ES2251134T3 - Uso de complejos entre liposomas cationicos y polidesoxirribonucleotidos como medicamentos. - Google Patents
Uso de complejos entre liposomas cationicos y polidesoxirribonucleotidos como medicamentos.Info
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Abstract
Complejos formados por liposomas catiónicos y por polidesoxirribonucleótidos con un peso molecular en el intervalo de 7.000-60.000 Da, preferiblemente de 10.000- 60.000 Da, obtenibles mediante la despolimerización de ácidos nucleicos, en los que los polidesoxirribonucleótidos están localizados en la superficie exterior del liposoma, para su uso como un medicamento.
Description
Uso de complejos entre liposomas catiónicos y
polidesoxirribonucleótidos como medicamentos.
La presente invención se refiere al uso como
medicamentos de complejos formados por liposomas catiónicos y
polidesoxirribonucleótidos. Más específicamente, la presente
invención se refiere al uso de los complejos mencionados
anteriormente, que poseen una notable estabilidad en el tiempo,
como medicamentos con actividad antinflamatoria.
Se sabe que los liposomas pueden usarse como
vehículos para la administración sistémica de fármacos. Se
administran mediante inyección intravenosa, subcutánea,
intramuscular o por infusión.
En cuanto a lo que se refiere a la estructura de
los complejos entre los liposomas y los ADN, se sabe que los
oligodesoxirribonucleótidos y los ADN de plásmidos pueden unirse
mediante un enlace iónico a la superficie externa de liposomas
catiónicos (C. F. Bennet y col., Mol. Pharmacol. 41,
1023-1033, 1992; Xiang Gao y col., Biochem.
Biophys. Res. Comm. 179, 280-285, 1991). Sin
embargo, no se da ninguna indicación sobre la estabilidad en el
tiempo de dichos complejos ni sobre su uso como fármacos
antinflamatorios. También se sabe, por la solicitud de patente
WO97/04787 que cuando los oligonucleótidos tienen una longitud de
cadena de entre 8 y 50 nucleótidos, pueden quedar confinados en los
liposomas. También, en esta referencia no se da información sobre la
estabilidad de los complejos en el tiempo.
Se han descrito los complejos con liposomas y
polidesoxirribonucleótidos con un peso molecular de 16000 Da,
obtenidos mediante la despolimerización de ácidos nucleicos, en los
que estos polímeros están contenidos dentro de la vesícula lipídica
(Gursoy y col., Pharmazie 48, (1993) H. 7, 559-560).
Puede repetirse lo mismo dicho anteriormente para el documento
WO97/04787.
También se sabe que los complejos de liposomas
con oligonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos tienen la
propiedad de aumentar notablemente las actividades farmacológicas
de estas últimas sustancias (Bennet y col., Gursoy y col., véase
anteriormente; A. Colige, Biochemistry 1993, 32,
7-11). Sin embargo, las pruebas llevadas a cabo por
el Solicitante han demostrado que estos complejos de la técnica
anterior no pueden usarse como agentes terapéuticos porque, cuando
se suspenden en un medio acuoso, lo que es necesario para su
administración, pierden muy rápidamente su actividad con el tiempo.
Además de esto, en dichos complejos los componentes catiónicos del
liposoma, tales como, por ejemplo, estearilamina y los tensioactivos
de amonio cuaternario, pueden ser agentes potencialmente tóxicos, y
causar efectos secundarios tóxicos. La degradación del complejo
también es evidente, dados los cambios en el aspecto físico de la
fase acuosa con el tiempo, que se vuelve desde opalescente
(emulsión inicial) hasta cristalina al final, con la formación de un
precipitado.
El documento
WO-A-96/18372 (GENZYME CORP)
describe anfífilos catiónicos y plásmidos para la administración
intracelular de moléculas terapéuticas. Dichos anfífilos catiónicos
contienen un grupo lipófilo conectado directamente, o a través de
un grupo conector, a dos grupos catiónicos, comprendiendo éste
último grupos amino, alquilamina o polialquilamina, de forma que da
como resultado una estructura en forma de "T". Usando dichos
anfífilos catiónicos, se incrementa la interacción del anfífilo con
moléculas terapéuticas tales como ácidos nucleicos, o con
estructuras celulares, tales como las glucoproteínas de la membrana
plasmática. Un tipo de estructura que puede formarse mediante dichos
anfífilos es el liposoma, una vesícula formada por una bicapa más o
menos esférica que es estable para los fluidos biológicos y que
puede confinar moléculas biológicas.
ZELPHATI y col. "Cationic liposomes as an
oligonucleotide carrier; mechanism of action", J. Lipos. Res,
vol. 7, n.º1, enero de 1997, describen la aplicación in
vitro de liposomas catiónicos de oligonucleótidos antisentido
(ODN). En el párrafo "Introduction" establecen que antes de
que alcancen su objetivo intracelular, los ODN deben superar varios
obstáculos, incluyendo su sensibilidad a las nucleasas, su baja
captación celular y su capacidad para hibridar con su ADN o ARN
objetivo presente en el citoplasma y/o en el núcleo de las células.
Una estrategia alternativa para evitar los problemas de estabilidad
y permeabilidad es usar los liposomas como vehículos de los ODN. Los
liposomas pueden proteger a los ODN del medio externo y pueden
suministrar las moléculas directamente en las células. En el
párrafo "Physicochemical characteristics of ODN/cationic lipid
complexes", se establece que el transporte de los
oligonucleótidos por lípidos catiónicos se basa en la interacción
electrostática entre las cargas negativas de los oligonucleótidos y
las cargas positivas de los lípidos. Por lo tanto, dichos liposomas
catiónicos no requieren ninguna etapa de encapsulación que limite
la aplicación de estos vehículos.
El documento
WO-A-90/10448 describe un conjugado
en el que un lípido está acoplado covalentemente a un
oligonucleótido.
El documento
EP-A-0558833 describe
oligodesoxirribonucleótidos con actividad antisquémica y un peso
molecular comprendido entre 4.000 y 10.000.
Los polidesoxirribonucleótidos, y específicamente
los conocidos como defibrotide, son bien conocidos como
medicamentos con una actividad profibrinolítica (R. Pescador y
col., Thromb. Res. 30: 1-11, 1983),
antitrombótica-trombolítica (R. Niada y col.,
Pharmacol. Res. Comm. 14 (10), 949-957, 1982)
antihipertensora (F. Trento y col., XXVII Congr. Naz. Soc. It.
Farmacol., Torino, 25-29 de septiembre de 1994,
Libro de Resúmenes, pág. 703), antisquémica, citoprotectora (G.
Rossoni y col., J. Cardiavasc. Pharmacol. 27,
680-685, 1986) y actividad antinflamatoria (R.
Scalia, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 18 (l0),
669-676, 1996). Las dosis diarias varían entre 600 y
1200 mg. Todas estas actividades farmacológicas de la sustancia son
esencialmente referibles a su propiedad de liberar localmente
cantidades terapéuticamente eficaces de prostaciclina endógena
desde el endotelio vascular (ref. R. Niada y col., anterior, C.
Thiemermann y col., Am. J. Cardiol. 56, 978-982,
1985).
Ahora el Solicitante ha averiguado sorprendente e
inesperadamente que es posible preparar complejos a partir de los
liposomas y los polidesoxirribonucleótidos con una alta actividad
que perdura en el tiempo, desprovistos de cualquier efecto
secundario tóxico.
Esto permite el uso de emulsiones acuosas que
contienen los complejos de la invención para subsiguientes
tratamientos, durante uno o más días, y también para
administraciones de larga duración, tales como infusiones.
Por lo tanto, es un objeto de la invención el uso
como medicamentos, específicamente como antinflamatorios, de los
complejos formados por liposomas catiónicos y por
polidesoxirribonucleótidos con un peso molecular en el intervalo de
7.000-60.000, preferiblemente de
10.000-60.000, muy preferiblemente de
15.000-60.000 Da, obtenibles mediante la
despolimerización de ácidos nucleicos, en los que los
polidesoxirribonucleótidos están localizados en la superficie
externa del liposoma.
Dichos complejos de liposomas se caracterizan
porque sus disoluciones, mediante la adición de alícuotas de una
disolución del cloruro de cetilpiridinio, forman una cantidad de un
precipitado con dicho ión de amonio cuaternario que es diferente al
obtenible mediante el tratamiento en las mismas condiciones de una
disolución de los complejos de liposomas de los mismos
polidesoxirribonucleótidos y liposomas catiónicos, en los que los
polidesoxirribonucleótidos están, en cambio, localizados dentro del
liposoma.
En una forma de realización preferible de la
invención, el polidesoxirribonucleótido es un defibrotide.
Por lo tanto, según la presente invención también
es posible reducir la dosis diaria que se va administrar al
paciente, sin afectar a la eficacia de la terapia.
Los liposomas son vesículas lipídicas que se
forman en fase acuosa, y generalmente están formadas por
fosfolípidos. Dichos compuestos forman, en presencia de agua y de
un disolvente orgánico insoluble, una cubierta esférica cuya pared
es una doble capa, en la que la porción polar de la molécula
(hidrófila) está en el lado exterior del liposoma y la porción
lipídica (hidrófoba) está dentro de la doble capa. La vesícula se
denomina en este caso monolaminar. También hay liposomas
multilaminares, que están formados por más capas lipídicas.
Los polidesoxirribonucleótidos con un peso
molecular en el intervalo de 15.000-60.000 que se
usan en los complejos con liposomas según la presente invención son
obtenibles mediante una extracción y la subsiguiente
despolimerización de ácidos nucleicos de alto peso molecular.
La extracción de los ácidos nucleicos de alto
peso molecular puede llevarse a cabo según se describe en el
documento USP 3.770.720. Es posible obtener
polidesoxirribonucleótidos con un peso molecular en el intervalo de
15.000- 30.000 llevando a cabo la despolimerización de los ácidos
nucleicos según se describe en el documento USP 4.985.552. El
Solicitante ha verificado que es posible obtener también polímeros
con un peso molecular en el intervalo de
30.000-60.000, usando las mismas condiciones de
proceso del documento USP 4.985.552 deteniendo la despolimerización
cuando el valor de la hipercromicidad reversible, según se define
en Methods in Enzymol., vol. III, págs. 708-712,
esté comprendido entre el 20 y el 40% (con respecto al valor de la
absorbancia de la hipercromicidad reversible de la muestra no
desnaturalizada), o deteniendo la despolimerización cuando el valor
de la hipercromicidad reversible sea mayor o igual a 3, para
obtener polidesoxirribonucleótidos con un peso molecular mayor o
igual a 7.000. La hipercromicidad reversible es el parámetro
mediante el cual se supervisa el progreso de la despolimeri-
zación.
zación.
Los polidesoxirribonucleótidos preferibles para
formar el complejo con el liposoma catiónico son aquellos conocidos
como defibrotide (D.C.I.) con un peso molecular en el intervalo de
15.000-30.000 (Informations Pharmaceutiques O.M.S.,
nº 4, vol. 1/1987, pág. 272).
Los principales componentes lipídicos de los
liposomas de la invención son fosfatidilcolina o
fosfatidiletanolamina, que pueden combinarse en el liposoma con
otros lípidos según se describe en R.R.C New volume "Liposomes, a
practical approach", IRL Press, 1994. Los lípidos asociados
preferibles son ergosterol y colesterol.
A la composición pueden añadirse uno o más
antioxidantes elegidos entre aquellos conocidos y que están
enumerados en la misma referencia mencionada previamente. El
antioxidante preferible es alfa-tocoferol.
A los liposomas de la invención se añaden
tensioactivos catiónicos que contienen uno o más grupos amínicos
mono o disustituidos, o grupos de amonio cuaternario. Dicho grupos
de amonio cuaternario contienen una o más cadenas alifáticas con un
número de átomos de carbono que varía entre 8 y 22.
Son preferibles los tensioactivos de amonio
cuaternario con cadenas alifáticas de 18 átomos de carbono.
La proporción molar entre la cantidad total
del(los) lípido(s) del liposoma y el tensioactivo
catiónico varía entre 10:0,05 y 10:3, preferiblemente es de 10:1.
Cuando junto con la fosfatidilcolina (o la fosfatidiletanolamina)
hay un segundo y diferente lípido, las proporciones molares
internas entre cada uno de los dos lípidos y el tensioactivo
(fosfatidilcolina (o fosfatidiletanolamina): segundo lípido:
tensioactivo) varían entre 9:1:0,05 y 7:3:3, preferiblemente
8:2:1.
La proporción ponderal entre la cantidad de
liposoma y la de principio activo (polidesoxirribonucleótidos) varía
entre 10:2 y 10:0,1, preferiblemente es de 10:1.
La preparación de los complejos de liposomas
catiónicos usados en la presente invención puede llevarse a cabo
según describen D. C. Litzinger, Biochim. Biophys. Acta 1281,
139-149, 1996, o el anteriormente mencionado R.R.C.
New's volume. En particular, un procedimiento usable para preparar
el complejo de la presente invención comprende las siguientes
etapas:
- a.
- preparación del liposoma mediante el procedimiento de la evaporación del disolvente en fase inversa, ref. Szoka, P. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 75, 4194, 1978): 4 partes de fase orgánica, que puede ser polar (por ejemplo, alcoholes alifáticos inferiores C_{1}-C_{4} lineales o ramificados) o apolar (por ejemplo, éteres de dialquilo C_{1}-C_{4} lineales o ramificados, tales como, por ejemplo, éter de dietilo, hidrocarburos C_{1}-C_{2} parcialmente clorados, preferiblemente cloroformo), en las que están solubilizados los lípidos, el tensioactivo catiónico y el antioxidante, con una parte de agua, el sistema bifásico así obtenido se somete a ultrasonidos a 0ºC durante 5-20 minutos, entonces la fase orgánica se evapora a temperatura ambiente y a una presión reducida, obteniendo así una emulsión,
- b.
- hacer fluir dicha emulsión, según la técnica descrita en las páginas 52-54 del R.R.C. New volume, a través de una membrana de policarbonato con un diámetro de poro que varía entre 100 y 600 nm, preferiblemente de 400 nm; entonces la etapa se repite durante al menos tres veces, de forma que se obtenga un diámetro medio de vesícula comparable al de los poros de la membrana,
- c.
- liofilizar la emulsión acuosa, tras la adición de una disolución acuosa de un coadyuvante de liofilización, por ejemplo, monosacáridos tales como sacarosa, sorbitol, manitol, fructosa, o polisacáridos tales como dextranos, maltodextrinas con un peso molecular diferente, de forma que el coadyuvante esté en un exceso de al menos 7 veces con respecto a los lípidos. Preferiblemente el exceso está comprendido entre 10 y 15 veces,
- d.
- preparación de la emulsión final para uso farmacéutico añadiendo, en un entorno estéril, con agitación, una disolución acuosa isotónica estéril diluida de polidesoxirribonucleótidos al recipiente que contiene la emulsión liofilizada. Se forma una emulsión que contiene un complejo de liposomas en el que los polidesoxirribonucleótidos están conectados con un enlace iónico a la pared externa del liposoma. Alternativamente, se añade al recipiente una disolución isotónica estéril que contiene los liposomas liofilizados, y la emulsión así obtenida, se mezcla en un entorno estéril con la disolución que contiene el principio activo.
Se ha evaluado la estabilidad de los liposomas de
la invención ensayando la actividad farmacológica inmediatamente
después de la preparación de la emulsión, y después en el día 30
tras el acondicionamiento en condiciones estériles a 25ºC en la
oscuridad.
La emulsión que contiene el complejo de liposomas
con los polidesoxirribonucleótidos confinados (Gursoy y col.,
anterior) sufrió la misma prueba y se usó como formulación
comparativa.
El Solicitante también ha averiguado que los
complejos de la presente invención pueden usarse también como
agentes antihipertensores y antitrombóticos con una alta actividad
en el tiempo, sin efectos secundarios tóxicos.
La actividad farmacológica se ha determinado en
los siguientes modelos experimentales.
- actividad antinflamatoria (Miyasaka y col.,
Eur. J. Pharmacol. 77, 229-236, 1982).
- hipertensión arterial (F. Trento y col., véase
anteriormente).
- actividad antitrombótica (R. Niada y col.,
Thromb. Res. 23, 233-246, 1981).
En el experimento relativo a la actividad
antinflamatoria, se ha ensayado la cantidad de mieloperoxidasa
presente en los polimorfonucleares obtenidos del exudado pleural
animal. La cantidad de enzima es directamente proporcional a la
inflamación producida. Los resultados se expresan como el % de
variación de la cantidad de mieloperoxidasa (MPO) con respecto a la
de los controles, determinada con la fórmula:
\frac{MPO_{tratados} -
MPO_{controles}}{MPO_{controles}}
\newpage
En el modelo de hipertensión arterial, el
parámetro usado para determinar la actividad fue la presión
sanguínea, que se controló hasta los 30 minutos a partir del
tratamiento con L-MAME, el inhibidor de la
liberación de óxido nítrico endógeno. En el modelo de actividad
antitrombótica se ha controlado la temperatura carótida hasta los
60 minutos tras la inducción de la lesión endotelial local. Los
resultados se han expresado como el % de variación del área bajo la
curva (\Delta% del ABC) obtenida con la muestra probada con
respecto a la de los controles, mediante la siguiente
proporción:
\frac{ÁREA_{tratada} -
ÁREA_{controles}}{ÁREA_{controles}}
Los resultados obtenidos, referidos
respectivamente en las Tablas I, II y III, muestran que el complejo
entre liposomas y polidesoxirribonucleótidos según la presente
invención es estable en el tiempo, a diferencia de la formulación
comparativa.
Según la presente invención es por tanto posible
administrar al paciente una cantidad menor de principio activo
manteniendo inalterado el efecto terapéutico.
También es posible usar una misma emulsión de
complejo formulada adecuadamente y con una concentración de
principio activo adecuada para un ciclo de terapia completo, según
se requiera en las patologías mencionadas anteriormente.
También se sabe que los
polidesoxirribonucleótidos conocidos como defibrotide tienen una
actividad antitrombótica (R. Niada, Pharmacol. Res. Comm., véase
anteriormente), antisquémica, citoprotectora (C. Thiermemann, véase
anteriormente), una actividad antinflamatoria (G. Rossoni, J.
Cardiovasc. Pharmacol., véase anteriormente), y en la
aterosclerosis (P. Lobel y col., Atherosclerosis 80,
69-79, 1989). Dichas actividades son referibles a la
liberación local de prostaciclina endotelial en el flujo sanguíneo
en cantidad terapéuticamente eficaces.
El Solicitante ha averiguado que los complejos
con liposomas-polidesoxirribonucleótidos descritos
en la presente invención pueden usarse para la terapia de
patologías cuyo tratamiento requiere una liberación sostenida de
prostaciclina endotelial.
Las formulaciones farmacéuticas que contienen los
liposomas catiónicos-polidesoxirribonucleótidos
incluyen los vehículos y excipientes habituales. Dichas
formulaciones pueden ser en forma de emulsiones estériles y
apirógenas, o de liofilizados, almacenadas en envases estériles,
para ser disueltas extemporáneamente en disolventes acuosos
estériles. En el último caso es preferible que el liofilizado de
liposomas se almacene por separado, y que los
polidesoxirribonucleótidos ya estén disueltos en el disolvente
estéril acuoso que se va a añadir a los liposomas.
Pueden usarse disolventes estériles acuosos,
disoluciones isotónicas estériles que contienen tampones
convencionales (citratos, fosfatos) junto con los conservantes
conocidos.
Las vías de administración de la emulsión que
contiene el complejo de la invención son las parenterales, es
decir, mediante inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea, y
mediante infusión.
La cantidad de principio activo contenida en la
preparación varía entre 1 y 20 mg/ml de
polidesoxirribonucleótido.
Las dosis diarias del polidesoxirribonucleótido
administradas con los complejos de liposomas varían entre 10 y 200
mg, preferiblemente entre 20 y 120 mg.
Los siguientes ejemplos tienen el propósito de
clarificar el contenido de la presente invención, y no deben
considerarse como una limitación del ámbito de la misma.
La preparación de los liposomas usados en la
presente invención se lleva a cabo según el procedimiento de
evaporación de disolvente en fase inversa.
Se disuelven 100 mg de fosfatidilcolina de soja
(Phospholipon® 90-Natterman Phospholipid GmbH),
bromuro de dioctadecildimetil amonio (abbr. DIDAB -Fluka Chemie AG)
y alpha-tocoferol al 0,1% p/p (Fluka Chemie AG) en
éter de dietilo. La fosfatidilcolina y el tensioactivo catiónicos
se mezclan en una proporción molar de 10:1.
A la fase orgánica se añade agua bidestilada en
una proporción de 4 partes de fase orgánica/1 parte de agua,
obteniendo así una emulsión A/O.
Se lleva a cabo la aplicación de ultrasonidos a
la emulsión a 0ºC durante 10 minutos usando un lote de ultrasonidos
Branson 2200. Entonces el éter se elimina mediante evaporación a
una presión reducida hasta que se obtiene un sistema liposomal
acuoso, que entonces se hace fluir a través de una membrana de
policarbonato (Nucleopore) con un diámetro de poro de 0,4 \mum.
Dicha etapa a través de la membrana se repite otras tres veces
más.
Se añade una cantidad de manitol igual a 10 veces
el peso del lípido, y la suspensión se liofiliza.
Se disuelven 50 mg de un
polidesoxirribonucleótido con un peso molecular de 28.000, obtenido
mediante una despolimerización según el documento USP 4.985.552, en
5 ml de una disolución fisiológica isotónica. El liofilizado
obtenido anteriormente se disuelve en 5 ml de agua bidestilada. Las
dos fases acuosas se mezclan y se agitan. En la emulsión así
obtenida, la concentración de fosfatidilcolina es de 10 mg/ml, y la
del polidesoxirribonucleótido es de 5 mg/ml.
(Comparativo)
Se seca por separado la misma fase orgánica del
Ejemplo 1, con los mismos componentes mencionados anteriormente, en
un recipiente. Se añade una disolución acuosa de un
polidesoxirribonucleótido con un peso molecular de 16.000,
preparada como la disolución del polidesoxirribonucleótido del
ejemplo anterior. Las vesículas liposomales que engloban el
principio activo se obtienen mediante la aplicación de
ultrasonidos. Las concentraciones de fosfatidilcolina y de
polidesoxirribonucleótido son las mismas que las del complejo del
ejemplo 1.
La electroforesis se lleva a cabo en un gel de
agarosa al 3% que contiene 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio como
agente de fluorescencia. El sistema electroforético está
constituido por una pequeña cámara electroforética que contiene una
capa de gel con un espesor comprendido entre 1-3 mm,
al cual se aplica un campo eléctrico de 50 mV.
En el gel se siembran respectivamente, en 6 zonas
separadas junto al polo negativo, 20 \mul de la disolución del
Ejemplo 1 (concentración de polidesoxirribonucleótido de 5 mg/ml),
y de disoluciones que contienen sólo el polidesoxirribonucleótido a
unas concentraciones de 4, 3, 2, 1, 0,5 mg/ml.
El campo eléctrico se aplica durante 40 minutos.
El polidesoxirribonucleótido se mueve desde la zona de siembra hacia
el polo positivo. Al final del recorrido electroforético, el gel de
agarosa se tiñe con bromuro de etidio. El complejo del liposoma no
muestra ninguna coloración. En el gel aparecen las bandas
correspondientes a las siembras de las disoluciones de
polidesoxirribonucleótido, cuya intensidad es proporcional a la
cantidad sembrada.
Comparación de la estabilidad del complejo
liposoma-polidesoxirribonucleótido obtenido según el
Ejemplo 1 con la del complejo en el que el
polidesoxirribonucleótido está contenido dentro del liposoma
(Ejemplo 2, comparativo), evaluando la actividad antinflamatoria
del polidesoxirribonucleótido en ratas tratadas con muestras de las
disoluciones de dichos complejos preparadas recientemente, y con
muestras de dichas disoluciones acondicionadas durante 30 días a
25ºC en recipientes cerrados, en la oscuridad.
Se usaron ratas macho Sprague Dawley de
250-270 g de peso.
Se formaron 3 grupos, cada grupo de 18 animales,
y a cada uno de los grupos se le administró respectivamente, por
vía intravenosa, una de las siguientes disoluciones a las dosis
establecidas:
- 1.
- Grupo de control: disolución fisiológica, a 2 ml/kg.
- 2.
- Grupo tratado con el complejo de liposoma- polidesoxirribonucleótido (ref. Ej. 1): disolución fisiológica que contiene el complejo en una cantidad igual a una concentración de polidesoxirribonucleótido de 1 mg/ml, a 2 mg/kg.
- 3.
- Grupo tratado con el complejo de liposoma- polidesoxirribonucleótido según A. Gursoy y col. (Véase anteriormente); disolución fisiológica que contiene el complejo en una cantidad igual a una concentración de polidesoxirribonucleótido de 1 mg/ml, a una dosis de 2 mg/kg.
30 minutos después del tratamiento, bajo una
suave anestesia con éter, se provocó una pleuritis en los animales
mediante la administración por vía intrapleural de 0,5 ml de una
disolución fisiológica de carragenina al 1% p/v y 5 ml de agua por
vía oral.
Después de 6 horas, los animales fueron
sacrificados. Mediante una jeringa se recuperó el exudado pleural, y
se determinó el contenido en leucocitos neutrófilos
polimorfonucleares (PMN) mediante el ensayo de la enzima
mieloperoxidasa (MPO), que es la enzima característica de estas
células.
El ensayo se llevó a cabo según describen
Schierwagen, C., y col., J. Pharmacol. Methods 23, 179, 1990.
Las muestras de exudado se agitaron, y después se
añadieron 0,2 ml a 4,8 ml de una disolución tamponada con HTAB
(bromuro de hexadeciltrimetil amonio) al 0,5% p/v. Entonces las
muestras se congelaron a -80ºC para provocar la ruptura celular, se
descongelaron y después se sometieron a 80 W de ultrasonidos durante
1 minuto. Entonces las preparaciones se calentaron a 60ºC durante
dos horas con objeto de degradar los inhibidores de la
mieloperoxidasa, y subsiguientemente se centrifugaron a 11.800 g
durante 5 minutos a 4ºC.
Antes de proceder al ensayo espectrofotométrico
de la enzima (longitud de onda de 650 nm), las muestras se
diluyeron con la disolución de HTAB con objeto de llevar los
valores de lectura al intervalo de la curva estándar obtenida usando
la enzima MPO pura.
Los resultados se expresan como la variación
porcentual con respecto a la cantidad de MPO encontrada en los
controles, y se refieren en la siguiente Tabla I.
La Tabla evidencia que la actividad
antinflamatoria de las dos preparaciones en el tiempo cero es
sustancialmente la misma, y después de 30 días la actividad de la
preparación según la invención no difiere significativamente del
valor inicial, mientras que la preparación que contienen los
liposomas según el ejemplo comparativo muestra una disminución en
la actividad del 70% con respecto al valor inicial. Al mismo
tiempo, se advirtió que esta última preparación estaba degradada,
dado que la fase acuosa aparecía cristalina y había un precipitado
presente que no pudo ser resuspendido.
Los animales tratados con esta preparación
mostraron signos evidentes de dolor y disnea pronunciada.
Comparación de la estabilidad del complejo
liposoma-polidesoxirribonucleótido obtenido según el
Ejemplo 1 con la del complejo en el que el
polidesoxirribonucleótido está contenido dentro del liposoma
(Ejemplo 2, comparativo), evaluando la actividad antihipertensora
del polidesoxirribonucleótido en ratas, con la hipertensión
inducida mediante la inhibición de la liberación del óxido nítrico
(NO) endógeno, administrando las muestras de las disoluciones que
contienen los complejos anteriores preparadas recientemente, y con
muestras de las mismas disoluciones acondicionadas a 25ºC durante
30 días en recipientes cerrados, en la oscuridad.
Se anestesian ratas macho Sprague Dawley de 250
\pm 20 g de peso, sin ayuno, con etiluretano. Se insertaron
respectivamente dos catéteres en la arteria carótida izquierda,
para registrar la presión sanguínea arterial media (MABP), y en la
vena yugular derecha, para la administración de las composiciones
probadas. La tráquea se canuló y la temperatura corporal del animal
se mantuvo a 37ºC. La MABP se registro de forma continua a lo largo
del experimento. Se administró heparina (500 U.I./Kg, i.v.) para
evitar la coagulación sanguínea en el sistema de registro.
Después de 30 minutos, las ratas se distribuyeron
aleatoriamente en grupos homogéneos.
El tratamiento con las composiciones o con el
placebo se llevó a cabo mediante una inyección i.v. rápida, seguida
inmediatamente por una perfusión. Una hora después del inicio de la
perfusión, todos los animales recibieron una inyección i.v. rápida
de L-NAME (10 mg/kg). La perfusión duró 30 minutos
después de la inyección de
L-NAME.
L-NAME.
Las modificaciones en la presión inducidas por
las composiciones se expresan como el área bajo la curva (ABC) en
el intervalo de los 30 minutos subsiguientes al tratamiento con
L-NAME.
En el modelo experimental en consideración, los
animales se dividieron en cuatro grupos (6 animales por grupo), cada
uno de ellos se trató por vía intravenosa con una inyección rápida
de 1 ml/kg, seguida inmediatamente por una perfusión de 2 ml/kg/h,
según se explica a continuación:
- 1.
- Grupo de control (CTR): disolución fisiológica, 1 ml/kg en inyección i.v. rápida + 2 ml/kg/hora en perfusión.
- 2.
- Grupo tratado con una inyección i.v. rápida de un polidesoxirribonucleótido con un peso molecular de 28.000 en una disolución fisiológica a una concentración de 10 mg/ml, a la dosis de 10 mg/kg (inyección i.v. rápida) + 20 mg/kg/h en perfusión.
- 3.
- Grupo tratado con una inyección i.v. rápida del complejo liposoma-polidesoxirribonucleótido de la invención en una disolución fisiológica a una concentración de polidesoxirribonucleótido de 5 mg/ml, a la dosis de 5 mg/kg (inyección i.v. rápida) + 10 mg/kg/h en perfusión.
- 4.
- Grupo tratado con una inyección i.v. rápida del complejo liposoma-polidesoxirribonucleótido según el ejemplo comparativo 2, en una disolución fisiológica a una concentración de polidesoxirribonucleótido de 5 mg/ml, a la dosis de 5 mg/kg (inyección i.v. rápida) + 10 mg/kg/h en perfusión.
La actividad farmacológica determinada usando las
muestras de las disoluciones preparadas recientemente que contienen
los complejos de liposomas referidos anteriormente, y las muestras
de las mismas disoluciones almacenadas en recipientes cerrados a
25ºC en la oscuridad, se refieren en la Tabla II.
Los resultados demuestran que mientras que en el
tiempo cero las dos preparaciones tienen prácticamente la misma
actividad antihipertensora, después de 30 días la actividad de la
preparación según la técnica anterior ha disminuido aproximadamente
en un 70%, por oposición al correspondiente valor de partida.
Los animales tratados con dicha preparación
mostraron signos evidentes de dolor, con una disnea acusada.
Comparación de la estabilidad del complejo
liposoma-polidesoxirribonucleótido obtenido según el
Ejemplo 1 con la del complejo en el que el
polidesoxirribonucleótido está contenido dentro del liposoma
(Ejemplo 2, comparativo), evaluando la actividad antitrombótica del
polidesoxirribonucleótido en ratas, tratadas con las muestras de
las disoluciones que contienen los complejos anteriores preparadas
recientemente, y con muestras de las mismas disoluciones
acondicionadas a 25ºC durante 30 días en recipientes cerrados, en la
oscuridad.
Se anestesiaron ratas macho Sprague Dawley de
200-230 g de peso, en un ayuno de 16 horas, con
uretano (1,25 g/kg, i.p.).
Después de aislar la arteria carótida derecha y
la vena yugular izquierda de los animales, se colocó un electrodo
bipolar (Lesion Producing Device 3500 Ugo
Basile-Comerio, Varese) en la arteria derecha y, a
una distancia de 0,5 cm, una sonda termosensible conectada a un
polígrafo. Se insertó un catéter en la vena para la administración
de las preparaciones.
Después de 15 minutos de estabilización, la
temperatura carótida se registró de forma continua desde los 5
minutos anteriores a los 60 minutos posteriores a la inducción de
la lesión endotelial mediante el electrodo. Esto permitió
determinar indirectamente la formación de trombos endoluminales
mediante la correlación entre la temperatura en disminución del
recipiente y la reducción del flujo sanguíneo. La lesión endotelial
fue provocada por una serie de 5 estímulos eléctricos. Los
estímulos, a intervalos de un minuto entre cada uno, eran tales que
la impedancia medida en la arteria lesionada era de 10 mA. La
impedancia se midió con un probador y se reguló para cada animal
durante los primeros 30 segundos de estimulación, y requirió la
aplicación de un voltaje de aproximadamente
30 V.
30 V.
La temperatura carótida se determinó
inmediatamente antes de la estimulación eléctrica (valor basal) y a
intervalos constantes de tiempo (5, 10, 15, 30, 45 y 60 minutos)
tras la estimulación.
Los grupos estaban formados, cada uno, por
10-12 ratas.
Todos los tratamientos se llevaron a cabo como
inyecciones i.v. rápidas que se administraron cinco minutos antes
del comienzo de la estimulación eléctrica.
Los grupos eran los siguientes:
- 1.
- Grupo de control SHAM, en el que los animales se operaron y se controlaron según se describió anteriormente, pero no se sometieron a la estimulación eléctrica.
- 2.
- Grupo de control, tratado con disolución fisiológica (1,5 mg/kg, i.v.).
- 3.
- Grupo tratado con el complejo liposoma-polidesoxirribonucleótido (ref. Ej. 1): disolución fisiológica que contiene el complejo en una cantidad igual a una concentración de polidesoxirribonucleótido de 5 mg/ml; dosis administrada: 7,5 mg/kg.
- 4.
- Grupo tratado con el complejo liposoma-polidesoxirribonucleótido según A. Gursoy y col. (véase anteriormente): disolución fisiológica que contiene el complejo en una cantidad igual a una concentración de polidesoxirribonucleótido de 5 mg/ml; dosis administrada: 7,5 mg/kg.
Se determinó la actividad en el momento de la
preparación de las disoluciones con los dos complejos y después de
30 días de acondicionamiento de dichas disoluciones a 25ºC en
oscuridad.
Los resultados se refieren en la Tabla III.
\newpage
A partir de la Tabla se aprecia que mientras que
la actividad antitrombótica de las dos preparaciones en el tiempo
cero es sustancialmente comparable, después de 30 días la actividad
de la preparación según la técnica anterior ha disminuido en
aproximadamente un 70%, por oposición al correspondiente valor de
partida.
Formulación farmacéutica, que contiene los
liposomas usados en la presente invención, para su administración en
dosis única. 3 ml de un vial estéril que contiene el liposoma
liofilizado:
| - phospholipon 90 | mg 100 |
| - DIDAB | mg 10 |
| - alfa-tocoferol | mg 0,1 |
| - sacarosa | g 1 |
Antes de su uso añadir 1 ml de agua para
inyección, entonces añadir de forma estéril la siguiente disolución
estéril, preelaborada en una jeringa estéril desechable de 1 ml, se
añade a lo anterior:
| - polidesoxirribonucleótido (ref. Ej. 1) | mg 10 |
| - citrato trisódico dihidratado | mg 2,5 |
| - agua para inyecciones y conservantes, suficiente para | ml 1 |
30 ml de un frasco estéril que contiene el
liposoma liofilizado:
| - phospholipon 90 | g 1 |
| - DIDAB | mg 100 |
| - alfa-tocoferol | mg 1 |
| - sacarosa | g 1 |
Antes de su uso añadir 10 ml de agua para
inyección de forma estéril en el frasco. A la emulsión así
preparada añadir la siguiente disolución estéril contenida en un
frasco de 15 ml o en una jeringa precargada desechable de
10 ml:
10 ml:
| - polidesoxirribonucleótido (ref. Ej. 1) | mg 100 |
| - citrato trisódico dihidratado | mg 25 |
| - agua para inyecciones y conservantes, suficiente para | ml 10 |
La preparación aporta varias dosis de 20 mg/día
para una terapia de 5 días de duración.
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo nº | MPO (\Delta % frente a CTR) | MPO (\Delta % frente a CTR) |
| (tiempo cero) | (30 días) | |
| 2 | -86 | -75 |
| 3 | -85 | -18 |
| Grupo nº | ABC (\Delta % frente a CTR) | ABC (\Delta % frente a CTR) |
| (tiempo cero) | (30 días) | |
| 2 | 0 * | - |
| 3 | -32 | -29 |
| 4 | -30 | -9 |
| * \begin{minipage}[t]{158mm} La dosis administrada de polidesoxirribonucleótido (10 mg/kg en inyección i.v. rápida + 20 mg/kg/h) es demasiado baja para suscitar una actividad antihipertensora significativa con respecto a los controles. \end{minipage} |
| Grupo nº | ABC (\Delta % frente a CTR) | ABC (\Delta % frente a CTR) |
| (tiempo cero) | (30 días) | |
| 3 | -85 | -74 |
| 4 | -90 | -24 |
Claims (14)
1. Complejos formados por liposomas catiónicos y
por polidesoxirribonucleótidos con un peso molecular en el
intervalo de 7.000-60.000 Da, preferiblemente de
10.000-60.000 Da, obtenibles mediante la
despolimerización de ácidos nucleicos, en los que los
polidesoxirribonucleótidos están localizados en la superficie
exterior del liposoma, para su uso como un medicamento.
2. Complejos según la reivindicación 1, en los
que el polidesoxirribonucleótido es defibrotide.
3. Complejos según la reivindicación 2, en los
que el polidesoxirribonucleótido tiene un peso molecular en el
intervalo de 15.000-30.000.
4. Complejos según las reivindicaciones
1-3, en los que se añaden uno o más antioxidantes,
preferiblemente alfa-tocoferol.
5. Complejos según las reivindicaciones
1-4, en los que hay presentes tensioactivos
catiónicos que contienen uno o más grupos amínicos mono o
disustituidos, o grupos de amonio cuaternario, conteniendo dichos
grupos de amonio cuaternario una o más cadenas alifáticas con un
número de átomos de carbono que varía entre 8 y 22, teniendo
preferiblemente dichos tensioactivos catiónicos de amonio
cuaternario cadenas alifáticas con 18 átomos de carbono.
6. Complejos según las reivindicaciones
1-5, en los que la proporción molar entre la
cantidad total del (los) lípido(s)
del liposoma y el tensioactivo catiónico varía entre 10:0,05 y 10:3, siendo preferiblemente de 10:1.
del liposoma y el tensioactivo catiónico varía entre 10:0,05 y 10:3, siendo preferiblemente de 10:1.
7. Complejos según la reivindicación 6, en los
que, junto con la fosfatidilcolina (o la fosfatidiletanolamina) hay
un segundo y diferente lípido, y la proporción molar entre la
fosfatidilcolina (o la fosfatidiletanolamina): el segundo lípido:
el tensioactivo varia entre 9:1:0,05 y 7:3:3, preferiblemente
8:2:1.
8. Complejos según las reivindicaciones
1-7, en los que la proporción ponderal entre la
cantidad de liposoma y el principio activo varía entre 10:2 y
10:0,1, preferiblemente es de 10:1.
9. Complejos según las reivindicaciones
1-8 obtenibles mediante un procedimiento que
comprende las siguientes etapas:
- a.
- preparación del liposoma mezclando 4 partes de fase orgánica polar o apolar, en la que están solubilizados los lípidos, el tensioactivo catiónico y el antioxidante, con 1 parte de agua, y sometiendo entonces el sistema bifásico obtenido a ultrasonidos a 0ºC durante 5-20 minutos y evaporar la fase orgánica a temperatura ambiente y a una presión reducida, formando así una emulsión,
- b.
- hacer fluir dichas emulsiones a través de una membrana de policarbonato con un diámetro de poro que varía entre 100 y 600 nm, preferiblemente de 400 nm, repitiendo dicha etapa durante al menos tres veces,
- c.
- liofilizar la emulsión tras la adición de una disolución acuosa de un coadyuvante de liofilización, de forma que la cantidad de dicho coadyuvante esté en un exceso de al menos 7 veces con respecto a la de los lípidos, variando preferiblemente el exceso entre 10 y 15 veces,
- d.
- preparar la emulsión para uso farmacéutico añadiendo, en un entorno estéril, con agitación, una disolución acuosa isotónica estéril diluida de polidesoxirribonucleótidos al recipiente que contiene el liofilizado, o alternativamente, añadiendo al recipiente una disolución isotónica estéril que contiene los liposomas liofilizados, y la emulsión así obtenida se mezcla en un entorno estéril con la disolución que contiene el principio activo.
10. Complejos según las reivindicaciones
1-8 contenidos en formulaciones farmacéuticas para
su administración parenteral.
11. Uso de los complejos según las
reivindicaciones 1-10 para la preparación de un
medicamento con actividad antinflamatoria.
12. Uso de los complejos según las
reivindicaciones 1-10 para la preparación de un
medicamento con actividad antitrombótica.
13. Uso de los complejos según las
reivindicaciones 1-10 para la preparación de un
medicamento con actividad antihipertensora.
14. Uso de los complejos según las
reivindicaciones 1-10 para la preparación de un
medicamento para la liberación local de prostaciclina endotelial en
el flujo sanguíneo.
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