de por lo menos uno de entre triglicéridos y ácidos grasos libres de un individuo, o
(d) incrementar la tasa metabólica de un individuo, o
(e) inducir la liberación de leptina de las células adiposas, o
(f) inducir una reducción de la incorporación de glucosa en las células adiposas,
en la que el polipéptido FGF-19:
(i) comprende la secuencia de residuos aminoácidos entre 1 o X o 23 \pm 5 a 216 de la fig. 2 (SEC ID nº 2), o un fragmento biológicamente activo de la secuencia de aminoácidos de la fig. 2 (SEC ID nº 2), o
(ii) comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de proteína humano depositada bajo el nº de acceso ATCC 209480, o
(iii) consiste en la secuencia de aminoácidos de la fig. 2 (SEC ID nº 2) sin la secuencia N-terminal de señal y/o sin la metionina de iniciación, o
(iv) presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos el 80% con la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 o X o 23 \pm 5 a 216 de la secuencia de aminoácidos de la fig. 2 (SEC ID nº 2) o con un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la fig. 2 (SEC ID nº 2) y es biológicamente activa;
(v) presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos el 80% con la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de proteína humana depositada bajo el nº de acceso ATCC 209480, y es biológicamente activa,
y en el que X es entre 17 y 27, y la actividad biológica es una o más de entre:
(1) incrementar el metabolismo o la tasa metabólica de un individuo;
(2) reducir el peso corporal de un individuo;
(3) reducir la adiposidad de un individuo;
(4) reducir la incorporación de glucosa por los adipocitos;
(5) incrementar la liberación de leptina por los adipocitos;
(6) reducir el nivel de triglicéridos de un individuo; y
(7) reducir el nivel de ácidos grasos libres de un individuo.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el nivel de identidad es de por lo menos el 85%.
3. Utilización según la reivindicación 2, en que el nivel de identidad es de por lo menos el 90%.
4. Utilización según la reivindicación 3, en la que el nivel de identidad es de por lo menos el 95%.
5. Utilización según la reivindicación 1, en la que el polipéptido FGF-19:
(i) comprende la secuencia de residuos aminoácidos entre 1 o X o 23 \pm 5 a 216 de la fig. 2 (SEC ID nº 2), o un fragmento biológicamente activo de la misma, o
(ii) comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de proteína humano depositado bajo el nº de acceso ATCC 209480, o
(iii) consiste en la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID nº 2) sin la secuencia N-terminal de señal y/o sin la metionina de iniciación.
6. Utilización según la reivindicación 1, en la que el polipéptido FGF-19:
(i) comprende la secuencia de residuos aminoácidos entre 1 o X o 23 \pm 5 a 216 de la fig. 2 (SEC ID nº 2), o
(ii) comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de proteína humano depositado bajo el nº de acceso ATCC 209480, o
(iii) consiste en la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID nº 2) sin la secuencia N-terminal de señal y/o sin la metionina de iniciación.
7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia de señal está comprendida entre los residuos aminoácidos 1 a 22 \pm 5 de la fig. 2 (SEC ID nº 2).
8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que X es 23.
9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido FGF-19 presenta una longitud de por lo menos 50 aminoácidos.
10. Utilización según la reivindicación 9, en la que el polipéptido FGF-19 presenta una longitud de por lo menos 100 aminoácidos.
11. Utilización según la reivindicación 9, en la que el polipéptido FGF-19 presenta una longitud de por lo menos 150 aminoácidos.
12. Utilización según la reivindicación 9, en la que el polipéptido FGF-19 presenta una longitud de por lo menos 200 aminoácidos.
13. Procedimiento in vitro o ex vivo de inducción de la liberación de leptina por las células adiposas, comprendiendo dicho procedimiento la administración de un polipéptido FGF-19, o de un ácido nucleico que codifica un polipéptido FGF-19, a dichas células en una cantidad efectiva para inducir la liberación de leptina, en el que dicho polipéptido FGF-19 es tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Procedimiento in vitro o ex vivo para la inducción de una reducción de la incorporación de glucosa por las células adiposas, comprendiendo dicho procedimiento la administración de un polipéptido FGF-19, o de un ácido nucleico que codifica un polipéptido FGF-19, a dichas células en una cantidad efectiva para inducir una reducción de la incorporación de glucosa, en el que dicho polipéptido FGF-19 es tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
15. Procedimiento para el cribado de un agente bioactivo capaz de modular la actividad de un polipéptido FGF-19, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) añadir un agente bioactivo candidato a una muestra de un polipéptido FGF-19; y
(b) determinar una alteración de la actividad biológica del polipéptido FGF-19,
en el que la presencia de una alteración indica que el agente bioactivo es capaz de modular la actividad del polipéptido FGF-19, y en el que dicha actividad biológica es: (i) la menor incorporación de glucosa por los adipocitos y/o la mayor liberación de leptina por los adipocitos; o (ii) la mayor oxidación de los lípidos y de los carbohidratos,
y en el que dicho polipéptido FGF-19 es tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
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