ES2262177T3

ES2262177T3 - Proteinas de union a colina para vacunas frente a neumococos.

Info

Publication number: ES2262177T3
Application number: ES97922539T
Authority: ES
Inventors: H.Robert Masure; Carsten I. Rosenow; Elaine Tuomanen; Theresa M. Wizeman
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2017-05-01
Also published as: EP0912608A2; JP2000511411A; AU2818297A; ATE323721T1; DE69735715D1; WO1997041151A2; CA2253252A1; AU732520B2; EP0912608B1; DE69735715T2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A PROTEINAS BACTERIANAS DE UNION DE COLINAS (CBPS) QUE UNEN COLINAS. TALES PROTEINAS SON PARTICULARMENTE ADECUADAS PARA VACUNAS CONTRA CEPAS APROPIADAS DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS, EN PARTICULAR ESTREPTOCOCOS, Y MAS EN PARTICULAR NEUMOCOCOS. TAMBIEN SE PRESENTAN SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN LAS PROTEINAS BACTERIANAS DE UNION DE COLINAS O FRAGMENTOS DE LAS MISMAS, ANTICUERPOS A LAS PROTEINAS BACTERIANAS DE UNION DE COLINAS, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN LAS PROTEINAS BACTERIANAS DE UNION DE COLINAS, ANTICUERPOS A LAS PROTEINAS BACTERIANAS DE UNION DE COLINAS PARA SU USO EN UNA INMUNIZACION PASIVA, E INHIBIDORES DE MOLECULAS PEQUEÑAS DE UNA ADHESION EN LA QUE INTERVIENEN MOLECULAS DE UNION DE COLINAS. TAMBIEN SE PRESENTAN PROCEDIMIENTOS PARA DIAGNOSTICAR LA PRESENCIA DE PROTEINAS BACTERIANAS DE UNION DE COLINAS, O DE LA BACTERIA. EN UNA REALIZACION ESPECIFICA DE LA INVENCION, UNA PROTEINA ESTREPTOCAL DE UNION DE COLINAS ES LA ENOLASA, QUE HA DEMOSTRADO POSEER UNA FUERTE AFINIDAD A LA FIBRONECTINA.

Description

Proteínas de unión a colina para vacunas frente a neumococos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a proteínas de unión a colina, procedimientos para aislar las proteínas de unión a colina y los genes que codifican estas proteínas. La invención también se refiere a vacunas acelulares para proporcionar protección frente a una infección bacteriana usando estas proteínas, y a anticuerpos frente a estas proteínas para su uso en diagnóstico e inmunoterapia pasiva. En particular, las proteínas de unión a colina de la invención son útiles como vacunas frente a neumococos. Cuando una proteína de unión a colina demuestra su actividad como proteína de adhesión, también es útil como inhibidor competitivo de la adhesión bacteriana o para descubrir pequeñas moléculas antagonistas de la adhesión.

Antecedentes de la invención Estrategias de vacunas antibacterianas

Las proteínas exportadas de bacterias participan en muchas funciones celulares diversas y esenciales tales como movilidad, transducción de señales, transporte macromolecular y ensamblaje, y en la adquisición de nutrientes esenciales. En las bacterias patogénicas, muchas proteínas exportadas son determinantes de virulencia que funcionan como adhesiones para colonizar y, de este modo, infectar al huésped, o como toxinas para proteger a las bacterias frente al sistema inmune del huésped [Publicación de patente internacional WO 95/06732, publicada el 9 de marzo de 1995 de Masure y col., para una revisión, véase Hoepelman y Tuomanen, Infect. Immun., 60:1729-33 (1992)]. Sin embargo, otras proteínas exportadas pueden no mediar directamente en la adhesión.

Desde que Jenner desarrolló la vacuna frente a la viruela en el siglo XVIII, la vacunación ha sido un importante armamento en el arsenal frente a los microorganismos infecciosos. Antes de la introducción de los antibióticos, la vacunación era la principal esperanza para proteger a las poblaciones frente a la infección viral o bacteriana. Con la llegada de los antibióticos a principio del siglo XX, la vacunación frente a infecciones bacteriana se volvió mucho menos importante. Sin embargo, la reciente aparición de cepas de bacterias infecciosas resistentes a antibióticos ha dado lugar al reestablecimiento de la importancia de las vacunas antibacterianas.

Una posibilidad de una vacuna antibacteriana es el uso de bacterias muertas o atenuadas. Sin embargo, las vacunas bacterianas completas tienen varias desventajas, incluyendo la posibilidad de una reversión de la bacteria muerta o atenuada a virulenta debido a una muerte o atenuación incompleta y a la inclusión de componentes tóxicos como contaminantes.

Otra vacuna alternativa es inmunizar con la cápsula bacteriana de carbohidratos. Actualmente, las vacunas frente a Streptococcus pneumoniae emplean conjugados compuestos de las cápsulas de los 23 serotipos más comunes de esta bacteria. Estas vacunas no son eficaces en los individuos más susceptibles a la infección patológica (jóvenes, ancianos e inmunodeprimidos) debido a su incapacidad para provocar una respuesta inmune de células T. Un estudio reciente ha mostrado que esta vacuna sólo protege al 50% de estos individuos [Shapiro y col., N. Engl. J. Med. 325:1453-60 (1991)].

Una alternativa a estas vacunas bacterianas completas son las vacunas acelulares o las vacunas de subunidades en las que el antígeno incluye una proteína de la superficie bacteriana. Estas vacunas potencialmente podrían superar las deficiencias de las vacunas bacterianas completas o a base de cápsulas. Además, dada la importancia de las proteínas exportadas en la virulencia bacteriana, estas proteínas son un objetivo importante para la intervención terapéutica. De especial importancia son las proteínas que representan un antígeno común para todas las cepas de una especie de bacteria en particular para su uso en una vacuna que protegería frente a todas las cepas de la bacteria. Sin embargo, hasta la fecha sólo se ha identificado un pequeño número de proteínas exportadas de bacterias Gram positivas y ninguna de estas representa un antígeno común para una especie en particular de bacterias.

Recientemente, se han exportado proteínas de fusión aparente que contiene PhoA en especies de bacterias Gram positivas y Gram negativas (Pearce y Masure, 1992, Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol. 92:127, resumen D-188). Este resumen describe la inserción de ADN de neumococo antes del extremo 5' del gen phoA de E. coli que carece de su secuencia señal y promotora en un vector lanzadera capaz de la expresión tanto en E. coli como en S. pneumoniae, y sugiere que deben encontrarse rutas similares para la translocación de proteínas exportadas a través de las membranas plasmáticas para ambas especies de bacterias.

En estudios previos, el uso de fusiones de genes de traducción aleatoria (mutagénesis de PhoA) para identificar y alterar las proteínas exportadas en Streptococcus pneumoniae proporcionó una comprensión de las probables proteínas exportadas [Pearce y col., Mol. Microbiol., 9: 1037 (1993); publicación de patente internacional Nº WO 95/06732, publicada el 9 de marzo de 1995; solicitud de patente de EE.UU. Nº de serie 08/116.541, presentada el 1 de septiembre de 1993, solicitud de patente de EE.UU. Nº de serie 08/245.511, presentada en 18 de mayo de 1994]. Uniendo esta tecnología de fusión génica con los ensayos de bioactividad para la adherencia de nemococos, el principal objetivo era identificar y caracterizar genéticamente los determinantes inmunogénicos de virulencia de adhesión para las células eucarióticas que definen la relación entre la bacteria y el huésped y, de este modo, sirven como candidatos a vacunas. Se han identificado más de 25 locus que llevan a cabo la adherencia como determinantes de virulencia.

Además, se ha empezado a definir el mecanismo molecular de la patogénesis causada por el neumococo [Cundell, y col., Infect. Immun. 63:2493-2498 (1995); Wizemann, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996); Cundell, y col., J. Cell Biol. S18A:45 (1994); Spellerberg, y col., Mol. Microb. (1996)]. Los resultados de estos esfuerzos muestran que muchos componentes bacterianos participan en un proceso coordinado complejo que causa la enfermedad. Sin embargo, también es aparente que esta estrategia ha producido sólo unos pocos candidatos potenciales para vacuna.

La proteína A de la superficie del neumococo (PspA) destaca en la búsqueda de proteínas exportadas de neumococos que podrían ser objetivos atractivos para una vacuna [véase Yother y col., J. Bacteriol., 174:610 (1992)]. Se ha descrito que PspA es un candidato a vacuna para S. pneumoniae ya que hasta la fecha se ha encontrado en todos los neumococos; la proteína purificada puede usarse para provocar una respuesta inmune protectora en ratones y los anticuerpos frente a la proteína confieren inmunidad pasiva en ratones [Talkington y col., Microb. Pathog. 13:343-355 (1992)]. Sin embargo, se ha demostrado la variabilidad antigénica de PspA entre cepas en la mitad del extremo N-terminal de la proteína, que contiene los epítopes inmunogénicos y que inducen protección (Yother y col., supra). Esta proteína no representa un antígeno común para todas las cepas de S. pneumoniae y, por tanto, no es un candidato óptimo para vacuna.

Proteínas neumocócicas de unión a colina

Estudios previos han demostrado que la PspA, así como otra proteína expuesta en la superficie, la amidasa autolítica LytA, se unen al ácido teicoico (AT), una parte integral de la pared celular de Streptococcus pneumoniae de forma dependiente de colina. AT contiene un único resto de fosforilcolina terminal. PspA, una proteína que tiene un peso molecular de 84 kDa, y que es muy variable, se libera de la superficie celular con alta concentración de colina. Lyt, o autolisina, es una proteína de 36 kDa, que lisa la pared celular del neumococo (autolisis), pero no se libera de la célula cuando se cultiva en concentraciones elevadas de colina, lavando con colina al 10% o cuando se cultiva en etanolamina. Las publicaciones sobre proteínas de unión a colina incluyen las de Sánchez-Puelles y col. Gene 89:69-75 (1990), Briese y Hakenback Eur. J. Biochem. 146:417-427, Yother y White J. of Bacteriol. 176:2976-2985, Sánchez-Beato y col. J. of Bacteriol. 177:1098-1103 y Wren Micro. Review Mol. Microbiol. 5:797-803 (1991).

Se han descrito una diversidad de mecanismos de unión covalentes y no covalentes para proteínas que se expresan en las superficies de bacterias Gram positivas. Algunos estreptococos y Clostridium sp. tienen fosforilcolina como único componente de la pared celular. Esta molécula es el constituyente terminal del ácido teicoico (polisacárido C) y del ácido lipoteicoico (ALT) unido a la pared celular y a la membrana plasmática de estas bacterias. También se ha descrito una familia de proteínas de unión a colina (CBP) que sirven para una diversidad de funciones celulares. Estas proteínas están compuestas de un dominio de actividad en el extremo N- terminal y un dominio repetido de unión a colina característico en el extremo C-terminal que ancla estas moléculas a la superficie de las bacterias. Este motivo se ha identificado en las regiones C-terminales de una glicoproteína secretada de Clostridium acetobutylicum NCIB 88052 [Sánchez-Beato, y col., J. Bacteriol. 177: 1098-1103 (1995)], las toxinas A y B de Clostridium difficile [Von Eichel-Streiber y Sauerborn, Gene 96: 107-13 (1990); Von Eichel-Streiber y col., J. Bacteriol. 174:6707-6710 (1992)], una proteína de unión a glucano de Streptococcus mutans, varias glicosiltransferasas de Streptococcus downei y S. mutans, la mureína hidrolasa (LytA) de neumococos y fagos líticos para neumococos [Ronda y col., Eur. J. Biochem. 164:621-4 (1987); Díaz y col., J. Bacteriol. 174:5516-25 (1992); Romero y col., Microb. Lett. 108:87-92 (1993); Yother y White, J. Bacteriol. 176:2976-85 (1994)], y un antígeno de superficie (PspA) también de neumococos.

Patología de la adherencia neumocócica

S. pneumoniae es una bacteria Gram positiva que es una causa principal de infecciones invasivas tales como sepsis y meningitis [Tuomanen y col., N. Engl. J. Med. 322: 1280-1284 (1995)]. El neumococo coloniza el epitelio nasofaríngeo y luego penetra en el epitelio del pulmón o de la nasofaringe para alcanzar el compartimento vascular. Esta translación implicaría, necesariamente, el paso de un lugar epitelial de la membrana a través de la membrana basal/matriz extracelular subyacente y a través de los endotelios. Se ha demostrado que los neumococos se adhieren a epitelios, endotelios y membrana basal in vitro e in vivo [Plotkowski y col., Am. Rev. Respir. Dis., 134 (1986); Cundell y Tuomanen, Microb Path., 17:361-374 (1994); Cundel y col., Nature, 377:435-438 (1995); van der Flier y col., Infect Immun., 63:4317-4322 (1995)].

La fibronectina es una glicoproteína de mamífero presente como un dímero soluble (peso molecular de 550 kDa) en fluidos corporales tales como plasma (200-700 mg/ml), líquido cefalorraquídeo y líquido amniótico y como un multímero menos soluble en la matriz extracelular y en la membrana basal [Ruoslahti, Ann. Rev. Biochem., 57:375-413 (1988)]. La fibronectina tiene sitios de unión específicos para varias proteínas incluyendo colágeno, integrinas y dos sitios de unión para la heparina. Muchos microorganismos se unen a la fibronectina, incluyendo estreptococos orales y algunas bacterias Gram negativas [Westerlund y Korhonen, Mol. Microbiol., 9:687-694 (1993)]. Estos diversos patógenos se dirigen todos hacia la repetición de tipo 1 del dominio N-terminal de unión a heparina de la fibronectina. Las proteínas de unión a fibronectina relacionadas muestran un motivo de secuencia de aminoácidos en consistencia con la unión a la misma diana de la fibronectina [Westerlund y Korhonen, 1993, supra]. A diferencia de este patrón, se encontró que el Streptococcus pneumoniae se adhiere ávidamente a la fibronectina inmovilizada en el dominio carboxiterminal de unión a heparina [van der Flier y col., Infect Immun., 63:4317-4322 (1995)]. Este dominio de conexión a fibrina tiene varias actividades biológicas. Contiene el dominio principal de unión a proteoglicano (Hep II) y también mantiene la unión de la integrina de leucocitos VLA-4 en dos regiones en el segmento de conexión de tipo III (IIICS) [Wayner y col., Cell. Biol., 109:1321-1330 (1989); Guan y Hynes, Cell, 60:53-61 (1990); Mould y col., J. Biol. Chem., 266:3579-3585(1991)]. El dominio de unión a VLA-4 es distinto del que contiene el motivo RGD de unión a fibronectina mediante VLA-5 [Pierschbacher y col., Cell, 26:259-267 (1981). El segmento IIICS está sometido a un ayuste alternativo y está ausente en algunas formas solubles de fibronectina [Guan y Hynes, 1990, supra].

VLA-4, \alpha4\beta1 (CD49d/CD29), es una integrina presente en linfocitos, monocitos, células musculares y células de melanoma que media en la unión a VCAM-1 en células endoteliales y mioblastos, y al dominio IIICS de la fibronectina en la matriz subentoletial [Osborn y col., Cell, 59:1203-1211 (1989); Mould y col., J. Biol. Chem. 254:4020-4024 (1990); Shimizu y col., Immunological Reviews, 114:109-143 (1990); Rosen y col., Cell, 69:1107-1119 (1992)]. Estas interacciones son importantes durante la infiltración de células mononucleares en los lugares de inflamación, metástasis de células de melanoma y en la miogénesis [McCarthy y col., J. Cell. Biol. 102:179-188 (1986); Osborn y col., 1989, supra; Shimuzu y col., 1990, supra; Rosen y col., 1992, supra]. VLA-4 se dirige hacia una región de 25 aminoácidos (CS1) con el dominio de fibronectina IIICs, una interacción que puede bloquearse con el tripéptido Leu-Asp-Val [Guan and Hynes, 1990, supra; Komoriya y col., J. Biol. Chem. 266:15075-15079 (1991); Mould y col., 1991, supra]. Un motivo IDSP homólogo está presente en el sitio de unión VLA-4 en los dominios I y IV de VACM-1 [Clements y col., J. Cell. Sci., 107:2127-2135 (1994)]. Se ha sugerido que los sitios de unión en VLA-4 para VCAM-1 y fibronectina son distintos pero se superponen [Elices y col., Cell, 50:577-584 (1990); Pulido y col., J. Biol. Chem., 266:10241-10245 (1991); Vonderheide y Springer, J. Exp. Med., 175:1433-1442 (1992); Makarem, J. Biol. Chem. 269:4005-4011(1994)]. La capacidad de los neumococos para dirigirse hacia la región HepII de la fibronectina aumentaba la posibilidad de que estas bacterias reconocieran la región común entre HepII y VCAM-1, y que la unión estuviera mediada por una versión bacteriana de VLA-4. Estas interacciones podrían promover el paso de los neumococos a través de la membrana basal. La importancia de las interacciones VLA-4-VCAM-1 para el tráfico leucocitario al cerebro también sugiere una función en la transmigración de los neumococos al sistema nervioso central en la meningitis.

Por tanto, a la vista de las deficiencias relacionadas mencionadas anteriormente con los procedimientos de la técnica previa de vacunación frente a patógenos bacterianos, debería ser aparente que sigue existiendo una necesidad en la técnica de identificar antígenos proteicos adecuados para su uso como vacunas de subunidad y para su uso en la inducción de anticuerpos adecuados para su uso en inmunización pasiva.

La citación de cualquier referencia en este documento no se debe interpretar como una admisión de que esta referencia está disponible como técnica previa a la invención.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan antígenos de la superficie bacteriana que son adecuados para su uso en la inmunización de animales frente a una infección bacteriana. Más en particular, se proporcionan nuevas proteínas de unión a colina que se pueden obtener de Streptococcus pneumoniae.

En una realización adicional, se proporciona un procedimiento para aislar e identificar estas proteínas de unión a colina y los genes que las codifican.

En su aspecto más amplio, la presente invención se extiende a antígenos superficiales de estreptococos, denominados generalmente en este documento como proteínas de unión a colina, que tiene una o más características seleccionadas entre el grupo compuesto por:

a) inhibir la adherencia de Streptococcus a las células huésped;

b) ser reactivas con los sueros de los pacientes infectados o recuperándose de una infección con la bacteria;

c) ser reactivas con antisueros de conejo generados frente a dicha proteína de unión a colina; y

d) ser marcada con isotiocianato de fluorescencia (FITC) sin el requerimiento de la lisis bacteriana (es decir, en bacterias intactas),

en la que dicha proteína de unión a colina se obtiene de Streptococcus pneumoniae, tiene un peso molecular aparente en SDS-PAGE al 10% de 112 kDa o 50 kDa, y comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las ID SEC Nº 1, 8 a 10, 19, 21 y 25.

En un ejemplo específico, el antígeno de superficie bacteriano se aísla de neumococos.

Aún en un aspecto adicional, la presente invención se extiende a vacunas basada en las proteínas de unión a colina, en la que dichas proteínas de unión a colina tienen un peso molecular aparente en SDS-PAGE al 10% de 112 kDa y comprenden la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las ID SEC Nº 1, 9 a 10, 21 y 25.

En una realización preferida, la invención proporciona una proteína de unión a colina que tiene un alto grado de similitud de secuencia con la enolasa, particularmente la enolasa de B. subtilis.

La presente invención también se refiere a un ácido nucleico aislado, tal como una molécula de ADN recombinante, un gen clonado o una variante degenerada del mismo, que codifican una proteína de unión a colina bacteriana (CBP) de la invención. En particular, la molécula de ácido nucleico, en particular una molécula de ADN recombinante o un gen clonado, codifica una proteína de unión a colina que comprende una secuencia de aminoácido de:

CBP50 casi de longitud completa (ID SEC Nº 19) o ID SEC Nº 25.

En una realización específica, un ácido nucleico de la invención tiene una secuencia de nucleótidos mostrada en la ID SEC Nº 18 desde el nucleótido 1 hasta el codón de terminación TAA o la secuencia de nucleótido como se muestra en la secuencia codificadora de ID SEC Nº 24.

Las secuencias de ADN que codifican las CBP de la presente invención pueden prepararse como sondas para la selección de secuencias complementarias y de clones genómicos en la misma especie o en especies alternas. La presente invención se extiende a sondas preparadas así que pueden proporcionarse para análisis. Por ejemplo, las sondas pueden prepararse con una diversidad de vectores conocidos, tales como el vector del fago \lambda. Estas sondas son útiles para el diagnóstico, por ejemplo, para confirmar una infección bacteriana por una especie o cepa Gram positiva, así como para clonar el ADNc o el gen que codifica las CBP.

La presente invención también incluye CBP que tienen las actividades indicadas en este documento y que presentan las secuencias de aminoácidos mostradas y descritas anteriormente, y seleccionadas entre las ID SEC Nº 1, 8, 9, 10, 19 y 21.

En una realización adicional de la invención, la secuencia de ADN completa de la molécula de ADN recombinante o del gen clonado así determinado puede unirse de forma operativa a una secuencia de control de la expresión que puede introducirse en un huésped apropiado. Por consiguiente, la invención se extiende a huéspedes unicelulares transformados con el gen clonado o con la molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la presente CBP y, más en particular, las secuencias de ADN determinadas a partir de las secuencias mostradas anteriormente y en la ID SEC Nº 18 desde el nucleótido 1 hasta el codón de terminación TAA, o de la región codificadora de la ID SEC Nº 24.

Según otras características preferidas de ciertas realizaciones preferidas de la presente invención, se proporciona un sistema de expresión recombinante para producir CBP biológicamente activas o porciones inmunológicamente reactivas de las mismas.

El concepto de los antígenos de la superficie bacteriana contempla que existen factores específicos para las correspondientes proteínas de unión específica, tales como CBP y similares, como se ha descrito anteriormente. Por consiguiente, la estructura exacta de cada CBP variará de forma comprensible para lograr esta unión a colina y la especificidad de la actividad. Es esta especificidad y la implicación directa de la CBP en la adherencia a la bacteria lo que ofrece la promesa de un amplio espectro de utilidades de diagnóstico y terapia.

La presente invención contempla naturalmente varios medios para la preparación de las CBP, incluyendo las técnicas recombinantes ilustradas en este documento, y la invención, por consiguiente, pretende cubrir estas preparaciones sintéticas dentro de su alcance. El aislamiento del ADN y de las secuencias de aminoácidos descritas en este documento facilita la reproducción de las CBP mediante estas técnicas recombinantes y, por consiguiente, la invención se extiende a vectores de expresión preparados a partir de las secuencias de ADN descritas para la expresión en sistemas huésped mediante técnicas de ADN recombinante y para los huéspedes transformados resultantes.

Una ventaja particular de la presente invención es que proporciona la preparación de cantidades suficientes de CBP para la comercialización de vacunas anti-CBP. Una ventaja adicional es que la invención proporciona la preparación de vacunas multicomponentes que contienen dos o más CBP, ampliando e incrementando de este modo la eficacia potencial de la vacuna. En su primer aspecto, la invención contempla la utilización de las CBP de la invención, independientemente o en combinaciones de dos o más, en vacunas para la protección frente a la infección nemunocócica. Preferiblemente, una vacuna que comprende dos o más CBP adicionalmente comprende PspA, LytA, o ambos. Según la invención, las CBP pueden prepararse de forma recombinante. De forma alternativa, las CBP pueden obtenerse a partir de cultivos bacterianos, por ejemplo, usando los procedimientos de purificación descritos e ilustrados en este documento. En una realización específica, se obtiene una mezcla de CBP de neumococos, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad a colina, y se usan directamente sin purificación adicional en la fabricación de un medicamento para inmunizar un animal y obtener anticuerpos protectores. Esta mezcla de proteínas purificadas mediante afinidad a colina puede obtenerse de bacterias que expresen PspA o que carecen de la expresión de PspA (es decir, bacterias PspA^{-},como se ilustra en este documento).

En otro aspecto, los genes (por ejemplo, ADNc) que codifican una o más CBP de la invención se manipulan genéticamente en un vector transgénico para la expresión en un huésped de mamíferos in vitro, como una vacuna a base de ácido nucleico.

Aún en otra realización, las CBP de la invención se usan para generar anticuerpos para inmunización pasiva, diagnósticos o de selección. En un ejemplo específico, infra, la inmunización pasiva en un modelo murino previene la muerte por infección neumocócica.

La utilidad diagnóstica de la presente invención se extiende al uso de los patrones de unión, principalmente anticuerpos, de las presentes CBP en ensayos para el análisis de la infección bacteriana.

Los anticuerpos frente a las CBP incluyen los obtenidos de forma natural y los anticuerpos preparados de forma recombinante. Estos anticuerpos podrían usarse para analizar las bibliotecas de expresión para obtener el gen o genes que codifican las CBP. Estos pueden incluir tanto anticuerpos policlonales como monoclonales preparados por técnicas genéticas conocidas, así como anticuerpos biespecíficos (quiméricos) y anticuerpos que incluyen otras funcionalidades que los hacen adecuados para un uso diagnóstico adicional junto con su capacidad para modular la adherencia bacteriana.

De este modo, las CBP, sus análogos y/o análogos, y los anticuerpos que puede obtenerse de éstas, son aptos para su uso en conexión con diversas técnicas diagnósticas, incluyendo inmunoensayos, tales como un radioinmunoensayo usando, por ejemplo, un anticuerpo frente a la CBP que se ha marcado mediante la adición de radioactividad o radioyodación.

En un inmunoensayo, puede prepararse una cantidad control de los antagonistas o anticuerpos de los mismos, o se pueden preparar similares y ser marcadas con un enzima, un patrón de unión específico y/o un elemento radioactivo y, a continuación, puede introducirse en una muestra celular. Después de que el material marcado o su patrón(es) de unión han tenido la oportunidad de alcanzar los sitios en la muestra, puede examinarse la masa resultante mediante técnicas conocidas, que pueden variar con la naturaleza del marcador unido.

En caso de que se use un marcador radioactivo, tal como los isótopos ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re, pueden utilizarse procedimientos conocidos de recuento disponibles actualmente. En caso de que el marcador sea una enzima, la detección puede lograrse mediante cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperiométricas o gasométricas conocidas en la técnica utilizadas actualmente.

La presente invención incluye un sistema de ensayo que puede prepararse en forma de un kit de ensayo para el análisis cuantitativo del grado de presencia de la infección bacteriana o para identificar fármacos u otros agentes que puedan mimetizar o bloquear esta infección. El sistema o kit de ensayo puede comprender un componente marcado preparado mediante una de las técnicas radioactivas y/o enzimáticas discutidas en este documento, uniendo un marcador a las CBP, sus agonistas y/o antagonistas y uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales, siendo al menos uno de los cuales un ligando libre o inmovilizado capaz de unirse con el componente marcado, su pareja de unión, uno de los componentes que se van a determinar o su pareja(s) de unión.

En particular, las proteínas CBP cuyas secuencias se presentan en las ID SEC Nº 1, 8 a 10, 19, 21 y 25 de este documento, sus anticuerpos, agonistas, antagonistas o fragmentos activos de las mismas, podrían prepararse en formulaciones farmacéuticas para la administración en casos en los que es apropiada la terapia antibiótica, tal como para tratar o prevenir una infección bacteriana. Estas proteínas libres podrían competir con la función de la CBP bacteriana, interfiriendo, de este modo, con la actividad patológica bacteriana tal como la adhesión.

Por lo tanto, un objetivo principal de la presente invención es proporcionar una CBP y sus subunidades en forma purificada.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar anticuerpos frente a la CBP y sus subunidades, y procedimientos para su preparación, incluyendo medios recombinantes.

Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un procedimiento para detectar la presencia de la CBP y de sus subunidades en mamíferos en los que se sospecha que presentan estados patológicos invasivos, espontáneos o idiopáticos.

Aún otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar medicamentos para el tratamiento de mamíferos para controlar la cantidad o actividad de las bacterias, la CBP o subunidades de la misma, alterando así las consecuencias adversas de esta presencia o la actividad, cuando sea beneficios, potenciar dicha actividad.

Aún un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un medicamento para el tratamiento de mamíferos para controlar la cantidad o actividad de las bacterias o sus subunidades, para tratar o evitar de ese modo las consecuencias adversas de estados patológicos invasivos, espontáneos o idiopáticos.

Aún un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar composiciones farmacéuticas para su uso en procedimientos terapéuticos que comprenden o se basan en la CBP, sus subunidades y su patrón(es) de unión.

Otros objetivos y ventajas serán aparentes para los expertos en la materia a partir de la revisión de la consiguiente descripción que procede en referencia a los siguientes dibujos ilustrativos y descripción detallada de la invención.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Inmunotransferencia de un SDS-PAGE al 6% en el que se han separado las proteínas de la superficie bacteriana. El carril A representa las proteínas de la superficie de LM91 (PspA) marcadas con FITC. El carril B representa las proteínas de la superficie de LM91 marcadas con FITC tras la cromatografía de afinidad a colina. El carril C representa las proteínas de LM91 tras la cromatografía de afinidad a colina (CBRO). "FITC" indica que se usó un anticuerpo (de ratón) anti-FITC. "Convalec." indica que se usa un anticuerpo convaleciente (infección postneumocócica) humano. "CBP" indica que se usó un anticuerpo (de conejo) anti-CBP.

Figura 2. Inmunotransferencia de un SDS-PAGE al 10% como se describe en la Figura 1.

Figura 3. Ensayo de adhesión de PN R6 a las células de pulmón A549.

Figura 4. Ensayo de adhesión de PN R6 a las células (endoteliales) HUVEC.

Figura 5. TÉCNICA ANTERIOR. Representación esquemática de la fibronectina y sus fragmentos.

Figura 6. Adherencia directa de neumococos a fragmentos recombinantes del dominio de unión a heparina II de 33 kDa.

Figura 7. Adherencia directa de neumococos a péptidos sintéticos basados en las regiones de heparina II tipo III Nº 14 y IIICs.

Figura 8. Inhibición de la adherencia de S. pneumoniae mediante colina. Las bacterias se preincubaron con colina, se lavaron las proteínas eluidas y la colina y se evaluó la adhesión bacteriana a la fibronectina.

Figura 9. Inhibición de la adherencia de neumococos a fibronectina mediante un anticuerpo anti-colina, TEPC15.

Figura 10. Comparación de la secuencia aminoterminal de la proteína de 50 kDa con la enolasa de B. subtilis.

Figura 11. Inhibición de la adherencia de neumococos a fibronectina mediante enolasa de levadura (Sigma).

Figura 12. Inhibición de la adherencia de neumococos a fibronectina mediante L-lisina.

Figura 13. SDS-PAGE del eluído de una columna de SEPHAROSE 4B activada con CnBr conjugada con fibronectina (carril A) y enolasa de levadura (Sigma) (carril B). Se aplicó el lisado por prensa de French de S. pneumoniae a la columna de SEPHAROSE-fibronectina. La columna se lavó y las proteínas absorbidas se eluyeron con L-lisina 0,01, 0,1 y 0,5 M. El eluído con lisina 0,5 M se analizó mediante SDS-PAGE con tinción de plata. La proteína eluída tenía un peso molecular aparente comparable al de la enolasa de levadura.

Figura 14. Comparación de la secuencia de ADN del ADN de la proteína de 50 kDa (ID SEC Nº 14) y de la enolasa de B. subtilis (ID SEC Nº 15). Las secuencias tenían una identidad del 74%.

Figura 15. Comparación de la secuencia de aminoácidos deducida para la proteína de 50 kDa (ID SEC Nº 16) y para la enolasa de B. subtilis (ID SEC Nº 17). Estas secuencias tenían una identidad del 72%, con el 85% positiva.

Figura 16. Protección pasiva de ratones frente a la sepsis con el antisuero anti-CBP. (A) ratones CF1 estimulados por vía intraperitoneal con neumococos D39 (tipo 2) a una dosis de 4,5 x 10^{4} (n=10 por grupo; \bullet) u 8,4 x 10^{4} (n=5 por grupo; \blacksquare) en 0,5 ml de PBS. Los grupos experimentales (-) se trataron con 0,5 ml de suero anti-CBP de conejo diluido 1:10 una hora después de la inoculación con bacterias. Los ratones control ( - - ) recibieron suero preinmune. Diariamente se evaluó el porcentaje de supervivencia durante un periodo de seis días. (B) La protección pasiva frente a la estimulación con el serotipo heterólogo SIII (tipo 3; n=5 por grupo; \Box) se realizó como en A con una dosis de 200 ufc. Las bacterias se preincubaron con antisuero (\bullet) durante 30 min antes de la inoculación intraperitoneal. Se tomaron muestras de sangre a las 24 horas para determinar las ufc y se evaluó la supervivencia cada 12 horas durante 72 horas.

Figura 17. Inhibición competitiva de la adherencia de neumococos a células humanas mediante CBP exógenas purificadas. (A) Se preincubaron células de pulmón (CP) de tipo II o (B) células endoteliales (CE) durante 15 min con la preparación de CBP (1 mg/ml), se lavaron e incubaron a continuación con neumococos R6 marcados con FITC. Se usó como control E. coli DH5\alpha. La adherencia se cuantificó por intensidad de fluorescencia. (C) Dependencia de dosis de la capacidad de las CBP para inhibir la adherencia de los neumococos marcados con FITC.

Figura 18. Adherencia del mutante CbpA^{-} a las células humanas y a glicoconjugados. (A) Se activaron monocapas de la línea celular de pulmón (CP) de tipo II, A549 o (B) células endoteliales (CE) de la vena umbilical mediante el tratamiento con TNF\alpha (10 ng/ml durante 2 h) o IL-5 (5 ng/ml durante 4 h) o se dejaron sin tratar (reposo). R6 y el mutante CbpA^{-} se marcaron con fluoresceína y se pusieron sobre las monocapas durante 30 min. Se lavaron las bacterias no adherentes y se cuantificó la adherencia visualmente y se expresó como % del control, es decir, 100% = 498 \pm 81 ó 174 \pm 81 bacterias R6 por 100 CP y CE en reposo, respectivamente. El experimento se realizó 5 veces con 6-8 pocillos por condición. (C) Se recubrieron placas de Terasaki con 6' sialil lactosa (6'SL), lacto-N-neotetraosa (LnNT), N-acetilgalactosamina-\beta1,4-galactosa HSA (GlcNAc-\beta1,4-Gal), N-acetilgalactosamina-\beta1,3-galactosa HSA (GlcNAc\beta1,3-Gal) o HSA a 100 \muM. R6 (barras rellenas) o CbpA^{-} (barras punteadas) se cultivaron hasta una D.O._{620} de 0,4 para todos los experimentos excepto los de 6'SL (D.O._{620} de 0,6). Las bacterias marcadas con fluoresceína se pusieron en los pocillos durante 30 min, los pocillos se lavaron y se contaron visualmente las bacterias adherentes por campos 40x. Los valores se expresan como % del control, es decir 100% = 133 \pm 24 R6 por campo 40x del pocillo de 6'SL, 32 \pm 8, 20 \pm, 15 \pm 4 para 6'SL, LnNT, GlcNAc-\beta1,4-Gal y GlcNAc\beta1,3-Gal, respectivamente. El experimento se realizó 3 veces con 6-12 pocillos por condición.

Figura 19. La contribución de CbpA al transporte de neumococos en crías de rata. Se comparó la capacidad para colonizar la nasofaríngea de ratas de 5 días de edad entre el control de cepas D39 (ralladas), D39 (iga^{-}) (punteada) y una cepa isogénica deficiente para cbpA (relleno). La ordenada indica el tiempo tras la inoculación y la abscisa el número de colonias en los lavados nasales (media \pm DT, n=20 por grupo).

Descripción detallada

Como se apuntó anteriormente, la presente invención se dirige a antígenos de la superficie bacteriana que son adecuados para su uso en la inmunización de animales frente a una infección bacteriana. Más en particular, se proporcionan nuevas proteínas de unión a colina de neumococos. Estas proteínas, que se encuentran en la superficie de neumococos, cuando se formulan con un adyuvante apropiado, se usan en vacunas para la protección frente a neumococos y frente a otras bacterias con reactividad cruzada con las proteínas de unión a colina.

Como se ha descrito previamente, S. pneumoniae se adhiere a la fibronectina en un sitio del dominio carboxilo terminal de unión a heparina II [Flier y col., Infect. Immun. 63:4317 (1995)]. Una extensión de ocho aminoácidos en la repetición de tipo III nº 14 mantiene la adherencia. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la adhesina de neumococos para fibronectina parece ser una proteína de unión a colina de aproximadamente 50 kDa. Esta proteína tiene una homología significativa con la enzima glicolítica enolasa. Por ejemplo, la preincubación de S. pneumoniae con rsVCAM inhibe la adherencia a la fibronectina en el 96% y S. pneumoniae se adhiere directamente a rsVCAM con el 6% de adherencia a la fibronectina completa. Además, los neumococos se unen directamente a un péptido sintético, Fn5, en base a la región de heparina II tipo III nº 14, que tiene la secuencia WQPPRARI (ID SEC Nº 11). El anticuerpo frente a Fn5 inhibe la adherencia de S. pneumoniae a la fibronectina completa en más del 70% (1:100). Los datos que se ilustran en este documento muestran que S. pneumoniae cuando se crece en etanolamina en comparación con colina da lugar a un descenso mayor del 90% en la adherencia. Las preparaciones de CBP inhiben de forma competitiva la adherencia de S. pneumoniae a fibronectina del 75-90%. Un anticuerpo anti-colina inhibe la adherencia de S. pneumoniae a la fibronectina en más del 95% a una dilución de 1:10 al 1:5.000. El tratamiento previo de S. pneumoniae con colina al 10% da lugar a un descenso mayor del 50% en la adherencia a fibronectina.

En una realización específica, una CBP de la invención es un homólogo de la enolasa.

Las posibilidades tanto diagnósticas como terapéuticas que surgen de la existencia de la CBP, derivan del hecho de que la CBP parece participar en la interacción proteína-proteína directa y causal entre las bacterias y su célula huésped. Como se sugirió previamente y se elaboró adicionalmente en este documento, la presente invención contempla la intervención farmacéutica en la reacción de unión en la que está implicada la CBP, para modular la actividad iniciada por la unión de CBP.

En una realización adicional, se proporciona un procedimiento para aislar e identificar proteínas de unión a colina y los genes que las codifican. Más en particular, el aislamiento de los genes que codifican las proteínas de unión a colina de la invención permite la producción recombinante de las proteínas, con un gran aumento de la capacidad para generar vacunas rentables.

Los antígenos de la proteína de unión a colina de la superficie del estreptococo de la invención tienen una o más características seleccionadas entre el grupo compuesto por:

a) inhibir la adherencia de Streptococcus a las células huésped;

b) ser reactivas con los sueros de los pacientes infectados o recuperándose de la infección con la bacteria;

d) ser marcadas con isotiocianato de fluorescencia (FITC) sin el requerimiento de la lisis bacteriana (es decir, en bacterias intactas),

en la que dicha proteína de unión a colina puede obtenerse de Streptococcus pneumoniae, tiene un peso molecular aparente en SDS-PAGE al 10% de 112 kDa o 50 kDa, y comprende la secuencia de aminoácido de una cualquiera de las ID SEC Nº 1, 8 a 10, 19, 21 y 25.

En un ejemplo específico, infra, el antígeno de la superficie del estreptococo puede obtenerse a partir de neumococos mediante cromatografía de afinidad en una columna de colina-agarosa mediante la elución con colina al 10%.

En una realización adicional, ilustrada en este documento, un péptido basado en la región nº 14 de la fibronectina tipo III de unión a heparina II se une al homólogo de la enolasa de estreptococos de la invención. En una realización específica, el péptido es Fn5 que tiene una secuencia de aminoácidos WQPPRARI (ID SEC Nº 11). Los neumococos completos se adhieren a este péptido preparado sintéticamente. De este modo, podría esperarse que el péptido libre inhiba la adherencia a la fibronectina in vivo mediada por enolasa. Además, un anticuerpo específico para este péptido inhibe la adherencia del neumococo a la fibronectina. En una realización específica, un anticuerpo anti-Fn5 inhibe la adherencia de S. pneumoniae a la fibronectina completa en más del 70%.

El término "bacteriano" usado en este documento se refiere a bacterias Gram positivas con proteínas de unión a colina homólogas a las proteínas que se ilustran en este documento. La presente invención se dirige, más en particular, a las CBP de estreptococos y más en particular, a las CBP de neumococos.

Las expresiones "antígeno de la superficie bacteriana (o estreptocócica o neumocócica)", "proteínas de unión a colina (CBP)" y cualquier variante no enumerada específicamente, pueden usarse en este documento de forma indistinta y, como se usa a lo largo de la presente solicitud y de las reivindicaciones, se refieren a material proteico que incluye proteínas sencillas o múltiples, y se extiende a las proteínas que tienen los datos de secuencias de aminoácidos descritas en este documento e identificadas mediante las (ID SEC Nº 1-10, 19 y 20), y el perfil de actividades mostrado en este documento y en las Reivindicaciones. Por consiguiente, se contemplan de igual modo las proteínas que se muestran sustancialmente equivalentes o con actividad alterada. Estas modificaciones pueden ser intencionadas, por ejemplo, tales como las modificaciones obtenidas mediante mutagénesis dirigida a sitio, o pueden ser accidentales, tales como las obtenidas mediante mutaciones en huéspedes que son productores del complejo o sus denominadas subunidades. También, se pretende que se incluyan dentro de su alcance las expresiones "antígeno de superficie bacteriano (o estreptocócico o neumocócico)" y "proteína de unión a colina (CBP)" proteínas específicamente enumeradas en este documento, así como todos los análogos sustancialmente homólogos y variaciones alélicas.

El término "enolasa" se refiere a la enzima 2-fosfo-D-glicerato hidrolasa.

Los restos de aminoácidos descritos en este documento preferiblemente están en la forma isomérica "L". Sin embargo, los restos en la forma isomérica "D" puede ser sustituido por cualquier resto L-aminoácido, siempre que el polipéptido mantenga la propiedad funcional deseada de unión a inmunoglobulina mediante el polipéptido. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino terminal de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo terminal de un polipéptido. Las abreviaturas usadas en este documento mantienen la nomenclatura convencional de polipéptidos, J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969).

Debería destacarse que todas las secuencias de restos de aminoácidos se representan en este documento por la fórmula cuya orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional del extremo amino terminal al carboxilo terminal. Además, debe apreciarse que un guión al principio o al final de una secuencia de restos de aminoácidos indica un péptido unido a una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos.

Purificación de las CBP

El ácido teicoico (AT), una parte integral de la pared celular de Streptococcus pneumoniae contiene un único resto fosforilcolina terminal. Se usaron la cromatografía de afinidad a colina o la Sepharose Mono-Q, muy relacionada con la colina, para purificar las CBP. Es importante apreciar que estas proteínas se purificaron inicialmente a partir de una cepa encapsulada de neumococo que estaba genéticamente modificaba para no producir PspA, una CBP principal. Los esquemas de purificación son los siguientes:

Se incuban bacterias completas con colina-agarosa o con Sepharose Mono-Q.

Las bacterias se lisan con detergente y el material no unido se lava con NaCl 0,5 M.

Las CBP se eluyen con cloruro de colina 0,5 M o con un gradiente lineal de cloruro de colina. Las masas moleculares de las proteínas purificadas mediante estos dos procedimientos se resumen en la Tabla 1 (véase la
Figura 1).

1

Se prefiere la purificación de las CBP a partir de la cromatografía de afinidad a colina, con al menos 9 proteínas con masas moleculares que oscilan de 200 a 40 kDa identificables de esta forma. También se detectó una banda de 37 kDa que con antisueros específicos para esta proteína, se demostró que era LytA. Esta es una CBP bien caracterizada y, de este modo, sirve como control positivo.

Criterios para candidatos a vacunas

Las CPB pueden someterse a una diversidad de ensayos para determinar si son buenos candidatos a vacunas. A continuación se resumen los criterios para el desarrollo de vacunas y las características de las CBP aisladas.

Las CBP deben estar expuestas en la superficie. Las bacterias completas pueden estar marcadas químicamente con FITC (isotiocianato de fluoresceína) y las proteínas marcadas se detectan con un antisuero específico para FITC. (Tabla 1 y Figura 1). Las CBP de 112, 75 y 80, así como LytA, se marcaban eficazmente con FITC, lo que sugiere que estas proteínas están expuestas en la superficie.

Los candidatos a vacunas han de ser inmunogénicos, por tanto, las CBP candidatas han de reaccionar con sueros convalecientes humanos. Las CBP de 112, 75 y 80 daban una señal fuerte con antisueros humanos obtenidos mezclados a partir de individuos en recuperación de una enfermedad neumocócica (Figura 1).

Los candidatos a vacuna deben ser antigénicos. Las CBP de la cromatografía de colina-agarosa se inyectaron en conejos y se analizó la reactividad cruzada en los sueros. Varias proteínas producían una fuerte señal. Destacaron las CBP de 112, 90, 84 y 70, y 50 (Figuras 1 y 2).

Un buen candidato a vacuna puede bloquear la adherencia a receptores celulares diana presentes en el huésped en los sitios críticos de infección. En comparación con los controles, la fracción CBP bloqueaba la adherencia del neumococo a CP el 45% y a CE el 89% de manera dependiente de dosis (Figura 3). En base a estos resultados, probablemente la fracción de CBP contiene adhesinas implicadas en la unión de las bacterias a las células diana eucarióticas. Puede valorarse la contribución de cada una de estas CBP para bloquear las propiedades adhesivas de las bacterias parentales, por ejemplo, para bloquear la unión de los neumococos a células epiteliales (células de pulmón de tipo II), endoteliales (células endoteliales de la vena umbilical humana) y a glicoconjugados inmovilizados que contienen GlcNAc\beta1-4Gal, GlcNAc\beta1-3Gal, GlcNAc u otros azúcares que se ha demostrado son análogos para los receptores eucarióticos.

Ha de apreciarse que no cualquier CBP puede funcionar como adhesina, de forma similar, la actividad de adhesión puede ser una característica colateral de las CBP.

Un candidato preferido a vacuna provocará una respuesta inmune protectora sin variabilidad antigénica entre los serotipos clínicos. Se generarán antisueros (monoclonales o policlonales) para cada CBP para determinar si las CBP nativa y recombinante son inmunogénicas. Los anticuerpos específicos para CBP se usarán para analizar la variabilidad antigénica de los serotipos neumocócicos relevantes.

En un aspecto más preferido, se analizarán los anticuerpos frente a CBP para confirmar que protegen frente a la infección neumocócica, preferiblemente de diversas cepas o serotipos. Por ejemplo, los animales inmunizados pasiva o activamente se estimulan con neumococos en modelos para bacteriemia o colonización, o preferiblemente
ambos.

Otros criterios considerados en la selección de una CBP preferida como candidata a vacuna, incluyen analizar la atenuación de la virulencia de mutantes defectivos para CBP en modelos animales de bacteriemia o la eficacia de colonización solas o en combinación, o conjugadas con un polisacárido capsular. Por ejemplo, datos preliminares muestran que la CBP112 se expresa en bacterias transparentes virulentas, pero esta expresión disminuye en una bacteria opaca no virulenta.

Genes que codifican CBP

Como se indica anteriormente, la presente invención también se refiere a una molécula de ADN recombinante, a un gen clonado, o una variante degenerada de los mismos, que codifica una CBP que comprende una secuencia de aminoácido mostrada en (ID SEC Nº 19 y 25). En un aspecto específico, una molécula de ácido nucleico, en particular una molécula de ADN recombinante o un gen clonado, que codifica la CBP de 50-112 kDa tiene una secuencia de nucleótido mostrada en la ID SEC Nº 18 del nucleótido 1 al codón de terminación TAA o la región codificadora de la ID SEC Nº 24.

De acuerdo con la presente invención pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y recombinación de ADN dentro de la experiencia en la materia. Estas técnicas se explican en detalle en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volúmenes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames y S.J. Higgins ed. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D.Hames y S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, eds. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).

Por lo tanto, si aparecen en este documento, las expresiones siguientes tendrán las definiciones mostradas a continuación.

Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control.

Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN de modo que lleva a la replicación del segmento unido.

Una "molécula de ADN" se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma de cadena única o en una hélice de doble cadena. Este término se refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la molécula y no se limita a ninguna forma terciaria en particular. De este modo, este término incluye ADN de doble cadena encontrado, inter alia, en moléculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. En la descripción de la estructura de las moléculas de ADN de doble cadena en particular, las secuencias pueden describirse en este documento según la convención normal de dar sólo la secuencia en la dirección de 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cepa que tiene una secuencia homóloga al ARNm).

Un "origen de replicación" se refiere a aquellas secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN.

Una "secuencia codificadora" de ADN es una secuencia de ADN de doble cadena que se transcribe y traduce in vivo en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) terminal y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxilo) terminal. Una secuencia codificadora puede incluir, pero sin limitaciones, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintético. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción se localizarán normalmente a 3' de la secuencia de codificadora.

Las secuencias de control de transcripción y traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadoras y similares, que proporciona la expresión de una secuencia codificadora en una célula huésped.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora después del extremo 3' (dirección 3'). Con el propósito de definir la presente invención, la secuencia promotora está unida en su extremo 3' terminal por el sitio de iniciación de transcripción y se extiende antes del extremo 5' (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de la transcripción (definido convenientemente por el mapeo con la nucleasa S1), así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos contendrán a menudo, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores procarióticos contienen secuencias de Shine-Dalgarno además de las secuencias consenso -10 y -35.

Una "secuencia control de expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificadora está "bajo el control" de las secuencias de control de transcripción y traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe a ARNm la secuencia codificadora, que a continuación se traduce a la proteína codificada por la secuencia codificadora.

Puede incluirse una "secuencia señal" antes de la secuencia codificadora. Esta secuencia codifica un péptido señal, en el extremo N-terminal del polipéptido, que comunica a la célula huésped que dirija al polipéptido a la superficie celular o secrete el polipéptido al medio, y este péptido señal es escindido por la célula huésped antes de que la proteína abandone la célula. Las secuencias señal puede encontrarse asociadas con una diversidad de proteínas nativas de procariotas o eucariotas.

El término "oligonucleótido", como se usa en este documento en referencia a la sonda de la presente invención, se define como una molécula compuesta de dos o más ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores que, en definitiva, dependerá de la función última y del uso del oligonucleótido.

El término "cebador" según se usa en este documento se refiere a un oligonucleótido, de origen natural como en un digerido de restricción purificado o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis cuando se induce colocándolo en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador, que es complementario con una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor, tal como una ADN polimerasa y a una temperatura y pH apropiados. El cebador puede ser de cadena sencilla o de cadena doble y debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo la temperatura, origen del cebador y el uso del procedimiento. Por ejemplo, para aplicaciones diagnósticas, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico típicamente contiene 15-25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.

Una secuencia de ADN está "unida de forma operativa" a una secuencia de control de la expresión cuando la secuencia de control de la expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de ADN. La expresión "unido de forma operativa" incluye el tener una secuencia inicial apropiada (por ejemplo, ATG) frente a la secuencia de ADN que va a ser expresada y manteniendo la fase de lectura correcta para permitir la expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la secuencia de control de la expresión y la producción del producto deseado codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desea insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal de inicio apropiada, puede insertarse esta señal de inicio frente al gen.

El término "condiciones de hibridación convencionales" se refiere a las condiciones de sal y temperatura sustancialmente equivalente a 5 x SSC y 65ºC tanto para la hibridación como para el lavado. Sin embargo, un experto en la técnica apreciara que estas "condiciones de hibridación convencionales" dependen de unas condiciones en particular incluyendo la concentración de sodio y magnesio en el tampón, de la longitud y concentración de la secuencia de nucleótidos, porcentaje de apareamientos erróneos, porcentaje de formamida y similares. También es importante en la determinación de las "condiciones de hibridación convencionales" si las dos secuencias que hibridan son ARN-ARN, ADN-ADN o ARN-ADN. Un experto en la técnica determinará fácilmente estas condiciones de hibridación convencionales según una fórmula bien conocida, en la que la hibridación típicamente está 10-20ºC por debajo de la T_{m} predicha o determinada y, si se desea, con lavados de mayor rigurosidad.

Los cebadores de este documento se seleccionan para que sean "sustancialmente" complementarios a cadenas diferentes de una secuencia de ADN diana particular. Esto significa que los cebadores han de ser suficientemente complementarios para hibridar con sus cadenas respectivas. Por lo tanto, la secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento nucleotídico no complementario puede unirse al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador sustancialmente complementaria con la cadena. De forma alternativa, pueden intercalarse en el cebador bases no complementarias o secuencias más largas, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena como para hibridar con esta y formar de ese modo el molde para la síntesis del producto de extensión.

Como se usa en este documento, las expresiones "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a las enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta el ADN de doble cadena en o cerca de una secuencia de nucleótidos específica.

Una célula se ha "transformado" mediante un ADN exógeno o heterólogo cuando se ha introducido este ADN dentro de la célula. El ADN transformante puede o no integrarse (unido covalentemente) en el ADN cromosómico para formar parte del genoma celular. En células procarióticas, de levaduras y de mamíferos por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episomal tal como un plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, una célula transformada estable es aquella en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma, de modo que las células hijas lo heredan a través de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariótica para establecer líneas celulares o clones compuestos por una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un "clon" es una población de células derivadas de una única célula o de un ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de crecer de forma estable in vitro durante muchas generaciones.

Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogos" cuando al menos aproximadamente el 75% (preferiblemente al menos aproximadamente el 80% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90 ó 95%) de los nucleótidos coinciden a lo largo de la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias usando un software convencional disponible en los bancos de datos de secuencias o en un experimento de hibridación genómica en, por ejemplo, condiciones rigurosas como las definidas para ese sistema en particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia en la materia. Véase por ejemplo, Maniatis y col., supra; DNA Cloning, Vol. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Se apreciará que también dentro del alcance de la presente invención están las secuencias de ADN codificadoras de las CBP que codifican para una CBP de la invención, pero que se ha degenerado con un oligonucleótido representado por el gen natural (es decir, nativo) purificado, por ejemplo, de ID SEC Nº 11. Por "degenerado a" se entiende que se usa un codón de tres letras diferente para especificar un aminoácido en particular. Es bien conocido en la técnica que los codones siguientes pueden usarse indistintamente para codificar cada aminoácido específico:

\newpage

Fenilanalina (Phe o F)	UUU o UUC
Leucina (Leu o L)	UUA o UUG o CUU o CUC o CUA o CUG
Isoleucina (Ile o I)	AUU o AUC o AUA
Metionina (Met o M)	AUG
Valina (Val o V)	GUU o GUC o GUA o GUG
Serina (Ser o S)	UCU o UCC o UCA o UCG o AGU o AGC
Prolina (Pro o P)	CCU o CCC o CCA o CCG
Treonina (Thr o T)	ACU o ACC o ACA o ACG
Alanina (Ala o A)	GCU o GCG o GCA o GCC
Tirosina (Tyr o Y)	UAU o UAC
Histidina (His o H)	CAU o CAC
Glutamina (Gln o Q)	CAA o CAG
Asparragina (Asn o N)	AAU o AAC
Lisina (Lys o K)	AAA o AAG
Ácido aspártico (Asp o D)	GAU o GAC
Ácido glutámico (Glu o E)	GAA o GAG
Cisteína (Cys o C)	UGU o UGC
Arginina (Arg o R)	CGU o CGC o CGA o CGG o AGA o AGG
Glicina (Gly o G)	GGU o GGC o GGA o GGG
Codón de terminación	UAA (ocre) o UAG (ámbar) o UGA (ópalo)

Se debe entender que los codones especificados arriba son para secuencias de ARN. Los codones correspondientes para ADN tiene la U sustituida por una T.

Pueden diseñarse oligonucleótidos completamente degenerados en base a la secuencia de aminoácidos que codifica la CBP, teniendo en cuenta los degenerados anteriores. Asimismo, cuando no se conoce con certeza el codón que codifica un aminoácido, por ejemplo, debido a la degeneración del código genético, puede incluirse inosina en la posición desconocida.

Las mutaciones pueden hacerse en un ácido nucleico que codifique una CBP, de modo que un codón en particular se cambia por un codón que codifica un aminoácido diferente. Esta mutación se hace generalmente haciendo el menor número posible de cambios de nucleótido. Una mutación de sustitución de esta clase puede hacer que cambie un aminoácido en la proteína resultante de forma no conservativa (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica en particular por un aminoácido que pertenece a otro grupo) o de forma conservativa (es decir, cambiando el codón de un aminoácido perteneciente a un grupo de aminoácido que tienen un tamaño o característica en particular por un aminoácido perteneciente al mismo grupo). Este cambio conservativo generalmente lleva a un cambio menor en la estructura y función de la proteína resultante. Un cambio no conservativo es más probable que altere la estructura, actividad o función de la proteína resultante. Debe considerarse que la presente invención incluye secuencias que contienen cambios conservativos que no alternan significativamente la actividad o las características de unión de la proteína resultante. Los sustitutos para un aminoácido de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase de aminoácidos a la que pertenece. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras de anillo aromático son fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. No se esperará que estas alteraciones afecten al peso molecular aparente determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida o al punto isoeléctrico.

Las sustituciones particularmente preferidas son:

- Lys por Arg y viceversa de modo que pueda mantenerse la carga positiva.

- Glu por Asp y viceversa de modo que pueda mantenerse la carga negativa.

- Ser por Thr de modo que pueda mantenerse un -OH libre; y

- Gln por Asn de modo que puede mantenerse un NH_{2} libre.

Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente el 70% de los restos de aminoácidos (preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90 ó 95%) son idénticos, o representan sustituciones conservativas.

Una región "heteróloga" de la construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN mayor que no se encuentra asociada con la molécula mayor en la naturaleza. De este modo, cuando heteróloga codifique un gen de mamífero, el gen normalmente estará flanqueado por un ADN que no flanquea al ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo de origen. Otro ejemplo de una secuencia codificadora heteróloga es una construcción donde la secuencia codificadora en sí no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc donde la secuencia codificadora genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes a los del gen nativo). Las variaciones alélicas o los sucesos de mutación naturales no dan lugar a una región heteróloga de ADN según se define en este documento.

La presente invención se extiende a la preparación de oligonucleótidos que pueden usarse para hibridar con ácidos nucleicos que codifican las CBP.

Como se menciona anteriormente, una secuencia de ADN que codifica una CBP puede prepararse sintéticamente antes que por clonación. La secuencia de ADN puede diseñarse con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos de CBP. En general, si la secuencia se va a usar para la expresión, se seleccionarán los codones preferidos para el huésped deseado. La secuencia completa se ensambla a partir de oligonucleótidos solapantes preparados mediante procedimientos convencionales y se ensamblan en una secuencia codificadora completa. Véase, por ejemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair y col., Science, 223: 1299 (1984); Jay y col., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984).

Las secuencias de ADN sintético permiten la construcción conveniente de genes que expresarán análogos de CBP o "muteínas". De forma alternativa, el ADN que codifica muteínas puede hacerse mediante mutagénesis dirigida a sitio de los genes de CBP nativa o de ADNc, y las muteínas pueden hacerse directamente usando la síntesis de polipéptidos convencional.

Un procedimiento general para la incorporación específica de sitio de aminoácidos no naturales en proteínas se describe en Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244:182-188 (Abril 1989). Este procedimiento puede usarse para crear análogos con aminoácidos no naturales.

Producción recombinante de CBP

Otra característica de esta invención es la expresión de las secuencias de ADN descritas en este documento. Como es bien conocido en la técnica, las secuencias de ADN pueden expresarse uniéndolas de forma operativa a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión apropiado y empleando ese vector de expresión para transformar un huésped unicelular apropiado.

Esta unión operativa de una secuencia de ADN de esta invención a una secuencia de control de la expresión, por supuesto, incluye, si no es ya parte de la secuencia de ADN, la provisión de un codón de iniciación, ATG, antes del extremo 5' de la fase de lectura correcta de la secuencia de ADN.

Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones huésped/vector de expresión para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden estar compuestos de segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, plásmidos de E. coli col E1, pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4; fagos de ADN, por ejemplo, los numerosos derivados del fago \lambda, por ejemplo, NM989, y otros fagos de ADN, por ejemplo, M13 y fagos filamentosos de ADN de cadena sencilla; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2 \mu o derivados del mismo; vectores útiles en células eucarióticas, tales como vectores útiles en células de insecto o de mamífero; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y fagos de ADN, tales como plásmidos que se han modificado para emplear ADN de fago u otras secuencias de control de la expresión y similares.

Cualquier secuencia de control de la expresión de una amplia variedad (secuencias que controlan la expresión de una secuencia de ADN unida de forma operativa a ella) puede usarse en estos vectores para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Estas secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos o tardíos de SV40, CMV, vaccinia, polioma o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, las regiones principales del operador y promotor del fago \lambda, las regiones de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa o de otras enzimas glicolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida (por ejemplo, Pho5), los promotores de los factores de apareamiento \alpha de levadura y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos.

También es útil una amplia variedad de células huésped unicelulares para la expresión de las secuencias de ADN de esta invención. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos bien conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos tales como levaduras y células animales, tales como células CHO, R1.1, B-W y L-M, células de riñón de mono verde africano (por ejemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 y BMT10), células de insecto (por ejemplo, Sf9) y células humanas y células vegetales en cultivos tisulares.

Se entenderá que no todos los vectores, secuencias de control de expresión y huésped funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Tampoco los huéspedes funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la materia será capaz de seleccionar los vectores, secuencias de control de expresión y huésped apropiados sin experimentación excesiva para conseguir la expresión deseada sin apartarse del alcance de esta invención. Por ejemplo, cuando se seleccione un vector, deberá considerarse el huésped ya que el vector ha de funcionar en él. También se considerará el número de copias del vector, la capacidad para controlar este número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tales como marcadores de antibióticos.

Para seleccionar una secuencia de control de la expresión, se considerarán normalmente diversos factores. Estos incluyen, por ejemplo, la potencia relativa del sistema, su posibilidad de controlarlo y su compatibilidad con la secuencia de ADN o gen en particular que se va a expresar, especialmente con respecto a estructuras secundarias potenciales. Los huéspedes unicelulares adecuados se seleccionarán mediante la consideración de, por ejemplo, su compatibilidad con el vector elegido, sus características de secreción, su capacidad para plegar las proteínas correctamente y sus requisitos de fermentación, así como la toxicidad para el huésped del producto codificado por las secuencias de ADN que se van a expresar y la facilidad para purificar los productos de expresión.

Considerando estos y otros factores, un experto en la materia será capaz de construir una diversidad de combinaciones de vector/secuencia de expresión/huésped que expresarán las secuencias de ADN de esta invención en fermentación o en cultivos animales a gran escala.

Se desea adicionalmente que los análogos de CBP puedan prepararse a partir de las secuencias de nucleótidos del complejo/subunidad proteica derivada dentro del alcance de la presente invención. Pueden producirse análogos, tales como fragmentos, por ejemplo, por digestión con pepsina de la CBP o del material bacteriano. Otros análogos, tales como las muteínas, pueden producirse mediante mutagénesis dirigida a sitio convencional de secuencias que codifican CBP. Los análogos que exhiben "actividad de unión a colina", tales como moléculas pequeñas, que funcionan como promotores o inhibidores, pueden identificarse por ensayos in vivo y/o in vitro conocidos.

Anticuerpos frente a CPB

Como se apuntó anteriormente, las CBP de la invención, obtenidas mediante la purificación a partir de fuentes bacterianas o de forma recombinante, pueden usarse para generar anticuerpos para diagnóstico y terapia, como se muestra en detalle a continuación. De este modo, las CBP preferidas de la invención son antigénicas, y más preferiblemente, inmunogénicas.

Una molécula es "antigénica" cuando es capaz de interaccionar específicamente con una molécula de reconocimiento de antígeno del sistema inmune, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o el receptor de antígeno de la célula T. Un polipéptido antigénico contiene al menos aproximadamente 5, y preferiblemente al menos aproximadamente 10, aminoácidos. Una porción antigénica de una molécula puede ser la porción que es inmunodominante para el anticuerpo o para el reconocimiento del receptor de la célula T, o puede ser una porción usada para generar un anticuerpo frente a molécula conjugando la porción antigénica a una molécula vehículo para la inmunización. Una molécula que es antigénica no necesita ser en sí misma inmunogénica, es decir, ser capaz de provocar una respuesta inmune humoral sin un vehículo.

Un "anticuerpo" para los fines de esta invención es cualquier inmunoglobulina, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se une a un epítope específico en una CBP. El término abarca anticuerpos policlonales, monoclonales y quiméricos, los últimos mencionados se describen en más detalle en las patentes de EE.UU. Nº 4.816.397 y 4.816.567.

Un "sitio de combinación de un anticuerpo" es una porción estructural de una molécula de anticuerpo que comprende regiones variables e hipervariables de las cadenas pesada y ligera que se une específicamente al antígeno.

La frase "molécula de anticuerpo" en sus diversas formas gramaticales como se usa en este documento contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta como una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina.

Según la invención, las CBP producidas de forma recombinante, mediante síntesis química o purificadas a partir de fuentes bacterianas naturales, y fragmentos u otros derivados, o análogos de los mismos, incluyendo proteínas de fusión, pueden usarse como inmunógeno para generar anticuerpos anti-CBP. Estos anticuerpos incluyen, pero sin limitaciones, policlonales, monoclonales, quiméricos, cadena sencilla, fragmentos Fab y una biblioteca de expresión de Fab.

Puede usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales frente a las CBP, derivados o análogos de los mismos (véase, por ejemplo, Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow y Lane, editores., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988). Para la producción de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos animales huésped mediante la inyección con CPB, o un derivado (por ejemplo, fragmento o proteína de fusión) de las mismas, incluyendo, pero sin limitaciones conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. En una realización, la CBP, o un fragmento de la misma, puede conjugarse a un vehículo inmunogénico, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH). Pueden usarse diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la CBP o fragmento, análogo o derivado de la misma, puede usarse cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares en cultivo continuado (véase, por ejemplo, Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow y Lane, editores, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988). Estos incluyen, pero sin limitaciones, la técnica de hibridomas originalmente desarrolla por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497); así como la técnica de trioma, la técnica de hibridomas de células B humanas (Kozbor y col., 1983, Immunology Today 4:72) y la técnica de hibridoma del EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). En una realización adicional de la invención, pueden producirse anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando tecnología reciente (documento PCT/US90/02545). Según la invención, pueden usarse anticuerpos humanos y puede obtenerse usando hibridomas humanos (Cote y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030) o mediante la transformación de células B humanas con el virus EBV in vitro (Cole y col., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77-96). De hecho, según la invención, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y col., 1984, J. Bacteriol. 159-870; Neuberger y col., 1984, Nature 312:604-608; Takeda y col., 1985, Nature 314:452-454) mediante el ayuste de genes de una molécula de anticuerpo de ratón específico para una CBP junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada; estos anticuerpos están dentro del alcance de este invención. Se prefieren estos anticuerpos humanos o quiméricos humanizados (descritos infra) para su uso en terapia de enfermedades o trastornos humanos, ya que es menos probable que los anticuerpos humanos o humanizados induzcan una respuesta inmune comparado con los anticuerpos xenogénicos, en particular una respuesta alérgica, por sí mismo.

Según la invención, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de EE.UU. 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos de CBP. Una realización adicional de la invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse y col., 1989, Science 246:1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para una CBP, sus derivados o análogos.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que contengan el idiotipo de la molécula de anticuerpo mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero sin limitaciones: el fragmento F(ab')_{2} que puede producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2} y los fragmentos Fab que puede generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.

En la producción de anticuerpos, la selección del anticuerpo deseado puede conseguirse por técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayo inmunorradiométrico, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando marcadores de oro coloidal, enzima o radioisótopo, por ejemplo), inmunotransferencias, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación de complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, la unión del anticuerpo se detecta detectando un marcador en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta detectando la unión de un anticuerpo secundario o un reactivo al anticuerpo primario. En una realización adicional, en anticuerpo secundario está marcado. En la técnica se conocen varios medios para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un epítope específico de una CBP, pueden ensayarse hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de CBP que contiene este epítope. Para la selección de un anticuerpo específico de una CBP a partir de una cepa particular de bacterias Gram positivas, especialmente neumococos, puede seleccionarse uno en base a la unión positiva con la CBP expresada por o aislada a partir de células de esta cepa de bacterias.

Los anticuerpos anteriores pueden usarse en procedimientos conocidos en la técnica con respecto a la localización y actividad de la CBP, por ejemplo, para inmunotransferencia, polipéptido CBP para captura de imágenes in situ, medida de los niveles de los mismos en muestras fisiológicas apropiadas, etc.

En una realización específica, pueden generarse anticuerpos que agonizan o antagonizan con la actividad de la CBP. Estos anticuerpos pueden analizarse usando los ensayos descritos supra para la caracterización de las CBP.

El término "adyuvante" se refiere a un compuesto o mezcla que potencia la respuesta inmune a un antígeno. Un adyuvante puede servir como un depósito tisular que libera lentamente el antígeno y también como un activador del sistema linfoide que potencia no de forma específica la respuesta inmune (Hood y col., Immunology, Segunda Edición., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, pág. 384). A menudo, una inmunización primaria con un antígeno, solo en ausencia de un adyuvante, no conseguirá una respuesta inmune humoral o celular. Los adyuvantes incluyen, pero sin limitaciones, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas superficiales, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o hidratos de carbono, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes potencialmente útiles para humanos, tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Preferiblemente, el adyuvante es farmacéuticamente aceptable.

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Vacunación y terapia pasiva inmune

La inmunidad activa frente a bacterias Gram positivas, especialmente neumococos, puede inducirse por inmunización (vacunación) con una cantidad inmunogénica de una CBP, un derivado o fragmento antigénico del mismo, y un adyuvante, en el que la CBP, o derivado o fragmento antigénico de la misma, es el componente antigénico de la vacuna.

La CBP sola o conjugada a una cápsula o cápsulas no pueden causar infección bacteriana, y la inmunidad activa provocada por la vacunación con la proteína según la presente invención, puede dar lugar tanto a una respuesta inmune inmediata como a memoria inmunológica y, de este modo, proporciona protección a largo plazo frente a la infección por la bacteria. Las CBP de la presente invención, o fragmentos antigénicos de las mismas, puede prepararse en una mezcla con un adyuvante para preparar una vacuna. Preferiblemente, la CBP, derivado o fragmento de la misma, usada como el componente antigénico de la vacuna, es una adhesina. Más preferiblemente, la CBP, derivado o fragmento de la misma, usada como el componente antigénico de la vacuna es un antígeno común a todas o muchas cepas de una especie de bacterias Gram positivas o común a especies de bacterias estrechamente relacionadas. Más preferiblemente, el componente antigénico de la vacuna es una adhesina que es un antígeno común.

La selección de un adyuvante depende del sujeto que se va a vacunar. Preferiblemente, se usa un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, una vacuna para un humano debe evitar adyuvantes de emulsión de aceite o de hidratos de carbono, que incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund. Un ejemplo de un adyuvante adecuado para su uso en humanos es el alumbre (gel de alúmina). Una vacuna para un animal, sin embargo, puede contener adyuvantes no apropiados para su uso en humanos.

Una alternativa a una vacuna tradicional que comprende un antígeno y un adyuvante implica la introducción directa in vivo en los tejidos de un sujeto de ADN que codifica el antígeno para la expresión de éste en las células del tejido del sujeto. Estas vacunas se denominan en este documento "vacunas a base de ácido nucleico". Puesto que el gen CBP contiene, por definición, una secuencia señal, la expresión del gen en las células del tejido da lugar a la secreción de la proteína expresada, en asociación con la membrana. Alternativamente, el vector de expresión puede manipularse por ingeniería genética para contener una secuencia señal autóloga en lugar de la secuencia señal de CBP. Por ejemplo, puede inyectarse en el tejido un vector de ADN desnudo (véase, por ejemplo, Ulmer y col., 1993, Science 259:1745-1749), un vector transportador de ADN (por ejemplo, Wu y col., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut y col., solicitud de patente canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990) o un vector viral que contenga el gen CBP deseado. Los vectores virales adecuados incluyen retrovirus que se empaquetan en células con una gama de huéspedes anfotrópicos (véase Miller, 1990, Human Gene Ther. 1:5-14; Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, 9) y virus de ADN atenuados o defectuosos, tales como, pero sin limitaciones, virus del herpes simple (VHS) (véase, por ejemplo, Kaplitt y col., 1991, Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330), papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus (véase, por ejemplo, Stratford Perricaudet y col., 1992, J. Clin. Invest. 90:626-630), virus adenoasociados (VAA) (véase, por ejemplo, Samulski y col., 1987, J. Virol. 61:3096-3101; Samulski y col., 1989, J. Virol. 63:3822-3828), y similares. Se prefieren virus defectuosos que carezcan por completo o casi por completo de genes víricos. Los virus defectuosos no infectan después de su introducción en una célula.

Los vectores que contiene la vacuna a base de ácido nucleico de la invención pueden introducirse en el huésped deseado mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola genética, o un vector transportador de ADN (véase, por ejemplo, Wu y col., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut y col., solicitud de patente canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990).

Las vacunas de la invención, es decir, unas vacunas que comprenden un antígeno de CBP, derivado antigénico o fragmento del mismo, o una vacuna de ácido nucleico de CBP, pueden administrarse a través de cualquier vía parenteral, incluyendo, pero sin limitaciones, la vía intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y similares. Preferiblemente, puesto que el resultado deseado de la vacunación es provocar una respuesta inmune frente al antígeno y, de este modo, frente a un organismo patogénico, la administración directamente, mediante un vector dirigido o la elección de un vector viral, indirectamente, a tejidos linfoides, por ejemplo, ganglios linfáticos o bazo. Puesto que las células inmunes se replican de forma continuada, son una diana ideal para las vacunas de ácidos nucleicos basadas en vectores retrovirales, puesto que los retrovirus requieren que las células se repliquen.

Puede conferirse inmunidad pasiva a un sujeto animal sospechoso de sufrir una infección con una bacteria Gram positiva, preferiblemente estreptocócica, y más preferiblemente neumocócica, administrando al paciente antisuero, anticuerpos policlonales, o un anticuerpo monoclonal neutralizante frente a una proteína de unión a colina de la invención. Aunque la inmunidad pasiva no confiere protección a largo plazo, puede ser una herramienta valiosa para el tratamiento de una infección bacteriana de un sujeto que no ha sido vacunado. La inmunidad pasiva es particularmente importante para el tratamiento de cepas resistentes a antibióticos de bacterias Gram positivas, ya que no se puede disponer de otra terapia. Preferiblemente, los anticuerpos administrados para la terapia pasiva inmune son anticuerpos autólogos. Por ejemplo, si el sujeto es un humano, preferiblemente los anticuerpos son de origen humano o se ha "humanizado" para minimizar la posibilidad de una respuesta inmune frente a los anticuerpos. En un ejemplo específico, infra, la inmunidad pasiva protege completamente frente a una infección bacteriana letal.

Una terapia análoga a la inmunización pasiva es la administración de una cantidad de proteína adhesina CBP suficiente para inhibir la adhesión de la bacteria a su célula diana. Un experto puede determinar la cantidad necesaria usando técnicas convencionales.

Las vacunas activas o pasivas de la invención, o la administración de una adhesina, pueden usarse para proteger a un sujeto animal de la infección de una bacteria Gram positiva, preferiblemente estreptococo, y más preferiblemente, neumococo. De este modo, puede usarse una vacuna de la invención en aves, tales como pollos, pavos y mascotas; en mamíferos, preferiblemente un humano, aunque las vacunas de la invención se contemplan para su uso en otras especies de mamíferos, incluyendo, pero sin limitaciones, animales domésticos (caninos y felinos); animales de granja (bovino, ovino, equino, caprino, porcino y similares); roedores y animales no domésticos.

Diagnóstico de una infección bacteriana Gram positiva

Los anticuerpos de la presente invención que pueden generarse frente a las CBP de bacterias Gram positivas son reactivos valiosos para el diagnóstico de una infección con un microorganismo Gram positivo, especialmente un neumococo. Actualmente, es difícil el diagnóstico de la infección con una bacteria Gram positiva. Según la invención, puede detectarse la presencia de bacterias Gram positivas en una muestra de un sujeto que se sospecha tiene una infección con una bacteria Gram positiva detectando la unión de un anticuerpo a una CBP de bacterias en o de una muestra. En un aspecto de la invención, el anticuerpo puede ser específico de una única cepa o de un número limitado de cepas de la bacteria, permitiendo, de este modo, el diagnóstico de la infección con esta cepa (o cepas) en particular. Alternativamente, el anticuerpo puede ser específico para muchas o para todas las cepas de una bacteria, permitiendo, de este modo, el diagnóstico de una infección con esta especie.

El diagnóstico de la infección con una bacteria Gram positiva puede usar cualquier formato de inmunoensayo conocido en la técnica, como se describe. En la sección titulada "Anticuerpos frente a CBP" se describen muchos posibles formatos de inmunoensayo. Los anticuerpos pueden estar marcados para la detección in vitro, por ejemplo, con marcadores tales como enzimas, fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, colorantes, oral coloidal, partículas de látex y agentes quimioluminiscentes. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser marcados para la detección in vivo, por ejemplo, con radioisótopos (preferiblemente tecnecio o yodo); reactivos de desplazamiento para resonancia magnética (tal como gadolinio y manganeso) o reactivos radioopacos.

En realizaciones específicas, la presencia de CBP dentro o sobre las células puede determinarse mediante los procedimientos inmunológicos normales aplicables a estas determinaciones. Se conocen varios procedimientos útiles. Los procedimientos y su aplicación son todos familiares para los expertos en la materia y, por consiguiente, pueden utilizarse dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, un procedimiento "competitivo" se describe en las patentes de EE.UU. Nº 3.654.090 y 3.850.752. Un procedimiento de tipo "sándwich" se describe en las patentes de EE.UU. Nº RE 31.006 y 4.016.043. Aún se conocen otros procedimientos tales como el procedimiento de "doble anticuerpo" o "DAFS".

En cada caso, la CBP forma complejos con uno o más anticuerpo(s) o parejas de unión y un miembro del complejo está marcado con un marcador detectable. El hecho de que se haya formado un complejo y, si se desea, la cantidad del mismo, puede determinarse mediante procedimientos conocidos aplicables a la detección de los marcadores.

Los marcadores más frecuentemente empleados para estos estudios son elementos radiactivos, enzimas, compuestos químicos que emiten fluorescencia cuando se exponen a la luz ultravioleta y otros.

Se conocen varios materiales fluorescentes y pueden utilizarse como marcadores. Estos incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, Rojo Texas, azul MACA y amarillo Lucifer. Un material de detección en particular es un anticuerpo anti-conejo preparado en cabra y conjugado con fluorescencia a través de un isotiocianato.

Las CBP o su pareja(s) de unión también pueden ser marcadas con un elemento radiactivo o con una enzima. El marcador radiactivo puede detectarse mediante cualquiera de los procedimientos de recuento actualmente disponibles. El isótopo preferido puede seleccionarse entre ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y
^{186}Re.

Los marcadores enzimáticos son así mismo útiles, y pueden detectarse mediante cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o gasométricas actualmente utilizadas. La enzima se conjuga con la partícula seleccionada mediante la reacción con moléculas de enlace tal como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehido y similares. Son conocidas muchas enzimas que pueden usarse en estos procedimientos y pueden utilizarse. Las preferidas son peroxidasa, \beta-glucuronidasa, \beta-D-glucosidasa, \beta-D-galactosidasa, ureasa, glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las patentes de EE.UU. 3.654.090, 3.850,752 y 4.016.043 se refieren a modo de ejemplo por sus descripciones de materiales y procedimientos de marcaje alternativos.

En una realización adicional de esta invención, pueden prepararse kits de ensayos comerciales, adecuados par su uso por un especialista médico, para determinar la presencia o ausencia de actividad de unión predeterminada o la capacidad de actividad de unión predeterminada a células que se sospecha son las dianas. Según las técnicas de ensayo discutidas anteriormente, una clase de estos kits contendrán al menos la CBP marcada y su pajera de unión, por ejemplo un anticuerpo específico de la misma, e indicaciones, por supuesto, dependiendo del procedimiento seleccionado, por ejemplo, "competitivo", de tipo "sándwich", "DAFS" y similares. Los kits también pueden contener reactivos periféricos tales como tampones, estabilizadores, etc.

Por consiguiente, puede prepararse un kit de ensayo para la demostración de la presencia o capacidad de las células para la actividad de unión a bacterias predeterminada, que comprende:

(a) una cantidad predeterminada de al menos un componente reactivo marcado inmunoquímicamente obtenido mediante la unión directa o indirecta del factor de CBP presente o una pareja de unión específica de la misma, a un marcador detectable;

(b) otros reactivos; y

(c) indicaciones para el uso de dicho kit.

Más específicamente, el kit de ensayo diagnóstico puede comprender:

(a) una cantidad conocida de la CBP como se describe anteriormente (o una pareja de unión), por lo general unida a una fase sólida para formar un inmunoabsorbente, o como alternativa, unida a una etiqueta adecuada, o estos productos finales múltiples (o sus parejas de unión) uno de cada.

(b) si es necesario, otros reactivos; y

(c) indicaciones para el uso de dicho kit.

En una variación adicional, el kit de ensayo puede prepararse y usarse para los fines indicados anteriormente, que funciona según un protocolo predeterminado (por ejemplo, "competitivo", de tipo "sándwich", "doble anticuerpo", etc.) y comprende:

(a) un componente marcado que se ha obtenido conjugando la CBP con un marcador detectable;

(b) uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales de los que al menos un reactivo es un ligando o un ligando inmovilizado, cuyo ligando se selecciona entre el grupo compuesto por:

(i): un ligando capaz de unirse con el componente marcado (a);

(ii): un ligando capaz de unirse con una pareja de unión del componente marcado (a);

(iii): un ligando capaz de unirse con al menos uno de los componentes que se van a determinar; y

(iv): un ligando capaz de unirse con al menos una de las parejas de unión de al menos uno de los componentes que se van a determinar, y

(c) indicaciones para la realización de un protocolo para la detección y/o determinación de uno o más componentes de una reacción inmunoquímica entre el CBP y una pareja de unión especifica de la misma.

Alternativamente, los ácidos nucleicos y secuencias de los mismos de la invención pueden usarse en el diagnóstico de infección con una bacteria Gram positiva. Por ejemplo, los genes CBP o fragmentos hidrolizables de los mismos pueden usarse para la hibridación in situ con una muestra de un sujeto que es sospechoso de portar una infección con una bacteria Gram positiva. En otra realización, pueden identificarse segmentos génicos específicos de una bacteria Gram positiva usando amplificación por PCR con sondas basadas en los genes CBP de la invención. En un aspecto de la invención, la hibridación con una sonda o con los cebadores de PCR puede realizarse en condiciones rigurosas, o con una secuencia específica para una única cepa o un número limitado de cepas de la bacteria, o ambas, permitiendo, de este modo, el diagnóstico de la infección con esa cepa (o cepas) en particular. Alternativamente, la hibridación puede realizarse en condiciones menos rigurosas, o la secuencia puede ser homóloga en cualquiera o en todas las cepas de una bacteria, permitiendo, de este modo, el diagnóstico de la infección con esa especie.

Composiciones terapéuticas y vacunas que comprenden CBP

Como se indicó anteriormente, la presente invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden anticuerpos frente a CPB (es decir, terapia pasiva inmune), vacunas anti-CBP (si están compuestas de CPB con un adyuvante o de una vacuna de ácido nucleico), CPB para competir con CBP bacterianas en las actividad patogénicas, tal como adherencia a células huésped, péptidos, tales como Fn5 o anticuerpos frente a Fn5. Preferiblemente, cualquier de estas composiciones es una composición farmacéutica que comprende el componente activo (anticuerpo, vacuna o CBP) en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La preparación de composiciones terapéuticas que contienen un componente activo está bien entendida en la técnica. Típicamente, estas composiciones se preparan como inyectables, como soluciones liquidas o suspensiones, sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la disolución, o suspensión, en un líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse. El ingrediente terapéutico activo a menudo se mezcla con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento de pH, que potencian la eficacia del ingrediente activo.

Puede formularse un componente activo en la composición terapéutica en forma de sal neutralizada farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido o molécula de anticuerpo) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas a partir de los grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.

Una composición que comprende "A" (donde "A" es una proteína, molécula de ADN, vector, etc., únicos) está sustancialmente libre de "B" (donde "B" comprende una o más proteínas, moléculas de ADN, vectores, etc., contaminantes) cuando al menos aproximadamente el 75% del peso de las proteínas, ADN, vectores (dependiendo de la categoría de la especie a la que pertenecen A y B) de la composición es "A". Preferiblemente, "A" comprende al menos aproximadamente el 90% en peso de las especies A + B de la composición, mas preferiblemente al menos aproximadamente el 99% en peso.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerable y típicamente no producen una reacción alérgica adversa o similar, tales como molestias gástricas, mareo y similares, cuando se administra a un humano. Preferiblemente, como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o Estatal o incluido en la Farmacopea de los EE.UU. y otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más en particular, en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual administra el compuesto. Estos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Preferiblemente se emplean como vehículos agua o soluciones salinas acuosas, soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, especialmente soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin.

La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" se usa en este documento para dar a entender una cantidad suficiente para reducir al menos aproximadamente el 15 por ciento, preferiblemente al menos el 50 por ciento, más preferiblemente al menos el 90 por ciento y, más preferiblemente prevenir un déficit clínicamente significativo de la actividad, función y respuesta del huésped. Alternativamente, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para causar una mejora en una afección clínicamente significativa en el huésped. En el contexto de la presente invención, se evidencia un déficit en la respuesta del huésped por la continuación o diseminación de la infección bacteriana. Una mejora en una afección clínicamente significativa en el huésped incluye un descenso de la carga bacteriana, aclaramiento de bacterias de las células huésped, reducción de la fiebre o de la inflamación asociada con la infección o una reducción en cualquier síntoma asociado con la infección bacteriana.

Según la invención, el componente o componentes de una composición terapéutica de la invención pueden introducirse por vía parenteral, transmucosa, por ejemplo, por vía oral, nasal, pulmonar, o rectal, o transdérmica. Preferiblemente, la administración es por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección intravenosa y también incluyendo, pero sin limitaciones, mediante administración por vía intraarterial, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular e intracraneal. Puede preferirse el suministro por vía oral o pulmonar para activar la inmunidad mucosa; ya que generalmente los neumococos colonizan la mucosa nasofaríngea y pulmonar, la inmunidad mucosa puede ser un tratamiento preventivo particularmente eficaz. La expresión "unidad de dosis" cuando se usa en referencia a una composición terapéutica de la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente necesario, es decir, transportador o vehículo.

En otra realización, el compuesto activo puede suministrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase, Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y col., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, López-Berestein y Fidler (editores.), Liss, Nueva York, pág. 353-365 (1989); López-Berestein, ibid., pág. 317-327; véase generalmente ibid.).

Aún en otra realización, el compuesto terapéutico puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el polipéptido puede administrarse usando infusión intravenosa, una bomba osmótica que puede implantarse, un parche transdérmico, liposomas u otros modos de administración. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald y col., Surgery 88:507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (editores.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); véase también Levy y col., Science 228:190 (1985); During y col., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard y col., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). Aún en otra realización, puede colocarse un sistema de liberación controlada en la proximidad de la diana terapéutica, es decir, el cerebro, requiriendo, de este modo, sólo una fracción de una dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pág. 115-138 (1984)). Preferiblemente, se introduce un dispositivo de liberación controlada en un sujeto en la proximidad al sitio de activación inmune inapropiada o un tumor.

Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

Un sujeto en el que la administración de un componente activo, como se muestra anteriormente, es un régimen terapéutico eficaz para una infección bacteriana es preferiblemente un humano, pero puede ser cualquier animal. De este modo, como puede fácilmente apreciar un experto en la técnica, los medicamentos y composiciones farmacéuticas de la presente invención son especialmente adeudados para su administración a cualquier animal, especialmente un mamífero, y que incluyen, pero sin limitaciones, animales domésticos, tales como sujetos felinos o caninos, animales de granja, tales como, pero sin limitaciones, sujetos bovinos, equinos, caprinos, ovinos y porcinos, animales salvajes (en su hábitat natural o en un parque zoológico), animales de investigación, tales como ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, cerdos, perros, gatos, etc., es decir, para uso médico veterinario.

En los medicamentos y composiciones terapéuticos de la invención, se proporciona una dosificación terapéuticamente eficaz del componente activo. Un profesional médico experto puede determinar una dosificación terapéuticamente eficaz en base a las características del paciente (edad, peso, sexo, afección, complicaciones, otras enfermedades, etc.), como es bien conocido en la técnica. Además, como se llevan a cabo estudios rutinarios adicionales, surgirá información más específica sobre los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas afecciones en diversos pacientes, y el profesional experto, considerando el contexto terapéutico, edad y estado de salud general del receptor, será capaz de determinar la dosificación apropiada. Generalmente, las dosis para inyección o infusión por vía intravenosa, pueden ser menores que para las vías intraperitoneal, intramuscular u otras vías de administración. El programa de dosificación puede variar, dependiendo de la semivida en circulación, y la formulación usada. Las composiciones se administran de manera compatible con la formulación de dosificación en la cantidad terapéuticamente eficaz. Las cantidades precisas del ingrediente activo que se necesita administrar dependen de la valoración del médico y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, las dosificaciones adecuadas pueden oscilar de aproximadamente 0,1 a 20, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10, y más preferiblemente de uno a varios miligramos de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal de individuo por día y depende de la vía de administración. También son variables los regimenes adecuados para la administración inicial y las inyecciones de refuerzo, pero se tipifican mediante una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de uno o más horas mediante una inyección posterior u otra administración. Alternativamente, se contempla una infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones de diez nanomolar a diez micromolar en la sangre.

Administración con otros compuestos Para el tratamiento de una infección bacteriana, puede administrarse el componente activo presente junto con una o más composiciones farmacéuticas usadas para tratar infecciones bacterianas, que incluyen, pero sin limitaciones, (1) antibióticos; (2) hidratos de carbono solubles inhibidores de la adhesión bacteriana; (3) otras moléculas pequeñas inhibidoras de la adhesión bacteriana; (4) inhibidores del metabolismo, transporte o transformación bacteriana; (5) estimuladores de lisis bacteriana o (6) anticuerpos o vacunas antibacterianas dirigidas a otros antígenos bacterianos. Otros componentes potencialmente activos incluyen agentes antiinflamatorios, tales como esteroides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos. La administración puede ser simultánea (por ejemplo, administración de una mezcla del componente activo presente y un antibiótico) o puede ser en serie.

Por consiguiente, en una realización específica, las composiciones terapéuticas pueden además incluir una cantidad eficaz del componente activo y uno o más de los siguientes ingredientes activos: un antibiótico, un esteroide, etc. A continuación se dan ejemplos de formulaciones:

Formulaciones Formulación por vía intravenosa I

Ingrediente	mg/ml
cefotaxima	250,0
CBP	10,0
dextrosa USP	45,0
bisulfito sódico USP	3,2
edetato disódico USP	0,1
Agua para inyección q.s.a.d.	1,0 ml

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Formulación por vía intravenosa II

Ingrediente	mg/ml
ampicilina	250,0
CBP	10,0
bisulfito sódico USP	3,2
edetato disódico USP	0,1
agua para inyección q.s.a.d.	1,0 ml

\vskip1.000000\baselineskip

Formulación por vía intravenosa III

Ingrediente	mg/ml
gentamicina (cargado como sulfato)	40,0
CBP	10,0
bisulfito sódico USP	3,2
edetato disódico USP	0,1
agua para inyección q.s.a.d.	1,0 ml

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Formulación por vía intravenosa IV

Ingrediente	mg/ml
CBP	10,0
dextrosa USP	45,0
bisulfito sódico USP	3,2
edetato disódico USP	0,1
agua para inyección q.s.a.d.	1,0 ml

\vskip1.000000\baselineskip

Formulación por vía intravenosa V

Ingrediente	mg/ml
antagonista de CBP	5,0
bisulfito sódico USP	3,2
edetato disódico USP	0,1
agua para inyección q.s.a.d.	1,0 ml

Como se usa en este documento, "pg" significa picogramo, "ng" significa nanogramo, "ug" o "\mug" significa microgramo, "mg" significa miligramo, "ul" o "\mul" significa microlitro, "ml" significa mililitro, "l" significa litro.

De este modo, en un ejemplo específico, cuando se desee reducir o inhibir la infección resultante de la unión mediada por CBP de bacterias a una célula huésped, podría introducirse CBP o un anticuerpo de ésta, un ligando de la misma o un anticuerpo frente a este ligando, tal como Fn5, para bloquear la interacción de la CBP presente en bacterias con la célula huésped.

Como se discute anteriormente, las CBP o los anticuerpos frente a estas, pueden prepararse en composiciones farmacéuticas, con un vehículo adecuado y a una potencia eficaz para la administración mediante diversos medios a un paciente que experimenta una afección médica adversa asociada con una infección bacteriana específica para el tratamiento de la misma. Puede utilizarse una diversidad de técnicas de administración, entre ellas técnicas de administración por vía parenteral, tal como inyecciones por vía subcutánea, intravenosa e intraperitoneal, cateterizaciones y similares. Las cantidades medias de las CBP o sus subunidades pueden variar y, en particular, deben basarse en las recomendaciones y prescripciones de un médico o veterinario cualificado.

Administración pulmonar

También se contempla en este documento la administración pulmonar del presente agente inhibidor de la adhesión (o derivados del mismo), de la invención, seleccionado entre el grupo compuesto por una proteína de unión a colina de la invención, un anticuerpo frente a una proteína de unión a colina de la invención, una proteína de unión a colina de la invención que comprende una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 8 o ID SEC Nº 19, un péptido de no más de 15 restos de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos WQPPRARI (ID SEC Nº 11) y un anticuerpo específico frente a un epítope que tienen la secuencia de aminoácidos WQPPRARI (ID SEC Nº 11). El agente inhibidor de la adhesión (o derivado) es adecuado para ser administrado en los pulmones de un mamífero, donde puede interferir con bacterias, es decir, estreptocócicas, y preferiblemente, neumocócicas que se unen a células huésped. En una realización específica, dicho agente inhibidor de la adhesión inhibe la unión de la enolasa estreptocócica a la fibronectina. Otros informes de preparación de proteínas para la administración pulmonar se encuentran en la técnica [Adjei y col. Pharmaceutical Research, 7:565-569 (1990); Adjei y col., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (acetato de leuprólida); Braquet y col., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (supl. 5): 143-146 (1989) (endotelina-1); Hubbard y col., Annals of Internal Medicine, Vol. III, pág. 206-212 (1989) (\alpha1-antitripsina); Smith y col., J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (1989) (\alpha-1-proteinasa); Oswein y col., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, marzo, (1990) (hormona de crecimiento humana recombinante); Debs y col., J. lmmunol. 140:3482-3488 (1988) (interferón-\gamma y factor de necrosis tumoral alfa); Platz y col., patente de EE.UU. Nº 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos)]. En la patente de EE.UU. Nº 5.451.569, presentada el 19 de septiembre de 1995 de Wong y col. se describe un procedimiento y composición para el suministro pulmonar de
fármacos.

Se contempla el uso en la práctica de esta invención de una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para el suministro pulmonar de productos terapéuticos, que incluyen, pero sin limitaciones, nebulizadores, inhaladores con dosificador e inhaladores en polvo, todos ellos familiares para los expertos en la materia. Con respecto a la construcción del dispositivo de administración, puede usarse en la práctica de la invención cualquier forma de aerosolización conocida en la técnica, incluyendo pero sin limitaciones, las botellas de pulverización, nebulización, atomización o bombas de aerosolización de una formulación líquida, y aerosolización de una formulación de polvo seco.

Algunos ejemplos específicos de dispositivos disponibles en el mercado para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador con dosificador Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; y el inhalador de polvo Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Berdford, Massachussets.

Todos estos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para la administración de un agente de inhibición de la adhesión (o derivado). Típicamente, cada formulación es específica del tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propulsor adecuado, además de los diluyentes, adyuvantes y/o vehículos normales útiles en terapia. También se contempla el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión u otros tipos de vehículos. También puede preparase un agente inhibidor de la adhesión modificado químicamente en diferentes formulaciones dependiendo del tipo de modificación química o del tipo de dispositivo empleado.

Las formulaciones adecuadas para su uso con un nebulizador, a chorro o ultrasónico, comprenderá típicamente el agente inhibidor de la adhesión (o derivado) disuelto en agua a una concentración de aproximadamente 0,1 a 25 mg de agente inhibidor de la adhesión biológicamente activo por ml de solución. La formulación también puede incluir un tampón y un azúcar simple (por ejemplo, para la estabilización y regulación de la presión osmótica del agente inhibidor de la adhesión). La formulación del nebulizador también puede contener un tensioactivo, para reducir o prevenir la agregación inducida en la superficie del agente inhibidor de la adhesión causada por la atomización de la solución cuando se forma el aerosol.

Las formulaciones para su uso con un dispositivo inhalador con dosificador generalmente comprenderán un polvo finamente dividido que contiene el agente inhibidor de la adhesión (o derivado) suspendido en un propulsor con la ayuda de un tensioactivo. El propulsor puede ser cualquier material convencional empleado para este fin, tal como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono, o un hidrato de carbono, incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitán y lecitina de soja. También puede ser útil el ácido oléico como tensioactivo.

Las formulaciones de aerosol líquido contienen un agente inhibidor de la adhesión y un agente de dispersión en un diluyente fisiológicamente aceptable. Las formulaciones de aerosol de polvo seco de la presente invención están compuestas de una forma sólida finamente dividida de un agente inhibidor de la adhesión y un agente dispersante. Con la formulación de aerosol líquida o en polvo seco, la formulación debe de ser aerosolizada. Esto es, debe dividirse en partículas líquidas o sólidas para asegurar que la dosis aerosolizada realmente alcance las membranas mucosas de los conductos nasales o del pulmón. La expresión "partícula de aerosol" se usa en este documento para describir la partícula líquida o sólida adecuada para la administración nasal o pulmonar, es decir, que alcanzará las membranas mucosas. Otras consideraciones, tales como la construcción del dispositivo de administración, componentes adicionales en la formulación y características de la partícula, son importantes. Estos aspectos de la administración pulmonar de un fármaco son bien conocidos en la técnica y la manipulación de formulaciones, medios de aerosolización y construcción de un dispositivo de administración requiere como mucho la experimentación rutinaria de un experto en la materia.

En una realización en particular, el diámetro dinámico medio de masa será de 5 micrómetro o menos para asegurar que las partículas del fármaco alcanzan los alveolos pulmonares [Wearley, L.L., Crit. Rev. in Ther. Drug Carrier Systems 8:333(1991)].

Los sistemas de administración del aerosol, tales como el inhalador con dosificador presurizado y el inhalador de polvo seco se describen en Newman, S.P., Aerosols and the Lung, Clarke, S.W. y Davia, D. editores, pág. 197-22 y puede usarse en conexión con la presente invención.

En una realización adicional, como se discute en detalle infra, una formulación de aerosol de la presente invención puede incluir otros ingredientes terapéutica o farmacológicamente activos además del agente inhibidor de la adhesión, tales como, pero sin limitación, un antibiótico, un esteroide, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, etc.

Formulaciones de aerosol líquido. La presente invención proporciona formulaciones de aerosol y formas de dosificación para su uso en el tratamiento de sujeto que sufren una infección bacteriana, por ejemplo, estreptocócica, en particular, neumocócica. En general estas formas de dosificación contienen un agente inhibidor de la adhesión en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitaciones, agua estéril, solución salina, solución salina tamponada, solución de dextrosa y similares. En una realización específica, un diluyente que puede usarse en la presente invención o la formulación farmacéutica de la presente invención es solución salina tamponada con fosfato o una solución salina tamponadas generalmente en el intervalo de pH 7,0-8,0 o agua.

La formulación de aerosol líquido de la presente invención puede incluir, como ingredientes óptimos, vehículos, diluyentes, agentes solubilizantes o emulsionantes, tensioactivos y excipientes farmacéuticamente aceptables.

La formulación puede incluir un vehículo. El vehículo es una macromolécula que es soluble en el sistema circulatorio y que es fisiológicamente aceptable, donde fisiológicamente aceptable significa que los expertos en la materia aceptarían la inyección de dicho vehículo en un paciente como parte de un régimen terapéutico. El vehículo preferiblemente es relativamente estable en el sistema circulatorio con una semivida de aclaramiento en plasma aceptable. Estas macromoléculas incluyen, pero sin limitaciones, lecitina de Soja, ácido oléico y trioleato de sorbitán, siendo preferido el trioleato de sorbitán

Las formulaciones de la presente realización también pueden incluir otros agentes útiles para el mantenimiento del pH, estabilización de la solución o para la regulación de la presión osmótica. Ejemplos de los agentes incluyen, pero sin limitaciones, sales tales como cloruro sódico o cloruro potásico, e hidratos de carbonos tales como glucosa, galactosa o manosa y similares.

La presente invención además contempla formulaciones de aerosol líquido que comprenden un agente inhibidor de la adhesión y otro fármaco terapéuticamente eficaz, tal como un antibiótico, un esteroide, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, etc.

Formulaciones para aerosol de polvo seco. También se contempla que la presente formulación para aerosol puede prepararse como una formulación en polvo seco que comprende una forma en polvo finamente dividido de un agente inhibidor de la adhesión o un dispersante.

Las formulaciones para dispersar a partir de un dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene un agente inhibidor de la adhesión (o derivado) y también puede incluir un agente de carga tal como lactosa, sorbitol, sacarosa o manitol en cantidades que faciliten la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo, el 50 al 90% en peso de la formulación. El agente inhibidor de la adhesión (o derivado) se prepara de forma más ventajosa en forma particulada con un tamaño de partícula medio de menos de 10 mm (o micrómetros), más preferiblemente de 0,5 a 5 mm, para la administración más eficaz al pulmón distal.

En otra realización, la formulación de polvo seco puede comprender un polvo seco finamente dividido que contenga un agente inhibidor de la adhesión, un agente de dispersión y también un agente de carga. Los agentes de carga útiles junto con la formulación presente incluyen agentes tales como lactosa, sorbitol, sacarosa o manitol, en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde el dispositivo.

La presente invención además contempla formulaciones de polvo seco que comprende un agente inhibidor de la adhesión y otro fármaco terapéuticamente eficaz, tal como un antibiótico, un esteroide, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, etc.

Identificación de pequeñas moléculas antagonistas de CBP

La identificación y aislamiento de un gen que codifica una proteína de unión a colina de la invención proporciona la expresión de la proteína en cantidades mayores que las que se pueden aislar a partir de fuentes naturales o en células indicadoras que se han manipulado genéticamente de forma especial para indicar la actividad de una CBP expresada tras la transfección o transformación de las células. Por consiguiente, además del diseño racional de agonistas y antagonistas en base a la estructura de una proteína de unión a colina, la presente invención contempla un procedimiento alternativo para ligandos específicos identificados de una proteína de unión a colina usando diversos ensayos de análisis conocidos en la técnica. Los ejemplos de pequeñas moléculas antagonistas de las CPB incluyen lisina, colina, el pentapéptido que tiene la ID SEC Nº 11; es probable que análogos de estos tipos de moléculas, tales como la arginina, también inhiban la adhesión bacteriana a los tejidos huésped, especialmente fibronectina.

Cualquier técnica de análisis conocida en la técnica puede usarse para seleccionar agonistas o antagonistas de proteínas de unión a colina. La presente invención contempla la selección de pequeñas moléculas ligandos o análogos y miméticos de ligandos, así como la selección de ligandos naturales que se unen, agonizan o antagonizan in vivo con actividades de la proteína de unión a colina, especialmente la adhesión de bacterias a células o tejidos huésped mediada por la proteína de unión a colina.

El conocimiento de la secuencia primaria de la CBP y la similitud de esa secuencia con proteínas de función conocida, pueden proporcionar un indicio sobre los inhibidores o antagonistas de la proteína. La identificación y el análisis de antagonistas se facilitan además determinando las características estructurales de la proteína, por ejemplo, usando cristalografía por rayos X, difracción de neutrones, espectrometría de resonancia magnética nuclear y otras técnicas para la determinación de la estructura. Estas técnicas proporcionan el diseño racional o la identificación de agonistas y antagonistas.

Otra aproximación usa bacteriófagos recombinantes para producir bibliotecas grandes. Usando el "procedimiento del fago" (Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390; Cwirla, y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382; Devlin y col., 1990, Science, 249:404-406), pueden construirse bibliotecas muy grandes (10^{6}-10^{8} entidades químicas). Una segunda aproximación usa principalmente procedimientos químicos, de los que son ejemplos el método de Geysen (Geysen y col., 1986, Molecular Immunology 23:709-715; Geysen y col. 1987, J. Immunologic Method 102:259-274) y el procedimiento reciente de Fodor y col. (1991, Science 251, 767-773). Furka y col. (1988, 14º Congreso Internacional de Bioquímica, Volumen 5, Resumen FR:013; Furka, 1991, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493), Houghton (Patente de EE.UU. Nº 4.631.211, presentada en diciembre de 1986) y Rutter y col. (patente de EE.UU. Nº 5.010.175, presentada el 23 de abril de 1991) describe procedimientos para producir una mezcla de péptidos que pueden probarse como agonistas o antagonistas.

En otro aspecto, pueden usarse bibliotecas sintéticas (Needels y col., 1993, "Generation and screening of an oligonucleotide encoded synthetic peptide library," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4; Ohlmeyer y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Lam y col., publicación de patente internacional Nº WO 92/00252; Kocis y col., publicación de patente internacional Nº WO 9428028) y similares para seleccionar ligandos de proteínas de unión a colina según la presente invención.

El análisis puede realizarse con células recombinantes que expresan una proteína de unión a colina o, alternativamente, usando proteína purifica, por ejemplo, producida de forma recombinante como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, para analizar las bibliotecas puede usarse la capacidad de la proteína de unión a colina marcada soluble o solubilizada, que incluye la porción de unión a ligando de la molécula, para unirse al ligando, como se describe en las referencias anteriores.

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar de forma más completa las realizaciones preferidas de la invención. No se deberán interpretar, sin embargo, como limitantes del amplio alcance de la invención.

Ejemplos Consideraciones preliminares

La presente invención identifica una familia de CBP que son proteínas expuestas en la superficie y sirven como adhesinas críticas para la unión de neumococos a las células eucarióticas que se encuentran en los lugares de infección. La invención también identifica y caracteriza una nueva CBP, CbpA, como una adhesina y un determinante de virulencia. Además, la presente invención demuestra que estas proteínas son inmunogénicas y, de este modo, pueden también funcionar como antígenos protectores.

Usando colina unida a perlas de agarosa, se purificó una familia de al menos 12 proteínas bacterianas de unión a colina (CBP), que incluye LytA, a partir de una cepa de neumococos PspA de serotipo II. El marcaje de bacterias completas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) sugirió que cuatro de estas CBP estaban expuestas en la superficie, mientras que los sueros convalecientes humanos presentaban reacción cruzada con cinco de las CBP. Se ha demostrado previamente que los neumococos se unen a células de pulmón (CP) de tipo II y a células endoteliales (CE) de la vasculatura periférica. En comparación con los controles, la fracción CBP bloqueaba la adherencia del neumococo a CP el 45% y a CE el 89% de forma dependiente de dosis. Se usó la fracción CBP para inmunizar conejos y se usaron anticuerpos policlonales para los estudios de inmunización pasiva. La secuencia de aminoácidos N-terminal e interna obtenida a partir de tres de las CBP no mostró similitud con ninguna de las secuencias proteicas conocidas. Además, el miembro predominante de esta familia de proteínas, CbpA, es una proteína de 112 kDa expuesta en la superficie que reacciona con sueros convalecientes humanos. El análisis de la secuencia del gen correspondiente mostró una única secuencia N-terminal y seis dominios C-terminales de unión a colina en la región C-terminal.

Ejemplo 1 Identificación de las proteínas de unión a colina de neumococos Materiales y procedimientos

Cepas. Las cepas bacterianas usadas incluían (1) R6, una cepa bacteriana no encapsulada derivada de D39 (tipo 2), no encapsulada, (2) AII encapsulada, (3) LM91 derivada de D39 (encapsulada), que es PspA^{-} y (4) Lyt^{-} derivada de D39, no encapsulada.

Cultivo celular y purificación de la proteína de unión a colina. Se crecieron cultivos de 0,1 ml de bacterias LM91 (suspensión madre a -80ºC) en 10 ml de medio semisintético C + Y durante 5 horas a 37ºC. A continuación, se usaron estos 10 ml de cultivo para inocular 400 ml de C + Y y este cultivo se incubó durante 5 horas a 37ºC en CO_{2} al 5% hasta una DO_{620} de 0,6. A esta mezcla se le añadieron 4 ml de perlas de colina-agarosa (PCA) y se incubó durante 30 minutos a 37ºC en CO_{2} al 5%, con agitación ocasional. Las bacterias y las perlas se centrifugaron a 4ºC durante 15 minutos a 8.000 x g y el sedimento se resuspendió en los 50 ml restantes del medio (C + Y). A estos 50 ml de añadieron 20 \mug/ml de leupeptina, 100 \mug/ml de PMSF y 250 \mul de Tritón X-100 a una concentración final del 0,5%. Esta mezcla se agitó durante 20-30 minutos hasta que la solución se volvió transparente, lo que indicaba que todas las bacterias se habían lisado. Las PCA se lavaron a continuación en un filtro de vidrio con DPBS/NaCl 1 M Las PCA se incubaron después con 2 cambios de 50 ml de DPBS/NaCl 1 M, y las perlas de nuevo se lavaron en un filtro de
vidrio.

Purificación de las proteínas de unión a colina. Se eluyeron las proteínas de unión a colina (CBP) con 3 lavados de 5m de DPBS/colina al 10%. Las CBP eluidas se concentraron en un concentrador Ultrafree-20 (Millipore) hasta 1,5 ml y, a continuación, se dializó frente a PBS.

Preparación de antisuero de conejo anti-CBP. Las proteínas de unión a colina aisladas de la columna de afinidad a colina se concentraron como se describe anteriormente y se usaron en una vacuna para inmunizar conejos y generar un antisuero anti-CBP. Se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda mediante inyección intradérmica en el lomo con 500 \mug de CBP purificadas en 1 ml de una emulsión 1:1 de tampón y adyuvante completo de Freund. Los conejos se reinmunizaron con una inyección subcutánea dorsal de 250 \mug de CBP purificadas en 1 ml de una proporción 1:1 tampón y adyuvante incompleto de Freund las semanas 3, 6, 9, 12 y 15. Los conejos se sangraron previamente y se sangraron para análisis aproximadamente 10 días antes de cada reinmunización. En todos los experimentos se usaron los sueros obtenidos en la semana 16.

Se examinaron las CBP mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia usando los siguientes anticuerpos: (1) suero policlonal anti-neumococos (de conejo o "ROB"); (2) anticuerpo monoclonal anti-PspA; (3) anticuerpo monoclonal anti-FITC; (4) sueros convalecientes humanos anti-neumococos y (5) anticuerpo policlonal anti-CBP. Se identificaron 9 CBP en SDS-PAGE/inmunotransferencia. Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2.

Ejemplo 2 Caracterización de las proteínas de unión a colina de neumococos

Las CBP aisladas mediante SDS-PAGE se sometieron al análisis de la secuencia N-terminal de aminoácidos. La fracción proteica obtenida de la columna de colina-agarosa eluida con cloruro de colina 0,5 M, se aplicó a un gel de poliacrilamida en presencia de SDS, se transfirió a una membrana de PVDF y se tiñeron las proteínas. Se escindieron las bandas individuales y se obtuvo la secuencia de aminoácidos N-terminal mediante degradación de Edman. Los datos de la secuencia interna se obtuvieron a partir de los fragmentos proteicos generados por proteasas. Los datos de la secuencia de aminoácidos de 8 de las 9 CBP se obtuvieron como sigue:

CBP112 XENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDE (ID SEC Nº 1)

CBP90 AREFSLEKTR (ID SEC Nº 2)

CBP84 XREFSLEKTRNIGIMAHVDAGKT (ID SEC Nº 3)

CBP80 XKXXWQXKQYLKEDGSQAANEXVFDTA (ID SEC Nº 4)

CBP78 QKIIGIDLGTTNSAVAVLEGTESKIIANPE (ID SEC Nº 5)

CBP70 XXXEVAKXSQDTTTAS (ID SEC Nº 6)

CBP60 XNERVKIVATLGPAVEGRG (ID SEC Nº 7)

CBP50 XIIXXVYAREVLDSRGNP (ID SEC Nº 8)

CBP112-Int1 EDRRNYHPTNTYK (ID SEC Nº 9)

CBP112-Int2 XDDQQAEEDYA (ID SEC Nº 10)

Ninguna de las secuencias habían sido previamente identificadas, excepto porque CBP84 era el 85% idéntica al factor de elongación G (EF-G) y CBP50 era similar a la enolasa.

Ejemplo 3 Las proteínas de unión a colina de neumococos bloquean la adherencia

La fracción de CBP aislada en el Ejemplo 1 se usó en un ensayo de adherencia para determinar su efecto sobre la adherencia neumocócica a las células de pulmón (CP) de tipo II y a células endoteliales (CE) de la vasculatura, como se describe en la patente internacional Nº PCT/US95/07209, presentada el 6 de junio de 1995 por Tuomanen y Cundell. La fracción CBP bloqueaba la adherencia neumocócica a CP el 45% y a CE el 89% de una manera dependiente de dosis (Figuras 3 y 4, respectivamente).

Ejemplo 4 La proteína de unión a colina de 50 kd media la adhesión neumocócica

La adherencia a las proteínas de la matriz extracelular, tal como fibronectina (véase la Figura 5), proporciona a los patógenos un medio para invadir los epitelios lesionados. Se sabe que S. pneumoniae se adhiere a la fibronectina inmovilizada en un sitio, en el dominio C-terminal de unión a heparina [van der Flier, y. col. Infect. Immun. 63:4317-4322(1995)]. Otros han descrito que esta región también se une a la integrina leucocitaria receptor de adhesión, \alpha4\beta1. También se ha demostrado que la molécula de adhesión de células vasculares (VCAM-1) contiene secuencias homólogas a IIICS que son los sitios de unión activos para \alpha4\beta1. Este Ejemplo evalúa, inter alia, si S. pneumoniae, al igual que \alpha4\beta1, tenía un reconocimiento cruzado de fibronectina y VCAM-1.

La adherencia de S. pneumoniae a fibronectina inmovilizada se inhibía el 96% por la preincubación de las bacterias con VCAM-1 recombinante soluble. S. pneumoniae también se adhiere directamente a pocillos recubiertos con VCAM-1 a una densidad de 75\pm18 bacterias/0,25 mm^{2}. Esto representa el 6% de la adherencia de neumococos a fibronectina completa. La especificidad de la adherencia de S. pneumoniae se caracterizó con más profundidad evaluando la adherencia a fragmentos del dominio de unión a heparina de 33 kDa de fibronectina. Se expresaron diversos fragmentos del dominio de 33 kDa como proteínas de fusión GST. Los resultados se muestran en la Figura 6. Las bacterias se adherían aproximadamente igual a los fragmentos recombinantes 33/66, 51 y 15. Estudios adicionales usando cuatro péptidos sintéticos basados en la región III14 identificaron el péptido FN5 (WQPPRARI (ID SEC Nº 11)) como el que era capaz de mediar la adherencia de S. pneumoniae (Figura 7). Los anticuerpos frente a FN5 inhibían la adherencia de neumococos tanto a fibronectina completa como a VCAM-1 (92 y 69%, respectivamente). Este Ejemplo muestra que S. pneumoniae se une mediante mecanismos similares a VCAM-1 y fibronectina, lo que puede proporcionar a los neumococos acceso a las rutas de tráfico leucocitario, promoviendo la progresión de la enferme-
dad.

Una adhesina en la superficie de S. pneumoniae es la proteína de unión a colina de 50 kDa. La preincubación de las bacterias en una solución de colina al 10%, para desplazar la unión de las proteínas de superficie a la colina, dio lugar a un descenso de la unión de neumococos a fibronectina de más del 50% (Figura 8). Las bacterias crecidas en presencia de etanolamina en vez de colina, de modo que no mostraban proteínas de unión a colina en su superficie, no podían unirse a fibronectina (> 85% de inhibición) (datos no mostrados). Diluciones de 1:10 a 1:5.000 del anticuerpo anti-colina, TEPC15, disminuían la unión de neumococos en más del 95% (Figura 9). Las preparaciones de proteínas de unión a colina de S. pneumoniae inhibían de forma competitiva la adherencia de neumococos a fibronectina (75-90% de inhibición) (datos no mostrados).

Para confirmar la identidad de la proteína adhesina en la superficie del neumococo, se separaron mediante SDS-PAGE los lisados de células completas en prensa de Frech y las preparaciones de proteínas de unión a colina y se transfirieron a membranas de PVDF Immobilon. Las membranas se incubaron a continuación con una solución de fibronectina durante varias horas. Después de lavar la proteína no unida, se detectó la fibronectina unida mediante quimioluminiscencia. Se observó una banda de aproximadamente 50 kDa tanto en el lisado de células completas como en las preparaciones de proteínas de unión a colina. La secuenciación proteica del extremo amino terminal de esta banda identificó esta proteína como un homólogo de la enzima glicolítica, enolasa (2-fosfo-D-glicerato hidrolasa). En la extensión de 18 aminoácidos analizados mediante el algoritmo BLAST, se demostró que una región de 16 restos tenía el 93% de identidad (15/16) con la enolasa de Bacillus subtilis (Figura 10).

La adición de la enzima glicolítica enolasa (Sigma) a pocillos recubiertos con fibronectina antes de la adición de las bacterias, dio lugar a la inhibición de la adherencia de neumococos a fibronectina (Figura 11). La inhibición era dependiente de la dosis. La inhibición máxima (98%) se observó con 1.000 U/ml de enolasa. No se observó adherencia directa del neumococo a los pocillos recubiertos con enolasa.

Se ha demostrado que la enolasa se adhiere al plasminógeno a través de su resto de lisina carboxi-terminal. La adherencia de S. pneumoniae a la fibronectina completa es dependiente de L-lisina. Se añadió lisina a los pocillos recubiertos con fibronectina 15 min antes de la adición de las bacterias. La adherencia de neumococos se inhibía el 67%, 95% y 99% con L-lisina 0,1 M, 0,5 M y 1 M, respectivamente (Figura 12). El análogo de lisina, ácido 6-amino hexanoico, no era capaz de inhibir la adherencia.

Los lisados de la prensa de French de S. pneumoniae se pasaron por una columna de perlas de sefarosa recubiertas de fibronectina. Las proteínas adherentes se eluían de forma competitiva con L-lisina (0,01-0,5 M) y se analizaron mediante SDS-PAGE. Se observó una banda de aproximadamente 50 kDa en todas las fracciones (Figura 13). Esta banda migraba junto con la enolasa comercial (Sigma).

Se obtuvieron la secuencia parcial del gen de la enolasa y la secuencia de aminoácidos deducida (ID SEC Nº 10 y 20). La comparación del ADN y de las secuencias de aminoácidos deducidas de neumococos y B. subtilis se muestran en las Figuras 14 y 15, respectivamente. Hay 74% de identidad a nivel de ADN y 72% de identidad, 85% de semejanza, a nivel de aminoácidos. Los datos de la secuencia más completa para la enolasa CBP-50, a la que le falta sólo una probable extensión 5' de 42 bases/extensión en el extremo N-terminal de 14 aminoácidos se muestran en las ID SEC Nº 18 y 19, respectivamente.

Además de unirse a fibronectina y a VCAM, el homólogo de la enolasa tiene otras dos propiedades relativas a la virulencia. Se une a la alfa-1-glicoproteína ácida (GPA) que está decorada con hidratos de carbono que son los determinantes clave de unión a células eucarióticas activadas. La GPA se fijó a una columna, se pasó un lisado de neumococos por la columna y se eluyeron las proteínas retenidas en la columna. Eluyó específicamente una proteína de 50 kDa y, tras la secuenciación de los aminoácidos N-terminales, se demostró que era el homólogo de la enolasa. Una segunda propiedad del homólogo de la enolasa es que parece estar ausente en neumococos no virulentos que tienen una fase morfológica distinta a la colonia opaca. Cuando se comparan las proteínas eluidas de neumococos tratados con colina al 2% entre las cepas opacas y transparentes, las opacas pierden la proteína de 112 kDa y la proteína de 50 kDa. Esto indica que la falta de virulencia está asociada con la falta de expresión del homólogo de la enolasa y, por tanto, el homólogo de la enolasa es un verdadero determinante de la virulencia.

Materiales y procedimientos

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento. Se usaron S. pneumoniae de tipo 2 (D39) y los derivados isogénicos no encapsulados R6x y R6. Se ha descrito la cepa neumocócica LM34 delecionada para la producción de la proteína A de la superficie del neumococo (pspA^{-}) [McDaniel y col., Infect. Immun., 59:222-9 (1991)]. Las bacterias se crecieron en agar tríptico de soja que contenía sangre de carnero al 5% durante 16-18 horas a 37ºC en 5% de CO_{2} o en un recipiente con vela.

Fibronectina y fragmentos proteolíticos derivados. La fibronectina del plasma humano se adquirió en Sigma (St. Louis, MO) y en Gibco BRL (Grand Island, NY). En la Figura 5 se representan esquemáticamente los fragmentos designados según el tamaño molecular. Los fragmentos proteolíticos adquiridos en Gibco BRL (indicados entre paréntesis en la Figura 5) incluyen un fragmento tríptico de unión a colágeno de 30 kDa, un fragmento \alpha-quimiotríptico de unión a células de 120 kDa y un fragmento \alpha-quimiotríptico de unión a heparina de 40 kDa. Los fragmentos proteolíticos preparados siguiendo el procedimiento de Vercellotti y col. [Vercellotti y col., J. Lab. Clin. Med., 103:34-43 (1984); McCarthy y col., 1986, supra] (indicado en los recuadros de la Figura 5) incluían un fragmento amino-terminal de 27 kDa, un fragmento de unión a colágeno de 46 kDa, un fragmento de unión a células de 75 kDa, un fragmento de unión a heparina de 33 kDa asociado con un segundo fragmento de 66 kDa (fragmento 33/66 kDa) y un fragmento carboxi-terminal de 31 kDa. Los fragmentos recombinantes del dominio de 33 kDa (véase la Figura 5) se prepararon como se describe en otro lugar [Huesbsch y col., Cir. Res. 77:43 (1995); Verfaille y col., Blood 84:1802 (1994)].

Ensayo de unión a fibronectina inmovilizada, VCAM y fragmentos. La fibronectina, sus fragmentos recombinantes o rsVCAM se inmovilizaron de forma no covalente mediante la absorción pasiva a placas de Terasaki de 60 pocillos (poliestireno humectable [tratado con plasma], Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). Brevemente, los sustratos se reconstituyeron (50 mg/mg) en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) y se dejó cubrir las placas de Terasaki durante 90 min a 37ºC. Posteriormente se bloqueó la superficie de poliestireno con albúmina sérica bovina al 5% (Sigma) durante al menos 3 horas a 37ºC. Antes de usarlas, las placas se lavaron cinco veces con DPBS y se eliminó el exceso de líquido de los pocillos. Se demostró que este procedimiento daba lugar al empaquetamiento multicapa denso preferido de las moléculas de fibronectina adsorbida (2,7 \mug/cm^{2}) [van der Flier y col., 1995, supra].

Las bacterias se marcaron con isotiocianato de fluoresceína como se describe [Geelen y col., Infect. Immun., 61:1538-1543 (1993)] y se resuspendieron en DPBS suplementado con glucosa al 0,05%, Ca^{++} y Mg^{++}. Las suspensiones bacterianas se llevaron a una A_{620} de 0,04, que previamente se estableció que equivalía a 1 x 10^{7} ufc/ml de S. pneumoniae. Se añadieron 10 \mul de bacterias a cada pocillo y se incubó sin agitación durante 1 hora a 37ºC. Las bacterias no unidas se eliminaron lavando cinco veces con DPBS. Las bacterias unidas se fijaron a la superficie mediante la incubación con una solución de glutaraldehido al 2,5% durante 3 minutos. Las bacterias se contaron visualmente con un microscopio invertido (Nikon) equipado con fluorescencia con un filtro IF DM 510. La unión se expresó como el número de bacterias unidas por 0,25 mm^{2} de área superficial. Los valores se corrigieron para la unión inespecífica sustrayendo la adherencia a los pocillos sin recubrir y se presentan como la media \pm desviación típica de al menos 3 experimentos con 3 a 6 pocillos/placa/experimento. Para algunos experimentos, la unión se realizó en presencia de anticuerpo policlonal de conejo anti-R6 neumocócica o uno de los siguientes anticuerpos monoclonales: anti-colina (TEPC-15), anti-PspA Xi126 y XiR278 [McDaniel y col., Microb. Pathog., 13:261-9 (1992)]; anti-adhesina A de la superficie del neumococo, PsaA [Sampson y col., Infect. Immun., 62:319-324 (1994)]; anti-VLA-4 (R & D Systems); y anti-VCAM-1 (R & D Systems). Alternativamente, la inhibición potencial de la unión de neumococos se evaluó en presencia de PspA recombinante o PspA purificadas.

Ejemplo 5 La proteína de unión a colina de112 kd, Cbpa, media en la adhesión de neumococos a células humanas

En este Ejemplo, la nueva CBP de 112 kDa se caracteriza más en profundidad. Funciona como una adhesina, que media en la adherencia a células humanas activadas con citoquinas y participan en la colonización neumocócica de la nasofaringe y es un determinante de virulencia.

Usando colina inmovilizada en una matriz sólida, se purificó una familia de CBP a partir de una cepa pspA^{-} de neumococos. El anticuerpo policlonal frente a estas CBP protege pasivamente a ratones infectados por vía intraperitoneal con una estimulación letal de neumococos. El miembro predominante de esta familia de proteínas, CbpA (o CBP-112), es una proteína de 112 kDa expuesta en la superficie que reacciona con sueros convalecientes humanos. El análisis de la secuencia del gen correspondiente muestra una única secuencia N-terminal y un dominio C-terminal que comprende 10 dominios de unión a colina repetidos similares a los PspA. Un mutante defectivo para cbpA muestra una reducción de más del 50% en la adherencia a células humanas activadas con citoquina y no se puede unir al ácido siálico o a lacto-N-neotetraosa inmovilizados. Este mutante también muestra una reducción de 100 veces en la virulencia en un modelo animal de colonización nasofaríngea. No hay diferencias entre la cepa parental y este mutante en un modelo intraperitoneal de sepsis. Estos datos para CbpA extienden las funciones importantes de la familia de CBP a la adherencia y virulencia bacteriana y representa un nuevo candidato para vacuna neumocócica.

Materiales y procedimientos

Cepas y medios. La cepa D39 de S. pneumoniae de serotipo 2, R6x (derivado no encapsulado de D39), cepa SIII (serotipo 3 capsular) (cada uno obtenido de la colección de la Universidad Rockefeller). La cepa P317 es un serotipo capsular 6B. Se ha descrito una cepa deficiente en lytA [Tomasz, 1988]. LM91 se ha descrito previamente (Larry McDaniel, Universidad de Alabama, Birmingham, AL). Todas las placas se sembraron en placas sobre agar tríptico de soja suplementado con sangre de carnero (TSAB) a una concentración final del 3% (v/v). Los cultivos se crecieron sin aireación a 37ºC en 5% de CO_{2} en un medio líquido de hidrolizado de caseína semisintético suplementado con extracto de levadura (medio C + Y), como se describe en el Ejemplo 1. Los neumococos se crecieron con plásmidos integrados en presencia de 1 mg ml^{-1} de eritromicina. La morfología de las colonias se evaluó en agar tríptico de soja sobre el que se añadieron 5.000 U de catalasa (Worthington Biochemical Co., Freehold, NJ).

Aislamiento de CBP. Para preparar la matriz de afinidad de colina inmovilizada, las perlas de agarosa activadas con vinilsulfona (1 g; Sigma, St. Louis, MO) se lavaron dos veces con 10 ml de agua destilada y a continuación se agitaron una noche a temperatura ambiente en colina 10 mM en tampón carbonato sódico, pH 11,5. Las perlas se lavaron una vez más con 10 ml adicionales de PBS para eliminar la colina no unida.

Se añadieron las perlas de colina-agarosa a 400 ml de cultivo de neumococos (10^{8} ufc/ml) y se incubó durante 30 min. El complejo bacteria-perla se sedimentó mediante centrifugación a 8.000 x g durante 15 min, y se resuspendió en 50 ml de medio C + Y. Las bacterias se lisaron con Triton X-100 (0,5%; agitación durante 20 min) en presencia de leupeptina (20 mg ml^{-1}) y fluoruro de fenil-metil-sulfonilo (100 mg ml^{-1}). El lisado se centrifugó a 1.000 x g durante 5 min para sedimentar las perlas. A continuación, las perlas se lavaron con tres volúmenes (30 ml) de solución salina tamponada con fosfato (PBS) ajustado a NaCl 0,5 M, para eliminar cualquier material no específico unido. El material unido de forma específica a la colina se eluyó con PBS ajustado a una concentración final de colina al 10% (p/v). Este eluído se dializó frente a PBS y, a continuación, se pasó a través de un ultrafiltro Centricon 10 (Amicon Inc. Beverly, MA). El material retenido contenía las CBP.

Procedimientos analíticos e inmunológicos. Las CBP se analizaron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 7,5% con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y mediante inmunotransferencia tras la transferencia electroforética a una membrana de transferencia Immobilon-P (Millipore Corporation, Bedford, MA). Para algunos experimentos, los neumococos se marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) como se describe en el ensayo de adherencia. El análisis por inmunotransferencia se realizó con anticuerpo anti-FITC (Molecular Probes), anti-CBP o antisueros convalecientes cada uno a una dilución de 1:1.000. El anticuerpo unido se detectó con suero de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa con el kit de quimioluminiscencia de Amersham (Cambridge, MA). Los sueros convalecientes eran una mezcla de sueros de cinco pacientes recogidos un mes después de la recuperación de una bateriemia y de una neumonía. Los serotipos capsulares de estos neumococos infectantes eran 3, 7, 14, 22 y 23.

Para el análisis por inmunotransferencia de las CBP en variantes fenotípicas, se crecieron variantes opacas y transparentes derivadas de la cepa R6 a una densidad igual en medio C + Y (D.O._{620} de 0,4). Las células se lavaron en PBS y se resuspendieron en 1/20 del volumen del cultivo original en PBS con o sin cloruro de colina al 2%. Las células se incubaron durante 15 min a 4ºC y se separaron las fracciones celulares y de sobrenadante (eluído). Se separaron las proteínas del eluído en geles de SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a Immobilon-P y se incubaron con el anticuerpo anti-CBP.

Para obtener la información de la estructura primaria de las CBP individuales, se aplicaron las muestras concentradas de la columna de afinidad a colina a un gel de poliacrilamida en presencia de SDS y las proteínas separadas se transfirieron mediante electroforesis a una membrana de transferencia Immobilon-P^{SQ}. Las proteínas se identificaron tras la tinción con negro amido al 0,1%: ácido acético al 10%: metanol al 40%. Las membranas que contenían bandas de proteína teñidas individualmente se escindieron y se remitieron al Centro de Secuenciación de Proteínas de la Universidad Rockefeller para el análisis de la secuencia N-terminal o interna.

Preparación de antisuero de conejo anti-CBP. El antisuero se generó por HRP Inc. (Denver, PA), según los procedimientos descritos en el Ejemplo 1.

Clonación y secuenciación de cbpA. Las técnicas de ADN que incluyen preparaciones de plásmidos, digeridos con endonucleasas de restricción, ligamientos, transformaciones en E. coli y electroforesis en gel se hicieron según los procedimientos convencionales conocidos en la técnica.

La información de la secuencia de ADN inicial de cbpA (ID SEC Nº 24) se obtuvo a partir de fragmentos de ADN generados por PCR anclada. Estos fragmentos se generaron usando cebadores degenerados derivados de la estructura primaria parcial de los fragmentos internos de la proteína purificada (ID SEC Nº 25) purificados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS. Se obtuvo información adicional de la secuencia a partir de los fragmentos generados por PCR producidos con moldes para las regiones terminales de los fragmentos conocidos y el cebador universal anclado. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó usando el kit Gene Amp (Perkin Elmer Cetus). La secuenciación de ADN se realizó en los fragmentos de PCR con un secuenciador de ADN ABI373 usando la reacción química dideoxi de terminación de la cadena marcado con colorante.

Se preparó un oligonucleótido degenerado que correspondía a la secuencia de aminoácidos amino-terminales (ID SEC Nº 1) de CbpA (5'GCTCTTNCTCGATGTCTCNGTNGCCAT3'; sentido) (ID SEC Nº 22). El oligonucleótido complementario (AGCATAGTCTTCTTCGACTTGTTGATCATC) (ID SEC Nº 23) se preparó según la secuencia de aminoácidos interna (ID SEC Nº 10) que era similar a una secuencia interna de PspA. Se preparó el ADN cromosómico total de LM91 como se describe previamente y se añadió (20 ng) a una mezcla de reacción de PCR que contenía 1 mM de cada uno de los cebadores sentido y complementario descritos anteriormente, según las recomendaciones proporcionadas con la ADN polimerasa AmpliTaq. Se realizaron 30 ciclos de PCR con hibridación de oligonucleótidos a 55ºC. La banda de ADN de aproximadamente 600 pb se aisló tras la electroforesis en gel de agarosa con una unidad de filtro ultrafree-MC (0,45 mm, Millipore Corporation, Bedford, MA), se digirió con Sau3A y se ligó en el sitio BamHI del vector pJDC9. Esta mezcla se transformó en E. coli DH5\alpha y se identificó un único clon recombinante que contenía el vector con la inserción.

Se obtuvo información adicional de la secuencia a partir de fragmentos generados por PCR "anclada" usando cebadores basados en los extremos de los fragmentos conocidos y el cebador universal anclado a fragmentos de restricción del ADN cromosómico. La secuenciación de nucleótidos se realizó con un secuenciador de ADN ABI 3373 usando el método dideoxi de terminación de cadena marcado con colorante.

Se creó un mutante deficiente en cbpA mediante mutagénesis por inserción-duplicación. Primero se generó mediante PCR un fragmento de ADN de 643 pares de bases correspondiente a los nucleótidos 554 a 1.196 de cbpA. Este fragmento comprende la región codificadora para los aminoácidos 155 al 372. Una digestión con SauIIIA de este fragmento produjo dos fragmentos de 201 y 195 pares de bases que se aislaron a partir de un gel de agarosa, se ligaron en el sitio BamHI de pJDC9 y se transformaron en E. coli (DH5\alpha). Se identificaron un único transformante que se transformó en las cepas D39 o 6B de neumococo y dos transformantes designados SPRU625 (D39) y SPRU632 (6B) que no expresaban CbpA mediante análisis por inmunotransferencia. El análisis por transferencia genómica confirmó la integración cromosómica del vector de interrupción de cbpA en SPRU625 (datos no mostrados). Se separó el ADN cromosómico digerido con HindIII o EcoRV mediante electroforesis y se transfirió bidireccionalmente a Hybond-N (Amersham). Las membranas se incubaron con el fragmento de PCR de 643 pares de bases marcado con peroxidasa de rábano picante (Amersham RPN 3000) como recomienda el fabricante.

Se realizó el análisis por transferencia genómica sobre el ADN cromosómico digerido con HindIII y EcoRV separado electroforéticamente, se transfirió bidireccionalmente a Hybond-N (Amersham) y se incubó con el fragmento de PCR de 600 pb marcado con peroxidasa de rábano picante (Amersham RPN 3000) como recomienda el fabricante.

Ensayo de adhesión bacteriana. Se cultivó la línea A549 de células de pulmón de tipo II humana (American Type Culture Colection) en medio de mezcla de nutrientes F12 Ham (Sigma, St. Louis, MO) suplementado con suero de ternera fetal al 10% (Sigma). Las células endoteliales derivadas de vena del cordón umbilical humanas (HUVEC; Clonetics, San Diego, CA) se cultivaron en medio M199 (Sigma). Cuando llegaron a la confluencia, las células se prepararon para el subcultivo con tripsina-EDTA al 0,05% (Sigma). Para los ensayos de adherencia, las células se transfirieron a placas de cultivo de Terasaki de 60 pocillos (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA) y se cultivaron durante otras 24 a 48 horas hasta formar una monocapa confluente. Para activar las células humanas, algunas monocapas se incubaron con TNF\alpha (10 ng/ml durante 2 horas; Boehringer-Manheim) o IL-1\beta (5 ng/ml durante 4 horas; Sigma). Antes del
ensayo de adherencia, se retiró el líquido de cultivo lavando la monocapa dos veces con el medio de cultivo tisular.

Las bacterias a una DO_{620} de 0,4 ó 0,6 se lavaron con 1 ml de tampón carbonato (carbonato sódico 0,05 M, cloruro sódico 0,1 M), se resuspendieron en el mismo tampón y se marcaron con FITC (Sigma; 1 mg ml-1) durante 20 minutos en oscuridad a temperatura ambiente (LO). Después de 3 lavados con tampón carbonato, las bacterias se resuspendieron en medio M199 sin antibióticos y se incubaron 5 x 10^{7} neumococos por pocillo durante 30 min a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5%. Después de eliminar las bacterias no unidas lavando las monocapas cinco veces con M199, las células y las bacterias se fijaron en glutaraldehido al 2,5% durante 3 min y se lavaron cinco veces con PBS. Los neumococos adherentes se contaron visualmente con un microscopio de campo invertido (Diaphot-TDM; Nikon Inc., Melville, NY) equipado para epifluorescencia con un filtro IF DM-510 y se expresó como el número de bacterias unidas por 100 células de pulmón. Se promediaron los valores de 6-9 pocillos y cada experimento se realizó 3-6 veces.

Para analizar la capacidad de la mezcla de CBP para tener efecto sobre la adherencia a células eucarióticas, el ensayo se modificó de modo que las monocapas se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon) recubiertas con gelatina al 0,2% y cuando alcanzaron la confluencia se incubaron con un intervalo de concentraciones de la mezcla de CBP (1 \mug a 1 mg ml^{-1}) durante 15 min. Después de lavar, las monocapas tratadas con CBP se estimularon con 5 x 10^{6} neumococos durante 30 min, se lavaron y se cuantificó la adherencia como la intensidad de fluorescencia medida en un Cytofluor II (Perseltive) con excitación a 485 nm y emisión a 530 nm.

La adherencia a glicoconjugados se evaluó cubriendo las placas de Terasaki durante una noche con 100 M de 6'sialillactosa-HSA, lacto-N-neotetraosa-HSA, N-acetilglucosamina-\beta1,4-glucosa-HSA o N-acetilglucosamina-\beta1,3-glucosa-HSA (Neose Inc., Horsham, PA). Se lavaron los pocillos y se añadieron 1 x 10^{7} neumococos marcados con FITC durante 30 min a 37ºC. Las células no unidas se eliminaron lavando tres veces con PBS y se cuantificó la adherencia visualmente como se describe anteriormente. Cada glicoconjugado se analizó en 18 pocillos durante tres experimentos.

Protección pasiva frente a la estimulación sistémica. Se mantuvieron ratones de la progenie CF1 en condiciones específicas sin patógenos según las directrices institucionales y del NIH. Se crecieron neumococos encapsulados durante 5 horas en medio C + Y y se diluyó en PBS. Dos grupos de diez ratones recibieron un inóculo de 4,5 x 10^{4} ufc de D39 mediante inyección en la cavidad peritoneal. Una hora después de la estimulación bacteriana, un grupo de ratones recibieron suero de conejo anti-CBP por vía intraperitoneal (0,5 ml 1:10 en PBS). Los animales control recibieron suero preinmune. Se llevó a cabo un segundo experimento a una dosis de estimulación más alta, con dos grupos de cinco ratones cada uno que recibieron 8,4 x 10^{4} ufc de neumococos. Para la estimulación con SIII, los grupos de cinco ratones recibieron 200 ufc por vía intraperitoneal de SIII sin tratar o SIII preincubado durante 30 min con antisuero anti-CBP. SIII es una cepa muy virulenta con una DL_{50} de menos de 10 bacterias.

Estimulación nasofaríngea. La colonización nasofaríngea de ratas Sprague Dawley de 1 a 5 días de edad por neumococos se realizó como se describe previamente usando aislados de dos serotipos capsulares 2 (D39) y 6B (P317). Para cada experimento, las camadas se distribuyeron aleatoriamente y se clasificaron en grupos de 10 crías por cepa de neumococos. Cada cría recibió inóculos intranasales iguales de 10^{4} ufc en 10 ml de PBS de la cepa parental (D39 o P317) o el mutante isogénico que contenía una mutación definida en cbpA. Como control adicional se usó una cepa isogénica (P354) que contenía una interrupción en el gen de Ia IgA1 proteasa de la superficie, iga. La colonización se evaluó a las 24 y 120 horas tras la inoculación. Para asegurar la evaluación precisa de las bacterias recuperadas, se hicieron diluciones seriadas del líquido de los lavados nasales, se sembraron en placas y se determinaron los recuentos de colonias. Los resultados se expresan como la media geométrica de cada grupo ± la desviación típica (n=20).

Resultados

Caracterización de las CBP. Como en el Ejemplo 1, se preparó una mezcla de CBP incubando una matriz de afinidad a colina con una cepa de bacterias deficiente para pspA, seguido de la lisis celular, tratando las perlas con una solución con alta concentración de sales para eliminar el material unido inespecíficamente y eluyendo las CBP una solución de colina al 10%. La CBP, LytA (muramidasa), se siguió en los procedimientos preparativos y analíticos mediante el análisis por inmunotransferencia y sirvió como control positivo. El análisis electroforético de la preparación de CBP mostró al menos ocho proteínas mayores de 45 kDa. Una proteína con una masa molecular aparente de 112 kDa era la más abundante. La muramidasa, LytA, está presente en la preparación con una masa molecular de 36 kDa, confirmando la especificidad de la técnica.

Para determinar si esta mezcla de CBP contenía antígenos protectores, se obtuvo un anticuerpo policlonal frente a la mezcla de CBP y se analizó su capacidad para proteger ratones de forma pasiva a partir de una estimulación intraperitoneal con bacterias a una concentración 1.000 veces superior a la DL_{50} (Figura 16A). Nueve de los diez animales que recibieron suero preinmune murieron en 3 días, a diferencia de los animales que recibieron anticuerpo anti-CBP. En un segundo experimento usando un inóculo 2 veces superior, el 100% de los animales tratados con suero preinmune murieron en un día, mientras que todos los animales tratados con anti-CBP sobrevivieron seis días. Se analizó, a continuación, la protección del antisuero frente a la sepsis inducida por el tipo capsular heterólogo (tipo 3). Todos los ratones controles que recibieron SIII solo por vía intraperitoneal o SIII con suero preinmune, presentaban bacteriemia en 24 horas con un amplio intervalo de densidades bacterianas de 2 x 10^{4} a 1 x 10^{7} ufc/ml. Por el contrario, los animales que recibieron SII con el suero anti-CBP o suero anti-Tipo III mostraron menos de 10^{4} bacterias/ml de sangre. Esta diferencia se reflejaba en la supervivencia a 36 y 48 horas. La mitad de los animales control murieron en 48 horas, mientras que ninguno de los que recibieron anticuerpos anti-CBP o anti-Tipo III murieron durante el mismo intervalo de tiempo. La protección se superaba finalmente y todos los animales morían en 72 horas, independientemente del tratamiento.

Para determinar si la mezcla de CBP podía contener adhesinas, se analizó la capacidad de la mezcla de CBP para inhibir la adherencia del neumococo a células endoteliales y epiteliales. La preincubación de las células eucarióticas con las CBP dio lugar a una disminución en la adherencia a las células epiteliales de aproximadamente el 50% y a las células endoteliales de más del 80% (Figura 17A). Este fenómeno era dependiente de la dosis, requiriendo la mitad de la actividad máxima aproximadamente 60 \mug/ml de CBP (Figura 17B).

En base a los indicios de que la mezcla de CBP contenía posibles antígenos protectores y ligandos adhesivos, se estudiaron con mayor profundidad las CBP individuales. Se buscaron características que fueran importantes para CBP bioactivas, específicamente la localización en la superficie del neumococo y la reactividad con antisueros convalecientes humanos y con el suero anti-CBP protector. Se marcaron neumococos intactos con FITC y a continuación se sometieron a fraccionamiento de CBP. El SDS-PAGE y el análisis por inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-FITC mostraron cuatro proteínas marcadas con FITC tanto en preparaciones de células completas como en preparaciones de CBP. Esto concuerda con el acceso de este grupo de CBP al medio extracelular de neumococos en la bacteria nativa. Cinco CBP reaccionaban con los antisueros convalecientes humanos y la banda de 112 kDa estaba marcada predominantemente en preparaciones de neumococos completos. Se daba este mismo patrón usando anticuerpo anti-CBP, que marcaba predominantemente la banda de 112 kDa en neumococos intactos y preparaciones de CBP.

Como resultado de la localización de la banda de 112 kDa en la superficie del neumococo y su fuerte reactividad con antisueros convalecientes y sueros de conejo anti-CBP protectores preparados a partir de bacterias completas o el procedimiento de fraccionamiento de CBP descrito, se determinó que la proteína de 112 kDa es el componente proteico principal de la mezcla de CBP y designado, de este modo, CbpA.

Clonación y análisis de la secuencia de cbpA. El análisis directo de los aminoácidos N-terminales de CbpA reveló una única secuencia (ID SEC Nº 1) sin similitud con las proteínas de ninguna de las bases de datos publicadas. Por el contrario, una secuencia interna (ID SEC Nº 10) era idéntica a una secuencia interna de la CBP, PspA. Puesto que para identificar cbpA se usó una cepa deficiente para pspA, este resultado no era un artefacto debido a un reordenamiento genético de pspA, pero probablemente representaba un gen compuesto de una única región codificadora 5' y una región codificadora 3' similar a pspA. Usando una estrategia basada en la PCR, se clonó y secuenció cbpA. El análisis por transferencia genómico usando una única sonda para la región 5' (véase la sección Procedimiento experimental) indicaba una única copia de cbpA en el cromosoma LM91 (datos no mostrado).

El análisis de la secuencia proteica derivada de cbpA reveló varias propiedades únicas. CbpA es una proteína de 630 aa con una masa molecular aparente de 71 kDa. Ésta es diferente de la masa molecular calculada (112 kDa) en función de sus propiedades migratorias por SDS-PAGE. La presencia de una secuencia señal N-terminal convencional implica la exportación dependiente de SecA. La proteína tiene dos dominios distintos. La región N-terminal (1-340) no tiene similitudes obvias con proteínas introducidas en las bases de datos publicadas. El análisis de Ganier-Robson predijo seis regiones alfa-hélice desde los restos 10-350. Se predijeron cinco estructuras de superhélice de más de 50 aa de longitud en esta misma región con el algoritmo de Paircoil. Por el contrario, la región C-terminal (341-360) era casi idéntica (> 95%) a PspA. Esta similitud se extiende a la secuencia de nucleótidos correspondiente. Las características comunes son una región rica en prolina (340-370) y diez secuencias tandem repetitivas directas de 20 aa (381-584) que representan el motivo de unión a colina que es el rasgo característico de la proteínas de unión a colina.

Variación fenotípica y expresión de las proteínas de unión a colina. Puesto que se demostró que las variantes opacas y transparentes de neumococos tenían diferencias en la expresión de la CBP LytA, se comparó la expresión de las CBP entre las variantes opacas y transparentes de una cepa no encapsulada (R6x) con suero anti-CBP. Aunque todas las bandas estaban presentes en ambos fenotipos, varias bandas diferían entre los tipos celulares opaco y transparente. Los organismos transparentes tenían cantidades significativamente más altas de LytA, como se documentó previamente. Además, la variante transparente expresaba cantidades aumentadas de CbpA y PspA. Por el contrario, los neumococos opacos tenían más PspA. En estos datos, las bandas secundarias de entre 70 y 90 kDa parecían ser productos de la degradación de PspA y CbpA. Había una proteína de aproximadamente 50 kDa presente en los organismos transparente independientemente de la presencia de colina, lo que sugería que ésta no era una CBP. Como control adicional, la identidad de estas CBP, LytA y PspA, se confirmó por la ausencia de estas bandas en el material obtenido de mutantes defectuosos para los genes correspondientes (datos no mostrados).

Análisis funcional del mutante CbpA. Para evaluar las bioactividades que pudieran estar afectadas por CbpA, se construyeron mutantes genéticos en diversos ensayos.

La velocidad de crecimiento de los mutantes CbpA^{-} en medio semisintético era equivalente a la del tipo silvestre y la tasa de variación fenotípica de variantes de colonias transparentes a opacas no estaba alterada con respecto a la cepa parental (datos no mostrados). Otras propiedades fisiológicas de los neumococos tampoco variaban, incluyendo la eficacia de la transformación de ADN de un marcador de resistencia a estreptomicina, lisis en la fase estacionaria y lisis inducida por penicilina (datos no mostrados).

Se analizó la capacidad del mutante deficiente para cbpA del serotipo capsular 2 para adherirse a células epiteliales de pulmón y a células endoteliales humanas y glicoconjugados. El mutante se adhería a aproximadamente el 80% de los niveles de la cepa parental (Figura 18A, B).

Esto coincidía con la capacidad equivalente de las dos cepas para adherirse a GalNAc-\beta1,4-Gal y GalNAc-\beta1,3-Gal, azúcares que se sabe son receptores en estas células eucarióticas (Cundell) (Figura 8C). Sin embargo, se detectó una diferencia en la adherencia entre la cepa parental y mutante con células activadas por citoquinas. La adherencia de la cepa parental a células activadas por citoquinas aumentaba a \sim135% de los valores de células en reposo. Por el contrario, la adherencia de los mutantes deficientes para cbpA no aumentaba para las células de pulmón o epiteliales (Figura 18A). Este defecto en la adherencia a células activadas por citoquinas concordaba con la ausencia de adherencia del mutante a glicoconjugados purificados (ácido siálico y lacto-N-neotetraosa, LnNT) conocidas por ser receptores para los neumococos en las células activadas por citoquinas (Figura 18C).

Se usó un modelo de crías de rata de transporte neumocócico para determinar si la capacidad de CbpA para mediar la adherencia a célula epiteliales humanas se correlacionaba con la capacidad de los neumococos para colonizar la nasofaringe. En este modelo animal, los neumococos persistían en la superficie mucosa a altos niveles durante muchos días tras una pequeña inoculación intranasal. A diferencia de los controles que tenían una cepa de serotipo capsular 2 y un mutante isogénico deficiente para iga (la IgA1 proteasa es otra proteína de la superficie), el mutante deficiente para cbpA era más de 100 veces menos eficaz en la colonización de la nasofaringe de crías de rata (Figura 19). Se obtuvieron resultados similares comparando una cepa de serotipo capsular 6B (P317) y un mutante isogénico deficiente para cbpA. El valor de bacterias medio es el lavado nasal en 24 horas para animales estimulados con la cepa parental era de 3,1 x 10^{4} ufc/ml (n=9). Por el contrario, de 6 a 10 crías estimuladas con la cepa 6B deficiente cbpA^{-} no portaban bacterias detectables (límite de detección, 100 ufc/ml), dos crías, 100 ufc/ml y 2 crías, 200 ufc/ml.

A diferencia de los resultados obtenidos en la nasofaringe, no se detectaron diferencias significativas en virulencia en un modelo de sepsis inducida por neumococos con un serotipo capsular 2, mutante deficiente para cbpA.

Discusión

Para estudiar la excepcional familia de proteínas de superficie CBP, se desarrolló una aproximación genética inversa por lo cual se usó una matriz de colina inmovilizada para capturar selectivamente las CBP de los neumococos intactos. Se eligió el mutante deficiente para pspA, LM91 como fuente de CBP para evitar la purificación del producto génico. La purificación y el análisis electroforético de las proteínas retenidas en la matriz de colina revelaron al menos ocho CBP. Se descubrieron varias propiedades importantes de esta mezcla. El antisuero frente a la mezcla de CBP protegía a los ratones frente a la estimulación con la cepa de serotipo capsular 2 de la que derivaba la mezcla de CBP. Además, el antisuero disminuía el nivel de bacteriemia y prolongaba la supervivencia de los ratones estimulados con una cepa de serotipo 3 heteróloga y muy virulenta. Esta protección cruzada sugiere que algunas CBP pueden compartir epítopes protectores entre los serotipos.

Además de generar un antisuero con actividad protectora, la mezcla de CBP inhibía la adherencia de neumococos cuando se aplicaba directamente a las células epiteliales pulmonares y a células endoteliales vasculares. Estas células son modelos in vitro para la adherencia de neumococos a lugares de infección neumocócica (NEJM). Esto sugiere que las CBP se unían a receptores en las células humanas y, de este modo, prevenían la unión bacteriana mediada por CBP. La demostración de una interacción directa CBP-célula humana que conduce a una pérdida de adherencia diferencia las CBP de todas las demás proteínas de neumococos que afectan a la adherencia bacteriana identificadas en estudios genéticos Mientras que la pérdida de estos otros elementos disminuye la capacidad de adherencia de las bacterias, no existe ningún indicio de que exhiban una inhibición competitiva de la adherencia, una característica clave de una adhesina estructural. Estas propiedades de adherencia y virulencia de la mezcla de CBP animaban a realizar análisis adicionales de las CBP individuales.

Se eligió CbpA para estudios adicionales porque era la CBP más abundante en la mezcla, se exponía en la superficie y reaccionaba fuertemente tanto con el anticuerpo convaleciente humano como con el suero protector anti-CBP de ratón, tanto en bacterias completas como en una preparación de CBP tras la purificación. Aunque de la secuencia se predice un peso molecular de 71 kDa, la proteína migra con una masa aparente de 112 kDa en SDS-PAGE, una discrepancia que también es característica de otra CBP, PspA. Los dominios de unión a colina de CbpA parecen ser idénticos a los de PspA, tanto a nivel de aminoácidos como de nucleótidos y, por consiguiente, de las estructuras génicas para estos elementos. Los dominios N-terminales de las dos CBP son muy diferentes en su secuencia primaria, y aún comparten características estructurales comunes, tales como varias regiones alfa-hélice grandes y cinco regiones superhélice. Esto sugeriría que CbpA puede ser una proteína fibrosa análoga de PspA, tropomiosina, troponina y la familia de la proteína M de proteínas estreptocócica. Parece razonable que el dominio N-terminal de CbpA contenga uno o dos dominios lectina capaces de unir LnNT y ácido siálico. Cabria esperar que estos dominios de lectina se mantuvieran conservados entre cepas y serotipos puesto que deben retener la capacidad para unirse a los receptores glicoconjugados humanos diana para mantener la virulencia. Esta conservación puede contribuir a la protección cruzada entre diversos serotipos, tal como se observó para el anticuerpo anti-CBP.

La expresión de CbpA parece variar coincidiendo con la transición de fase entre las variantes opaca y transparente. Algunas CBP, tales como PspA, se expresan en cantidades más elevadas en las variantes opacas. CbpA varía de la misma manera que LytA, de modo que las variantes transparentes expresan cantidades aumentadas de esta proteína. Se desconoce el significado del aumento de PspA en organismos opacos y la función de esta CBP. Por el contrario, el aumento de expresión de LytA y CbpA en las formas transparentes se correlaciona con un aumento de la adherencia y de la colonización. No se ha podido demostrar una función para LytA en la colonización. Por el contrario, la función de
CbpA en la adherencia y colonización se confirmó directamente mediante el análisis del mutante deficiente para cbpA.

Se ha propuesto un modelo en dos etapas para la adherencia de neumococos. Inicialmente, los neumococos se dirigen a un nicho en el huésped mediante la unión a glicoconjugados de la superficie, tales como GalNAc-\beta1,4-Gal y GalNAc-\beta1,3-Gal, en la superficie de las células eucarióticas. Un mutante deficiente para cbpA no tenía afectadas sus propiedades de adherencia a estas células o a los glicoconjugados correspondientes. Se cree que una segunda etapa de adhesión conduce a la invasión y se observa tras la activación por citoquinas de la célula humana. En las células activadas aparecen nuevos azúcares específicos que dan lugar al aumento de la adherencia neumocócica. Este segundo nivel de adherencia se distingue por la capacidad de los glicoconjugados sializados (6'SL) y LnNT para inhibir la unión bacteriana. Estos azúcares no son análogos de receptores para las células en reposo. Un mutante deficiente para cbpA pierde la capacidad para unirse a células activadas por citoquinas o a 6'SL y LnNT inmovilizadas. Junto con la capacidad de las CBP purificadas para inhibir la unión de neumococos, estos resultados sugieren que CbpA puede ser una adhesina estructural con posible actividad lectina. Se sugiere que las células activadas por citoquinas expresan el receptor del factor activador de plaquetas (PAF) que puede unirse a la fosforilcolina de la pared celular de neumococos. La presencia de CBP adheridas a la fosforilcolina enmascararía presumiblemente la unión de fosforilcolina al receptor de PAF. Se desconoce el número relativo de determinantes de fosforilcolina libres frente a los unidos a CBP en la superficie de neumococos. Parece que tanto CbpA como la fosforilcolina participan en la unión de neumococos a células humanas activadas.

CbpA parece representar el primer ejemplo de una adhesina proteica en la superficie de neumococos. Puede actuar como un puente entre la fosforilcolina de la pared celular, unida por las repeticiones de unión a colina C-terminales, y los glicoconjugados de las células humanas, presumiblemente a través del dominio N-terminal. La capacidad de unión está restringida a las células humanas activadas y puede, por tanto, ser importante para promover el curso de la enfermedad de una colonización benigna a la invasión. Esto también está de acuerdo con los resultados que sugieren que CbpA está sujeto a variación de fase y que es un marcador para las variantes de fase transparentes competentes en la colonización. Por consiguiente, las CBP, y CbpA (CBP-112) en especial, son dianas atractivas para el desarrollo de vacunas e inmunoterapia pasiva.

Mientras que la invención se ha descrito e ilustrado en este documento a través de referencias a diversos materiales, procedimientos y ejemplos específicos, se entiende que la invención no se restringe a las combinaciones materiales en particular de material, y procedimientos seleccionados para ese propósito. Pueden implicarse numerosas variaciones de estos detalles como apreciarán los expertos en la materia.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Masure, H. Robert

\hskip3.9cm

Rosenow, Carsten I.

\hskip3.9cm

Tuomanen, Elaine

\hskip3.9cm

Wizemann, Theresa M.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS DE UNIÓN A COLINA PARA VACUNAS FRENTE A NEUMOCOCOS.

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 25

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: David A. Jackson, Esq.

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(B): CALLE: 411 Hackensack Ave, Continental Plaza, 4º Piso

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(C): CIUDAD: Hackensack

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(D): ESTADO: Nueva Jersey

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL: 07601

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(v): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: IBM compatible con PC

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Jackson Esq., David A.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 26.742

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 600-1-158

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: 201-487-5800

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 201-343-1684

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(A): DESCRIPCIÓN: cBP112

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cBP90

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cBP84

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cBP80

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cBP78

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cBP70

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cBP60

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cBP50 pep

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cBP112-Int1

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: cBP112-Int2

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: proteína de 50 kDa

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: S. pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

13

2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: proteína de 50 kDa

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: B. subtilis

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 210 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: S. pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 210 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: B. subtilis

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 70 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: S. pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 70 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: B. subtilis

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1511 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: S. pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 420 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: S. pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 429 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: S. pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 142 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: S. pneumoniae

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 21:

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador oligonucleotídico"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador oligonucleotídico"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2462 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 24:

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 631 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 25:

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Claims

1. Una proteína de unión a colina que tiene una o más de las características siguientes:

a) inhibir la adherencia de Streptococcus a células huésped;

b) ser reactiva con los sueros de los pacientes infectados o recuperándose de una infección con la bacteria;

c) ser reactiva con antisueros de conejo generados frente a dicha proteína de unión a colina; y

d) ser marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) sin requerir la lisis estreptocócica (es decir, en bacterias intactas).

en la que dicha proteína de unión a colina se puede obtener de Streptococcus pneumoniae, tiene un peso molecular aparente en SDS-PAGE al 10% de 112 kDa o 50 kDa y comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las ID SEC Nº 1, 8 a 10, 19, 21 y 25.

2. La proteína de unión a colina de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 19 o ID SEC Nº 25.

3. La proteína de unión a colina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 marcada con un marcador detecta-
ble.

4. Una vacuna que comprende la proteína de unión a colina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable, en la que dicha proteína de unión a colina tiene un peso molecular aparente en SDS-PAGE al 10% de 112 kDa y comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las ID SEC Nº 1, 9 a 10, 21 y 25.

5. La vacuna de la reivindicación 4 que adicionalmente comprende: a) una proteína de unión a colina adicional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2; b) PspA, c) autolisina (LytA) o d) cualquier combinación de uno o más de los anteriores.

6. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a colina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, que adicionalmente comprende:

a) PspA o autolisina (LytA);

b) un antibiótico;

c) una vacuna de proteína de unión a anti-colina, en la que la proteína de unión a colina es una proteína de unión a colina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2; o e) una vacuna anti-estreptocócica.

8. Un anticuerpo purificado frente a la proteína de unión a colina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

9. Un anticuerpo monoclonal frente a la proteína de unión a colina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

10. Una línea celular inmortal que produce un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 9.

11. El anticuerpo de la reivindicación 8 o la reivindicación 9 marcado con un marcador detectable.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en el que el marcador es una enzima, un compuesto químico que sea fluorescente o un elemento radioactivo.

13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 8 o de la reivindicación 9, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un ácido nucleico purificado que codifica la proteína de unión a colina de la reivindicación 2, o un ácido nucleico purificado que es homólogo de dicho ácido nucleico y codifica una proteína de unión a colina.

15. El ácido nucleico purificado de la reivindicación 14, en el que al menos el 75% de los nucleótidos coinciden a lo largo de la longitud definida de la secuencia de nucleótidos de dicho ácido nucleico que codifica la proteína de unión a colina de la reivindicación 2.

16. El ácido nucleico purificado de la reivindicación 14, en el que al menos el 80% de los nucleótidos coinciden a lo largo de la longitud definida de la secuencia de nucleótidos de dicho ácido nucleico que codifica la proteína de unión a colina de la reivindicación 2.

17. El ácido nucleico purificado de la reivindicación 14, en el que al menos el 90% de los nucleótidos coinciden a lo largo de la longitud definida de la secuencia de nucleótidos de dicho ácido nucleico que codifica la proteína de unión a colina de la reivindicación 2.

18. El ácido nucleico purificado de la reivindicación 14, en el que al menos el 95% de los nucleótidos coinciden a lo largo de la longitud definida de la secuencia de nucleótidos de dicho ácido nucleico que codifica la proteína de unión a colina de la reivindicación 2.

19. El ácido nucleico de la reivindicación 14 que es una molécula de ADN que tiene una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene una cualquiera de las secuencias como se representa en las ID SEC Nº 19 y 25.

20. Una molécula de ADN recombinante de la reivindicación 19.

21. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 20, que tiene una secuencia de nucleótidos como se representa en la ID SEC Nº 18 desde el nucleótido 1 al codón de terminación TAA o que tiene una secuencia de nucleótidos como se representa en la región codificadora de la ID SEC Nº 24.

22. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 20 o de la reivindicación 21, en la que la molécula de ADN está unida de forma operativa a una secuencia de control de la expresión.

23. Un huésped unicelular transformado con la molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22.

24. Una vacuna de ácido nucleico que comprende una molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22.

25. Un procedimiento para detectar la presencia de una proteína de unión a colina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la proteína de unión a colina se mide:

a) poniendo en contacto una muestra en la que se sospecha la presencia o actividad de la proteína de unión a colina con un anticuerpo frente a la proteína de unión a colina en condiciones que permitan que se produzca la unión de la proteína de unión a colina a la pareja de unión; y

b) detectando si se ha producido la unión entre la proteína de unión a colina de la muestra y el anticuerpo;

en el que la detección de la unión indica la presencia o actividad de la proteína de unión a colina en la muestra.

26. Un procedimiento para detectar la presencia de una bacteria que tiene un gen de una proteína de unión a colina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende:

a) poner en contacto una muestra en la que se sospeche la presencia o actividad de la bacteria con un oligonucleótido que híbrida con el gen de la proteína de unión en condiciones que permiten que tenga lugar la hibridación específica del oligonucleótido con el gen; y

b) detectar si la hibridación ha tenido lugar entre el oligonucleótido y el gen;

en el que la detección de la hibridación indica la presencia o actividad de la bacteria en la muestra.

27. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la adhesión estreptocócica a la fibronectina que es: un péptido de no más de 15 restos de aminoácidos teniendo la secuencia de aminoácidos WQPPRARI (ID SEC Nº 11); la proteína de unión a colina de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la ID SEC Nº 8 o la ID SEC Nº 19; o un anticuerpo específico para la secuencia de aminoácidos WQPPRARI.

28. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, que se adapta para la administración pulmonar.

29. La proteína de unión a colina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, 13, 27 y 28 o el anticuerpo de la reivindicación 8 o reivindicación 9, para su uso para tratar la infección de una bacteria que expresa una proteína de unión a colina.

30. La vacuna de las reivindicaciones 4-5 ó 24 para su uso para prevenir la infección con una bacteria que expresa una proteína de unión a colina.

31. Uso de la vacuna de las reivindicaciones 4-5 ó 24 en la fabricación de un medicamento para la prevención de la infección con una bacteria que expresa una proteína de unión a colina.

32. Un ácido nucleico que codifica una proteína de unión a colina, en el que el ácido nucleico es homólogo a la secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 21, en el que dicha secuencia de nucleótidos es como se representa en la región codificadora de la ID SEC Nº 24.

33. El ácido nucleico de la reivindicación 32, en el que al menos el 80% de los nucleóticos coindicen a lo largo de la longitud de la secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 21, en el que dicha secuencia de nucleótidos es como se representa en la región codificadora de la ID SEC Nº 24.

34. El ácido nucleico de la reivindicación 32, en el que al menos el 90% de los nucleóticos coindicen a lo largo de la longitud de la secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 21, en el que dicha secuencia de nucleótidos es como se representa en la región codificadora de la ID SEC Nº 24.

35. El ácido nucleico de la reivindicación 32, en el que al menos el 95% de los nucleóticos coindicen a lo largo de la longitud de la secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 21, en el que dicha secuencia de nucleótidos es como se representa en la región codificadora de la ID SEC Nº 24.