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ES2246533T3 - Fibra adenovirica modificada y adenovirus dianas. - Google Patents

Fibra adenovirica modificada y adenovirus dianas.

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Publication number
ES2246533T3
ES2246533T3 ES98917294T ES98917294T ES2246533T3 ES 2246533 T3 ES2246533 T3 ES 2246533T3 ES 98917294 T ES98917294 T ES 98917294T ES 98917294 T ES98917294 T ES 98917294T ES 2246533 T3 ES2246533 T3 ES 2246533T3
Authority
ES
Spain
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baselineskip
adenovirus
fiber
residues
seq
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES98917294T
Other languages
English (en)
Inventor
Valerie Legrand
Majid Mehtali
Pierre Boulanger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Transgene SA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Transgene SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9703987A external-priority patent/FR2761688A1/fr
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Transgene SA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Abstract

La invención se refiere a fibras de adenovirus modificadas mediante la mutación de uno o más residuos. Los residuos se dirigen hacia receptores de células naturales en la estructura tridimensional de dicho adenovirus. La invención se refiere además a un fragmento de DNA y a un vector de expresión, y la línea de células que expresan dicha fibra, y también se refiere a los adenovirus, los procedimientos para producir este tipo de adenovirus y una célula huésped infectable, así como a sus aplicaciones terapéuticas y las correspondientes composiciones farmacéuticas.

Description

Fibra adenovírica modificada y adenovirus dianas.
La presente invención se refiere a una fibra adenovírica mutada en las regiones implicadas en el reconocimiento y la unión del receptor celular natural de los adenovirus. Se refiere igualmente a los adenovirus recombinantes que portan en su superficie dicha fibra, y un ligante que les confiere una especificidad de huésped modificado o diana hacia un tipo celular particular, a las células que contienen estos adenovirus, así como a un método para preparar partículas víricas infecciosas de estos últimos, destinadas al uso terapéutico. La invención presenta un interés muy particular para perspectivas de terapia génica, especialmente en el ser humano.
Gracias a sus propiedades particulares, los adenovirus se usan en un número creciente de aplicaciones en terapia génica. Puestos en evidencia en numerosas especies animales, son poco patógenos, no integradores, y se replican tanto en las células en división como en las quiescentes. Además, presentan una amplia gama de huéspedes, y son capaces de infectar un número muy grande de tipos celulares tales como las células epiteliales, endoteliales, los miocitos, los hepatocitos, las neuronas y los sinoviocitos (Bramson et al., 1995, Curr. Op. Biotech. 6, 590-595). Sin embargo, esta ausencia de especificidad de infección podría constituir un límite para la utilización de los adenovirus recombinantes; por una parte, a nivel de la seguridad, puesto que puede haber una diseminación del gen recombinante en el organismo huésped, y, por otra parte, a nivel de la eficacia, puesto que el virus no infecta específicamente al tipo celular que se desea tratar.
De manera general, el genoma adenovírico está constituido por una molécula de ADN lineal, bicatenario y de aproximadamente 36 kb, que contiene los genes que codifican las proteínas víricas, y en sus extremos tiene dos repeticiones inversas (denominadas ITR por Repetición Terminal Inversa (Invert Terminal Repeat, en inglés)) que intervienen en la replicación y en la región de encapsidamiento. Los genes precoces se reparten en 4 regiones dispersas en el genoma adenovírico (E1 a E4; E por precoz (early, en inglés)), que contienen 6 unidades de transcripción provistas de sus propios promotores. Los genes tardíos (L1 a L5; L por tardío (late, en inglés)) recubren, en parte, las unidades de transcripción precoces, y son, en su mayoría, transcritos a partir del promotor principal tardío MLP (por Promotor Principal Tardío (Major Late Promoter, en inglés)).
A título indicativo, todos los adenovirus utilizados en los protocolos de terapia génica son deficientes para la replicación, por supresión de al menos la región E1, y se propagan en una línea celular de complementación, que suministra en trans las funciones víricas suprimidas. Se utiliza corrientemente la línea 293, establecida a partir de células de riñones embrionarios humanos, que complementa eficazmente la función E1 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). En la bibliografía se han propuesto recientemente vectores de segunda generación. Conservan las regiones en cis necesarias para la replicación del virus en la célula infectada (las ITR y las secuencias de encapsidamiento), y contienen supresiones internas importantes con el objetivo de suprimir lo esencial de los genes víricos cuya expresión in vivo puede conducir al establecimiento de respuestas inflamatorias o inmunitarias en el huésped. Los vectores adenovíricos y sus técnicas de preparación son objeto de numerosas publicaciones accesibles para el experto en la técnica.
El ciclo infeccioso de los adenovirus se desarrolla en 2 etapas. La fase precoz preceda la iniciación de la replicación y permite producir las proteínas precoces que regulan la replicación y la transcripción del ADN vírico. A la replicación del genoma le sigue la fase tardía durante la cual se sintetizan las proteínas estructurales que constituyen las partículas víricas. La unión de los nuevos viriones toma su sitio en el núcleo. En un primer momento, las proteínas víricas se unen a fin de formar cápsidas vacías de estructura icosaédrica, en las que el genoma se encapsida. Los adenovirus liberados son susceptibles de infectar a otras células permisivas. Para este fin, la fibra y el pentón base presentes en la superficie de las cápsidas tienen un papel crítico en la unión celular de los viriones y su interiorización.
El adenovirus se une a un receptor celular presente en la superficie de las células permisivas, a través del intermedio de la fibra trimérica (Philipson et al., 1968, J. Virol. 2, 1064-1075; Defer et al., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673). Después, la partícula se introduce mediante endocitosis por unión del pentón base a las integrinas celulares \alpha_{V}\beta_{3} y \alpha_{V}\beta_{5} (Mathias et al., 1994, J. Virol. 68, 6811-6814). La capacidad de la fibra soluble o de anticuerpos anti-fibra para inhibir la infección demuestra su papel en la unión celular del virus.
La fibra está compuesta de 3 dominios (Chroboczek et al., 1995, Current Top. Microbiol. Immunol. 199, 165-200):
(1)
En N-terminal, la cola, muy conservada de un serotipo a otro, interacciona con el pentón base y asegura el anclaje de la molécula en la cápsida.
(2)
El tallo es una estructura con forma de bastoncito, compuesto de un número de repeticiones de hojas \beta, variando este número según los serotipos.
(3)
Finalmente, en el extremo distante del tallo, la cabeza es una estructura globular esférica que contiene las señales de trimerización (Hong y Engler, 1996, J. Virol. 70, 7071-7078; Novelli y Boulanger, 1991, J. Biol. Chem. 266, 9299-9303; Novelli y Boulanger, 1991, Virology 185, 365-376). Además, la mayoría de los datos experimentales muestran que el dominio de la cabeza es responsable de la unión a las células permisivas (Henry et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246; Louis et al., 1994, J. Virol. 68, 4104-4106).
Ya se han propuesto en la bibliografía adenovirus "diana" cuya fibra nativa se modifica a fin de reconocer a un receptor celular diferente. Así, el documento WO94/10323 describe mutantes de la fibra de Ad5 en los que una secuencia que codifica un fragmento de anticuerpo (de tipo scFv) se inserta al final de una de las 22 unidades repetitivas del tallo, con el objeto de modificar la especificidad de infección frente a células que presentan el antígeno diana. El documento US nº 5.543.328 describe una fibra quimera Ad5 en la que el dominio de la cabeza se sustituye por el factor de necrosis tumoral (TNF) a fin de interaccionar con el receptor celular del TNF. En otra construcción, la fibra nativa de Ad5 se fusiona en su extremo C-terminal al péptido ApoE permitiendo una unión al receptor LDL (por Lipoproteína de baja densidad (low density lipoprotein, en inglés)) presente en la superficie de las células hepáticas. El documento WO95/26412 describe una fibra, modificada mediante incorporación de un ligante en el extremo C-terminal, que conserva sus capacidades de trimerización. El documento WO96/26231 describe una fibra quimera obtenida mediante sustitución de una parte de la fibra nativa, y en particular de la cabeza, por la parte equivalente de una fibra adenovírica de otro serotipo, y eventualmente mediante inserción, en el extremo C-terminal, de un péptido RGD específico de la vitronectina. Gall et al., J. Virol., vol. 70, 1996, p. 2116-2123, describe la preparación de un adenovirus quimérico en el que se procede a la sustitución completa de las fibras del adenovirus de tipo 5 por fibras de adenovirus de tipo 7. Esta sustitución completa (cabeza, tallo y cola de la fibra) está destinada a modificar la especificidad de reconocimiento de la partícula adenovírica. McClelland et al., J. Cell. Biochem, 1995, p. 411, describe la sustitución de la cabeza de la fibra de Ad5 (delimitada por los nucleótidos 405-592) por una secuencia capaz de reconocer un sitio de unión diferente del de la fibra de Ad5. Tras esta sustitución de la totalidad de la cabeza de la fibra, se constata que es posible modificar la especificidad de reconocimiento de la fibra adenovírica.
Como se indica anteriormente, la especificidad de infección de un adenovirus se determina por la unión de la fibra adenovírica a un receptor celular situado en la superficie de las células permisivas. La solicitud de patente francesa 97 01005 destaca el papel de los antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I y de los módulos III de la fibronectina como receptor primario y cofactor de los adenovirus, respectivamente. Sin embargo, pueden intervenir otras proteínas. Para este fin, trabajos recientes han conjeturado la utilización del receptor celular de los virus Coxsackie por los adenovirus de tipo 2 y 5 para penetrar en sus células diana (Bergelson et al., 1997, Science 275, 1320-1323). El problema que la presente invención propone resolver es modificar la región de interacción de la fibra adenovírica con el o los receptores celulares a fin de alterar la especificidad de huésped natural de los adenovirus que portan la fibra mutada. Para facilitar la comprensión, se utilizará, en lo siguiente, la expresión "receptor celular" de los adenovirus para designar el o los polipéptidos celulares que intervienen directamente o no en la unión de los adenovirus a sus células diana naturales o en la penetración en el seno de estas últimas. Bien entendido, dicho receptor puede ser diferente según los serotipos. La adición de un ligante permite conferir un nuevo tropismo hacia uno o varios tipos celulares específicos que portan en su superficie una molécula diana reconocida por el ligante en cuestión.
La presente invención constituye una mejora de la técnica anterior porque da a conocer las regiones de la fibra a mutar, para inhibir o impedir la unión al receptor celular natural de los adenovirus. Ahora se ha sustituido uno o varios residuos de la región 443 a 462 de la cabeza de la fibra de Ad5, y se ha demostrado una inhibición de la capacidad de infección de los adenovirus correspondientes a células normalmente permisivas. La introducción del ligante GRP (por péptido liberador de gastrina (Gastrin Releasing Peptide, en inglés)) en el seno de estas fibras debería permitir una individualización de la infección hacia las células que expresan el receptor del GRP. El objetivo de la presente invención es disminuir las cantidades terapéuticas de adenovirus a utilizar, e individualizar la infección a las células a tratar. Esta especificidad es indispensable cuando se utiliza un adenovirus que expresa un gen citotóxico, para evitar la propagación del efecto citotóxico a las células sanas. Las ventajas proporcionadas por la presente invención son una reducción de los riesgos de diseminación y de los efectos secundarios relacionados con la tecnología adenovírica.
Es por ello que la presente invención tiene por objeto una fibra de un adenovirus, modificada por mutación de uno o varios residuos de dicha fibra, caracterizada porque dichos residuos se dirigen hacia el receptor celular natural de dicho adenovirus.
El término "fibra" se define ampliamente en la parte introductoria. La fibra de la presente invención puede derivar de un adenovirus de origen humano, canino, aviar, bovino, murino, ovino, porcino, o símico, o también puede ser híbrido y comprender fragmentos de orígenes diversos. Haciendo referencia a los adenovirus humanos, se prefiere utilizar los de serotipo C, y especialmente los adenovirus de tipo 2 ó 5 (Ad2 o Ad5). Se indica que la fibra de Ad2 contiene 580 aminoácidos (aa), cuya secuencia se da a conocer en Herissé et al., (1981, Nucleic Acid Res. 9, 4023-4042). La fibra de Ad5 presenta 582 aa, y su secuencia, presentada en el identificador de secuencia 1 (SEC ID nº 1), ha sido determinada por Chroboczek y Jacrot (1987, Virology 161, 549-554). Cuando la fibra de la presente invención es originaria de un adenovirus animal, se recurre preferentemente a los adenovirus bovinos, y en particular a los de la cepa BAV-3. Estos últimos han sido el objeto de numerosos estudios, y la secuencia de la fibra se da a conocer en la Solicitud Internacional WO95/16048. Bien entendido, la fibra de la presente invención puede presentar otras modificaciones con relación a la secuencia nativa, además de las que son objeto de la presente
invención.
De acuerdo con los objetivos perseguidos por la presente invención, la fibra según la invención se modifica a fin de reducir o abolir su capacidad de unión al receptor celular natural. Tal propiedad se puede verificar mediante el estudio de la capacidad infecciosa o de la unión celular de los virus correspondientes, aplicando las técnicas de la técnica anterior, tales como las detalladas a continuación. Según una forma de realización ventajosa, las propiedades de trimerización y de unión al pentón base no se ven afectadas.
En el sentido de la presente invención, el término "mutación" designa una supresión, una sustitución o también una adición de uno o varios residuos, o una combinación de estas posibilidades. Se prefiere más particularmente el caso en el que las regiones de interacción con el receptor celular natural se suprimen en su totalidad o en parte, y se sustituyen especialmente por un ligante específico de una proteína de superficie celular diferente de la del receptor natural de los adenovirus.
La estructura cristalográfica tridimensional de la cabeza adenovírica ha sido determinada por Xia et al. (1994, Structure 2, 1259-1270). Cada monómero contiene 8 hojas \beta antiparalelas denominadas A a D y G a J, y 6 bucles mayores de 8 a 55 residuos. Por ejemplo, el bucle CD une la hoja \beta C a la hoja \beta D. Se indica que se considera que las hojas menores E y F forman parte del bucle DG situado entre las hojas D y G. A título indicativo, la tabla 1 indica la localización de estas estructuras en la secuencia de aminoácidos de la fibra de Ad5, tal como se muestra en el identificador de secuencia nº 1 (SEC ID nº: 1), representando el +1 el residuo Met iniciador. De manera general, las hojas forman una estructura ordenada y compacta mientras que los bucles son más flexibles. Estos términos son clásicos en el campo de la bioquímica de las proteínas, y se definen en los documentos base (véase, por ejemplo, Stryer, Biochemistry, 2ª edición, Cap. 2, p. 11 a 39, Ed. Freeman and Company, San Francisco).
TABLA 1
Hoja \beta bucle
Nomenclatura residuos nomenclatura residuos
A 400 a 403 AB 404 a 418
B 419 a 428 - -
C 431 a 440 CD 441 a 453
D 454 a 461 DG 462 a 514
G 515 a 521 GH 522 a 528
H 529 a 536 HI 537 a 549
I 550 a 557 IJ 558 a 572
J 573 a 578
Las cuatro hojas \beta A, B, C y J constituyen las hojas V dirigidas hacia la partícula vírica. Las otras cuatro (D, G, H e I) forman las hojas R, supuestamente enfrentadas al receptor celular. Las hojas V parecen tener un papel importante en la trimerización de la estructura, mientras que las hojas R estarían implicadas en la interacción con el receptor. Los residuos de la fibra de Ad2, Ad3, Ad5, Ad7, Ad40, Ad41 y del adenovirus canino CAV, que forman estas diferentes estructuras, se indican claramente en la referencia anterior.
Las modificaciones de la fibra adenovírica según la invención se refieren más particularmente a la parte que comprende el bucle CD, la hoja D y la parte próxima del bucle DG (posiciones 441 a 478 de la fibra de Ad2 y de Ad5), y, más particularmente, la región que se extiende de los residuos 443 a 462 para la Ad5, o 451 a 466 en el caso de la Ad2. La otra región diana para las modificaciones es la hoja H (aa 529 a 536 de la fibra de Ad5 y de la fibra de Ad2). Otra alternativa consiste en la modificación de las hojas menores E (aa 479-482 Ad5) y F (aa 485-486 Ad5).
Como se indica anteriormente, se puede operar mediante sustitución de uno o más aminoácidos en las regiones expuestas. Se pueden citar, a este respecto, los ejemplos siguientes que derivan de la fibra de Ad5, en la que:
-
el residuo glicina en posición 443 se sustituye por un ácido aspártico,
-
el residuo leucina en posición 445 se sustituye por una fenilalanina,
-
el residuo glicina en posición 450 se sustituye por una asparagina,
-
el residuo treonina en posición 451 se sustituye por una lisina,
-
el residuo valina en posición 452 se sustituye por una asparagina,
-
el residuo alanina en posición 455 se sustituye por una fenilalanina,
-
el residuo leucina en posición 457 se sustituye por una alanina o una lisina, y/o
-
el residuo isoleucina en posición 459 se sustituye por una alanina.
Es posible asimismo introducir varias sustituciones en el seno de la región diana de la fibra, especialmente a nivel de los aminoácidos que forman un codo, preferentemente de tipo \alpha\alpha (véase la Tabla 2 de Xia et al., 1994, más arriba). A título ilustrativo, se pueden citar los dos ejemplos siguientes, en los que la fibra de Ad5 se modifica mediante sustitución:
-
del residuo glicina en posición 443 por un ácido aspártico,
-
del residuo serina en posición 444 por una lisina, y
-
del residuo alanina en posición 446 por una treonina,
o también
-
del residuo serina en posición 449 por un ácido aspártico,
-
del residuo glicina en posición 450 por una lisina,
-
del residuo treonina en posición 451 por una leucina, y
-
del residuo valina en posición 452 por una treonina.
Asimismo, los aminoácidos de sustitución se mencionan únicamente a título indicativo, y cualquier aminoácido puede ser conveniente para los fines de la presente invención. Se prefiere, sin embargo, no modificar de manera drástica la estructura tridimensional. Preferentemente, los aminoácidos que forman un codo se sustituirán por residuos que forman una estructura similar, tales como los citados en la referencia de Xia et al. ya mencionada.
La fibra de la presente invención se puede igualmente modificar mediante supresión. La región eliminada puede implicar todo o una parte del dominio expuesto, y especialmente del bucle CD, de la hoja D, del bucle DG y/o de las hojas E y F. Haciendo referencia a una fibra de Ad5 según la invención, se puede citar más particularmente la supresión:
-
de la región que se extiende de la serina en posición 454 a la fenilalanina en posición 461,
-
de la región que se extiende de la valina en posición 441 a la glutamina en posición 453,
-
de la región que se extiende de la valina en posición 441 a la fenilalanina en posición 461, o
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de la región que se extiende de la asparagina en posición 479 a la treonina en posición 486.
Igualmente es posible generar otros mutantes de sustitución o de supresión en las otras hojas o bucles, como por ejemplo las hojas G, H e I, y los bucles HI y DG.
Igualmente es posible sustituir, cuando una al menos de las modificaciones es una supresión de al menos 3 residuos consecutivos de un bucle y/o de una hoja, los residuos suprimidos por residuos de un bucle y/o de una hoja equivalente que deriva de una fibra de un segundo adenovirus susceptible de interaccionar con un receptor celular diferente del reconocido por el primer adenovirus. El segundo adenovirus puede ser de cualquier origen humano o animal. Esto permite mantener la estructura de la fibra según la invención, confiriéndole una especificidad de huésped que corresponde a la del segundo adenovirus. Como se indica en Xia et al. (1994, más arriba), el receptor celular que mide la infección de los adenovirus de tipo 2 y 5 es diferente del que interacciona con los adenovirus de tipo 3 y 7. Así, una fibra de Ad5 o de Ad2, a la que se le suprimen al menos 3 residuos consecutivos entre los especificados aquí arriba, se puede sustituir por los residuos que provienen de una región equivalente de la fibra de Ad3 o de Ad7, para reducir su capacidad para unirse al receptor de Ad5 y conferirle una nueva especificidad por el receptor celular de Ad3 o de Ad7. A título de ejemplo no limitativo, se puede citar la sustitución de los residuos LAPISGTVQSAHLIIRFD (posición 445 a 462) de la fibra de Ad5 por los residuos VNTLFKNKNVSINVELYFD de la fibra de Ad3, o la sustitución de los residuos PVTLTITL (posición 529 a 536) de la fibra de Ad5 por los residuos PLEVTVML de la fibra de Ad3.
La presente invención se refiere igualmente a una fibra de un adenovirus que presenta una capacidad de unión al receptor celular natural sustancialmente reducida, y sin embargo es capaz de trimerizarse y de unirse al pentón base. Como se indica a continuación, el receptor celular natural se selecciona ventajosamente de entre el grupo que consta de los antígenos mayores de histocompatibilidad de clase I, la fibronectina y el receptor celular de los virus Coxsackie (CAR), o cualquier otro determinante de superficie celular que interviene habitualmente o que participa en la capacidad de infecciosa de los adenovirus.
Según una forma de realización particularmente ventajosa, la fibra según la invención comprende además un ligante. En el sentido de la presente invención, el término ligante define toda entidad capaz de reconocer y unirse a, preferentemente con una fuerte afinidad, una molécula de superficie celular diferente del receptor celular natural. Esta molécula se puede expresar o exponer en la superficie de la célula que se desea seleccionar como diana (marcador de superficie celular, receptor, péptido antigénico presentado por los antígenos de histocompatibilidad, etc.). Conforme a los objetivos buscados por la presente invención, un ligante puede ser un anticuerpo, un péptido, una hormona, un polipéptido o también un azúcar. El término anticuerpo comprende especialmente los anticuerpos monoclonales, los fragmentos de anticuerpos (Fab), y los anticuerpos de cadena simple (scFv). Estas denominaciones y abreviaturas son convencionales en el campo de la inmunología.
En el campo de la presente invención, puede ser particularmente interesante seleccionar como diana una célula tumoral, una célula infectada, un tipo celular particular o una categoría de células que portan un marcador de superficie específico. Por ejemplo, si la célula huésped a seleccionar como diana es una célula infectada por el virus del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana (Human Immunodeficiency Virus, en inglés)), el ligante puede ser un fragmento de anticuerpo contra la fusina, el receptor CD4 o contra una proteína vírica expuesta (glicoproteína de recubrimiento), o también la parte de la proteína TAT del virus del VIH que se extiende de los residuos 37 a 72, (Fawell et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668). Haciendo referencia a una célula tumoral, la elección recaerá sobre un ligante que reconoce un antígeno específico de tumor (por ejemplo, la proteína MUC-1 en el caso del cáncer de mama, algunos epítopos de las proteínas E6 o E7 del virus del papiloma HPV), o sobreexpresado (receptor de IL-2 sobreexpresado en algunos tumores linfoides, péptido GRP (péptido liberador de gastrina; de Gastrin Releasing Peptide, en inglés) sobreexpresado en las células de carcinoma de pulmón (Michaël et al., 1995 Gene Therapy 2, 660-668) y en los tumores del páncreas, de la próstata y del estómago). Si se desea seleccionar como dianas a los linfocitos T, se puede utilizar un ligante del receptor de célula T. Por otra parte, la transferrina es un buen candidato para seleccionarla como diana hepática. De manera general, los ligantes que se pueden utilizar en el contexto de la invención se describen ampliamente en la bibliografía, y se pueden clonar mediante técnicas estándares. Es igualmente posible sintetizarlos por vía química y acoplarlos a la fibra según la invención. Para ello, el acoplamiento de residuos de galactosilo debería conferir una especificidad hepática como consecuencia de la interacción con los receptores de las asialoglicoproteínas. Pero la forma de realización preferida consiste en insertar el ligante en el extremo C-terminal de la fibra según la invención, o en sustitución de los residuos suprimidos cuando una al menos de las modificaciones es una supresión de al menos 3 residuos consecutivos.
La presente invención se refiere igualmente a un fragmento de ADN que codifica una fibra según la invención, así como a un vector de expresión de tal fragmento. Para este fin se puede utilizar todo tipo de vector, ya sea de origen plasmídico o vírico, integrativo o no. Tales vectores están disponibles comercialmente o se describen en la bibliografía. Igualmente, el experto en la técnica es capaz de adaptar los elementos de regulación necesarios para la expresión del fragmento de ADN según la invención. Además, se puede asociar a una o más sustancias susceptibles de mejorar la eficacia transfeccional y/o la estabilidad del vector. Estas sustancias están ampliamente documentadas en la bibliografía, accesible para el experto en la técnica (véanse, por ejemplo, Felgner et al., 1989, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson y Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate chemistry 5, 647-654). A título ilustrativo y no limitativo, pueden ser polímeros, lípidos, especialmente catiónicos, liposomas, proteínas nucleares y lípidos neutros. Una combinación potencial es un vector asociado con lípidos catiónicos (DC-Chol, DOGS, etc.) y lípidos neutros (DOPE).
La presente invención se refiere igualmente a un adenovirus desprovisto de una fibra nativa funcional, y que comprende en su superficie una fibra según la invención. Ésta se puede expresar mediante el genoma adenovírico, o se puede llevar en trans mediante una línea celular de complementación, tal como las definidas a continuación. Además, puede comprender un ligante, tal como se define aquí arriba. Preferentemente, la especificidad de unión de tal adenovirus con su receptor celular natural está reducida de manera significativa o, mejor, abolida, debido a la fibra modificada que porta. La pérdida de la especificidad natural se puede evaluar mediante estudios de unión celular realizados en presencia de virus marcados (por ejemplo, con la ^{3}H-timidina según la técnica de Roelvink et al., 1996, J. Virol. 70, 7614-7621), o mediante estudios de capacidad infecciosa de células permisivas, o que expresan la molécula de superficie seleccionada como diana por el ligante (véanse los ejemplos siguientes).
El ligante se puede acoplar de manera química al adenovirus según la invención. Pero se prefiere la variante según la cual las secuencias que codifican el ligante se insertan en el seno del genoma adenovírico, en particular en el seno de las secuencias que codifican la fibra modificada según la invención, preferentemente en fase, a fin de preservar el marco de lectura. La inserción puede tener lugar en un sitio cualquiera. Sin embargo, el sitio de inserción preferido está corriente arriba 5' del codón de parada en el extremo C-terminal o en el lugar de los residuos suprimidos. Es igualmente factible introducir las secuencias del ligante en el seno de otras secuencias adenovíricas, especialmente las que codifican otra proteína de cápsida, como el hexón o el pentón.
Ventajosamente, un adenovirus según la invención es recombinante y defectuoso para la replicación, es decir, incapaz de replicación autónoma en una célula huésped. La deficiencia se obtiene mediante mutación o supresión de uno o varios genes víricos esenciales y, especialmente, de toda o de parte de la región E1. Se pueden considerar supresiones en el seno de la región E3 para aumentar las capacidades de clonación. Sin embargo, puede ser ventajoso conservar las secuencias que codifican la proteína gp19k (Gooding y Wood, 1990, Critical Reviews of Immunology 10, 53-71) a fin de modular las respuestas inmunitarias del huésped. Bien entendido, el genoma de un adenovirus según la invención puede igualmente comprender supresiones o mutaciones suplementarias que afectan a otras regiones, especialmente las regiones E2, E4 y/o L1-L5 (véase, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO94/28152, y Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339, que describen la mutación termosensible del gen DBP de E2).
Según una forma de realización preferida, un adenovirus según la invención es recombinante, y comprende uno o varios genes de interés puestos bajo control de los elementos necesarios para su expresión en una célula huésped. El gen en cuestión puede ser de origen cualquiera, genómico, ADNc (ADN complementario) o híbrido (minigén desprovisto de uno o varios intrones). Se puede obtener mediante las técnicas convencionales de biología molecular o mediante síntesis química. Puede codificar un ARN antisentido, una ribosima o un ARNm que se traducirá después en polipéptido de interés. Éste puede ser citoplásmico, membranario o se puede segregar de la célula huésped. Por otra parte, puede tratarse de todo o parte de un polipéptido tal como se encuentra en la naturaleza, de un polipéptido quimera que proviene de la fusión de secuencias de orígenes diversos, o de un polipéptido mutado con relación a la secuencia nativa que presenta propiedades biológicas mejoradas y/o modificadas.
En el campo de la presente invención, puede resultar ventajoso utilizar los genes que codifican los polipéptidos siguientes:
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citoquinas o linfoquinas (interferones \alpha, \beta y \gamma, interleuquinas y especialmente la IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12, factores de necrosis tumoral (TNF), factores estimulantes de colonias (GM-CSF, C-CSF, M-CSF, etc.);
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receptores celulares o nucleares, especialmente los reconocidos por los organismos patógenos (virus, bacterias o parásitos) y, preferentemente, por el virus del VIH o sus ligantes (ligante fas);
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proteínas implicadas en una enfermedad genética (factor VII, factor VIII, factor IX, distrofina o minidistrofina, insulina, proteína CFTR (regulador de la transmisión transmembránica de la fibrosis cística; en inglés, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), hormonas del crecimiento (hGH);
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enzimas (ureasa, renina, trombina, etc.);
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inhibidores de enzimas (\alpha1-antitripsina, antitrombina III, inhibidores de proteasas víricas, etc.);
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polipéptidos con efecto antitumoral capaces de inhibir al menos parcialmente la iniciación o la progresión de tumores o cánceres (anticuerpos, inhibidores que actúan a nivel de la división celular o de las señales de transdución, productos de expresión de los genes supresores de tumores, por ejemplo p53 o Rb, proteínas que estimulan el sistema inmunitario, etc.);
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proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad de las clases I ó II, o proteínas reguladoras que actúan sobre la expresión de los genes correspondientes;
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polipéptidos capaces de inhibir una infección vírica, bacteriana o parasitaria, o su desarrollo (polipéptidos antigénicos que tienen propiedades inmunógenas, epítopos antigénicos, anticuerpos, variantes transdominantes susceptibles de inhibir la acción de una proteína nativa mediante competición, etc.);
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toxinas (timidina quinasa del virus del herpes simple 1 (TK-HSV-1), ricina, toxina colérica, diftérica, etc.) o inmunotoxinas;
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marcadores (\beta-galactosidasa, luciferaza, etc.);
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polipéptido que tiene un efecto sobre la apoptosis (inductor de apoptosis: Bax, etc., inhibidor de apoptosis Bcl2, Bclx), agentes citostáticos (p21, p16, Rb...), las apolipoproteínas (apoE, etc.), SOD, catalasa, óxido nítrico sintasa (NOS); y
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factores de crecimiento (FGF por factor de crecimiento de fibroblastos (Fibroblast Growth Factor, en inglés), VEGF por factor del crecimiento celular endotelial vascular (Vascular Endotelial cell growth Factor, en inglés), etc.).
Debe destacarse que esta lista no es limitativa y que se pueden utilizar igualmente otros genes.
Por otra parte, un adenovirus según la invención puede, además, comprender un gen de selección que permite seleccionar o identificar las células infectadas. Se pueden citar los genes neo (que codifican la neomicina fosfotransferasa) que confiere una resistencia al antibiótico G418, dhfr (dihidrofolato reductasa), CAT (cloranfenicol acetil-transferasa), pac (puromicina acetil-transferasa), o también gpt (xantina guanina fosforribosil-transferasa). De manera general, los genes de selección son conocidos por el experto en la técnica.
Por elementos necesarios para la expresión de un gen de interés en una célula huésped, se entiende el conjunto de los elementos que permiten su transcripción en ARN, y la traducción de un ARNm en proteína. Entre estos, el promotor reviste una importancia particular. En el campo de la presente invención, puede derivar de un gen cualquiera de origen eucariota o también vírico, y puede ser constitutivo o regulable. Por otra parte, se puede modificar a fin de mejorar la actividad promotora, suprimir una región inhibidora de la transcripción, hacer un promotor consecutivo regulable o viceversa, introducir un sitio de restricción, etc. Alternativamente, puede tratarse del promotor natural del gen a expresar. Se pueden mencionar, a título de ejemplo, los promotores víricos CMV (citomegalovirus), RSV (virus del sarcoma de Rous), promotores del gen TK del virus del HSV-1, promotor precoz del virus SV40 (virus del simio 40), el promotor adenovírico MLP, o también los promotores eucariotas de los genes PGK (fosfoglicerato quinasa) murino o humano, MT (metalotionina), \alpha1-antitripsina y albúmina (específica del hígado), inmunoglobulinas (específicas de linfocitos). Igualmente se puede utilizar un promotor específico de tumor (\alpha fetoproteína AFP, Ido et al., 1995, Cancer Res. 55, 3105-3109; muc-1; PSA por antígeno específico de la próstata (prostate specific antigen, en inglés), Lee et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 4561-4568; y flt 1, específico de las células endoteliales, Morishita et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 27948-27953).
Asimismo, un gen de interés de uso en la presente invención puede además comprender elementos adicionales necesarios para su expresión (secuencia intrónica, secuencia señal, secuencia de localización nuclear, secuencia terminadora de la transcripción, sitio de iniciación de la traducción de tipo IRES u otro, etc.), o también para su mantenimiento en la célula huésped. Tales elementos son conocidos por el experto en la técnica.
La invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de un adenovirus según la invención, según el cual:
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se transfecta el genoma de dicho adenovirus en una línea celular apropiada,
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se cultiva dicha línea celular transfectada en condiciones apropiadas para permitir la producción de dicho adenovirus, y
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se recupera dicho adenovirus del cultivo de dicha línea celular transfectada y, eventualmente, se purifica sustancialmente dicho adenovirus.
La elección de la línea celular depende de las funciones deficientes del adenovirus según la invención, y se utilizará una línea de complementación capaz de suministrar en trans la o las funciones defectuosas. La línea 293 conviene para complementar la función E1 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). Para una doble deficiencia E1 y E2 o E4, se puede utilizar una línea entre las descritas en la solicitud de patente francesa 96 04413. Igualmente se puede utilizar un virus auxiliar para complementar el adenovirus defectuoso según la invención en una célula huésped cualquiera, o también un sistema mixto que utiliza una célula de complementación y un virus auxiliar en el que los elementos dependen unos de otros. Los medios de propagación de un adenovirus defectuoso son conocidos por el experto en la técnica, que puede referirse por ejemplo a Graham y Prevec (1991, Methods in Molecular Biology, vol. 7, p. 190-128; ed. E.J. Murey, The Human Press Inc.). El genoma adenovírico se reconstituye preferentemente in vitro en Escherichia coli (E. coli) mediante ligación o también mediante recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la Solicitud francesa 94 14470). Los procedimientos de purificación se describen en la técnica anterior. Se puede citar la técnica de centrifugación en gradiente de densidad.
La presente invención se refiere igualmente a una línea celular que comprende, bien en forma integrada en el genoma o bien en forma de episoma, un fragmento de ADN que codifica una fibra según la invención puesto bajo control de los elementos que permiten su expresión. Dicha línea puede además ser capaz de complementar un adenovirus deficiente para una o varias funciones seleccionadas entre las codificadas por las regiones E1, E2, E4 y L1-L5. Deriva preferentemente de la línea 293. Tal línea puede ser útil para la preparación de un adenovirus cuyo genoma está desprovisto de toda o de parte de las secuencias que codifican la fibra (a fin de producir una fibra no funcional). La presente invención tiene igualmente por objeto el procedimiento correspondiente, según el cual:
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se transfecta el genoma de dicho adenovirus en una línea celular según la invención,
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se cultiva dicha línea transfectada en las condiciones apropiadas para permitir la producción de dicho adenovirus, y
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se recupera dicho adenovirus en el cultivo de dicha línea celular transfectada y, eventualmente, se purifica sustancialmente dicho adenovirus.
La presente invención se refiere igualmente a una célula huésped infectada por un adenovirus según la invención, o susceptible de ser obtenida mediante un procedimiento según la invención. Se trata ventajosamente de una célula de mamífero y, especialmente, de una célula humana. Ésta puede ser primaria o tumoral, y de cualquier origen, por ejemplo hematopoyética (célula madre totipotente, leucocito, linfocito, monocito o macrófago, etc.), muscular (célula satélite, miocito, mioblasto, célula muscular lisa), cardíaco, nasal, pulmonar, traqueal, hepático, epitelial o fibroblasto.
La invención tiene igualmente por objeto una composición farmacéutica que comprende, como agente terapéutico o profiláctico, una célula huésped o un adenovirus según la invención, o susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento según la invención, en asociación con un soporte farmacéuticamente aceptable. La composición según la invención se destina, particularmente, al tratamiento preventivo o curativo de enfermedades tales como las enfermedades genéticas (hemofilia, mucoviscidosis, diabetes o miopatía de Duchenne, de Becker, etc.), los cánceres, tales como los inducidos por oncogenes o virus, las enfermedades víricas, como la hepatitis B o C y el SIDA (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida que resulta de la infección por el VIH), las enfermedades víricas recurrentes, como las infecciones víricas provocadas por el virus del herpes, y las enfermedades cardiovasculares, que incluyen las restenosis.
Una composición farmacéutica según la invención se puede fabricar de manera convencional. En particular, se asocia una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico o profiláctico a un soporte tal como un diluyente. Una composición según la invención se puede administrar por vía local, sistémica, o por aerosol, particularmente por vía intragástrica, subcutánea, intracardíaca, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intrapulmonar, intranasal o intratraqueal. La administración puede tener lugar en una dosis única o repetida una o varias veces tras un cierto tiempo de intervalo. La vía de administración y la dosis apropiadas varían en función de diversos parámetros, por ejemplo, del individuo o de la enfermedad a tratar, o también del o de los genes de interés a transferir. En particular, las partículas víricas según la invención se pueden formular en forma de dosis comprendida entre 10^{4} y 10^{14} ufp (unidades formadoras de placas), ventajosamente 10^{5} y 10^{13} y, preferentemente, 10^{6} y 10^{12} ufp. La formulación puede igualmente incluir un diluyente, un coadyuvante, un excipiente farmacéuticamente aceptable, al igual que un agente estabilizante, conservante y/o solubilizante. Una formulación en disolución salina, no acuosa o isotónica conviene particularmente para una administración inyectable. Se puede presentar en forma líquida o seca (por ejemplo, liofilizado, et.), o en cualquier otra forma galénica corrientemente utilizada en el campo farmacéutico.
Finalmente, la presente invención se refiere al uso terapéutico o profiláctico de un adenovirus o de una célula huésped según la invención, o de un adenovirus susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento según la invención, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia génica. Según una primera posibilidad, el medicamento se puede administrar directamente in vivo (por ejemplo mediante inyección intravenosa, en un tumor accesible, en los pulmones por aerosol, etc.). Igualmente se puede adoptar el enfoque ex vivo, que consiste en extraer células del paciente (células madre de la médula ósea, linfocitos de la sangre periférica, células musculares, etc.), transfectarlas o infectarlas in vitro según las técnicas anteriores, y de readministrarlas al paciente.
La invención se extiende igualmente a un método de tratamiento según el cual se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un adenovirus, o de una célula huésped según la invención, a un paciente que necesita de tal tratamiento.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran únicamente una forma de realización de la presente invención.
Las construcciones descritas a continuación se realizan según las técnicas generales de ingeniería genética y de clonación molecular, detalladas en Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), o según las recomendaciones del fabricante cuando se utilice un kit comercial. Las etapas de clonación que utilizan plásmidos bacterianos se realizan preferentemente en la cepa de E. coli 5K (Hubacek y Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50, 111-127) o BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). Preferentemente, se utiliza esta última cepa para las etapas de recombinación homóloga. La cepa NM522 (Stratagène) conviene para la propagación de los vectores fágicos M13. Las técnicas de amplificación mediante PCR son conocidas por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, PCR Protocols-A guide to methods and applications, 1990, editado por Innis, Gelfand, Sninsky y White, Academic Press Inc.). En cuanto a la reparación de los sitios de restricción, la técnica utilizada consiste en un llenado de los extremos 5' protuberantes con la ayuda del gran fragmento del ADN polimerasa I de E. coli (Klenow). Las secuencias nucleotídicas Ad5 son las utilizadas en el banco de datos Genebank con la referencia M73260.
En cuanto a la biología celular, las células se transfectan según las técnicas estándares bien conocidas por el experto en la técnica. Se puede citar la técnica con fosfato de calcio (Maniatis et al., más arriba), pero igualmente se puede utilizar cualquier otro protocolo, tal como la técnica de DEAE dextrano, la electroporación, los métodos basados en choques osmóticos, la microinyección, o los métodos basados en el uso de lípidos catiónicos. En cuanto a las condiciones de cultivo, son las clásicas. En los ejemplos siguientes se recurre a la línea humana 293 (ATCC CRL1573) y a las líneas murinas Swiss 3T3 (ATCC CCL92), NR6 (Wells et al., 1990, Science 247; 962-964), NR6-hEGFR (Schneider et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 333-336), Daudi HLA- (ATCC CCL213) y Daudi HLA+ (Quillet et al., 1988, J. Immunol. 141, 17-20). Se indica que la línea Daudi se establece a partir de un linfoma de Burkitt, y naturalmente es deficiente en la expresión de la \beta-2 microglobulina y, de este modo, no posee en su superficie las moléculas HLA de clase I (Daudi HLA-). La línea celular E8.1 derivada de los Daudi se ha generado mediante transfección de un gen que codifica la \beta-2 microglobulina a fin de restaurar la expresión de moléculas HLA de clase I en sus superficies (Daudi-HLA+; Quillet et al., 1988, J. Immunol. 141, 17-20). Se entiende que se pueden igualmente utilizar otras líneas celulares.
Ejemplo 1 Construcción de un adenovirus que presenta un tropismo de huésped hacia las células que expresan el receptor del GRP (por péptido liberador de gastrina (gastrin releasing peptide, en inglés) A. Inserción de las secuencias que codifican el ligante GRP (fibra-GRP)
El plásmido pTG6593 deriva de p poli II (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201) por introducción del gen completo que codifica la fibra de Ad5 en forma de un fragmento EcoRI-SmaI (nucleótidos (nt) 30049 a 33093). El fragmento HindIII-SmaI (nt 31994-33093) se aísla y se clona en M13TG130 (Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99) digerido por estas mismas enzimas, para dar M13TG6526. Este último se somete a una mutagénesis dirigida con la ayuda del oligonucleótido oTG7000 (SEC ID nº: 2) (kit Sculptor, mutagénesis in vitro, Amersham) a fin de introducir un adaptador que codifica una brazo espaciador de 12 aminoácidos de secuencia PSASASASAPGS. El vector mutado así obtenido, M13TG6527, se somete a una segunda mutagénesis que permite introducir la secuencia que codifica los 10 residuos del péptido GRP (GNHWAVGHLM; Michael et al., 1995, Gene Ther. 2, 660-668). Para ello, se utiliza el oligonucleótido oTG7001 (SEC ID nº: 3). El fragmento HindIII-SmaI se aísla del fago mutado M13TG6528, y se introduce mediante la técnica de recombinación homóloga (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810) en el plásmido pTG6590, que porta el fragmento de genoma adenovírico Ad5 que se extiende de los nt 27081 a 35935, y se linealiza mediante MunI (nt 32825). El fragmento SpeI-ScaI (que porta los nt 27082 a 35935 del genoma Ad5 modificados por introducción del brazo espaciador y del péptido GRP) se aísla del vector anterior denominado pTG8599, y después se intercambia con el fragmento equivalente de pTG6591 anteriormente digerido por estas mismas enzimas. A título indicativo, el pTG6591 comprende las secuencias adenovíricas salvajes de las posiciones 21562 a 35935. Se obtiene el pTG4600, del que se aísla el fragmento BstEII (nt 24843 a 35233). Después de la recombinación homóloga con el plásmido pTG3602, que comprende el genoma Ad5 (descrito más detalladamente en la Solicitud Internacional WO96/17070), se genera el vector pTG4601.
Se introduce un casete que permite la expresión del gen LacZ en el lugar de la región adenovírica E1, mediante recombinación homóloga entre el plásmido pTG4601, linealizado mediante ClaI, y un fragmento BsrGI-PstI, que comprende el gen LacZ que codifica la \beta-galactosidasa bajo control del promotor MLP de Ad2, y la señal de poliadenilación del virus SV40. Este fragmento se aísla del vector pTG8526 que contiene el extremo 5' del ADN genómico vírico (nt 1 a 6241) en el que la región E1 (nt 459 a 3328) se sustituye por el casete de expresión LacZ. Su construcción está al alcance del experto en la técnica. El vector final se denomina pTG4628.
Los virus correspondientes AdTG4601 y AdTG4628 se obtienen mediante transfección de los fragmentos adenovíricos liberados de las secuencias plasmídicas mediante digestión PacI en la línea 293. A título indicativo, AdTG4601 porta el genoma Ad5 completo en el que el gen de la fibra comprende, en su extremo 3', un brazo espaciador seguido del péptido GRP. El virus recombinante AdTG4628 porta además el casete de expresión del gen informador LacZ bajo control del promotor adenovírico MLP.
B. Estudio del tropismo del virus que porta la fibra-GRP
La presencia del péptido GRP a nivel de la fibra adenovírica permite seleccionar como dianas a las células que expresan en su superficie el receptor de GRP. La expresión de los mensajeros que codifican este último se estudia en las células 293 y en las células murinas Swiss-3T3 (Zachary et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7616-7620), mediante transferencia Northern. Como sonda, se utiliza una mezcla de 2 fragmentos de ADN complementarios de la secuencia que codifica el receptor de GRP, marcados mediante las técnicas convencionales con isótopo ^{32}P. A título indicativo, los fragmentos se producen mediante PCR inversa a partir de los ARN celulares totales, con la ayuda de los oligonucleótidos oTG10776 (SEC ID nº: 4) y oTG10781 (SEC ID nº: 5) (Battey et al., 1991, Proc Natl. Acad. Sci. USA 88, 395-399; Corjay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 18771-18779). La intensidad de los ARNm detectados es mucho más importante en el caso de las células Swiss-3T3 que en las células 293, indicando la sobreexpresión del receptor GRP por la línea murina.
Se realizan ensayos de competición en los 2 tipos de células. El competidor está constituido por la cabeza de la fibra de Ad5 producida en E. coli, cuyas propiedades de unión al receptor celular adenovírico han sido demostradas (Henry et al., 1994, J. Virol. 68, 5239-5246). Las células en monocapa se incuban previamente durante 30 min. en presencia de PBS, o de concentraciones crecientes de cabeza Ad5 recombinante (0,1 a 100 \mug/ml) en un medio DMEM (Gibco BRL) complementado con un suero de ternera fetal al 2% (FCS). Después, se añade el virus AdTG4628, cuya fibra contiene el péptido GRP, a una multiplicidad de 0,001 unidad infecciosa/célula, durante 24h a 37ºC. Como control, y según las mismas condiciones de ensayo, se utiliza el virus recombinante AdLacZ (Stratford-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest. 90, 626-630) que porta un gen de la fibra nativa. Después, las células se fijan, y se evalúa la expresión del gen LacZ (Sanes et al., 1986, EMBO J. 5, 3133-3142). El número de células azules es representativo de la eficacia de la infección vírica. Una inhibición por competición se traduce por una reducción del número de células coloreadas, con relación a un testigo sin competidor (PBS).
La adición de cabeza de Ad5 recombinante, a una concentración de 100 \mug/ml, inhibe fuertemente la infección de las células 293 por los virus AdLacZ y AdTG4628 (porcentaje de inhibición de 95% y 98%). Esto sugiere que la presencia del competidor impide la interacción de la fibra adenovírica con su receptor celular natural. Por el contrario, los dos virus tienen un comportamiento diferente sobre las células Swiss-3T3. La infección del virus AdTG4628 en presencia de 100 \mug/ml del competidor está sólo parcialmente inhibida, mientras que, en las mismas condiciones de ensayo, la infección del virus AdLacZ, que tiene la fibra nativa, está totalmente inhibida. Estos resultados sugieren que la infección de las células Swiss-3T3 por el AdTG4628 está en parte mediada por un receptor independiente, probablemente el receptor de GRP, que estas células sobreexpresan. En conclusión, la adición del ligante GRP, en el extremo C-terminal de la fibra, favorece la infección de las células que expresan el receptor de GRP, de manera independiente a la interacción fibra-receptor celular natural.
Ejemplo 2 Construcción de un adenovirus que presenta un tropismo de huésped hacia las células que expresan el receptor del EGF (Factor de crecimiento epidérmico (Epidermal Growth Factor, en inglés))
Este ejemplo describe una fibra que porta las secuencias EGF en su extremo C-terminal. Para ello, se utilizan los oligonucleótidos oTG11065 (SEC ID nº: 6) y oTG11066 (SEC ID nº: 7) para amplificar un fragmento HindIII-XbaI a partir del plásmido M13TG6527. Los oligonucleótidos oTG11067 (SEC ID nº: 8) y oTG11068 (SEC ID nº: 9) permiten generar un fragmento XhoI-SmaI (que va del codón de parada hasta el nt 33093), a partir de M13TG6527. El ADN complementario del EGF, obtenido de ATCC (nº 59957), se amplifica en forma de un fragmento XhoI-XbaI con la ayuda de los oligonucleótidos oTG11069 (SEC ID nº: 10) y oTG11070 (SEC ID nº: 11). Después, los 3 fragmentos digeridos por las enzimas adecuadas se religan para dar un fragmento HindIII-SmaI, que contiene el EGF fusionado en el extremo C-terminal de la fibra. Se aplica el mismo procedimiento de recombinación homóloga que el descrito en el ejemplo 1 para reponer este fragmento en su contexto genómico.
Sin embargo, las etapas de clonación se pueden simplificar introduciendo un sitio único BstBI en la región diana, mediante las técnicas clásicas de mutagénesis. Se obtienen pTG4609 y pTG4213 con LacZ. La recombinación homóloga entre pTG4609, linealizado mediante BstBI, y el fragmento HindIII-SmaI, anterior, genera el plásmido pTG4225 que porta la región E1 salvaje. Su equivalente pTG4226, que porta el casete de expresión LacZ, se obtiene mediante recombinación homóloga con el pTG4213 digerido mediante BstBI. Los virus AdTG4225 y AdTG4226 se pueden introducir clásicamente mediante transfección de una línea celular apropiada, por ejemplo sobreexpresando el receptor del EGF.
Para ensayar la especificidad de infección de estos virus, se pueden utilizar las células fibroblásticas murinas NR6 y las células NR6-hEGFR que expresan el receptor del EGF humano. Las competiciones con la cabeza de Ad5 recombinante o con el EGF permiten evaluar la intervención de los receptores celulares naturales y de EGF para mediar la infección de los virus.
Ejemplo 3 Modificaciones de la cabeza de la fibra para eliminar la unión al receptor celular natural
Se ha realizado la mutación de la región de la fibra adenovírica, implicada en la interacción con el receptor celular natural, a fin de eliminar la capacidad de la fibra para unirse a su receptor natural; y la adición de un ligante permitirá modificar el tropismo de los adenovirus correspondientes.
Las secuencias de la fibra Ad5, que codifican la región que se extiende de los residuos 443 a 462 y 529 a 536, se han sometido a diversas mutaciones. La supresión de la hoja D utiliza el oligonucleótido de mutagénesis oTG7414 (SEC ID nº: 12), y la supresión del bucle CD el oligonucleótido oTGA (SEC ID nº: 13). El oligonucleótido oTGB (SEC ID nº: 14) permite la supresión del bucle CD y de la hoja D. El oligonucleótido oTG7416 (SEC ID nº: 38) permite la supresión de la hoja H. Todos estos oligonucleótidos contienen un sitio BamHI que permite detectar fácilmente los mutantes e, igualmente, insertar las secuencias que codifican un ligante, por ejemplo el péptido EGF.
Otros tipos de modificaciones consisten en sustituir estas regiones suprimidas por las secuencias equivalentes que provienen de la fibra de Ad3 (D+CD5 en D+CD3 significa que la región CD y D de la fibra Ad5 se sustituye por su equivalente de Ad3). En efecto, numerosos datos muestran que el Ad5 y el Ad3 no se unen al mismo receptor, de manera que tal sustitución debería abolir la infección mediada por el receptor Ad5 y seleccionar como dianas a las células que portan el receptor Ad3. La sustitución del bucle CD Ad5 por el del Ad3 utiliza oTG11135 (SEC ID nº: 15); la sustitución de la hoja D de la fibra Ad5 por la de la fibra Ad3 se efectúa mediante el oligonucleótido oTG10350 (SEC ID nº: 16); y la sustitución de la hoja D y del bucle CD del Ad5 por los del Ad3 se realiza sobre el mutante anterior con la ayuda del oTG11136 (SEC ID nº: 17). La sustitución de la hoja H se realiza con la ayuda del oligonucleótido oTG10352 (SEC ID nº: 39).
Igualmente, se ha modificado esta región diana de la cabeza adenovírica por una serie de mutaciones puntuales.
-
sustitución del codo \alpha\alpha GSLA en codo \alpha\alpha DKLT: oTGC (SEC ID nº: 18),
-
sustitución del codo \alpha\alpha SGTV en codo \alpha\alpha DKLT: oTGD (SEC ID nº: 19),
-
G443 en D (G443D): oTGE (SEC ID nº: 20),
-
L445 en F (L445F): oTGF (SEC ID nº: 21),
-
G450 en N (G450N): oTGG (SEC ID nº: 22),
-
T451 en K (T451K): oTGH (SEC ID nº: 23),
-
V452 en N (V452N): oTGI (SEC ID nº: 24),
-
A455 en F (A455F): oTGJ (SEC ID nº:25),
-
L457 en K (L457K): oTGK (SEC ID nº: 26),
-
I459 en A (I459A): oTGL (SEC ID nº: 27).
Los oTGE a I introducen mutaciones en el bucle CD de la fibra adenovírica sobre aminoácidos que son no conservativos entre el Ad5 y el Ad3, mientras que los oTGJ a K se refieren a aminoácidos de la hoja D no comprometidos en un enlace de hidrógeno que estabiliza a la estructura.
Las mutagénesis se pueden realizar sobre el vector M13TG6526 o M13TG6528. El primero porta el fragmento HindIII-SmaI salvaje, y, el segundo, este mismo fragmento modificado por inserción de las secuencias GRP. Los plásmidos que portan el genoma adenovírico se pueden reconstituir como se describe anteriormente para los plásmidos pTG4609 (E1 salvaje) y pTG4213 (LacZ en el lugar de la región E1). Los virus se generan mediante transfección de las células 293, o bien de células que sobreexpresan el receptor que se une al ligante al que se refiere. Tales células se pueden generar mediante transfección del ADN complementario correspondiente. Se utilizan preferentemente células que no expresan naturalmente el receptor celular natural de los adenovirus, por ejemplo la línea Daudi (ATCC CCL213).
La viabilidad de los diferentes mutantes se evalúa mediante transfección de células 293 y 293-Fb+ (células 293 transfectadas por un vector de expresión de la fibra de Ad5 salvaje). Sin embargo, la eficacia de transfección es variable de un ensayo a otro, incluso en lo que concierne a un adenovirus que porta una fibra salvaje que ha incorporado el péptido GRP en su extremo C-terminal (AdFbGRP). Para estandarizar los resultados, las placas obtenidas tras la transfección de las células 293-Fb+ se amplifican primero en esta misma línea, y se titulan los virus generados: en este estado pueden portar la fibra salvaje, o la fibra mutante, o los 2 tipos. Las células 293 se infectan entonces con estos virus con una baja multiplicidad de infección, que permite infectar sólo aproximadamente el 10% de las células (MOI de aproximadamente 0,2 unidades infecciosas/célula), y se determina la amplitud de la infección vírica 7 días después de la infección, midiendo la acumulación del ADN vírico y el título vírico. Siendo la propagación de la infección dependiente de la fibra mutada, los mutantes interesantes son los que no dan lugar a una infección productiva, mostrando que la mutación altera la unión al receptor natural. La capacidad de propagación de los adenovirus que portan la fibra mutada se compara con la de un adenovirus salvaje y la de un AdFbGRP.
Los resultados muestran que la inserción del péptido GRP en el extremo de la fibra salvaje reduce ligeramente el crecimiento del virus correspondiente con relación a un Ad salvaje, pero el factor de multiplicación es, sin embargo, del orden de 1000. Las mutaciones V452N, D+CD5 en D+CD3 y L445F reducen de manera significativa (factor 3 a 11) la afinidad de la cabeza de la fibra mutada por el receptor celular natural de los adenovirus. Las mutaciones \DeltaD (supresión de la hoja D de la fibra Ad5), \DeltaCD+D (supresión del bucle CD y de la hoja D), CD5 en CD3 (sustitución del bucle CD de un Ad5 por su equivalente de un Ad3), G443D, A445F, L457K e I459A, suprimen totalmente la propagación de los virus correspondientes en las células 293 (factor de multiplicación menor que 1).
Después, se verifica la capacidad de los virus mutantes para penetrar en las células diana vía el receptor de GRP. Los mutantes interesantes son los que presentan un factor de multiplicación significativo (mayor que 1). Para ello, se puede utilizar una línea denominada 293-GRPR, que expresa el MHC-I y el receptor de GRP en cantidades elevadas. Se genera mediante transfección de las células 293 por un plásmido de expresión eucariota que porta el ADNc del receptor de GRP (Corjay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 18771-18779). El casete de expresión está constituido por el promotor CMV precoz (Boshart et al., 1985, Cell 41, 521), las secuencias de corte y empalme del gen \beta-globina, el ADNc que codifica el receptor de GRP, y las secuencias polyA del gen \beta-globina. La selección de los transformantes se efectúa en presencia de higromicina (350 \mug/ml), y se seleccionan 50 clones, se amplifican y se ensayan para la expresión del ARNm que codifica el receptor mediante la técnica de transferencia Northern. Los clones más productivos se reúnen y se denominan 293-GRPR. La expresión de la proteína se puede igualmente controlar mediante FACS con la ayuda de un péptido GRP conjugado con la biotina y la avidina-FITC, seguido de una detección con la ayuda de
fluoresceína.
Ejemplo 4 Inserción del ligante en una proteína de cápsida distinta de la fibra, en asociación con una de las modificaciones de la fibra anteriormente citadas
Este ejemplo describe la inserción del ligante EGF en la proteína de cápsida hexón. Bien entendido, se prefiere que el adenovirus correspondiente haya perdido su capacidad de unión al receptor celular natural. Su genoma puede incluir, por ejemplo, un gen de la fibra modificada (véase el ejemplo 3), o puede estar desprovisto de al menos una parte de las secuencias de la fibra.
Se construye un plásmido de transferencia para la recombinación homóloga que cubre la región del genoma de Ad5 que codifica el hexón (nt 18842-21700). El fragmento de Ad5 HindIII-XhoI (nt 18836-24816) se clona en pBSK+ (Stratagene), digerido por estas mismas enzimas, para dar el plásmido pTG4224. Las secuencias que codifican el péptido EGF se introducen en el bucle hipervariable L1 del hexón, mediante creación de fragmentos quiméricos mediante PCR: hexón (nt 19043-19647)-XbaI-EGF-BsrGI-hexón (nt 19699-20312). El fragmento nt 19043 a 19647 se obtiene mediante amplificación PCR a partir del plásmido pTG3602 con los oligonucleótidos oTG11102 (SEC ID nº: 28) y oTG11103 (SEC ID nº: 29). El fragmento nt 19699 a 20312 se amplifica a partir del mismo ADN con los oligonucleótidos oTG11104 (SEC ID nº: 30) y oTG11105 (SEC ID nº: 31). El EGF se clona a partir del ADNc con la ayuda de los oligonucleótidos oTG11106 (SEC ID nº: 32) y oTG11107 (SEC ID nº: 33), permitiendo poner la secuencia que codifica el EGF en fase con el hexón. Los productos PCR se digieren por las enzimas adecuadas, y después se religan. El fragmento quimérico se puede entonces insertar mediante recombinación homóloga en el plásmido pTG4224, linealizado por NdeI (nt 19549), para dar pTG4229. Las secuencias que codifican el hexón modificado se pueden obtener mediante digestión HindIII-XhoI, y se reponen en sus contexto genómico mediante recombinación homóloga. Se puede utilizar el vector pTG3602, pTG4607, pTG4629 linealizado mediante SgfI, o un vector que porta el genoma adenovírico, al que se le han suprimido las secuencias de la fibra (como el pTG4607, descrito a continuación), o que expresa una fibra modificada conforme al ejemplo 3.
El genoma adenovírico incapaz de producir una fibra nativa funcional se obtiene mediante una supresión que afecta al codón iniciador pero que no se extiende a los demás ORF adenovíricos. Se procede de la manera siguiente: el fragmento adenovírico en dirección 5' de la supresión (nt 30564 a 31041) se amplifica mediante PCR con la ayuda de los cebadores oTG7171 y oTG7275 (SEC ID nº: 34 y 35). La amplificación del fragmento en dirección 3' (nt 31129 a 33099) utiliza los cebadores oTG7276 y oTG7049 (SEC ID nº: 36 y 37). Los fragmentos PCR se digieren mediante XhoI, y se ligan antes de ser introducidos mediante recombinación homóloga en el vector pTG6591, linealizado mediante NdeI, para dar pTG4602. Después, el fragmento BstEII, aislado de este último, se somete a una recombinación homóloga con el vector pTG3602, digerido mediante SpeI. Se obtiene pTG4607. El vector pTG4629 es equivalente al pTG4607, pero porta además el casete de expresión LacZ en el lugar de E1.
Los virus correspondientes se pueden obtener después de la transfección de células 293, 293-Fb+, o de células que sobreexpresan el receptor del EGF. El estudio de la especificidad de infección se podrá realizar como se describe anteriormente, utilizando el EGF como competidor.
Ejemplo 5 Construcción de un mutante de la fibra a la que se le ha suprimido las hojas E y F
Igualmente se ha generado un mutante de supresión de las hojas EF del campo de la cabeza de la fibra de Ad5. El plásmido pTG6593 se digiere mediante HindIII y SmaI, y el fragmento que porta las secuencias de la fibra se aísla y se clona en el vector M13TG130 separado mediante ruptura por HindIII y SmaI. La mutación supresora utiliza el oligonucleótido indicado en la SEC ID nº 40. El fragmento HindIII-SmaI mutado se recombina en E. coli con pTG4609, linealizado mediante BstBI (Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810). Este último contiene el genoma Ad5 completo que comporta un sitio BstBI en posición 32940 en dirección 3' del codón de parada de la fibra.
La capacidad de trimerización de la fibra modificada se ensaya sobre gel de SDS-PAGE (Novelli y Boulanger, J. of Biological Chemistry, 1991, 266, 9299-9303) a partir de la proteína producida por vía recombinante en las células Sf9 de insectos, con la ayuda de un baculovirus recombinante que porta las secuencias correspondientes puestas bajo control del promotor polihedrina. Paralelamente, la viabilidad (o capacidad para propagarse) de los viriones que portan la fibra mutada se determina mediante transfección de las células 293 y 293Fb+. Finalmente, la unión de la fibra a los receptores celulares MHC-I y CAR se puede estudiar en ensayos de competición de infección de un adenovirus recombinante Ad5-Luc sobre las células Daudi-HLA+ y CHO-CAR (Bergelson et al., 1997, Science 275, 1320-1323). A título indicativo, el virus Ad5Luc es un adenovirus competente para la replicación que contiene el gen luciferasa puesto bajo control del promotor precoz del virus SV40 (virus símico 40) insertado en la región E3 del genoma adenovírico (Mittal et al., 1993, Virus Research 28, 67-90).
La fibra \DeltaEF se acumula en forma de trímeros, puede propagarse en las células 293 y 293Fb+, y no es un competidor de la infección de las células Daudi-HLA+ por el Ad5Luc. Es capaz de inhibir parcialmente la infección de las células CHO-CAR, pero menos eficazmente que la fibra salvaje. Esto supone que las hojas E y F son importantes para la unión del Ad5 al receptor MHC-I que, aunque tiene un papel más pequeño, puede ser de estabilización en la unión al CAR. La inserción de un nuevo ligante debería permitir redirigir la capacidad de infección hacia las células que portan el receptor reconocido por el ligante.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Transgene S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
DIRECCIÓN: 11 rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Estrasburgo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CÓDIGO POSTAL: 67000
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
TELÉFONO: (33) 03 88 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
FAX: (33) 03 88 27 91 01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
DIRECCIÓN: 3 rue Michael Ange
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: París
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 75794 Cedex 16
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: (33) 01 44 96 40 00
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
FAX: (33) 01 44 96 50 00
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Fibra adenovírica modificada y adenovirus diana
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 40
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 581 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: fibra Ad5
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: 31063 A 33120 DEL GENOMA Ad5
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7000 (código por PSASASASAPGS)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACGATTCTT TAGCTGCCGG GAGCAGAGGC GGAGGCGGAG GCGCTGGGTT CTTGGGCAAT 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7001 (código por GRP)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACGATTCTT TACATCAGGT GGCCCACAGC CCAGTGGTTT CCGCTGCCGG GAGCAGA 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG10776
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTTCCACGG GGAAGATTGTA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG10781
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGGTGTCTG TCTTCACACT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11065
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGAAGCTTG AGGTTAACCT AAGCAC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11066
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGTCTAGAG CTGCCGGGAG CAGAGGCG 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11067
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCTCGAGT TATGTTTCAA CGTGTTTAT 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11068
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGCCCGGGG AGTTTATTAA TATC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11069 (clonación EGF)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGTCTAGAA ATAGTGACTC TGAATGTCCC C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11070 (clonación EGF)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCTCGAGC ACAAACGATT CTTTAGCGCA GTTCCCACCA CTTCAG 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7414 (supresión de la hoja D)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGCACTCCA TTTTCGTCGG ATCCTTGAAC TGTTCCAGAT AT 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGA (supresión del bucle CD)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTATAATAA GATGAGCACT GGATCCAGCC AAAACTGAAA CTG 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGB (supresión de los bucles CD y f.D)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAGCACTCC ATTTTCGTCG GATCCAACAG CCAAAACTGA AACTG 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 88 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: adenovirus humano Ad5 y Ad3
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11135 (bucle CD5 y CD3)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Adenovirus (Mastadenovirus)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 3
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG10350 (Hoja D5 en D3)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTAGCACTCC ATTTTCGTCA AAGTAGAGCT CCACGTTGAT ACTTTGAACT GTTCCAGATA 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGG 
\hfill
64 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 88 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus Ad5 y Ad3
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11136 (CD+D5 en CD+D3)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGC (Sustitución de Codo GSLA en DKLT)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGAACTGTT CCAGATATTG GGGTCAGTTT GTCTTTAACA GCCAAAAGTG AAACTG 
\hfill
56 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGD (Sustitución de Codo SGTV en DKLT)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATAAGATGA GCACTTTGGG TCAGTTTGTC TATTGGAGCC AAACTGAA 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGE (Sustitución de G443 en D)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAGATATTG GAGCCAAACT GTCTTTAACA GCCAAAACTG AAAC 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGF (Sustitución de L445 en F)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTTCCAGAT ATTGGAGCGA AACTGCCTTT AACAGCCAAA AC 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGG (Sustitución de G450 en N)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGAGCACTT TGAACTGTGT TAGATATTGG AGCCAAACTG CC 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGH (Sustitución de T451 en K)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAAGATGAGC ACTTTGAACC TTTCCAGATA TTGGAGCCAA ACTG 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGI (Sustitución de V452 en N)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTATAATAA GATGAGCACT TTGGTTTGTT CCAGATATTG GAGCC 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGJ (Sustitución de A455 en F)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCAAATCTT ATAATAAGAT GGAAACTTTG AACTGTTCCA GATATTGG 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGK (Sustitución de L457 en K)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCATTTTCGT CAAATCTTAT AATTTTATGA GCACTTTGAA CTGTTCC 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGL (Sustitución de I459 en A)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCACTCCATT TTCGTCAAAT CTAGCAATAA GATGAGCACT TTGAAC 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11102 (Clonación hexon)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGTTCATCC CTGTGGACCG TGA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11103 (Clonación hexón)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCCTCTAGA GTTGAGAAAA ATTGCATTTC CACTTGAC 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11104 (Clonación hexón)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTATTGTAC AGTGAAGATG TAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11105
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTTGGAAGG ACTGTACTTT AGC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11106 (Clonación ADNc EGF)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGTCTAGT GGCGAATAGT GACTCTGAAT GTCCCCTG 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Homo sapiens 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11107 (Clonación ADNc EGF)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACTGTACA ATACCACTTT AGGGCGCAGT TCCCACCACT TCAGG 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7171 (supresión de la fibra)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGGTTAACT TGCACCAGTG C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7275 (Supresión de la fibra)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCTCGAGC TGCAACAACA TGAAGAT 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7276 (supresión de la fibra)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGCTCGAGA CTCCTCCCTT TGTATCC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7049 (supresión de la fibra)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCCCGGGA GTTTATTAAT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7416 (supresión de la hoja H)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTTTCCTGT GTACCGTTGG ATCCTTTAGT TTTGTCTCCG TT 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 3
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG10352 (hoja H5 en H3)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis (supresión de las hojas E y F)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTATAGGCT GTGCCTTCGG ATCCCCAATA TTCTGGGTCC AG 
\hfill
42

Claims (30)

1. Fibra de un adenovirus modificada mediante mutación de sustitución de uno o varios residuos de dicha fibra, caracterizada porque dichos residuos están dirigidos hacia el receptor celular natural de dicho adenovirus y comprendidos en la parte de dicha fibra que comprende el bucle CD, la hoja D y el bucle DG, teniendo por efecto dicha mutación reducir o abolir la capacidad de unión de dicha fibra modificada al receptor celular natural.
2. Fibra de un adenovirus según la reivindicación 1, caracterizada porque se modifica mediante mutación de sustitución de uno o varios residuos en la parte de dicha fibra que comprende el bucle CD, la hoja D y la parte próxima al bucle DG.
3. Fibra de un adenovirus según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque dicho adenovirus es el adenovirus de tipo 5 (Ad5), y porque dicha fibra comprende toda o parte de la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº 1 (SEC ID nº: 1), y porque se modifica por mutación de sustitución de uno o varios residuos de la región comprendida entre los residuos 441 a 478 de la SEC ID nº: 1 y, preferentemente, 443 a 462.
4. Fibra de un adenovirus según la reivindicación 1, caracterizada porque se modifica por mutación de sustitución de uno o varios residuos comprendidos en las hojas E y F de dicha fibra.
5. Fibra de un adenovirus según la reivindicación 4, caracterizada porque dicho adenovirus es el adenovirus 5 (Ad5), y porque dicha fibra comprende toda o parte de la secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº 1 (SEC ID nº: 1), y porque se modifica por mutación de sustitución de uno o varios residuos de la región comprendida entre los residuos 479 a 486 de la SEC ID nº: 1.
6. Fibra de un adenovirus Ad5 según la reivindicación 3, caracterizada porque se modifica mediante sustitución:
-
del residuo glicina en posición 443 por un residuo ácido aspártico,
-
del residuo leucina en posición 445 por un residuo fenilalanina,
-
del residuo valina en posición 452 por un residuo asparagina,
-
del residuo alanina en posición 455 por un residuo fenilalanina,
-
del residuo leucina en posición 457 por un residuo alanina o lisina, o
-
del residuo isoleucina en posición 459 por un residuo alanina.
7. Fibra de un adenovirus según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque dicho adenovirus es el adenovirus de tipo 2 (Ad2), y porque dicha fibra se modifica por mutación de sustitución de uno o varios residuos de la región comprendida entre los residuos 441 a 478, y preferentemente 451 a 466, de dicha fibra.
8. Fibra de un adenovirus según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho adenovirus es el adenovirus de tipo 2 (Ad2), y porque dicha fibra se modifica por mutación de sustitución de uno o varios residuos de la región comprendida entre los residuos 479 a 486 de dicha fibra.
9. Fibra de un adenovirus según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque presenta una capacidad de unión al receptor celular natural sustancialmente reducido en comparación con una fibra no modificada, y porque es capaz de trimerizar.
10. Fibra de un adenovirus según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende además un ligante capaz de reconocer una molécula de superficie celular diferente del receptor celular natural de dicho adenovirus.
11. Fibra de un adenovirus según la reivindicación 10, caracterizada porque el ligante se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo, un péptido, una hormona, un polipéptido, o también un azúcar.
12. Fibra de un adenovirus según la reivindicación 10 u 11, caracterizada porque el ligante se inserta en el extremo C-terminal de la fibra.
13. Fragmento de ADN o vector de expresión que codifica una fibra de un adenovirus según una de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Línea celular caracterizada porque comprende, bien en forma integrada en el genoma o bien en forma de episoma, un fragmento de ADN según la reivindicación 13 puesto bajo control de los elementos que permiten su expresión en dicha línea celular.
15. Línea celular según la reivindicación 14, caracterizada porque es capaz además de complementar un adenovirus deficiente de una o varias funciones seleccionadas entre las funciones codificadas por las regiones E1, E2, E4 y L1-L5.
16. Línea celular según la reivindicación 14 a 15, caracterizada porque deriva de la línea 293.
17. Adenovirus caracterizado porque está desprovisto de una fibra nativa funcional, y porque comprende una fibra según una de las reivindicaciones 1 a 12, siendo dicha fibra codificada según una de las reivindicaciones 1 a 12 por el genoma de dicho adenovirus, o suministrada en trans por una línea celular según una de las reivindicaciones 14 a 16.
18. Adenovirus caracterizado porque está desprovisto de una fibra funcional, y porque comprende una fibra según una de las reivindicaciones 1 a 12 y un ligante capaz de reconocer una molécula de superficie celular diferente del receptor celular natural de dicho adenovirus.
19. Adenovirus según la reivindicación 18, caracterizado porque el ligante se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo, un péptido, una hormona, un polipéptido, o también un azúcar.
20. Adenovirus según una de las reivindicaciones 18 y 19, caracterizado porque el ligante se inserta en el extremo C-terminal de la fibra.
21. Adenovirus según una de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque el ligante se inserta en una proteína de cápsida distinta de la fibra, especialmente el hexón o el pentón.
22. Adenovirus según una de las reivindicaciones 17 a 21, caracterizado porque se trata de un adenovirus recombinante defectuoso para la replicación.
23. Adenovirus según la reivindicación 22, caracterizado porque se le suprime toda o parte de la región E1 y, opcionalmente, toda o parte de la región E3.
24. Adenovirus según la reivindicación 23, caracterizado porque se le suprime además toda o parte de la región E2, E4 y/o L1-L5.
25. Adenovirus según una de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque comprende un gen de interés seleccionado de entre los genes que codifican una citoquina, un receptor celular o nuclear, un ligante, un factor de coagulación, la proteína CFTR, la insulina, la distrofina, una hormona de crecimiento, una enzima, un inhibidor de enzima, un polipéptido con efecto antitumoral, un polipéptido capaz de inhibir una infección bacteriana, parasitaria o vírica y, especialmente el VIH, un anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina y un marcador.
26. Procedimiento para producir un adenovirus según una de las reivindicaciones 17 a 25, caracterizado porque:
-
se transfecta el genoma de dicho adenovirus en una línea celular apropiada,
-
se cultiva dicha línea celular transfectada en condiciones apropiadas para permitir la producción de dicho adenovirus, y
-
se recupera dicho adenovirus de dicho cultivo de dicha línea celular transfectada y, eventualmente, se purifica sustancialmente dicho adenovirus.
27. Procedimiento para producir un adenovirus cuyo genoma está desprovisto de toda o parte de las secuencias que codifican una fibra, caracterizado porque:
-
se transfecta el genoma de dicho adenovirus en una línea celular según una de las reivindicaciones 14 a 16,
-
se cultiva dicha línea celular transfectada en condiciones apropiadas para permitir la producción de dicho adenovirus, y
-
se recupera dicho adenovirus en el cultivo de dicha línea celular transfectada y, eventualmente, se purifica sustancialmente dicho adenovirus.
28. Célula huésped que comprende un adenovirus según una de las reivindicaciones 17 a 25, u obtenido mediante un procedimiento según la reivindicación 26 ó 27.
29. Composición farmacéutica que comprende un adenovirus según una de las reivindicaciones 17 a 25, u obtenido mediante un procedimiento según la reivindicación 26 ó 27, o una célula huésped según la reivindicación 28, en asociación con un soporte farmacéuticamente aceptable.
30. Utilización terapéutica o profiláctica de un adenovirus según una de las reivindicaciones 17 a 25, u obtenido mediante un procedimiento según la reivindicación 26 ó 27, o de una célula huésped según la reivindicación 28, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia génica.
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