ES2252287T3

ES2252287T3 - Enzima amilolitico de bacillus sp. a7-7 (dsm 12368) asi com0 agentes de lavado y de limpieza con este nuevo enzima amilolitico.

Info

Publication number: ES2252287T3
Application number: ES01967209T
Authority: ES
Inventors: Beatrix Kottwitz; Roland Breves; Karl-Heinz Maurer; Laura Polanyi; Angela Hellebrandt; Irmgard Schmidt; Regina Stehr; Angrit Weber
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2001-07-19
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2021-07-19
Also published as: CA2417547A1; EP1307547B1; SK912003A3; KR20030037267A; RU2003105683A; HUP0300840A2; AU2001287643A1; CN1443236A; US20070048839A1; US20090120555A1; WO2002010356A2; CZ2003267A3; CN100491525C; DZ3349A1; HK1055763A1; US7303905B2; BR0112778A; ATE307882T1; IL154142A0; DK1307547T3

Abstract

Proteína amilolítica con una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 96 % a través de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos dada

Description

Enzima amilolítico procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368) así como agentes de lavado y de limpieza con este nuevo enzima amilolítico.

La presente solicitud se refiere a un nuevo enzima amilolítico procedente del microorganismo Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) y proteínas suficientemente similares con función amilolítica, a procedimientos para su obtención así como a diversas posibilidades de aplicación de estas proteínas. Además de las posibilidades de aplicación indicadas pueden desarrollarse finalidades, ante todo industriales. La presente solicitud se refiere, especialmente, a agentes de lavado y de limpieza con tales proteínas amilolíticas, a procedimientos para la limpieza de textiles o de superficies duras con participación de tales proteínas amilolíticas o agentes correspondientes, así como a su empleo para la limpieza de textiles o de superficies duras.

Las \alpha-amilasas (E.C. 3.2.1.1) se hidrolizan en los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos de los almidones y de los polímeros similares a los almidones tales como, por ejemplo, amilosa, amilopectina o glicosa, con formación de dextrinas y de oligosacáridos \beta-1,6-ramificados. Éstos pertenecen a los enzimas más importantes, que son utilizados en la industria. Esto se debe a dos motivos: por un lado son producidos, en su mayoría, igual que muchos enzimas o microorganismos, degradantes del substrato, en el medio ambiente de tal manera, que pueden ser obtenidos a escala industrial mediante fermentación y enriquecimiento del medio de cultivo con un coste proporcionalmente reducido. Por otro lado se requieren amilasas para un gran espectro de aplicaciones.

Un empleo industrial importante de la \alpha-amilasa consiste en la fabricación de jarabe de glucosa. Otras aplicaciones son, por ejemplo, las de componentes activos en los agentes de lavado y de limpieza, para el tratamiento e materiales en bruto en la fabricación de textiles, para la fabricación de pegamentos o para la fabricación de artículos comestibles o componentes de artículos comestibles azucarados.

Desde hace décadas se utilizan los enzimas tales como las proteasas, las amilasas, las lipasas o las celulasas como componentes activos en los agentes de lavado y de limpieza. Su contribución respectiva con relación al rendimiento de lavado o bien de limpieza del agente correspondiente consiste, en el caso de las proteasas, en la capacidad que tienen para degradar las impurezas que contienen proteína, en el caso de las amilasas, en la degradación de las impurezas que contienen almidón y, en el caso de las lipasas, en la actividad disociadora de la grasa. Las celulasas son empleadas, especialmente, debido a su contribución a las prestaciones secundarias de lavado de un agente de lavado y debido a su efecto sobre las fibras en los textiles, preferentemente en los agentes de lavado. Los respectivos productos de hidrólisis son atacados por los restantes componentes de los agentes de lavado y de limpieza disueltos, emulsionados o suspendidos o, debido a su elevada solubilidad en el baño de lavado, se separan por flotación de tal manera, que se producen efectos sinérgicos entre los enzimas y los restantes componentes.

Una \alpha-amilasa empleada frecuentemente en los agentes de lavado y de limpieza es la que procede del Bacillus licheniformis. El producto correspondiente de la firma Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dinamarca, porta, por ejemplo, el nombre comercial Termamyl®; el de la firma Genencor Int., Rochester, New York, USA, se llama Purastar®. El homólogo obtenido a partir de B. subtilis, o bien a partir de B. amyloliquefaciens y divulgado en la solicitud norteamericana US 1 227 374 es comercializado por la firma Novo Nordisk A/S bajo el nombre BAN®.

Esta molécula de amilasa, o bien sus parientes próximos, han sido desarrollados en un gran número de invenciones, que tenían como objeto optimizar sus propiedades enzimáticas para aplicaciones especiales con ayuda de diversas modificaciones realizadas mediante biología molecular. Tales optimaciones pueden referirse, por ejemplo, a las especificidades con respecto al substrato, a la estabilidad del enzima bajo diversas condiciones de reacción o a la propia actividad enzimática. Como ejemplos de tales optimaciones relativas a las aplicaciones específicas pueden citarse las siguientes solicitudes: EP 0410498 para el encolado de textiles y la WO 96/02633 para la licuación de los almido-
nes.

Las \alpha-amilasas siguen siendo desarrolladas, ante todo, en lo que se refiere a su empleo en los agentes de lavado y de limpieza. Como ejemplos a este respecto pueden citarse simplemente las solicitudes siguientes: las amilasas de la solicitud WO 99/02702 son más estables a temperaturas elevadas que la molécula de partida. Los enzimas de la solicitud WO 99/23211 son estables a valores elevados del pH, en presencia de iones de calcio y a temperaturas elevadas. Las \alpha-amilasas de la solicitud WO 97/43424 presentan un comportamiento de enlazamiento con respecto a los iones de calcio modificado y, por lo tanto, propiedades enzimáticas modificadas. El procedimiento de mutagénesis de la solicitud WO 99/20768 conduce a variantes de \alpha-amilasas que son especialmente estables en presencia de los componentes de los agentes de limpieza. Prácticamente sucede siempre que en el caso de las modificaciones de este tipo, una modificación de una propiedad enzimática individual tiene consecuencias también sobre otras propiedades y sobre el rendimiento de lavado del enzima correspondiente. Un ejemplo de un producto optimizado, obtenido de este modo, que se encuentra actualmente en el mercado, es el Duramyl® (WO 94/02597) con una menor sensibilidad a la oxidación (firma Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dinamarca; SÖFW-Journal 123, (1997), páginas
723-731).

Puesto que los desarrollos, que consisten simplemente en optimaciones de únicamente un reducido número de enzimas de partida conocidos, están limitados posiblemente en cuanto a los resultados alcanzables, tiene lugar paralelamente una búsqueda intensa de enzimas comparables a partir de otras fuentes naturales. Se han identificado enzimas disociadores de los almidones, por ejemplo a partir de Pimelobacter, Pseudomonas y Thermus para la fabricación de artículos comestibles, productos cosméticos y productos farmacéuticos (EP 0 636693), igual que a partir de Rhizobium, Arthrobacter, Brevibacterium y Micrococcus (EP 0 628 630), a partir de Pyrococcus (WO 94/19454) y Sulfolobus para la licuación de los almidones a elevadas temperaturas, o bien condiciones de reacción fuertemente ácidas (EP 0 727 485 y WO 96/02633). Para el empleo a valores alcalinos del pH se han encontrado amilasas procedentes de Bacillus sp. (WO 95/26397 y WO97/00324). Otras amilasas procedentes de diversos Bacilli (EP 0 670 367) son adecuadas para el empleo en los agentes de lavado y de limpieza debido a su baja sensibilidad frente a los detergentes.

Los enzimas procedentes de nuevos organismos encontrados son adecuados, debido a su origen, posiblemente mejor que los enzimas poco establecidos para seguir siendo desarrollados con relación a aplicaciones específicas. Un ejemplo a este respecto es la amilasa procedente de Thermoalcalibacter (WO 98/13481), cuya actividad natural es ampliamente insensible frente a los iones calcio de manera, que proporciona, en principio, buenas condiciones previas para el empleo en los agentes de lavado.

Otras optimaciones de los enzimas, aislados a partir de fuentes naturales, para el correspondiente campo de aplicación pueden llevarse a cabo, por ejemplo, a través de los métodos de biología molecular (por ejemplo según las publicaciones US 5171673 o WO 99/20768) o mediante modificaciones químicas (DE 4013142). En la solicitud de patente WO 99/43793, por ejemplo, se describe un desarrollo adicional de la conocida \alpha-amilasa Novamyl\registrado. En esta publicación se aprovechan las similitudes de las secuencias entre el Novamyl\registrado y las ciclodextrinaglucanotransferasas conocidas (CGTasas), para construir un gran número de moléculas emparentadas con ayuda de técnicas de biología molecular. Estas \alpha-amilasas están constituidas por aquellas con secuencias de consenso (cajas) y funciones adicionales específicas de las CGTasas o, a la inversa, están constituidas por CGTasas con zonas y funciones adicionales, típicas de las \alpha-amilasas, o por quimeras de ambas moléculas. El sentido de este desarrollo consiste en optimizar el Novamyl\registrado para estas aplicaciones.

En la solicitud WO 99/57250 se divulga otro método relativo al modo en que puede aumentarse las prestaciones de lavado de los enzimas de los agentes de lavado, por ejemplo de las lipasas, celulasas, proteasas, amilasas o incluso de las CGTasas. El principio, allí descrito, consiste en que los enzimas correspondientes son enlazados covalentemente a través de un ligamiento de tipo no aminoácido, sobre los dominios de enlace de la celulosa (CBD) de origen bacteriano. Éstos se encargan de que el enzima actúe con mayor potencia sobre la superficie del textil. Con la publicación WO 99/57252 se incorporan a este concepto otros posibles ligamientos y con la publicación WO 99/57254 otros enzimas, tales como por ejemplo glicosil-transferasas o acil-transferasas, que se enlazan sobre los CBD bien mediante la formación de una proteína quimérica o por medio de los ligamientos citados en la publicación WO 99/57252.

Cada amilasa, empleada para los agentes de lavado y de limpieza, posee un perfil individual de actuación, lo cual se muestra porque algunas suciedades se eliminan mejor por un enzima y otras se eliminan mejor por otro enzima. Esto demuestra además la necesidad de enriquecer el estado de la técnica con otros enzimas amilolíticos que presenten también espectros individuales de actividad. Esta necesidad se produce también por las costumbres y exigencias, cambiantes, de los usuarios una vez que existe, por ejemplo, una necesidad creciente de agentes de lavado para la limpieza a temperaturas bajas y medias.

Además los nuevos enzimas, como los que pueden obtenerse a partir de organismos no descubiertos todavía para esta finalidad, pueden servir en el sentido de una "ingeniería de proteínas" como producto de partida para otras modificaciones realizadas mediante ingeniería genética. Su objetivo consiste en la consecución de propiedades que no presentan o que no pueden presentar los enzimas conocidos hasta el presente o los enzimas para agentes de lavado, derivados de los anteriores.

Por otro lado se presentan precisamente como candidatos especialmente adecuados para tales optimaciones aquellos enzimas naturales que presenten, desde un inicio, ciertas prestaciones de lavado o bien de limpieza en conjunción con los componentes usuales de los agentes de lavado o de limpieza.

A pesar de todos estos desarrollos existe la tarea permanente de seguir encontrando, junto a los pocos enzimas naturales amilolíticos, que son realmente aprovechados en la industria sin modificaciones o en forma de desarrollos más avanzados, aquellos que presenten a priori un amplio espectro de aplicación y que puedan servir como producto de partida para desarrollos ulteriores.

La presente invención tiene como tarea, por lo tanto, identificar una \alpha-amilasa natural, no descrita hasta ahora, que se presenta como adecuada incluso para las posibilidades de aplicación industriales, especialmente en los agentes de lavado o de limpieza o que puede servir como base para desarrollos ulteriores específicos para su aplicación.

Una tarea parcial consistía en obtener un ácido nucleico que codificase una \alpha-amilasa de este tipo, puesto que este es imprescindible tanto para la obtención biotecnológica como también para el desarrollo ulterior de este enzima.

Otra tarea parcial consistía en encontrar un organismo que produjese de manera natural la \alpha-amilasa correspondiente.

Otra tarea parcial consistía en posibilitar la producción biotecnológica de la \alpha-amilasa encontrada.

Otra tarea parcial consistía en poner a disposición agentes de lavado y de limpieza, cuyas prestaciones de lavado o bien cuyas prestaciones de limpieza se mejorase por medio de la \alpha-amilasa encontrada, es decir que sus prestaciones de lavado o bien sus prestaciones de limpieza pudiesen deberse, en parte, a la proteína amilolítica según la inven-
ción.

Otros aspectos parciales consisten en la puesta a disposición de procedimientos correspondientes de lavado o de limpieza y en la indicación de las correspondientes posibilidades de aplicación.

Otra tarea parcial consistía en definir otras posibilidades industriales de aplicación de una \alpha-amilasa, que se presenta adecuada en primer lugar para el empleo en los agentes de lavado y de limpieza.

La solución de la tarea y por lo tanto del primer objeto de esta invención está constituida por proteínas amilolíticas, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica, al menos, en un 96%, preferentemente, al menos, en un 98%, de forma especialmente preferente en un 100% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 2, especialmente a través de una región parcial, que corresponde a los aminoácidos 32 hasta 516 según la SEQ ID NO. 2.

A estas pertenecen aquellas proteínas amilolíticas que se derivan de una secuencia de nucleótidos, que es idéntica al menos en un 85%, preferentemente, al menos, en un 90% y, de forma especialmente preferente, en un 100% con la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1, especialmente a través de una región parcial, que corresponde a los aminoácidos 32 hasta 516 según la SEQ ID NO. 1. A éstos pertenecen, también, aquellos enzimas proteolíticos que presentan una similitud suficiente con aquellos o que pueden derivarse de los mismos con ayuda de métodos en sí conocidos. Los representantes preferentes pueden aislarse naturalmente de los microorganismos, especialmente de las bacterias gram-positivas del género Bacillus, especialmente de la especie Bacillus sp. A 7-7 y, entre éstas, especialmente, de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368).

El segundo objeto de la invención está constituido por ácidos nucleicos que codifican proteínas amilolíticas, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica al menos en un 85%, preferentemente, al menos, en un 90% y, de forma especialmente preferente en un 100% con la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO. 1, especialmente a través de una región parcial, que corresponde a los aminoácidos 32 hasta 516 según la SEQ ID NO. 2. A éstos pertenecen los ácidos nucleicos correspondientemente preferentes, que codifican la proteína correspondiente del primer objeto de la invención.

El tercer objeto de la invención consiste en organismos naturales que forman una proteína o derivado del primer objeto de la invención o que contienen aminoácidos que los codifiquen. Una forma de realización especialmente preferente a este respecto consiste en la cepa Bacillus sp. A 7-7, que ha sido depositada bajo la denominación DSM (12368).

El cuarto objeto de la invención consiste en vectores con los ácidos nucleicos del segundo objeto de la invención, en células huésped transformadas con tales vectores y en todos los procedimientos biotecnológicos para la obtención de una proteína o derivado según el primer objeto de la invención.

El quinto objeto de la invención está constituido por agentes de lavado o de limpieza, caracterizados porque contienen proteínas o derivados según el primer objeto de la invención. A éstos pertenecen, preferentemente, aquellos que contienen la proteína amilolítica o el derivado en proporciones desde 0,000001 por ciento en peso hasta un 5% en peso, especialmente desde 0,00001 hasta 3% en peso, que contengan otros enzimas, que se presenten en formas de administración en sí conocidas o en los que la actividad amilolítica cumpla una función para la liberación de los componentes del agente o que se autocontrolan.

El sexto estado de la técnica está constituido por procedimientos para la limpieza de textiles o de superficies duras, caracterizado porque al menos en una de las etapas del procedimiento se activa una proteína amilolítica o derivado del primer objeto de la invención. Preferentemente se emplearán en este caso agentes según el quinto objeto de la invención; y preferentemente se empleará la proteína amilolítica o el derivado en la etapa correspondiente del procedimiento en una cantidad desde 0,01 mg hasta 200 mg por aplicación, preferentemente desde 0,02 mg hasta 100 mg por aplicación.

El séptimo objeto de la invención está constituido por las posibilidades correspondientes de aplicación de las proteínas o de los derivados del primer objeto de la invención o de los agentes del quinto objeto de la invención para la limpieza de textiles o de las superficies duras o para la liberación de los componentes de los agentes correspondientes; preferentemente por aplicación en una máquina para el fregado de la vajilla o en una máquina lavadora, en una cantidad desde 0,01 mg hasta 200 mg, preferentemente desde 0,02 mg hasta 100 mg de la proteína amilolítica o derivado.

El octavo objeto de la invención está constituido por otras posibilidades de aplicación industrial de las \alpha-amilasas encontradas. A éstas pertenecen procedimientos para la licuación de almidones, especialmente para la producción de etanol, para procedimientos temporales de pegado y para diversas posibilidades de aplicación, especialmente para el tratamiento de las materias en bruto o de los productos intermedios en la fabricación de textiles, especialmente para el desencolado del algodón, para la fabricación de oligosacáridos lineales y/o de cadena corta, para la hidrólisis de ciclodextrinas, para la liberación de compuestos de bajo peso molecular a partir de portadores de polisacáridos o de ciclodextrinas, para la obtención de artículos comestibles y/o de los componentes de los artículos comestibles, para la fabricación de pienso para los animales y/o de componentes de piensos para los animales y/o para la disolución de uniones por pegado que contengan almidón.

En el sentido de la presente invención debe entenderse por proteína un polímero compuesto por aminoácidos naturales, formado ampliamente de manera lineal, que adquiere al menos una estructura tridimensional para el ejercicio de su función. En la presente solicitud se denominarán los 19 L-aminoácidos proteinógenos, que no son de origen natural, con el código internacional usual de 1 y 3 letras.

En el sentido de la invención se entenderá por enzima una proteína que ejerza una determinada función bioquímica. Se entenderán por proteínas amilolíticas o por enzimas con función amilolítica aquellos que hidrolicen los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos de los polisacáridos, especialmente aquellos que se encuentren situados en el interior del polisacárido. Por lo tanto se denominarán también como \alpha-1,4-amilasas (E.C. 3.2.1.1).

Se forma un gran número de proteínas en forma de las denominadas preproteínas, es decir junto con un péptido señal. Debe entenderse por esta expresión la parte N-terminal de la proteína, cuya función consiste la mayoría de las veces en garantizar la expulsión de la proteína formada a partir de la célula productora en el periplasma o el medio circundante y/o su plegado correcto. A continuación se disocia del resto de la proteína el péptido señal bajo condiciones naturales por medio de una peptidasa señal de tal manera que ésta ejerza su actividad catalítica propiamente dicha sin ejercer el N-término presente en primer lugar. La \alpha-amilasa nativa procedente de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), por ejemplo tiene una longitud de 516 aminoácidos, tal como se ha representado por ejemplo en la SEQ ID NO. 2. Como se ha representado en la SEQ ID NO. 1, el péptido señal de este enzima abarca 31 aminoácidos de manera, que se produce una longitud de 485 aminoácidos para el enzima maduro.

Para las aplicaciones industriales son preferentes los péptidos maduros debido a su actividad enzimática, es decir los enzimas procesados tras su obtención, frente a las preproteínas.

Las pro-proteínas son precursores inactivos de proteínas. Sus precursores con secuencia señal se denominan como pre-pro-proteínas.

En el sentido de la presente solicitud se entenderán por ácidos nucleicos las moléculas naturales constituidas por nucleótidos que sirven como portadores de información, que codifican la serie lineal de aminoácidos en las proteínas o en los enzimas. Éstos pueden presentarse como hebra individual, como hebra individual complementaria de esta hebra individual o como hebra doble. Para los trabajos de biología molecular es preferente el ácido nucleico DNA como el portador de información duradero por naturaleza. Por el contrario, para la realización de la invención en un medio natural, tal como, por ejemplo, en una célula de expresión, se formará un RNA, por lo cual las moléculas de RNA, esenciales según la invención, representan, igualmente, formas de realización de la presente invención.

En el DNA deben tenerse en consideración las secuencias de las dos hebras complementarias respectivamente en las tres pautas posibles de lectura. Además debe tenerse en consideración que diversos codón-tripletes pueden codificar estos aminoácidos de manera que puede derivarse una serie determinada de aminoácidos de varias secuencias de nucleótidos diferentes y que presenten dentro de lo posible tan solo una pequeña identidad (degeneración del código genético). Además los diversos organismos presentan diferencias en el uso de este codón, por estos motivos deben incorporarse en el ámbito de la protección tanto las secuencias de aminoácidos como también las secuencias de nucleótidos y las secuencias de nucleótidos indicadas deben ser consideradas respectivamente tan solo como una codificación ejemplificativa de una determinada serie de aminoácidos.

La unidad de información, que corresponde a una proteína, se denominará en el sentido de la presente solicitud como gen.

Un técnico en la materia tiene la posibilidad de preparar por medio de secuencias conocidas de DNA y/o de aminoácidos los ácidos nucleicos correspondientes hasta un gen completo con ayuda de los métodos conocidos en general en la actualidad, tales como por ejemplo la síntesis química o la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en combinación con métodos corrientes de biología molecular y/o de química de las proteínas. Tales métodos son conocidos, por ejemplo, por la publicación "Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlín, 1999, tomo 1, páginas 267-271 y tomo 2, páginas 227-229.

Se denominan como mutaciones las variaciones de la secuencia de nucleótidos como las que pueden producirse según métodos conocidos de la biología molecular. Según el tipo de la modificación se distingue entre mutaciones por delección, por inserción o por substitución o aquellas en las que se fusionan entre sí diversos genes o partes de genes (shuffling -mutagénesis por fusión-); éstas son mutaciones genéticas. Los organismos correspondientes se denominan como mutantes. Las proteínas derivadas de ácidos nucleicos mutados se denominan como variantes. De este modo, por ejemplo, las mutaciones por delección, por inserción, por substitución o las fusiones conducen a genes mutados por delección, por inserción, por substitución o a genes por fusión y en el plano de las proteínas a las correspondientes variantes por delección, por inserción o por substitución, o bien a las proteínas de fusión.

Se entenderán por fragmentos todas las proteínas o péptidos que sean menores que las proteínas naturales o aquellas que correspondan a genes completamente trasladados y, por ejemplo, también que puedan ser obtenidos sintéticamente. Debido a su secuencia de aminoácidos pueden asociarse a las proteínas completas correspondientes. De manera ejemplificativa pueden tomar estructuras iguales o pueden ejercer actividades proteolíticas o actividades parciales, tales como por ejemplo la formación de complejos con un substrato. Los fragmentos y los derivados por delección de las proteínas de partida son equivalentes en principio; mientras que los fragmentos representan un pequeño trozo desprendido, los mutantes por delección carecen únicamente de pequeñas regiones, y por lo tanto sólo de algunas funciones parciales.

Se entenderán por proteínas quiméricas o híbridas en el sentido de la presente solicitud aquellas proteínas que estén compuestas por elementos que procedan por su naturaleza de diversas cadenas de péptidos procedentes del mismo organismo o de organismos diferentes. Este proceder se denomina también mutagénesis por fusión (Shuffling). El sentido de una fusión de este tipo puede consistir por ejemplo en incorporar o modificar una función enzimática determinada con ayuda de la parte de la proteína introducida por fusión.

Entre las proteínas, obtenidas mediante mutación por inserción, deben entenderse aquellas variantes, que se han obtenido a través de métodos en sí conocidos por incorporación de un fragmento de ácido nucleico o bien de proteína en las secuencias de partida. Éstas deben asociarse a las proteínas quiméricas debido a su equivalencia básica. Éstas se diferencian de aquellas únicamente en la proporción cuantitativa de la parte de la proteína no modificada con respecto al tamaño del conjunto de la proteína. En tales proteínas, mutadas por inserción, la proporción en proteína extraña es menor que en las proteínas quiméricas.

La mutagénesis por inversión, es decir la inversión parcial de la secuencia, puede considerarse tanto como forma especial de la delección como de la inserción. Lo mismo es válido para una nueva agrupación de diversas partes de la molécula que se diferencie de la serie de aminoácidos original. Ésta puede considerarse tanto como variante por delección, como variante por inserción, así como también como variante Shuffling de la proteína original.

En el sentido de la presente solicitud se entenderán por derivados aquellas proteínas cuya cadena de aminoácidos haya sido modificada químicamente. Tales derivaciones pueden llevarse a cabo por ejemplo de manera biológica en combinación con la biosíntesis de la proteína por medio del organismo huésped. En este caso pueden emplearse métodos de biología molecular. Sin embargo pueden llevarse a cabo también químicamente, por ejemplo mediante la transformación química de una cadena lateral de un aminoácido o mediante el enlace covalente de otro compuesto sobre la proteína. Un compuesto de este tipo puede estar constituido por ejemplo por otra proteína, que haya sido enlazada por ejemplo a través de un compuesto químico bifuncional sobre la proteína según la invención. Del mismo modo debe entenderse por derivación en el enlace covalente sobre un soporte macromolecular.

Se resumirán en el sentido de la presente invención todos los enzimas, proteínas, fragmentos y derivados, en tanto en cuanto no precisen ser designados explícitamente como tales, bajo la expresión general de proteínas.

En el sentido de la presente invención se entenderán por vectores los elementos constituidos por ácidos nucleicos, que contengan un gen interesado como región caracterizante de los ácidos nucleicos. Éstos son capaces de establecer este elemento genéticamente estable, que se replica en una especie o en una línea celular a través de varias generaciones o de divisiones celulares independientemente del genoma restante. Los vectores son plásmidos especiales especialmente en el empleo en bacterias, es decir elementos genéticos circulares. Se distingue en la genética por un lado entre aquellos vectores que sirven para el almacenamiento y por lo tanto en cierta medida también para el trabajo genético, los denominados vectores de clonación y, por otro lado, aquellos que cumplen la función de realizar el gen interesado en la célula huésped, es decir que posibilitan la expresión de la proteína correspondiente. Estos vectores se denominan como vectores de expresión.

Mediante comparación con enzimas conocidos, que están depositados por ejemplo en bancos de datos accesibles al público, pueden seguirse a partir de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de nucleótidos partes características de la molécula tales como por ejemplo elementos estructurales o la actividad enzimática de un enzima considerado. Dicha comparación se verifica mediante asociación mutua de series similares en las secuencias de los nucleótidos o de los aminoácidos de las proteínas consideradas. Esto se denomina homologación. Una asociación tabulada de las posiciones correspondientes se denomina alineamiento. En el caso del análisis de secuencias de nucleótidos deben tenerse en consideración a su vez ambas hebras complementarias y, respectivamente, las tres pautas de lectura; del mismo modo la degenerabilidad del código genético y el uso del codón específico del organismo. Entre tanto se han establecido alineamientos por medio de programas de ordenador, tal como por ejemplo por medio de los algoritmos FASTA o BLAST; esta forma de proceder se describe por ejemplo por D. J. Lipman y W. R. Pearson (1985) en Science, tomo 227, páginas 1435-1441. Un conjunto de todas las posiciones coincidentes en las secuencias comparadas se denomina como secuencia de consenso.

Una comparación de este tipo permite también una predicción sobre la similitud o la homología de las secuencias comparadas entre sí. Esta se indica en porcentaje de identidad, es decir en la proporción de los nucleótidos idénticos o restos de aminoácidos en las misas posiciones. Otro concepto de homología establecido incluye en este valor el intercambio conservado de aminoácidos. Entonces se habla de similitud en porcentaje: tales predicciones pueden extenderse a través detoda la proteína o del gen o únicamente a través de regiones individuales.

Las regiones homólogas de diversas proteínas son, la mayoría de las veces, aquellas con elementos estructurales y/o funciones idénticas, que pueden reconocerse por la identidad en la secuencia primaria de aminoácidos. Ésta se extiende hasta la identidad completa en regiones mínimas, que se llaman cajas, que únicamente abarcan un reducido número de aminoácidos y que, la mayoría de las veces, ejercen funciones esenciales para el conjunto de la actividad. Debe entenderse por funciones de las regiones homólogas, aquellas funciones parciales, mínimas, de la función ejercida por el conjunto de la proteína, tal como por ejemplo la formación de compuestos individuales con puente de hidrógeno para la formación de complejos de un substrato o complejo de transición.

La actividad enzimática puede modificarse cualitativa o cuantitativamente por medio de otras regiones de la proteína, que no participen en la reacción propiamente dicha. Esto se refiere por ejemplo a la estabilidad enzimática, a la actividad, a las condiciones de la reacción o a la especificidad del substrato.

Así pues debe entenderse por la expresión de una proteína amilolítica según la invención no solamente una proteína con la función pura, que lleva a cabo la hidrólisis de los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos, que se debe a un número reducido de restos de aminoácidos de un centro activado probablemente por catálisis. Esta expresión abarca, además, todas las funciones que favorezcan la hidrólisis de un enlace \alpha-1,4-glicosídico. Éstas pueden alcanzarse por ejemplo por péptidos individuales así como también por una o varias partes individuales de una proteína mediante actuación sobre las regiones activas realmente catalíticas. La expresión de función amilolítica abarca también todas estas funciones modificadoras. Puesto que, por un lado, no se conoce exactamente que restos de aminoácidos de la proteína según la invención catalizan realmente la hidrólisis, y, por otro lado, no pueden excluirse inicialmente determinadas funciones individuales definitivamente de la participación en la catálisis. A las funciones auxiliares o actividades parciales pertenecen, por ejemplo, el enlace de un substrato, de un producto intermedio o de un producto final, la activación o la inhibición o la propagación de un efecto regulador sobre la actividad hidrolítica. En este caso puede tratarse, por ejemplo, de la formación de un elemento estructural, que se encuentre alejado del centro activo, o de un péptido señal, cuya función se refiera a la expulsión de la proteína formada a partir de la célula y/o se refiera a su plegamiento correcto y sin que se forme in vivo, por regla general, un enzima apto para ejercer una función. Desde luego debe producirse en conjunto una hidrólisis de los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos de los almidones o de los polímeros similares a los almidones.

Se entenderá por la potencia de un enzima su actividad en el sector industrial considerado en cada caso. Esto se basa en la actividad enzimática propiamente dicha, pero además depende de otros factores relevantes para el proceso correspondiente. A éstos pertenecen, por ejemplo, la estabilidad, el enlace con el substrato, la interacción con el material que porta al substrato o la interacción con otros componentes, especialmente con sinérgicos. De este modo se considera, por ejemplo, en los ensayos dirigidos a determinar si un enzima es adecuado para el empleo en los agentes de lavado o de limpieza, su contribución a las prestaciones de lavado o de limpieza de un agente formulado con otros componentes. Para diversas aplicaciones industriales puede desarrollarse adicionalmente y optimizarse un enzima, especialmente los que se han citado anteriormente, mediante técnicas de biología molecular en sí conocidas.

De acuerdo con el tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos del 28 de abril de 1977 se ha depositado para la presente solicitud el siguiente microorganismo en la colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH -Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH- en Braunschweig (DSMZ): Bacillus sp. A 7-7. Éste ha recibido allí el número de registro DSM 12368 (DSM 98-587). Los datos correspondientes sobre las características de este material biológico, tal como han sido determinados por la DSMZ en el momento de su depósito, se han reunido en la tabla 1 siguiente.

TABLA 1 Propiedades microbiológicas del Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) (determinado por la DSMZ el 9.10.1998)

Propiedad	Resultado
Forma celular	Barretas
\hskip3mm anchura [\mum]	\hskip3mm 3,0 - 4,5
\hskip3mm longitud [\mum]	\hskip3mm 0,8 - 1,0
Esporas	positivo/oval
Esporangio	hinchado
Oxidasa	positivo
Catalasa	positivo
Crecimiento anaerobio	positivo
Reacción VP	negativo
pH en medio VP	9,1

TABLA 1 (continuación)

Propiedad	Resultado
\hskip3mm Crecimiento a 40ºC	positivo/esponja
\hskip3mm Crecimiento a 50ºC	negativo
Crecimiento en
\hskip3mm medio a pH 7,0	\hskip3mm negativo
\hskip3mm NaCl 2%	\hskip3mm positivo
\hskip3mm NaCl 5%	\hskip3mm positivo
\hskip3mm NaCl 7%	\hskip3mm positivo
\hskip3mm NaCl 10%	\hskip3mm positivo
\hskip3mm NaCl 12%	\hskip3mm negativo
\hskip3mm NaCl 16%	\hskip3mm negativo
\hskip3mm medio lisozima	\hskip3mm positivo
Ácido procedente de
\hskip3mm D-glucosa	\hskip3mm negativo
\hskip3mm L-arabinosa	\hskip3mm negativo
\hskip3mm D-xilosa	\hskip3mm negativo
\hskip3mm D-manita	\hskip3mm positivo
\hskip3mm D-fructosa	\hskip3mm positivo
Hidrólisis de
\hskip3mm almidones	\hskip3mm positivo
\hskip3mm gelatinas	\hskip3mm positivo
\hskip3mm caseína	\hskip3mm positivo
\hskip3mm tirosina	\hskip3mm débil
\hskip3mm Tween 80	\hskip3mm positivo
\hskip3mm Tween 60	\hskip3mm positivo
\hskip3mm Tween 40	\hskip3mm positivo
\hskip3mm Tween 20	\hskip3mm negativo
Lecitinasa	positivo
Pululano	positivo
Hidrólisis de Hippurat	positivo
Esculina	positivo
Evaluación de
\hskip3mm citrato	\hskip3mm positivo
\hskip3mm propionato	\hskip3mm positivo
NO_{2} a partir de NO_{3}	positivo
Reacción de indol	negativo
Fenilalanindesaminasa	negativo
Resultado	Bacillus sp. (grupo RNA VI, alcalifílico)
Observación	\begin{minipage}[t]{75mm} Los resultados de los ensayos fisiológicos sugieren las especies B. alcalophilus o B. horikoshii, sin embargo, no pueden identificarse claramente las especies citadas. La cepa muestra dos formas de colonia que, sin embargo, fueron determinadas con ayuda del análisis de los ácidos grasos como variantes de una especie.\end{minipage}
	\begin{minipage}[t]{75mm} La secuenciación parcial del 16S rDNA proporcionó una coincidencia del 94,8% con respecto a B. alcalophilus. \end{minipage}
	\begin{minipage}[t]{75mm}La cepa A 7-7 consiste probablemente en el representante de una nueva especie.\end{minipage}

Tal como pudo observarse sorprendentemente, más allá de esta caracterización, el enzima amilolítico producido por esta cepa presenta propiedades que lo predestinan para el empleo en una pluralidad de procesos industriales. Además la cepa dispone de propiedades que favorecen su aptitud al cultivo.

El enzima amilolítico según la invención de la cepa Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) puede caracterizarse por vía bioquímica, tal como se ha indicado en particular en el ejemplo 2, de la manera siguiente: éste presenta, en forma de proteína madura en la electrofóresis de gel de poliacrilo desnaturalizante SDS un peso molecular aparente de 58 kD, mientras que puede deducirse a partir de la secuencia de proteínas, que abarca 516 aminoácidos (SEQ ID NO. 2) un peso molecular de aproximadamente 59 kD, o bien tras la disociación del péptido señal, que abarca 31 aminoácidos un peso molecular de 55,5 kD. De acuerdo con la focalización isoeléctrica, el punto isoeléctrico de la proteína madura se encuentra en 6,0. Éste presenta una actividad fuertemente disociadora. Es estable en el caso de una incubación durante 10 minutos a pH 10, hasta 50ºC.

A 60ºC se encuentra todavía una reactividad del 50%. El enzima es ampliamente estable en el caso de una incubación durante 10 minutos a 40ºC, entre los valores de pH comprendidos entre 5 y 12, observándose la estabilidad óptima a pH 9. En presencia de 0,1% de SDS, tras incubación durante 15 minutos a pH 10 y a 50ºC, el enzima presenta todavía una reactividad del 98%. En presencia de 10 HPE/ml adicionales de actividad de proteasa y tras una incubación de 15 minutos a pH 10 y a 50ºC, el enzima presenta todavía una reactividad del 74%.

Así pues, con la presente invención se pone a disposición un enzima de origen natural, que debe ser considerado como \alpha-amilasa debido a la homología de su secuencia con respecto a los enzimas conocidos hasta ahora y debido a su actividad enzimática. Éste puede emplearse, en principio, para todas las aplicaciones que requieran una función amilolítica. Es especialmente adecuado para aquellas aplicaciones que se desarrollen a valores alcalinos del pH y en intervalos medios de temperatura, especialmente a valores del pH situados por encima de 9 y/o a temperaturas situadas por encima de 40ºC. El espectro de aplicación se amplía mediante la estabilidad comparativamente elevada del enzima frente a los detergentes y frente a las proteasas. Por lo tanto se presenta como especialmente adecuado para el empleo en los agentes de lavado o de limpieza.

La secuencia de nucleótidos de este enzima se indica con el protocolo de secuencias bajo la denominación SEQ ID NO. 1. Ésta está disponible por lo tanto, de manera ejemplificativa, para desarrollos ulteriores mediante métodos de biología molecular en sí conocidos. La secuencia de aminoácidos de este enzima se indica con el protocolo de secuencia bajo la denominación SEQ ID NO. 2.

Las proteínas amilolíticas comparables representan igualmente formas de realización de la presente invención y quedan reivindicadas en tanto en cuanto presenten secuencias de proteínas o de DNA que se encuentren dentro del intervalo de similitud con respecto a las secuencias indicadas en la SEQ ID NO.1 y/o SEQ ID NO. 2. Éste intervalo de similitud abarca todas las proteínas, cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica al menos en un 96%, en un 96,5%, en un 97%, en un 97,5%, en un 98%, en un 98,5%, en un 99%, en un 99,5% o en un 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO.2. El intervalo de similitud abarca también todas las proteínas, cuya secuencia de nucleótidos sea idéntica al menos en un 87,5%, en un 90%, en un 92,5%, en un 95%, en un 96%, en un 97%, en un 98%, en un 99% o en un 100% con respecto a la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1. Esto es válido especialmente para aquellas zonas de la proteína que correspondan a los aminoácidos 32 hasta 516.

La proteína más parecida, conocida hasta el 17.3.2000, está constituida por la \alpha-amilasa procedente de Bacillus alcalophilus, con la denominación P 19571 en el banco de datos Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Ginebra, Suiza; http://www.genebio.com/sprot.html). Ésta presenta con relación al enzima amilolítico según la invención procedente de Bacillus sp. A 7-7(DSM 12368) una homología de secuencias con una identidad del 93,4% en el plano de las proteínas. La proteína según la invención se ha caracterizado claramente como \alpha-amilasa a través de las regiones homólogas. Se han presentado en el alineamiento de la figura 1 proteínas emparentadas representativas.

Tomando como base este alineamiento pueden suponerse para las proteínas según la invención ampliamente las mismas estructuras secundarias y terciarias que para las proteínas utilizadas para la homologación. Sus elementos estructurales pueden se solicitados en los bancos de datos accesibles al público tales como por ejemplo en EMBL-European Bioinformatics Institute (EBI) in Cambridge, Großbritannien (http://www.ebi.ac.uk), Swiss-Prot o GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Si se produjesen estructuras diferentes de aquellas o si se estableciese que existiesen diversas variantes de plegamiento con propiedades amilolíticas diferentes, lo cual interesa por ejemplo a las condiciones óptimas de reacción o a la especificidad del substrato, quedarán incorporadas todas ellas en el campo de protección de la presente invención. Puesto que, por un lado, el plegamiento puede depender de las condiciones de obtención, por ejemplo cuando esté presente o esté ausente el péptido conductor. Por otro lado pueden presentarse como especialmente adecuadas estas variantes para diversas posibilidades de aplicación, por ejemplo para la licuación cuantitativa del almidón, para la hidrólisis de las ciclodextrinas o para el empleo en los agentes de lavado o de limpieza.

Tiene un interés especial la secuencia parcial, que corresponde a los aminoácidos 32 hasta 516 de la secuencia indicada en la SEQ ID NO. 2. Puesto que los primeros 31 aminoácidos representan, tal como puede deducirse de la secuencia de aminoácidos, un péptido señal, que inicia probablemente la expulsión de la proteína a partir del interior de la célula hasta el medio circundante a la célula en el caso de la producción en microorganismos correspondientes. Este péptido señal se disocia in vivo tras la expulsión de manera que la actividad amilolítica propiamente dicha es ejercida por la parte restante de la proteína.

Para la función amilolítica propiamente dicha, los aminoácidos 1 a 31 tienen, por lo tanto, probablemente poco significado, pero son significativos para la producción, y concretamente de manera especial para el plegamiento deseado. Por lo tanto no pueden excluirse del intervalo de protección de la presente invención.

Si se pusiese de manifiesto que se producen desviaciones en cuanto a la longitud del péptido señal y/o de la proteína madura, en el momento de la obtención, por ejemplo debido a una o varias cepas de bacterias, las reivindicaciones referidas a la posición 1 hasta 31, o bien 32 hasta 516 según la SEQ ID NO. 2, de manera correspondiente para las variantes desviadas. De este modo sería posible, por ejemplo, que la traducción de la proteína procedente de Bacillus sp. A 7-7(DSM 12368) insertase ya seis nucleótidos por delante de la secuencia de los nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1. Delante de este inicio tomado como probable, se encuentran los seis nucleótidos ATG ACG. Éstos pueden traducirse como Met-Thr, con lo cual el péptido señal N-terminal se prolonga en dos aminoácidos y se presenta una cierta similitud con respecto a la amilasa, indicada en la figura 1 bajo el número 2, procedente de Bacillus sp. # 707. Igualmente son posibles también variaciones en la disociación del péptido señal.

Entre las variantes, que se encuentran dentro del intervalo de similitud anteriormente indicado, son especialmente preferentes aquellas que presenten propiedades óptimas en lo que se refiere a las posibilidades de aplicación previstas. Éstas pueden obtenerse, tal como se ha indicado al principio, según métodos en sí conocidos, preferentemente métodos de biología molecular. De manera ejemplificativa sería posible también, mediante la aplicación de las enseñanzas de la solicitud WO 94/18314, verificar la delección de restos de metionina, de triptofano, de cisteína y/o de tirosina de las proteínas según la invención y/o llevar a cabo su substitución por restos de aminoácidos que sean menos fácilmente oxidables. De este modo pueden mejorarse la estabilidad a la oxidación, el perfil de actividad de pH y/o la estabilidad térmica. Desarrollos adicionales a través de mutagénesis puntual específica pueden orientarse por ejemplo también a las solicitudes WO 99/09183 y WO 99/23211.

Se entenderán por fragmentos, según la invención, todas las proteínas o los péptidos que sean menores que cualquiera de las proteínas correspondientes a la SEQ ID NO. 1 o a la SEQ ID NO.2, pero con las que son suficientemente homólogas en las secuencias parciales correspondientes. En tanto en cuanto ejerzan una función amilolítica o, al menos, una función que favorezca la hidrólisis de un enlace \alpha-1,4-glicosídico, se considerarán fragmentos con actividad amilolítica y representan formas de realización de la presente invención. Esto se refiere, por ejemplo, a aquellos fragmentos que contribuyan a la formación de complejos de un substrato o a la formación de un elemento estructural necesario para la hidrólisis. En el caso de los fragmentos puede tratarse, por ejemplo, de dominios individuales o de pedazos rotos que no correspondan con los dominios. Tales fragmentos pueden prepararse de manera más económica, no tienen ya determinadas características, eventualmente inconvenientes, de la molécula de partida, tal como posiblemente un mecanismo de regulación reductor de la actividad, o desarrollan un perfil de actividad más favorable. Tales fragmentos de proteína pueden prepararse por vía no biosintética sino, por ejemplo, por vía química. La síntesis química puede ser ventajosa, por ejemplo, cuando al final de la síntesis deban llevarse a cabo modificaciones
químicas.

Los fragmentos deben asociarse, debido a su identidad inicial, también a las proteínas que pueden ser obtenidas mediante mutación por delección. Estas pueden coincidir ampliamente, desde el punto de vista bioquímico, con las moléculas de partida o precisamente ya no pueden presentar funciones individuales. Esto parece ser especialmente interesante por ejemplo en el caso de la delección de las regiones inhibidoras. Como resultado pueden presentarse con las delecciones tanto una especialización como también una ampliación del campo de aplicación de la proteína. En tanto en cuanto se mantenga, se modifique, se especifique o incluso se consiga por primera vez una función amilolítica en el sentido más amplio de la palabra, las variantes por delección así como los fragmentos estarán constituidos por proteínas según la invención; la única condición previa adicional en este sentido consiste en que se encuentren dentro del intervalo de similitud, anteriormente indicado, con respecto a las secuencias SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2 más allá de la secuencia parcial homóloga aún presente.

De este modo es posible, de acuerdo con la publicación WO 99/57250, por ejemplo, dotar a una proteína según la invención o a una parte de la misma con dominios de enlace procedentes de otras proteínas, a través de ligamientos de tipo péptido o de tipo no péptido y, de este modo, se lleva a cabo de una manera más efectiva la hidrólisis del substrato. Tales construcciones se encuentran por lo tanto dentro del campo de protección de la presente invención si ejercen actividades amilolíticas y las partes de la construcción, que ejercen esta función, son suficientemente similares a las secuencias indicadas según la invención. Del mismo modo pueden enlazarse también proteínas amilolíticas según la invención por ejemplo con proteasas, para ejercer una función doble.

Las proteínas y los péptidos señal, obtenibles de preparaciones mediante la disociación de los aminoácidos N-terminales, pueden considerarse también fragmentos formados de manera natural, o bien proteínas mutadas por delección. Un mecanismo de disociación de este tipo puede utilizarse también para establecer puntos específicos de rotura en las proteínas recombinantes con ayuda de determinadas regiones de secuencia, que son reconocidas por las peptidasas de señal. De este modo pueden llevarse a cabo in vitro la activación y/o la desactivación de las proteínas según la invención. El ámbito de protección de la presente invención se extiende a cada una de estas proteínas en tanto en cuanto se encuentren dentro del ámbito de protección reivindicado y proporcione una actividad amilolítica.

Se entenderán por proteínas quiméricas o híbridas según la invención, aquellas proteínas que estén constituidas por elementos que procedan de manera natural de diversas cadenas polipéptidas. Esta forma de proceder se denomina también mutagénesis por fusión o Shuffling (barajado). Se tratará de proteínas quiméricas según la invención si las proteínas, obtenidas mediante la fusión, presentan una actividad amilolítica en el sentido más amplio de la palabra. Ésta puede ejercerse o modificarse por una molécula que se derive de una proteína según la invención y que se encuentre dentro del intervalo de similitud reivindicado. El sentido de una fusión de este tipo puede consistir por ejemplo en introducir o en modificar una función amilolítica o favorecedora de la hidrólisis de los enlaces \alpha-1,4-glicosídicos con ayuda de la parte de la proteína según la invención fusionada. En este caso carece de importancia, en el sentido de la presente invención que una proteína quimérica, de este tipo esté constituida por una sola cadena polipéptida o por varias subunidades, sobre las cuales puedan distribuirse funciones diferentes. Para la realización de la alternativa citada en último lugar es posible, por ejemplo, trocear una sola cadena polipéptida quimérica en varias una vez realizada la traducción o solamente después de una etapa de purificación por medio de una disociación proteolítica específica. Al objeto de la invención pertenecen también aquellas proteínas quiméricas que presentan una identidad, debido a su construcción, a través de toda su secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, en caso dado menor que como la que se ha definido anteriormente para el intervalo de similitud según la invención, que pueda asociarse con el mismo, sin embargo, en al menos una de las regiones incorporadas mediante fusión y ejerzan en esta parte las mismas funciones que en una amilasa, que se encuentre a través de toda su longitud en el intervalo de homología
citado.

Se entenderán por proteínas según la invención, obtenibles mediante estimulación por inserción, las variantes de las proteínas que están incluidas a través de todas sus longitudes de secuencia en los intervalos de protección designados de las secuencias SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO.2, que han sido obtenidas mediante la incorporación de un segmento de ácido nucleico o bien de proteína en la secuencia correspondiente. El sentido de la mutagénesis por inserción puede consistir, igual que el de la hibridación, en la combinación de propiedades individuales de las proteínas según la invención con las de otras proteínas. En este caso se trata de proteínas según la invención, obtenidas mediante estimulación por inserción o de proteínas quiméricas, cuando las regiones relacionadas, a través de su homología, con las secuencias SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2, presenten valores de homología correspondientes y la proteína tenga una función amilolítica en el sentido más amplio de la palabra debido a esta región.

Del mismo modo quedan incorporadas en el ámbito de protección de la presente invención las proteínas obtenidas mediante mutagénesis por inversión y aquellas con una nueva agrupación de diversas partes de la molécula que se diferencien de la serie original de aminoácidos. Lo mismo es válido para. Ésta puede considerarse tanto como variante por delección, como variante por inserción, así como también como variante por Shuffling de la proteína original.

Entre los derivados amilolíticamente activos, según la invención, se entenderán aquellas proteínas amilolíticas que hayan sido modificadas, por ejemplo en relación con la síntesis de las proteínas mediante procesamiento por medio del organismo huésped o químicamente, por ejemplo mediante la transformación de una cadena lateral de un aminoácido o mediante enlace covalente de otro compuesto sobre la proteína. Un compuesto de este tipo puede estar constituido, por ejemplo, por otras proteínas que se enlacen, por ejemplo, a través de compuestos químicos bifuncionales sobre las proteínas según la invención. Tales modificaciones pueden influenciar, por ejemplo, la especificidad con respecto al substrato o la intensidad del enlace sobre el substrato o provocar un bloqueo provisional de la actividad enzimática, cuando la substancia enlazada esté constituida por un inhibidor. Esto puede ser conveniente por ejemplo para el período de tiempo correspondiente al almacenamiento. Otra forma de realización está constituida por aquellos derivados que han sido obtenidos mediante enlace covalente sobre soporte macromoleculares, tales como por ejemplo polietilenglicol o polisacárido.

Otras soluciones de la tarea según la invención son proteínas amilolíticas o derivados, que tienen en común al menos un determinante antígeno con una de las proteínas o derivados anteriormente indicados.

Lo esencial para el ejercicio de las actividades enzimáticas consiste, no sólo en la pura serie de aminoácidos de una proteína, sino también en sus elementos estructurales secundarios y en su plegamiento tridimensional. De este modo dominios claramente diferentes entre sí en cuanto a su estructura primaria, pueden ejercer estructuras ampliamente coincidentes en el espacio y, por lo tanto, posibilitan comportamientos enzimáticos idénticos. Tales coincidencias en la estructura secundaria se reconocen usualmente como determinantes antígenos coincidentes de antisueros o anticuerpos puros o monoclonales. Así pues pueden detectarse y ordenarse proteínas o derivados estructuralmente semejantes entre sí por medio de reacciones de cruce inmunoquímicas.

Por este motivo se incorporan al campo de protección de la presente invención precisamente también aquellas proteínas o derivados que presenten actividad amilolítica y que posiblemente no puedan asociarse por medio de sus valores de homología en la estructura primaria, pero sí por medio de su parentesco inmunoquímico con las proteínas o derivados según la invención anteriormente definidas.

Las proteínas según la invención que pueden proceder de fuentes naturales, son formas de realización preferentes de la presente invención, especialmente cuando procedan de microorganismos tales como hongos o bacterias monocelulares. Puesto que éstos pueden manipularse en la mayoría de los casos más fácilmente que los organismos policelulares o que los cultivos celulares que se derivan de células múltiples. Éstas representan opciones interesantes para formas especiales de realización.

Según la invención son especialmente preferentes las proteínas o los derivados procedentes de bacterias gram-positivas, puesto que éstas no tienen una membrana externa y desprenden directamente en el medio circundante por lo tanto las proteínas secretadas.

Según la invención son muy especialmente preferentes las proteínas o los derivados procedentes de bacterias gram-positivas del género Bacillus, puesto que éstos se han establecido como organismos productores con un rendimiento de producción especialmente elevado en procedimientos industriales.

Entre las proteínas o los derivados según la invención procedentes de las especies Bacillus, son preferentes, a su vez, los que proceden del Bacillos alcalífilos y entre éstos especialmente los que proceden de Bacillus sp. A 7-7, y muy especialmente preferente los que proceden de la cepa Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368). Puesto que se ha obtenido originalmente a partir de la misma la forma de realización del enzima según la invención, cuyas secuencias correspondientes han sido indicadas en el protocolo de secuencias y cuyas características enzimáticas han sido descritas en los ejemplos.

Son preferentes respectivamente aquellas cepas que desprendan la proteína amilolítica formada en el medio circundante, por motivos de ingeniería de producción.

Es posible que los productores de origen natural puedan preparar ciertamente un enzima amilolítico según la invención, pero lo expresan y/o lo liberan al medio ambiente sólo en cantidades pequeñas bajo las condiciones determinadas en primer lugar. Sin embargo quedan abarcados por el ámbito de protección de la presente invención en tanto en cuanto exista la posibilidad de determinar experimentalmente condiciones ambientales adecuadas o factores de bajo peso molecular o de otro tipo, bajo cuyo efecto puedan excitarse para generar una producción de la proteína según la invención, que permite considerar un aprovechamiento adecuado económico. Un mecanismo de regulación de este tipo puede emplearse específicamente para la producción biotecnológica, por ejemplo para la regulación de los promotores responsables.

De acuerdo con la obtención, la elaboración o la preparación de una proteína podrán comercializarse con otros productos diferentes, especialmente cuando esta proteína haya sido obtenida a partir de productores naturales. Sin embargo podrá combinarse específicamente también, independientemente de lo anterior, con otros productos determinados, por ejemplo para aumentar su estabilidad al almacenamiento. Bajo la expresión de proteína según la invención deben entenderse por lo tanto además, también, todas las preparaciones de la proteína según la invención propiamente dicha. Esto ocurre igualmente de manera independiente de que en una determinada preparación se desarrollo o no realmente esta actividad enzimática. Puesto que puede ser deseable que durante el almacenamiento no tenga ninguna actividad o que únicamente tenga una baja actividad y solamente desarrolle su función amilolítica en el momento de la utilización. Esto puede depender, por ejemplo, del estado de plegamiento de la proteína o resultar del enlace reversible de uno o varios productos acompañantes procedentes de la preparación o resultantes de otro mecanismo de control.

Las proteínas según la invención pueden protegerse especialmente durante el almacenamiento mediante estabilizantes, por ejemplo contra la desnaturalización, la descomposición o la inactivación, por ejemplo debido a efectos físicos, por oxidación o por disociación proteolítica. En el caso de las proteínas que han sido obtenidas a partir de microorganismos, es especialmente crítica una inhibición de la proteólisis puesto que la mayoría de los microorganismos secretan proteasas diferentes como enzimas de digestión en el medio ambiente. Éstos pueden dañar considerablemente a las proteínas interesadas durante las siguientes etapas de purificación.

Un grupo de estabilizantes son los inhibidores de proteasa reversibles, tales como por ejemplo el hidrocloruro de benzamidina y leupeptina, borax, ácido úrico, ácidos borónicos, sus sales o ésteres peptidoaldehídos o inhibidores peptídicos puros tales como ovomucoide o inhibidores específicos de subtilisina. Otros estabilizantes enzimáticos usuales son los aminoalcoholes tales como la mono-, di-, trietanol- y -propanolamina, los ácidos carboxílicos alifáticos tales como por ejemplo los ácidos dicarboxílicos con 12 átomos de carbono, los alcoholes alifáticos inferiores, ante todo sin embargo los polioles, tales como por ejemplo la glicerina, el etilenglicol, el propilenglicol o la sorbita. Del mismo modo se emplean sales de calcio, tales como por ejemplo el acetato de calcio o el formiato de calcio, las sales de magnesio, diversos polímeros tales como, por ejemplo, lignina, éteres de celulosa, poliamidas o vinil-copolímeros solubles en agua para estabilizar la preparación enzimática, ante todo, frente a los efectos físicos de las oscilaciones del valor del pH. Los agentes reductores y los antioxidantes, tales como por ejemplo el sulfito de sodio o los azúcares reductores, aumentan la estabilidad de la proteína frente a la descomposición por oxidación.

La invención se lleva a cabo, también, en la forma de realización de los ácidos nucleicos correspondientes, en tanto en cuanto los ácidos nucleicos correspondientes codifiquen una proteína amilolítica, en el sentido más amplio de la palabra y presenten una afinidad, anteriormente definida, suficiente con respecto a la secuencia indicada bajo la SEQ ID NO.1, especialmente aquellos ácidos nucleicos que codifiquen una proteína que corresponda a la región parcial de los aminoácidos desde 32 hasta 516 de la secuencia de los aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 1.

Representan formas de realización especialmente preferentes aquellos ácidos nucleicos que codifiquen una de las proteínas amilolíticas según la invención anteriormente indicadas. Esto abarca también aquellas variantes que no se encuentren en el intervalo de similitud definido según la SEQ ID NO. 1 a través de toda la longitud de su secuencia, pero que sin embargo lo haga en regiones individuales. A estas pertenecen, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que, como se ha indicado anteriormente, hayan sido obtenidas mediante mutación por inserción o por delección, las proteínas quiméricas o los fragmentos de proteína. Del mismo modo, las construcciones denominadas antisentido, por ejemplo a través de una sección parcial individual, representan formas de realización de la presente invención, puesto que pueden emplearse para la regulación de la actividad amilolítica.

Los ácidos nucleicos forman el punto de partida para los ensayos de biología molecular y desarrollos más avanzados. Tales métodos están descritos, por ejemplo, en el manual de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989. Del mismo modo todos los métodos de ingeniería genética reunidos en el estado de la técnica por la expresión ingeniería de las proteínas, y los métodos bioquímicos para proteínas están basados en el gen, especialmente en el gen clonado. Con los mismos pueden optimizarse todavía más las proteínas según la invención desde el punto de vista de las diversas aplicaciones, por ejemplo mediante mutagénesis puntual o mediante fusión con secuencias procedentes de otros genes.

A las variantes de una proteína según la invención, obtenibles a través de métodos conocidos de biología molecular, pertenecen, especialmente, aquellas con intercambios específicos de aminoácidos individuales o mutaciones puntuales estadísticas, delecciones de aminoácidos individuales o de secuencias parciales, fusiones con otros fragmentos o con otros enzimas, inserciones o inversiones, es decir inversiones parciales de la secuencia. Tales mutaciones o modificaciones pueden representar preferentemente formas de realización para aplicaciones específicas. Una mutagénesis de este tipo puede llevarse a cabo de manera específica o a través de métodos casuales. Esto puede combinarse, por ejemplo, con un procedimiento de reconocimiento y/o de selección (muestreo y selección), dirigido a continuación a la actividad con los genes clonados. Los genes, obtenidos por mutación, están sometidos al ámbito de protección de la invención aquí descrita cuando codifiquen una proteína amilolítica en el sentido más amplio de la palabra y se encuentren en el intervalo de similitud anteriormente definido; esto último al menos en las regiones homólogas y relevantes para la función.

Otra solución de la tarea según la invención y, por lo tanto, un objeto de la invención propio está representado por los organismos que forman de manera natural una proteína o derivado según la invención o que contienen ácidos nucleicos que codifiquen una proteína o derivado según la invención. Puesto que su descubrimiento posibilita la realización de la idea inventiva. Tales organismos pueden obtenerse mediante el empleo de técnicas conocidas en general, por ejemplo mediante aislamiento de cepas procedentes de un habitat natural o mediante muestreo de bancos de genes. La secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1 puede emplearse en este caso especialmente como sonda para el muestreo o como muestra para la construcción del iniciador PCR correspondiente. De manera análoga pueden emplearse péptidos de cadena corta o péptidos completos con secuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO. 2 para la formación de los antisueros correspondientes con cuya ayuda pueden identificarse organismos correspondientes, o bien las proteínas liberadas por los mismos.

De acuerdo con las indicaciones anteriormente dadas son preferentes, ante todo, debido a la aptitud al cultivo de los microorganismos, preferentemente las bacterias, entre estas las bacterias gram-positivas, entre las cuales se encuentran aquellas del género Bacillus, especialmente Bacillus sp. A 7-7 y de una manera especialmente preferente el Bacillus sp. A 7-7 DSM (12368).

Se asocian como un objeto propio de la invención los vectores que contengan una de las regiones de los ácidos nucleicos del segundo objeto de la invención.

Así pues, para manipular los ácidos nucleicos se clonarán los DNA adecuadamente en un vector. A éstos pertenecen, por ejemplo, aquellos que se deriven de plásmidos bacterianos, de virus o de bacteriófagos, o vectores preponderantemente sintéticos o plásmidos con elementos de origen diverso. Los vectores son capaces con los otros elementos genéticos presentes en cada caso de estabilizarse en forma de unidades estables en las células huésped correspondientes durante varias generaciones. En este caso no tiene importancia en el sentido de la invención que se establezcan de manera extracromosómica como unidades propias o que se integren en un cromosoma. El sistema elegido entre el gran número de sistemas conocidos por el estado de la técnica, dependerá de cada caso particular. De manera ejemplificativa puede ser decisivo el número de copias alcanzable, los sistemas de selección disponibles, entre ellos ante todo la resistencia a los antibióticos, o la aptitud al cultivo de las células huésped capaces de alojar a los vectores.

Los vectores forman puntos de partida adecuados para los ensayos de biología molecular y bioquímicos del gen correspondiente o de la proteína correspondiente y para el desarrollo adicional según la invención y, finalmente, para la amplificación y la producción de la proteína según la invención. Éstos representan formas de realización de la presente invención en tanto en cuanto las secuencias de las regiones de los ácidos nucleicos, obtenidas según la invención, se encuentren dentro del intervalo de homología descrito anteriormente con mayor detalle.

Los vectores de clonación son formas de realización preferentes de la presente invención. Éstos son adecuados, además de para el almacenamiento, la amplificación biológica o la selección del gen interesado, para la caracterización del gen correspondiente, por ejemplo mediante el establecimiento de un mapa de restricción o mediante la secuencialización. Los vectores de clonación son, por lo tanto, también formas preferentes de realización de la presente invención puesto que representan una forma transportable y almacenable de los DNA reivindicados. Éstos son también productos de partida preferentes para las tecnologías de biología molecular que no están relacionadas con la célula, tal como por ejemplo la reacción en cadena de la polimerasa.

Los vectores de expresión tienen secuencias parciales que son capaces de replicarse en los organismos huésped optimizados para la producción de proteínas y hacen que el gen obtenido se exprese en los mismos. Son formas preferentes de realización los vectores de expresión, que portan en sí mismos los elementos genéticos necesarios para la expresión. La expresión es influenciada, por ejemplo, por promotores que regulan la transcripción del gen. De este modo puede llevarse a cabo la expresión por medio del promotor natural, localizado originalmente por delante de este gen, así como también tras la fusión genética tanto por medio de un promotor preparado en el vector de expresión de la célula huésped como también por medio de un promotor modificado o de un promotor completamente diferente de otro organismo.

Los vectores de expresión son formas preferentes de realización que pueden regularse mediante modificaciones de las condiciones de cultivo o mediante la adición de determinados compuestos, tal como por ejemplo la densidad celular o factores especiales. Los vectores de expresión posibilitan que la proteína correspondiente se produzca de manera heteróloga, es decir en otro organismo diferente de aquél en el cual puede obtenerse de manera natural. También se encuentra dentro del ámbito de protección de la presente invención una obtención homóloga de proteínas a partir de un organismo huésped que exprese el gen de manera natural a través de un vector adaptado. Esto puede presentar la ventaja de que se lleven a cabo reacciones de modificación naturales, que están relacionadas con la traducción, en la proteína formada del mismo modo que se produciría también de manera natural.

También pueden ser formas de realización de la presente invención los sistemas de expresión exentos de células, en los que la biosíntesis de las proteínas se realiza in vitro. Tales sistemas de expresión están igualmente establecidos en el estado de la técnica.

Otra forma de realización de este objeto de la invención está representada por células que contengan uno de los vectores anteriormente definidos, especialmente un vector de clonación o un vector de expresión. Puesto que, especialmente en el transcurso de los trabajos de biología molecular, tales como los que se requieren por ejemplo para la mutagénesis, para la secuenciación o para el almacenamiento de vectores, se lleva a cabo su transformación en células correspondientes. A este respecto pueden ser adecuadas, en función del método, por ejemplo bacterias gram-positivas, especialmente sin embargo también bacterias gram-negativas.

Otra forma de realización está constituida por células huésped, que expresan una proteína o derivado del primer objeto de la invención o que pueden excitarse para su expresión, preferentemente con empleo de un vector de expresión anteriormente definido.

Así pues, la síntesis preferente in vivo de un enzima amilolítico, según la invención, requiere la transferencia del gen correspondiente hasta una célula huésped. Como células huésped son adecuados en principio todos los organismos, es decir los procariotas, los eucariotas y los cianofitos. Son preferentes aquellas células huésped que puedan manipularse genéticamente bien, por ejemplo en cuanto a la transformación con el vector de expresión y a su establecimiento estable, por ejemplo hongos o bacterias individuales. Además las células huésped preferentes se caracterizan por una buena manipulabilidad microbiológica y biotecnológica. Esto se refiere por ejemplo a la fácil aptitud al cultivo, a las elevadasvelocidades de crecimiento, a los reducidos requisitos exigidos a los medios de fermentación y a las buenas velocidades de producción y de secreción para la proteína foránea. Frecuentemente tienen que determinarse experimentalmente entre el gran número de los diversos sistemas, disponibles según el estado de la técnica, los sistemas de expresión óptimos para cada caso particular.

Cada una de las proteínas según la invención puede obtenerse de este modo a partir de una pluralidad de organismos huésped.

Representan formas preferentes de realización aquellas células huésped que pueden regularse en cuanto a su actividad debido a los elementos de regulación genéticos, que pueden estar disponibles por ejemplo en el vector de expresión, así como también que pueden estar presentes desde un inicio en estas células. De manera ejemplificativa pueden excitarse estas células para que produzcan la expresión mediante la adición controlada de compuestos químicos, que sirven como activadores, mediante la modificación de las condiciones de cultivo o cuando se alcance una determinada densidad celular. Esto posibilita una producción muy económica de las proteínas interesa-
das.

Una variante de este principio de ensayo está representada por sistemas de expresión en los que genes adicionales, por ejemplo aquellos que están disponibles en otros vectores, influyen sobre la producción de las proteínas según la invención. En este caso puede tratarse de productos genéticos modificados o puede tratarse de aquellos que deban ser purificados conjuntamente con la proteína según la invención por ejemplo para influenciar sobre su función amilolítica. En este caso puede tratarse, por ejemplo, de otras proteínas o enzimas, de inhibidores o de aquellos elementos que influyen la interacción con diversos substratos.

Las células huésped preferentes son células procariotas o células bacterianas. Las bacterias se caracterizan frente a los eucariotas por regla general por tiempos más cortos de generación y por menores exigencias con relación a las condiciones de cultivo. De este modo pueden establecerse procedimientos económicos para la obtención de proteínas según la invención.

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Son especialmente preferentes las células huésped, especialmente las bacterias, que secreten en el medio ambiente la proteína o el derivado formado de manera que las proteínas expresadas según la invención puedan purificarse directamente.

Una forma de realización de la presente invención utiliza el propio Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), para expresar de manera homóloga proteínas según la invención. Esto puede llevarse a cabo por ejemplo mediante un vector incorporado que introduzca en estas células el amplio gen endógeno presente o modificaciones del mismo según la invención, por ejemplo en una pluralidad de número de copias. Esto puede ser especialmente ventajoso cuando la proteína deba sufrir modificaciones después de su síntesis, que deban llevarse a cabo adecuadamente por las propias células correspondientes.

Por el contrario es preferente, sin embargo, la expresión heteróloga. Las bacterias gram-positivas tales como por ejemplo Actinomycten o Bacilli, no tienen membrana externa de manera que liberan directamente en el medio circundante las proteínas secretadas. A las bacterias, preferentes para la expresión heteróloga pertenecen, por lo tanto, aquellas del género Bacillus, especialmente de aquellas de las especies Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

Del mismo modo pueden aprovecharse para la expresión heteróloga las bacterias gram-negativas. En el caso de estas bacterias se secretará una pluralidad de proteínas en la cavidad periplasmática, es decir en el compartimento comprendido entre ambas membranas que encierran a las células. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especiales. A este respecto pertenecen, por ejemplo, aquellas de los géneros Klebsiella o Escherichia, preferentemente de la especie Escherichia coli, de forma especialmente preferente de las cepas E. coli JM 109, E. coli DH 100B o E. coli DH 12S.

También pueden ser adecuadas células eucariotas para la producción de las proteínas amilolíticas según la invención. Ejemplos a este respecto son levaduras tales como Saccharomyces o Kruyveromyces. Esto puede ser especialmente ventajoso, por ejemplo, cuando las proteínas deban recibir modificaciones específicas en relación con su síntesis, que posibiliten tales sistemas. A éstos pertenecen por ejemplo el enlace de compuestos de bajo peso molecular tales como anclajes con la membrana u oligosacáridos.

Todos los elementos ya citados anteriormente pueden combinarse en procedimientos para la obtención de las proteínas según la invención. En este caso puede imaginarse para cada una de las proteínas según la invención una pluralidad de posibilidades de combinación de etapas del procedimiento. Todas ellas revisan la idea en la que está basada la presente invención, concretamente la obtención cuantitativa de representes de un tipo de proteína definido por medio de la función amilolítica y, al mismo tiempo, por la elevada homología con relación a las secuencias indicadas en los controles de secuencias, con ayuda de la información genética correspondiente. El procedimiento óptimo debe determinarse experimentalmente para cada caso concreto individual.

En principio se procederá en este caso de la manera siguiente: se ligan los ácidos nucleicos según la invención, es decir aquellos que se encuentran dentro del intervalo de similitud anteriormente definido con respecto a la secuencia de la SEQ ID NO. 1, adecuadamente en forma del DNA en un vector adecuado de expresión. Éste se transfiere hasta la célula huésped, por ejemplo en células de una cepa de bacterias fácilmente cultivable, que expulsen hasta el medio nutriente circundante las proteínas, cuyos genes se forman bajo el control del elemento genético correspondiente; pudiéndose poner a disposición por ejemplo del vector de expresión para ello elementos reguladores. A partir del medio circundante puede purificarse la proteína según la invención a través de varias etapas de purificación, tales como por ejemplo precipitaciones o cromatografías. Un técnico en la materia es capaz de extrapolar un sistema, que haya sido optimizado experimentalmente a escala de laboratorio, a una escala de producción indus-
trial.

A continuación se indicarán las posibilidades de aplicación industrial más importantes para las proteínas según la invención. Se ha indicado un gran número de posibilidades de aplicación, establecidas en la industria, para los enzimas amilolíticos en los manuales tales como por ejemplo el libro "Industrial enyzmes and their applications" de H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998. La recopilación siguiente no deber ser considerada como una enumeración excluyente sino que representa una elección entre todas las posibilidades de aplicación teóricamente imaginables. Si se pusiese de manifiesto que algunas proteínas individuales según la invención fuesen adecuadas además para otras posibilidades de aplicación adicionales, no reivindicadas aquí expresamente, éstas quedarían incluidas con ello en el ámbito de protección de la presente invención.

Un campo de aplicación importante de los enzimas amilolíticos consiste en su empleo como componentes activos en los agentes de lavado o de limpieza para la limpieza de textiles o para superficies duras. En estas aplicaciones la actividad amilolítica sirve para disolver y para desprender del fondo de manera hidrolítica las impurezas hidrocarbonadas, especialmente similares a los almidones. En este caso pueden emplearse solas, en medios adecuados o incluso en agentes de lavado o de limpieza. Estos agentes se caracterizan porque los enzimas amilolíticos y los otros componentes tienen efecto sinérgico para la eliminación de las impurezas, por ejemplo por solubilización de los productos de hidrólisis de las proteínas amilolíticas por medio de otros componentes de los agentes tales como por ejemplo los tensioactivos. Una proteína según la invención puede encontrar aplicación tanto en medios para el consumo industrial o en aplicaciones industriales como también en productos para el consumo privado.

Así pues, representan un objeto propio de la invención todos los agentes de lavado o todos los agentes de limpieza que se caractericen porque contengan una proteína o derivado amilolítico según la invención.

Con ello quieren indicarse todos los tipos imaginables de agentes de limpieza, tanto concentrados como también agentes a ser empleados en estado no diluido; para el empleo a escala comercial, en las máquinas lavadoras o en el lavado a mano, o bien en el fregado a mano. A éstos pertenecen, por ejemplo, agentes de lavado para textiles, alfombras o fibras naturales, para los que se utiliza según la presente invención la denominación de agentes de lavado. A estos pertenecen, por ejemplo, también agentes para el fregado de la vajilla para el fregado a máquina de la vajilla o agentes para el fregado a mano de la vajilla o limpiadores para superficies duras tales como metales, vidrio, porcelana, cerámica, baldosines, piedra, superficies barnizadas, materiales sintéticos, madera o cuero; para tales se empleará según la presente invención la denominación de agentes de limpieza. Cualquier tipo de agente de limpieza representa una forma de realización de la presente invención en tanto en cuanto se enriquezca con una proteína según la invención.

Las formas de realización de la presente invención abarcan todas las formas de administración de los agentes según la invención establecidas según el estado de la técnica y/o convenientes. A éstas pertenecen, por ejemplo, los agentes sólidos, pulverulentos, líquidos, en forma de gel o pastosos, en caso dado incluso constituidos por varias fases, comprimidos o no comprimidos; además pertenecen por ejemplo a estos: cuerpos extruidos, granulados, tabletas o bolsitas, tanto en grandes envases como también envasados en porciones.

Además de un enzima según la invención, el agente según la invención contiene, en caso dado, otros componentes tales como tensioactivos, por ejemplo tensioactivos no iónicos, aniónicos y/o anfóteros, y/o agentes de blanqueo, y/o adyuvantes, así como en caso dado otros componentes usuales.

Como tensioactivos no iónicos se utilizan, preferentemente, alcoholes alcoxilados, ventajosamente etoxilados, especialmente primarios, con preferentemente de 8 a 18 átomos de carbono y, en promedio, de 1 a 12 moles de óxido de etileno (EO) por mol de alcohol, en los que el resto de alcohol puede ser lineal o preferentemente ramificado con metilo en posición 2 o puede contener restos lineales y ramificados con metilo mezclados, de la manera en que están presentes usualmente en los restos de oxoalcoholes. Sin embargo, se prefieren, especialmente, los etoxilatos de alcoholes con restos lineales, a partir de alcoholes de origen natural con de 12 a 18 átomos de carbono, por ejemplo de alcoholes grasos de coco, de palma, de sebo o alcohol oleico, y, en promedio, desde 2 hasta 8 EO por mol de alcohol. A los alcoholes etoxilados preferentes pertenecen, por ejemplo, los alcoholes con de 12 a 14 átomos de carbono con 3 EO o con 4 EO, los alcoholes con 9 a 11 átomos de carbono con 7 EO, los alcoholes con de 13 a 15 átomos de carbono con 3 EO, 5 EO, 7 EO u 8 EO, los alcoholes con de 12 a 18 átomos de carbono con 3 EO, 5 EO o 7 EO y mezclas de los mismos, tales como mezclas de alcoholes con de 12 a 14 átomos de carbono con 3 EO y alcoholes con de 12 a 18 átomos de carbono con 7 EO. Los grados de etoxilación indicados representan valores medios estadísticos, que, para un producto especialmente pueden ser un número entero o un número fraccionario. Los etoxilatos de alcohol preferentes presentan una distribución estrechada de homólogos (narrow range ethoxylates, NRE). Además de estos tensioactivos no iónicos pueden utilizarse también alcoholes grasos con más de 12 EO. Ejemplos a este respecto son alcoholes grasos de sebo con 14 EO, 25 EO, 30 EO o 40 EO.

Otra clase de tensioactivos no iónicos. preferentemente empleados, que se emplean bien como tensioactivo no iónico solo o bien en combinación con otros tensioactivos no iónicos, son ésteres de alquilo de ácidos grasos alcoxilados, preferentemente etoxilados o etoxilados y propoxilados, preferentemente con 1 hasta 4 átomos de carbono en la cadena de alquilo, especialmente los ésteres de metilo de los ácidos grasos.

Otra clase de tensioactivos no iónicos, que pueden ser empleados ventajosamente, son los alquilpoliglicósidos (APG). Los alquilpoliglicósidos empleables corresponden a la fórmula general RO(G)_{z}, en la que R significa un resto alifático, de cadena lineal o de cadena ramificada, especialmente ramificada con metilo en la posición 2, saturado o insaturado, con 8 hasta 22, preferentemente con 12 hasta 18 átomos de carbono, y G es el símbolo de una unidad de glicosa con 5 o 6 átomos de carbono, preferentemente significa glucosa. El grado z de glicosilación se encuentra en este caso, comprendido entre 1,0 y 4,0. Preferentemente se emplearán alquilpoliglucósidos lineales, es decir alquilpoliglicósidos, en los que el resto de poliglicol sea un resto de glucosa y el resto alquilo sea un resto n-alquilo.

También pueden ser adecuados los tensioactivos no iónicos del tipo de los óxidos de aminas, por ejemplo el óxido de N-cocoalquil-N,N-dimetilamina y el óxido de N-seboalquil-N,N-dihidroxietilamina, y de las alcanolamidas de los ácidos grasos. Preferentemente, la cantidad de estos tensioactivos no iónicos no es mayor que la de los alcoholes grasos etoxilados, especialmente no es mayor que la mitad de la misma.

Otros tensioactivos adecuados son amidas de los ácidos polihidroxigrasos de fórmula (II),

(II)R --- CO ---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R ^{1} }}

--- [Z]

en la que RCO significa un resto acilo alifático con 6 hasta 22 átomos de carbono, R^{1} significa hidrógeno, un resto alquilo o hidroxialquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono y [Z] significa un resto lineal o ramificado de polihidroxialquilo con 3 hasta 10 átomos de carbono y con 3 hasta 10 grupos hidroxilo. Las amidas de los ácidos polihidroxigrasos están constituidas por substancias conocidas, que usualmente pueden obtenerse por medio de la aminación reductora de un azúcar reductor con amoníaco, una alquilamina o una alcanolamina y acilación subsiguiente con un ácido graso, un éster de alquilo de ácido graso o con un cloruro de ácido graso.

Al grupo de las amidas de los ácidos polihidroxigrasos pertenecen, también, los compuestos de fórmula (III),

(III)--- R --- CO ---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R ^{1}  --- O --- R ^{2} }}

--- [Z]

en la que R es un resto alquilo o alquenilo, lineal o ramificado, con 7 hasta 12 átomos de carbono, R^{1} es un resto alquilo lineal, ramificado o cíclico, o un resto arilo, con 2 hasta 8 átomos de carbono, y R^{2} es un resto alquilo lineal, ramificado o cíclico, o un resto arilo o con un resto oxi-alquilo, con 1 hasta 8 átomos de carbono, siendo preferentes los restos alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono o los restos fenilo, y [Z] significa un resto lineal de polihidroxialquilo, cuya cadena alquilo está substituida por, al menos, dos grupos hidroxilo, o derivados alcoxilados, preferentemente etoxilados o propoxilados de este resto.

Preferentemente, [Z] se obtiene por medio de la aminación reductora de un azúcar reductor, por ejemplo glucosa, fructosa, maltosa, lactosa, galactosa, manosa o xilosa. Los compuestos substituidos por N-alcoxi o por N-ariloxi pueden transformarse en las amidas de los ácidos polihidroxigrasos, deseadas, mediante reacción con ésteres de metilo de ácidos grasos en presencia de un alcóxido a modo de catalizador.

Como tensioactivos aniónicos se utilizaron, por ejemplo, aquellos del tipo de los sulfonatos y sulfatos. En este caso entran en consideración como tensioactivos de tipo sulfonato, preferentemente, por ejemplo, alquilbencenosulfonatos con 9 a 13 átomos de carbono, sulfonatos de olefinas, es decir, mezclas de sulfonatos de alquenos e hidroxialcanos, así como disulfonatos, como los que se obtienen, por ejemplo, a partir de monoolefinas con de 12 a 18 átomos de carbono con doble enlace terminal o en el interior de la cadena, por medio de la sulfonación con trióxido de azufre gaseoso e hidrólisis alcalina o ácida, subsiguiente, de los productos de sulfonación. También son adecuados los alcanosulfonatos, que se obtienen, por ejemplo, a partir de alcanos con de 12 a 18 átomos de carbono por medio de la sulfocloración o de la sulfoxidación con hidrólisis o bien neutralización subsiguiente. También son adecuados los ésteres de los ácidos \alpha-sulfograsos (éstersulfonatos), por ejemplo los ésteres de metilo \alpha-sulfonados de los ácidos grasos de coco, de semilla de palma o sebo hidrogenados.

Otros tensioactivos aniónicos, adecuados, son los ésteres de glicerina de ácidos grasos, sulfitados. Por ésteres de glicerina y ácidos grasos se entienden los mono, di y triésteres, así como sus mezclas, tal como se obtienen en la producción por medio de esterificación de una monoglicerina con de 1 a 3 moles de ácido graso o en la transesterificación de triglicéridos con de 0,3 a 2 moles de glicerina. En este caso, los ésteres de glicerina de ácidos grasos, sulfitados, preferentes son los productos de sulfitación de ácidos grasos saturados con de 6 a 22 átomos de carbono, por ejemplo del ácido caprónico, del ácido del caprílico, del ácido caprínico, del ácido mirístico, del ácido láurico, del ácido palmítico, del ácido esteárico o del ácido behénico.

Como sulfatos de alqu(en)ilo son preferentes las sales alcalinas, y en especial las sales de sodio, de los semiésteres del ácido sulfúrico con alcoholes grasos con 12 a 18 átomos de carbono, de manera ejemplificativa a partir de alcoholes grasos de coco, de alcoholes grasos de sebo, de alcohol láurico, alcohol mirístico, alcohol cetílico o alcohol esteárico, o de oxoalcoholes con 10 a 20 átomos de carbono, y aquellos semiésteres de alcoholes secundarios con estas longitudes de cadena. Además, son preferentes sulfatos de alqu(en)ilo con las citadas longitudes de cadena, que contengan un resto alquilo de cadena lineal sintético, obtenido sobre base petroquímica Son preferentes, por interés de la tecnología del lavado, los sulfatos de alquilo con 12 a 16 átomos de carbono y los sulfatos de alquilo con 12 a 15 átomos de carbono, así como sulfatos de alquilo con 14 a 15 átomos de carbono. También son agentes tensioactivos aniónicos adecuados los sulfatos de 2,3-alquilo.

También son adecuados los monoésteres de ácido sulfúrico y los alcoholes etoxilados con 1 hasta 6 moles de óxido de etileno, de cadena lineal o de cadena ramificados, con de 7 a 21 átomos de carbono, tales como alcoholes con 9 a 11 átomos de carbono, 2-metil-ramificados, con un promedio de 3,5 moles de óxido de etileno (EO) o alcoholes grasos con de 12 a 18 átomos de carbono con de 1 a 4 EO. Debido a su marcado comportamiento espumante, éstos se utilizan en las composiciones de tensioactivos o bien en los agentes de limpieza únicamente en cantidades relativamente pequeñas, por ejemplo en cantidades desde un 1 hasta un 5% en peso.

Otros tensioactivos aniónicos, adecuados, son también las sales de los ácidos alquilsulfosuccínicos, que también se denominan también como sulfosuccinatos o como ésteres del ácido sulfosuccínico y que representan monoésteres y/o diésteres del ácido sulfosuccínico con alcoholes, preferentemente con alcoholes grasos y, especialmente, con alcoholes grasos etoxilados. Los sulfosuccinatos preferentes contienen restos de alcoholes grasos con de 8 a 18 átomos de carbono o mezclas de los mismos. Los sulfosuccinatos especialmente preferentes contienen un resto de alcohol graso, que se deriva de alcoholes grasos etoxilados, que, en sí mismos, representan tensioactivos no iónicos (para su descripción véase mas adelante). En este caso son especialmente preferentes, a su vez, los sulfosuccinatos, cuyos restos de alcohol graso se deriven de alcoholes grasos etoxilados con una distribución estrechada de homólogos. También es posible utilizar
un ácido alqu(en)ilsuccínico con, preferentemente, de 8 a 18 átomos de carbono en la cadena de alqu(en)ilo o sus sales.

Como otros tensioactivos aniónicos entran en consideración, especialmente, los jabones. Son adecuados los jabones de los ácidos grasos saturados, tales como las sales del ácido láurico, del ácido mirístico, del ácido palmítico, del ácido esteárico, del ácido erúcico hidrogenado y del ácido behénico, así como, especialmente, las mezclas de jabones derivadas de los ácidos grasos naturales, por ejemplo de los ácidos grasos de coco, de semilla de palma o de sebo.

Los tensioactivos aniónicos, inclusive los jabones, pueden estar presentes en forma de sus sales de sodio, de potasio o de amonio, así como en forma de sales solubles de bases orgánicas, como mono, di o trietanolamina. Preferentemente se presentan los tensioactivos aniónicos en forma de sus sales de sodio o de potasio, especialmente en forma de sus sales de sodio.

Los tensioactivos pueden estar contenidos en los agentes de limpieza y de lavado según la invención, en total en una cantidad desde, preferentemente, un 5% en peso hasta un 50% en peso, especialmente desde un 8% en peso hasta un 30% en peso, referido al agente acabado.

Los agentes según la invención pueden contener agentes de blanqueo. Entre los compuestos, que sirven como agente de blanqueo, que proporcionan H_{2}O_{2} en agua, tiene un significado especial el percarbonato sódico, el perborato sódico tetrahidrato y el perborato sódico monohidrato. Otros agentes de blanqueo empleables son, por ejemplo, los peroxipirofosfatos, los perhidratos de citrato, así como las sales perácidas que proporcionan H_{2}O_{2} o los perácidos, tales como los persulfatos o bien el ácido persulfúrico. También puede emplearse el peroxihidrato de urea percarbamida, que puede describirse por medio de la fórmula H_{2}N-CO-NH_{2}.H_{2}O_{2}. Especialmente en le caso en que se utilice el agente para la limpieza de superficies duras, por ejemplo en el caso del fregado a máquina de la vajilla, pueden contener, en caso deseado, también agentes de blanqueo del grupo de los agentes de blanqueo orgánicos, aún cuando su empleo es posible también en el caso de los agentes para el avado de los textiles. Los agentes orgánicos de blanqueo, típicos, son los peróxidos de diacilo, tal como, por ejemplo, el peróxido de dibenzoilo. Otros agentes de blanqueo orgánicos típicos son los peroxiácidos, mencionándose como ejemplos especialmente los alquilperoxiácidos y los arilperoxiácidos. Representantes preferidos son el ácido peroxibenzoico y sus derivados sustituidos en el anillo, tales como los ácidos alquilperoxibenzoicos, así como también pueden utilizarse el ácido peroxi-\alpha-naftoico y el monoperftalato de magnesio, los peroxiácidos alifáticos o sustituidos alifáticos, tales como el ácido peroxiláurico, el ácido peroxiesteárico, el ácido \varepsilon-ftalimidoperoxicaprónico (ácido ftaloiminoperoxihexanoico PAP), el ácido o-carboxibenzamidoperoxicaprónico, el ácido N-nonenilamidoperadípico y el N-nonenilamidopersuccinatos, y ácidos peroxidicarboxílicos alifáticos y aralifáticos, tales como el ácido 1,12-di-peroxicarboxílico, el ácido 1,9-diperoxiazelaico, el ácido diperoxisebácico, el ácido diperoxibrasílico, los ácidos diperoxiftálicos, el ácido 2-decildiperoxibutano-1,4-dioico, el ácido N,N-tereftaloil-di(6-antinopercaprónico).

El contenido de los agentes en agentes de blanqueo puede encontrarse comprendido entre un 1 y un 40% en peso y, especialmente, entre un 10 y un 20% en peso, empleándose, preferentemente, el monohidrato de perborato o el percarbonato. Se ha descrito un empleo sinérgico de amilasas con percarbonato o de amilasas con ácido percarbónico en la solicitud WO 99/63036, o bien WO 99/63037.

Para conseguir un efecto de blanqueo mejorado, cuando se lave a temperaturas de 60ºC y por debajo de este valor, y, especialmente, en el caso del tratamiento previo de la colada, los agentes pueden contener también activadores de blanqueo. Como activadores de blanqueo pueden emplearse compuestos que formen ácidos peroxocarboxílicos alifáticos bajo las condiciones de perhidrólisis con, preferentemente, 1 hasta 10 átomos de carbono, especialmente con 2 hasta 4 átomos de carbono y/o ácidos perbenzoicos en caso dado substituidos. Son adecuadas substancias que porten grupos O- y/o N-acilo, con el número de átomos de carbono citado y/o grupos benzoilo en caso dado substituidos. Son preferentes las alquilendiaminas poliaciladas, especialmente la tetraacetiletilendiamina (TAED), los derivados acilados de triazina, especialmente la 1,5-diacetil-2,4-dioxohexahidro-1,3,5-triazina (DADHT), los glicolurilos acilados, especialmente el tetraacetilglicolurilo (TAGU), las N-acilimidas, especialmente la N-nonanoilsuccinimida (NOSI), los fenolsulfonatos acilados, especialmente el n-nonanoil- o el isononanoilbencenosulfonato (n- o bien iso-NOBS), los anhídridos de los ácidos carboxílicos, especialmente el anhídrido del ácido ftálico, los alcoholes polivalentes acilados, especialmente la triacetina, el diacetato de etilenglicol, el 2,5-diacetoxi-2,5-dihidrofurano y los enolésteres, conocidos por las solicitudes alemanas DE 196 16 693 y DE 196 16 767 así como el sorbitol y el manitol acetilados o bien sus mezclas descritas en la solicitud de patente europea EP 0 525 239 (SORMAN), los derivados sacáricos acilados, especialmente la pentaacetilglucosa (PAG), la pentaacetilfructosa, la tetraacetilxilosa y la octaacetillactosa así como la glucamina acetilada, en caso dado N-alquilada y la gluconolactona, y/o las lactamas N-aciladas, por ejemplo la N-benzoilcaprolactama, que se conocen por las solicitudes de patente internacionales WO-A-94/27970, WO-A-94/28102, WO-A-94/28103, WO-A-95/00626, WO-A-95/14759 y WO-A-95/17498. Los acilacetales substituidos hidrófilos, conocidos por la solicitud de patente alemana DE 196 16 769 y las acillactamas, descritas en la solicitud de patente alemana DE 196 16 770 así como en la solicitud de patente internacional WO 95/14075, se emplearán también de manera preferente. También pueden emplearse las combinaciones de los activadores de blanqueo convencionales, conocidos por la solicitud de patente alemana DE 44 43 177. Del mismo modo pueden emplearse derivados de nitrilo tales como cianopiridinas, nitrilquats, por ejemplo N-alquilamonioacetonitrilo y/o derivados de cianoamida. Los activadores de blanqueo preferentes son el 4-(octanoiloxi)-bencenosulfato de sodio, el oxibencenosulfato de n-nonanoilo o de isononanoilo (n- o bien iso-NOBS), oxibencenosulfonato de undecenoilo (UDOBS), dodecanoiloxibencenosulfonato de sodio (DOBS), el ácido decanoiloxibenzoico (DOBA, OBC 10) y/o el oxibencenosulfonato de dodecanoilo (OBS 12), así como el N-metilmorfolinio-acetonitrilo (MMA). Tales activadores de blanqueo pueden estar contenidos dentro de intervalos cuantitativos usuales desde un 0,01 hasta un 20% en peso, preferentemente en cantidades desde un 0,1 hasta
un 15% en peso, especialmente desde un 1% en peso hasta 10% en peso, referido al conjunto de la composición.

Además de los activadores de blanqueo convencionales, o en su lugar, pueden estar contenidos, también, los denominados catalizadores de blanqueo. Estos productos están constituidos por sales de metales de transición, o bien complejos de metales de transición o bien complejos de metales de transición, que refuerzan el blanqueo, tales como, por ejemplo, complejos de sales o complejos de carbonilo de Mn, Fe, Co, Ru o Mo. También pueden emplearse como catalizadores de blanqueo los complejos de Mn, Fe, Co, Ru, Mo, Ti, V y Cu, con ligandos trípode, nitrogenados, así como complejos amínicos de Co, Fe, Cu y Ru, empleándose, preferentemente, aquellos compuestos que han sido descritos en la publicación DE 197 09 284 A1. También so capaces de desarrollar un efecto activador del blanqueo los derivados de acetonitrilo, según la publicación WO 99/63038, y los compuestos de los complejos de los metales de transición, según la publicación WO 99/63041, en combinación con amilasas.

Los agentes según la invención contienen, por regla general, uno o varios adyuvantes, especialmente zeolitas, silicatos, carbonatos, coadyuvantes orgánicos y -cuando no existan motivos ecológicos contra su empleo- también fosfatos. Estos últimos son productos estructurantes a ser empleados preferentemente en los agentes de limpieza para el fregado a máquina de la vajilla.

En este caso deben citarse los silicatos de sodio cristalinos, estratificados, de la fórmula general NaMSi_{x}O_{2x+1}\cdotH_{2}O, en la que M significa sodio o hidrógeno, x es un número de 1,6 a 4, preferentemente de 1,9 a 4,0 e y es un número de 0 a 20, y los valores preferentes para x son 2, 3 o 4. Tales silicatos cristalinos estratificados se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 0 164 514. Los silicatos estratificados cristalinos, preferentes, de la fórmula indicada, son aquellos en los cuales M es sodio y x toma los valores 2 o 3. Especialmente se prefieren tanto los b como también los \delta-disilicatos de sodio Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O. En el comercio se encuentran tales compuestos, por ejemplo, bajo la denominación SKS® (firma Clariant). De este modo el SKS-6® está constituido, preponderantemente por un \delta-disilicato de sodio de la fórmula Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O, el SKS-7® está constituido, preponderantemente, por el \beta-disilicato de sodio. Mediante reacción con ácidos (por ejemplo ácido cítrico o ácido carbónico) se forma, a partir del \delta-disilicato de sodio, la canemita NaHSi_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O, que se encuentra en el comercio bajo las denominaciones SKS-9® o bien SKS-10® (firma Clariant). También puede ser ventajoso emplear modificaciones químicas de estos silicatos estratificados. De este modo puede influenciarse adecuadamente por ejemplo la alcalinidad de los silicatos estratificados. Los silicatos estratificados dopados con fosfato o bien con carbonato presentan, en comparación con el \delta-disilicato de sodio, morfologías cristalinas modificadas, se disuelven más rápidamente y presentan, en comparación con el \delta-disilicato de sodio, una mayor capacidad enlazante del calcio. De este modo se han descrito silicatos estratificados de la fórmula cuantitativa general x Na_{2}O \cdot y SiO_{2} \cdot z P O_{5}, en la que la relación entre x e y corresponde a un número desde 0,35 hasta 0,6, la proporción entre x y z corresponde a un número desde 1,75 hasta 1.200 y la proporción entre i y z corresponde a un número desde 4 hasta 2.800, en la solicitud de patente DE 19601 063. La solubilidad de los silicatos estratificados puede aumentarse también si se emplean silicatos estratificados finamente divididos, de manera especial. También pueden emplearse mixturas constituidas por silicatos estratificados cristalinos con otros componentes. En este caso deben citarse especialmente mixturas con derivados de la celulosa, que presentan ventajas en cuanto al efecto desintegrante y que se emplean especialmente en las tabletas de los agentes de lavado, así como mixturas con policarboxilatos, por ejemplo ácido cítrico, o bien policarboxilatos polímeros, por ejemplo copolímeros del ácido acrílico.

También pueden utilizarse los silicatos amorfos de sodio con un módulo Na_{2}O:SiO_{2} de 1:2 a 1:3,3, preferentemente de 1:2 a 1:2,8 y especialmente de 1:2 a 1:2,6, que sean de disolución retardada y que presenten propiedades secundarias de lavado. En este caso, el retardo en la disolución, frente a los silicatos de sodio amorfos tradicionales, puede haber sido producido de diferentes maneras, por ejemplo por medio del tratamiento superficial, el amasado, la compactación / compresión o por medio de un sobresecado. En el ámbito de la presente invención, se entenderá por la expresión "amorfo" también "amorfo para los rayos X". Esto significa que los silicatos, en el caso de experimentos de difracción de rayos X, no proporcionan reflexiones nítidas de los rayos X, como las que son típicas para las substancias cristalinas, sino que, a lo sumo, presentan uno o varios máximos de la radiación de rayos X dispersada, que presentan una anchura del ángulo de difracción de varias unidades de grados. Sin embargo, pueden conseguirse, incluso muy bien, buenas propiedades de adyuvante, si las partículas de silicato proporcionan máximos de difracción poco claros o incluso nítidos en los experimentos de la difracción electrónica. Esto debe interpretarse de tal manera, que los productos microcristalinos presentan zonas con un tamaño desde 10 hasta algunos cientos de nm, siendo preferentes los valores hasta un máximo de 50 nm y especialmente de hasta un máximo de 20 nm. Son especialmente preferentes los silicatos amorfos compactados/comprimidos, los silicatos amorfos amasados y los silicatos amorfos a los rayos X, sobresecados.

Una zeolita finamente cristalina, sintética y que contiene agua enlazada, empleable en caso dado, es, preferentemente, la zeolita A y/o P. Como zeolita P será especialmente preferente la zeolita MAP® (producto comercial de la firma Crosfield). Sin embargo, también es adecuada la zeolita X, así como las mezclas de A, X y/o P. Un producto que puede obtenerse comercialmente y utilizarse preferentemente en el ámbito de la presente invención, es también, por ejemplo, un producto cocristalizado de zeolita X y de zeolita A (aproximadamente 80% en peso de zeolita X), comercializado por la firma CONDEA Augusta S.p.A. bajo el nombre comercial VEGOBOND AX®, y que puede describirse por medio de la fórmula

nNa_{2}O\cdot(1-n)K_{2}O\cdot Al_{2}O_{3}\cdot(2 - 2,5)SiO_{2}\cdot(3,5 - 5,5) H_{2}O.

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Las zeolitas adecuadas presentan un tamaño medio de partícula menor que 10 \mum (distribución de volumen; método de medición: Coulter Counter) y contienen preferentemente del 18 al 22% en peso, especialmente del 20 al 22% en peso de agua enlazada.

Evidentemente, también es posible el uso de los fosfatos conocidos en general como substancias adyuvantes, en tanto en cuanto una utilización de este tipo no deba ser evitada por motivos ecológicos. Entre la gran cantidad de fosfatos que pueden adquirirse comercialmente, en la industria de los agentes de lavado y los agentes de limpieza tienen la mayor importancia los fosfatos de metales alcalinos, prefiriéndose especialmente el trifosfato pentasódico o el trifosfato pentapotásico (tripolifosfato de sodio o bien de potasio).

Los fosfatos de los metales alcalinos representan en este caso una denominación general para las sales de los metales alcalinos (especialmente de sodio y de potasio) de los diversos ácidos fosfóricos, en los que se puede distinguir entre los ácido metafosfórico (HPO_{3})_{n} y ácido ortofosfórico H_{3}PO_{4} además de representantes de mayor peso molecular. Los fosfatos reúnen en este caso varias ventajas: éstos actúan como portadores de álcali, impiden los recubrimientos de cal y contribuyen además a las prestaciones de limpieza.

El dihidrógenofosfato de sodio, NaH_{2}PO_{4}, existe como dihidrato (densidad 1,91 gcm^{-3}, punto de fusión 60º) y a modo de monohidrato (densidad 2,04 gcm^{-3}). Ambas sales son polvos blancos que se disuelven muy fácilmente en agua, que pierden en agua de cristalización por calentamiento y que se transforman a 200º en el difosfato débilmente ácido (hidrógenodifosfato disódico, Na_{2}H_{2}P_{2}O_{7}), a temperaturas mayores se convierten en el trimetafosfato de sodio (Na_{3}P_{3}O_{9}) y en sal de Maddrell (véase más adelante). El NaH_{2}PO_{4} tiene reacción ácida; se forma cuando se ajusta el ácido fosfórico a un valor del pH de 4,5 con lejía de hidróxido de sodio y se pulveriza el caldo. El dihidrógenofosfato de potasio (fosfato de potasio primario o monobásico, bifosfato de potasio, KDP), KH_{2}PO_{4} es una sal blanca con una densidad de 2,33 gcm^{-3}, tiene un punto de fusión de 253º [descomposición con formación de polifosfato de potasio (KPO_{3})_{x}] y se disuelve fácilmente en agua.

El hidrógenofosfato disódico (fosfato de sodio secundario), Na_{2}HPO_{4}, es una sal cristalina, incolora, que se disuelve muy fácilmente en agua. Existe en estado anidio y con 2 moles (densidad 2,066 gcm^{-3}, pérdida de agua a 95º), con 7 moles (densidad 1,68 gcm^{-3}, punto de fusión 48º con pérdida de 5 H_{2}O) y con 12 moles de agua (densidad 1,52 gcm^{-3}, punto de fusión 35º) con pérdida de 5 H_{2}O), a 100º se vuelve anhidra y se transforma por fuerte calentamiento en el difosfato Na_{4}P_{2}O_{7}. El hidrógenofosfato disódico se prepara mediante neutralización de ácido fosfórico con solución de carbonato de sodio con empleo de fenolftaleína como indicador. El hidrógenofosfato dipotásico (fosfato potásico secundario o bien dibásico), K_{2}HPO_{4}, es una sal blanca, amorfa, que se disuelve fácilmente en agua.

El fosfato trisódico, fosfato sódico terciario, Na_{3}PO_{4} está formado por cristales incoloros, que presentan a modo de dodecahidrato una densidad de 1,62 gcm^{-3} y un punto de fusión de 73-76º (descomposición), en forma de decahidrato (lo que corresponde a un 19-20% de P_{2}O_{5}) presentan un punto de fusión de 100º y en forma anhidra (lo que corresponde a un 39-40% de P_{2}O_{5}) presentan una densidad de 2,536 gcm^{-3}. El fosfato trisódico es fácilmente soluble en agua con reacción alcalina y se prepara mediante concentración por evaporación de una solución constituida exactamente por 1 mol de fosfato disódico y 1 mol de NaOH. El fosfato tripotásico (fosfato potásico terciario o tribásico), K_{3}PO_{4}, es un polvo granular blanco, esparcible con una densidad de 2,56 gcm^{-3}, tiene un punto de fusión de 1.340º y es fácilmente soluble en agua con reacción alcalina. Se forma, por ejemplo, por calentamiento de las escorias del procedimiento Thomas con carbón y con sulfato de potasio. A pesar de su precio mayor son preferentes muchas veces en la industria de los agentes de limpieza los fosfatos de potasio que se disuelven más fácilmente y que por lo tanto tienen mayor actividad, frente a los correspondientes compuestos de sodio.

El difosfato tetrasódico (pirofosfato de sodio), Na_{4}P_{2}O_{7}, existe en forma anhidra (densidad 2,534 gcm^{-3}, punto de fusión 988º, también se ha dado el valor de 880º) y como decahidrato (densidad 1,815-1,836 gcm^{-3}, punto de fusión 94º con pérdida de agua). Ambas substancias son cristales incoloros, solubles en agua con reacción alcalina. El Na_{4}P_{2}O_{7} se forma por calentamiento del fosfato disódico a > 200º o por reacción del ácido fosfórico con carbonato de sodio en proporciones estequiométricas y deshidratación de la solución mediante pulverización. El decahidrato forma complejos con sales de metales pesados y con formadores de la dureza y reduce por lo tanto la dureza del agua. El difosfato de potasio (pirofosfato de potasio), K_{4}P_{2}O_{7}, existe en forma del trihidrato y representa un polvo incoloro, higroscópico con una densidad de 2,33 gcm^{-3}, que es soluble en agua, siendo el valor del pH de la solución al 1%, a 25º, de 10,4.

Mediante condensación del NaH_{2}PO_{4} o bien del KH_{2}PO_{4} se forman fosfatos de sodio y de potasio de elevada molecularidad, en los cuales pueden distinguirse representantes cíclicos, los metofosfatos de sodio o bien de potasio o tipos en forma de cadena, los polifosfatos de sodio o bien de potasio. Especialmente para estos últimos se utiliza un gran número de denominaciones: fosfato de fusión o de calcinación, sal de Graham, sal de Kurrol y de Maddrell. Todos los fosfatos de sodio y de potasio superiores se denominan conjuntamente como fosfatos condensados.

El trifosfato pentasódico importante industrialmente, Na_{5}P_{3}O_{10} (tripolifosfato sódico), es una sal anhidra o cristalizada con 6 H_{2}O, no higroscópica, blanca, soluble en agua, de la fórmula general NaO-[P(O)(ONa)-O]_{n}-Na con n=3. A temperatura ambiente se disuelven en 100 g de agua aproximadamente 17 g, a 60º aproximadamente 20 g, a 100º aproximadamente 32 g de la sal exenta de agua de cristalización; al cabo de un calentamiento de 2 horas de la solución a 100º se forma, mediante hidrólisis, aproximadamente un 8% de ortofosfato y un 15% de difosfato. En la obtención del trifosfato pentasódico se hace reaccionar el ácido fosfórico con solución de carbonato de sodio o con lejía de hidróxido de sodio en proporciones estequiométricas y la disolución se deshidrata mediante pulverización. De manera similar a la de la sal de Graham y como el difosfato sódico, el trifosfato pentasódico disuelve muchos compuestos metálicos insolubles (también jabones de cal, etc.). El trifosfato pentapotásico, K_{5}P_{3}O_{10} (polifosfato de potasio), se encuentra en el comercio por ejemplo en forma de una solución al 50% en peso (> 23% de P_{2}O_{5}, 25% de K_{2}O). El polifosfato de potasio encuentra una amplia aplicación en la industria de los agentes de lavado y de limpieza. Además, también existen los tripolifosfatos de sodio y potasio, que también pueden utilizarse en el marco de la presente invención. Estos se producen, por ejemplo, cuando se hidroliza el trimetafosfato de sodio con KOH:

(NaPO_{3})_{3} + 2 \ KOH \rightarrow Na_{3}K_{2}P_{3}O_{10} + H_{2}O

Éstos pueden utilizarse, al igual que tripolifosfato de sodio, el tripolifosfato de potasio o las mezclas de estos dos; también pueden utilizarse según la invención las mezclas de tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de sodio y potasio o mezclas de tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio y potasio o mezclas de tripolifosfato de sodio y tripolifosfato de potasio y tripolifosfato de sodio y potasio.

En los agentes para le fregado a máquina de la vajilla, según la invención, pueden emplearse como coadyuvantes orgánicos especialmente policarboxilatos / ácidos policarboxílicos, policarboxilatos polímeros, ácido asparagínico, poliacetales, dextrinas, otros coadyuvantes orgánicos (véase lo expuesto más abajo), así como fosfonatos. Estas clases de substancias se describen a continuación.

Las substancias adyuvantes orgánicas adecuadas son, por ejemplo, los ácidos policarboxílicos que pueden utilizarse en forma de sus sales de sodio, entendiéndose por ácidos policarboxílicos aquellos ácidos carboxílicos que llevan más de una función ácida. Estos son, por ejemplo, el ácido cítrico, ácido adípico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido fumárico, ácidos sacáricos, ácidos aminocarboxílicos, ácido nitrilotriacético (NTA), siempre que este tipo de uso no pueda rechazarse por motivos ecológicos, así como mezclas de los mismos. Las sales preferentes son las sales de los ácidos policarboxílicos, tales como ácido cítrico, ácido adípico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido tartárico, ácidos sacáricos y mezclas de las mismas.

También pueden utilizarse los ácidos propiamente dichos. Además de su efecto de adyuvante, los ácidos tienen también típicamente la propiedad de un componente de acidificación y, con ello, sirven también para el ajuste de un valor de pH bajo y suave de los detergentes y agentes de limpieza. Aquí deben nombrarse especialmente el ácido cítrico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido glucónico y cualquier mezcla de éstos. Del mismo modo pueden servir como reguladores del pH los ácidos minerales, especialmente el ácido sulfúrico o las bases, especialmente el hidróxido de amonio o los hidróxidos alcalinos. Tales reguladores están contenidos en los agentes, según la invención, en cantidades, preferentemente, no mayores que el 20% en peso, especialmente desde un 1,2% en peso hasta un 17% en peso.

Como adyuvante son adecuados otros policarboxilatos polímeros, siendo estos son, por ejemplo, las sales de los metales alcalinos del ácido poliacrílico o del ácido polimetacrílico, por ejemplo aquellas con un peso molecular relativo de 500 a 70.000 g/mol.

En cuanto a los pesos moleculares, indicados para los policarboxilatos polímeros, se trata, en el sentido de esta publicación, de pesos moleculares M_{w} promedios en peso de la forma respectiva del ácido, que se determinaron básicamente mediante la cromatografía de permeación en gel (GPC), para lo cual se utilizó un detector de rayos UV. A este respecto, la medición se realizó frente a un patrón externo de ácido poliacrílico, que proporciona valores de peso molecular similares a los reales, debido a su afinidad estructural con los polímeros analizados. Estos datos difieren marcadamente de los datos de pesos moleculares para los cuales se utiliza un patrón ácidos poliestirenosulfónicos. Los pesos moleculares medidos frente a los ácidos poliestirenosulfónicos son, en general, marcadamente más altos que los pesos moleculares indicados en este documento.

Los polímeros adecuados son, especialmente, los poliacrilatos, que presentan preferentemente un peso molecular desde 2.000 hasta 20.000 g/mol. Debido a su mayor solubilidad, pueden ser preferentes, entre este grupo, a su vez los poliacrilatos de cadena corta, que presentan pesos moleculares desde 2.000 hasta 10.000 g/mol, y de forma especialmente preferente desde 3.000 hasta 5.000 g/mol.

Además, son adecuados los policarboxilatos copolímeros, especialmente aquellos del ácido acrílico con ácido metacrílico y del ácido acrílico o el ácido metacrílico con ácido maleico. Han demostrado ser especialmente adecuados los copolímeros del ácido acrílico con ácido maleico, que contienen del 50 al 90% de ácido acrílico y del 50 al 10% de ácido maleico. Su peso molecular relativo, referido al ácido libre, es desde 2.000 hasta 70.000 g/mol, preferentemente desde 20000 hasta 50000 g/mol y especialmente desde 30.000 hasta 40.000 g/mol. Los policarboxilatos (co)polímeros pueden utilizarse o bien como polvo o bien como solución acuosa. El contenido de los agentes en policarboxilatos (co)polímeros puede encontrarse entre un 0,5 hasta un 20% en peso, especialmente desde un 1 hasta un 10% en
peso.

Para mejorar la solubilidad, los polímeros pueden contener también ácidos alilsulfónicos como monómeros, como por ejemplo ácido aliloxibencenosulfónico y ácido metalilsulfónico.

También son especialmente preferentes los polímeros biodegradables constituidos por más de dos unidades de monómeros diferentes, por ejemplo aquellos que contienen como monómeros, sales del ácido acrílico y del ácido maleico, así como alcohol vinílico o derivados del alcohol vinílico, o contienen como monómeros, sales del ácido acrílico y del ácido 2-alquilalilsulfónico, así como derivados del azúcar.

Otros copolímeros preferentes son aquellos que presentan como monómeros preferentemente acroleína y ácido acrílico / sales de ácido acrílico o bien acroleína y acetato de vinilo.

También deben mencionarse, como otras substancias adyuvantes preferentes, los ácidos aminodicarboxílicos polímeros, sus sales o sus substancias precursoras. Siendo especialmente preferentes los ácidos poliasparagínicos o bien sus sales y derivados.

Otras substancias adyuvantes, adecuadas, son los poliacetales, que pueden obtenerse por reacción de dialdehídos con ácidos policarboxílicos, que presenten desde 5 hasta 7 átomos de carbono y al menos 3 grupos hidroxilo. Los poliacetales preferentes se obtienen a partir de dialdehídos, tales como el glioxal, el glutaraldehído, el tereftalaldehído, así como a partir de sus mezclas y a partir de los ácidos poliolcarboxílicos, tales como el ácido glucónico y/o el ácido glucoheptónico.

Otras substancias adyuvantes orgánicas, adecuadas, son las dextrinas, por ejemplo los oligómeros o bien los polímeros de los hidratos de carbono, que pueden obtenerse por hidrólisis parcial de los almidones. La hidrólisis puede realizarse según procedimientos usuales, por ejemplo catalizados con ácidos o con enzimas. Preferentemente se trata de productos de hidrólisis con pesos moleculares medios en el intervalo desde 400 hasta 500.000 g/mol. En este caso, es preferente un polisacárido con un equivalente de dextrosa (DE) en el intervalo desde 0,5 hasta 40, especialmente desde 2 hasta 30, siendo el valor DE una medida usual del efecto reductor de un polisacárido en comparación con la dextrosa, que tiene un valor DE de 100. Pueden emplearse tanto las maltodextrinas, con un valor DE comprendido entre 3 y 20 y los jarabes secos de glucosa con un valor DE comprendido entre 20 y 37, así como, también, las denominadas dextrinas amarillas y dextrinas blancas con pesos moleculares mas elevados, en el intervalo desde 2.000 hasta 30.000 g/mol.

En cuanto a los derivados oxidados de este tipo de dextrinas, se trata de sus productos de reacción con agentes oxidantes, que son capaces de oxidar, al menos, una función alcohólica del anillo del sacárido para dar una función de ácido carboxílico. Los adyuvantes orgánicos especialmente preferentes para los agentes según la invención son almidones oxidados o bien sus derivados descritos en las solicitudes EP 472 042, WO 97/25399 y EP 755 944.

También son otros coadyuvantes adecuados, los oxidisuccinatos y otros derivados de los disuccinatos, preferentemente etilendiaminodisuccinato. En este caso se empleará el ácido N,N'-etilendiamino-N,N-disuccínico (EDDS), preferentemente en forma de sus sales de sodio o magnesio. En este contexto son preferentes, además, los disuccinatos de glicerina y los trisuccinatos de glicerina. Las cantidades de aplicación, adecuadas, son desde un 3 hasta un 15% en peso, en formulaciones, que contienen zeolita y/o que contienen silicato.

Otros adyuvantes orgánicos adecuados son, por ejemplo, los ácidos hidroxicarboxílicos acetilados o bien sus sales, que, en caso dado, también pueden estar presentes en forma de lactona y que contienen, al menos, 4 átomos de carbono y, al menos, un grupo hidroxilo, así como, como máximo, dos grupos ácidos.

Otra clase de substancias con propiedades coadyuvantes son los fosfonatos. En este caso se trata, especialmente, de fosfonatos de hidroxialcano o bien de aminoalcano. Entre los fosfonatos de hidroxialcano, tiene un significado especial el 1,1-difosfonato de 1-hidroxietano (HEDP) como coadyuvante. Se utilizará preferentemente como sal de sodio, teniendo la sal disódica una reactividad neutra y la sal tetrasódica una reactividad alcalina (pH 9). Como fosfonatos de aminoalcano entran en consideración, preferentemente, el fosfonato de etilendiaminotetrametileno (EDTMP), el fosfonato de dietilentriaminopentametileno (DTPMP), así como sus homólogos superiores. Preferentemente se utilizarán en forma de las sales de sodio de reactividad neutra, por ejemplo como la sal hexasódica del EDTMP o bien como sal heptasódica y octasódica del DTPMP. En este caso se empleará, preferentemente, el HEDP entre la clase de los fosfonatos. Además, los fosfonatos de aminoalcano tienen una marcada capacidad enlazante con los metales pesados. Por lo tanto puede ser preferente emplear fosfonatos de aminoalcano, especialmente el DTPMP, o mezclas de los fosfonatos mencionados.

Además, pueden emplearse como coadyuvantes todos los compuestos capaces de formar complejos con iones alcalinotérreos.

Las substancias adyuvantes pueden estar contenidas en los agentes según la invención en caso dado en cantidades de hasta un 90% en peso. Éstas están contenidas, preferentemente, en cantidades de hasta un 75% en peso. Los agentes de lavado según la invención presentan contenidos en adyuvantes especialmente desde un 5% en peso hasta un 50% en peso. En los agentes según la invención para la limpieza de superficies duras, especialmente para la limpieza a máquina de la vajilla, el contenido en substancias adyuvantes supone, especialmente, desde un 5% en peso hasta un 88% en peso, sin que se utilicen en tales agentes preferentemente materiales adyuvantes insolubles en agua. En una forma preferente de realización, los agentes según la invención para la limpieza mecánica de la vajilla contienen desde un 20% en peso hasta un 40% en peso de adyuvantes orgánicos solubles en agua, especialmente citratos alcalinos, desde un 5% en peso hasta un 15% en peso de carbonatos alcalinos y desde un 20% en peso hasta un 40% en peso de disilicatos alcalinos.

Los disolventes, que pueden ser empleados en las combinaciones líquidas hasta en forma de gel de los agentes de lavado y de limpieza, proceden, de manera ejemplificativa, del grupo de alcoholes monovalentes o polivalentes, de las alcanolaminas o de los glicoléteres, en tanto en cuanto éstos sean miscibles con agua en el intervalo de concentración indicado. Preferentemente se seleccionan los disolventes entre el etanol, el n- o i-propanol, los butanoles, el glicol, el propanodiol o el butanodiol, la glicerina, el diglicol, el propildiglicol o el butildiglicol, el etilenglicolmetiléter, el etilenglicoletiléter, el etilenglicolpropiléter, el etilenglicolmono-n-butiléter, el dietilenglicol-metiléter, el dietilenglicoletiléter, el propilenglicolmetil-, -etil- o -propil-éter, el dipropilenglicolmonometil- o -etiléter, el metoxi-, etoxi- o butoxitriglicol, el 1-butoxietoxi-2-propanol, el 3-metil-3-metoxibutanol, el propilen-glicol-t-butiléter, así como mezclas de estos disolventes.

Los disolventes pueden emplearse en los agentes de lavado y de limpieza líquidos hasta en forma de gel, según la invención, en cantidades comprendidas entre un 0,1 y un 20% en peso, preferentemente sin embargo por debajo del 15% en peso, y especialmente por debajo del 10% en peso.

Para el ajuste de la viscosidad pueden añadirse a las composiciones, según la invención, uno o varios espesantes, o bien sistemas espesantes. Estos productos de elevado peso molecular, que se denominan también agentes de hinchamiento, absorben la mayoría de las veces los líquidos y se hinchan para, finalmente, transformarse en soluciones viscosas reales o en soluciones coloidales.

Los espesantes adecuados son compuestos inorgánicos u orgánicos polímeros. A los espesantes inorgánicos pertenecen, por ejemplo, los ácidos polisilícicos, los minerales de arcilla tales como montmorillonita, zeolitas, ácidos silícicos y bentonitas. Los espesantes orgánicos proceden de los grupos de los polímeros naturales, de los polímeros naturales modificados y de los polímeros completamente sintéticos. Los polímeros que proceden de la naturaleza son por ejemplo, el agar-agar, el carrageno, el tragacanto, la goma arábiga, los alginatos, las pectinas, las poliosas, el harina de guar, el harina de algarroba, los almidones, las dextrinas, las gelatinas y las caseínas. Los productos naturales modificados, que se emplean como espesantes, proceden ante todo del grupo de los almidones y de las celulosas modificadas. De manera ejemplificativa pueden citarse en este caso la carboximetilcelulosa y otros éteres de celulosa, la hidroxietil- y -propilcelulosa así como éteres de flor de harina. Los espesantes completamente sintéticos son polímeros tales como compuestos de poliacrilato y de polimetacrilato, polímeros vinílicos, ácidos policarboxílicos, poliéteres, poliiminas, poliamidas y poliuretanos.

Los espesantes pueden estar contenidos en cantidades de hasta un 5% en peso, preferentemente desde un 0,05 hasta un 2% en peso y, de forma especialmente preferente, desde un 0,1 hasta un 1,5% en peso, referido a la composición acabada.

Los agentes de lavado y de limpieza según la invención pueden contener en caso dado a modo de otros componentes usuales, agentes secuestrantes, electrolitos y otros productos auxiliares tales como abrillantadores ópticos, inhibidores del agrisado, inhibidores de la corrosión de la plata, inhibidores del corrido de los colores, inhibidores de la espuma, productos abrasivos, colorantes y/o productos odorizantes, así como productos activos microbianos y/o absorbedores de los UV.

Los agentes para el lavado de los textiles, según la invención, pueden contener abrillantadores ópticos del tipo de los derivados del ácido diaminoestilbendisulfónico o bien de sus sales de metales alcalinos. Son adecuadas por ejemplo, sales del ácido 4,4'-bis(2-anilino-4-morfolino-1,3,5-triazinil-6-amino)estilben-2,2'-disulfónico o compuestos de constitución similar, que porten, el lugar del grupo morfolino, un grupo dietanolamino, un grupo metilamino, un grupo anilino o un grupo 2-metoxietilamino. Además pueden estar presentes abrillantadores del tipo de los difenilestirilos substituidos, por ejemplo las sales alcalinas del 4,4'-bis(2-sulfoestiril)-difenilo, del 4,4'-bis(4-cloro-3-sulfoestiril)-difenilo, o del 4-(4-cloroestiril)-4'-(2-sulfoestiril)-di-fenilo. También pueden emplearse mezclas de los abrillantadores anteriormente citados.

Los inhibidores del agrisado tienen como cometido mantener en suspensión en el baño la suciedad desprendida de las fibras y, de este modo, impedir su agrisado. Para ello son adecuados coloides solubles en agua, la mayoría de las veces de naturaleza orgánica, por ejemplo las sales solubles en agua de los ácidos carboxílicos polímeros, colas, gelatinas, sales de los ácidos etercarboxílicos o de los ácidos etersulfónicos de los almidones o de la celulosa o sales de ésteres ácidos del ácido sulfúrico de la celulosa o de los almidones. También son adecuadas para esta finalidad poliamidas que contienen grupos ácidos, solubles en agua. Además pueden emplearse preparados solubles del almidón y otros productos del almidón diferentes de los anteriormente indicados, por ejemplo almidones degradados, aldehídoalmidones, etc. También puede emplearse la polivinilpirrolidona. Preferentemente se emplearán, sin embargo, éteres de celulosa tales como carboximetilcelulosa (sal de Na), metilcelulosa, hidroxialquilcelulosa y éteres mixtos, tales como metilhidroxietilcelulosa, metilhidroxipropilcelulosa, metilcarboximetilcelulosa y sus mezclas, así como polivinilpirrolidona por ejemplo en cantidades desde 0,1 hasta 5% en peso, referido a los agentes.

Con objeto de provocar una protección contra la corrosión de la plata, pueden emplearse en los agentes de limpieza según la invención para la vajilla inhibidores de la corrosión de la plata. Éstos son conocidos por el estado de la técnica, por ejemplo benzotriazoles, cloruro férrico(III) o CoSO_{4}. Tal como se conoce, por ejemplo, por la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 736084 B1, son especialmente adecuados para el empleo conjunto con enzimas los inhibidores de la corrosión de la plata constituidos por sales y/o complejos de manganeso, de titanio, de circonio, de hafnio, de vanadio, de cobalto o de cerio, en los cuales están presentes los metales citados en uno de los niveles de oxidación II, III, IV, V o VI. Ejemplos de tales compuestos son MnSO_{4}, V_{2}O_{5}, V_{2}O_{4}, VO_{2}, TiOSO_{4}, K_{2}TiF_{6}, K_{2}ZrF_{6}, Co(NO_{3})_{2}, Co(NO_{3})_{3}, así como sus mezclas.

Los productos activos "desprendedores de la suciedad" "Soil-Release" o "Soil-Repellents" son, en la mayoría de los casos, polímeros, que proporcionan a las fibras de la colada propiedades que la hacen repeler la suciedad cuando se emplean en un agente de lavado y/o favorecen la capacidad desprendedora de la suciedad de los restantes componentes de los agentes de lavado. Un efecto comparable puede observarse también cuando se emplean en agentes de limpieza para superficies duras.

Los productos activos, desprendedores de la suciedad (Soil-Release) especialmente activos y conocidos desde hace mucho tiempo son copolímeros con unidades de ácidos dicarboxílicos, de alquilenglicol y de polialquilenglicol. Ejemplos a este respecto son copolímeros o polímeros mixtos constituidos por tereftalato de polietileno y polioxietilenglicol (DT 16 17 141, o bien DT 22 00 911). Se han citado en la solicitud de patente alemana publicada, no examinada DT 22 53 063 agentes ácidos que contienen, entre otras cosas, un copolímero constituido por un ácido carboxílico dibásico y por un alquilen- o cicloalquilenpoliglicol. Los polímeros constituidos por tereftalato de etileno y por tereftalato de óxido de polietileno y su empleo en los agentes de lavado están descritos en las memorias descriptivas de las patentes alemanas DE 28 57 292 y DE 33 24 258 y en la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 253 567. La patente europea EP 066 944 se refiere a agentes, que contienen un copolímero constituido por etilenglicol, polietilenglicol, ácidos dicarboxílicos aromáticos y ácidos dicarboxílicos aromáticos sulfonados en determinadas proporciones molares. Se conocen por la patente europea EP 0 185 427 poliésteres cerrados en los extremos con grupos metilo o con grupos etilo con unidades de tereftalato de etileno y/o de propileno y con unidades de tereftalato de óxido de polietileno y agentes de lavado que contienen tales polímeros desprendedores de la suciedad. La patente europea EP 0 241 984 se refiere a poliéster que contiene, además de grupos de oxietileno y de unidades de ácido tereftálico, también unidades de etileno substituidas así como unidades de glicerina. Se conocen por la patente europea EP 0 241 985 poliésteres que contienen, además de grupos de óxido de etileno y de unidades de ácido tereftálico, grupos de 1,2-propileno, 1,2-butileno y/o 3-metoxi-1,2-propileno así como unidades de glicerina y que están cerrados en los grupos extremos con grupos alquilo con 1 a 4 átomos de carbono. Se conocen por la solicitud de patente europea EP 0 272 033 poliésteres cerrados en los grupos extremos al menos en parte por restos alquilo o por restos acilo con 1 a 4 átomos de carbono con unidades de tereftalato de polietileno y tereftalato de polioxietileno. La patente europea EP 0 274 907 describe poliésteres desprendedores de la suciedad que contienen tereftalato cerrados en los grupos extremos con sulfoetilo. Según la solicitud de patente europea EP 0 357 280 se preparan mediante sulfonación de los grupos extremos insaturados, poliésteres desprendedores de la suciedad con unidades de tereftalato, de alquilenglicol y de poli-glicol con 2 a 4 átomos de carbono. La solicitud de patente internacional WO 95/32232 se refiere a poliésteres ácidos, aromáticos, con capacidad para el desprendimiento de la suciedad. Se conocen por la solicitud de patente internacional WO 97/31085 productos activos no polímeros repelentes a la suciedad para materiales constituidos por algodón con varias unidades funcionales. Una primera unidad, que puede ser catiónica, por ejemplo, es capaz de adsorberse sobre la superficie del algodón mediante interacción electrostática, y una segunda unidad, que está formada de manera hidrófoba, que es responsable de la permanencia del producto activo sobre la superficie límite entre el agua/algodón.

A los inhibidores del corrido de los colores que entran en consideración para el empleo en los agentes de lavado de textiles, según la invención, pertenecen, especialmente, las polivinilpirrolidonas, los polivinilimidazoles, los N-óxidos polímeros tal como el poli-(N-óxido de vinilpiridina) y los copolímeros de vinilpirrolidona con vinilimidazol.

Cuando se emplean en procedimientos de limpieza a máquina puede se ventajoso añadir los agentes inhibidores de la espuma. Como inhibidores de la espuma son adecuados, por ejemplo, jabones de origen natural o sintético, que presenten una elevada proporción en ácidos grasos con 18 a 24 átomos de carbono. Los inhibidores de la espuma de tipo no tensioactivos, adecuados, son, por ejemplo, órganopolisiloxanos y sus mezclas con ácido silícico microfino, en caso dado silanizado así como parafinas, ceras, ceras microcristalinas y sus mezclas con ácido silícico silanizado o biesteariletilendiamida. Ventajosamente se emplearán también mezclas constituidas por diversos inhibidores de la espuma, por ejemplo aquellas constituidas por siliconas, parafinas o ceras. Son preferentes los inhibidores de la espuma, especialmente los inhibidores de la espuma que contienen silicona y/o parafina, enlazados sobre una substancia de soporte granular, soluble en agua o bien dispersable en agua. Son especialmente preferentes en este caso mezclas constituidas por parafinas y por biesteariletilendiamidas.

Un agente de limpieza según la invención para superficies duras puede contener, además, componentes con actividad abrasiva, especialmente del grupo que comprende harina de cuarzo, harina de madera, harina de material sintético, cretas y microesferas así como sus mezclas. Los productos abrasivos están contenidos en los agentes de limpieza según la invención preferentemente en una proporción no mayor que el 20% en peso, especialmente desde el 5% en peso hasta el 15% en peso.

A los agentes de lavado y de limpieza se les añaden colorantes y productos odorizantes para mejorar la impresión estética de los productos y para poner a disposición un producto "típico e inconfundible" desde el punto de vista estético y sensorial. Como esencias perfumantes o bien producto odorizantes pueden utilizarse compuestos odorizantes individuales, por ejemplo los productos sintéticos del tipo de los ésteres, de los éteres, de los aldehídos, de las cetonas, de los alcoholes y de los hidrocarburos. Los compuestos odorizantes del tipo de los ésteres son, por ejemplo, el acetato de bencilo, el isobutirato de fenoxietilo, el acetato de p-terc.-butilciclohexilo, el acetato de linalilo, el acetato de dimetilbencilcarbinilo, el acetato de feniletilo, el benzoato de linalilo, el formiato de bencilo, el glicinato de etilmetilfenilo, el propionato de alilciclohexilo, el propionato de estiralilo y el salicilato de bencilo. A los éteres pertenece, por ejemplo, el benciletiléter, a los aldehídos pertenecen, por ejemplo los alcanales lineales con de 8 a 18 átomos de carbono, el citral, el citronelal, el citroneliloxiacetaldehído, el ciclamenaldehído, el hidroxicitronelal, el lilial y el bourgeonal, a las cetonas pertenecen, por ejemplo la ionona, la \alpha-isometilionona y la metilcedrilcetona, a los alcoholes pertenecen el anetol, el citronelol, el eugenol, el geraniol, el linalool, el alcohol feniletílico y el terpineol, a los hidrocarburos pertenecen, principalmente, los terpenos, tales como limoneno y el pineno. Sin embargo se prefieren mezclas de diferentes productos odorizantes, que produzcan, en conjunto, una nota de olor agradable. Tales esencias perfumantes también pueden contener mezclas de productos odorizantes naturales, como a las que pueden obtenerse a partir de fuentes vegetales, por ejemplo la esencia de pino, de cítricos, de jazmín, de pachulí, de rosas o Ylang-Ylang. También son adecuadas esencias de moscatel, de salvia, de manzanilla, de clavel, de melisa, de menta, de hojas de canela, de pétalos de tilo, de bayas de enebro, de vetiver, de olibano, de galbano y de jara, así como esencia de azahar, de neroli, de cáscara de naranja y de madera de sándalo. Usualmente el contenido de los colorantes en los agentes de lavado y de limpieza se encuentra por debajo del 0,01% en peso, mientras que los productos odorizantes pueden constituir hasta un 2% en peso del conjunto de la formulación.

Los productos odorizantes pueden incorporarse directamente en los agentes de lavado y de limpieza, no obstante también puede ser ventajoso disponer los productos odorizantes sobre soportes, que refuercen la adherencia del perfume sobre la ropa y que se encarguen de que el olor de los materiales textiles se mantenga por mucho tiempo mediante una liberación lenta del olor. Se han acreditado, por ejemplo, como materiales de soporte las ciclodextrinas, pudiéndose revestir los complejos de ciclodextrina-perfume adicionalmente con otros agentes auxiliares. Otro soporte preferente para los productos odorizantes es la zeolita x, descrita, que puede absorber también productos odorizantes en lugar de o en mezcla con los tensioactivos. Son preferentes los agentes de lavado y de limpieza, que contengan la zeolita X, descrita, y los productos odorizantes, que estén al menos parcialmente absorbidos en la zeolita.

Los colorantes preferentes, cuya elección no constituye ninguna dificultad para el técnico en la materia, tienen una elevada estabilidad al almacenamiento y son insensibles frente a los restantes componentes del agente y contra la luz así como están exentos de cualquier substantividad marcada frente a las fibras textiles para no colorearlas.

Para la lucha contra los microorganismos, los agentes de lavado y de limpieza pueden contener productos activos antimicrobianos. En este caso se distingue según el espectro antimicrobiano y el mecanismo de actuación entre bacteriostáticos y bactericidas, fungistáticos y fungicidas, etc. Los productos importantes de estos grupos son, por ejemplo, el cloruro de benzalconio, los alquilarilsulfonatos, los halógenofenoles y el mercuriacetato de fenol. Las expresiones de efecto antimicrobiano y producto activo antimicrobiano tienen en el ámbito de las enseñanzas según la invención el significado usual en el ramo, que se han dado por ejemplo en la publicación de K. H. Wallhäu\betaer en "Praxis der Sterilisation, Desinfektion - Konservierung: Keimidentifizierung - Betriebshygiene" (5ª edición - Stuttgart; New York: Thieme, 1995), pudiéndose emplear todas las substancias allí descritas con efecto antimicrobiano. Los productos activos antimicrobianos adecuados se eligen, preferentemente, entre el grupo de los alcoholes, las aminas, los aldehídos, los ácidos antimicrobianos o bien sus sales, los ésteres de los ácidos carboxílicos, las amidas de ácido, los fenoles, los derivados de fenol, los difenoles, los difenilalcanos, los derivados de urea, los acetales, así como los formales oxigenados y nitrogenados, las benzamidinas, las isotiazolinas, los derivados de ftalimida, los derivados de piridina, los compuestos tensioactivos antimicrobianos, las guanidinas, los compuestos anfóteros antimicrobianos, las quinolinas, el 1,2-dibromo-2,4-dicianobutano, el yodo-2-propil-butil-carbamato, el yodo, los yodóforos, los compuestos peroxo, los compuestos halogenados así como mezclas arbitrarias de los precedentes.

El producto activo antimicrobiano puede elegirse en este caso entre etanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butanodiol, fenoxietanol, 1,2-propilenglicol, glicerina, ácido undecilénico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido dihidracético, o-fenilfenol, N-metilmorfolinacetonitrilo (MMA), 2-bencil-4-clorofenol, 2,2'-metilen-bis-(6-bromo-4-clorofenol), 4,4'-dicloro-2'-hidroxidifeniléter (Dichlosan), 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifeniléter (Trichlosan), clorohexidina, N-(4-clorofenil)-N-(3,4-diclorofenil)-urea, dihidrocloruro de N,N'-(1,10-decan-diildi-1-piridinil-4-iliden)-bis-(1-octanoamina), N,N'-bis-(4-clorofenil)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecanodiimidoamida, glucoprotaminas, compuestos cuaternarios tensioactivos antimicrobianos, guanidinas con inclusión de las biguanidinas y de las poliguanidinas, tales como por ejemplo el dihidrocloruro de 1,6-bis-(2-etilhexil-biguanido-hexano), el tetrahidrocloruro del 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-fenil-N_{1},N_{1}-metildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,6-diclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-[N_{1},N_{1}'-beta-(p-metoxifenil) diguanido-N_{5},N_{5}']-hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-alfa-metil-.beta.-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-p-nitrofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, dihidrocloruro de omega:omega-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-di-n-propiléter, tetrahidrocloruro de omega:omega'-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-di-n-propiléter, tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,4-diclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-p-metilfenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-2,4,5-triclorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, dihidrocloruro de 1,6-di-[N_{1},N_{1}'-alfa-(p-clorofenil)etildiguanido-N_{5},N_{5}']hexano, dihidrocloruro de omega:omega-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')m-xileno, dihidrocloruro de 1,12-di-(N_{1},N_{1}'-p-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')-dodecano, tetrahidrocloruro de 1,10-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-decano, tetrahidrocloruro de 1,12-di-(N_{1},N_{1}'-fenildiguanido-N_{5},N_{5}')-dodecano, dihidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, tetrahidrocloruro de 1,6-di-(N_{1},N_{1}'-o-clorofenildiguanido-N_{5},N_{5}')hexano, etilen-bis-(1-tolilbiguanido), etilen-bis-(p-tolil biguanida), etilen-bis-(3,5-dimetilfenilbiguanida), etilen-bis-(p-terc.-amilfenilbiguanida), etilen-bis-(nonilfenilbiguanida), etilen-bis-
(fenilbiguanida), etilenbis-(N-butilfenilbiguanida), etilen-bis (2,5-dietoxifenilbiguanida), etilen-bis (2,4-dimetilfenil biguanida), etilen-bis (o-difenilbiguanida), etilen-bis (amil naftilbiguanida mixta), N-butil-etilen-bis-(fenilbiguanida), trimetileno bis (o-tolilbiguanida), N-butil-trimetilo-bis-(fenilbiguanida) y las sales correspondientes tales como los acetatos, los gluconatos, los hidrocloruros, los hidrobromuros, los citratos, los bisulfitos, los fluoruros, los polimaleatos, los N-cocoalquilsarcosinatos, los fosfitos, los hipofosfitos, los perflúoroctanoatos, los silicatos, los sorbatos, los salicilatos, los maleatos, los tartratos, los fumaratos, los etilendiaminotetraacetatos, los iminodiacetatos, los cinamatos, los tioacetatos, los alginatos, los piromelilatos, los tetracarboxibutiratos, los benzoatos, los glutaratos, los monoflúorfosfatos, los perflúorpropionatos así como mezclas arbitrarias de los mismos. Además son adecuados los derivados halogenados del xileno y del cresol, tales como el p-clorometacresol o el p-clorometa-xileno, así como productos activos antimicrobianos naturales de origen natural (por ejemplo procedentes de especias o de hierbas aromáticas), de origen natural así como microbiano. Preferentemente pueden emplearse compuestos cuaternarios antimicrobianos, de acción tensioactiva, un producto activo antimicrobiano natural de origen vegetal y/o un producto activo antimicrobiano natural de origen animal, de manera extraordinariamente preferente al menos un producto activo antimicrobiano natural de origen vegetal del grupo que comprende la cofeína, la teobromina y la teofilina así como esencias etéreas tales como eugenol, timol y geraniol, y/o al menos un producto activo antimicrobiano natural de origen animal del grupo que comprende los enzimas tales como la proteína de leche, la lisozima y la lactoperoxidasa, y/o al menos un compuesto cuaternario antimicrobiano, de acción tensioactiva con un grupo amonio, sulfonio, fosfonio, yodonio o arsonio, compuestos peroxo y compuestos clorados. También pueden emplearse productos de origen microbiano, las denominadas bacteriocinas.

Los compuestos de amonio cuaternario (QAV), adecuados como productos activos antimicrobianos, de la fórmula general (R^{1})(R^{2})(R^{3})(R^{4}) N^{+} X^{-}, en la que R^{1} hasta R^{4} son restos alquilo con 1 hasta 22 átomos de carbono, restos aralquilo con 7 hasta 28 átomos de carbono o restos heterocíclicos, iguales o diferentes, formando dos restos o, en el caso de un enlace aromático tal como en la piridina, incluso tres restos, junto con el átomo de nitrógeno del heterociclo, por ejemplo un compuesto de piridinio o un compuesto de imidazolinio y X^{-} significa iones halogenuro, iones sulfato, iones hidroxi o iones similares. Para un efecto antimicrobiano óptico uno de los restos presenta al menos preferentemente una longitud de la cadena de 8 hasta 18, especialmente de 12 hasta 16 átomos de carbono.

Los QAV pueden obtenerse mediante reacción de aminas terciarias con agentes de alquilación, tales como por ejemplo cloruro de metilo, cloruro de bencilo, sulfato de dimetilo, bromuro de dodecilo así como también con óxido de etileno. La alquilación de las aminas terciarias con un resto alquilo largo y dos grupos metilo se consigue de forma especialmente sencilla, también la cuaternización de las aminas terciarias con dos restos largos y un grupo metilo puede llevarse a cabo con ayuda de cloruro de metilo bajo condiciones suaves. Las amidas, que disponen de un resto alquilo largo o de un resto alquilo substituido por hidroxi, son menos reactivas y se cuaternizarán preferentemente con sulfato de dimetilo.

Los QAV adecuados son, por ejemplo, el cloruro de benzalconio (cloruro de N-alquil-N,N-dimetil-bencilamonio, CAS No. 8001-54-5), benzalcona B (cloruro de m,p-diclorobencil-dimetil-alquilamonio con 12 átomos de carbono, CAS No. 58390-78-6), cloruro de benzoxonio (cloruro de bencil-dodecil-bis-(2-hidroxietil)-amonio), bromuro de cetrimonio (bromuro de N-hexadecil-N,N-trimetil-amonio, CAS No. 57-09-0), cloruro de bencetonio (cloruro de N,N-dimetil-N-[2-[2-[p-1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenoxi]etoxi]etil]-bencilamonio, CAS No. 121-54-0), cloruros de dialquildimetilamonio tales como el cloruro de di-n-decil-dimetil-amonio (CAS No. 7173-51-5-5), bromuro de didecildimetilamonio (CAS No. 2390-68-3), cloruro de dioctil-dimetil-amonio, cloruro de 1-cetilpiridinio (CAS No. 123-03-5) y yoduro de tiazolinio (CAS No. 15764-48-1) así como sus mezclas. Los QAV especialmente preferentes son los cloruros de benzalconio con restos alquilo con 8 hasta 18 átomos de carbono, especialmente el cloruro de alquil-bencil-dimetil-amonio con 12-14 átomos de carbono.

Los halogenuros de benzalconio y/o los halogenuros de benzalconio substituidos son obtenibles comercialmente por ejemplo como Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/ Sherex y Hyamine® ex Lonza, así como Bardac® ex Lonza. Otros productos activos antimicrobianos, adquiribles en el comercio son el cloruro de N-(3-cloroalil)-hexaminio tales como Dowicide® y Dowicil® ex Dow, cloruro de benzoetonio tal como Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, cloruro de metilbenzoetonio tal como Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, cloruro de cetilpiridinio tal como Cepacolchlorid ex Merrell Labs.

Los productos activos antimicrobianos se emplean en cantidades desde 0,0001% en peso hasta 1% en peso, preferentemente desde 0,001% en peso hasta 0,8% en peso, de forma especialmente preferente desde 0,005% en peso hasta 0,3% en peso y, especialmente, desde 0,01 hasta 0,2% en peso.

Los agentes pueden contener absorbedores de los UV (absorbedores UV), que se absorban en los textiles tratados y que mejoren la estabilidad frente a la luz de las fibras y/o la estabilidad frente a la luz de otros componentes de la receta. Se entenderán por absorbedores de los UV substancias orgánicas (filtros protectores contra la luz), que sean capaces de absorber la irradiación ultravioleta y de desprender de nuevo la energía absorbida por ejemplo en forma de irradiación de longitud de onda más larga, por ejemplo en forma de calor.

Los compuestos que presentan estas propiedades deseadas son, por ejemplo, los compuestos activos mediante desactivación en ausencia de irradiación y los derivados de la benzofenona con substituyentes en la posición 2 y/o en la posición 4. Además son adecuados también los benzotriazoles substituidos, los acrilatos substituidos por fenilo en la posición 3 (derivados del ácido cinámico, en caso dado con grupos ciano en la posición 2), salicilatos, complejos orgánicos de Ni así como productos naturales tales como la umbeliferona y los ácidos urocanoicos corporales. Tienen un significado especial los derivados de bifenilo y, ante todo, los derivados los estilbeno como los que se han descrito por ejemplo en la publicación EP 0728749 A y que pueden adquirirse en el comercio como Tinosorb® FD o Tinosorb® FR ex Ciba.

Como absorbedores de las UV-B pueden citarse: el 3-bencilidenalcanfor o bien el 3-bencilidennoralcanfor y sus derivados, por ejemplo el 3-(4-metilbenciliden)alcanfor, como se describe en la publicación EP 10693471 B1; los derivados del ácido 4-aminobenzoico, preferentemente el 4-(dimetilamino)benzoato de 2-etilhexilo, el 4-(dimetilamino)benzoato de 2-octilo y el 4-(dimetilamino)benzoato de amilo; los ésteres del ácido cinámico, preferentemente el 4-metoxicinamato de 2-etilhexilo, el 4-metoxicinamato de propilo, el 4-metoxicinamato de isoamilo, el 2-ciano-3-fenil-cinamato de 2-etilhexilo (octocrileno); los ésteres del ácido salicílico, preferentemente el salicilato de 2-etilhexilo, el salicilato de 4-isopropilbencilo, el salicilato de homometilo; los derivados de la benzofenona, preferentemente la 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona, la 2-hidroxi-4-metoxi-4'-metilbenzofenona, la 2,2'-dihidroxi-4-metoxibenzofenona; los ésteres del ácido benzalmalónico, preferentemente el 4-metoxibenzalmalonato de 2-etilhexilo; los derivados de triazina, tales como, por ejemplo, la 2,4,6-trianilino-(p-carbo-2'-etil-1'-hexiloxi)-1,3,5-triazina y la octil triazona, como se han descrito en la publicación EP 0818450 A1 o dioctil butamido triazona (Uvasorb® HEB); las propano-1,3-dionas tal como, por ejemplo, la 1-(4-terc.-butilfenil)-3-(4'-metoxifenil)propano-1,3-diona; los derivados de cetotriciclo(5.2.1.0)decano, tales como los que se han descrito en la publicación EP 0694521 B1. Además, son adecuados el ácido 2-fenilbencimidazol-5-sulfónico y sus sales alcalinas, alcalinotérreas, de aminoro, de alquilamonio, de alcanolamonio y de glucamonio; los derivados de ácidos sulfónicos de benzofenonas, preferentemente el ácido 2-hidroxi-4-metoxibenzofenona-5-sulfónico y sus sales; los derivados de ácidos sulfónicos del 3-bencilidenalcanfor tales como, por ejemplo, el ácido 4-(2-oxo-3-bornilidenmetil)bencenosulfónico y el ácido 2-metil-5-(2-oxo-3-borniliden)sulfónico y sus sales.

Como filtros típicos contra los UV-A típicos entran en consideración de derivados del benzoilmetano, tales como, por ejemplo, la 1-(4'-terc.-butilfenil)-3-(4'-metoxifenil)propano-1,3-diona, el 4-terc.-butil-4'-metoxidebenzoilmetano (Parsol 1789), la 1-fenil-3-(4'-isopropilfenil)-propano-1,3-diona así como compuestos de enamina, como los que se han descrito en la publicación DE 19712033 A1 (BASF). Los filtros para los UV-AS y UV-B pueden emplearse también, evidentemente, en mezcla. Además de los productos solubles, citados, entran en consideración para esta finalidad también pigmentos insolubles, protectores contra la luz, en concreto óxidos metálicos finamente dispersados o bien sales. Ejemplos de los óxidos metálicos adecuados son, especialmente, el dióxido de titanio y, además, los óxidos de hierro, de circonio, de silicio, de manganeso, de aluminio, de cerio así como sus mezclas. Como sales pueden emplearse silicatos (talco), sulfato de bario o estearato de cinc. Los óxidos y las sales se emplearán en forma de pigmentos listos para emulsiones destinadas al cuidado de la piel y para la protección de la piel y para productos cosméticos decorativos. Las partículas deben presentar en este caso un diámetro medio menor que 100 nm, preferentemente comprendido entre 5 y 50 nm y, especialmente, comprendido entre 15 y 30 nm. Estas pueden presentar una forma esférica, sin embargo, pueden emplearse también aquellas partículas que tengan una forma elipsoide o que se diferencie de la configuración esférica de otro modo. Los pigmentos pueden presentarse también tratados superficialmente, es decir hidrofilado o hidrofobado, Ejemplos típicos son dióxidos de titanio revestidos, tales como, por ejemplo dióxido de titanio T 805 (Degussa) o Eusolex\registrado T2000 (Merck); como agentes de revestimiento hidrófobos entran en consideración todas las siliconas y, en este caso, especialmente los trialcoxioctilsilanos o simeticonas. Preferentemente se empleará el óxido de cinc micronizado. Otros filtros adecuados, protectores contra la luz UV pueden verse en la recopilación de P.Finkel en SÖFW-Journal 122, (1966), página 543.

Los absorbedores de los UV se emplearán usualmente en cantidades desde 0,01% en peso hasta 5% en peso, preferentemente desde 0,03% en peso hasta 1% en peso.

También pueden requerir una protección especial en los agentes de lavado y de limpieza, según la invención y/o otras proteínas. Con esta finalidad, los agentes según la invención pueden contener estabilizantes.

Un grupo de estabilizantes son los inhibidores reversibles de la proteasa, que cuando se diluye el agente en el baño de la colada se separan por disociación. El hidrocloruro de la benzamidina y la leupeptina se han establecido para esta finalidad. Frecuentemente se utilizan borax, ácido bórico, ácidos borónicos o sus sales o ésteres, entre los cuales, ante todo, derivados con grupos aromáticos, por ejemplo ácidos fenilborónicos ortosubstituidos según la publicación WO 95/12655, ácidos poliborónicos metasubstituidos según la publicación WO 92/19707 y ácidos fenilborónicos parasubstituidos según la publicación US 5 972 873, o bien sus sales o ésteres. En las solicitudes WO 98/13460 y EP 583 534 se divulgan peptidoaldehídos, es decir oligopéptidos con C-extremo reductor y, concretamente, aquellos constituidos por 2 hasta 50 monómeros, para la inhibición reversible de las proteasas en los agentes de lavado y de limpieza. A los inhibidores reversibles de la proteasa peptídicos pertenecen, entre otros, el ovomucoide (WO 93/00418). De manera ejemplificativa se divulgan con la solicitud WO 00/01826 inhibidores reversibles de péptidos, específicos, para la proteasa subtilisina para el empleo en los agentes que contienen proteasa y en la publicación WO 00/01831 se divulgan proteínas de fusión correspondientes constituidas por proteasas e inhibidor.

Otros estabilizantes de los enzimas son aminoalcoholes tales como mono-, di-, trietanol- y -propanolamina y sus mezclas. Ácidos carboxílicos alifáticos con hasta 12 átomos de carbono inclusive, tales como por ejemplo los que se conocen por la solicitud EP 0 378 261 y WO 97/05227, tales como el ácido succínico, otros ácidos dicarboxílicos o sales de los ácidos citados. Se divulgan en la solicitud DE 196 50 537 para esta finalidad alcoxilatos de amidas de ácidos grasos cerrados en los grupos extremos. Determinados ácidos orgánicos, empleados a modo de adyuvantes, son capaces, tal como se ha divulgado en la publicación WO 97/18287, de estabilizar adicionalmente un enzima contenido.

Los alcoholes alifáticos inferiores, ante todo sin embargo los polioles, tales como por ejemplo la glicerina, el etilenglicol, el propilenglicol o la sorbita son otros estabilizantes de los enzimas frecuentemente empleados. De acuerdo con una solicitud reciente (EP 0 965 268) el fosfato de glicerina protege también contra la desnaturalización provocada por influjos físicos. Del mismo modo se emplearán sales de calcio, tal como por ejemplo el acetato de calcio o el formiato de calcio divulgado en la memoria descriptiva de la patente EP 0 028 865 para esta finalidad, y las sales de magnesio, por ejemplo según la solicitud de patente europea EP 0 378 262.

Los oligómeros de poliamida (WO 99/43780) o los compuestos polímeros tales como lignina (WO 97/00932), los copolímeros vinílicos solubles en agua (EP 828 762) o como se ha divulga en la publicación EP 702 712, los éteres de celulosa, los polímeros acrílicos y/o las poliaminas, estabilizan la preparación enzimática entre otras cosas frente a los influjos físicos o frente a las oscilaciones del valor del pH. Los polímeros que contienen N-óxido de poliamina (EP 587 550 y EP 581 751) actúan simultáneamente como estabilizantes de los enzimas y como inhibidores del corrido de los colores. Otros estabilizantes polímeros son los polioxialquilenos con 8 hasta 18 átomos de carbono lineales divulgados en la publicación WO 97/05227 junto a otros componentes. Los alquilpoliglicósidos pueden estabilizar los componentes enzimáticos del agente según la invención como en las solicitudes WO 97/43377 y WO 98/45396 e incluso acrecentar sus prestaciones. Los compuestos que contienen N-reticulados, como los que se han divulgado en la publicación WO 98/17764, cumplen una doble función en forma de agentes desprendedores de la suciedad y como estabilizantes de los enzimas. Los polímeros hidrófobos, no iónicos actúan en una mezcla con otros estabilizantes según la solicitud WO 97/32958 ejerciendo una acción estabilizante sobre una celulasa, de tal manera que estos componentes o componentes similares pueden ser adecuados también para el enzima según la invención.

Los agentes reductores y los antioxidantes aumentan, tal como se ha divulgado en la publicación EP 780 466, la estabilidad de los enzimas frente a la descomposición por oxidación. Los agentes reductores azufrados son conocidos, por ejemplo, por las memorias descriptivas de las patentes EP 0 080 748 y EP 0 080 223. Otros ejemplos son el sulfito de sodio (EP 533 239) y los azúcares reductores (EP 656 058).

Muchas veces se emplean también combinaciones de estabilizantes, por ejemplo constituidas por polioles, ácido bórico y/o borax en la solicitud WO 96/31589, la combinación de ácido bórico o de borax, sales reductoras y ácido succínico u otros ácidos dicarboxílicos en la solicitud EP 126 505 o la combinación de ácido bórico o de borato con polioles o con compuestos de poliamina y con sales reductoras, como se han divulgado en la solicitud EP 080 223. El efecto de los estabilizantes péptido-aldehídicos se acrecenta, de acuerdo con la publicación WO 98/13462 mediante la combinación con ácido bórico y/o con derivados del ácido bórico y polioles y se refuerza todavía más según la publicación WO 98/13459 mediante el empleo adicional de iones de calcio.

Los agentes con actividades enzimáticas estabilizadas representan formas preferentes de realización de la presente invención. Son especialmente preferentes aquello con enzimas que estén estabilizados a través de varias de las formas indicadas.

Los agentes según la invención contienen las proteínas o los derivados esenciales para la invención, en cantidades desde 0,000001 por ciento en peso hasta 5% en peso y de una manera mas preferente desde 0,00005 hasta 4% en peso, desde 0,00001 hasta 3% en peso, desde 0,0001 hasta 2% en peso y, de forma especialmente preferente desde 0,001 hasta 1% en peso. La concentración en proteína puede determinarse con ayuda de métodos conocidos, por ejemplo según el conocido procedimiento BCA (ácido bicincónico: ácido 2,2'-biquinoil-4,4'-dicarboxílico) o el procedimiento al biuret (A.G. Gornall, C.C. Bardawill y M.M. David, J. Biol. Chem. 177 (1948), páginas 751-766).

Los agentes según la invención pueden contener además de las proteínas según la invención, otros enzimas amilolíticos, especialmente \alpha-amilasas. Entre éstas pueden encontrarse también los enzimas descritos al principio, que se han establecido para su empleo en los agentes de lavado y de limpieza. Ejemplos de amilasas comercialmente obtenibles son BAN®, Termamyl®, Purastar®, Amylase-LT®, Maxamyl®, Duramyl® y/o Purafect® OxAm. Esto es adecuado cuando los diferentes enzimas sean capaces de complementarse. Un complemento de este tipo puede verificarse, por ejemplo, desde el punto de vista de la regulación, por ejemplo mediante activación mutua o mediante inactivación. Puede producirse por ejemplo si al menos una parte del enzima según la invención, no homóloga con las \alpha-amilasas conocidas, ejerce un efecto sobre las actividades amilolíticas que no corresponden a la invención. Sin embargo puede ser interesante el empleo conjunto debido a especificidades del substrato variables. Ambas son formas de realización de la presente invención.

Especialmente puede ser ventajoso sobre suciedades químicamente diferentes, emplear los enzimas amilolíticos en los agentes de lavado y de limpieza junto con otros enzimas con actividad de lavado y/o de limpieza. Por lo tanto los agentes de lavado y de limpieza, que están caracterizados además de por una proteína según la invención, por otros enzimas adicionales, representan formas de realización preferentes de la presente invención.

A éstas pertenecen, además de otras amilasas, por ejemplo proteasas, así como también lipasas, cutinasas, esterasas, pululanasas, celulasas, hemicelulasas y/o xilanasas, así como sus mezclas. Son especialmente preferentes las proteasas, las lipasas, las \beta-glucanasas y/o las celulasas. Otros enzimas amplían las prestaciones de limpieza del agente correspondiente en su potencia enzimática específica respectiva. A éstos pertenecen por ejemplo las óxidorreductasas o las peroxidasas como componentes de los sistemas de blanqueo enzimáticos, las lacasas (WO 00/39306), las \beta-glucanasas (WO 99/06515 y WO 99/06516) o enzimas desprendedores de pectina (WO 00/42145), que se emplean especialmente en agentes de lavado especiales.

Ejemplos de enzimas que pueden ser adquiridos en el comercio para su utilización en los agentes según la invención son proteasas tales como subtilisina BPN', Properase®, BLAP®, Optimase®, Opticlean®, Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Alcalase®, Esperase®, Savinase®, Durazym®, Everlase® y/o Purafect®G o Purafect®OxP y lipasas tales como Lipolase®, Lipomax®, Lumafast® y/o Lipozym®.

La actividad de la proteasa en tales agentes puede determinarse según los métodos descritos en la publicación Tenside, tomo 7 (1970), páginas 125-132. Por lo tanto se indicará en PE (unidades de proteasa). La actividad en proteasa de los agentes preferentes puede llegar hasta 1.500.000 unidades de proteasa por gramo de preparación (PE, determinado según los métodos descritos en la publicación Tenside, tomo 7 (1970), páginas 125-132).

En lo que se refiere a su obtención entran en consideración entre los enzimas empleable, en primer lugar, los que se obtienen a partir de microorganismos, tales como bacterias u hongos, por ejemplo a partir de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Streptomyces griseus, Humicola lanuginosa, Humicola insolens, Pseudomonas pseudoalcaligenes o Pseudomonas cepacia, especialmente las mezclas de enzimas formadas de manera natural por estas cepas, o bien mezclas con las otras cepas. De manera conocida se obtienen mediante procesos de fermentación a partir de los microorganismos adecuados, que han sido descritos por ejemplo en las solicitudes de patente alemanas publicadas, no examinadas DE 19 40 488 y DE 21 21 397, en las memorias descriptivas de las patentes norteamericanas US 3 623957 y US 4 264 738, en la solicitud de patente europea EP 006 638, así como en la solicitud de patente internacional WO 91/02792.

También estos enzimas, empleados adicionalmente en caso dado, pueden estar adsorbidos sobre soportes y/o pueden estar incrustados en substancias de recubrimiento para su protección contra una inactivación prematura como se describe por ejemplo en la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 564 476 o en la solicitud de patente internacional WO 94/23005. Éstos están contenidos en los agentes de lavado preferentemente en cantidades de hasta un 10% en peso, especialmente desde un 0,2% en peso hasta un 2% en peso, empleándose de forma especialmente preferente enzimas estabilizados contra la degradación por oxidación, como los que se conocen por ejemplo, por la solicitud de patente internacional WO 94/18314.

Los agentes según la invención pueden estar constituidos por varias fases para liberar separadamente entre sí en el tiempo o en el espacio por ejemplo los productos activos contenidos. En este caso puede tratarse de fases en diversos estados de agregación, especialmente puede tratarse de dos fases en el mismo estado de agregación.

Los agentes según la invención, que están constituidos por varios componentes sólidos, pueden fabricarse de manera sencilla mezclándose entre sí diversos polvos o granulados con diversos componentes y/o comportamientos diferentes a la liberación en estado a granel en conjunto. La fabricación de los agentes sólidos según la invención a partir de una o varias fases puede llevarse a cabo de manera conocida, por ejemplo mediante secado por pulverización o granulación, añadiéndose en caso dado ulteriormente, por separado, los enzimas y, eventualmente, otros componentes sensibles a la temperatura tales como por ejemplo los agentes de blanqueo. Para la fabricación de los agentes según la invención con un elevado peso a granel, especialmente en el intervalo desde 650 g/l hasta 950 g/l, es preferente un procedimiento conocido por la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 486 592, que presenta una etapa de extrusión. Otra fabricación preferente con ayuda de un procedimiento de granulación está descrita en la memoria descriptiva de la patente europea EP 0 642 576.

Las proteínas pueden emplearse para los agentes sólidos, por ejemplo, en forma secada, granulada, encapsulada o encapsulada y adicionalmente secada. Pueden añadirse separadamente, es decir como fase propia, o junto con otros componentes en la misma fase, con o sin compactación. Cuando deban elaborarse enzimas microencapsulados en forma sólida, podrá eliminarse el agua con procedimientos conocidos por el estado de la técnica a partir de las soluciones acuosas que se forman durante la preparación, tal como mediante secado por pulverización, eliminación por centrifugación o mediante transolubilización. Las partículas, obtenidas de este modo, tienen usualmente un tamaño de partícula comprendido entre 50 y 200 \mum.

La forma encapsulada es adecuada para proteger los enzimas frente a otros componentes, tales como por ejemplo los agentes de blanqueo o para posibilitar una liberación controlada (controlled release). De acuerdo con el tamaño de estas cápsulas se distinguirá entre milicápsulas, microcápsulas y nanocápsulas, siendo las microcápsulas especialmente preferentes para los enzimas. Tales cápsulas se han divulgado por ejemplo, con las solicitudes de patente WO 97/24177 y DE 199 18 267. Otro posible método de encapsulación consiste en que los enzimas, adecuados para el empleo en los agentes de lavado y de limpieza, es encapsulan a partir de una mezcla de la solución enzimática con una solución o suspensión de almidones o de un derivado del almidón, en almidones, o bien en el derivado del almidón. Un procedimiento de encapsulación de este tipo se ha descrito en la solicitud de patente alemana DE 199 56 382 con el título "Procedimiento para la obtención de enzimas microencapsulados".

Otra posibilidad de poner a disposición un agente sólido según la invención consiste en el prensado o en la compactación para dar tabletas. Tales tabletas pueden ser monofásicas o polifásicas. De este modo esta forma de administración ofrece también la posibilidad de presentar un agente sólido según la invención con dos fases sólidas. Para la fabricación de los agentes según la invención en forma de tabletas, que pueden ser monocrómicas o policrómicas y/o que pueden estar constituidas por una o por varias capas, se mezclan entre sí en un mezclador preferentemente todos los componentes -en caso dado para cada capa- y la mezcla se prensa con prensas entabletadoras tradicionales, por ejemplo prensas excéntricas o prensas circulares, con fuerzas de prensado en el intervalo desde aproximadamente 50 hasta 100 kN/cm^{2}, preferentemente a 60 hasta 70 kN/cm^{2}. Especialmente en el caso de tabletas con varias capas puede ser ventajoso que se prense previamente al menos una capa. Esto se llevará a cabo preferentemente con fuerzas para el prensado comprendidas entre 5 y 20 kN/cm^{2}, especialmente a 10 hasta 15 kN/cm^{2}. Preferentemente una tableta configurada de este modo presenta un peso desde 10 g hasta 50 g, especialmente desde 15 g hasta 40 g. La forma geométrica de las tabletas es arbitraria y puede ser circular, oval, poligonal, aún cuando también sean posibles formas intermedias.

Pueden añadirse a los agentes líquidos, en forma de gel o pastosos, según la invención, los enzimas, así como también una proteína según la invención a partir de una obtención de proteínas realizada según el estado de la técnica y preparación en solución concentrada acuosa o no acuosa, por ejemplo en forma líquida, por ejemplo como solución, suspensión o emulsión, así como también forma de gel o encapsulada o como polvo secado. Tales agentes de lavado o de limpieza según la invención en forma de soluciones en disolventes usuales se fabrican, por regla general, por simple mezcla de los componentes, que pueden añadirse en substancia o como solución a un mezclador automáti-
co.

Una forma de realización de la presente invención consiste en tales agentes líquidos, en forma de gel o pastosos a los que se les haya añadido una proteína según la invención y/u otra de las proteínas obtenidas y/u otro de los componentes contenidos en forma de microcápsulas. Entre éstos son especialmente preferentes aquellos con cápsulas de material sensible a la amilasa. Un empleo conjunto de este tipo de los materiales sensibles a las amilasas y del enzima amilolítico, según la invención, en un agente de lavado o de limpieza puede presentar efectos sinérgicos, por ejemplo de tal manera que el enzima con mayor potencia disociadora favorezca la disociación de las microcápsulas y, de este modo, controle el proceso de liberación de los componentes encapsulados de tal manera que su liberación no se produzca durante el almacenamiento y/o tampoco al inicio del programa de limpieza, sino que se produzca solamente en un momento determinado. Los sistemas complejos de lavado y de limpieza con los componentes más diversos y con los tipos de cápsulas más diversos pueden estar basados en este mecanismo que representa formas de realización especialmente preferentes de la presente invención.

Un efecto similar se obtiene cuando los componentes del agente de lavado y de limpieza estén distribuidos al menos entre dos fases diferentes, por ejemplo entre dos o varias fases unidas entre sí de un agente de lavado o de limpieza en forma de tabletas o granulados diferentes dentro del mismo agente pulverulento. Los limpiadores con dos o varias fases pertenecen al estado de la técnica para la aplicación tanto en el fregado a máquina de la vajilla como también en los agentes de lavado. La actividad de un enzima amilolítico en una fase activada previamente es una condición previa para la activación de una fase ulterior cuando ésta esté recubierta por una vaina o recubrimientos sensibles a las amilasas o el material sensible a las amilasas represente un componente integral de la fase sólida, desintegrándose la fase correspondiente durante su hidrólisis parcial o completa. El empleo del enzima según la invención para esta finalidad representa, por lo tanto, una forma de realización preferente de la presente invención.

Los componentes de los agentes de lavado y de limpieza son capaces de favorecerse adecuadamente entre sí en cuanto a sus prestaciones. El empleo sinérgico de amilasas y de inhibidores del corrido de los colores para aumentar las prestaciones de limpieza se divulga por ejemplo en la solicitud WO 99/63035. También se sabe que los polímeros, que pueden emplearse simultáneamente como coadyuvantes, tales como por ejemplo los alquil-poli-glicósidos, pueden estabilizar y aumentar la actividad y la estabilidad de los enzimas contenidos, tal como se conoce por la solicitud WO 98/45396. Del mismo modo es posible modificar, especialmente estabilizar y/o aumentar una actividad amilolítica según la invención por medio de uno de los restantes componentes, anteriormente indicados. Las recetas ajustadas correspondientemente para los agentes según la invención representan, por lo tanto, formas de realización especialmente preferentes de la presente invención. Esto es válido especialmente cuando, de este modo, se aumenten las prestaciones de lavado o bien de limpieza del agente.

También un procedimiento para la limpieza de textiles o de superficies duras, caracterizado porque al menos en una etapa del procedimiento se activa una proteína o derivado amilolítico, según la invención, realizará la idea de la presente invención.

Precisamente los procedimientos de limpieza a máquina se caracterizan por programas de limpieza con varias etapas, es decir que se aplican diversos componentes con actividad de limpieza sobre el objeto a ser limpiado, separadamente entre sí en el tiempo. Tales procedimientos se utilizan por ejemplo en la limpieza de instalaciones industriales de producción para artículos comestibles. Por otro lado las proteínas según la invención tienen, debido a su actividad enzimática propiamente dicha, la capacidad de atacar a las suciedades que contienen hidratos de carbono y precisamente también en ausencia parcial o completa de detergentes o de otros componentes característicos de los agentes de lavado y de limpieza. Según una forma de realización de la presente invención puede elegirse, por lo tanto, también un procedimiento mecánico para la limpieza de textiles o de productos sólidos, en el cual se deja actuar sobre las suciedades una proteína según la invención durante un cierto período de tiempo sin otros componentes con actividad de limpieza.

Todos los procedimientos de limpieza representan formas de realización preferentes de la presente invención, entre las cuales se encuentran los procedimientos de limpieza a mano, especialmente sin embargo los procedimientos de limpieza a máquina, caracterizados porque se activa al menos en una de las etapas del procedimiento una proteína o derivado amilolítico según la invención. Éste puede ser tanto un procedimiento para la limpieza de textiles o de materiales comparables, así como también un procedimiento para la limpieza de superficies duras.

Tal como se ha demostrado en los ejemplos, la \alpha-amilasa procedente de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) según la invención es adecuada, cuando esté enlazada en un agente conveniente de lavado o de limpieza, tanto para el aumento de las prestaciones de lavado de los agentes de lavado a máquina para textiles como también para aumentar las prestaciones de limpieza de los agentes para el fregado a máquina de la vajilla.

Del mismo modo todos los procedimientos de limpieza representan formas preferentes de realización de la presente invención, entre los cuales se cuentan los procedimientos de limpieza manuales, especialmente sin embargo los procedimientos de limpieza a máquina, caracterizados porque se emplea al menos en una etapa del procedimiento un agente según la invención. Éste puede ser tanto un procedimiento para la limpieza de textiles o de materiales comparables así como también un procedimiento para la limpieza de superficies duras.

Se han determinado como cantidades especialmente adecuadas de la proteína o del fragmento según la invención, para los procedimientos de limpieza, por ejemplo en las máquinas domésticas para el fregado de la vajilla o en las máquinas domésticas para la colada, corrientes, desde 0,02 mg hasta 400 mg de la proteína o del fragmento amilolítico, preferentemente desde 0,01 mg hasta 200 mg, especialmente desde 0,02 mg hasta 100 mg del enzima o del fragmento amilolítico por aplicación.

En una posible forma de realización de los procedimientos mecánicos para la limpieza de textiles o de superficies duras se han establecidos como especialmente adecuadas para una proteína según la invención, concentraciones activas desde 0,0005 mg hasta 10 mg por litro de baño de colada, preferentemente desde 0,005 mg hasta 8 mg por litro de baño de colada. Por lo tanto representan formas de realización de la presente invención. En otras formas adecuadas de realización pueden producirse valores claramente diferentes de los anteriores cuando se tenga en consideración que para los procedimientos de limpieza a máquina se utilizan dispositivos que muevan entre 5 y 70 litros de baño de colada con cantidades casi idénticas de agentes de lavado o bien de fregado.

También el empleo de una proteína según la invención o de un agente según la invención representa una forma de realización de la presente invención. Este empleo puede llevarse a cabo a máquina o de otra manera, especialmente de manera manual. Esto se refiere a la limpieza de todos los materiales imaginables, especialmente de textiles o de superficies duras. En este caso puede estar incrustada la proteína según la invención en una receta constituida por otras substancias activas o, de acuerdo con su naturaleza, puede llevarse a cabo también ampliamente sin tales compuestos.

Del mismo modo el empleo solo de una proteína según la invención para la limpieza de textiles o de superficies duras representa una forma correspondiente de realización, especialmente dentro de un procedimiento de limpieza con varias etapas.

Todas las posibilidades de aplicación en las cuales se utilicen agentes según la invención para la limpieza de textiles o de superficies duras representan formas preferentes de realización.

Un empleo preferente se caracteriza porque se utilizan desde 0,02 mg hasta 400 mg, preferentemente desde 0,01 mg hasta 200 mg, especialmente desde 0,02 mg hasta 100 mg de la proteína o del fragmento amilolítico por aplicación en una máquina para el fregado de la vajilla o en una máquina lavadora.

El empleo de las proteínas o de los derivados según la invención para el desprendimiento total o parcial de capas de protección alrededor de los componentes de los agentes de lavado o de limpieza sólidos o para la desintegración de fases sólidas con materiales sensibles a las amilasas contenidos o recubridores, representa igualmente una forma de realización de la presente invención. Esto es válido también para las formas de realización en las cuales están contenidas en una de estas fases proteínas amilolíticas según la invención solas o junto con al menos otro producto activo con actividad limpiadora o favorecedor del efecto de limpieza. En este sentido la proteína amilolítica sirve para la activación de las fases propias o de otras fases en un agente de lavado o de limpieza constituido por más de una fase. También es especialmente preferente bajo este aspecto la liberación de los componentes para provocar un efecto limpiador de los componentes sobre superficies duras o en un material tipo textil.

El empleo del enzima según la invención para provocar el desprendimiento total o parcial de las cápsulas que contienen hidratos de carbono, especialmente nanocápsulas, microcápsulas o milicápsulas en agentes líquidos, en forma de gel o pastosos, representa una forma de realización de la presente invención, cuyo significado ha sido ya tratado para un procedimiento controlado de liberación de los componentes encapsulados del medio. Se tratará de una forma especialmente preferente de realización de esta invención cuando la liberación de los componentes se lleve a cabo para provocar un efecto limpiador de los componentes sobre una superficie dura o sobre un material de tipo textil.

El empleo de una proteína o de un derivado según la invención para el tratamiento de los materiales en bruto o de los productos intermedios en la fabricación de los textiles, especialmente para el desencolado del algodón, representa otra forma de realización.

Los materiales en bruto y los productos intermedios de la fabricación de los textiles, por ejemplo para aquellos a base de algodón, se bonifican en el ámbito de su fabricación y de su elaboración ulterior con almidones para posibilitar una elaboración mejorada. Este procedimiento, empleado tanto sobre hilos, sobre productos intermedios así como sobre textiles se denomina encolado (sizing). Para eliminar el apresto, es decir la capa protectora que contiene almidón (desencolado, desizing) son adecuadas las proteínas amilolíticas según la invención.

Los procedimientos para la licuación de los almidones, especialmente para la producción de etanol representan otra forma de realización que se caracteriza porque se emplea en los mismos una proteína o derivado según la invención.

Para la licuación de los almidones se incuban almidones hinchables en agua o en tampón con enzimas amilolíticas, con lo cual se disocia el polisacárido en componentes más pequeños, en primer lugar preponderantemente en maltosa. Los enzimas según la invención se emplearán preferentemente para un procedimiento de este tipo o en una etapa parcial de mismo cuando pueda adaptarse perfectamente a un procedimiento de producción correspondiente debido a sus propiedades bioquímicas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando deban incorporarse en una etapa además de otros enzimas que requieran las mismas condiciones de reacción. Las proteínas amilolíticas según la invención son especialmente preferentes cuando constituyan el centro de interés precisamente los productos formados por las mismas. La licuación de los almidones puede representar también una etapa en un procedimiento de varias etapas para la obtención de etanol o productos derivados del mismo, por ejemplo ácido acético.

El empleo de una proteína o derivado según la invención para la obtención de oligosacáridos lineales y/o de cadena corta representa otra forma de realización.

Las proteínas amilolíticas según la invención, procedentes de polímeros similares a los almidones forman, debido a su actividad enzimática, al cabo de un corto período tiempo de incubación, preponderantemente oligosacáridos de elevado peso molecular tales como por ejemplo maltohexaosa, maltoheptaosa o maltooctaosa. Al cabo de un período más prolongado de incubación aumenta, bajo las condiciones de la reacción, la proporción de oligosacáridos inferiores, tales como por ejemplo maltosa o maltotriosa. Podrán emplearse variantes correspondientes de las proteínas según la invención cuando exista un interés especial en determinados productos de la reacción y/o cuando se establezcan de manera correspondiente las condiciones de la reacción. Esto es especialmente atractivo cuando no se trate de obtener compuestos puros sino que se trate de obtener mezclas de compuestos similares, tal como por ejemplo la formación de soluciones, suspensiones o geles con únicamente propiedades físicas determinadas.

El empleo de una proteína o derivado según la invención para la hidrólisis de las ciclodextrinas representa otra forma de realización.

Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos enlazados de manera \alpha-1,4-glicosídica, entre las cuales tienen el mayor significado económico las que están constituidas por 6, 7 u 8 monómeros de glucosa, las \alpha-, \beta- o bien \gamma-ciclodextrinas (o ciclohexa-, -hepta-, o bien -octa-amilosas). Éstas pueden formar con moléculas foráneas hidrófobas, tales como por ejemplo productos odorizantes, productos mejoradores del sabor o productos farmacéuticamente activos, compuestos de oclusión, a partir de los cuales pueden volverse a liberar las moléculas foráneas en caso necesario. Tales compuestos de oclusión son significativos, según el campo de aplicación de los componentes por ejemplo para la fabricación de artículos comestibles, de artículos farmacéuticos o de artículos cosméticos, por ejemplo en productos correspondientes para el consumidor final. La liberación de los componentes a partir de las ciclodextrinas representa por lo tanto una posibilidad de aplicación de las proteínas según la invención.

El empleo de una proteína o derivado según la invención para la liberación de compuestos de bajo peso molecular a partir de polisacáridos o de ciclodextrinas representa otra forma de realización.

Debido a su actividad enzimática las proteínas amilolíticas según la invención pueden liberar también compuestos de bajo peso molecular a partir de otros polisacáridos enlazados de manera \alpha-1,4-glicosídica. Esto puede verificarse en el plano molecular en el caso de las ciclodextrinas así como también en sistemas mayores, tales como por ejemplo componentes, que estén encapsulados en forma de microcápsulas. De manera ejemplificativa el almidón es un material establecido en el estado de la técnica para encapsular durante el almacenamiento compuestos, tales como por ejemplo enzimas, que deban aportarse en cantidades definidas en las cargas de la reacción. El procedimiento de liberación controlada, a partir de tales cápsulas puede favorecerse por los enzimas amilolíticos según la invención.

El empleo de una proteína o derivado según la invención para la obtención de artículos comestibles y/o de componentes para artículos comestibles representa otra forma de realización.

Del mismo modo, el empleo de una proteína o derivado según la invención para la obtención de pienso para animales y/o de componentes para pienso de animales, constituye una forma de realización de este objeto de la invención.

Siempre que los almidones o los hidratos de carbono derivados de los almidones jueguen un papel como artículos comestibles o como componentes de los artículos comestibles, podrá emplearse una actividad amilolítica para la obtención de este artículo. Ésta aumenta la proporción de monómeros o de oligómeros frente a los azúcares polímeros, lo cual favorece por ejemplo el sabor, la aptitud a la digestión o la consistencia del artículo comestible. Esto puede ser necesario para la fabricación de determinados piensos para animales, por ejemplo sin embargo también en el caso de la fabricación de jugos de frutas, de vino o de otros artículos comestibles, cuando la proporción de azúcar polímero deba reducirse y cuando deba aumentarse la de los azúcares dulces y/o fácilmente solubles. La posibilidad de aplicación anteriormente indicada relativa a la licuación de los almidones y/o a la producción de etanol puede considerarse como variante industrial de este principio.

Además, las amilasas se oponen también a la pérdida de sabor conocida como producto atrasado de los artículos de panadería (efecto Anti staling). Para ello se añadirán adecuadamente a la masa antes del cochurado. Por lo tanto constituyen formas de realización preferentes de la presente invención aquellas en las que se utilicen proteínas según la invención para la fabricación de artículos de panadería.

El empleo de una proteína o derivado según la invención para el desprendimiento de uniones por pegado que contengan almidón representa otra forma de realización.

Del mismo modo los procedimientos de pegado temporales, caracterizados porque se emplea en los mismos una proteína o derivado según la invención, representan una forma de realización de este objeto de la invención.

Además de otros productos naturales se utilizan también los almidones desde hace siglos como aglutinantes en la fabricación del papel y para el pegado de papeles y cartones diversos. Esto se refiere por ejemplo a la industria gráfica y del libro. En el transcurso de períodos largos de tiempo pueden presentarse ondulaciones o roturas de tales papeles bajo efectos desfavorables, tal como por ejemplo la humedad, lo cual puede conducir hasta su destrucción total. Durante la restauración de tales papeles y cartones puede ser necesario el desprendimiento de las capas de pegamento y esto se facilita considerablemente mediante el empleo de una proteína amilolítica según la invención.

Los polímeros vegetales tales como los almidones o la celulosa y sus derivados solubles en agua se utilizan, entre otras cosas, como pegamentos o engrudos. Para ello tienen que hincharse en primer lugar en agua y secarse, tras aplicación sobre el objeto a ser pegado, con lo cual éste se fija sobre la base. El enzima según la invención puede añadirse a una suspensión acuosa de este tipo para influenciar las propiedades de pegado del engrudo formado. Sin embargo, en lugar de esta función o adicionalmente a la misma, puede añadirse al engrudo para permanecer inactivo sobre el objeto pegado tras el secado durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo durante algunos años. Las modificaciones específicas de las condiciones ambientales, por ejemplo mediante humectación, pueden emplearse para que se active el enzima en un momento ulterior y, de este modo, se produzca un desprendimiento del engrudo. De este modo puede desprenderse el objeto pegado fácilmente de nuevo de la base. En este procedimiento el enzima según la invención actúa, debido a su actividad amilolítica, como agente separador en un procedimiento de pegado temporal o como el denominado "conmutador" para desprender el objeto pegado.

Ejemplos Ejemplo 1

Entre los candidatos de un muestreo microbiológico de microorganismos formadores de amilasa con el criterio de selección constituido por el crecimiento y la formación de halo sobre placas de agar con almidón, como única fuente de carbono, se encontraba también la cepa de Bacillus sp. (RNA-Grupo VI, alcaliphil) A 7-7, que ha sido depositada en la DSMZ. (DSM ID 98-587, depósito DSM 12368).

El cultivo se llevó a cabo en medio YPSS, que contiene 15 g/l de almidón soluble, 4 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de K_{2}HPO_{4} y 0,5 g/l de MgSO_{4} x 7 H_{2}O. El valor del pH se ajustó a 10,3 tras el tratamiento en autoclave, con solución al 20% de carbonato de sodio. Se cargaron respectivamente 25 ml del medio en matraces de Erlenmeyer estériles de 100 ml y se inocularon con un cultivo de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), que había crecido sobre una placa de agar YPSS. El cultivo se llevó a cabo a 30ºC durante 48 h con aplicación de sacudidas a 200 rpm.

Ejemplo 2

Se obtuvo un enzima singular mediante las etapas de enriquecimiento siguientes a partir del medio de cultivo: precipitación del sobrenadante del cultivo con etanol; recogida del pellets de proteína en 50 mM de tampón tris/HCl, pH 8,5; diálisis contra 50 mM de tampón tris/HCl, pH 8,5; cromatografía por intercambio catiónico sobre Fast-flow-S-Sepharose® (firma Pharmacia-Amersham Biotech, Freiburg) con 50 mM de tampón tris/HCl, pH 8,5 como eluyente; retamponado del permeato que contiene amilasa contra 20 mM de tampón de glicina/NaOH, pH 10, a través de columnas PD10® de la firma Pharmacia-Amersham Biotech; cromatografía con intercambio de aniones a través de Mono-Q® (firma Pharmacia-Amersham Biotech) con elución con el mismo tampón con un gradiente salino creciente desde 0 hasta 1 M de NaCl. La amilasa eluye aproximadamente a 0,25 M de NaCl.

De este modo se obtienen, a partir de 250 ml de medio de cultivo, como se ha determinado con ayuda del método BCA (ácido bicinconinoico; ácido 2,2'-biquinolil-4,4'-diarboxílico), 2,6 mg de una proteína pura según la electrofóresis de gel SDS y la tinción con plata.

El enzima amilolítico de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) presenta un peso molecular de 58 kD en el caso de una electrofóresis desnaturalizante con gel de poliacrilato SDS en un gel al 8-25%, en el sistema PHAST® de la firma Pharmacia-Amersham y en comparación con grandes marcas reconocidas.

De acuerdo con la focalización isoeléctrica a pH 3 hasta 9 en el sistema PHAST® de la firma Pharmacia-Amersham el punto isoeléctrico se encuentra en 6,0.

La actividad amilolítica del enzima purificado se determinó con ayuda del método denominado DNS, es decir mediante el empleo de acido dinitrosalicílico. Para ello se detectan los oligosacáridos, los disacáridos y las unidades de glucosa, liberados mediante el enzima durante la hidrólisis del almidón, mediante oxidación de los extremos reductores con ácido dinitrosalicílico (DNS). La intensidad del desarrollo de color es proporcional en este caso al número de productos de disociación formados. Este ensayo se lleva a cabo de la manera siguiente: tras una incubación de 50 \mul de solución enzimática con 100 \mul de almidón soluble al 1% en tampón de tris/maleato pH 6,5 (12,11 g de tris + 11,61 g de ácido maleico hasta 1 litro, pH ajustado con NaOH 0,2 N) a 50ºC durante 15 minutos, se oxidan los sacáridos reducidos con 300 \mul de solución de DNS (8,8 g de ácido nitrosalicílico, 915 ml de agua destilada, 250 g de tartrato de K-Na, 334 ml de NaOH al 4,5%, 6,3 g de disulfito de sodio) a 100ºC durante 20 minutos. Tras refrigeración en el baño de hielo se detecta la absorción fotométricamente a 540 nm contra un valor en blanco. La calibración del análisis se lleva a cabo por medio de una serie de concentraciones de maltosa. La actividad se da en \mumoles de azúcar reductor (con relación a la maltosa) por min y ml.

La proteína ejemplificativa presenta, según este ensayo, una clara actividad amilolítica. A continuación sirve la actividad, determinada de este modo, como parámetro para la estabilidad del enzima bajo condiciones respectivamente diferentes.

La estabilidad a la temperatura del enzima se midió respectivamente mediante una incubación de 10 minutos a un valor del pH de 10. A temperatura ambiente, a 30ºC, a 40ºC y a 50ºC la actividad es, como mínimo, del 85%. A 40ºC la amilasa tiene su máximo de 90% de reactividad. A 60ºC el enzima tiene un 50% de actividad. A temperaturas por encima de 60ºC pierde intensamente en actividad, pero sin embargo a 80-90ºC presenta todavía un 10% de reactividad.

El enzima amilolítico, procedente de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), es ampliamente estable a valores del pH comprendidos entre 5 y 12, cuando se incuba, respectivamente, durante 10 minutos a 40ºC. A valores del pH desde 8 hasta 9 la amilasa es estable hasta un 100%. A valore el pH situados por debajo y por encima de estos valores la actividad disminuye lentamente; el enzima dispone de una actividad residual todavía mayor que el 65% a pH 5 y a pH 12.

Para la caracterización adicional se ensayó el efecto negativo sobre la actividad enzimática mediante posibles factores perturbadores tales como proteasas o detergentes: tras la actuación de 10 HPE/ml de la proteasa Savinase® (Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dinamarca; las unidades de HPE pueden determinarse según el método indicado en la publicación Tenside 7 (1970), páginas 125-132) y 0,1% de SDS a pH 10 durante 15 minutos y 50ºC, el enzima presenta una reactividad residual del 74%. Tras una actuación de 0,1% de SDS bajo las mismas condiciones (pH 10, 15 minutos, 50ºC) el enzima presenta una actividad residual del 98%. Del mismo modo, bajo estas condiciones (pH 10, 15 minutos, 50ºC), tiene una actividad residual todavía del 10% en presencia de 3 mM de EDTA y en presencia de 1 mM de EDTA tiene todavía una actividad residual del 65%.

Ejemplo 3

Todas las etapas de trabajo de biología molecular se realizan siguiendo métodos establecidos, como los que se han indicado por ejemplo en los manuales tal como en el de Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989.

En primer lugar se precipitó con etanol la proteína obtenida según el ejemplo 1 y purificada según el ejemplo 2, para la determinación de la secuencia interna de aminoácidos y se separó por medio de electrofóresis desnaturalizante de SDS-poliacrilo. Tras corte de la banda correspondiente, procedente del gel de SDS poliacrilamida, se digerió con tripsina in situ, el péptido resultante se separó por medio de HPLC y se analizó mediante degradación Edman y MALDITOF. A partir del gran número de fragmento tripsínicos, obtenidos de este modo, se eligieron los dos D1 y D6 siguientes:

D1:	GITAVWIPPAWK	5'-GTN TGG ATH CCN CCN GCN TGG-3'
D6:	QGTYPSVFYGDYYGIPTH	5'-GGD ATN CCN TAN TAR TCN CC-3'

De acuerdo con sus secuencias de aminoácidos (indicadas en la izquierda) se construyó el iniciador PCR correspondientemente degenerado. Sus secuencias de nucleótidos se han indicado a la derecha (N significa cualquier base; H significa A o C o T; R significa A o G; D significa A, G o T).

A partir de DNA cromosómico, preparado de manera habitual, de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) como matriz, pudo amplificarse con este par iniciador, en una PCR patrón, un fragmento con un tamaño aproximado de 1.000 bp. Este fragmento de PCR se clonó para su almacenamiento en el vector pGEM-Teasy® (firma Promega, Madison, Wisconsin, USA).

Ejemplo 4

El fragmento de PCR purificado se marcó como sonda de DNA tras orientación con el estuche de etiquetado no radioactivo DIG-High-Prime® de la firma Boehringer Mannheim (Alemania; producto número 1745832). Para la hibridación subsiguiente se disoció DNA cromosómico de la cepa Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368) con el enzima de restricción Xba I y se separó sobre un gel de agarosa al 0,9%. El DNA pudo transferirse con ayuda de un dispositivo de transferencia por borrones en vacío (Vakuum-Blotters) hasta una membrana de nylon cargada positivamente (firma Roche, Mannheim). La hibridación de DNA y la detección inmunológica del fragmento de PCR, empleado como sonda, se llevan a cabo por medio de la rutina del estuche DIG-High-Prime® Labeling-and-Detection-Starter I® de la firma Boehringer Mannheim. Se detecta que el gen buscado se encuentra en un fragmento de DNA con un tamaño aparente de aproximadamente 3.000 - 4.000 bp. Los fragmentos de este orden de magnitud se purificaron por medio de un gel de agarosa al 0,9% y, a continuación, se ligaron en el vector pCB56C (procedente de B. subtilis DB104; descrito en la solicitud WO 91/02792) troceado con los enzimas de restricción Xba I y Nhe I. Después de la transformación en una cepa de Bacillus subtilis negativa a la amilasa pudieron identificarse los clones positivos a la amilasa sobre placas de agar que contenían almidón mediante la formación de halo. Un material aislado representativo portaba el inserto deseado.

Ejemplo 5

La secuenciación del plásmido obtenido se llevó a cabo según el método de la interrupción de la cadena según procedimientos usuales. El plásmido contenía un inserto con un tamaño de 2.015 bp. Sobre éste se ligó el gen que comprende 1.545 bp para el enzima interesado, que se ha indicado en la presente solicitud bajo la SEQ ID NO. 1 en el protocolo de secuencias. Éste corresponde a un polipéptido de 516 aminoácidos, cuya secuencia se ha indicado en la SEQ ID NO. 2 en el protocolo de secuencias. El peso molecular, deducido a partir de esta secuencia de aminoácidos, es de 59 kD o bien para la proteína madura, obtenida mediante la disociación de los 31 aminoácidos que comprende el péptido de señal, es de 55,5 kD.

La comparación entre las secuencias según el método de BLAST (S. F. Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25 (1997), páginas 3389-3402), que se llevó a cabo el 17.3.2000, caracteriza el enzima como \alpha-amilasa. La homología de esta proteína con respecto a las proteínas conocidas se encuentra, tal como muestra la tabla 2 siguiente, en el plano de las proteínas entre un 71 y un 95% de identidad.

TABLA 2 Homología del enzima según la invención procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368) con respecto a las proteínas más parecidas y con respecto a otras proteínas representativas; dada en % de identidad en el plano de las proteínas. Se han indicado con ID los números de registro del banco de datos Swiss-Prot (Ginebra, Suiza)

Organismo	ID	Identidad (%)
B. alcalophilus	P19571	95
B. alcalophilus	WO 96/23873	91
B. licheniformis	P06278	72
B. amyloliquefaciens	P00692	72
B. stearothermophilus	P06297	71

En la figura 1 se ha representado un alineamiento con proteínas representativas. Todas ellas están constituidas por \alpha-amilasas, de manera que debe suponerse, debido a su amplia coincidencia, que el enzima según la invención está constituido también por una \alpha-amilasa. Esto se confirma con la obtención original del gen a partir de un microorganismo degradante de los almidones (ejemplo 1) y mediante la comprobación de la actividad amilolítica de un transformante con el plásmido que porta el inserto (ejemplo 4). Las propiedades de la proteína amilolítica, obtenida a partir de esta cepa de producción, coinciden con las de la cepa del tipo silvestre (ejemplo 2). Dicha cepa de producción puede prepararse según el ejemplo 4.

Ejemplo 6

Se ensuciaron, de manera normalizada, textiles de algodón con las cuatro suciedades diferentes A (Mousse au chocolat), B (copos de maíz con cacao), C (copos de maíz con cacao y un poco de leche) y D (almidón de patata) y se ensayaron por medio del material preparado de este modo, diversas recetas de agentes de lavado mediante realización de coladas, en cuanto a sus prestaciones de lavado. Para ello se estableció respectivamente una proporción de baño de 1:12 y se llevó a cabo la colada durante 30 minutos a una temperatura de 30ºC. La dosis era de 5,88 g de cada agente de lavado por litro de baño de colada. La dureza del agua fue de 16º de dureza alemana.

Como agente de lavado de control sirvió para A, B y C una receta básica de agente de lavado con la siguiente composición (todas las indicaciones en % en peso): alquilbencenosulfonato lineal (sal de sodio) 4%, sulfato de alcoholes grasos con 12-18 átomos de carbono (sal de sodio) 4%, alcoholes grasos con 12-18 átomos de carbono con 7 EO 5,5%, jabones de sodio 1%, carbonato de sodio 11%, disilicato de sodio amorfo 2,5%, tetrahidrato de perborato de sodio 20%, TAED 5,5%, zeolita A 25%, policarboxilato 4,5%, fosfonato 0,5%, granulado inhibidor de la espuma 2,5%, sulfato de sodio 5%, granulado de proteasa 1%, resto: agua, abrillantador óptico, perfume, sales. Se combinaron con diversas amilasas para las diversas series de ensayos de tal manera que se produjo, respectivamente, una concentración final de 44 TAU de actividad amilolítica por litro de baño de colada.

Para la determinación de la actividad amilolítica en TAU se utiliza un p-nitrofenilmaltoheptaósido modificado, cuya unidad de glucosa situada en el extremo de la cadena está bloqueada por un grupo de bencilideno; éste se disocia por medio de amilasa para dar p-nitrofenil-oligosacárido libre, que, por su parte, se transforma con ayuda de los enzimas auxiliares constituidos por la glucoamilasa y por la \alpha-glucosidasa, para dar glucosa y p-nitrofenol. De este modo la cantidad de p-nitrofenol liberada es proporcional a la actividad de la amilasa. La medida se lleva a cabo, por ejemplo, con el estuche de ensayo Quick-Start® de la firma Abbott. El aumento de absorción (405 nm) en la carga de ensayo se detecta a 37ºC durante 3 min frente a un valor en blanco por medio del fotómetro. La calibración se lleva a cabo por medio de un patrón enzimático con actividad conocida (por ejemplo Maxamyl®/Purastar® 2900 de la firma Genencor con 2900 TAU/g). La evaluación se lleva a cabo mediante la aplicación de la diferencia de absorción dE (405 nm) por min frente a la concentración enzimática del patrón.

Con el enzima amilolítico, según la invención, procedente de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) se compararon Termamyl®, Duramyl® y BAN® (fabricante respectivamente: Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dinamarca). Para la suciedad de D se utilizó la misma receta de base, desde luego sin proteasa, y se empleó como A-C como controles, o bien se combinó con amilasas.

En el ejemplo presente se midió el grado de blancura de los textiles en el sistema CIELAB con el dispositivo de medida Minolta CR 310 antes y después de la colada en comparación con un patrón, que se tomó con 100%. Las diferencias de los valores obtenidos se han reunido en la tabla 3 siguiente para los ensayos correspondientes. Se ha dado el valor medio de 5 mediciones. Éstos permiten tener en consideración directamente la contribución del enzima obtenido a las prestaciones de lavado del agente empleado.

TABLA 3

Agente de lavado de base con	A	B	C	D

\hskip3mm Amilasa esencial según la invención	29,3	26,0	20,9	15,2
\hskip3mm Termamyl®	25,9	22,7	17,4	12,3
\hskip3mm Duramyl®	28,6	23,4	20,2	14,3
\hskip3mm BAN®	22,5	22,0	17,0	13,2
\hskip3mm Controles sin amilasa	22,9	22,2	11,9	10,0
Desviación patrón	1,3	0,6	1,4	2,2

Puede verse que la \alpha-amilasa procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368) produce, en el caso de la suciedad B, prestaciones de lavado claramente mejores que las de cada uno de los tres enzimas de referencia. En los restantes tipos de suciedad ésta presenta, en el ámbito de los límites de error, prestaciones de lavado ligeramente mejores, que se encuentran siempre claramente por encima de los valores comparativos sin enzima amilolítica. Este resultado es tanto más convincente cuanto que se obtiene un agente de blanqueo en todas las recetas ensayadas de los agentes de lavado, al que reaccionan de una manera muy sensible precisamente, en general, los enzimas de tipo silvestre.

Ejemplo 7

Se ensuciaron, de manera normalizada, textiles de algodón con las suciedades B (copos de maíz con cacao) y C (copos de maíz con cacao y un poco de leche). En ensayo realizado mediante la realización de lavados se llevó a cabo como en el ejemplo 1, con el empleo de otra receta de base para el agente de lavado, concretamente con un porcentaje en peso respecto de: alquilbencenosulfonato-Na 14%, sulfonato de alcoholes grasos-Na 6%, alcoholes grasos con 12-18 átomos de carbono etoxilados 7 veces 6%, jabones 1%, zeolita Na-A 25%, carbonato de Na 10%, policarboxilato polímero 5% (Sokalan\registrado CP5), dihidrato de citrato trisódico 11%, ácido cítrico 4%, inhibidor de la espuma confeccionado en forma de partículas 1%, granulado de proteasa 1%, sulfato de sodio 5%, resto: agua y sales. Esta receta de base empleó para las diversas series de ensayos con diferentes amilasas de tal manera que se produjese respectivamente una concentración final de 33,5 TAU de actividad amilolítica por litro de baño de colada; tal como puede determinarse según el método descrito en el ejemplo 1. Con el enzima amilolítico, según la invención, procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368) se compararon Termamyl®, Duramyl® y BAN® (fabricante respectivamente: Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dinamarca). La dosis fue de 4,45 g del correspondiente agente de lavado por litro de baño de colada.

Tras la colada se determinó el grado de blancura de los textiles lavados como en el ejemplo precedente. Los valores diferenciales obtenidos en cada caso se han reunido en la tabla 4 siguiente. Se trata, respectivamente, de los valores medios procedentes de 5 mediciones, que a su vez permiten una relación directa de la contribución del enzima correspondiente a las prestaciones de lavado del agente.

TABLA 4

Agente de lavado de base con	B	C

\hskip3mm Amilasa esencial según la invención	30,6	7,5
\hskip3mm Termamyl®	29,3	15,0
\hskip3mm Duramyl®	29,2	16,7
\hskip3mm BAN®	28,9	15,6
\hskip3mm Controles sin amilasa	28,5	14,5
Desviación patrón	0,6	1,2

Se observa que la \alpha-amilasa procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368) en esta receta de agente de lavado exenta de agente de blanqueo proporciona prestaciones de lavado mejores sobre las suciedades B y C que las del enzima de referencia.

Ejemplo 8

Se ensuciaron, de manera normalizada, textiles de algodón con dos tipos diferentes de cacao con leche de dos marcas obtenibles en el comercio (E y F). A continuación se llevó a cabo el ensayo mediante la realización de coladas como se ha descrito en el ejemplo 1. Como agente de lavado de control sirvió la receta de base del agente de colada del ejemplo 2, sin embargo sin proteasa. Ésta se combinó para las diversas series de ensayos, como en el ejemplo 2, con las diversas amilasas y se empleó con la misma dosificación.

Tras la colada se determinó el grado de blancura de los textiles lavados en comparación con la del sulfato de bario, que se tomó como 100%. La medición se llevó a cabo en un espectrómetro Datacolor SF500-2 a 460 nm (filtro bloqueante de los UV 3), diafragma de 30 mm, sin brillo, tipo de luz D65, 10º, d/8º. Los resultados obtenidos se han reunido como tanto por ciento de remisión es decir como porcentaje en comparación con el sulfato de bario, en la tabla 4 siguiente. En dicha tabla se ha dado también el valor inicial correspondiente. Se han dado los valores medios procedentes de 5 mediciones. Éstos permiten una relación directa con la contribución del enzima amilolítico obtenido sobre las prestaciones de lavado del agente empleado.

TABLA 5

Agente de lavado de base con	E	F

\hskip3mm Amilasa esencial según la invención	70,3	41,0
\hskip3mm Termamyl®	67,3	39,7
\hskip3mm Duramyl®	68,3	40,5
\hskip3mm BAN®	68,7	39,8
\hskip3mm Controles sin amilasa	61,1	31,4

TABLA 5 (continuación)

Agente de lavado de base con	E	F

Valor inicial	21,1	25,0
Desviación patrón	1,0	1,2

Puede verse que la \alpha-amilasa procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368) en esta receta proporciona, en el caso de E, prestaciones de lavado claramente mejores que las de todos los enzimas de referencia ensayados y que, en el caso de F, proporciona prestaciones de lavado comparables.

Ejemplo 9

Para los ensayos de limpieza, orientados a la aplicación, se dotaron a recipientes con superficies duras, lisas de manera normalizada, con las siguientes suciedades: A (copos de avena DIN), B (copos de avena hinchados en agua) y C (almidones mixtos), y se enjuagaron a 45ºC con el programa normal de una máquina para el fregado de la vajilla doméstica tipo Miele\registrado G 575. Por cada proceso de fregado se utilizaron 20 g del agente de fregado; la dureza del agua fue de 16º de dureza alemana.

Como agente de fregado sirvió la receta de base siguiente (todas las indicaciones respectivamente en tanto por ciento en peso): polifosfato de sodio 55% (calculado como anhidro), disilicato de sodio amorfo 4% (calculado como anhidro), carbonato de sodio 22%, perborato de sodio 9%, TAED 2%, tensioactivo no iónico 2%, granulado de proteasa 1,4%, resto: agua, colorante, perfume. Esta receta de base se empleó para los diversos ensayos con diversas amilasas, concretamente con Termamyl®, Duramyl® y BAN® (fabricante respectivamente: Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Dinamarca) o con el enzima amilolítico según la invención procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368), en cantidades activas de, respectivamente, tal como se ha determinado de acuerdo con el método indicado en el ejemplo 1, 150 TAU de actividad amilolítica por programa de limpieza.

Tras el fregado se evaluó la descarga de la suciedad A, tras coloración con yodo por medio de la reacción de yodo-almidón, a simple vista en una escala desde 0 (= invariable, es decir suciedad muy fuerte) hasta 10 (= ausencia de suciedad reconocible). La descarga de las suciedades B y C se determinaron por gravimetría en tanto por ciento. Para ello se correlacionó la diferencia entre el peso del recipiente sucio y fregado a continuación y el peso inicial del recipiente con la diferencia de peso entre el recipiente no fregado y el peso inicial. Esta relación puede considerarse como porcentaje de descarga.

Los resultados obtenidos se han reunido en la tabla 6 siguiente. En la misma se han dado los valores medios procedentes respectivamente de nueve mediciones para A y B, o bien de 18 mediciones para C. Éstos permiten una correlación directa sobre la contribución del enzima obtenido sobre las prestaciones de limpieza del agente empleado.

TABLA 6

Agente de lavado de base con	A	B	C
		% de descarga	% de descarga
\hskip3mm Amilasa esencial según la invención	6,2	91,2	95,8
\hskip3mm Termamyl®	3,7	53,9	15,7
\hskip3mm Duramyl®	2,2	78,8	35,5
\hskip3mm BAN®	3,7	69,1	34,2
\hskip3mm Controles sin amilasa	4,3	31,7	0,6

Estos resultados muestran que la \alpha-amilasa procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368) sobrepasa, en lo que se refiere a sus prestaciones de limpieza en los agentes para el fregado a máquina de la vajilla en las tres suciedades, a una temperatura de fregado de 45ºC, a todas las otras amilasas ensayadas.

Ejemplo 10

Se aplicaron a recipientes con superficies duras, lisas, las mismas suciedades que en el ejemplo precedente y se fregaron a 55ºC. Las condiciones de limpieza y la receta del agente empleado correspondían igualmente a los del ejemplo precedente.

Tras el fregado se evaluó la descarga de la suciedad A a simple vista como en el ejemplo 4 mediante la reacción de yodo-almidón y se evaluó en una escala desde 0 hasta 10; y la descarga de las suciedades B y C se determinó igual que en el ejemplo 4, por gravimetría en porcentaje. Los resultados obtenidos se han reunido en la tabla 6 siguiente en la misma se han indicado los valores medios, respectivamente, de 9 mediciones para A, 10 para B y 18 mediciones para C. Éstos permiten una relación directa de la contribución del enzima obtenido sobre las prestaciones de lavado del agente empleado.

TABLA 7

Agente de lavado de base con	A	B	C
		% de descarga	% de descarga
\hskip3mm Amilasa esencial según la invención	8,3	97	99
\hskip3mm Termamyl®	6,7	95	53
\hskip3mm Duramyl®	6,9	95	89
\hskip3mm BAN®	6,2	92	77
\hskip3mm Controles sin amilasa	5,3	71	27

Estos resultados muestran que la \alpha-amilasa procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368) supera, en cuanto a lo que se refiere a sus prestaciones de lavado en los agentes para el fregado a máquina de la vajilla en las tres suciedades, incluso a 55ºC de temperatura de fregado, a todas las otras amilasas ensayadas.

Descripción de las figuras

Figura 1: alineación del encima amilolítico según la invención procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368) con las tres amilasas más parecidas.

En esta figura significan:

1.: amilasa procedente de Bacillus sp. A7-7 (DSM 12368)

2.: amilasa madura procedente de Bacillus sp. # 707 según: Tsukamoto, Kimura, Ishii, Takano y Yamane, Biochem. Biophys. Res. Commun. 151 (1988), páginas 25-31

3.: amilasa de la SEQ ID NO. 1 de la solicitud WO 96/23873

4.: amilasa de la SEQ ID NO. 2 de la solicitud WO 96/23873.

<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien

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<120> Nuevo enzima amilolítico procedente de Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) así como agentes de lavado y de limpieza con este nuevo enzima amilolítico

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<130> H 4713 / H 4846

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<140>

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<141>

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<150> DE10036752

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<151> 2000-07-28

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<150> DE10036753

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<151> 2000-07-28

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1551

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<212> DNA

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<213> Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1551)

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<220>

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<221> mat_peptide

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<222> (94)

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<400> 1

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1

2

3

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<210> 2

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<211> 516

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<212> PRT

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<213> Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368)

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<400> 2

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4

5

Claims

1. Proteína amilolítica con una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 96% a través de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO. 2.

2. Proteína amilolítica con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica al menos en un 98% a través de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO. 2.

3. Proteína amilolítica con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica al menos en un 96% a través de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO. 2 en las posiciones 32 hasta 516.

4. Proteína amilolítica con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica al menos en un 98% a través de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos dada en la SEQ ID NO. 2 en las posiciones 32 hasta 516.

5. Proteína amilolítica, que se deriva de una secuencia de nucleótidos, que es idéntica al menos en un 87,5% a través de toda la longitud de la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1, especialmente a través de la región parcial, que corresponde a los aminoácidos 32 hasta 516 según la SEQ ID NO. 2.

6. Proteína amilolítica, que se deriva de una secuencia de nucleótidos, que es idéntica al menos en un 90% a través de toda la longitud de la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1, especialmente a través de la región parcial que, corresponde a los aminoácidos 32 hasta 516 según la SEQ ID NO. 2.

7. Proteína amilolítica, que es idéntica completamente con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO. 2 y/o en las posiciones 32 hasta 516 y/o que es idéntica totalmente a una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1 y/o en las posiciones 32 hasta 516.

8. Derivado amilolíticamente activo de una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 7, que se obtiene mediante transformación de una cadena lateral de un aminoácido o mediante enlace covalente de otro compuesto sobre la proteína.

9. Proteína o derivado amilolítico según la reivindicación 8 que contiene en conjunto al menos un determinante antígeno con una proteína o derivado citados en las reivindicaciones 1 a 8.

10. Proteína o derivado amilolítico según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque puede obtenerse de manera natural o a partir de un microorganismo.

11. Proteína o derivado amilolítico según la reivindicación 10, caracterizado porque el microorganismo está constituido por una bacteria gram-positiva.

12. Proteína o derivado amilolítico según la reivindicación 11, caracterizado porque la bacteria gram-positiva está constituida por una del género Bacillus.

13. Proteína o derivado amilolítico según la reivindicación 12, caracterizado porque la especie Bacillus está constituida por Bacillus sp. A 7-7, especialmente por Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368).

14. Ácido nucleico que codifica una proteína amilolítica, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica al menos en un 87,5% a lo largo de toda la longitud de la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1, especialmente a través de una región parcial, que corresponde a los aminoácidos 32 hasta 516 según la SEQ ID NO. 2.

15. Ácido nucleico que codifica una proteína amilolítica, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica al menos en un 90% a través de toda la longitud de la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1, especialmente a través de una región parcial, que corresponde a los aminoácidos 32 hasta 516 según la SEQ ID NO. 2.

16. Ácido nucleico que codifica una proteína amilolítica, que es idéntica en un 100% con la secuencia de nucleótidos indicada en la SEQ ID NO. 1, especialmente a través de una región parcial, que corresponde a los aminoácidos 32 hasta 516 según la SEQ ID NO. 2.

17. Ácido nucleico que codifica una de las proteínas o derivados indicados en una de las reivindicaciones 1 a
13.

18. Microorganismo natural que forma una de las proteínas o derivados indicados en una de las reivindicaciones 1 a 13 o que contiene ácido nucleicos que los codifican.

19. Microorganismo según la reivindicación 18, caracterizado porque es una bacteria.

20. Microorganismo según la reivindicación 19, caracterizado porque la bacteria está constituida por una bacteria gram-positiva.

21. Microorganismo según la reivindicación 20, caracterizado porque la bacteria gram-positiva está constituida por una del género Bacillus, especialmente por Bacillus sp. A 7-7, muy especialmente por Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368).

22. Vector, que contiene una región de los ácidos nucleicos indicados en una de las reivindicaciones 14 a 17, o que contiene una región de ácidos nucleicos que codifica una de las proteínas o derivados indicados en una de las reivindicaciones 1 a 13.

23. Vector de clonación según la reivindicación 22.

24. Vector de expresión según la reivindicación 22.

25. Célula, que contiene un vector según una de las reivindicaciones 22 a 24.

26. Célula huésped, que expresa una de las proteínas o derivados indicados en una de las reivindicaciones 1 a 13 o que puede ser excitada para su expresión, preferentemente mediante el empleo de un vector de expresión según la reivindicación 24.

27. Célula huésped según la reivindicación 26, caracterizada porque es una bacteria, especialmente una que secreta al medio circundante la proteína o el derivado formados.

28. Célula huésped según la reivindicación 26 o 27, caracterizada porque es una bacteria del género Bacillus, especialmente de la especie Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis o Bacillus alcalophilus.

29. Célula huésped según las reivindicaciones 26 o 27, caracterizada porque es una bacteria gram-negativa.

30. Célula huésped según la reivindicación 29, caracterizada porque pertenece al género Escherichia, preferentemente a la especie Escherichia coli, de forma especialmente preferente a una de las cepas E. coli JM 109, E. coli DH 100B o E. coli DH 12S.

31. Célula huésped según la reivindicación 26, caracterizada porque es una célula eucariota, especialmente una célula que modifica de manera post-traducción a la proteína formada.

32. Procedimiento para la obtención de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13 con empleo de un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 14 a 17 y/o con empleo de un vector según una de las reivindicaciones 22 a 24 y/o con empleo de una célula huésped según una de las reivindicaciones 26 a 31 o con el empleo de una célula, que lo forme de manera natural, especialmente una célula según una de las reivindicaciones 18 a 21.

33. Agente de lavado o de limpieza caracterizado porque contiene una proteína o un derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13.

34. Agente según la reivindicación 33, caracterizado porque contiene un 0,000001 por ciento en peso hasta un 5% en peso, especialmente desde un 0,00001 hasta un 3% en peso de la proteína o del derivado amilolítico.

35. Agente según una de las reivindicaciones 33 o 34, caracterizado porque adicionalmente contiene una o varias proteínas amilolíticas diferentes, especialmente \alpha-amilasas.

36. Agente según una de las reivindicaciones 33 a 35, caracterizado porque contiene, adicionalmente, otro enzima, especialmente una o varias proteasas, lipasas, \beta-glucanasas y/o celulasas.

37. Agente según una de las reivindicaciones 33 a 36, caracterizado porque está constituido por más de una fase.

38. Agente según una de las reivindicaciones 33 a 37, caracterizado porque es sólido y porque al menos dos polvos o granulados diferentes se presentan mezclados entre sí en conjunto en estado a granel.

39. Agente según la reivindicación 37, caracterizado porque al menos dos fases sólidas se presentan enlazadas entre sí, especialmente después de una etapa conjunta de compactación.

40. Agente sólido según una de la reivindicaciones 38 a 39, caracterizado porque al menos una de las fases contiene un material sensible a las amilasas, especialmente el almidón o está al menos parcialmente rodeado o recubierto por el mismo.

41. Agente según una de las reivindicaciones 33 a 37, caracterizado porque es líquido, en forma de gel o pastoso y la proteína contenida y/o al menos uno de los enzimas contenidos y/o al menos uno de los otros componentes contenidos se presentan en estado encapsulado individualmente o junto con otros componentes, preferentemente en microcápsulas, de forma especialmente preferente en aquellas constituidas por material sensible a las amilasas.

42. Agente según una de las reivindicaciones 33 a 41, caracterizado porque la actividad amilolítica está modificada por uno de los otros componentes del agente, especialmente estabilizada y/o se aumenta en cuanto a su contribución a las prestaciones de lavado o bien de limpieza del agente.

43. Procedimiento para la limpieza de textiles o de superficies duras, caracterizado porque se activa una proteína o derivado amilolítico según una de las reivindicaciones 1 a 13 al menos en una de las fases del procedimiento.

44. Procedimiento para la limpieza de textiles o de superficies duras, caracterizado porque se emplea un agente según una de las reivindicaciones 33 a 42 al menos en una de las etapas del procedimiento.

45. Procedimiento según las reivindicaciones 43 o 44, caracterizado porque la proteína o el derivado amilolítico se emplean en la etapa correspondiente del procedimiento en una cantidad desde 0,01 mg hasta 200 mg por aplicación, preferentemente desde 0,02 mg hasta 100 mg por aplicación.

46. Empleo de una proteína o derivado amilolítico según una de las reivindicaciones 1 a 13 solo o junto con al menos otro producto activo con actividad de limpieza o que favorezca la actividad limpiadora, para la limpieza de textiles o de superficies duras.

47. Empleo de un agente según una de las reivindicaciones 33 a 42 para la limpieza de textiles o de superficies duras.

48. Empleo según las reivindicaciones 46 o 47, caracterizado porque se emplean desde 0,01 mg hasta 200 mg de la proteína o del derivado amilolítico, preferentemente desde 0,02 mg hasta 100 mg de la proteína o del derivado amilolítico por aplicación, preferentemente por aplicación en una máquina para el fregado de la vajilla o en una máquina lavadora.

49. Empleo de una proteína o derivado amilolítico según una de las reivindicaciones 1 a 13 solo o junto con al menos otro producto activo con actividad limpiadora o que favorezca el efecto de limpieza en un agente de lavado o de limpieza, constituido por más de una fase, para la activación de la propia fase o de otras fases.

50. Empleo de una proteína o derivado amilolítico según una de las reivindicaciones 1 a 13, solo o junto con al menos un producto activo con actividad limpiadora o que favorezca el efecto limpiador en un agente de lavado o de limpieza con componentes encapsulados para la liberación de los componentes a partir de las cápsulas.

51. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13 para el tratamiento de materiales en bruto o de productos intermedios en la fabricación de textiles, especialmente para el desencolado del algodón.

52. Procedimiento para la licuación de almidones, especialmente para la producción de etanol, caracterizado porque se emplea una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13.

53. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de oligosacáridos lineales y/o de cadena corta.

54. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13 para la hidrólisis de ciclodextrinas.

55. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13 para la liberación de compuestos de bajo peso molecular a partir de portadores de polisacáridos o de ciclodextrinas.

56. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de artículos comestibles y/o de componentes para artículos comestibles.

57. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13 para la fabricación de piensos para animales y/o de componentes para piensos para animales.

58. Empleo de una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13 para el desprendimiento de las uniones por pegado que contienen almidón.

59. Procedimiento de pegado temporal caracterizado porque se emplea una proteína o derivado según una de las reivindicaciones 1 a 13.