ES2255715T3 - Diagnostico y tratamiento de transtornos relacionados con la aur-1 y/o la aur-2. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LOS POLIPEPTIDOS AUR 1 Y/O AUR - 2, ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN DICHOS POLIPEPTIDOS, CELULAS, TEJIDOS Y ANIMALES QUE CONTENGAN DICHOS ACIDOS NUCLEICOS, ANTICUERPOS CONTRA DICHOS POLIPEPTIDOS, ENSAYOS UTILIZANDO DICHOS POLIPEPTIDOS, Y METODOS RELACIONADOS CON TODO LO ANTERIOR. SE PROPORCIONAN METODOS PARA EL TRATAMIENTO, DIAGNOSTICO, Y BUSQUEDA DE ESTADOS O ENFERMEDADES RELACIONADAS CON EL AUR - 1 Y/O EL AUR - 2 QUE SE CARACTERIZAN POR UNA INTERACCION ANORMAL ENTRE UN POLIPEPTIDO AUR - 1 Y/O AUR - 2 Y UN SEGUNDO COMPONENTE AL QUE SE UNE AUR - 1 Y/O AUR - 2.

Description

Diagnóstico y tratamiento de trastornos relacionados con la AUR-1 y/o la AUR-2.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a las nuevas proteínas denominadas AURORA UNO y AURORA DOS ("AUR-1" y "AUR-2"), a secuencias de nucleótidos que codifican a la AUR-1 y/o a la AUR-2 así como a varios productos y métodos útiles para el diagnóstico y el tratamiento de diversos trastornos y estados patológicos relacionados con la AUR-1 y/o la AUR-2.

Antecedentes de la invención

La siguiente descripción de los antecedentes de la invención se facilita para ayudar a comprender la invención, pero no se admite que sea la técnica anterior de la invención.

La transducción de señales celulares es un mecanismo fundamental por el que los estímulos externos, que regulan diversos procesos celulares, se transfieren al interior de las células. Uno de los mecanismos bioquímicos clave de la transducción de señales implica la fosforilación reversible de proteínas, que permite la regulación de la actividad de proteínas maduras mediante la alteración de su estructura y de su funcionamiento.

Las proteína-quinasas mejor caracterizadas de los eucariotas fosforilan las proteínas del resto alcohol de los grupos serina, treonina y tirosina. Estas quinasas se subdividen en general en dos grupos, las específicas de la fosforilación de serinas y treoninas y las que son específicas de la fosforilación de tirosinas. Algunas quinasas, denominadas quinasas de "especificidad dual", son capaces de fosforilar los restos tirosina y también los restos serina/treonina.

Las proteína-quinasas pueden caracterizarse también por su ubicación dentro de la célula. Algunas quinasas son proteínas de tipo receptor transmembrana, capaces de alterar directamente su capacidad catalítica en respuesta al entorno externo, por ejemplo la fijación de un ligando. Otras son proteínas de tipo no receptor, que carecen del dominio transmembrana. Pueden hallarse en una gran variedad de compartimentos celulares, desde la superficie interior de la membrana celular hasta el núcleo.

Muchas quinasas intervienen en las cascadas reguladoras, en las que sus sustratos pueden incluir otras quinasas, cuyas actividades están reguladas por su estado de fosforilación. Finalmente, la actividad de algún efector en dirección a 3'(downstream) está modulada por la fosforilación resultante de la activación de tal conducto.

La familia de las serina/treonina-quinasas incluye a miembros que se hallan en todos los pasos de varias cascadas de señalización, incluidos los que intervienen en el crecimiento, la migración y la diferenciación celulares y la secreción de hormonas, la fosforilación de factores de transcripción que conduce a una alteración de la expresión genética, a la contracción muscular, al metabolismo de la glucosa, al contro de la síntesis de proteínas celulares y a la regulación del ciclo celular.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos AUR-1 y/o AUR-2, a ácidos nucleicos que codifican a tales polipéptidos, a células que contienen tales ácidos nucleicos, a anticuerpos contra tales polipéptidos, a ensayos que utilizan dichos polipéptidos y a métodos relacionados con todo lo anterior. La presente invención se basa en el aislamiento y la caracterización de nuevas proteínas que hemos denominado AUR-1 y/o AUR-2. Los polipéptidos y ácidos nucleicos pueden producirse empleando técnicas estándar bien conocidas de síntesis, si se dan las secuencias presentas aquí. La AUR-1 y la AUR-2 son serina/treonina-quinasas afines, de extensiones N-terminales cortas. Los homólogos de Drosophila y de levadura parecen intervenir en la regulación mitótica. Las proteínas humanas parecen participar en el cáncer y/u otros trastornos de transducción de señales. El RNA de la AUR1 se expresa ampliamente en células de división rápida, derivadas de tejidos tanto normales como tumorales. En cambio, el RNA de la AUR2 se expresa en un modelo más restringido, estando poco presente o incluso ausente de la mayor parte de tejidos normales y abundante solamente en un subgrupo de líneas celulares derivadas de tumores, en particular las de origen colorrectal.

Tanto la Aurora1 como la Aurora2 presentan una expresión intermedia en el hígado fetal, en los testículos de adultos y en el timo, lo cual sugiere un rol normal de estas proteínas en la división meiótica.

Tanto la AUR1 como la AUR2 parecen regular la división nuclear, la interrupción de su señalización provoca la formación de células poliploides. Este fenotipo se debe probablemente a la mala segregación cromosómica, tal como se observa en su homólogo de levadura IPL1. Dado que la poliploidía es un distintivo de las células tumorales y de células que carecen del supresor tumoral p53, hemos verificado el rol de la AUR1 y de la AUR2 en la transformación celular.

El análisis de la secuencia primaria de los genes humanos revela que contienen un dominio de proteína-quinasa C-terminal muy conservado y un dominio N-terminal débilmente conservado de 74 a 130 aminoácidos que desempeña un papel o función reguladora como motivo de fijación a sustrato. Los genes humanos contienen además un sitio R/KR/KXS/T de fosforilación cAMP/PKA en el bucle de activación del dominio quinasa, lo cual sugiere que existe un conducto regulador similar al ciclo celular regulado por proteínas afines CDC2/CDK.

El análisis "Southern" con sondas derivadas de las regiones N-terminales únicas de la AUR1 y de la AUR2 indica que existen en forma de genes de copia simple en las células humanas. Sin embargo, en condiciones de baja restricción, hemos podido detectar fragmentos SacI de 1,3 kb y 3,2 kb, que se hibridan débilmente con la sonda de AUR1. La clonación y el análisis de secuencia revelan que esta región codifica a un pseudogén sin intrón relacionado con la AUR1 (llamado AUR3), con múltiples desplazamientos de marco. Además, en posición inmediatamente siguiente en dirección a 5'(upstream) del pseudogén AUR3 existe una región con repeticiones invertidas de complejo, que previsiblemente forman un bucle de herradura (hairpin loop) muy estable. La secuencia del DNA de la AUR3 es homóloga de la AUR1 y empieza con el primer nucleótido del cDNA de la AUR1. En posición inmediatamente contigua a este sitio en dirección a 5'(upstream) se halla el bucle de herradura previsto de la AUR3. Actualmente estamos caracterizando los clones genómicos de la AUR1 para determinar si la homología con la AUR3 continúa en dirección a 5'después de este nucleótido y si el cDNA de la AUR1 incluye o está precedido por un bucle de herradura similar.

La utilidad de la presente invención incluye la capacidad de explorar los inhibidores de crecimiento celular y de desarrollar terapéuticas de moléculas pequeñas para tratar el cáncer.

Por ello, en un primer aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada, enriquecida o purificada, caracterizada porque codifica a un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4.

Con "aislado" en referencia a un ácido nucleico se indica un polímero de nucleótidos conjugados entre sí, que incluye el DNA o el RNA, que se aísla a partir de una fuente natural o que se sintetiza. En ciertas formas de ejecución de esta invención son preferidos los ácidos nucleicos más largos, por ejemplo los que tienen 600, 900 ó más nucleótidos y/o los que tienen por lo menos una identidad del 50%, 60%, 75%, 90%, 95% o 99% con la secuencia de longitud completa presentada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. El ácido nucleico aislado de la presente invención es único en el sentido de que no se halla en la naturaleza en estado puro ni en estado separado. El uso del término "aislado" indica que una secuencia de origen natural se ha apartado de su entorno celular normal (p.ej. cromosómico). Por lo tanto, la secuencia puede estar en una solución libre de células o colocada en un entorno celular diferente. El término no implica que la secuencia sea la única cadena de nucleótidos presente, pero que está esencialmente libre (con una pureza por lo menos del 90 - 95%) de material no nucleótido asociado de forma natural con ella y significa por tanto que se distingue de los cromosomas aislados.

Con el uso del término "enriquecido" en relación a un ácido nucleico se indica que la secuencia específica de DNA o RNA constituye una fracción significativamente mayor (de 2 a 5 veces) del DNA o RNA total presente en las células o en la solución de interés, de la que se ha tomado la secuencia. Esto puede realizarlo una persona con reducción preferente de la cantidad de otro DNA o RNA presente, o por aumento preferente de la cantidad de la secuencia específica de DNA o RNA, o por combinación de ambos. Sin embargo, hay que señalar que "enriquecido" no implica que no haya presentes otras secuencias de DNA o RNA, sino que precisamente la cantidad relativa de la secuencia de interés ha aumentado de forma significativa. El término "significativo" se utiliza aquí para indicar que el nivel de aumento es útil para la persona que provoca tal aumento, y en general significa un aumento con respecto a otros ácidos nucleicos del orden por lo menos de 2 veces, con mayor preferencia por lo menos de 5 a 10 veces o incluso más. El término no implica que no pueda haber DNA o RNA de otras fuentes. Otras fuentes de DNA pueden ser por ejemplo un genoma de levadura o de una bacteria, o un vector de clonación, por ejemplo el pUC19. Este término distingue entre acontecimientos de tipo natural, por ejemplo una infección vírica, o crecimientos de tipo tumoral, en los que el nivel de un mRNA puede aumentar de forma natural con respecto a otras especies de mRNA. Es decir, este término indica únicamente aquellas situaciones en las que una persona interviene para elevar la proporción de un ácido nucleico deseado.

También es ventajoso para algunos propósitos que la secuencia de nucleótidos esté en forma purificada. El término "purificada" en relación a un ácido nucleico no requiere que la pureza sea absoluta (por ejemplo, en forma de preparación homogénea); pero sí contiene la indicación de que la secuencia es relativamente más pura que en el entorno natural (si se compara con el nivel natural, este nivel debería ser por lo menos 2-5 veces mayor, p.ej. en términos de mg/ml). Los clones individuales aislados de una biblioteca de cDNA pueden purificarse hasta la homogeneidad electroforética. Las moléculas de DNA reivindicadas, obtenidas a partir de estos clones, pueden obtenerse directamente del DNA total o del RNA total. Los clones de cDNA no son de origen natural, sino que se obtienen con preferencia mediante la manipulación de una sustancia de origen natural que se purifica parcialmente (RNA mensajero). La construcción de una biblioteca de cDNA a partir del mRNA implica la creación de una sustancia sintética (cDNA) y los clones de cDNA individualmente puros pueden aislarse a partir de la biblioteca sintética por selecciones de clones de las células que llevan la biblioteca de cDNA. Por lo tanto, el proceso que implica la construcción de una biblioteca de cDNA a partir de mRNA y el aislamiento de diferentes clones de cDNA proporciona una purificación aproximadamente de 10^{6} veces del mensaje nativo. Por ello se contempla expresamente la purificación por lo menos de un orden de magnitud, con preferencia dos o tres órdenes y con preferencia especial de cuatro o cinco órdenes de magnitud.

Con un "polipéptido AUR-1" y/o un "polipéptido AUR-2" se entienden 100 o más aminoácidos continuos dispuestos en la secuencia de aminoácidos de longitud total SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o un derivado funcional de los mismos, tal como se describe aquí. En ciertos aspectos son preferidos los polipéptidos de 200, 300 ó más aminoácidos. El polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 puede codificarse con una secuencia de aminoácidos de longitud completa o cualquier porción de una secuencia de aminoácidos de longitud completa, en el supuesto de que se conserve la actividad funcional del polipéptido.

En las formas preferidas de ejecución, el ácido nucleico aislado contiene, consta esencialmente de o consta de una secuencia de ácidos nucleicos definida en la secuencia de aminoácidos de longitud completa SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, un derivado funcional de las mismas o codifica por lo menos 200 ó 300 aminoácidos contiguos de las mismas.

El ácido nucleico puede aislarse a partir de una fuente natural por clonación de cDNA o hibridación sustractiva; la fuente natural puede ser sangre, semen o tejido (humano) de mamífero y el ácido nucleico puede sintetizarse por el método del triéster o empleando un sintetizador automático de DNA. En otras formas de ejecución preferidas, el ácido nucleico es una región conservada o única, por ejemplo las que son útiles para el diseño de sondas de hibridación para facilitar la identificación y la clonación de polipéptidos adicionales, el diseño de sondas de PCR para facilitar la clonación de polipéptidos adicionales y la obtención de anticuerpos contra regiones del polipéptido.

Los ejemplos de secuencias de aminoácidos incluyen las siguientes:

ENSYPWPYGRQ (SEQ ID NO: 5)

CISGP (SEQ ID NO: 6)

QFPO (SEQ ID NO: 7)

VNSGQ (SEQ ID NO: 8)

RKEPVTPSA-LV (SEQ ID NO: 9)

LMSRSNVQPTAAP (SEQ ID NO: 10)

VQNQKQKQLQATSVPH (SEQ ID NO: 11)

PVSRPLNNTQK (SEQ ID NO: 12)

VMENSSGTPD (SEQ ID NO: 13)

ILTRHFTID (SEQ ID NO: 14)

SKQPLPSAPENNPEEQLASKQK (SEQ ID NO: 15).

Se entiende por "regiones conservadas de ácido nucleico" aquellas regiones que están presentes en dos o más ácidos nucleicos que codifican a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2, con las que puede hibridarse una secuencia concreta de ácido nucleico en condiciones de restricción escasa. Los ejemplos de condiciones de restricción escasa, idóneas para la exploración de ácidos nucleicos que codifican a polipéptidos AUR-1 y/o AUR-2 se encontrará en Abe y col., J. Biol. Chem. 19, 13361, 1992.

Con preferencia, las regiones conservadas diferentes en menos de 5 entre 20 nucleótidos.

Se entiende por "región única de ácido nucleico" una secuencia que está presente en un ácido nucleico de longitud completa que codifica a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 y que no está presente en una secuencia que codifique a cualquier otro polipéptido de origen natural. Tales regiones abarcan con preferencia 30 ó 45 nucleótidos contiguos, presentes en el ácido nucleico de longitud completa que codifica a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2. En particular, una región única de ácido nucleico tiene con preferencia su origen en un mamífero.

La invención se refiere además a una sonda de ácido nucleico para la detección de un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 o de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra. La sonda de ácido nucleico contiene un ácido nucleico que se híbrida con una secuencia definida en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o un derivado funcional del mismo.

La sonda de ácido nucleico es altamente complementaria del ácido nucleico que codifica por lo menos a 105, 120, 150, 200, 250, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de la secuencia de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o un derivado funcional de las mismas. Pueden utilizarse varias condiciones de hibridación de restricción escasa o elevada en función de la especificidad y de la selectividad deseadas. Se entiende por condiciones de hibridación restrictiva aquellas en las que solamente se hibridan las secuencias altamente complementarias de ácidos nucleicos. Tales condiciones impiden con preferencia la hibridación de ácidos nucleicos que tienen 1 ó 2 apareamientos defectuosos entre 20 nucleótidos contiguos.

Los métodos para utilizar las sondas incluyen la detección de la presencia o de la cantidad del RNA de la AUR-1 y/o de la AUR-2 en una muestra poniendo en contacto la muestra con la sonda de ácido nucleico en condiciones tales que tenga lugar la hibridación y detectando la presencia o la cantidad de la sonda fijada al RNA de la AUR-1 o de la AUR-2. El ácido nucleico dúplex formado entre la sonda y la secuencia de ácido nucleico que codifica a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 puede utilizarse para la identificación de la secuencia del ácido nucleico detectado (véase por ejemplo Nelson y col., Nonisotopic DNA Probé Techniques, Academic Press, San Diego, coordinador: Kricka, p. 275, 1992).

Pueden construirse kit para llevar estos métodos a la práctica, de modo que incluyan un recipiente que contenga una sonda de ácido nucleico.

La invención se refiere también a ácido nucleico recombinante que codifica por lo menos a 100 aminoácidos contiguos de una secuencia definida como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o a un derivado funcional del mismo y a un vector o a un promotor eficaz para iniciar la transcripción en una célula hospedante. El ácido nucleico recombinante puede contener alternativamente una región funcional de iniciación de transcripción en una célula, una secuencia complementaria de una secuencia de RNA que codifica a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 y una región funcional de terminación de transcripción en una célula.

En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 aislado, enriquecido o purificado.

Se entiende por "aislado" en relación a un polipéptido un polímero de 100 o más aminoácidos contiguos de una secuencia definida en la SEQ ID NO: 3 o en la SEQ ID NO: 4, conjugados entre sí, incluidos los polipéptidos que se aíslan de una fuente natural o que se sintetizan. En ciertos aspectos se prefieren los polipéptidos más largos, como son los que tienen 402, 407, 413 ó 425 aminoácidos contiguos, definidos en las SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Los polipéptidos aislados de la presente invención son únicos en el sentido de que no se hallan en estado puro ni separado en la naturaleza. El uso del término "aislado" indica que la secuencia de origen natural se ha apartado de su entorno celular normal. Por lo tanto, la secuencia puede estar en una solución exenta de células o colocada en un entorno celular diferente. El término no implica que la secuencia sea la única cadena de aminoácidos que está presente, pero que está esencialmente libre (pureza por lo menos del 90-95%) de material no aminoácido asociado naturalmente a ella.

Con el uso del término "enriquecido" en relación a un polipéptido se indica que la secuencia específica de aminoácidos contiene una fracción significativamente mayor (de 2 a 5 veces) del total de aminoácidos que están presentes en las células o en la solución de interés con respecto a las células normales o enfermas o con respecto a las células de las que se ha tomado la secuencia. Esto puede provocarlo una persona con la reducción preferente de la cantidad de otros aminoácidos presentes o por un incremento preferente de la cantidad de la secuencia de aminoácidos de interés o por combinación de ambos. Sin embargo, hay que indicar que enriquecido no implica que pueden estar presentes otras secuencias de aminoácidos, sino que precisamente la cantidad relativa de la secuencia de interés ha aumento de modo significativo. El término significativo se emplea aquí para indicar que el nivel del aumento es útil para la persona que realiza tal aumento, y significa con preferencia un aumento con respecto a otros aminoácidos en una cantidad por lo menos de 2 veces, con mayor preferencia de 5 a 10 veces o más. El término no implica que no haya aminoácidos de otras fuentes. Otra fuente de aminoácidos puede comprender, por ejemplo, los aminoácidos codificados por un genoma de levadura o de bacteria o un vector de clonación, como el pUC19. El término abarca solamente aquellas situaciones en las que interviene una persona para elevar la proporción del ácido nucleico deseado.

Es también ventajoso para algunos propósitos que la secuencia de aminoácidos esté en forma purificada. El término "purificado" en relación a un polipéptido no requiere que la pureza sea absoluta (por ejemplo en una preparación homogénea); sino que contiene la indicación de que la secuencia es relativamente más pura que en el entorno natural (si se compara con el nivel, este nivel debería ser por lo menos 2-5 veces mayor, p.ej. en términos de mg/ml). Se contempla de modo expreso la purificación por lo menos en un orden de magnitud, con preferencia dos o tres órdenes y con preferencia especial cuatro o cinco órdenes de magnitud. La sustancia está con preferencia libre de contaminación en un nivel funcionalmente significativo, por ejemplo tendrá una pureza del 90%, del 95% o del 99%.

En las formas preferidas, el polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 contiene por lo menos 200, 250, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de la secuencia de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o un derivado funcional de las mismas.

En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo (p.ej. un anticuerpo monoclonal o policlonal) que tiene una afinidad de fijación específica con el polipéptido AUR-1 y/o AUR-2. El anticuerpo contiene una secuencia de aminoácidos que es capaz de fijarse específicamente a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 que tiene por lo menos 100 aminoácidos contiguos en la secuencia de longitud completa definida en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Se entiende por "afinidad específica de fijación" que el anticuerpo se fija sobre polipéptidos AUR-1 y/o AUR-2 con mayor afinidad que sobre otros polipéptidos en condiciones especificadas.

Los anticuerpos que tienen afinidad específica de fijación sobre los polipéptidos AUR-1 y/o AUR-2 pueden utilizarse en métodos para la detección de la presencia y/o la cantidad de un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra, poniendo en contacto la muestra con el anticuerpo en condiciones tales que se forme un inmunocomplejo y detectando la presencia y/o la cantidad del anticuerpo conjugado con el polipéptido AUR-1 y/o AUR-2. Los kits de diagnóstico para la puesta en práctica de tales métodos pueden construirse de modo que incluyan un primer recipiente que contiene un anticuerpo y un segundo recipiente que contiene un conjugado de un reactivo de fijación del anticuerpo y un marcador.

En otro aspecto, la invención se refiere a un hibridoma que produce un anticuerpo que tiene afinidad específica de fijación sobre un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 que tiene por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de longitud completa definida en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Se entiende por hibridoma una línea celular inmortalizada que es capaz de secretar un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo de AUR-1 y/o de AUR-2.

Mediante "purificado" en relación a un anticuerpo se indica que el anticuerpo es distinto del anticuerpo de origen natural, por ejemplo está en forma purificada. El anticuerpo se genera con técnica estándar con preferencia en forma de preparación homogénea. Los usos de los anticuerpos contra polipéptidos clonados incluyen la terapia y las herramientas de diagnóstico.

La invención se refiere a un método para la exploración de células humanas que contiene un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 o una secuencia equivalente. El método consiste en identificar el nuevo polipéptido en células humanas empleando técnicas que son habituales y estándar en el ámbito de la genética, por ejemplo las descritas en esta solicitud para identificar la AUR-1 y/o la AUR-2 (clonación molecular, análisis de transferencia "Southern" o "northern", hibridación "in situ", amplificación por PCR, etc.).

En otro aspecto, la invención proporciona un ensayo para identificar los agentes capaces de interferir en la interacción entre la AUR-1 y/o la AUR-2 y un reactivo de fijación de la AUR-1 y/o de la AUR-2. Dichos ensayos pueden realizarse "in vitro" o "in vivo" y se describen con detalle en la presente o pueden obtenerse por modificación de otros ensayos ya existentes, por ejemplo el ensayo de crecimiento descrito en el documento que lleva el número de serie 08/487,088, depositado con fecha 7 de junio de 1995, o los ensayos descritos en el documento que lleva el número de serie 60/005,167, depositado con fecha 13 de octubre de 1995. Otro ensayo que podría modificarse para el uso en genes de la presente invención se describe en la solicitud internacional nº WO 94/23039, publicada con fecha 13 de octubre de 1994. Otras posibilidades incluyen la detección de la actividad de quinasa en ensayos de autofosforilación o la verificación de la actividad de quinasa en sustratos estándar, por ejemplo histonas, proteína básica de mielina, gamma-tubulina o proteínas de centrosomas. Los reactivos de fijación pueden identificarse colocando la porción N-terminal de la proteína en una pantalla de dos híbridos o detectando la fosfotirosina de una quinasa de especificidad dual, ver Fields y Song, patente US-5 283 173, publicada el 1 de febrero de 1994.

Un medio para definir los inhibidores de la actividad de la Aurora consiste en un sistema de exploración que emplea un mutante de levadura sensible a la temperatura, como el descrito por Chan y Botstein, Genetics 135, 677-691, 1993; véase también Francisco y col., Mol. Cell. Bio. 14(7), 4731-4740, 1994.

Resumiendo, la cepa de levadura CCY72-3D-1 (ipl 1-2), que expresa una forma sensible a la temperatura del homólogo de levadura de la Aurora (ip11) al tiempo que es viable a 26ºC, es incapaz de crecer a 37ºC. La transfección de esta cepa con un plásmido de expresión que contiene un gen híbrido de Aurora, que contiene la porción N-terminal del ip11, que contiene el o los dominios putativos de interacción con el sustrato, y la porción C-terminal de las Auroras 1 y 2, que contienen el dominio catalítico, supera esta sensibilidad a la temperatura de crecimiento. La cepa de levadura que expresa la Aurora puede cultivarse entonces a 37ºC en presencia de una sustancia de ensayo. No se observa crecimiento en presencia de sustancias que inhiben la función catalítica de la Aurora. Los inhibidores potenciales incluyen los compuestos químicos de peso molecular bajo y/o los productos naturales aislados de diversos organismos, por ejemplo hongos, organismos marinos, plantas, etc.

El resumen de la invención recién descrito es no limitante y otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes de la descripción que sigue de las formas preferidas de ejecución y también de las reivindica-
ciones.

Descripción de las formas preferidas de ejecución

La presente invención se refiere a polipéptidos AUR-1 y/o AUR-2, a ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, a anticuerpos contra tales polipéptidos, a ensayos que utilizan dichos polipéptidos y a métodos relacionados con todo lo anterior.

I. Ácido nucleico que codifica a polipéptidos AUR-1 y/o AUR-2

Se incluyen dentro del alcance de esta invención los equivalentes funcionales de las moléculas de ácido nucleico aisladas, descritas en esta solicitud. La degeneración del código genético permite la sustitución de ciertos codones por otros codones, que especifican el mismo aminoácido y por ello dan lugar a la misma proteína. La secuencia de ácido nucleico puede variar sustancialmente porque, excepto la metionina y el triptófano, los aminoácidos conocidos pueden codificarse por acción de más de un codón. Por ello, las porciones o la totalidad de los genes de AUR-1 y/o AUR-2 pueden sintetizarse para obtener una secuencia de ácido nucleico significativamente diferente de la definida en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos codificada debería conservarse.

Además, la secuencia de ácido nucleico puede contener una secuencia de nucleótidos que resulte de la adición, deleción o sustitución por lo menos de un nucleótido del extremo 5'y/o del extremo 3'de la fórmula de ácido nucleico definida en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o un derivado de la misma. A tal efecto puede emplearse cualquier nucleótido o polinucleótido, con la condición de que su adición, deleción o sustitución no altere la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 que se codifica con la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, la presente invención incluye cualquier secuencia de ácido nucleico que resulte de la adición del ATG como codón de iniciación en el extremo 5'de la secuencia de ácido nucleico de la invención o de su derivado o de la adición de TTA, TAG o TGA como codón de terminación en el extremo 3'de la secuencia de nucleótidos de la invención o de su derivado. Además, la molécula de ácido nucleico de la presente invención puede tener, si fuera necesario, sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción añadidos a su extremo 5'y/o extremo 3'.

Tales alteraciones funcionales de una secuencia determinada de ácido nucleico proporcionan una oportunidad para promover la secreción y/o el procesado de proteínas heterólogas codificadas por secuencias de ácidos nucleico ajenas, fusionadas a las mismas. Todas las variaciones de secuencias de nucleótidos de los genes y fragmentos de la AUR-1 y/o AUR-2 permitidas por el código genético se incluyen, por tanto, en esta invención.

Además, es posible la deleción de codones o la sustitución de uno o varios codones por codones diferentes de los codones degenerados para producir un polipéptido estructuralmente modificado, pero que tiene sustancialmente la misma utilidad o actividad que el polipéptido producido por la molécula no modificada de ácido nucleico. Tal como se reconoce en la técnica, los dos polipéptidos son funcionalmente equivalentes, como lo son las dos moléculas de ácido nucleico que dan lugar a su producción, incluso a pesar de que las diferencias entre las moléculas de ácido nucleico no guarden relación con la degeneración del código genético.

II. Una sonda de ácido nucleico para la detección de la AUR-1 y/o la AUR-2

Puede utilizarse una sonda de ácido nucleico de la presente invención para explorar una biblioteca apropiada de cromosomas o de cDNA mediante los métodos habituales de hibridación, obteniendo otra molécula de ácido nucleico de la presente invención. Una biblioteca de DNA cromosómicos o de cDNA puede prepararse a partir de células apropiadas con arreglo a métodos ya reconocidos de la técnica (véase "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, coordinado por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Como alternativa, la síntesis química se lleva a cabo para obtener sondas de ácido nucleico que tengan secuencias de nucleótidos que corresponden a las porciones N-terminales y C-terminales de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés. Por lo tanto, las sondas de ácido nucleico sintetizadas pueden utilizarse como cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), realiza con arreglo a técnicas PCR reconocidas, esencialmente con arreglo a los protocolos PCR descritos en "A Guide to Methods and Applications", coordinado por Michael y col., Academic Press, 1990, empleando una biblioteca apropiada de cromosomas o de cDNA para obtener el fragmento de la presente invención.

Un experto en la materia puede diseñar fácilmente tales sondas, basadas en la secuencia publicada en esta solicitud y utilizando métodos de análisis computerizado de alineamiento y secuencias ya conocidos de la técnica (véase "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, coordinado por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Las sondas de hibridación de la presente invención pueden marcarse por técnicas estándar de marcado, por ejemplo con radiomarcadores, marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores de biotina-avidina, quimioluminiscencia y similares. Después de la hibridación, las sondas pueden visualizarse empleando métodos conocidos.

Las sondas de ácido nucleico de la presente invención incluyen las sondas de RNA y también las de DNA, por ejemplo las sondas que se generan aplicando técnicas ya conocidas. La sonda de ácido nucleico puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. Los ejemplos de tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a plásticos, por ejemplo el policarbonato, hidratos de carbono complejos, por ejemplo la agarosa y la Sepharose, y resinas acrílicas, por ejemplo las poliacrilamidas y las esferillas de látex. Las técnicas para fijar las sondas de ácido nucleico sobre tales soportes sólidos son bien conocidas.

Las muestras idóneas para el ensayo en métodos de exploración de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen por ejemplo las células y los extractos de ácidos nucleicos de células o los fluidos biológicos. La muestra empleada en los métodos recién descritos puede variar en función del formato de ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos a ensayar. Los métodos de preparación de extractos de ácidos nucleicos de células son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse fácilmente para obtener una muestra que sea compatible con el método utilizado.

III. Un método basado en una sonda y un kit para la detección de la AUR-1 y/o la AUR-2

Un método para detectar la presencia de la AUR-1 y/o la AUR-2 en una muestra consiste en (a) poner en contacto dicha muestra con la sonda de ácido nucleico recién descrita, en condiciones tales que tenga lugar la hibridación y (b) detectar la presencia de dicha sonda fijada sobre dicha molécula de ácido nucleico. Un experto en la materia podrá seleccionar la sonda de ácido nucleico con arreglo a técnicas ya conocidas y descritas anteriormente. Las muestras a ensayar incluyen, pero no se limitan a muestras de RNA de tejidos humanos.

Un kit para la detección de la presencia de AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra contiene por lo menos un recipiente que contiene en su interior la sonda de ácido nucleico descrita antes. El kit puede contener además otros recipientes que contengan uno o varios de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de una sonda de ácido nucleico fijada. Los ejemplos de reactivos de detección incluyen, pero no se limitan a sonda radiomarcadas, sondas marcadas enzimáticamente (peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina) y sondas marcadas por afinidad (biotina, avidina o estreptavidina).

En detalle, un kit dividido en compartimentos incluye cualquier kit en el que los reactivos están almacenados en recipientes separados. Dichos recipientes incluyen recipientes pequeños de vidrio, recipientes de plástico o tiras de plástico o de papel. Tales recipientes permiten la transferencia eficaz de los reactivos de un compartimento a otro compartimento, de modo que las muestras y los reactivos no sufran contaminación cruzada y los reactivos o soluciones de cada recipiente puedan añadirse de modo cuantitativo desde un compartimento a otro. Tales recipientes pueden incluir un recipiente para la muestra a ensayar, un recipiente para la sonda o cebadores empleados en el ensayo, recipientes para los reactivos de lavado (por ejemplo solución salina tamponada con fosfato, tampones Tris y similares) y recipientes para reactivos empleados para detectar la sonda hibridada, el anticuerpo fijado, el producto amplificado o similares. Un experto en la materia reconocerá fácilmente que las sondas de ácido nucleico descritas en la presente invención pueden incorporarse con facilidad a uno de los formatos de kit establecidos, que son bien conocidos en la técnica.

IV. Constructos de DNA que contienen la molécula de ácido nucleico de la AUR-1 y/o AUR-2 y células que contienen estos constructos

La presente invención se refiere también a una molécula de DNA recombinante que contiene, de 5'a 3', un promotor eficaz para iniciar la transcripción en una célula hospedante y las moléculas de ácido nucleico recién descritas. Además, la presente invención se refiere a una molécula de DNA recombinante que contiene un vector y una molécula de ácido nucleico descrita antes. La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico que contiene una región funcional de transcripción a una célula, una secuencia complementaria de una secuencia de RNA que codifica a una secuencia de aminoácido correspondiente al polipéptido descrito anteriormente y una región funcional de terminación de la transcripción en dicha célula. Las moléculas recién descritas pueden ser moléculas de DNA aisladas y/o purificadas.

La presente invención se refiere además a una célula u organismos que contiene la molécula de ácido nucleico descrita antes y por ello es capaz de expresar un péptido. El polipéptido puede purificarse a partir de células que se hayan alterado para expresar el polipéptido. Se dice que una célula "se altera para expresar un polipéptido deseado" cuando dicha célula por manipulación genética se crea de modo que produzca una proteína que normalmente no produce o que la célula normalmente produce en niveles bajos. Un experto en la materia puede adaptar rápidamente los procedimientos para introducir y expresar secuencias genómicas, de cDNA o sintéticas en células eucariotas o procariotas.

Se dice que una molécula de ácido nucleico, por ejemplo el DNA es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contengan información reguladora de la transcripción y de la traducción y tales secuencias están "unidas operativamente" a las secuencias de nucleótidos que codifican al polipéptido. Un engarce operativo es un engarce en el que las secuencias reguladoras de RNA y la secuencia de DNA que se pretenden expresar están conectadas de tal manera que permita la expresión de la secuencia genética. La naturaleza exacta de las regiones reguladoras que se necesitan para la expresión de la secuencia genética pueden variar de un organismo a otro, pero en general deberán contener una región de promotor que, en los procariotas, contiene tanto el promotor (que dirige la iniciación de la transcripción del RNA) como secuencias de DNA que, cuando se transcriben al RNA, señalarán el inicio de la síntesis. Tales regiones incluyen normalmente las secuencias 5'no codificadoras que participan en la iniciación de la transcripción y traducción, por ejemplo la caja TATA, la secuencia de remate (capping), la secuencia CAAT y similares.

Si se desea, la región 3'no codificadora de la secuencia que codifica al gen de la AUR-1 y/o AUR-2 puede obtenerse por los métodos recién descritos. Esta región puede retenerse para sus secuencias reguladoras de terminación de transcripción, por ejemplo la terminación y la poliadenilación. Por lo tanto, cuando se retiene la región 3', que está naturalmente contigua a la secuencia de DNA que codifica un gen de AUR-1 y/o de AUR-2, pueden proporcionarse señales de terminación de la transcripción. Cuando las señales de terminación de la transcripción no funcionan satisfactoriamente en la célula hospedante de la expresión, entonces puede sustituirse la región funcional 3'de la célula hospedante.

Se dice que dos secuencias de DNA (por ejemplo una secuencia de región de promotor y una secuencia de AUR-1 y/o AUR-2) están unidas operativamente, cuando la naturaleza del engarce entre las dos secuencias de DNA (1) no provoca la introducción de una mutación de desplazamiento de marco y (2) no interfiere en la capacidad de la secuencia de región de promotor para dirigir la transcripción de una secuencia de gen de AUR-1 y/o AUR-2 o (3) no interfiere con la capacidad de una secuencia de gen de AUR-1 y/o AUR-2 de transcribirse por acción de la secuencia de la región de promotor. Por lo tanto, la región de promotor debería estar unida operativamente con una secuencia de DNA, si el promotor es capaz de efectuar la transcripción de dicha secuencia de DNA. Por ello, para expresar un gen de AUR-1 y/o AUR-2 son necesarias señales de transcripción y de traducción que sean reconocidas por un hospedante apropiado.

La presente invención abarca la expresión del gen de la AUR-1 y/o de la AUR-2 (o un derivado funcional del mismo) en células procariotas o eucariotas. Los hospedantes procariotas son en general muy eficaces y convenientes para la producción de proteínas recombinantes y son, por ello, un tipo de sistema de expresión preferido para los genes de la AUR-1 y/o AUR-2. Los procariotas están representados con gran frecuencia por varias cepas de E. coli. Sin embargo pueden utilizarse también otras cepas microbianas, incluidas otras cepas bacterianas.

En sistemas procariotas pueden utilizarse vectores plásmidos que contienen sitios de replicación y secuencias de control derivadas de una especie compatible con el hospedante. Los ejemplos de vectores plásmidos idóneos pueden incluir el pBR322, el pUC118, el pUC119 y similares; los vectores idóneos de fago o bacteriófago pueden incluir el \gammagt10, el \gammagt11 y similares; y los vectores víricos idóneos pueden incluir el pMAM-neo, el pKRC y similares. El vector seleccionado de la presente invención tendrá con preferencia capacidad de replicarse en la célula hospedante elegida.

Los hospedantes procariotas reconocidos incluyen las bacterias, p.ej. E. coli, los bacilos, el Streptomyces, los Pseudomonas, la Salmonella, la Serratia y similares. Sin embargo, en tales condiciones los péptidos no se glucosilarán. El hospedante procariota tiene que ser compatible con el replicón las secuencias de control del plásmido de expresión.

Para expresar la AUR-1 y/o AUR-2 (o un derivado funcional de las mismas) en una célula procariota es necesario unir operativamente la secuencia de la AUR-1 y/o AUR-2 con un promotor procariota funcional. Tales promotores pueden ser constitutivos o, con mayor preferencia, regulables (es decir, inducibles o desrepresibles). Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor int del bacteriófago \lambda, el promotor bla de la secuencia del gen de \beta-lactamasa del pBR322 y el promotor CAT de la secuencia del gen de cloranfenicol-acetil-transferasa del pPR325 y similares. Los ejemplos de promotores procariotas inducibles incluyen los promotores principales derecho e izquierdo del bacteriófago \lambda (P_{L} y P_{R}), el trp, el recA, el \lambdaacZ, el \lambdaacI y los promotores gal de la E. coli, la \alpha-amilasa (Ulmanen y col., J. Bacteriol. 162, 176-182, 1985) y los promotores específicos \varsigma-28 del B. subtilis (Gilman y col., Gene sequence 32, 11-20, 1984), los promotores del bacteriófago de bacilos (Gryczan, The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press Inc., NY, 1982) y los promotores de Streptomyces (Ward y col., Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986). Los promotores procariotas se reseñan en Glick (J. Ind. Microbiot. 1, 277-282, 1987); Cenatiempo (Biochimie 68, 505-516, 1986) y Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18, 415-442, 1984).

La expresión correcta en una célula procariota requiere además la presencia de un sitio de fijación de ribosoma en dirección a 5'(upstream) de la secuencia que codifica a la secuencia del gen. Tales sitios de fijación de ribosomas se describen por ejemplo en Gold y col., Ann. Rev. Microbiol. 35, 365-404, 1981. La selección de secuencias de control, vectores de expresión, métodos de transformación y similares dependerá del tipo de célula hospedante empleada para expresar el gen. Tal como se emplea en esta solicitud, "célula", "línea celular" y "cultivo celular" pueden utilizarse indistintamente y todas las denominaciones incluyen la progenie. Por lo tanto, los términos "transformantes" o "células transformadas" incluyen las células en cuestión primarias y los cultivos derivados de las mismas, con independencia del número de transferencias. Se da por supuesto además que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en cuanto a contenido de DNA, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Sin embargo, tal como se ha definido, la progenie mutante tiene la misma funcionalidad que la célula originalmente transformada.

Las células hospedantes que pueden utilizarse para los sistemas de expresión de la presente invención no están limitadas de forma estricta, con la condición de que sean idóneas para el uso en la expresión del péptido AUR-1 y/o AUR-2 de interés. Los hospedantes idóneos pueden incluir a menudo células eucariotas. Los hospedantes eucariotas preferidos incluyen por ejemplo la levadura, los hongos, las células de insectos, la células de mamíferos, ya sea "in vivo", ya sea en cultivo de tejido. Las células de mamíferos que pueden ser útiles como hospedantes incluyen las células HeLa, las células de origen fibroblasto tal como VERO o CHO-K1 o las células de origen linfoide y sus derivados. Las células hospedantes de mamíferos preferidas incluyen las SP2/0 y J558L así como las líneas celulares de neuroblastoma, por ejemplo la IMR 332, que puede proporcionar una mejor capacidad para el procesado correcto de la post-traducción.

Además, las células de plantas están disponibles también como hospedantes y están disponibles secuencias de control compatibles con células de plantas, por ejemplo el virus del mosaico de coliflor 35S y 19S y promotor de nopalina-sintasa y secuencias de señales de poliadenilación. Otro hospedante preferido es una célula de insecto, por ejemplo de larvas de Drosophila. Empleando como hospedantes las células de insectos, podrá utilizarse el promotor de alcohol-deshidrogenasa de la Drosophila, véase Rubín, Science 240, 1453-1459, 1988. Como alternativa pueden diseñarse vectores baculovirus para expresar grandes cantidades de AUR-1 y/o AUR-2 en células de insectos (Jasny, Science 238, 1653, 1987; Miller y col., Genetic Engineering, coordinadores: Setlow, J.K. y col., editorial Plenum, vol. 8, pp. 277-297, 1986).

Puede utilizarse cualquiera de una serie de sistemas de expresión de secuencias genéticas de levadura, que incorporen promotor y elementos de terminación de secuencias genéticas expresadas activamente, que codifican enzimas glucolíticas producidas en grandes cantidades, cuando se cultivan las levaduras en medios ricos en glucosa. Las secuencias conocidas de genes glucolíticos proporcionan además señales muy eficaces de control de transcripción. La levadura proporciona ventajas sustanciales por el hecho de que realiza también modificaciones de péptidos después de la traducción. Existe un gran número de estrategias de DNA recombinante que recurren a promotores fuertes y número elevado de copias de plásmidos que pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas de la levadura. La levadura reconoce las secuencias guía (leader) de productos de secuencia genética clonados de mamíferos y secreta péptidos que llevan secuencias guía (es decir, pre-péptidos). Para un hospedante mamífero se disponen de varios sistemas de vectores para la expresión de la AUR-1 y/o AUR-2.

Pueden emplearse un gran número de secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción, en función de la naturaleza del hospedante. Las señales reguladoras de la transcripción y de la traducción pueden derivarse de fuentes víricas, por ejemplo de un adenovirus, de papilloma-virus bovino, de citomegalovirus, de virus de simios o similares, en las que las señales reguladoras están asociadas con una secuencia genética particular, que tiene un nivel alto de expresión. Como alternativa pueden emplearse promotores de productos de expresión de mamíferos, por ejemplo actina, colágeno, miosina y similares. Pueden elegirse señales reguladoras de iniciación de transcripción que permitan la represión o la activación, de modo que pueda modularse la expresión de las secuencias del gen. Son de interés las señales reguladoras que son sensibles a la temperatura, de modo que variando la temperatura puede reprimirse o iniciarse la expresión o que estén sometidas a una regulación química (por ejemplo de un metabolito).

La expresión de la AUR-1 y/o AUR-2 en hospedantes eucariotas requiere el uso de regiones reguladoras eucariotas. Tales regiones incluyen en general una región de promotor suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis del RNA. Los promotores eucariotas preferidos incluyen, por ejemplo, el promotor de la secuencia del gen de la metalotioneína I del ratón (Hamer y col., J. Mol. Appl. Gen. 1, 273-288, 1982); el promotor TK del herpes virus (McKnight, Cell 31, 355-365, 1982); el promotor precoz SV40 (Benoist y col., Nature (Londres) 290, 304-310, 1981); el promotor de secuencia del gen ga14 de levadura (Johnston y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6971-6975, 1982; Silver y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5951-5955, 1984).

La traducción del mRNA eucariota se inicia en el codón que codifica a la primera metionina. Por esta razón es preferible asegurar que el engarce entre el promotor eucariota y una secuencia de DNA que codifica a la AUR-1 y/o AUR-2 (o un derivado funcional de las mismas) no contenga ningún codón que intervenga, que sea capaz de codificar a la metionina (es decir, AUG). La presente de tales codones provoca la formación de una proteína de fusión (si el codón AUG está en el mismo marco de lectura que la secuencia que codifica a la AUR-1 y/o AUR-2) o una mutación de desplazamiento de marco (si el codón AUG no está en el mismo marco de lectura que la secuencia que codifica a la AUR-1 y/o AUR-2).

Una molécula de ácido nucleico de AUR-1 y/o AUR-2 y un promotor unido operativamente pueden introducirse en una célula receptora procariota o eucariota, ya sea como molécula de DNA (o RNA) no replicativa, que puede ser una molécula lineal o, con más preferencia, una molécula circular covalente cerrada. Dado que tales moléculas son incapaces de replicación autónoma, la expresión del gen puede tener lugar por la expresión transitoria de la secuencia introducida. Como alternativa, puede realizarse la expresión permanente por integración de la secuencia de DNA introducida en el cromosoma hospedante.

Puede emplearse un vector que sea capaz de integrar las secuencias genéticas deseadas en el cromosoma de la célula hospedante. Las células que integran de manera estable el DNA introducido en sus cromosomas pueden seleccionarse también introduciendo uno o varios marcadores que permitan la selección de las células hospedantes que contienen el vector de expresión. El marcador puede proporcionar la fototrofia a un hospedante auxotrófico, resistencia a biocidas, p.ej. antibióticos o metales pesados, por ejemplo cobre o similares. La secuencia del gen marcador seleccionado puede unirse directamente a las secuencias de gen de DNA que se quieren expresar o puede introducirse en la misma célula por co-transfección. Pueden necesitarse elementos adicionales para una síntesis óptima del mRNA de la proteína de fijación de cadena simple. Estos elementos incluyen las señales de empalme así como los promotores de transcripción, amplificadores y señales de terminación. Los vectores de expresión de cDNA que incorporan tales elementos incluyen los descritos por Okayama, Molec. Cell. Biol. 3, 280, 1983.

La molécula de ácido nucleico introducida puede incorporarse a un vector plásmido o vírico, capaz de replicación autónoma en el hospedante receptor. A tal fin puede emplearse uno cualquiera de un gran número de vectores. Los factores importantes en el momento de elegir un vector plásmido o vírico particular incluyen: la facilidad con que las células receptoras que contienen el vector podrán ser reconocidas y seleccionadas por aquellas células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un hospedante concreto; y si es deseable que sea capaz de actuar de "lanzadera" (shuttle) del vector entre las células hospedantes de diferentes especies.

Los vectores procariotas preferidos incluyen los plásmidos tales que sean capaces de replicación en E. coli (por ejemplo el pBR322, ColEl, pSC101, pACYC 184, nVX. Tales plásmidos se describen por ejemplo en el manual de Sambrook (véase "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, coordinadores: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Los plásmidos de bacilos incluyen el pC194, pC221, pT127 y similares. Tales plásmidos se han publicado en Gryczan (The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, 1982, pp. 307-329). Los plásmidos idóneos de Streptomyces incluyen el plJ101 (Kendall y col., J. Bacteriol. 169, 4177-4183, 1987) y los bacteriófagos de Streptomyces, por ejemplo el \varphiC31 (Chater y col., Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Adademiai Kaido, Budapest, Hungría, 1986, pp. 45-54). Los plásmidos de Pseudomonas se revisan en John y col. (Rev. Infect. Dis. 8, 693-704, 1986) y en Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33, 729-742, 1978).

Los plásmidos eucariotas preferidos incluyen, por ejemplo, el BPV, la viruela, el SV40, el círculo de 2 micras y similares, o sus derivados. Tales plásmidos son bien conocidos en la técnica (Botstein y col., Miami Wntr. Symp. 19, 265-274, 1982; Broach, en: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 445-470, 1981; Broach, Cell 28, 203-204, 1982; Bollon y col., J. Clin. Hematol. Oncol. 10, 39-48, 1980; Maniatis, en: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608, 1980).

Una vez se ha preparado para la expresión el vector o la molécula de ácido nucleico que contiene el o los constructos, el o los constructos de DNA pueden introducirse en una célula hospedante apropiada por uno cualquiera de los muchos disponibles, p.ej. transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, tecnología de disparo de partículas, precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa y similares. Después de la introducción del vector, se cultivan las células receptoras en un medio selectivo, que selecciona el crecimiento de las células que contienen vector. La expresión de la o de las moléculas del gen clonado da lugar a la producción de la AUR-1 y/o la AUR-2 o de fragmentos de las mismas. Esto puede tener lugar en las células transformadas de por sí o después de la inducción de estas células a una diferenciación (por ejemplo mediante la administración de bromodesoxicuracilo a las células del neuroblastoma o similares). Puede utilizarse una gran variedad de condiciones de incubación para formar el péptido de la presente invención. Las condiciones preferidas son las condiciones que imitan las condiciones fisiológicas.

V. Polipéptidos de AUR-1 y/o AUR-2 purificados

Para obtener un péptido de la presente invención puede utilizarse una gran variedad de metodologías ya conocidas de la técnica. El péptido puede purificarse a partir de tejidos o de células que producen el péptido de forma natural. Como alternativa, los fragmentos de ácidos nucleico aislados recién descritos podrían utilizarse para expresar la proteína UAR-1 y/o AUR-2 en cualquier organismo. Las muestras de la presente invención incluyen células, extractos de proteína o extractos de membrana de células, o fluidos biológicos. La muestra puede variar en base del formato del ensayo, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, células o extractos empleados como muestra.

Como fuente de péptido de la invención puede utilizarse cualquier organismo eucariota, en el supuesto de que el organismo fuente contenga naturalmente tal péptido. Tal como se emplea en esta descripción, el término "organismo fuente" indica un organismo original, a partir del cual se deriva la secuencia de aminoácidos de la subunidad, con independencia del organismo del que y en el que en último término se expresa la subunidad.

Un experto en la materia puede aplicar fácilmente métodos conocidos para aislar proteínas con el fin de obtener el péptido libre de contaminantes naturales. Estos incluyen, pero no se limitan a: cromatografía de exclusión de tamaños, HPLC, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de inmunoafinidad.

VI. Un anticuerpo que tenga afinidad de fijación a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 y un hibridoma que contenga un anticuerpo

La presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de fijación a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2. El polipéptido puede tener la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o un derivado funcional de las mismas o por lo menos 9 aminoácidos contiguos de las mismas (con preferencia por lo menos 20, 30, 35 ó 40 aminoácidos contiguos de las mismas).

La presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de fijación específica sobre un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2. Tal anticuerpo puede aislarse comparando su afinidad de fijación a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 con la afinidad de fijación que tiene a otro polipéptido. Los que se fijan selectivamente sobre la AUR-1 y/o AUR-2 se eligen para el uso en los métodos que requieren la distinción entre la AUR-1 y/o la AUR-2 y otros polipéptidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a: el análisis de la expresión alterada de la AUR-1 y/o la AUR-2 en un tejido que contenga otros polipéptidos.

Las proteínas AUR-1 y/o AUR-2 de la presente invención pueden utilizarse en una gran variedad de procedimientos y métodos, por ejemplo la generación de anticuerpos, para el uso en identificar composiciones farmacéuticas y para estudiar la interacción DNA/proteína.

Los péptidos AUR-1 y/o AUR-2 de la presente invención pueden utilizarse para producir anticuerpos o hibridomas. Un experto en la materia reconocerá que si se desea un anticuerpo, tal péptido podrá generarse del modo descrito en esta solicitud y emplearse como inmunógeno. Los anticuerpos de la presente invención incluyen a los anticuerpos monoclonales y a los policlonales, así como a fragmentos de estos anticuerpos y formas humanizadas. Las formas humanizadas de anticuerpos de la presente invención pueden generarse empleando uno de los procedimientos ya conocidos de la técnica, por ejemplo la quimerización o el injerto por CDR. La presente invención se refiere además a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal recién descrito o un fragmento de fijación del mismo. Un hibridoma es una línea celular inmortalizada que es capaz de secretar un anticuerpo monoclonal
específico.

En general, las técnicas para la preparación de anticuerpos monoclonales e hibridomas son bien conocidas en genética (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holanda, 1984; St. Groth y col., J. Immunol. Methods 31, 1-21, 1980). Cualquier animal (ratón, conejo y similares), del que se sabe que produce anticuerpos, podrá inmunizarse con el polipéptido seleccionado. Los métodos para la inmunización son bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen la inyección subcutánea o intraperitoneal del polipéptido. Un experto en la material podrá reconocer que la cantidad de polipéptido utilizada para la inmunización puede variar en base al animal que se pretende inmunizar, la antigenicidad del polipéptido y el sitio de la inyección.

El polipéptido puede modificarse o administrarse en un adyuvante con el fin de aumentar la antigenicidad del péptido. Los métodos para incrementar la antigenicidad de un polipéptido son bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen la adición del antígeno sobre una proteína heteróloga (por ejemplo la globulina o la \beta-galactosidasa) o por inclusión de un adyuvante durante la inmunización.

Para los anticuerpos monoclonales, se extraen células del bazo de animales inmunizados, se fusionan con células de mieloma, por ejemplo células de mieloma SP2/2-Agl4, y se deja que se conviertan en células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales. Uno cualquier de los muchos métodos bien conocidos de la técnica podrá utilizarse para identificar la célula de hibridoma que produce un anticuerpo la célula de hibridoma que produce un anticuerpo de características deseadas. Estos incluyen la exploración de hibridomas con un ensayo ELISA, análisis "western blot" o radioinmunoensayo (Lutz y col., Exp. Cell Res. 175, 109-124, 1988). Se clonan los hibridomas que secretan los anticuerpos deseados y se determina el grupo y subgrupo empleando procedimientos ya conocidos de la técnica (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", lugar citado, 1984).

Para el caso de anticuerpos policlonales, se aíslan anticuerpos que contienen anticuerpos a partir de un animal inmunizado y se exploran para determinar la presencia de anticuerpos de la especificidad deseada empleando uno de los procedimientos mencionados anteriormente. Los anticuerpos descritos antes pueden marcarse de forma detectable. Los anticuerpos pueden marcarse de forma detectable con el uso de radioisótopos, marcadores de afinidad (por ejemplo biotina, avidina y similares), marcadores enzimáticos (por ejemplo peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina y similares), marcadores fluorescentes (por ejemplo el FITC o la rodamina y similares), átomos paramagnéticos y similares. Los procedimientos para realizar tal marcado son bien conocidos en la técnica, véase por ejemplo (Stemberger y col., J. Histochem. Cytochem. 18, 315, 1970; Bayer y col., Meth. Enzym. 62, 308, 1979; Engval y col., Immunot. 109, 129, 1972; Goding, J. Immunol. Meth. 13, 215, 1976). Los anticuerpos marcados de la presente invención pueden utilizarse para ensayos "in vitro", "in vivo" e "in situ" para identificar células o tejidos que expresan un péptido específico.

Los anticuerpos recién descritos pueden inmovilizarse también en un soporte sólido. Los ejemplos de tales soportes sólidos incluyen los plásticos, por ejemplo el policarbonato, los hidratos de carbono complejos, por ejemplo la agarosa y la Sepharose, las resinas acrílicas, por ejemplo la poliacrilamida, y las bolas de látex. Las técnicas para fijar anticuerpos sobre dichos soportes sólidos ya son conocidas en la técnica (Weir y col., "Handbook of Experimental Immunology", 4ª ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Inglaterra, 1986, capítulo 10; Jacoby y col., Meth. Enzym. 34, Academic Press, N.Y., 1974). Los anticuerpos inmovilizados de la presente invención pueden utilizarse en ensayos "in vitro", "in vivo" e "in situ" así como en inmunocromatografía.

Además, un experto en la materia puede adaptar fácilmente los procedimientos actualmente disponibles así como las técnicas, métodos y kits publicados en párrafos anteriores relativos a anticuerpos, para generar péptidos capaces de fijar una secuencia específica de péptido con el fin de generar péptidos de antipéptido diseñados racionalmente, véase por ejemplo Hurby y col., "Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", en Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY, pp. 289-307, 1992; y Kaspczak y col., Biochemistry 28, 2930-8, 1989.

Los péptidos anti-péptido pueden generarse reemplazando los restos aminoácido básicos que se hallan en la secuencia de péptido de la AUR-1 y/o AUR-2 por restos ácidos, pero conservando los grupos hidrófobos y los polares no cargados. Por ejemplo, los restos lisina, arginina y/o histidina se reemplazan por restos ácido aspártico o ácido glutámico y los restos ácidos glutámico se reemplazan por lisina, arginina o histidina.

VII. Un método basado en un anticuerpo y un kit para la detección de la AUR-1 y/o la AUR-2

La presente invención abarca un método para la detección de un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra, que consiste en: (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo descrito antes, en condiciones tales que se formen inmunocomplejos y (b) detectar la presencia de dicho anticuerpo fijado sobre el polipéptido. En detalle, los métodos consisten en incubar una muestra a analizar con uno o varios anticuerpos de la presente invención y ensayar si el anticuerpo se fija sobre la muestra. Los niveles alterados de AUR-1 y/o AUR2 en una muestra, si se comparan con los niveles normales, pueden indicar la existencia de una enfermedad.

Las condiciones para incubar un anticuerpo con una muestra a analizar son variables. Las condiciones de incubación dependen del formato empleado en el ensayo, los métodos de detección empleados y el tipo y la naturaleza del anticuerpo empleado en el ensayo. Un experto en la materia sabrá reconocer que uno cualquiera de los formados de ensayo inmunológico habitualmente disponibles (por ejemplo los radioinmunoensayos, los ensayos inmunoabsorbentes de fijación sobre enzimas, Ouchterlony basado en la difusión o ensayos de cohete inmunofluorescente) pueden adaptarse fácilmente para que puedan emplearse los anticuerpos de la presente invención. Los ejemplos de tales ensayos se pueden encontrar en Chard, "An Introduction to Radioimmunoassays and Related Techniques", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holanda, 1986; Bullock y col., "Techniques in Imunocitochemistry", Academic Press, Orlando, FL, vol. 1 (1982), vol. 2 (1983), vol. 3 (1985); Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Holanda, 1985.

Las muestras a analizar mediante ensayos inmunológicos de la presente invención incluyen células, proteínas o extractos de membrana de células o líquidos biológicos, por ejemplo sangre, suero, plasma u orina. La muestra a analizar utilizada en el método recién mencionado puede variar en función del formato de ensayo, la naturaleza del método de detección y los tejidos, células o extractos empleados como muestra a analizar. Los métodos para preparar los extractos de proteínas o los extractos de membrana de células son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse fácilmente con el fin de obtener una muestra que sea susceptible de análisis con el sistema empleado.

Un kit contiene todos los reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de detección mencionados antes. El kit puede contener: (i) un primer recipiente que contenga un anticuerpo ya descrito antes e (ii) un segundo recipiente que contenga un conjugado compuesto por un reactivo de fijación del anticuerpo y un marcador. En otra forma preferida de ejecución, el kit contiene además uno o varios recipientes más que contienen uno o varios de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de anticuerpos fijados.

Los ejemplos de reactivos de detección incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos secundarios marcados, o como alternativa, si el anticuerpo primario está marcado, los reactivos cromóforos, enzimáticos o de fijación de anticuerpo que sean capaces de reaccionar con el anticuerpo marcado. El kit dividido en compartimentos puede ser como los kits descritos antes para sondas de ácido nucleico. Un experto en la materia reconocerá fácilmente que los anticuerpos descritos en la presente invención pueden incorporarse fácilmente a uno de los formados establecidos de kit, que son bien conocidos en la técnica.

VIII. Aislamiento de compuestos que interaccionan con la AUR-1 y/o la AUR-2

La presente invención se refiere además a un método para detectar un compuesto capaz de fijarse sobre un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2, que consiste en incubar el compuesto con la AUR-1 y/o AUR-2 y detectar la presencia del compuesto fijado sobre la AUR-1 y/o la AUR-2. El compuesto puede estar presente dentro de una mezcla compleja, por ejemplo suero, fluido sanguíneo o extractos celulares.

La presente invención se refiere además a un método para detectar un agonista o antagonista de la actividad de la AUR-1 y/o AUR-2 o de la actividad de un reactivo de fijación de la AUR-1 y/o AUR-2 que consiste en incubar las células que producen la AUR-1 y/o la AUR-2 en presencia de un compuesto y detectar los cambios en el nivel de actividad de la AUR-1 y/o AUR-2 o de actividad del reactivo de fijación de la AUR-1 y/o AUR-2. Los compuestos así identificados producirán un cambio en la actividad, lo cual indica la presencia del compuesto. El compuesto puede estar presente dentro de una mezcla compleja, por ejemplo suero, líquidos corporales o extractos celulares. Una vez se ha identificado el compuesto, este podrá aislarse empleando métodos bien conocidos de la técnica.

La presente invención abarca además un método para fomentar (estimular) o contrarrestar (antagonizar) la actividad asociada con la AUR-1 y/o AUR-2 en un mamífero, que consiste en administrar a dicho mamífero un agonista o un antagonista de la AUR-1 y/o AUR-2 en una cantidad suficiente para efectuar dicho estímulo o antagonismo. La presente invención contempla además un método para tratar enfermedades de un mamífero con un agonista o con un antagonista de la actividad de la AUR-1 y/o AUR-2 consiste en administrar el agonista o el antagonista al mamífero en una cantidad suficiente para fomentar o contrarrestar las funciones asociadas a las AUR-1 y/o AUR-2.

IX. Animales transgénicos

Una gran variedad de métodos están disponibles para la producción de animales transgénicos asociados con esta invención. El DNA puede inyectarse dentro del pronúcleo de un huevo fecundado antes de la fusión de los pronúcleos de macho y hembra o inyectarse en el núcleo de una célula embriónica (p.ej. el núcleo de un embrión de dos células) después de la iniciación de la división celular (Brinster y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 4438-4442, 1985). Los embriones pueden infectarse con virus, en especial con retrovirus, modificados para que lleven secuencias de nucleótidos receptores de iones inorgánicos de la invención.

Los células germinales pluripotentes derivadas de la masa celular interior del embrión y estabilizadas en cultivo pueden manipularse en el cultivo para que incorporen secuencias de nucleótidos de la invención. Un animal transgénico puede producirse a partir de tales células por implantación en un blastocisto que está implantado en una madre adoptiva y dejar que llegue a término. Los animales idóneos para ensayos transgénicos se obtienen de proveedores comerciales estándar, por ejemplo Charles River (Wilmington, MA), Taconic (Germantown, NY), Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN), etc.

Los procedimientos de manipulación de un embrión de roedor y para la microinyección de DNA en el pronúcleo de un cigoto son bien conocidos de los expertos en la materia (Hogan y col., lugar citado). Los procedimientos de microinyección en peces, huevos de anfibios y aves se describen con detalle en Houdebine y Chourrout, Experientia 47, 897-905, 1991. Otros procedimientos para la introducción de DNA en tejidos de animales se describen en la patente US-4 945 050 (Sandford y col., 30 de julio de 1990).

A título meramente ilustrativo, para preparar un ratón transgénico se inducen la superovulación de las hembras de ratón. Se colocan las hembras junto a los machos y las hembras fecundadas se sacrifican por asfixia con CO_{2} o por dislocación cervical y se recuperan los embriones de los oviductos extirpados. Se extraen las células cúmulo adyacentes. Después se lavan los embriones pronucleares y se almacenan hasta el momento de la inyección. Se aparean hembras de ratón adulto de ciclo aleatorio con machos vasectomizados. Las hembras receptoras se fecundan al mismo tiempo como hembras dadoras. A continuación se realiza la transferencia quirúrgica de los embriones. El procedimiento para generar ratas transgénicas es similar al de los ratones, véase Hammer y col., Cell 63, 1099-1112, 1990.

Los métodos para cultiva células germinales embrionarias (ES) y la posterior producción de animales transgénicos por introducción de DNA en las células ES empleando métodos tales como la electroporación, la precipitación de DNA con fosfato cálcico y la inyección directa son bien conocidas de los expertos en la materia, véase por ejemplo "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach", de E.J. Robertson, coordinador, IRL Press, 1987.

En los casos, en los que se realiza una integración genética aleatoria, un clon que contiene la o las secuencias de la invención se cotransfecta con un gen que codifica resistencia. Como alternativa, el gen que codifica la resistencia a la neomicina se fija físicamente sobre la o las secuencias de la invención. La transfección y el aislamiento de los clones deseados se llevan a cabo por cualquiera de los diversos métodos bien conocidos de los expertos en la materia (E.J. Robertson, lugar citado).

Las moléculas de DNA introducidas en células ES pueden integrarse también en el cromosoma por un proceso de recombinación homóloga, ver Capecchi, Science 244, 1288-1292, 1989. Ya se han descrito métodos para la selección positiva del acontecimiento de recombinación (es decir, la neorresistencia) y la sección dual positivo-negativo (es decir, la neorresistencia y la resistencia al gancyclovir) y la posterior identificación de los clones deseados por PCR, véase Capecchi, lugar citado, y Joyner y col., Nature 338, 153-156, 1989, cuyas enseñanzas se incorporan a la presente solicitud. La fase final del procedimiento consiste en inyectar células ES diana a los blastocistos y transferir los blastocistos a hembras pseudopreñadas. Los animales quiméricos resultantes se nutren y se analizan los descendientes por "Southern blotting" para identificar los individuos que llevan los transgenes. Otros autores han debatido los procedimientos para la producción de mamíferos no roedores y otros animales, véase Houdebine y Chourrout, lugar citado; Pursel y col., Science 244, 1281-1288, 1989; y Simms y col., Bio/Technology 6, 179-183, 1988.

Por lo tanto, la invención proporciona mamíferos transgénicos no humanos que llevan un transgén que codifica a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 o un gen que efectúa la expresión de un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2. Tales mamíferos transgénicos no humanos son útiles en particular como sistema de ensayo "in vivo" para estudiar los efectos de la introducción de un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2, para regular la expresión de polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 (es decir, por introducción de genes adicionales, ácidos nucleicos antisentido o ribozimas).

Un "animal transgénico" es un animal que tiene células que contienen DNA que se ha insertado artificialmente en la célula, dicho DNA se convierte en parte del genoma del animal, que se desarrolla a partir de tal célula. Los animales transgénicos preferidos son los primates, ratones, ratas, vacas, cerdos, caballos, cabras, ovejas, perros y gatos. El DNA transgénico puede codificar a un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 humano. La expresión nativa en un animal puede reducirse proporcionando una cantidad de RNA antisentido o DNA, que sea eficaz para reducir la expresión del receptor.

X. Terapia genética

La AUR-1 y/o AUR-2 o sus secuencias genéticas serán útiles además en la terapia genética (revisión en Miller, Nature 357, 455-460, 1992). Miller constata que se han registrado avances en las estrategias prácticas de terapia genética humana que confirman los resultados positivos iniciales. La ciencia básica de la terapia genética se describe en Mulligan, Science 260, 926-931, 1993.

En una forma preferida de ejecución se inserta un vector de expresión que contienen la secuencia que codifica a la AUR-1 y/o AUR-2 en células, se cultivan las células "in vitro" y después se infunden en gran cantidad en los pacientes. En otra forma preferida de ejecución se transfiere un segmento de DNA que contiene un promotor a elegir (por ejemplo un promotor fuerte) a células que contienen la AUR-1 y/o AUR-2 endógena, de tal manera que el segmento del promotor incremente la expresión del gen de la AUR-1 y/o AUR-2 endógena (por ejemplo, el segmento del promotor se transfiere a la célula de modo que quede unida directamente al gen de la AUR-1 y/o AUR-2 endógena).

La terapia genética puede incluir el uso de un adenovirus que contenga el cDNA de la AUR-1 y/o AUR-2 dirigido a un tumor, un aumento de la AUR-1 y/o AUR-2 por implantación de células de ingeniería genética, la inyección con virus de AUR-1 y/o AUR-2 o la inyección de AUR-1 y/o AUR-2 desnuda a tejidos apropiados.

Las poblaciones de células diana pueden modificarse por introducción de formas alteradas de uno o de varios componentes de los complejos de proteína con el fin de modular la actividad de tales complejos. Por ejemplo, reduciendo o inhibiendo la actividad de un componente del complejo dentro de las células diana puede reducirse, inhibirse o invertirse un acontecimiento anormal de transducción de señales que conduzca a un estado patológico. La deleción o los mutantes de sentido erróneo de un componente, que conservan la capacidad de interaccionar con otros componentes de los complejos de proteínas, pero no pueden funcionar en la transducción de señales, pueden utilizarse para inhibir un acontecimiento anormal o nocivo de transducción de señales.

Los vectores de expresión derivados de virus, tales como retrovirus, virus de viruela, adenovirus, adenovirus asociados, herpes virus, diversos virus de RNA o virus del papilloma bovino, pueden utilizarse para el transporte de secuencias de nucleótidos (p.ej. cDNA) que codifican a la proteína AUR-1 y/o AUR-2 recombinante hasta la población de células diana (p.ej. células tumorales). Los métodos, que son bien conocidos de los expertos en la materia, pueden utilizarse para construir vectores víricos recombinantes que contengan secuencias codificadoras, véase por ejemplo las técnicas descritas por Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1989 y por Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. 1989. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico recombinantes, que codifican a secuencias de proteínas, pueden utilizarse como DNA desnudo o en sistemas reconstituidos, p.ej. liposomas u otros sistemas de lípidos para el transporte de células diana (véase p.ej. Felgner y col., Nature 337, 387-8, 1989). Existen diversos métodos más para la transferencia directa de DNA plásmido a células que pueden utilizarse en la terapia genética humana y consiste en dirigir el DNA a receptores de las células mediante el complejado de DNA plásmido en proteínas, véase Miller, lugar citado.

En su forma más simple, la transferencia genética puede realizarse por simple inyección de cantidades minúsculas de DNA en el núcleo de una célula, mediante un proceso de microinyección, véase Capecchi, M.R., Cell 22, 479-88, 1980. Una vez se han introducido los genes recombinantes en la célula, pueden reconocerse por los mecanismos normales de las células de transcripción y traducción y se expresará un producto genético. Existen otros métodos que también se han probado para introducir DNA en un gran número de células. Estos métodos incluyen: la transfección, en la que se precipita el DNA con CaPO_{4} y se recoge en las células por pinocitosis (Chen, C. y Okayama, H., Mol. Cell Biol. 7, 2745-52, 1987), electroporación, en la que se exponen las células a pulsos de voltaje elevado para introducir orificios en la membrana (Chu. G. y col., Nucleic Acid Res. 15, 1311-26, 1987); lipofección/fusión de liposomas, en la que el DNA se empaqueta en vesículas lipófilas, que se fusionan con la célula diana (Felgner, P.L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7, 1987); y bombardeo de partículas, empleando el DNA fijado sobre pequeños proyectiles (Yang, N.S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 9568-72, 1990). Otro método para la introducción de DNA en células consiste en unir el DNA a proteínas modificadas químicamente.

Se ha puesto de manifiesto además que las proteínas de adenovirus son capaces de desestabilizar los endosomas y aumentar la absorción de DNA en las células. La adición de adenovirus a soluciones que contienen complejos de DNA o la fijación del DNA a polilisina unida con enlace covalente a adenovirus empleando agentes de reticulación de proteínas mejora sustancialmente la absorción y expresión del gen recombinante, Curiel, D.T. y col., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 6, 247-52, 1992.

Tal como se emplea aquí, "transferencia genética" significa el proceso de introducir una molécula de ácido nucleico ajeno en una célula. La transferencia genética se realiza habitualmente para permitir la expresión de un producto concreto, codificado por el gen. El producto puede incluir una proteína, un polipéptido, un DNA o RNA antisentido o un RNA activo en sentido enzimático. La transferencia genética puede realizarse a células cultivadas o por administración directa a animales. La transferencia genética supone en general un proceso de contacto del ácido nucleico con una célula diana mediante interacciones no específicas o mediadas por un receptor, la absorción del ácido nucleico en la célula a través de la membrana o por endocitosis y la liberación del ácido nucleico en el citoplasma de la membrana plasmática o endosoma. La expresión puede requerir, además, el movimiento del ácido nucleico hacia el núcleo de la célula y la fijación sobre factores nucleares apropiados para la transcripción.

Tal como se emplea aquí, "terapia genética" es una forma de transferencia genética y está incluida en la definición de transferencia genética empleada aquí y se refiere específicamente a la transferencia genética para expresar un producto terapéutico de una célula "in vivo" o "in vitro". La transferencia genética puede realizarse "ex vivo" en células que después se trasplantan a un paciente, o puede realizarse por administración directa del ácido nucleico o del complejo de proteínas del ácido nucleico a un paciente.

En otra forma preferida de ejecución se proporciona un vector que tiene secuencias de ácido nucleico que codifican a la AUR-1 y/o AUR-2, dicha secuencia de ácido nucleico se expresa únicamente en tejidos específicos. Los métodos para realizar la expresión genética específica de tejido se describen en la publicación internacional WO 93/09236, depositada con fecha 3 de noviembre de 1992 y publicada con fecha 13 de mayo de 1993.

En todos los vectores precedentes descritos antes, otro aspecto de la invención es que la secuencia de ácido nucleico contenida en el vector puede incluir adiciones, deleciones o modificaciones de una parte o de toda la secuencia del ácido nucleico, definido antes.

En otra forma preferida de ejecución se define un método de reemplazo de genes. Tal como se emplea aquí, el término "reemplazo de genes" indica el suministro de una secuencia de ácido nucleico que es capaz de expresarse "in vivo" en un animal y de este modo proporcionar o aumentar la función de un gen endógeno, que está ausente o deficiente en el animal.

Ejemplos

Los ejemplos que siguen no son limitantes, sino que son meramente ilustrativos de varios aspectos y características de la presente invención. Los siguientes ejemplos describen el aislamiento y la caracterización de las nuevas proteínas AUR-1 y AUR-2.

Las proteína-quinasas son uno de los grupos más numerosos de proteínas eucariotas, con varios centenares de miembros conocidos. Estas proteínas comparten un dominio de 250-300 aminoácidos, que puede subdividirse en 12 subdominios distintos, que abarcan la estructura nuclear catalítica común. Estos motivos proteicos conservados se han explotado recientemente empleando estrategias de clonación basadas en la PCR, que conduce a una expansión significativa de la quinasas conocidas. El alineamiento múltiple de las secuencias del dominio catalítico permite su segregación en un árbol filogenético. De este modo, las quinasas afines se reúnen en distintas ramas o subgrupos, que incluyen: las tirosina-quinasas, la quinasas dependientes de nucleótidos cíclicos, las quinasas de calcio/calmodulina, las quinasas dependientes de ciclina y las MAP-quinasas, así como otros subgrupos menos definidos.

Inicialmente hemos empezado a identificar homólogos del CCK4, un receptor que representa un grupo distinto de tirosina-quinasas. Los alineamientos múltiples sugieren que el CCK4 es muy afín con el ROS y el grupo TRK de las tirosina-quinasas de receptor. Hemos diseñado cebadores degenerados para secuencias conservadas dentro de los subdominios I y IX de quinasa de estos receptores. El subdominio I está en el extremo N del dominio de quinasa y contiene el motivo de consenso GXGXXGXV que interviene en el anclaje del ATP sobre la unidad catalítica de todas las clases de quinasas. El subdominio IX contiene un Asp casi invariable que actúa estabilizando el bucle catalítico y uniendo los restos del subdominio VIB. Este Asp invariable y los aminoácidos que lo flanquean se utilizan a menudo en las estrategias de clonación por PCR, ya que distingue las tirosina-quinasas (DVWSY/FGI/V) de las serina/treonina-quinasas (DXWA/SXGI/V). Basándonos en la comparación de todas las proteína-quinasas conocidas, hemos diseñado cebadores oligonucleótidos degenerados para los subdominios I y IX que recogerían únicamente el CCK4 y su homólogo KLG de pollo por PCR.

Hemos diseñado cebadores degenerados, el A y el DVW, basados en restos conservados dentro del dominio de quinasa del CCK4, que pueden utilizarse para identificar nuevas quinasas empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Cuando se aplica a la célula HEPM el sscDNA como molde se aíslan múltiples copias del CCK4 así como un nuevo fragmento de DNA (43-43) de 567 bp con homología con otras quinasas. La nueva secuencia es muy similar a la Aurora-quinasa de la Drosophila (Genebank número de registro #X83465) y el clon se denomina Aurora1 humana. Utilizando este fragmento como sonda hemos explorado los RNA de un gran número de líneas celulares de cáncer de colon y un "Northern blot" de tejido múltiple humano, demostrando una aparente selectividad de expresión de la Aurora1 en células tumorales.

La sonda Aurora1 se utiliza también para explorar una biblioteca de cDNA construida a partir de mRNA de línea celular de cáncer de páncreas humano para aislar los clones que se solapan, abarcando el marco abierto completo de lectura de la Aurora1. De los múltiples clones aislados, siete corresponden a la Aurora1 humana. Se aíslan además otros dos clones, que se hibridan débilmente, durante la exploración y el análisis de secuencia revela que corresponden a una quinasa afín, aunque distinta, que hemos denominado Aurora2 humana.

La AURORA1 y AURORA2 recombinantes expresadas en células COS migran con Mr aparente de 39.000 y 46.000, consistente con sus pesos moleculares previstos de 39.264 y 46.730, basados en su secuencia primaria de aminoácidos. Este análisis confirma que la proteína recombinante puede producirse de forma estable en células de mamíferos. Están en marcha ensayos de fosforilación para determinar la especificidad de diana de estas supuestas quinasas.

Los inmunorreactivos específicos se generan en conejos contra la secuencia de péptido a partir de los dominios N-terminales de AUR1 y AUR2, estos reactivos tienen que localizar la expresión de Auroras endógenas y recombinantes dentro de las células. Además, estos reactivos pueden utilizarse en el empeño por identificar sustratos para las Auroras con el fin de comprender mejor su rol biológico normal.

Las formas negativas dominantes y constitutivamente activas de la AUR1 y AUR2 serán útiles para delinear consecuencias biológicas de reducción (oblation) o de sobreexpresión de estas supuestas serina/treonina-quinasas. Los estudios iniciales con constructos de DNA alterados demuestran que en apenas 2 horas después de la infección de las células de NIH3T3 o BALB/3T3 con los materiales retrovíricos AUR1 o AUR2, las células se convierten en multinucleadas. Este fenotipo persiste de modo que 2 días después de la infección se observa que algunas células tienen hasta 20 núcleos. Las células multinucleadas tienen como es lógico un citoplasma mayor y límites celulares difusos. La inmunotinción con actina y DAPI confirma que estos núcleos están contenidos todos ellos dentro de una sola célula y que el citoesqueleto de activa es aparentemente normal. Los experimentos en curso se dirigen a esclarecer el contenido cromosómico y la integridad dentro del núcleo, el número y ubicación de los cromosomas y la organización general de la red del microtúbulo.

La caracterización de las consecuencias a largo plazo de la expresión de la AUR1 o AUR2 normal, constitutivamente activa y negativamente dominante está en marcha y se estudia en particular si inducen o invierten la transformación celular. Se están aislando clones estables que expresan estas proteínas recombinantes. Se caracterizarán por su velocidad de crecimiento, síntesis de DNA, inhibición de contacto celular (formación de "foci"), crecimiento independiente del anclaje (ensayos en agar blando) y tumorigenicidad en ratones desnudos (= sin pelo).

¿Qué papel desempeñan las Auroras en la replicación y segregación centrosómica en mamíferos? La disrupción o desregulación de tales funciones se sabe que provocan una mala agregación de cromosomas, husos (spindles) monopolares y división nuclear asimétrica en la levadura, la Drosophila y los anfibios. La homología entre las Auroras humanas, la levadura IPL1 y la Aurora de la Drosophila es sorprendente. Por ello hemos deseado evaluar si las Auroras humanas son equivalentes funcionales de la levadura IPL1. El gen de la levadura IPL1 se requiere para la segregación cromosómica de alta fidelidad en el Saccharomyces cerevisiae (Francisco, L. y col., Mol. Cell. Biol. 14, 4731-4740, 1994) y se ha aislado un mutante sensible a la temperatura. Hemos planificado determinar si varias versiones de longitud completa y quiméricas de las Auroras humanas pueden complementar este mutante sensible a la temperatura en la levadura. Los constructos quiméricos que contienen el dominio N-terminal de la IPL1 y el dominio quinasa de las Auroras humanas nos permitirán determinar si la quinasa es funcionalmente equivalente, evitando los potenciales roles regulador o de localización intracelular, mediados por dominios N-terminales peor conservados. Si los genes humanos compensan la pérdida de función de la IPL1, entonces podríamos utilizar esta línea para explorar los inhibidores de molécula pequeña de la Aurora-quinasa humana.

Ejemplo 1

Clonación molecular

Se aíslan RNA totales empleando el protocolo de extracción con sales de guanidina/fenol de Chomczynski y Sacchi (P. Chomczynski y N. Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156, 1987) a partir de células humanas normales de próstata, duodeno, ovarios, hígado, pituitaria, cerebro, timo y glándulas salivales, de células HEMP humanas (mesénquima palatal), de tumor de Wilms primario humano y de carcinoma de ovarios y de líneas celulares tumorales humanas originadas en el colon/recto (HT29, SW480, SW1463, SW1417, SW837, SW948, SW620, SW403, SW1116, T84, HTC15, LS123 y Caco-2), riñón (CaKi-1, CaKi-2), hígado (SK-HEP-1), páncreas (HS766T, ASPC, Capan-1) y mama (MCF7).

Estos RNA se utilizan como molde para generar cDNA de hebra simple empleando el kit llamado Superscript Preamplification System for First Strand Synthesis kit, suministrado por Gibco BRL (Life Technologies, EE.UU; Gerard, G.F. y col., FOCUS 11, 66, 1989) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Una reacción típica emplea 10 \mug de RNA total o 2 \mug de poly(A)* RNA, con 1,5 \mug de oligo(dT)_{12-18} en un volumen de reacción de 60 \mul. El producto se trata con RNasa H y se diluye con 100 \mul de H_{2}O. Para la siguiente amplificación por PCR se emplean en cada reacción 1-4 \mul de estos sscDNA.

Los oligonucleótidos se sintetizan en un sintetizador del tipo Applied Biosystems 394 DNA Synthetizer utilizando la química ya establecida de las fosforamiditas y después de la precipitación en etanol se utilizan sin purificar. Los cebadores de oligonucleótidos degenerados son:

A = 5'-GARTTYGGNGARGTNTTYYTNGC-3'(SEQ ID NO: 16) (sentido) y

DVW: 5'-AGNACNCCRAANGCCCACACRTC-3'(SEQ ID NO: 17) (antisentido).

Estos cebadores derivan de las secuencias de péptido EFGEVFLA (SEQ ID NO: 18) (hebra sentido del subdominio I de quinasa) y DVW(A/S)FGVL (hebra antisentido del subdominio IX de quinasa), respectivamente. Las denominaciones de restos de nucleótidos degenerados son: N = A, C, G o T; R = A o G; e Y = C o T. Utilizando el CCK4 como molde, estos cebadores producen un producto de 567 bp.

Se lleva a cabo una reacción PCR empleando los cebadores A y DVW aplicados a las fuentes de hebras simples recién descritas. Los cebadores se añaden en una concentración final de 5 \muM a una mezcla que contiene Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada trifosfato de desoxinucleósido, un 0,001% de gelatina y 1,5 U de DNA-polimerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer/Cetus) y 1-4 \mul de cDNA. Después de una desnaturalización a 95ºC durante 3 min, las condiciones del ciclo son 94ºC durante 30 s, 37ºC durante 1 min, una rampa de 2 min hasta 72ºC y a 72ºC durante 1 min para los 3 primeros ciclos, después siguen 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min 45 s para otros 35 ciclos. Se aíslan los fragmentos de la PCR que migran entre 500-600 bp a través de geles de agarosa del 2% empleando GeneClean (Bio101) y T-A clonado en el vector pCRII (Invitrogen Corp., EE.UU.) con arreglo a las instrucciones del fabricante.

Las colonias se seleccionan para preparaciones de DNA mini-plásmido empleando columnas Qiagen y los DNA plásmidos se secuencian empleando un kit terminador de colorante para secuenciación en ciclos con DNA-polimerasa AmpliTaq, FS (ABI, Foster City, CA). Los productos de la reacción de secuenciación se obtienen en un aparato del tipo ABI Prism 377 DNA Sequencer y se analizan aplicando el algoritmo de alineamiento BLAST (Altschul, S.F. y col., J. Mol. Biol. 215, 403-10). Se aísla un nuevo clon (#43-43) por PCR con los cebadores A y DVW utilizando como molde un cDNA de hebra simple de mesénquima palatal embrionario humano (HEPM o CRL1486). A continuación se denomina este clon un fragmento de la Aurora1 humana.

Se construye una biblioteca de cDNA lambda-ZapII (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) empleando como molde para la síntesis de la primera hebra del cDNA un mRNA de un banco (pool) de líneas celulares de carcinoma de páncreas. Se exploran los fagos en filtros de nitrocelulosa con un inserto marcado con P^{33} y cebado aleatoriamente a partir del p43-43 que codifica a la Aurora1 humana a 2x10^{6} cpm/ml en tampón de hibridación que contiene 6xSSC, 1x reactivo de Denhardt, 0,1% de SDS, con 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado. Después de una hibridación a 65ºC durante una noche se lavan los filtros a 65ºC en 0,1xSSC, 0,1% de SDS. Se secuencian los clones de cDNA de longitud completa en bandas hebras empleando la secuenciación manual con polimerasa T7 y cebadores de oligonucleótidos (Tabor y Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-71, 1987).

Ejemplo 2

Análisis "northern blot"

Los "northern blots" que contienen 2 \mug de poly A+RNA por pista de 16 tejidos diferentes de humanos adultos (bazo, timo, próstata, testículos, ovarios, intestino delgado, mucosa de colon, corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculos de esqueleto, riñón, páncreas y leucocitos de sangre periférica), cuatro tejidos diferentes de fetos humanos (cerebro, pulmón, hígado y riñón) y 8 líneas celulares de cáncer humano (HL60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480 y G361) en una membrana de poliamida (Nylon) modificada en carga se obtienen de Clontech (Palo Alto, CA). Los "northern blots" adicionales se preparan cromatografiando 10 \mug de RNA total aislado a partir de células tumorales humanas a través de un gel desnaturalizador de agarosa con un 1,2% de formaldehído y transfiriéndolos a membranas de poliamida.

Se hibridan los filtros con sondas marcadas con dCTP[P^{32}] cebadas aleatoriamente, sintetizadas ya sea del inserto de 527 bp del clon 43-43 de la Aurora1 humana, ya sea del fragmento EcoRI de 1162 bp del pSG20, o ya sea del fragmento EcoRI de 1 kb del clon 11-1A de la Aurora2 humana o del fragmento BamHI-NotI de 1257 bp del pS621. Se realiza la hibridación a 60ºC durante una noche en 6XSSC, 0,1% de SDS, 1X solución de Denhardt, 100 mg/ml de DNA de esperma de arenque desnaturalizado con 1-2 x 10^{6} cpm/ml de sondas de DNA marcado con P^{32}. Los filtros se lavan con 0,1 x SSC/0,1% de SDS, 65ºC y se exponen durante una noche sobre una película XAR-2 de Kodak.

Se identifica un transcrito de mRNA de AUR1 de aproximadamente 1,4 kb y se constata que es más abundante en el timo y en el intestino delgado, con señales débiles en las muestras de testículos, ovarios, colon, placenta y bazo. La próstata y los linfocitos de sangre periférica son negativos. Son también positivos el hígado y el riñón fetales humanos, con una señal débil en el pulmón fetal y sin expresión en el cerebro fetal (ver tabla).

Un análisis similar de la expresión de la AUR2 humana presenta un perfil de expresión más restringido. Se detecta con intensidad un solo transcrito de AUR2 de 2,4 kb en testículos de adulto y en timo y débilmente en [corazón, placenta, músculos esqueléticos] y en hígado y en riñón fetal, mientras que las demás fuentes de tejido normal son negativas (ver tabla).

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Análisis "northern" de AURORA 1 y AURORA 2 en tejidos humanos normales y en células cancerosas

Tipo de célula	Origen	AUR 1	AUR 2
timo	tejido normal	5	4
hígado fetal	tejido normal	4	2
riñón fetal	tejido normal	4	1
pulmón	tejido normal	3	0
duodeno	tejido normal	2	1
colon	tejido normal	2	0
pulmón fetal	tejido normal	2	0
ovario	tejido normal	2	0
testículos	tejido normal	2	2
cerebro	tejido normal	0	0
cerebelo	tejido normal	0	0
glándula salival	tejido normal	0	0
corazón	tejido normal	0	0
hígado	tejido normal	0	0
páncreas	tejido normal	0	0
riñón	tejido normal	0	0
bazo	tejido normal	0	0
estómago	tejido normal	0	0
útero	tejido normal	0	0
próstata	tejido normal	0	0
músculo esquelético	tejido normal	0	0
cerebro fetal	tejido normal	0	0
PBL	tejido normal	0	0
glándula salival	tejido normal	0	0
placenta	tejido normal	0	0

(Continuación)

Tipo de célula	Origen	AUR 1	AUR 2
SF-268	tumor del SNC	4	ND
CCRF-CEM	leucemia	4	ND
K-562	leucemia	4	ND
HCC-2998	tumor de colon	4	ND
SW620	tumor de colon	4	2
KM-12	leucemia	4	ND
MCF7/ADR-RES	tumor de mama	4	2
MDA-N	tumor de mama	4	ND
BT-549	tumor de mama	4	ND
SW480	tumor de colon	4	4
SW48	tumor de colon	4	ND
Calu-3	tumor de pulmón	4	ND
Calu3	tumor de pulmón	4	2
T47D	tumor de mama	4	2
A375	melanoma	4	0
SF767	tumor del SNC	4	0
SW1417	tumor de colon	4	4
CaKi2	tumor de riñón	4	0
CaKi1	tumor de riñón	4	0
Caco2	tumor de colon	4	4
SW1417	tumor de colon	4	0
T98G	tumor del SNC	4	0
SF-539	tumor del SNC	3	ND
SK-MEL-2	melanoma	3	ND
SK-MEL-5	melanoma	3	ND
R-48	tumor gástrico	3	ND
RF-1	tumor gástrico	3	ND
SW948	tumor de colon	3	ND
AGS	tumor gástrico	3	ND
HFL1	pulmón normal	3	ND
OVCAR-8	tumor de ovarios	2	ND
HT-29	tumor de colon	2	ND
MDA-MB-231	tumor de mama	2	ND
MDA-MB-435	tumor de mama	2	ND
SK-MEL-5	melanoma	2	ND
Kato-3	tumor gástrico	2	ND
Colo 205	tumor de colon	2	ND
Colo 320DM	tumor de colon	2	2
WiDr	tumor de colon	2	ND
HT-29	tumor de colon	2	ND
SNU-C2B	tumor de colon	2	ND
HTC15	tumor de colon	2	2
T84	tumor de colon	2	0
SW948	tumor de colon	2	0
Daoy	tumor del SNC	2	0
OVCAR3	tumor de ovarios	2	0
HS766T	tumor de páncreas	2	0
SW1116	tumor de colon	2	0
tumor de Wilms	tumor de riñón	2	0
UO-31	tumor renal	0	ND

\newpage

El perfil de expresión del mRNA de la AUR1 en diversos tumores primarios y líneas celulares múltiples de diversos orígenes neoplásicos se determina mediante el análisis Northern y mediante un ensayo semicuantitativo por PCR empleando cebadores de secuencias del dominio de quinasa AUR1. Los resultados se incluyen en la tabla. Los transcritos de AUR1 se detectan en cada línea tumorales y se ensayan con la expresión máxima en diversas líneas celulares de cáncer de colon humano (SW480, Colo320, SW620, SW1417, Caco2, SW12417) y en carcinoma de pulmón (Calu3), carcinoma de mama (T47D, MCF7), melanoma (A375), carcinoma de riñón (CaKi-1, CaKi-2), carcinoma de hígado (SK-HEP-1) y tumores neurológicos (SF767, T98G). La expresión menor de la AUR1 se observa en otros carcinomas de colon (HTC15, T84, SW948, SW1116, HT29), tumores neurológicos (Daoy), carcinoma de ovarios (Ovcar3, tumor primario), carcinoma de páncreas (HS766T) y tumor primario de riñón.

El perfil de expresión de la AUR2 en líneas celulares tumorales es sorprendentemente más restringido que el de la AUR1. Una expresión fuerte de la AUR2 se detecta solamente en las líneas celulares de carcinoma de colon (Caco2, SW480, SW1417, SW620), mientras que se observan señales débiles en otras líneas celulares de tumores de colon (HTC15, Colo320), mama (T47D, MCF7) y pulmón (Calu3). Diversas líneas tumorales más no tienen transcritos detectables de la AUR2.

Ejemplo 3

Detección semicuantitativa por PCR de la AURORA 1

Se aísla el RNA de una gran variedad de líneas celulares humanas, tejidos congelados frescos y tumores primarios. Se sintetiza el cDNA de hebra simple a partir de 10 mg de cada RNA del modo descrito anteriormente empleando el sistema llamado Superscript Preamplification System (Gibco BRL). Entonces se utilizan moldes de hebra simple en una reacción PCR de 35 ciclos con dos oligonucleótidos específicos de la AURORA1 (3476: 5'-TTTGGCTCGGGAGAA
GAAAAGCCAT-3' (SEQ ID NO: 19) y 3506: 5'-CAATCATCTCTGGGGGCAGGTAGT-3') SEQ ID NO: 20). Los productos de reacción se someten a electroforesis en geles de agarosa del 2%, se tiñen con bromuro de etidio y se fotografían en una caja de luz UV. Se estima la intensidad relativa de las bandas específicas de la AURORA1 de \approx475 bp de cada muestra.

Ejemplo 4

Análisis "Southern blot"

Se aísla el DNA genómico de un gran número de líneas humanas transformadas (CaCO2, HTC15, LS147T,
SKCO4, SW480, SW403, SW620, SW948, SW1417, SW1116, MCF7, BT474) empleando procedimientos estándar (Maniatis y col.). Se tripsinizan las células, se lavan con PBS y se suspenden de nuevo a razón de \approx10^{8} células/ml en un tampón de digestión (NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 25 mM, pH 8, SDS del 0,5%, 0,1 mg/ml de proteinasa K). Se lisan las células por incubación a 50ºC durante 12 horas, después se extraen con fenol/cloroformo y se precipitan con un volumen igual de acetato amónico 7,5 M y EtOH del 100%. Se resuspenden los DNA en tampón TE. Se digieren aproximadamente 20 microgramos de DNA genómico con HindIII o XhoII a 37ºC por lo menos durante 4 horas antes del fraccionamiento a través de geles de agarosa del 1%. Los fragmentos de DNA se transfieren a membranas de nitrocelulosa por el método de transferencia capilar (Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503, 1975) y se hibridan
con sondas específicas de la Aurora1 y de la Aurora2 humanas del modo descrito en el anterior análisis Northern Blot.

Se restringen los DNA con HindIII, dado que los DNA tanto de la AUR1 como de la AUR2 contienen un sitio único para esta enzima de restricción. La AUR1 presenta una banda única de 4,3 kb de igual densidad a partir de todas las fuentes, lo cual sugiere que se trata de un gen de copia simple, no reordenado, en los múltiples tipos de tumor ensayados. Sin embargo, en condiciones de baja restricción, hemos sido capaces de detectar fragmentos SacI de 1,3 kb y 3,2 kb, que se hibridan débilmente con la sonda de la AUR1. La clonación y el análisis de secuencia revelan que esta región codifica un pseudogén afín a la AUR1 sin intrón (denominado AUR3), que presentan múltiples desplazamientos de marco. Además, inmediatamente después del pseudogén AUR3 en dirección a 5'(upstream) existe una región con repeticiones invertidas complejas, que previsiblemente formarán un bucle de herradura (hairpin) muy estable. La secuencia de DNA de la AUR3 es homóloga con la AUR1 empezando desde el primer nucleótido del cDNA de la AUR1. Inmediatamente después de este sitio en dirección a 5'(upstream) existe el bucle de herradura previsto de la AUR3. Actualmente estamos caracterizando los clones genómicos de la AUR1 para determinar si la homología de la AUR3 continúa en dirección a 5'después de este nucleótido y si el cDNA de la AUR1 incluye o está precedido por un bucle de herradura similar. La AUR2 presenta bandas en 7,0 kb y 4,3 kb y una banda de pesos moleculares ligeramente superior en \approx10 kb a partir de todas las fuentes. Estos datos sugieren que la AUR2 es también un gen de copia simple. Las múltiples bandas que se han visto en las transferencias (blots) con sondas de AUR2 se deben probablemente al hecho de que se emplea una sonda de cDNA de longitud completa.

Ejemplo 5

Análisis de secuencia de clones cDNA que codifican a la AURORA1 y AURORA2 humanas

La secuencia completa de la Aurora1 y de la Aurora2 humanas se determina a partir de clones de longitud completa de cada una de ellas, aislada a partir de la biblioteca del carcinoma de páncreas humano, a partir del duodeno humano normal y de material aislado de Aurora1 humana parcial de células HEPM.

La secuencia de nucleótidos de la Aurora1 humana de 1,244 bp (AUR1_h) se presenta en la SEQ ID NO: 1 o en la SEQ ID NO: 2 y contiene un único marco de lectura abierto que codifica a un polipéptido de 344 aminoácidos. La región codificadora de la AUR1_1 está flanqueada por un región de 54 nucleótidos no traducida en 5'y una región de 132 nucleótidos no traducida en 3', que termina en una cola poly(A).

La secuencia de nucleótidos de la Aurora2 humana (AUR2_h) de 2,198 bp se presenta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 y contiene un único marco abierto de lectura que codifica a un polipéptido de 403 aminoácidos. La región codificadora de la AUR2_h está flanqueada por una región de 200 nucleótidos con 5'sin traducida y una región de 768 nucleótidos con 3'sin traducir.

Las secuencias de los cDNA de la AUR1 y AUR2 se secuencian a partir tanto de tumores pancreáticos humanos como de duodeno humano normal, sin diferencias de secuencia, excepto algunos sitios probablemente polimórficos. Estas ambigüedades incluyen:

cDNA	nucleótido	Comentario:
AUR1	1174	un clon tiene insertada la polyA
	873	T en todos los clones duodenales, C en el tumor de páncreas
	469	T en un clon, C en todos los demás
	848	G en un clon, A en todos los demás, cambia el aminoácido E por G
	1097	G en un clon, T en otros 2
	956	G en un clon, A en otros 4
	29	empalme con 103 en 5 clones, sin empalme (diseminado) en 5 clones
AUR2	349	T en 1 clon, C en muchos otros (cambio del aminoácido P por L)
	369	A en 3 clones, G en muchos otros (cambio del AA V por I).

Las porciones terminales en C de la AUR1 y de la AUR2 conservan los 12 subdominios característicos de proteína-quinasas eucariotas. Estos dominios de quinasa de AUR1 y AUR2 están precedidos por un dominio N-terminal que tiene 74 y 130 aminoácidos, respectivamente. La comparación de nucleótidos de la AUR1 y AUR2 y las secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4) con el DNA disponible y las bases de datos de secuencias de proteínas indican que son únicos, con la excepción de que varias secuencias EST comparten una gran identidad de secuencia. Pero, tienen una homología sorprendente tanto en los dominios N-terminales como en los catalíticos con la Aurora de la Drosophila y los genes IPL1 del Saccharomyces cerevisiae. Además, dos entradas de bases de datos no publicadas apoyan la verosimilitud de que son homólogos próximos del Xenopus laevis (p46APK - GB nº de registro #Z17206 y p46BPK - GB nº de registro #Z17207).

Los dominios N-terminales de las Auroras de humanos, de la rana, de la Drosophila y de la levadura comparten una identidad limitada de secuencia. La AUR2 requerida tiene abundancia de glutamatos que están presentes a menudo en pares separados por un resto único.

La comparación de los dominios catalíticos de estas proteínas revela que la AUR1 comparte un 70% de identidad de aminoácidos con la AUR2, un 61% con la Aurora de la Drosophila y un 45% con el gen IPL1 de la levadura. La quinasa de la AUR2 comparte un 60% de identidad de aminoácidos con la proteína de la Drosophila y un 45% de identidad con el IPL1 de la levadura. Tanto la AUR1 como la AUR2 comparten menos de un 45% de homología con otras quinasas conocidas de mamíferos (la más próxima es la proteína-quinasa A dependiente de cAMP), lo cual sugiere que son homólogas de estas quinasas de Drosophila y de levadura.

Tanto la AUR1 como la AUR2 contienen un sitio de fosforilación de proteína-quinasa dependiente de cAMP (THR232 de la AUR1 y THR288 de la AUR2), que está conservado en los homólogos de Drosophila y de levadura y es un sitio regulador conocido de la quinasa p34cdc2 dependiente de ciclina. La AUR2 contiene un sitio PKA adiciona en SER342. Ambas proteínas tienen además múltiples sitios de fosforilación de caseína-quinasas II (cinco y seis para la AUR1 y AUR2) y proteína-quinasas C (cuatro y diez para la AUR1 y AUR2). Además, la AUR2 tiene un sitio de consenso de fosforilación único para la tirosina en TYR334, que está también conservado en la Aurora de la Drosophila, pero no está presenta en la AUR1 ni en el IPL1 de la levadura.

Es curioso que los mutantes naturales de la Aurora de la Drosophila AUR_dm y del gen IPL1 de la levadura sufren una división nuclear asimétrica que conduce a una mala agregación de cromosomas y husos monopolares atípicos. Este fenotipo parece ser el resultado de un fallo en la separación de centrosomas. Parece no estar afectada la arquitectura de microtúbulo asociada. Los mutantes naturales de los restos de aminoácidos diana tanto de la Drosophila como de la levadura están estrictamente conservados entre las Auroras humanas, lo cual confirma que pueden ser homólogos funcionales. Los restos correspondientes de la AUR1 que se hallan en los mutantes naturales de la AUR_dm o del IPL1 son el GLU125, el THR232, el PRO312 y el HIS324. Todas estas mutaciones están dentro del dominio catalítico y, notablemente, una representa el sitio de fosforilación PKA conservado. Una mutación adicional de la AUR_dm en ASP47 es en un resto no conservado del dominio N-terminal.

Estos resultados sugieren que la actividad catalítica puede desempeñar un papel muy importante en la biología de la replicación o segregación de centrosomas en organismos inferiores y sugieren además que las Auroras humanas pueden tener un papel complementario en las células de mamíferos.

Ejemplo 6

Exposión recombinante de la AURORA1 y AURORA2 Construcción del vector de expresión

Los constructos de expresión se generan por mutagénesis asistida por PCR en la que los dominios codificadores completos de la Aurora1 y de la Aurora2 se marcan en sus extremos terminados en carboxi con el epítope YPYDVPDYAS del la hemaglutinina (HA) del Haemophilus influenzae (SEQ ID NO: 21) (Pati, 1992). Estos constructos se introducen en dos vectores de expresión en mamíferos: pLXSN (Miller, A.D. & Rosman, G.J., Biotechniques 7, 980-988, 1989) para la generación de líneas productoras de virus; y pRK5 para en análisis de expresión transitoria. Los insertos se diseñan para ir flanqueados por sitios BamHI y NotI únicos y se clonan directamente en pLXSN o pRK5 de los sitios 5'-BamHI y 3'-NotI.

Los constructos AUR1 y AUR2 de longitud completa con BamHI-NotI se ligan al RS316 (Liu, H. y col., Genetics 132, 665-673, 1992). Este vector contiene un promotor inducible por galactosa en un vector lanzadera (shuttle) centrómero para la expresión en el Saccharomyces cerevisiae. Se tiene que evaluar si los genes humanos pueden complementar el mutante afín IPL1 de la levadura, sensible a la temperatura, que es muy afín a la AUR1. Además se generan constructos de fusión que contienen el dominio N-terminal del IPL1 de la levadura fusionado con los dominios de quinasa C-terminales de la AUR1 y de la AUR2. Estos se producen por inserción de un sitio ClaI artificial en el extremo 5'de los dominios de las quinasas, en la secuencia conservada Asp-Asp-Phe-Glu.

Los constructos dominantes negativos de la AUR1 y AUR2 se generan también tanto en el pLXSN como en el pRK5 por mutación de la Lys invariable (posiciones de aminoácidos 106 y 162 de la AUR1 y de la AUR2, respectivamente) en la Met por mutagénesis de PCR. Los constructos se denominan AUR1KM y AUR2KM. Las formas constitutivamente activas de la AUR1 y de la AUR2 se generan por mutación del DNA que dirige la codificación del sitio de fosforilación (232 y 288) hacia un Asp, resultando de ello la AUR1TD y la AUR2TD.

Los constructos de expresión tanto en el pLXSN como en el pRK5 se producen también para que contengan precisamente el dominio no catalítico N-terminal de la AUR1 y AUR2. Estos se generan por PCR a partir de constructos originales previos y contienen 77 aminoácidos N-terminales de la AUR1 y los 132 aminoácidos N-terminales de la AUR2.

Los marcos completos de lectura abiertos de la AUR1 y AUR2 (no marcados con HA), excluyendo las metioninas de inicio, se generan por PCR y se ligan al vector pGEX para la producción bacteriana de proteínas de fusión GST para la inmunización de conejos para la producción de anticuerpos.

Ejemplo 7

Generación de líneas celulares de Aurora productoras de virus

Para generar existencias concentradas de virus se transfectan constructos recombinantes de pLXSN ya sea de genes de AUR1, ya sea de AUR2, en una línea de células auxiliares anfotrópicas PA317 empleando la transfección mediada por CaCl_{2}. Después de la selección a través del G418 se extienden las células en placas en medio normal, sin G418 (500 \mug/ml). Se utilizan los líquidos sobrenadantes de células resistentes para infectar la línea de células auxiliares ecotrópica GP+E86 y se seleccionan de nuevo las células a través del G418. Se recogen de nuevo las células resistentes del G418 y se recogen los líquidos sobrenadantes cada 8-12 horas y se reúnen en forma de existencias víricas (Redemann, N., Holzmann, B., Wagner, E.F., Schlessinger, J. & Ullrich, A., Mol. Cell. Biol. 12, 491-498, 1992). Las concentraciones de las existencias víricas se sitúan por ejemplo en \approx10^{6}/ml.

Ejemplo 8

Infección retrovírica de células NIH-3T3 con Auroras

Se cultivan células NIH-3T3 y BALB/3T3 en placas de 100 mm con DMEM (Gibco) que contiene un 10% de suero fetal bovino (FCS). Se superinfectan las células con retrovirus de AUR1 y AUR2 por adición de aproximadamente 3 ml de líquido sobrenadante vírico a 15 ml de medio de cultivo durante aproximadamente 24 horas. Después se seleccionan las células que expresan los constructos retrovíricos mediante crecimiento en FCS al 10% en DMEM suplementado con 500 \mug/ml de G418.

\newpage

Ejemplo 9

Generación de un inmunorreactivo específico de la Aurora

Los inmunorreactivos específicos de la AURORA se cultivan en conejos contra péptidos sintéticos conjugados con KLH, correspondiente a la región N-terminal de la AUR2 (^{104}SAPENNPEEQLASK^{117}) (SEQ ID NO: 22) y (^{90}RPLNNTQKSKQPL^{102}) (SEQ ID NO: 23) o el dominio del extremo N o el dominio del extremo N de la AUR1 humana (^{1}MAQKENSYPWPYG^{13}) (SEQ ID NO: 24) y (^{53}PGQKVMENSSGTP^{65}) (SEQ ID NO: 25). Los inmunorreactivos adicionales se generan inmunizando conejos con proteínas de fusión GST de la AUR1 y AUR2 de longitud completa expresadas en bacterias.

Ejemplo 10

Expresión transitoria de las Auroras en células de mamíferos

Se introducen plásmidos de expresión pRK5 (10 \mug de DNA/placa de 100 mm) que contienen los genes de AUR1 y AUR2 marcados con HA en células COS y 293 con lipofectamina (Gibco BRL). Pasadas 72 horas se recogen las células en 0,5 ml de tampón de solubilización (HEPES 20 mM, pH 7,35, NaCl 150 mM, glicerina al 10%, Tritón X-100 al 1%, MgCl_{2} 1,5 mM, EGTA 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM, aprotinina 1 \mug/ml). Se resuelven partes alícuotas de muestra por electroforesis a través de gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) a través de geles de acrilamida al 15%/bis-acrilamida al 0,5% y se transfieren por electroforesis a la nitrocelulosa. Se bloquea la fijación no específica preincubando los materiales a transferir (blots) en "blotto" (solución salina tamponada con fosfato que contiene un 5% p/v de leche desnatada deshidratada y un 0,2% v/v de Nonidet P-40 (Sigma)) y se detecta la proteína recombinante empleando un anticuerpo monoclonal (mab) murino contra el marcador decapéptido HA. Como alternativa, la proteína recombinante puede detectarse empleando varios antisueros específicos de la AUR1 o AUR2.

Ejemplo 11

La proteína básica de la mielina es un sustrato artificial para la quinasa Aurora1 y Aurora2 Método

Se cultivan células SW480 de adenocarcinoma colorrectal humano en RPMI 1640 más un 10% de suero fetal bovino, L-glutamina, penicilina y estreptomicina. Se lavan los cultivos confluyentes de células SW480 tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo y después se raspan sobre 1 ml de PBS enfriado con hielo. Se centrifugan las células a 1.000 rpm a 4ºC, se quita el PBS por aspiración y se almacena el culote resultante de células a -80ºC. Se descongelan sobre hielo los culotes obtenidos con tres placas de 15 cm y se resuspenden en un total de 1 ml de tampón de lisis de quinasa HEPES 50 mM, pH 7,4, KCl 100 mM, NaF 25 mM, NaVO_{3} 1 mM, 0,5% de NP40, DTT 1 mM, aprotinina 2 \mug/ml y leupeptina 1 \mug/ml y se agitan por rotación suave a 4ºC durante 20 minutos. Después se centrifugan las muestras a 10.000 rpm a 4ºC durante 10 minutos y se transfiere el líquido sobrenadante resultante a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml y se almacena o se guarda sobre hielo. Se determina la concentración de proteína por análisis de Bradford. Se preclarifica un miligramo de proteína total con 10 \mul de proteína A-Sepharose (Boehringer) a 4ºC durante 15 minutos y después por adición de 2 \mul de suero preinmune de conejo, o antisuero de péptido de Aurora1 purificado por afinidad, o antisuero de péptido de Aurora1 purificado por afinidad más 6 \mug de péptido competidor de Aurora1, antisuero de péptido de Aurora2 purificado por afinidad, antisuero de péptido de Aurora2 purificado por afinidad más 6 \mug de péptido competidor de Aurora2 y se incuba a 4ºC durante 30 minutos. A continuación se añaden 10 \mul de proteína A-Sepharose y se prosigue la incubación a 4ºC durante 45 minutos más. Se centrifugan los tubos brevemente para obtener un culote de complejo de anticuerpo-proteína A-Sepharose y se quita el líquido sobrenadante por aspiración. Se lava dos veces el culote de anticuerpo-proteína A-Sepharose con 0,5 ml de tampón de lisis de quinasa y después se lava con 0,5 ml de tampón de quinasa (HEPES 20 mM, pH 7,4, KCl 125 mM, MgCl_{2} 10 mM, NaF 1 mM, NaVO_{3} 1 mM y DTT 1 mM). Se resuspende el culote de anticuerpo-proteína A-Sepharose en 20 \mul de tampón de quinasa que contiene 5 \muCi de ATP-[\gamma-P^{32}] y 0,5 mg/ml de proteína básica de mielina (Sigma), se incuba a 37ºC durante 20 minutos y después se añaden 10 \mul de tampón de muestra de proteína Tris-Cl 200 mM, pH 6,8, glicerina del 40%, B-mercaptoetanol 730 mM, SDS del 0,4% y azul de bromofenol del 0,05%). Se mezcla bien el contenido de los tubos y se incuba a 100ºC durante 5 minutos. Se resuelven las muestras a través de un gel de SDS al 18% en poliacrilamida y se visualizan por autorradiografía.

Resultados

Los inmunocomplejos de Aurora1 y Aurora2 son capaces de fosforilar la proteína básica de la mielina. Cuando se emplea un péptido competidor en las inmunoprecipitaciones, ni los inmunocomplejos de antisueros de Aurora1 ni de Aurora2 son capaces de fosforilar la proteína básica de la mielina en mayor grado que los sueros preinmunes de control. Esto sugiere que la actividad de quinasa observada es debida a la Aurora1 y 2 y no a otras proteínas que estén presentes en el inmunocomplejo.

Esta observación da pie a la purificación de la quinasa activa Aurora1 y 2 empleando la proteína básica de la mielina como sustrato para explorar la actividad de quinasa. Esto permite además desarrollar un ensayo de quinasa "in vitro" empleando las proteínas recombinantes de Aurora1 y 2. Además, el ensayo de quinasa "in vitro" de la Aurora1 y 2 permite explorar colecciones de moléculas pequeñas para detectar los inhibidores de las quinasas Aurora1 y 2, midiendo la inhibición de la fosforilación de la proteína básica de la mielina.

La invención descrita a título ilustrativo puede ponerse en práctica de modo conveniente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, que no se haya descrito específicamente en esta solicitud. Los términos y expresiones se han empleado como términos de la descripción y no de limitación y no existe intención alguna de que el uso de tales términos y expresiones pueda excluir ninguno de los equivalentes de las características presentadas y descritas ni de porciones de las mismas, al contrario, se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de las invención reivindicada. Por lo tanto, se da por supuesto que aunque la presente invención se haya descrito específicamente mediante formas preferidas de ejecución y características opcionales, la modificación y la variación de los conceptos descritos en esta solicitud puede emprenderse por parte de los expertos en la materia, pero tales modificaciones y variaciones se consideran contempladas dentro del alcance de esta invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Mossie, Kevin G. Plowman, Gregory D.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Aplicación de Aurora humana

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Lyon & Lyon

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 633 West Fifth Street, Suite 4700

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(C)

CIUDAD: Los Ángeles

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(D)

ESTADO: CA

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(E)

PAÍS: Estados Unidos

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 90071-2066

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(v)

FORMA LEGIBLE CON ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, versión #1.30

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(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US

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(B)

FECHA DEL DEPÓSITO:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Warburg, Richard J.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32,327

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: (213) 489-1600

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(B)

TELEFAX: (213) 955-0440

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(C)

TELEX: 67-3510

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1244 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

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(iii)

HIPOTÉTICA: no

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(iv)

ANTISENTIDO: no

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\newpage

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1

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1

2

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 2198 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: no

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: no

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2

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3

4

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 344 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(iii)

HIPOTÉTICA: no

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(iv)

ANTISENTIDO: no

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3

5

6

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 403 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE HEBRA: simple

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(iii)

HIPOTÉTICA: no

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(iv)

ANTISENTIDO: no

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4

7

8

Claims (31)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada, enriquecida o purificada, caracterizada porque codifica a un polipéptido AUR-1 que tiene una longitud por lo menos de 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o a un polipéptido AUR-2 que tiene una longitud por lo menos de 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico es un ácido nucleico humano.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, dicha molécula codifica por lo menos 200 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, con preferencia por lo menos 300.

4. Una sonda de ácido nucleico para la detección del ácido nucleico que codifica a un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3, dicha sonda es muy complementaria de la longitud completa de dicho ácido nucleico o a un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4, dicha sonda es muy complementaria de la longitud completa de dicho ácido nucleico, con la condición de que dicha sonda de ácido nucleico no sea la secuencia EST yg60d11.r1 (GenBank gi: 98371, nº de registro R97911), ni la EST97212 (GenBank gi: 618232, nº de registro T36134) ni el complemento de las mismas.

5. La sonda de la reivindicación 4, dicha sonda es muy complementaria del ácido nucleico que codifica por lo menos a 200 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO: 4, con preferencia por lo menos a 300.

6. Una molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque codifica a un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO. 3 o a un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO. 4 y un vector o promotor eficaz para iniciar la transcripción en una célula hospedante.

7. Una molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada porque contiene una región funcional de transcripción en una célula, una secuencia complementaria de una secuencia de RNA que codifica a un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO. 3 o a un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO. 4 y una región funcional de terminación de la transcripción en una célula.

8. Un polipéptido aislado, enriquecido o purificado, caracterizado porque dicho polipéptido es un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO. 3 o un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO. 4.

9. El polipéptido AUR-1 o AUR-2 de la reivindicación 8, dicho polipéptido consta por lo menos de 200 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 O SEQ ID NO: 4, con preferencia por lo menos de 300 aminoácidos.

10. El polipéptido AUR-1 o AUR-2 de la reivindicación 8 o de la reivindicación 9, dicho polipéptido se aísla, purifica o enriquece a partir de un mamífero.

11. El polipéptido AUR-1 o AUR-2 de la reivindicación 10, dicho polipéptido se aísla, se purifica o se enriquece a partir de un ser humano.

12. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 11, dicho polipéptido es un polipéptido AUR-1.

13. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 11, dicho polipéptido es un polipéptido AUR-2.

14. Un anticuerpo caracterizado porque tiene una afinidad de fijación específica sobre un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o sobre un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4.

15. El anticuerpo de la reivindicación 14, en el que dicho polipéptido se aísla, purifica o enriquece a partir de un mamífero.

\newpage

16. El anticuerpo de la reivindicación 15, en el que dicho polipéptido se aísla, purifica o enriquece a partir de un humano.

17. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones de 14 a 16, en el que dicho polipéptido es un polipéptido AUR-1.

18. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones de 14 a 16, en el que dicho polipéptido es un polipéptido AUR-2.

19. Un hibridoma caracterizado porque produce un anticuerpo que tiene afinidad de fijación específica sobre un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o sobre un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4.

20. El hibridoma de la reivindicación 19, en la que dicho polipéptido AUR-1 o AUR-2 contiene por lo menos 200 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o en la SEQ ID NO: 4, con preferencia por lo menos 300 aminoácidos.

21. El hibridoma de la reivindicación 19 o de la reivindicación 20, en el que dicho polipéptido se aísla, se purifica o se enriquece a partir de un mamífero.

22. El hibridoma de la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido se aísla, se purifica o se enrique a partir de un ser humano.

23. El hibridoma de la reivindicación 20 o de la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido es un polipéptido AUR-1.

24. El hibridoma de la reivindicación 20 o de la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido es un polipéptido AUR-2.

25. El uso de la sonda de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones de 4 a 6 en un método para detectar la presencia de ácido nucleico que codifique a un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o a un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4.

26. Un kit para detectar la presencia de ácido nucleico que codifica a un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o a un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4, que consta por lo menos de un recipiente que contiene una sonda de ácido nucleico con arreglo a una cualquiera de las reivindicaciones de 4 a 6.

27. El uso de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones de 14 a 18 en un método para detectar un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4.

28. Un kit para detectar la presencia de un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o de un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4, que consta de i) un primer recipiente que contiene un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones de 14 a 18 e ii) un segundo recipiente que contiene un conjugado que consta de un reactivo de fijación del anticuerpo y de un marcador.

29. Un método para detectar un compuesto capaz de fijarse sobre un polipéptido AUR-1 o AUR-2, que consiste en el paso de incubar el compuesto con un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o con un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4 y de detectar la presencia del compuesto fijado sobre dicho polipéptido AUR-1 y/o AUR-2.

30. Un método para detectar un agonista o antagonista de la actividad de la AUR-1 o AUR-2, que consiste en incubar las células que producen un polipéptido AUR-1 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 3 o un polipéptido AUR-2 de por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 4 en presencia de un compuesto y en detectar los cambios en el nivel de actividad de dicho polipéptido AUR-1 y/o AUR-2.

31. Un método según la reivindicación 30, en el que dicha actividad de la AUR-1 o AUR-2 es la fosforilación de una molécula de sustrato.