ES2264170T3

ES2264170T3 - Utilizacion de complejos para la preparacion de composiciones para el tratamiento de pieles sensibles, procedimiento de preparacion y composiciones hipoalergenicas.

Info

Publication number: ES2264170T3
Application number: ES97943120T
Authority: ES
Inventors: Dominique Castelli; Gerd Ries; Laurence Friteau; Elisabeth Bousigniere; Laurent Fredon
Original assignee: Johnson and Johnson Consumer France SAS
Current assignee: Johnson and Johnson Consumer Holdings France SAS
Priority date: 1996-10-22
Filing date: 1997-10-21
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2017-10-21
Also published as: EP0955995B1; KR100544570B1; EP0955995A1; US6352698B1; DE69735814D1; CO5070618A1; BR9712648B1; JP2001502685A; AR008685A1; DK0955995T3; FR2754713B1; ATE324863T1; PT955995E; US7008627B1; BR9712648A; CA2269594A1; FR2754713A1; WO1998017246A1; DE69735814T2; CA2269594C

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE AL USO DE, POR LO MENOS, DOS COMPUESTOS, ESCOGIDOS ENTRE COMPONENTES QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD A) ANTIRRADICAL, B) ANTIINFLAMATORIA Y C) ANTIALERGICA, PARA LA PREPARACION DE UNA COMPOSICION QUE TIENE, POR LO MENOS, DOS DE LAS ACTIVIDADES A), B) Y C), ESTANDO DICHA COMPOSICION DESTINADA AL TRATAMIENTO DE PIELES SENSIBLES Y/O ALERGICAS. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE DICHAS COMPOSICIONES, ASI COMO A LAS COMPOSICIONES OBTENIDAS DE ESTE MODO.

Description

Uso de complejos para la preparación de composiciones para el tratamiento de piel sensible, proceso de preparación y composiciones hipoalergénicas.

La invención se refiere a nuevas composiciones dermocosméticas y farmacéuticas que son útiles para mejorar y tratar afecciones de piel hiperreactiva y, más generalmente, reacciones de tipo alérgico y/o fenómenos de intolerancia, estén causadas por factores externos o por factores intrínsecos al individuo.

Cantidades en aumento de niños y adultos muestran de hecho, piel descrita como "sensible". Durante un reciente estudio en Francia, el 70% de las mujeres preguntadas declararon que tenían la piel facial sensible. La noción de piel sensible cubre una serie de signos externos que comprenden piel reactiva y piel intolerante. También puede incluirse en ella la piel atópica. Estos tipos de piel son a veces conocidos por los sujetos incorrectamente como "alérgicos"; sin embargo, mientras que un componente alérgico puede a veces suscitarse en los síntomas de piel sensible, puede no estar restringido a esta. Los factores desencadenantes pueden ser agresiones medioambientales tales como viento, contaminación, variaciones de temperatura, agua excesivamente dura o higiene, cosméticos o productos de cuidado inadecuados; estos fenómenos pueden también estar asociados con estrés o emociones que siente el sujeto, algunas dietas o la toma de medicamentos. Además, existen factores de predisposición individuales (en particular neurológicos u hormonales) o factores de predisposición familiares que amplifican estas reacciones.

Generalmente, el sujeto siente molestias cutáneas que pueden manifestarse mediante signos subjetivos y/o objetivos. La piel emite fácilmente dolores punzantes, picores o escozores y el sujeto puede experimentar sensaciones de calor, hormigueo o ardor en la piel. La piel puede enrojecer o descamarse. Se observa xerosis, dermatitis seborreica, telangiectasias, vesículas o incluso edema, en una base irregular.

En los casos más serios, pueden observarse dolencias dermatológicas de tipo inmunoalérgico, tales como atopia, eccema o neurodermatitis.

Esta afección puede manifestarse sobre la piel, las membranas mucosas o el cuero cabelludo. En el último caso, puede estar asociada con una afección de caspa y/o alopecia.

Hasta ahora, se han realizado intentos para prevenir la aparición de estas reacciones limitando la presencia, en formulaciones dermocosmetológicas, de componentes que se sabe son alergizantes. Sin embargo, sería deseable ser capaces de tener disponibles verdaderas composiciones activas que sean capaces de prevenir o aliviar estos síntomas disminuyendo la reactividad de la piel y mejorando su resistencia a los factores desencadenantes.

La Compañía Solicitante ha descubierto ahora, inesperadamente, que estos objetivos pueden conseguirse mediante el uso de una composición que contiene una combinación sinérgica que produce un complejo hipoalergénico activo.

Dicho complejo mejorará, además, la receptividad de la piel hacia otros principios activos.

Por esta razón, el objeto de la presente invención es una combinación sinérgica de un extracto de Ginkgo biloba y de \beta-glucano o de uno de sus derivados.

De hecho, la Compañía Solicitante ha sido capaz de demostrar que esta combinación tiene actividades anti-alérgicas, anti-radicales y/o anti-inflamatorias complementarias, e hizo posible combatir eficazmente los fenómenos asociados con la aparición de los síntomas de piel sensible y/o intolerante o de dolencias inmunoalérgicas, mediante una sinergia de las actividades de los componentes.

Los componentes que forman parte de las formulaciones de acuerdo con la invención pueden ser moléculas purificadas o sin purificar, productos sintéticos o extraídos, mezclas de principios activos o extractos que se han sometido a una o varias etapas de fraccionamiento a partir de un material inicial de origen vegetal o animal.

La función anti-inflamatoria puede tener también la consecuencia de disminuir la producción de derivados nitro reactivos por las células, limitando la generación de radicales libres.

Cada componente contribuye, mediante varios parámetros, a la actividad global de la composición de acuerdo con la invención.

La composición de acuerdo con la invención ventajosamente tiene una marcada actividad inhibidora sobre la síntesis y/o la expresión de neuromediadores, en particular con respecto a células cutáneas, resultante de una sinergia de las actividades de sus diferentes componentes. Los neuromediadores pueden elegirse entre el grupo que comprende neuroquininas A (NKA) y B (NKB), polipéptido intestinal vasoactivo (VIP), péptido relacionado con el gen liberador de la calcitonina (CGRP), neuropéptido Y (NPY), neurotensina (NT), somatostatina (SOM), péptido liberador de gastrina (GRP), factor de crecimiento nervioso (NGF), PGP 9.5 (Proteína Producto del Gen 9.5) y bombesina.

Los componentes que hacen posible la preparación de composiciones dermocosméticas de acuerdo con la invención se eligen entre el siguiente grupo: Ginkgo biloba y sus extractos, y \beta-glucano y sus derivados.

De acuerdo con la invención, la composición contiene dos componentes elegidos entre el grupo anterior.

Puede mencionarse, entre los derivados de \beta-glucano, el carboximetil-\beta-glucano y la drielina.

La drielina es una poli-\beta-(1\rightarrow3)-glucopiranosa de fórmula

1

con n = 1000.

La molécula puede proporcionarse en forma de una solución al 0,1% en agua y sorbitol, o en forma de polvo.

En la invención, la composición contiene una combinación sinérgica de un extracto de Ginkgo biloba y de un compuesto de \beta-glucano.

De hecho, la Compañía Solicitante ha descubierto que la combinación de estos dos componentes hizo posible obtener la combinación óptima de las características funcionales que proporcionan la actividad de las composiciones de acuerdo con la invención.

El glucano se compone de una cadena de glucosa \beta(1\rightarrow3) que puede, en particular, extraerse de la pared de células de levadura. Es posible someterla a modificaciones químicas para, en particular, mejorar su solubilidad.

El \beta-glucano se sustituye ventajosamente por grupos carboximetilo; puede existir en forma de sal, en particular la forma de sal sódica. Se obtienen buenos resultados con un derivado en el que el grado de sustitución por grupos carboximetilo está dentro del intervalo de 0,65 a 0,85 y que muestra un pH de 5,5 a 8,5.

Ginkgo biloba es un árbol dioico del lejano oriente, cuyas hojas se usan por ciertas propiedades medicinales. Contienen constituyentes, tales como hidrocarburos alifáticos y alcoholes, polifenoles, tales como luteolina o quercetol, o biflavonas obtenidas de amentoflavona, y constituyentes más específicos: ácido ginkgólico, derivados de anacardo, terpenos obtenidos de limoneno o terpenos que contienen un grupo terc-butilo.

Se han propuesto los extractos de Ginkgo para mejorar los síntomas de deficiencia mental en ancianos, de claudicación intermitente, de eliminación de arteriopatías crónicas y de la enfermedad de Raynaud, o en el caso de deficiencia retiniana.

Se han usado en cosmetología por su efecto protector con respecto a los radicales libres.

La Compañía Solicitante ha descubierto, inesperadamente, que los extractos de ginkgo tienen una excelente actividad anti-inflamatoria y anti-alérgica que puede demostrarse sobre células cutáneas, tales como queratinocitos y macrófagos. Además, la Compañía Solicitante ha demostrado que esta actividad se potencia en presencia de \beta-glucano.

Los extractos que son particularmente adecuados para la puesta en práctica de la invención se obtienen de hojas de Ginkgo biloba que se han sometido a una etapa durante la cual la concentración de terpenos se ha llevado a un valor de menos de aproximadamente el 7% y preferiblemente, de menos de aproximadamente el 3% (p/p de extracto seco). En una de las realizaciones, esta concentración de terpenos es menos de aproximadamente el 1%.

La concentración de heterósidos de flavona en el extracto seco es ventajosamente mayor del 24% y preferiblemente mayor de aproximadamente el 28%.

Las propiedades anti-inflamatorias y anti-alérgicas pueden demostrarse en particular con respecto a modelos in vitro, para los que existe una correlación con modelos animales y estudios clínicos ya realizados en el hombre.

Es posible en particular, trabajar sobre queratinocitos y células de macrófago porque estas son células que son esenciales para el desarrollo de una reacción inflamatoria local. Es más, los macrófagos son células particularmente ventajosas porque, debido al hecho de que son células residentes en la piel, regulan no sólo reacciones inflamatorias locales, sino que también regulan las respuestas inmunes por su capacidad para presentar el antígeno y para producir un gran número de citoquinas que regulan la inmunidad local. Estos macrófagos también están implicados en comunicaciones con el sistema circulatorio que puede, si fuera apropiado, movilizar diferentes tipos celulares (monocitos, neutrófilos, eosinófilos y linfocitos T), aumentando de este modo la potencia defensiva específica y no específica del tejido en consideración.

Las actividades de los productos de ensayo se investigan por lo tanto, con respecto a cultivos de macrófagos y queratinocitos humanos que se estimulan o no, por interferón-\gamma + lipopolisacárido (inflamación no específica) o mediante IL-4 (inflamación alérgica). Este tipo de estimulación sitúa las células en el contexto de una respuesta pro-oxidante (generación de NO o radicales libres de anión superóxido, que puede evaluarse midiendo la producción de derivados de nitrógeno) y una respuesta inmuno-inflamatoria (producción de citoquinas tales como TNF-\alpha).

Para evaluar la inflamación alérgica, las células se activan por IL-4, que induce al receptor CD23, y después por complejos inmunes que contienen IgE. En todos los casos, los sobrenadantes celulares se analizan después de la activación.

Se realiza además, un estudio de variabilidad sobre las células.

La actividad de los componentes se confirma también en cultivos linfo-epidérmicos mezclados (MLEC).

En la piel, las células de Langherans de hecho juegan un papel esencial en presencia del antígeno, y los queratinocitos generan factores que están implicados en la respuesta inmune, constituyendo por tanto un sistema inmune cutáneo. Los MLEC hacen posible determinar las propiedades inmunomoduladoras de sustancias, midiendo la proliferación de linfocitos inducida por las células epidérmicas alogénicas que presentan el antígeno, con o sin tratamiento por la sustancia.

Los resultados obtenidos con ginkgo y \beta-glucano se resumen en la tabla a continuación:

Actividad	Mediador o parámetro	Ginkgo biloba	\beta-Glucano
Anti-inflamatoria	\bullet LTB_{1}	inhibición	sin efecto
	\bullet PGE_{2}	sin efecto	inhibición
	\bullet IL-1\alpha	sin efecto	inhibición
	\bullet TNF-\alpha	sin efecto	inhibición
Anti-radicales libres	\bullet peroxidación de los lípidos	inhibición	sin efecto
	\bullet NO	inhibición	inhibición
	\bullet catalasa	sin efecto	estimulación
	\bullet glutatión peroxidasa	estimulación	estimulación
Anti-alérgica	\bullet MLEC	Inhibición	sin efecto

Las composiciones de acuerdo con la invención contienen en particular del 0,001% al 10% p/p de un extracto de ginkgo y preferiblemente del 0,05 al 2%; de acuerdo con una de las realizaciones, la concentración de extracto de ginkgo será de aproximadamente el 0,1 al 0,5% pero se ajustará por la persona especialista en la técnica.

Las concentraciones de \beta-glucano, en particular \beta-glucano carboximetilado, que son adecuadas para la puesta en práctica de la invención están dentro del intervalo del 0,001% al 10% p/p total de la composición.

La combinación de las sustancias constituye un complejo hipoalergénico activo, que preferiblemente disminuye la síntesis o la expresión de los neuromediadores, tales como VIP, PGP 9.5 o CGRP, que están en correlación con la llamada piel "sensible" o irritable.

Otro objeto de la invención es un método para el tratamiento cosmético de piel sensible que comprende la aplicación a la piel del cuerpo o de la cara, una o varias veces por día, de complejos hipoalergénicos activos y/o composiciones como se han definido anteriormente.

En particular, la invención se refiere a un método para el tratamiento de alopecia que comprende la aplicación al cuero cabelludo una vez por semana, dos veces por semana, diariamente o dos veces al día de una combinación de los componentes. Las combinaciones pueden estar en diferentes formulaciones, tales como champús o lociones, que pueden aplicarse simultáneamente, por separado o secuencialmente, opcionalmente con otros principios activos que son activos con respecto a alopecia, afecciones de caspa y/o afecciones seborreicas.

Otro de los objetos de la invención es el uso de un complejo hipoalergénico como se ha definido anteriormente para la preparación de un medicamento inmunomodulador, en particular pretendido para el tratamiento de una dolencia elegida entre atopia, psoriasis, eritema multiforme, xerodermatitis, lupus eritematoso, pénfigo, dermatitis rosácea, acne, eccemas y neurodermatitis.

Las combinaciones hipoalergénicas de acuerdo con la invención, se formularán ventajosamente dentro de composiciones que también contengan agentes hidratantes y/o agentes que mejoren la penetración cutánea, lo que promoverá la actividad del complejo de acuerdo con la invención. Pueden mencionarse, a modo de ejemplos, urea, propilenglicol o ácido oleico, siendo capaz la persona especialista en la técnica de usar otros promotores de penetración adecuados al tipo de formulación.

Las composiciones de acuerdo con la invención contendrán además excipientes farmacéuticamente y/o cosmetológicamente aceptables conocidos para la persona especialista en la técnica, adecuados para su formulación, en particular en forma de soluciones, lociones, cremas, champús, emulsiones, y similares.

Pueden mencionarse, de modo no limitante, pigmentos, tintes, conservantes, agentes texturizantes, espesantes, emulsionantes o fragancias. También pueden contener agentes de protección solar o bloqueantes de otro principio activo.

Finalmente, los complejos hipoalergénicos que contienen las combinaciones de acuerdo con la invención, pueden introducirse en composiciones que contengan al menos un principio activo mediante la vía tópica, en particular cuando este principio activo es capaz de causar una reacción cutánea.

Pueden mencionarse más particularmente, entre dichos principios activos, retinoides y agentes activos despigmentantes.

Se entiende por retinoides en particular ácido retinoico o tretinoina, retinol, retinaldehídos, sus sales y sus ésteres. El metal alcalino, amonio y sales de amonio C_{2}-C_{30} son sales típicas. Se prefieren particularmente las sales de sodio, potasio, trietanolamonio y amonio. Las combinaciones de todos los compuestos anteriores pueden estar presentes en las composiciones. Además, debe entenderse que las expresiones "retinol" y "ácido retinoico", incluyen los isómeros hidrogenados y no hidrogenados, tales como 9-cis-retinol, dideshidroretinol, ácido 13-cis-retinoico, ácido 13-trans-retinoico y ácido dideshidroretinoico.

Los agentes despigmentantes comprenden, por ejemplo, ácido kójico, hidroquinona, vitamina C, fosfato de magnesio de vitamina C, carotenoides, arbutina, y similares.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención.

En estos ejemplos, se hará referencia a las siguientes figuras:

Figura 1: efecto de dosis de carboximetil-\beta-glucano con respecto a las funciones inflamatorias de los queratinoci-
tos.

Figura 2: sinergia entre un extracto de Ginkgo biloba (H37) y carboximetil-\beta-glucano (K18) en sus funciones anti-inflamatorias con respecto a queratinocitos.

Ejemplo 1 1. Materiales y Métodos Productos

Se usaron los siguientes productos durante este estudio: LPS (lipopolisacáridos) de Escherichia coli (Sigma), usados a 1 \mug/ml. IFN-\gamma e IL-4 proceden de Immugenex (Los Angeles CA) y se usan respectivamente a 1000 U/ml y 10 ng/ml, las IgE monoclonales proceden de Stallergène (Fresnes, Francia) y las anti-IgE son de Nordic (Tilburg, Holanda).

Cultivo de queratinocitos

Los cultivos primarios de queratinocitos se obtienen de prepucios de neonatos y se mantienen en proliferación ex vivo en un medio que no contiene suero de ternero. Los cultivos de queratinocitos confluyentes se tripsinizan y se transfieren a placas de 24 pocillos en medio fresco a la densidad celular de 10^{5} células/ml/pocillo. Si fuera apropiado, en el caso de estimulación por IL-4, la presencia del receptor de IgE (CD23) en la superficie de las células se verifica por inmunomarcado.

Cultivo de macrófagos

Las células de macrófago se obtienen de la sangre periférica de donantes normales (no alérgicos). Las células mononucleares se aíslan de un gradiente de ficoll y el anillo de células linfoides se recupera y se lava tres veces y las células se cultivan después para causar la adherencia de las células de macrófago. Estas células se recuperan después de adherirse durante 1 hora y se cultivan (10^{6} células/ml/pocillo). Si fuera apropiado, en el caso de estimulación por IL-4, la presencia del receptor de IgE (CD23) en la superficie de las células se verifica por inmunomarcado.

Activación de células

Las células se activan mediante la combinación de IFN-\gamma y LPS durante de 3 a 4 días y los sobrenadantes de estos cultivos se recuperan después para determinar cuantitativamente los derivados de nitrógeno y TNF-\alpha. Asimismo, durante la estimulación por IgE, las células se activan primero mediante IL-4, para inducir al CD23, y se cultivan y estimulan posteriormente por los complejos inmunes que contienen IgE durante de 3 a 5 días antes de recuperar los diferentes sobrenadantes. En todos los casos, la viabilidad celular se consigue al término de estos cultivos. En el caso específico de macrófagos, se realizó un estudio de viabilidad a largo plazo (7 a 12 días), para determinar los efectos protectores de estos productos. La determinación cuantitativa de los derivados de nitrógeno se realiza usando el enfoque de Griess y el nivel de TNF se mide usando kits de determinación cuantitativa de Medgénix (Fleurus, Bélgica).

2. Resultados 2.1. Efecto de un extracto de Ginkgo biloba sobre los queratinocitos y los macrófagos estimulados por IFN-\gamma + LPS

Las hojas secas de Ginkgo biloba se sometieron a extracción continua mediante una mezcla de acetona/agua al vacío y después varias etapas de retirada del disolvente así como de clorofila, lípidos, ceras, lectinas y de ciertas sustancias dan como resultado un extracto posteriormente denotado por H37.

Existe en forma de un polvo fino que corresponde a las siguientes especificaciones:

- solventes residuales

\bullet etanol: < 3%

\bullet acetona: < 0,1%

\bullet butanol: < 0,1%

\bullet acetato de etilo: < 0,1%

- ceniza sulfatada: < 1,5%

- contenido de agua: < 3%

- pro-antocianidinas: < 5%

- terpenos: < 0,5%

- ácido ginkgólico: < 10 ppm

- metales pesados: < 20 ppm

- heterósidos de flavona: 32 \pm 3%

Esto es al 6% (p/p) soluble en PEG (polietilenglicol) 400 y al 4% (p/v) soluble en etanol de 90º.

En este estudio, el producto H37 (10 mg/ml) se añade 30 min antes de la estimulación por IFN-\gamma + LPS. Este producto no mostró actividad citotóxica.

TABLA 1A Producción de derivados nitro (NO_{2}^{-} \muM) después de la estimulación por IFN-\gamma + LPS +/- 10 mg/ml de H37

Células		Expt-1	Expt-2	Expt-3	Expt-4
Macrófagos		11(5)	11(5)	5(3)	2(9)
	+H37	7(4)	8(4)	2(2)	2(2)
Queratinocitos		12(15)	17(3)	23(12)	13(5)
	+H37	7(6)	7(3)	8(11)	6(4)
Los valores entre paréntesis son los de células que no han sido estimuladas por IFN-\gamma + LPS

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TABLA 1B Producción de TNF (pg/ml) después de la estimulación por IFN-\gamma + LPS +/- 10 mg/ml de H37

Células		Expt-1	Expt-2	Expt-3	Expt-4
Macrófagos		755(ND)	1250(155)	998(55)	1510(ND)
	+H37	605(ND)	1120(75)	895(50)	1315(ND)
Queratinocitos		187(ND)	173(ND)	208(ND)	135(ND)
	+H37	168(ND)	165(ND)	112(ND)	105(ND)
\begin{minipage}[t]{157mm}Los valores entre paréntesis son los de células que no han sido estimuladas por IFN-\gamma + LPS, ND = no detectable.\end{minipage}

Por estos experimentos, parece que los macrófagos estimulados por IFN-\gamma + LPS no producen derivados nitro a un grado significativo, mientras que los queratinocitos los producen de forma reproductiva. De hecho, se ha demostrado recientemente que, durante dicha estimulación, los macrófagos producen una NO sintasa truncada que pudo tener una significativa disminución en su actividad, lo que, aparentemente, no es el caso de los queratinocitos.

En los queratinocitos, el H37 inhibe la producción de NO después de la estimulación.

El producto H37 muestra una ligera actividad "anti-inflamatoria". Es más, evaluando el efecto de dosis de H37 sobre esta producción por los queratinocitos, se demuestra que el máximo efecto se observa a 10 mg/ml.

Además, el H37 protege a las células de macrófago de la muerte celular inducida por productos de radicales. El hecho de que los macrófagos estimulados no producen cantidades significativas de derivados nitro, no excluye el hecho de que estas células no están sometidas a un choque oxidativo que puede dar como resultado la muerte celular.

Esto se objetiviza mediante comparaciones de los efectos sobre la viabilidad celular a largo plazo en 10 días o con los cultivos a corto plazo (2 días). Parece que H37, a 10 mg/ml, protege a los macrófagos de la muerte celular inducida la mayor parte del tiempo por los productos de radicales.

TABLA 2 Efecto de H37 sobre la viabilidad de los macrófagos

Macrófagos + IFN/LPS	% de células viables en el día 2	% de células viables en el día 10
Medio	85 \pm 2	55 \pm 7
+H37	88 \pm 3	80 \pm 2

2.2 Efecto del producto H37 sobre los macrófagos y los queratinocitos estimulados por IL-4

Las células se estimulan durante 48 horas en presencia de IL-4 (10 ng/ml), para inducir al receptor con una baja afinidad para las IgE (CD23) en su superficie. Al término de este periodo de cultivo, del 30 al 80% de los queratinocitos y de los macrófagos expresan CD23. Las variaciones individuales no son en ningún caso el reflejo de una situación alérgica diferente entre estos individuos. Sea cual sea la situación, en esta fase de inducción, el producto ensayado no modifica esta inducción de CD23. De hecho, una disminución de menos del 5% no puede observarse (n = 8).

TABLA 3 Inducción de la expresión de CD23 por las diferentes células estimuladas por IL-4 en presencia o en ausencia de 10 mg/ml de H37

Células	Medio	+ IL-4
Macrófagos	< 5%	45 +/- 4
+H37	< 5%	41 +/- 2
Queratinocitos	ND	55 +/- 7
+H37	ND	51 +/- 4
\begin{minipage}[t]{157mm}Las células se estimulan durante 48 h en presencia o en ausencia de 10 ng/ml de IL-4 y en presencia o en ausencia de los diferentes productos, ND = no detectable.\end{minipage}

Después de que el CD23 se ha tomado por inmunocomplejos que contienen IgE, se induce la producción de una gran cantidad de mediadores y citoquinas (en particular TNF) y de productos resultantes del metabolismo oxidativo, tales como derivados de nitrógeno. Esta estimulación redefine in vitro una reacción inflamatoria de tipo alérgico.

En este caso, los resultados observados son a todo respecto comparables con los obtenidos con IFN-\gamma y LPS, lo que tiende a demostrar que H37 muestra ciertas actividades anti-inflamatorias (no específicas y alérgicas), probablemente mediante su capacidad para regular las capacidades oxidantes de las células "inflamadas". Los resultados obtenidos se resumen en las siguientes dos tablas:

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TABLA 4A Producción de derivados nitro (NO_{2}^{-} \muM) después de la estimulación por IL-4 +/- 10 mg/ml de H37

Células		Expt-1	Expt-2	Expt-3	Expt-4
Macrófagos		25(5)	30(2)	55(11)	15(2)
	+H37	15(2)	17(75)	21(50)	6(2)
Queratinocitos		17(13)	13(3)	23(12)	13(5)
	+H37	12(11)	8(2)	10(10)	8(6)
\begin{minipage}[t]{157mm}Los valores entre paréntesis son los de células que no han sido estimuladas por los inmunocomplejos que contienen IgE.\end{minipage}

El producto H37 muestra una buena capacidad para inhibir la producción de derivados nitro por los macrófagos y los queratinocitos estimulados por IL-4.

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TABLA 4B Producción de TNF (pg/ml) después de la estimulación por IL-4 +/- 10 mg/ml de H37

Células		Expt-1	Expt-2	Expt-3	Expt-4
Macrófagos		975(105)	275(35)	455(40)	310(89)
	+H37	850(105)	215(25)	365(35)	275(87)
Queratinocitos		185(ND)	158(ND)	315(35)	308(ND)
	+H37	155(ND)	120(ND)	245(30)	276(ND)
\begin{minipage}[t]{157mm}Los valores entre paréntesis son los de células que no han sido estimuladas por inmunocomplejos que contienen IgE, ND = no detectable.\end{minipage}

El producto H37 induce una ligera disminución en la producción de TNF-\alpha por los macrófagos y queratinocitos estimulados por IL-4.

Mientras dura la estimulación no específica, parece que H37 aumenta la viabilidad a largo plazo de los macrófagos y de los queratinocitos estimulados por los inmunocomplejos que contienen IgE, lo que, de nuevo, sugiere muy fuertemente que el producto H37 ejerce su ligera actividad anti-inflamatoria mediante una actividad anti-oxidante con respecto a las células diana.

Por lo tanto, parece que el producto H37 muestra una actividad anti-inflamatoria (alérgica o no alérgica). Esta característica es muy importante porque la gravedad de las respuestas inflamatorias, ya sean o no de origen alérgico, resultan de un desequilibrio en el metabolismo oxidativo de estas células. Es este desequilibrio en particular, la fuente, al menos en parte, de la regulación de los fenómenos inmunológicos asociados con estas reacciones: este ese el caso para reacciones alérgenas específicas y para la producción de citoquinas.

2.3. Efecto de los productos K17 y K18 sobre los queratinocitos y los macrófagos estimulados por IFN-\gamma + LPS

La drielina se denota por K17. La drielina es una poli-\beta(1\rightarrow3)-glucopiranosa purificada de membranas de levadura Saccharomyces cerevisiae; está en solución en una mezcla de agua/sorbitol.

El carboximetil-\beta-glucano (vendido con el nombre comercial CM Glucan® por la compañía Arnaud) se denota por K18.

En este estudio, los productos (10 mg/ml de 1/100 v/v) se añaden 30 min antes de la estimulación por IFN-\gamma + LPS. En ninguno de los casos han mostrado estos productos una actividad citotóxica.

TABLA 5A Producción de derivados nitro (NO_{2}^{-} en \muM) después de la estimulación por IFN-\gamma + LPS +/- 10 mg/ml de los productos K17 y K18

Células		Expt-1	Expt-2	Expt-3	Expt-4
Macrófagos		13(2)	8(5)	9(6)	3(2)
	+K17	5(2)	2(1)	7(1,5)	2(2)
	+K18	6(1)	4(1)	5(1)	1(2)
Queratinocitos		25(2)	28(5)	19(6)	13(2)
	+K17	15(2)	16(1)	15(1)	8(2)
	+K18	13(1)	14(1)	11(1)	7(1)
Los valores entre paréntesis son los de células que no han sido estimuladas por IFN-\gamma + LPS.

Los productos K17 y K18 tienen una alta capacidad para inhibir la producción de derivados nitro por los macrófagos y los queratinocitos estimulados por IFN-\gamma y LPS.

TABLA 5B Producción de TNF (pg/ml) después de la estimulación por IFN-\gamma + LPS +/- ó 10 mg/ml de los productos K17 y K18

Células		Expt-1	Expt-2	Expt-3	Expt-4
Macrófagos		612(ND)	920(155)	903(55)	700(ND)
	+K17	605(ND)	902(95)	970(45)	695(ND)
	+K18	121(ND)	320(125)	512(20)	333(ND)
Queratinocitos		205(ND)	138(ND)	145(ND)	108(ND)
	+K17	125(ND)	98(95)	100(ND)	70(ND)
	+K18	130(ND)	95(ND)	85(ND)	82(ND)
\begin{minipage}[t]{157mm}Los valores entre paréntesis son los de células que no han sido estimuladas por IFN-\gamma + LPS, ND = no detectable.\end{minipage}

La producción de TNF-\alpha por los macrófagos y los queratinocitos estimulados por IFN-\gamma + LPS está afectada también de forma perjudicial en presencia de los diferentes productos de forma comparable con la observada para los derivados nitro. Los productos K17 y K18 inhiben eficazmente la producción de TNF.

2.4. Efecto de los productos K17 y K18 sobre los macrófagos y los queratinocitos estimulados por IL-4

Las células se estimulan durante 48 h en presencia de IL-4 (10 mg/ml), para inducir al receptor con una baja afinidad por las IgE (CD23) en su superficie. Al término de este periodo de cultivo, del 30 al 80% de los queratinocitos y de los macrófagos expresan CD23. Las variaciones individuales no son en ningún caso el reflejo de una situación alérgica diferente entre estos individuos. Sea cual sea la situación, en esta fase de inducción, ninguno de los productos ensayados modifica esta inducción de CD23; de hecho, una disminución de menos del 5% no puede observarse (n = 8).

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TABLA 6A Producción de derivados nitro (NO_{2}^{-} en \muM) después de la estimulación por inmunocomplejos que contienen IgE (IL-4) +/- 10 mg/ml de los productos K17 y K18

Células		Expt-1	Expt-2	Expt-3	Expt-4
Macrófagos		15(5)	18(3)	25(11)	27(3)
	+K17	16(3)	17(6)	19(7)	30(6)
	+K18	7(2)	6(4)	10(2)	7(2)
Queratinocitos		19(5)	22(1)	13(1)	7(1)
	+K17	16(3)	20(3)	14(2)	7(6)
	+K18	4(2)	7(4)	9(2)	3(2)
\begin{minipage}[t]{157mm}Los valores entre paréntesis son los de células que no han sido estimuladas por inmunocomplejos que contienen IgE.\end{minipage}

El producto K18 muestra una actividad inhibidora sobre la generación de derivados nitro por los queratinocitos y los macrófagos estimulados por IL-4.

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TABLA 6B Producción de TNF (pg/ml) después de la estimulación por IL-4 +/- K17 y K18

Células		Expt-1	Expt-2	Expt-3	Expt-4
Macrófagos		908(78)	135(40)	508(45)	712(58)
	+K17	917(45)	102(41)	510(41)	700(32)
	+K18	524(59)	98(35)	420(32)	333(25)
Queratinocitos		198(31)	105(10)	128(10)	132(15)
	+K17	185(35)	111(31)	120(32)	132(10)
	+K18	95(23)	60(35)	25(12)	35(12)
\begin{minipage}[t]{157mm}Los valores entre paréntesis son los de células que no han sido estimuladas por inmunocomplejos que contienen IgE, ND = no detectable.\end{minipage}

El producto K18 muestra una actividad inhibidora sobre la generación de TNF por los macrófagos y los queratinocitos estimulados por IL-4.

Por lo tanto, parece que K18 posee una actividad anti-inflamatoria no específica y de tipo alérgico, mientras que el producto K17 sólo tiene una actividad anti-inflamatoria no específica.

Por consiguiente, los efectos del producto K18 se evaluaron en función de la dosis. Los resultados se ilustran en la Figura 1.

K18 por lo tanto inhibe, de forma dependiente de la dosis, la generación de derivados nitro y también de TNF. Los resultados obtenidos de este modo demuestran que K18 muestra una actividad anti-inflamatoria generalmente ventajosa y que esta actividad es similar a la de H37.

Ejemplo 2 Demostración de una sinergia de actividad entre CM-\beta-glucano (K18) y extracto de ginkgo (H37)

Las actividades anti-inflamatorias de K18 y H37 y de su combinación se determinan respectivamente.

Los ensayos se realizan en un modelo de queratinocitos, como se ha indicado en el Ejemplo 1 (Materiales y Métodos) después de la estimulación, por un lado, por una combinación de un IFN-\gamma + LPS y, por otro lado, por inmunocomplejos que contienen IL-4 e IgE.

Como se muestra en la Figura 2, los productos K18 y H37 actúan en sinergia en sus funciones anti-inflamatorias.

Debe recordarse que esta actividad anti-inflamatoria cubre la actividad anti-inflamatoria no específica y alérgica.

Ejemplo 3 Análisis de la prevención de cambios cutáneos perjudiciales obtenidos mediante irradiación de piel humana con UV A y UV B

Se producen cultivos de órganos de acuerdo con el siguiente protocolo. 10 fragmentos de piel de diferentes donantes (fuente: cirugía plástica) se colocan en insertos que se posicionan ellos mismos sobre pocillos de cultivo. El medio de cultivo (antibióticos, FCS) se añade al fondo de los pocillos, consiguiéndose el paso entre los dos compartimentos por difusión lenta mediante una membrana porosa (0,45 \mum).

Antes de cada irradiación, se deposita cada crema cosmética (2 mg/cm^{2}) directamente sobre la piel durante 2 horas (en paralelo se analizarán pieles de control sin tratamiento). Las 3 cremas y los excipientes se renuevan tres veces por semana sobre las pieles:

- crema 1: CM-glucano al 0,5%

- crema 2: Ginkgo biloba al 0,05%

- crema 3: CM-glucano + extracto de Ginkgo biloba (H37)

- crema 4: excipiente (placebo Carbopol)

Después de retirar la crema sobrante, la piel se irradia entonces con 12 J/cm^{2} de UV A y 6 J/cm^{2} de UV B (lámpara T40M de Vilber Lourmat), equivalente a 20 DEM, dosis determinadas mediante un estudio preliminar que hizo posible obtener rápidamente lesiones al nivel de la epidermis y dermis con, en particular, cambios perjudiciales en el colágeno y las fibras elásticas. Estas dosis son, además, equivalentes a las dosis usadas para los ensayos de fotoparche y a las dosis usadas en modelos de ratón sin pelo para generar células quemadas por el sol.

La irradiación se realiza cada dos días. Se realizan tres sesiones de exposición y después se recogen los fragmentos de piel para los siguientes análisis.

La producción de derivados de oxígeno, tales como óxido nítrico (NO) muestra agresiones por radiación UV.

La posible protección prestada por las cremas se cuantificará evaluando la disminución en la cantidad de nitritos y el aumento en SOD.

1) Determinación cuantitativa de óxido nítrico y de nitritos

El óxido nítrico, NO, es un mediador fisiológico importante, no sólo como vasodilatador y neurotransmisor sino también como agente pro-inflamatorio. Su síntesis se media por una enzima, NO sintasa, que se expresa por muchos tipos de células y en particular queratinocitos, cuando están activados.

El NO, obtenido mediante la oxidación de L-arginina por NO sintasa, es un producto inestable que se degrada rápidamente a nitritos (NO_{2}^{-}) y nitratos (NO_{3}^{-}). Esta es la determinación cuantitativa espectrofotométrica de los nitritos en el sobrenadante del cultivo en presencia de reactivo de Griess que revela la actividad de NO sintasa.

Los resultados se notifican en la tabla a continuación.

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Determinación cuantitativa de los nitritos
	(nmol/ml)	% de protección

Piel tratada con crema 1	21,6 \pm 7,3	14,7% \pm 8,2
Piel tratada con crema 2	21,4 \pm 3,6	13,5% \pm 5,8
Piel tratada con crema 3	16,4 \pm 2,9\cdot	33,8% \pm 2,3\cdot
Piel tratada con crema 4	24,9 \pm 5,3

\cdot Resultado estadísticamente significativo (p< 0,05; Ensayo de Student)

El porcentaje de protección se calculó de la siguiente manera: (A-B/A) x 100, donde A es el resultado con la crema número 4 y B el resultado con la crema 1, 2 o 3.

Las pieles tratadas con las cremas 1 y 2 muestran una ligera disminución (no significativa) en la producción de nitritos. La mayor disminución se obtiene con las pieles tratadas con la crema 3, una diferencia que es estadísticamente significativa con respecto al excipiente. El cálculo del porcentaje de protección confirma estos resultados, teniendo la crema 3 en particular una protección del 34%.

2) Determinación cuantitativa de SOD

La agresión por la radiación UV se refleja mediante una disminución en el nivel de SOD.

La actividad de superóxido dismutasa se determina mediante la técnica de McCord y Fridovich. En resumen, se generan aniones de superóxido por la acción de la xantina oxidasa sobre la xantina. La SOD presente en las muestras puede después inhibir la reducción del citocromo C por estos aniones de superóxido. La actividad de la SOD se relaciona con la cantidad de citocromo C reducido que permanece en el medio de reacción.

Los resultados se expresan por porcentajes de inhibición con respecto al excipiente (crema Nº 4). La SOD hidroliza una parte de los radicales libres generados por la agresión de UV, y el sistema xantina/xantina oxidasa. Por tanto, la disminución de la densidad óptica (proporcional a la cantidad de radicales libres) hará posible cuantificar directamente el nivel de SOD.

Determinación cuantitativa de SOD
	% de inhibición

Piel tratada con crema 1	11,1% \pm 3,4
Piel tratada con crema 2	7,04% \pm 2,9
Piel tratada con crema 3	15,1% \pm 3,3\cdot

\cdot Resultado estadísticamente significativo (p< 0,05: Ensayo de Student)

Con respecto al excipiente, las pieles tratadas con las cremas 1 y 2 muestran una ligera protección (no significativa) contra la disminución en la actividad de SOD inducida por radicación UV. Esta protección es mayor con las pieles tratadas con la crema 3, una diferencia que es estadísticamente significativa con respecto al excipiente.

Conclusión

La determinación cuantitativa de los nitritos ha demostrado, para las pieles tratadas con la crema Nº 3, una disminución significativa en su cantidad con respecto al excipiente. Estos resultados hacen posible prever la actividad protectora de la crema Nº 3 con respecto a los cambios dérmicos perjudiciales generados por componentes inflamatorios. Las pieles tratadas con las cremas 1 y 2 solamente tienen una tendencia hacia la protección. Existe por lo tanto una sinergia entre los componentes de la crema Nº 3.

La determinación cuantitativa de SOD parece confirmar este análisis con la protección de pieles tratadas con la crema Nº 3 con respecto a los cambios radicales perjudiciales generados por la radiación U.V.. Las pieles tratadas con las cremas 1 y 2 solamente tienen una tendencia hacia la protección, más marcada en el caso de la crema Nº 1.

Ejemplo 4 Composiciones que contienen combinaciones de acuerdo con la invención A) Formulación con agentes despigmentantes

	%

- Agua	70,965
- Metoxicinamato de octilo	6,000
- Estearato de glicerilo/estearato PEG-100	5,000
- Glicerol	5,000
- Benzoato de alquilo C_{12}-C_{15}	4,000
- Vaselina	1,500
- Palmitato de cetilo	1,000
- Alcohol cetílico	1,000
- Alcohol estearílico	0,500
- Sulfito sódico	0,025
- Disulfito sódico	0,025
- hidroquinona	2,000
- Ácido cítrico	0,150
- Carbómero	0,300
- Acetato de tocoferilo	0,100
- Fenoxietanol	0,730
- Metilparabeno	0,200
- Propilparabeno	0,070
- Hidróxido sódico	0,135
- EDTA disódico	0,200
- \beta-Glucano	1,000
- Extracto de Ginkgo biloba	0,100

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(Tabla pasa a página siguiente)

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B) Formulación con retinol

	%

- Agua	56,42
- Octanoato de cetearilo	9,00
- Metoxicinamato de octilo	8,00
- Lactosa	5,00
- Glicerol	5,00
- Aceite de cacahuete hidrogenado	5,00
- Polimetacrilato de glicerilo	3,45
- Butilmetoxidibenzoilmetano	1,50
- Miristato de isopropilo	1,00
- Lecitina hidrogenada	1,00
- \beta-Glucano	1,00
- Hidróxido de amonio	0,75
- Fenoxietanol	0,73
- Copolímero de acrilato de alquilo C_{10}-C_{30}/acrilatos	0,50
- Poloxámero 407	0,50
- Acetato de tocoferilo	0,50
- Metilparabeno	0,20
- Extracto de Ginkgo biloba	0,10
- Carbómero	0,10
- BHT	0,10
- Propilparabeno	0,07
- Propilenglicol	0,05
- Retinol	0,03
	100,00

c) Formulación con tretinoína

- Tretinoína	0,050 g
- \beta-Glucano	0,500 g
- Extracto de Ginkgo biloba	0,100 g
- Parafina líquida ligera	25,000 g
- Solución de sorbitol al 70 por ciento no cristalizable	5,000 g
- Hidroxiestearato de hidroxioctacosanilo	5,000 g
- Metoximacrogol 22/copolímero de dodecilglicol	5,000 g
- Macrogol 45/copolímero de dodecilglicol	3,000 g
- Estearoxitrimetilsilano y alcohol estearílico	1,000 g
- Dimeticona	1,000 g
- Fragancia	0,250 g
- Para-hidroxibenzoato de metilo	0,200 g
- Edetato sódico	0,100 g
- Cuaternium 15	0,100 g
- Hidroxitolueno butilado	0,100 g
- Monohidrato de ácido cítrico	0,100 g
- Agua purificada	53,495 g

Claims

1. Combinación sinérgica de un extracto de Ginkgo biloba y de \beta-glucano o de uno de sus derivados.

2. Combinación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el \beta-glucano se sustituye por grupos carboximetilo.

3. Combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la concentración de terpenos en el extracto de Ginkgo biloba es menos del 1% p/p de materia seca.

4. Composición dermatológica que contiene la combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, con un excipiente dermatológicamente aceptable.

5. Composición de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque la concentración de extracto de Ginkgo biloba está entre el 0,001% y el 10% p/p.

6. Composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizada porque la concentración de \beta-glucano está entre el 0,001% y el 10% p/p.

7. Composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizada porque contiene adicionalmente al menos un principio activo diferente que es activo por la vía tópica cutánea.

8. Composición de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque contiene al menos un principio activo elegido entre el grupo de retinoide y agentes despigmentantes.

9. La combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 a 8 para uso como un medicamento.

10. La combinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 a 8 para uso como un medicamento para el tratamiento de piel sensible y/o alérgica, para inhibir la síntesis o la expresión de neuromediadores por células cutáneas, para el tratamiento de una dolencia elegida entre atopia, psoriasis, eritema multiforme, xerodermatitis, lupus sistémico eritematoso, pénfigo, dermatitis, rosácea, neurodermatitis y alopecia.

11. Uso de la combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, para la preparación de una composición inmunomoduladora destinada para el tratamiento de una piel sensible y/o alérgica.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque la composición inhibe la síntesis o la expresión de neuromediadores por células cutáneas.

13. Uso de la combinación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 para la preparación de un medicamento destinado para el tratamiento de una dolencia elegida entre atopia, psoriasis, eritema multiforme, xerodermatitis, lupus sistémico eritematoso, pénfigo, dermatitis, rosácea, neurodermatitis y alopecia.