ES2255340B2

ES2255340B2 - Produccion, sistema de aislamiento y purificacion del alergeno ole e 10.

Info

Publication number: ES2255340B2
Application number: ES200300265A
Authority: ES
Inventors: Maria Teresa Villalba Diaz; Rosalia Rodriguez Garcia; Eva Batanero Cremades
Original assignee: Universidad Complutense de Madrid
Current assignee: Universidad Complutense de Madrid
Priority date: 2003-02-04
Filing date: 2003-02-04
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2023-02-04
Also published as: ES2255340A1

Abstract

Producción, sistema de aislamiento y purificación del alérgeno Ole e 10. La invención consiste en la producción de la proteína Ole e 10, mediante tecnología recombinante en la levadura Pichia pastoris, que implica el uso de la secuencia nucleotídica caracterizada por SEQ ID NO:1 o de otras secuencias nucleotídicas obtenidas por mutagénesis de la secuencia SEQ ID NO:1. Para ello se ha aislado a partir de polen de Olea europaea, purificado y caracterizado un alergeno principal que es reconocido por más del 60 % de los pacientes alérgicos a esta fuente biológica. Se ha clonado y expresado el DNA recombinante que codifica el alergeno Ole e 10 de polen de olivo (Olea europaea). La proteína recombinante producida en la levadura (Pichia pastoris) se aísla con gran rendimiento, está correctamente plegada y exhibe propiedades inmunológicas equivalentes a las del alergeno natural por lo que tanto ella como las proteínas homólogas, las formas modificadas derivadas de ellas, los fragmentos derivados que contengan al menos un epítopo alergénico, pueden ser empleadas en protocolos de diagnosis e inmunoterapia.

Description

Producción, sistema de aislamiento y purificación del alergeno Ole e 10.

Objeto de la invención

La presente invención, según se expresa en el enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a uno de los alergenos del polen de olivo (Olea europaea), la proteína Ole e 10, y a epítopos alergénicos presentes en la proteína. La invención también hace referencia a los DNAs recombinantes que codifican tanto para la proteína completa como para fragmentos que incluyen al menos un epítopo de la molécula, así como moléculas homólogas de Ole e 10 con capacidad alergénica en otras especies relacionadas y no relacionadas. En concreto el objeto de la invención consiste en la producción de la proteína Ole e 10, mediante tecnología recombinante en la levadura Pichia pastoris, que implica el uso de la secuencia nucleotídica caracterizada por SEQ ID NO:1 o de otras secuencias nucleotídicas obtenidas por mutagénesis de la secuencia SEQ ID NO:1.

La invención proporciona también un eficaz método de aislamiento tanto para el alergeno recombinante como para el natural obtenido a partir del polen de olivo.

Estado de la técnica

La alergia tipo I es una enfermedad que afecta a más del 20% de la población de los países industrializados (Kay, A.B. (1997) Allergy and allergic diseases, Blackwell Science, Oxford, UK). Esta afección es ocasionada por los alergenos, presentes tanto en organismos y productos biológicos -alimentos, ácaros, venenos de insectos, pólenes, hongos, epitelios de mamíferos-, como en materiales de síntesis. En la mayor parte de las fuentes biológicas alergénicas, los alergenos son proteínas de masas moleculares comprendidas entre 5 y 70 kDa. Los síntomas que se derivan de la alergia, tales como rinitis, conjuntivitis, o asma, son provocados por la liberación de mediadores celulares, como la histamina, desde basófilos y mastocitos, células del sistema inmune. Dicha liberación viene inducida por el entrecruzamiento de anticuerpos IgEs unidos a los receptores de alta afinidad Fc\epsilonRI, los cuales se encuentran a su vez anclados a basófilos y mastocitos. El entrecruzamiento de las IgE es provocado por la unión del correspondiente alergeno, o un fragmento suyo, a través de un epítopo IgE (contenido en dicho alergeno, o en su fragmento). La terapia que actualmente se viene utilizando para tratar la alergia implica la hiposensibilización del paciente mediante la administración por vía parental u oral de dosis adecuadas del propio alergeno, o alergoides relacionados. En la práctica totalidad de los casos se administra un extracto alergénico obtenido, mediante una mínima manipulación, de la fuente biológica natural, lo que implica a una mezcla muy compleja de proteínas y otras sustancias, en la cual, el alergeno -o alergenos- puede representar una parte ínfima del producto total utilizado.

En efecto, en la actualidad, los protocolos utilizados para la diagnosis de casos de alergia y su posterior inmunoterapia implican el uso de extractos alergénicos que frecuentemente no están caracterizados, ni siquiera estandarizados respecto a los alergenos más importantes que pueden contener. A menudo, su administración no proporciona una diagnosis completa, sobre todo cuando la hipersensibilidad del paciente se refiere a alergenos presentes en baja concentración en dichos extractos (Valenta, R.; Lidholm, J.; Niederberger, V.; Hayek, B.; Kraft, D. and Grondlund, H. (1999) Clin. Exp. Allergy 29, 896-904). Por otro lado, la inmunoterapia realizada con estas preparaciones es frecuentemente ineficaz y origina en ocasiones efectos secundarios indeseables que pueden llegar a ser más graves que la propia afección alérgica que se pretende resolver. Una alternativa a la utilización de estos extractos es la preparación de mezclas de los alergenos más significativos, obtenidos por aislamiento de su fuente natural (Rodríguez, R.; Villalba, M.; Monsalve, R.I. and Batanero, E. (2001) Int. Arch. Allergy Immunol. 125, 185-195). Sin embargo, esta vía presenta dos importantes barreras. Por un lado, implica un buen conocimiento de los componentes alergénicos del material que provoca la alergia, al menos de todos sus alergenos principales, y este dato, frecuentemente, no está disponible. Por otro lado, el proceso de aislamiento de los alergenos conocidos, a partir del material biológico, es a menudo difícil y no proporciona las cantidades necesarias o la calidad requerida para un posterior empleo, debido fundamentalmente a los bajos niveles en los cuales se encuentra. Todos estos problemas se acentúan cuando el material alergénico es el polen de una especie vegetal. La gran cantidad de pigmentos, carbohidratos, lípidos y componentes insolubles hacen muy difícil su manipulación. Ni que decir tiene que su disponibilidad es, además, muy reducida y de alto coste económico, debido a la dificultad de su recolección. Por todo lo expuesto, se hace necesario el diseño de procedimientos para la producción de alergenos a utilizar en los protocolos de diagnosis e inmunoterapia de la alergia. La producción de DNA recombinante se prevé como la forma más reproducible y eficaz de obtención de polipéptidos alergénicos bien definidos, no sólo para uso clínico, sino incluso para investigación.

Explicación de la invención

Producción del alergeno recombinante de Olea europaea Ole e 10 en la levadura Pichia pastoris, y sistema de aislamiento y purificación.

La presente invención se refiere al método de aislamiento utilizado para la purificación del alergeno Ole e 10 -un alergeno del polen de olivo de creciente importancia clínica sobre todo en determinadas áreas geográficas, alcanzando una prevalencia del 55% en los pacientes alérgicos al polen de olivo en algunas regiones de Andalucía- a partir del polen de olivo (Olea europaea). Más específicamente comprende la obtención, mediante clonación, de moléculas de DNA recombinante que codifican polipéptidos con las mismas o similares propiedades antigénicas que el alergeno procedente del polen de olivo, o bien polipéptidos que posean al menos un epítopo del alergeno Ole e 10. La invención incluye también la secuencia completa del cDNA del alergeno Ole e 10 y la secuencia completa deducida del
alergeno.

El procedimiento objeto de la invención, permite llevar a cabo la purificación del alergeno Ole e 10 del polen de olivo a partir de un extracto proteico de polen de olivo mediante tres etapas cromatográficas, dos cromatografías de penetrabilidad y una de HPLC, según se describe detalladamente más adelante.

La invención dispone de secuencias polinucleotídicas de DNA que hibridan, en condiciones restrictivas, con las descritas antes -lo que implica un nivel de identidad de al menos un 60% entre sus secuencias de nucleotidos-, o bien son derivadas de ellas por degeneración del código genético o mutagénesis.

El procedimiento de clonación del alergeno recombinante de Olea europaea Ole e 10, incluye vectores de clonación y células huésped que contienen una secuencia de nucleótidos como la descrita en SEQ ID NO: 1, codificante de Ole e 10, proteínas homólogas o fragmentos suyos.

De esta manera se obtiene la secuencia nucleotídica que codifica al alergeno completo y aquellos fragmentos nucleotídicos que poseen, al menos, una secuencia que codifica un determinante antigénico del alergeno Ole e 10 de olivo, así como de alergenos homólogos de Ole e 10 -principalmente en especies relacionadas con el olivo- que, dada la similitud estructural, presentan reactividad alergénica cruzada con Ole e 10 o con una parte de él.

Estos polipéptidos pueden contener la secuencia antigénica unida a otros polipéptidos (por ejemplo como proteínas de fusión), haber sido sintetizados químicamente o haber sido obtenidos mediante digestiones proteoliticas y modificados química o enzimáticamente.

La inserción de dicha secuencia en vectores de expresión en organismos hospedadores eucarióticos permite disponer de construcciones recombinantes que pueden utilizarse para la producción del alergeno recombinante.

Una vez producida la molécula polipeptídica con actividad antigénica de Ole e 10 en medio de crecimiento mínimo, ésta es aislada del medio extracelular del cultivo en forma soluble mediante cromatografía de intercambio aniónico y de penetrabilidad.

Los productos recombinantes obtenidos mediante el procedimiento objeto de la invención presentan la capacidad de unión de anticuerpos IgE del suero de pacientes alérgicos a olivo, sensibles a Ole e 10.

Finalmente, con el procedimiento objeto de la invención, se dispone de Ole e 10 inmunológicamente activo, además de fragmentos antigénicos y alergénicos de este alergeno, y de proteínas homólogas de él, que sirven para ser incorporados en las pruebas "in vivo" e "in vitro" a realizar para la fiel diagnosis de la hipersensibilidad a este polen, y a otros pólenes relacionados filogenéticamente con él. También podrán ser empleados en las preparaciones de alergenos que se utilicen para llevar a cabo la inmunoterapia correspondiente para el tratamiento de la alergia al polen de olivo.

Para el diagnóstico y la terapia de la alergia al polen de olivo se utilizan actualmente extractos proteicos obtenidos a partir del polen. Esto implica una escasa reproducibilidad y un alto contenido en moléculas contaminantes, de origen proteico y no proteico, que pueden originar efectos secundarios adversos en los pacientes tratados. El disponer de moléculas homogéneas obtenidas por las técnicas del DNA recombinante, en cantidades ilimitadas, perfectamente cuantificables y estandarizadas, rebajaría considerablemente todos los inconvenientes citados. Esta tecnología permite disponer de esas moléculas y, además, de péptidos o formas modificadas de las mismas que contienen al menos uno de los epítopos alergénicos.

Descripción de las figuras

Figura 1.- Purificación de Ole e 10. (A) y (B) perfiles de elución de las cromatografías de filtración en gel en columnas de Sephadex G-75 (35 x 750 mm) y Sephadex G-50 (15 x 530 mm), respectivamente. El extracto de polen de olivo obtenido como se describe a continuación fue aplicado a la primera columna y las fracciones correspondientes a moléculas de masa molecular inferior a 15 kDa fueron reunidas, liofilizadas y aplicadas a la segunda columna. (C) Perfil de elución en una columna C-18 de fase reversa en HPLC usando un gradiente de acetonitrilo en 0.1% TFA. Las fracciones que contienen la proteína purificada están sombreados en la figura. (D) Análisis por PAGE/SDS de las distintas etapas de purificación: línea p, extracto de polen; líneas a, b y c, proteína obtenida en la mezcla de las fracciones sombreadas de los perfiles de elución A), B) y C), respectivamente; línea m, patrones de peso molecular conocido. Las muestras fueron teñidas con azul de Coomassie o transferidas a membranas de nitrocelulosa e inmunoteñidas con una mezcla de sueros de pacientes alérgicos al polen de olivo.

Figura 2.- cDNA que codifica para Ole e 10 (mayúsculas) y secuencia de aminoácidos deducida. La secuencia de cDNA de las regiones no codificantes 3' y 5' están incluidas en la figura con letras minúsculas. El sitio de procesamiento está indicado por una punta de flecha. La secuencia de DNA está disponible en el GenBank/EMBL bajo el número de acceso de AY082335.

Modo de realización de la invención

La presente invención se refiere a un DNA recombinante que codifica epítopos del alergeno de Olea europaea Ole e 10, a la producción recombinante, en la levadura Pichia pastoris, de los polipéptidos codificados por dicho DNA y al aislamiento del alergeno natural procedente del polen de olivo. También se refiere a la aplicación de ambas moléculas al diagnóstico y terapia de este desorden inmunológico.

El procedimiento objeto de esta invención se realiza mediante las siguientes fases:

\bullet Aislamiento de RNA total

Se aisló el RNA total a partir del polen de olivo siguiendo el protocolo publicado por Ullrich y col. [Science 196, 1313-1318, 1977]. En este aislamiento se partió de 0.5 g de polen que se homogeneizó en un tampón 0.1 M de Tris-HCl, pH 7.5 que contenía tiocianato de guanidinio 4M, laurilsarcosinato sódico al 0.5% y 2-mercaptoetanol 0.14 M, mediante un homogeneizador Polytron. Se centrifugó esta suspensión a 5000 xg a 20°C en una centrífuga Sorvall. Posteriormente se sometió al sobrenadante a una centrifugación en gradiente de CsCl 5.7 M en 0.01 M EDTA a 40.000 rpm en un rotor SW 60 (Beckman) durante 12 horas. El mismo procedimiento se llevó a cabo para aislar otros RNAs de diferentes pólenes usados (aligustre, fresno, lila) y con los diferentes tejidos del olivo empleados (tallo, hojas y frutos). Con estos últimos se introdujo una etapa inicial adicional en la que fueron macerados en presencia de nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino y homogéneo. A partir de 5 \mug de RNA total se llevó a cabo la síntesis del cDNA utilizando el "kit" SMART II de síntesis de cDNA (Clontech).

\bullet Clonación de Ole e 10 basado en técnicas de PCR

En el procedimiento de clonación del alergeno recombinante de Olea europaea Ole e 10, se llevó a cabo una digestión tríptica (relación en peso 1:1000) de la proteína para obtener secuencias aminoacídicas internas de la proteína debido a que la obtención de la secuencia N-terminal mediante Degradación de Edman resultó fallida por estar bloqueada.

Tras la secuenciación de alguno de los péptidos obtenidos (AHASYAMNSWYQSK), se utilizó la secuencia (AMNSWYQ) para diseñar el oligonucleótido degenerado ("antisense"), OLE10B: 5'-YTGRTACCANGARTTCAT
NGC-3' que fue utilizado, junto con el primer inespecífico UPM: 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' y utilizando el cDNA como molde, para amplificar por PCR la secuencia parcial codificante (1-92) y no codificante 5' correspondientes al cDNA de Ole e 10, incluido el péptido señal. Las secuencias obtenidas permitieron posteriormente obtener la secuencia N-terminal, Met Arg Gly Thr Ala Gly Val, que que sirvió de base para el diseño de un oligonucleotido no degenerado, OLE10F: 5'-ATGCGAGGAACCGCAGGTGTG-3'. La amplificación posterior con los oligonucleótidos, OLE10F Y UPM, y su clonación permitieron la obtención de la secuencia de nucleótidos codificante completa y la secuencia 3' no codificante. El molde y los cebadores de las reacciones de PCR fueron disueltos en una mezcla de PCR estándar (250 \muM de dNTPs, tampón estándar y 50 pmoles de los cebadores). Después de una primera etapa de desnaturalización a 95°C durante 5 min, se llevaron a cabo 25 ciclos a temperaturas de hibridación de 45°C en la primera etapa y 68°C en la segunda en presencia de Advantage DNA polimerasa II(Clontech). La reacción se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 1.5% y los fragmentos de DNA fueron purificados usando el Magic PCR Prep kit (Promega) e insertados en el plásmido pCR2.1 linearizado y con una T terminal en los extremos 5'. Con esta construcción se transformaron células competentes TOP10 según el protocolo del TOPO TA cloning kit (Invitrogen), a continuación se seleccionaron los recombinantes y se llevó a cabo la secuenciación de algunos de los clones seleccionados, obteniéndose secuencias de este alergeno. En una última etapa de PCR se amplificó la secuencia de DNA que codifica la región correspondiente a la proteína madura (Ser22-Ser123), y utilizándose los oligonucleótidos no degenerados NT10: 5'-cgtctcgagaaaagaTCTTCGTCGCCCGTCCCA-3' para la secuencia N-terminal y CT10: 5'-cgtccgcggTCAAGAGAGGAATGAGCATGA-3' y CT10-2: 5'-cgtccgcggTCAAGAGAGGAAT
GAGCATGACCCCTGACT-3' para la secuencia C-terminal y C-terminal con una Gln en lugar de la Asn116, posible sitio de N-glicosilación de la proteína, respectivamente.

\bullet Producción recombinante

Para la producción de la forma recombinante de esta proteína, la secuencia codificante de DNA fue ligada al plásmido de expresión pPICZ\alpha-A (Invitrogen Corp.). Las células utilizadas fueron de la cepa KM71 de Pichia pastoris. La inducción se llevó a cabo por metanol al 0.5% durante cinco días, creciendo las células a 30°C en medio mínimo de crecimiento de levadura. Las células se sedimentaron centrifugando a 5000 xg, se recogieron los sobrenadantes y una muestra de los mismos se aplicó en un gel de poliacrilamida al 15% en presencia de SDS. Una banda de 10 kDa, única, fue detectada mediante tinción de los geles con Azul de Coomassie. La proteína es reconocida por sueros de pacientes alérgicos específicos de Ole e 10 natural (dilución 1:10). La purificación de las proteínas se llevó a cabo mediante la liofilización del medio extracelular de la levadura y la aplicación de dos etapas cromatográficas, una de intercambio fónico en DEAE-celulosa y una de penetrabilidad en Sephadex G-50, obteniéndose tras esta última el alergeno con un grado de pureza del 99%. Se llevaron a cabo con ellas estudios de caracterización estructural (espectros de dicroismo en el UV lejano, espectrometría de masas) e inmunológica (con sueros individuales de pacientes alérgicos) y en todos los casos las proteínas recombinantes se comportaron de manera equivalente a la del alergeno natural.

\bullet Aislamiento del alergeno Ole e 10 a partir del polen de olivo (Olea europaea)

El alergeno Ole e 10 ha sido purificado a partir de extracto proteico de polen de olivo, obtenido por homogeneización de 3 g de polen en bicarbonato amónico 50 mM pH 8.0 durante 3 horas a T ambiente. Dicho extracto fue aplicado a una columna de Sephadex G-75. Las fracciones que contenían la proteína fueron aplicadas a una columna de penetrabilidad en Sephadex G-50 y por último a una de fase reversa C-18 en HPLC con un gradiente de acetonitrilo (0-60%) en TFA al 0.1%.

La invención cubre el uso de Ole e 10 recombinante en diagnóstico, "in vivo" mediante pruebas cutáneas o "in vitro" mediante técnicas de inmunodetección (ELISA, RAST), permitiendo precisar qué alergenos son los responsables de la sintomatología clínica de un individuo y reducir así el número de moléculas necesarias para su inmunoterapia. Se origina, por tanto, una inmunoterapia personalizada.

<110> Universidad Complutense de Madrid

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Producción, sistema de aislamiento y purificación del alérgeno Ole e 10.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Olea europaea

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(369)

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> AY082335

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 2002 03 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Olea europaea

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> sig_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> FROM 1 TO 21

\vskip0.400000\baselineskip

<300>

\vskip0.400000\baselineskip

<308> AY082335

\vskip0.400000\baselineskip

<309> 2002 03 19

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

4

Claims

1. Moléculas de DNA recombinante caracterizadas por SEQ ID NO: 1 que codifican un polipéptido con actividad alergénica y que poseen, al menos, un epítopo alergénico común con el alergeno Ole e 10 de Olea europaea.

2. Moléculas de DNA recombinante, o modificaciones de las mismas, según reivindicación 1, que codifican polipéptidos con, al menos, un epítopo de Ole e 10 en su estructura, unido a un polipéptido adicional, o modificado química o enzimáticamente.

3. Moléculas de DNA recombinante caracterizadas por hibridar en condiciones fuertemente restrictivas con la secuencia descrita en SEQ ID NO: 1.

4. Moléculas de DNA recombinante caracterizadas por presentar, al menos, un 60% de identidad con la descrita en SEQ ID NO: 1, conteniendo una secuencia de nucleotidos que codifica un polipéptido con actividad alergénica idéntica o reducida (hipoalergénica) con respecto a Ole e 10 de Olea europea.

5. Polipéptido recombinante correspondiente al alergeno Ole e 10 de Olea europaea, o fragmentos de dicho polipéptido, según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por la secuencia dada en SEQ ID NO: 2 que presentan la antigenicidad de, al menos, un epítopo de Ole e 10.

6. Polipéptidos recombinantes del alergeno homólogo de Ole e 10 en otras especies relacionadas y no relacionadas filogenéticamente, o fragmentos de dichos polipéptidos, según reivindicaciones 3 y 4 que presentan la antigenicidad de, al menos, un epítopo de Ole e 10.

7. Polipéptidos que posean una secuencia de aminoácidos según reivindicaciones 5 y 6, y que presenten una alergenicidad atenuada.

8. Polipéptidos o fragmentos de dichos polipéptidos de polen de Chenopodiaceas con, al menos, un epítopo de Ole e 10, según reivindicaciones anteriores, que se produzcan recombinantes unidos a un polipéptido adicional.

9. Polipéptidos de polen de Olea europaea, según reivindicaciones 5,6,7 y 8, que estén modificados química o enzimáticamente.

10. Un vector de expresión eucariota, y preferentemente pPICZ\alphaA, que contenga las secuencias caracterizadas por SEQ ID NO: 1 según reivindicaciones 1,2,3 y 4 cuya expresión dé lugar a la producción de los polipéptidos caracterizados por SEQ ID NO: 2 según reivindicaciones 5,6,7,8 y 9.

11. Un organismo hospedador eucariota, preferentemente la levadura Pichia pastoris, transformado con la construcción formada según reivindicación 10.

12. Un método para producir las formas recombinantes correspondientes a las secuencias polipeptídicas descritas en las reivindicaciones 5,6,7,8 y 9, en el sistema eucariótico de levadura Pichia pastoris, y preferentemente de la cepa KM71, crecidas en medio rico, caracterizado por una cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa, una de penetrabilidad en Sephadex G-50 y una en una columna una de penetrabilidad en Sephadex G-50 y una en una columna C-18 de fase reversa de HPLC.

13. Un método para producir las formas recombinantes correspondientes a las secuencias polipeptídicas mencionadas en las reivindicaciones 5,6,7,8 y 9, en el sistema eucariótico de levadura Pichia pastoris y preferentemente de la cepa KM71 crecidos en medio mínimo, caracterizado por una cromatografía de intercambio en DEAE-celulosa, una de penetrabilidad en Sephadex G-50 y una en una columna C-18 de fase reversa de HPLC.

14. Un método para el aislamiento del alergeno Ole e 10 a partir del polen de Olea europaea utilizando una cromatografía de penetrabilidad en Sephadex G-75, una de penetrabilidad en Sephadex G-50 y una columna de fase reversa nucleosil C-18 de HPLC.

15. Utilización de los péptidos de las reivindicaciones 5-9 para la preparación de compuestos farmacológicos.

16. Utilización de las moléculas según reivindicaciones 1-9 en el diagnóstico "in vitro" de la alergia.

17. Aplicación de las moléculas recombinantes de las reivindicaciones 1-9 para el diseño de vacunas destinadas a la inmunoterapia de la alergia.

18. Aplicación de las moléculas recombinantes de las reivindicaciones 1-4 para producir péptidos, según reivindicaciones 5-9, que contengan al menos un epítopo T alergénico, capaces de actuar como vacunas.

19. Aplicación de las moléculas recombinantes de las reivindicaciones 1-4 en la producción de isoformas recombinantes hipoalergénicas que tengan disminuida o anulada su unión a IgE para el tratamiento de alergias.