ES2243000T3

ES2243000T3 - Nuevos medicamentos basados en polimeros compuestos de gelatina modificada con metacrilamina.

Info

Publication number: ES2243000T3
Application number: ES98930789T
Authority: ES
Inventors: Etienne Schacht; An Van Den Bulcke; Bernard Delaey; Jean-Pierre Draye
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1997-06-03
Filing date: 1998-06-03
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2018-06-03
Also published as: CA2290806A1; ATE295189T1; AU8110198A; JP3602145B2; EP0986408A1; US6458386B1; WO1998055161A1; DE69830166D1; DE69830166T2; HK1029289A1; AU736784B2; JP2002506431A; EP0986408B1; PT986408E

Abstract

La presente invención se refiere a un medicamento que comprende una matriz de biopolímero que contiene derivados vinílicos de gelatina reticulados, o gelatina con modificación de metacrilamida copolimerizada con polisacáridos con modificación vinílica, o un polisacárido y gelatina de sustitución vinílica reticulados y físicamente atrapados en una red de semiinterpenetración. Preferentemente el polisacárido contiene dextrano o xantano. La presente invención se refiere a un apósito para heridas o un dispositivo de liberación controlada que comprende la matriz de biopolímero. Preferentemente, la matriz está en forma de película hidratada, de espuma hidratada o seca, de fibras secas que pueden formarse en un tejido tejido o no-tejido, de microesferas hidratadas o secas, de polvo seco, o también la matriz puede revestirse con una película semipermeable que permite regular la humedad de la herida cubierta por el apósito, seleccionándose la permeabilidad para mantenerse esta humedad en una gama óptima desde el punto de vista terapéutico.

Description

Nuevos medicamentos basados en polímeros compuestos de gelatina modificada con metacrilamida.

La presente invención se refiere a materiales de vendaje para heridas que comprenden gelatina modificada con metacrilamida reticulada, o gelatina modificada con metacrilamida copolimerizada con polisacáridos sustituidos con vinilo. El material es útil para cubrir una variedad de tipos de heridas, particularmente heridas crónicas y quemaduras. El material también es adecuado para la liberación controlada de fármacos. Cuando se carga con factores de crecimiento adecuados o con sustancias promotoras de la reparación de heridas, la matriz es útil para la fabricación de vendajes para heridas para el tratamiento de una variedad de tipos de heridas, particularmente heridas crónicas y quemaduras.

Un gran número de personas sufren de heridas crónicas de la piel que no cicatrizan. Una característica común en el tratamiento de estas heridas es que necesitan que sean cubiertas para la cicatrización óptima. El efecto beneficioso de cubrir heridas se sitúa a diferentes niveles, y depende del tipo de material de vendaje usado. Para heridas agudas, los vendajes adecuados pueden ayudar a lograr la hemostasia y de este modo controlar la pérdida de sangre. También, el recubrimiento de heridas protege eficazmente a la herida del medioambiente, protegiéndola de este modo de la contaminación microbiana. Además, algunos vendajes para heridas denominados oclusivos o semioclusivos tienen la capacidad para mantener la humedad de la herida, lo que es beneficioso para la cicatrización. Finalmente, algunos vendajes para heridas pueden promover ellos mismos directamente el proceso de cicatrización, por ejemplo debido a que contienen componentes que promueven directamente el crecimiento o migración celular, o que atraen o activan células del sistema inmunitario que por sí mismas segregan sustancias promotoras del crecimiento. Otros vendajes pueden contener sustancias antimicrobianas, que son útiles para controlar la infección de la herida.

A lo largo del tiempo, se ha usado una variedad sorprendentemente amplia de materiales de vendajes para cubrir heridas, muchos de los cuales están actualmente disponibles de forma comercial. Cada uno de ellos tiene sus propias indicaciones, dependiendo del tipo de herida, de la profundidad, del tamaño, de la ausencia o presencia de infección, del nivel de formación de exudado, etc.

Por ejemplo, la gasa de algodón se usa ampliamente como vendaje para heridas. Tiene la ventaja de ser barata, pero tiene la desventaja de no ser oclusiva y algunas veces se incrusta en la herida. Para evitar esto, estos vendajes se impregnan algunas veces con una sustancia grasienta, tal como parafina. Un ejemplo comercialmente disponible de tal vendaje es Jelonet^{TM} (Smith y Nephew, UK).

Otra clase de vendajes para heridas son los vendajes de hidrogeles absorbentes. Estos tienen una capacidad elevada para la absorción de exudado de heridas. Consisten en polímeros hidrófilos, tales como gelatina, polisacáridos, poliacrilamida, etc., que se hinchan al entrar en contacto con el fluido de la herida, y pueden absorber varias veces su propio peso de exudado. Los vendajes de hidrogeles comercialmente disponibles incluyen gel Intrasite (Smith y Nephew, UK) y Vigilon (CR Bard, USA). Un tipo especial de hidrogeles son los alginatos, que son polisacáridos hidrófilos extraídos de alga. Se producen como tejidos delgados no tejidos, o como cuerdas. Al entrar en contacto con el fluido de la herida, se convierten en un gel que tiene una elevada capacidad absorbente del fluido de la herida. Los ejemplos incluyen Kaltostat (Brit-Cair, UK) y Sorbsan (Steriseal, UK).

Otro tipo de vendajes son los vendajes oclusivos o semioclusivos. En su forma más simple, habitualmente existen como una membrana plástica flexible y delgada, por ejemplo de poliuretano. Para facilitar la aplicación, estos vendajes se fabrican habitualmente con un revestimiento autoadhesivo. Estos vendajes se denominan oclusivos debido a que limitan la evaporación del agua desde la superficie de la herida, manteniendo de este modo la humedad. Los ejemplos de tales gasas son Opsite (Smith y Nephew, UK) y Tegaderm (3M, USA). Los ejemplos de vendajes semioclusivos son Omiderm (Iatro Medical Systems, UK) y Exkin (Koninklijke Utermöhlen, Países Bajos). Estos últimos vendajes permiten una tasa de evaporación ligeramente mayor, dando como resultado una superficie de la herida semiseca.

Un tipo más complejo de vendajes oclusivos son los vendajes de hidrocoloides (HCD). Estos están fabricados de partículas hidrocoloidales (por ejemplo, que consisten en gelatina, pectina, carboximetilcelulosa, etc.) embebidas en una matriz hidrófoba (por ejemplo, un poliisobutileno, un copolímero de estireno-isopreno-estireno). Estos vendajes se pueden soportar con una membrana oclusiva y/o una capa de espuma plástica. Además de ser oclusivos, los vendajes de HCD tienen una elevada capacidad absorbente, haciéndolos muy adecuados para el tratamiento de heridas que producen cantidades elevadas de exudado. Estas propiedades beneficiosas han hecho a los vendajes de HCD entre los vendajes usados con más éxito para el tratamiento de úlceras crónicas de la piel. Los ejemplos comercialmente disponibles de estos vendajes incluyen DuoDERM© (Convatec, UK), Tegasorb^{TM} (3M, USA), y Comfeel, (Coloplast, Dinamarca).

Aunque tienen muchísimo éxito, informes recientes sugieren que los vendajes de HCD pueden inducir no obstante reacciones secundarias indeseables en los tejidos tratados. Por ejemplo, Van Luyn informa que los vendajes DuoDERM (Convatec, UK), Biofilm (Biotrol SPA, Francia), Comfeel (Coloplast, Dinamarca) y Ulcer (Johnson and Johnson, USA), todos los cuales son vendajes de HCD, caen dentro de la clase de toxicidad elevada cuando se ensayan en ensayos de metilcelulosa usando fibroblastos de piel humana como células diana (Van Luyn, M. Tesis Doctoral 1992, State University Groningen, Países Bajos; Van Luyn, M., Abstract Book of the joint WHS/ETRS meeting, Amsterdam, 1993, p. 114). Todos los vendajes de HCD ensayados por este autor inhibieron muchísimo el crecimiento celular (> 70%) e indujeron morfologías fuertemente irregulares en las células supervivientes. Leek et al. (Abstract Book of the Second Annual WHS Meeting, Richmond, VA, USA, p. 75, 1992) ha ensayado cuatro vendajes de HCD en heridas por escisión de grosor completo, en cerdos. Todos los vendajes indujeron desarrollo de lesiones granulomatosas entre 4 y 10 días después de la formación de la herida, y mostraron muy pocos signos de resolución a los 3 meses después de la formación de la herida. La reacción más grave se obtuvo con DuoDERM e Intrasite HCD. Rosdy y Clauss (J. Biomedical Mat. Res. 24, 363-3777, 1990) encontraron que el vendaje de HCD Granuflex^{TM} (Bristol-Myers Squibb, USA) indujo efectos citopáticos sobre fibroblastos MRC5 y células epidérmicas con el contacto directo. Young et al. (J. Invest. Dermatol. 97, 586-592, 1991) describe, en un sistema de modelo de animal, el desarrollo de reacciones de tipo cuerpo extraño profundamente alojado, y granulomas en heridas cicatrizadas que se tratan con vendajes de HCD. Los experimentos con el vendaje de HCD DuoDERM^{TM} muestran que este vendaje da como resultado una respuesta inflamatoria notable y crónica cuando se coloca en heridas de grosor completo, en cerdos.

Los datos mencionados anteriormente sugieren que, aunque los vendajes de HCD pueden promover la cicatrización de heridas a corto plazo, su uso está asociado a menudo con efectos inflamatorios indeseables. Por lo tanto, está claro que existe una necesidad de un vendaje para heridas que presente las propiedades beneficiosas de los vendajes de HCD, pero que dé como resultado una inflamación crónica o una respuesta a un cuerpo extraño sustancialmente menores. Tal vendaje para heridas estimularía la formación de tejido de granulación, sería absorbente, y eventualmente sería biodegradable dentro de un marco de tiempo limitado.

La gelatina, que es una forma desnaturalizada de la proteína colágeno, se ha usado en una variedad de vendajes para heridas y sistemas de liberación controlada. Debido a su punto de fusión relativamente bajo, los geles de gelatina no son muy estables a la temperatura corporal. En consecuencia, es necesario estabilizar estos geles de gelatina antes de que se puedan usar con el fin de cicatrizar heridas. Esto se realiza generalmente estableciendo reticulaciones entre las cadenas proteínicas tratando a la gelatina con formaldehído o con glutaraldehído. Como alternativa, esto se puede lograr reticulando la gelatina con polialdehídos producidos mediante oxidación parcial de polisacáridos tales como dextrano (Schacht EH, Nobels M, Vanteenkiste S, Demeester J, Fransen J, Lemahieu A. Polym Gels Networks 1993; 1:213-224). La gelatina reticulada se puede fabricar como esponjas secas que son útiles para inducir hemostasia en heridas sangrantes. Los ejemplos comercialmente disponibles de tales esponjas incluyen Spongostan® (Ferrosan, Dinamarca) y Gelfoam (Upjohn, USA). Una desventaja principal de estas esponjas es que el agente de reticulación usado (formaldehído o glutaraldehído) es tóxico para las células. El efecto negativo de la reticulación con glutaraldehído se ejemplifica, por ejemplo, en los hallazgos de Vries et al. (Abstract Book of the Second Annual Meeting of the WHS, Richmond, USA, p. 51, 1992). Estos autores mostraron que las redes cristalinas de colágeno reticulado con glutaraldehído eran tóxicas para las células, mientras que no era así para la variedad no reticulada. Por lo tanto, a pesar de sus propiedades hemostáticas beneficiosas, estos productos no son muy óptimos como vendajes para heridas para el tratamiento de heridas problemáticas tales como úlceras crónicas o quemaduras. En consecuencia, sería muy deseable un vendaje para heridas a base de gelatina que use una tecnología de reticulación diferente, menos tóxica. El dextrano es un polisacárido que también se usa ampliamente con fines médicos, y que también se puede usar en un vendaje para heridas. Por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT nº WO 94/27647 (Smith y Chakravarty, publicada el 08/12/94) enseña la fabricación de una composición polímera que comprende dextrano reticulado, en la que los grupos de reticulación consisten en grupos de imidocarbonato o carbonato lineales. Este polímero se puede incorporar en un vendaje para heridas. Una característica importante de esta composición polímera es que es hidrolíticamente lábil. Esto significa que las formas hidratadas del material son inherentemente inestables, y que el polímero sólo se puede almacenar durante períodos prolongados cuando se deshidrata.

Schacht et al., en la patente Europea publicada con el número 0308330, describe una composición polímera que comprende gelatina, reticulada con polisacáridos oxidados en los que adicionalmente se pueden inmovilizar proteínas, enzimas o microorganismos.

Aparte del desarrollo de vendajes mejorados, a lo largo de los últimos años se ele ha prestado una creciente atención al uso posible de factores de crecimiento para promover la cicatrización de heridas, en particular quemaduras y úlceras. A continuación se dan unos pocos informes científicos que describen el uso de factores de crecimiento para promover la cicatrización de heridas en seres humanos. El factor de crecimiento epidérmico (EGF) se ha usado para el tratamiento de sitios donantes de injerto de piel (Brown et al., N. Engl. J. Med. 321, p. 76-79, 1989) y de úlceras crónicas (Brown et al., Plast. Reconstr. Surg. 88, p. 189-194, 1991). Este mismo factor también se ha usado con éxito en oftalmología para el tratamiento tópico de úlceras de la córnea traumáticas (Scardovi et al., Ophthalmologica 206, p. 119-124, 1993), y para promover la cicatrización endotelial en córneas humanas (Hoppenreijs et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, p. 1946-1957, 1992). Existen comercialmente disponibles colirios de EGF con el nombre comercial Gentel® de Inpharzam S.A. (Cadempino, Suiza). El factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) se ha usado para el tratamiento de úlceras de decúbito clónicas (Robson et al., Ann. Surg. 216, p. 401-408, 1992), y para el tratamiento de ampollas de succión experimentalmente inducidas, en seres humanos (Lyonnet et al., J; Invest. Dermatol. 96, p. 1022, 1991). Se encontró que el factor de crecimiento transformante \beta (TGF\beta) tiene efectos beneficiosos en el tratamiento de agujeros maculares de espesor total en ojos humanos (Glaser et al., Ophthalmology 99, p. 1162-1173). Se encontró que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es un estimulante de la cicatrización de úlceras de decúbito crónicas en seres humanos (Robson et al., Lancet 339, p. 23-25, 1992). Se ha informado que la hormona humana del crecimiento acelera la cicatrización de heridas en niños con grandes quemaduras cutáneas (Gilpin et al., Ann. Surg. 220, p. 19-24, 1994). También se ha encontrado que el lisado de plaquetas, que es una preparación bruta que contiene una mezcla de varios factores de crecimiento, estimula la cicatrización de úlceras crónicas (Knigton et al., Surgery Gyn. Obst. 170, 56-60, 1990). Esta última preparación se ha comercializado con el nombre comercial Procuren por Curative Technologies, Inc. (USA). Los estudios de los inventores de la presente, con lisados de queratinocitos brutos, que también contienen varias actividades promotoras del crecimiento celular, han demostrado que aumentan la velocidad de cicatrización de heridas por quemaduras, y potencian la epitelialización de defectos del oído medio en pacientes con otorrea crónica y tras la timpanoplastia.

Un problema habitual con todos los estudios mencionados anteriormente es encontrar un camino eficaz para el suministro controlado de las sustancias activas a la herida. En la mayoría de los casos, estas sustancias se aplican simplemente como una disolución acuosa, o en el mejor de los casos como una formulación en un gel semilíquido o crema. Usando tales formulaciones, la mayoría de las sustancias activas se libera en el sitio de la herida muy rápidamente. No obstante, se sabe que muchos factores de crecimiento son relativamente inestables, y es de esperar que su vida media en el medioambiente de la herida sea relativamente corta. Esto significa que existe una necesidad de un dispositivo que permita la liberación controlada de la sustancia activa durante un período prolongado, a la vez que proteja el factor aún no liberado de la degradación prematura. Esto reduciría significativamente el coste, y aumentaría la eficacia de la terapia para heridas con factores de crecimiento, reduciendo la dosis necesaria y el número de aplicaciones. Se han considerado varias estrategias y materiales para la liberación controlada de factores de crecimiento peptídicos y sustancias similares. A continuación se dan unos pocos enfoques que se han dado a conocer en la bibliografía científica, o para los cuales se han presentado solicitudes de patentes.

Una clase de dispositivos de liberación controlada consiste en polímeros biodegradables sintéticos. Por ejemplo, los poli-lactida-glicolidas (PLG) son polímeros degradables hidrolíticamente que se pueden usar para la liberación lenta de varias sustancias farmacéuticas, incluyendo macromoléculas bioactivas tales como calcitonina, LHRH, somatostatina, insulina, interferón y vacunas (Lewis, Pharmaceutical Manufacturing International, 1993, p. 99-105). Debido al uso de disolventes orgánicos, la incorporación de péptidos o proteínas biológicamente activos en PLG a menudo da como resultado su inactivación. Aunque esto se puede evitar mediante la producción de mezclas físicas de PLG/péptido (por ejemplo, moldeando por compresión mezclas en polvo), éstas pueden ser menos adecuadas como vendajes para heridas debido a su rigidez y fragilidad.

Además de los polímeros sintéticos, se ha usado una amplia variedad de polímeros de origen natural, o modificaciones de los mismos, para la liberación controlada de factores peptídicos bioactivos. Un ejemplo de esto son las lanas de metilpirrolidinona-quitosano cargadas con bFGF (Berscht et al., Biomaterials 15, 593-600, 1994). En el documento WO 92/09301 de Greisler se describe una composición de liberación controlada particular, documento el cual enseña el uso de un sellante de tejidos de fibrina que contiene factor de crecimiento para la aceleración de la cicatrización de heridas. Los productos según esta última invención, probablemente serían relativamente caros, debido al coste elevado de adhesivos de pegamentos de fibrina comercialmente disponibles.

Un biopolímero usado frecuentemente para la liberación controlada es también la gelatina. Las esponjas de gelatina que contienen colágeno, para el suministro de fármacos proteínicos, se han descrito en las solicitudes de patentes EP 0568334 (publicada el 03/11/94) y WO 93/21908. Golunbek et al., en Cancer Res. 53, p. 5841-5844 (1993), describe el uso de microesferas de gelatina cargadas con IFN\gamma o GM-CSF, como vacunas potenciales para la terapia del cáncer. Cortesi et al. (Int. J. Pharm. 105, p. 181-186, 1994) describe el uso de microesferas de gelatina para la liberación de oligonucleótidos sintéticos y de fragmentos de ADN generados mediante PCR. La síntesis de microesferas de gelatina que contienen interferón se dio a conocer por Tabata e Ikada (Pharm. Res. 6, p. 422-427, 1989). Shinde y Erhan (Bio-Med. Mat. Eng. 2, p. 127-131, 1992) describen películas de gelatina flexibilizadas para la liberación de insulina.

Como se expone anteriormente, el glutaraldehído o formaldehído usados habitualmente para la reticulación de estos biomateriales a base de gelatina tienen la desventaja de ser tóxicos para las células. Además de sus propiedades tóxicas, también es de esperar que el glutaraldehído y el formaldehído afecten a la actividad biológica de las sustancias proteínicas bioactivas incorporadas cuando la reticulación se lleva a cabo después de la adición de estas sustancias al sistema. En consecuencia, sería muy deseable un dispositivo de liberación lenta a base de gelatina, que use una tecnología de reticulación diferente, menos tóxica, para la fabricación de, por ejemplo, vendajes para heridas medicados con factores de crecimiento.

La presente invención se dirige de este modo a proporcionar un vendaje adecuado para heridas.

La presente invención también se dirige a proporcionar un dispositivo adecuado para la liberación lenta o controlada.

La presente invención se dirige además a métodos para producir y usar dichos vendajes para heridas o dichos dispositivos de liberación controlada o lenta.

La presente invención se refiere al descubrimiento de que los hidrogeles preparados con gelatina químicamente modificada y reticulada constituyen medicamentos excelentes, más particularmente vendajes para el tratamiento de heridas y para la liberación de agentes bioactivos. La gelatina según la presente invención está modificada con grupos laterales de metacrilamida, que se pueden reticular mediante radicales. Este concepto permite incluir polisacáridos y otros polímeros solubles en agua que tengan grupos laterales polimerizables mediante radicales, por ejemplo grupos laterales de acrilamida o metacrilato. La factibilidad para preparar tales hidrogeles se demostró usando un derivado de acrilamida o de metacrilato de dextrano, un polisacárido particularmente adecuado para uso en la presente invención. En el Ejemplo 1, se ejemplifican las preparaciones de gelatina modificada con vinilo, dextrano modificado con acrilamida, metacrilato de dextrano, y la preparación de películas de hidrogeles.

Una de las ventajas del medicamento descrito en la presente es que comprende un material biodegradable. No obstante, puesto que la biodegradabilidad no se obtiene mediante el uso de enlaces rompibles hidrolíticamente, el objeto de esta invención es suficientemente estable en una forma hidratada para permitir el almacenamiento prolongado. A diferencia de la gelatina no reticulada, también tiene un punto de fusión suficientemente elevado para permanecer en el sitio de la herida en forma intacta durante un tiempo suficientemente largo. Una ventaja es que una de las realizaciones del vendaje descrito ofrece la posibilidad de inmovilizar en el vendaje dextranos sulfatados o moléculas polianiónicas similares, una modificación que potencia la unión de los factores moduladores de la reparación de heridas añadidos, o de factores de unión a heparina producidos in situ.

Según un segundo aspecto, la presente invención se refiere al hallazgo de que la gelatina reticulada mencionada anteriormente constituye una matriz biopolímera ideal para la incorporación y liberación controlada subsiguiente de factores peptídicos bioactivos. Por lo tanto, los péptidos o polipéptidos farmacéuticamente activos se pueden incorporar en la matriz mezclándolos con el componente de gelatina solubilizado, seguido de la reticulación radicálica de los grupos laterales de vinilo para obtener un gel reticulado estabilizado que contiene los polipéptidos en una forma liberable. La incorporación de los polipéptidos durante el procedimiento de producción del hidrogel es más rápida y más eficaz que el procedimiento alternativo de la incorporación de los polipéptidos mediante procedimientos de sorción (por ejemplo, empapando la matriz deshidratada o parcialmente deshidratada en una disolución que contiene los polipéptidos). Tal matriz de gelatina reticulada medicada se puede usar para varias aplicaciones terapéuticas, en particular para la fabricación de vendajes medicados para heridas.

La expresión "matriz biopolímera", según la presente invención, se refiere a una matriz compuesta de gelatina modificada, o gelatina modificada y polisacáridos modificados, como se define anteriormente, que tiene como propiedad básica el ser biodegradable.

En una realización preferida, el vendaje para heridas propuesto consiste en una lámina o película hidratada de matriz como se define anteriormente, soportada sobre una película oclusiva o semioclusiva. Oclusiva en este contexto significa que la película tiene una permeabilidad al agua que es suficientemente baja para evitar que la herida se seque, pero suficientemente elevada para evitar la acumulación excesiva de exudado debajo del vendaje para heridas.

En otra realización, el vendaje para heridas se fabrica en forma de micropartículas deshidratadas o secas. Estas micropartículas son especialmente adecuadas para ser aplicadas en heridas profundas, muy exudantes. En virtud de la elevada capacidad absorbente de fluidos de las partículas, las heridas se pueden limpiar, de este modo, del exceso de exudado y de la masa de tejido muerto.

En aún otra forma, el polímero propuesto se fabrica en una espuma deshidratada flexible. Tal espuma se puede aplicar fácilmente sobre heridas superficiales, y también tiene una elevada capacidad absorbente. Pero también se concibe cualquier otro formato que respete las propiedades del polímero de estabilidad, biodegradabilidad y de retención de factores de crecimiento bioactivos. A este respecto, una espuma hidratada puede tener otras cualidades.

El polímero propuesto también se puede usar para la fabricación de un vendaje para heridas que contenga una o más sustancias promotoras de la reparación de la herida. Los ejemplos de tales sustancias son, por ejemplo, factores de crecimiento tales como EGF, TGF-\alpha, FGF, PDGF, anfirregulina, HB-EGF, betacelulina, TGF-\beta, IGF u otros mitógenos o sus antagonistas que puedan modular el proceso de reparación de la herida. Tal vendaje medicado para heridas se puede producir en formas diferentes, incluyendo láminas flexibles, espumas, micropartículas, fibras para crear tejidos no tejidos o tejidos, etc. Una de las realizaciones de la invención se refiere a la producción de un vendaje para heridas que contiene múltiples capas, en el que cada capa contiene un componente activo diferente, para lograr un suministro programado de los diferentes componentes a lo largo del tiempo. En otra realización, los grupos de afinidad adecuados se enlazan a la matriz polímera para aumentar la afinidad de la matriz por las sustancias activas incorporadas, disminuyendo de este modo su velocidad de liberación, y/o para protegerlas de la degradación o inactivación prematuras. Los ejemplos de tales grupos de afinidad incluyen oligo- o polisacáridos polisulfatados, tales como heparina, sulfato de heparano, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de dextrano, o análogos o fragmentos funcionales de los mismos, que tienen una afinidad por factores de crecimiento que se unen a la heparina, tales como los FGF, anfirregulina y HB-EGF. De ese modo, también se incluye cualquier proteoglicano que contenga cadenas de glicosaminoglicano capaces de unirse a los factores que se unen a la heparina. Los grupos de afinidad posibles también incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales, o microproteínas según se obtienen mediante presentación de fagos, y que tienen una afinidad elevada y selectiva por factores de crecimiento específicos.

La presente invención se refiere al descubrimiento de que los hidrogeles compuestos de gelatina o de gelatina y polisacáridos, como se definen anteriormente, constituyen un excelente material para la preparación de vendajes adecuados para cubrir y tratar heridas. Además, el material también presenta propiedades de liberación controlada inesperadamente favorables para el suministro de sustancias terapéuticas, particularmente a las heridas. Los hidrogeles se preparan reticulando gelatina solubilizada o derivados de gelatina. La gelatina es una forma desnaturalizada de la proteína colágeno del tejido conjuntivo. Existen varios tipos de gelatina, dependiendo de la fuente de colágeno usada, y del procedimiento de extracción y de producción empleado. Un tipo de gelatina se extrae de huesos de animales, mientras que otro tipo se extrae de la piel de animales. Habitualmente, el material animal procede de un origen bovino o porcino. Dependiendo del procedimiento de extracción, se pueden preparar dos tipos de gelatina: el tipo A (o ácido), que se prepara mediante hidrólisis ácida del colágeno, y que tiene un punto isoeléctrico de alrededor de 8, y el tipo B (o básico), que se prepara mediante hidrólisis básica del colágeno, y que tiene un punto isoeléctrico de alrededor de 5. Ambos tipos de gelatina son usables para la preparación de matrices de hidrogeles, como se define anteriormente, adecuadas para la presente invención. Una propiedad importante de la gelatina es que forma geles con una cierta rigidez. La rigidez de estos geles se expresa mediante el número de Bloom de la gelatina. Para los fines de esta invención, son usables gelatinas con una variedad de números de Bloom. Sin embargo, se prefieren los números de Bloom de al menos 150, preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 250, debido a que ofrecen matrices de hidrogeles de una elevada resistencia mecánica, las cuales se pueden fabricar en forma de películas o láminas.

En la presente invención, se seleccionó dextrano modificado con acrilamida o con metacrilato como ejemplo de un polisacárido sustituido con vinilo, que se puede copolimerizar con gelatina sustituida con vinilo. Sin embargo, debe ser obvio para la persona experta en la técnica que también se pueden usar otros polisacáridos y polímero soluble en agua sustituido con vinilo, con propiedades de viscosidad, masa molecular y contenido de vinilo adecuadas. Un ejemplo de otro polisacárido es xantano. Aunque para los fines de esta invención se conciben de este modo polisacáridos diferentes, a partir de ahora se hará referencia solamente al uso de dextranos sustituidos con acrilamida. Esto es simplemente en aras de la claridad, y en ningún modo se debe considerar como una limitación con respecto al intervalo de posibles polisacáridos utilizables dentro del marco de la invención. El peso molecular del dextrano usado para la fabricación de vendajes para heridas según la invención está preferiblemente por debajo de 5.000.000, más preferiblemente entre 10.000 y 100.000, de tal manera que la viscosidad de la disolución acuosa del dextrano no sea demasiado elevada, por ejemplo entre 0,1 y 1 Pa.s para una disolución al 2% (según se mide usando un viscosímetro LVT de Brookfield que funciona a 30 ciclos).

La sustitución de dextrano con grupos laterales de acrilamida o de metacrilato se llevó a cabo según métodos descritos en la bibliografía. Por ejemplo, tales derivados se pueden obtener haciendo reaccionar el polisacárido con 2-vinil-4,4-dimetil-2-oxalin-5-ona (vinildimetilazolactona). La reticulación de la metacrilamida de gelatina, o la copolimerización de la metacrilamida de gelatina con polisacárido sustituido con vinilo, o la reticulación de los polisacáridos sustituidos con vinilo para atrapar gelatina en una red semi-interpenetrante, se realizan en medio acuoso en presencia de un iniciador de radicales, tal como persulfato de amonio + N,N'-tetrametilendiamina. La reticulación también se puede lograr mediante formación de radicales inducida por la luz. El Ejemplo 1 muestra ejemplos para la preparación de gelatina y de dextranos modificados con vinilo, y para la preparación de películas de hidrogel mediante reticulación por radicales después de la exposición de los derivados de vinilo a la luz UV en presencia de un fotoiniciador. El Ejemplo 2 muestra las propiedades viscoelásticas de películas de hidrogel de gelatina preparadas reticulando mediante radicales gelatina modificada con metacrilamida.

Aunque se prefiere el procedimiento descrito anteriormente, será claro para la persona experta en la técnica que también son posibles otros métodos que conduzcan a la introducción de los grupos laterales de vinilo, por ejemplo mediante tratamiento con anhídrido metacrílico en un disolvente orgánico tal como dimetilsulfóxido. Después, el dextrano modificado se puede purificar y separar convenientemente de los componentes de la reacción de bajo peso molecular mediante los métodos clásicos de purificación. Los ejemplos para lograr esto incluyen, pero no se limitan a, precipitación (por ejemplo, mediante adición de acetona, metanol o isopropanol) o diálisis, ultrafiltración o cromatografía de permeación en gel, seguido de liofilización.

La velocidad y el grado de reticulación dependen de una variedad de parámetros, tales como la concentración, el tipo de gelatina y su grado de sustitución vinílica, el peso molecular y el grado de sustitución vinílica de los polisacáridos, etc.

Según la presente invención, los hidrogeles de gelatina preparados como se describe anteriormente se pueden usar para la fabricación de una variedad de vendajes para heridas.

Según una realización preferida, los hidrogeles de gelatina se fabrican en forma de una lámina o película delgada, adecuada para la aplicación sobre una superficie de la herida. Existen varias tecnologías conocidas para lograr esto. Por ejemplo, se puede mezclar una disolución de la gelatina sustituida con vinilo (mantenida a una temperatura mayor que el punto de gelificación de la gelatina usada, habitualmente > 30ºC) con una disolución del iniciador, y se puede verter en un molde adecuado antes de que tenga lugar cualquier reticulación apreciable. Después de que el proceso de reticulación esté terminado, la película se retira del molde. Otra manera de formar películas es usar uno de los procedimientos utilizados en la industria fotográfica para la preparación de películas y papeles fotográficos. Para el fin de esta invención, el grosor de las películas debe oscilar preferiblemente entre 0,1 y 2 mm, más preferiblemente entre 0,3 y 1 mm, aunque para algunas aplicaciones pueden ser apropiadas películas de tamaños diferentes.

Cuando se coloca sobre una herida una película según el procedimiento descrito anteriormente, durante un tiempo prolongado, es posible que aún tenga lugar la deshidratación debido a que el fluido se puede evaporar de la superficie de la película. Para evitar esto, la película del vendaje para heridas de hidrogel de gelatina se puede cubrir adicionalmente mediante una de las películas oclusivas o semioclusivas de vendajes para heridas, por ejemplo un poliuretano tal como Opsite o Tegaderm. Sin embargo, se proporciona una mejor solución según otra realización preferida de la presente invención cuando se lamina directamente una película de hidrogel de gelatina sobre una membrana oclusiva adecuada, durante el procedimiento de producción. Por ejemplo, las películas plásticas particularmente muy adecuadas son aquellas de la serie Pebax, tal como Pebax 1205, que son producidas por Elf. Este tipo de película tiene una permeabilidad al vapor de agua muy baja, haciéndola muy adecuada para la fabricación de vendajes para heridas destinados al uso sobre heridas relativamente secas. Para la aplicación sobre heridas más exudantes, es deseable una mayor tasa de evaporación, para evitar la acumulación excesiva de fluido bajo el vendaje. En este caso, se puede preferir una membrana de soporte con una mayor permeabilidad al vapor de agua, tal como la fabricada por Utermöhlen en los Países Bajos (Exkin) o por Iatro Medical Systems en el Reino Unido (Omiderm). Será obvio para la persona experta en la técnica que, dependiendo del tipo de herida, del grado de formación de exudado y de la frecuencia deseada de cambio de vendaje, se pueden usar otras películas de soporte con diferentes propiedades de permeabilidad al vapor de agua, para obtener un equilibrio óptimo de fluidos en la superficie de la herida.

Según otra realización, los hidrogeles de gelatina se fabrican en forma de un vendaje para heridas de partículas hidratadas o deshidratadas. Para lograr esto, se conocen varias técnicas. Se puede producir un polvo o granulado de hidrogel de gelatina seco mediante deshidratación de una masa sólida de hidrogel de gelatina después de la reticulación, seguido de la reducción a polvo del material deshidratado. La deshidratación se puede obtener, por ejemplo, secando en una corriente de aire seco, mediante liofilización, mediante extracción con disolventes orgánicos, etc. Después de la etapa de granulación o de reducción a polvo, las partículas de un tamaño deseado se pueden seleccionar, por ejemplo tamizando a través de una serie de tamices con un tamaño adecuado de malla. Para la fabricación de partículas o microperlas de hidrogel de gelatina esféricas o sustancialmente esféricas, se puede generar una pulverización haciendo pasar una disolución recientemente preparada de gelatina sustituida con vinilo (o una mezcla sustituida con vinilo y polisacáridos sustituidos con vinilo, o una mezcla de polisacáridos sustituidos con vinilo y gelatina) a través de una boquilla de atomización apropiada. Se entenderá que los tamaños de las gotas de la pulverización variarán según el tipo de aplicación, y se pueden determinar escogiendo el tipo apropiado de boquilla, la presión y la capacidad para el proceso de atomización. Otra posibilidad es emulsionar las disoluciones recientemente preparadas descritas anteriormente con un disolvente no miscible en agua, tal como un hidrocarburo alifático o aromático, o un aceite. Para crear partículas esféricas de un tamaño más grande, las disoluciones se pueden añadir alternativamente gota a gota al disolvente no miscible en agua. También se pueden usar otras técnicas para producir partículas de gel hidratadas o deshidratadas, conocidas por la persona experta en la técnica, para preparar un vendaje de partículas para heridas según esta invención. Tal vendaje de partículas para heridas puede ser útil para el tratamiento de una variedad de tipos de heridas, pero especialmente para el tratamiento de heridas relativamente profundas y muy exudantes, tales como úlceras crónicas o heridas de decúbito. Cuando se aplican en forma deshidratada, tienen la propiedad de absorber el exudado. Esto es una característica muy deseable, puesto que la eliminación del exceso de exudado y de la masa de tejidos muertos es una meta terapéutica importante con respecto a la prevención de la colonización microbiana, con respecto a la limitación de una necrotización posterior, y con respecto al alivio del malestar del paciente. Tal vendaje de partículas para heridas también se puede usar en su forma hidratada (es decir, omitiendo el proceso de deshidratación después de la preparación de las partículas, o rehidratando las partículas deshidratadas antes de su aplicación sobre la herida). En esta última forma, se puede aplicar, por ejemplo, como una pasta a heridas que produzcan menos exudado. Debe ser obvio que, dependiendo de las necesidades de un tipo de herida particular, también existe la posibilidad de usar el vendaje de partículas para heridas en una forma parcialmente hidratada. En esta última forma, el vendaje aún tendrá propiedades absorbentes de fluidos sustanciales, pero, en virtud de su cierta pegajosidad, sería fácilmente aplicable como una pasta o se fabricaría fácilmente en forma de una película delgada. Adaptando el tipo de gel, se pueden diseñar vendajes para heridas que sean apropiados para el tratamiento de otras heridas, tales como heridas o defectos de la córnea, reconstrucciones de la membrana timpánica, u otras reconstrucciones del oído medio, u otorrea crónica. También debe estar claro que las formas deshidratadas, parcialmente hidratadas y completamente hidratadas de estos vendajes de partículas para heridas se pueden suspender en cualquier excipiente acuoso u orgánico adecuado, para facilitar la aplicación. Los ejemplos de tales excipientes incluyen, pero no se limitan a, aceite de parafina, vaselina, glicerina, etc.

Como alternativa, los componentes incorporados en o unidos a la matriz de afinidad pueden presentar una afinidad por factores moleculares que sea suficientemente elevada de manera que la unión se pueda convertir en un proceso estable. Cuando se aplica sobre una herida, tales matrices de GDP de afinidad tienen el potencial para secuestrar específicamente factores moleculares que son perjudiciales para el proceso de cicatrización de la herida, tales como factores que provocan el crecimiento desregulado o la hipertrofia o una formación superflua de colágeno, y que pueden provocar la formación de queloides.

En la presente invención, también se describe que las matrices de hidrogel de gelatina de esta invención constituyen un material eficaz y versátil para la fabricación de dispositivos de liberación lenta o controlada para el suministro de sustancias farmacológicamente activas. Se pueden incorporar sustancias peptídicas o polipeptídicas, y subsiguientemente se pueden liberar de forma eficaz a partir de las matrices de hidrogel. Esto se demuestra en el Ejemplo 3, que demuestra la liberación eficaz de varios polipéptidos yodados.

Los factores farmacológicamente activos de interés se pueden incorporar en las matrices de hidrogel de la presente invención de varias maneras. El método más preferido es añadir los factores antes del proceso de reticulación. Por lo tanto, una disolución acuosa del agente activo se mezcla con una disolución acuosa de gelatina sustituida con vinilo, a una temperatura de alrededor de 37ºC, seguido de la polimerización de la gelatina sustituida con vinilo, o de la copolimerización con polisacáridos sustituidos con vinilo. Después, se deja que las mezclas resultantes se enfríen. Puesto que las disoluciones de gelatina son viscosas, se debe tener cuidado de que los diferentes componentes se mezclen a conciencia, de forma que se obtenga una disolución homogénea del agente activo en la matriz de hidrogel de gelatina. Otra posibilidad es incorporar los factores activos en las matrices de hidrogel de gelatina de la presente invención después de que el proceso de reticulación esté terminado, por medio de un procedimiento de sorción. Por lo tanto, las matrices de hidrogel de gelatina están parcial o completamente deshidratadas. Esta deshidratación se puede lograr secando las matrices en una corriente de aire, mediante liofilización, mediante extracción con disolventes orgánicos, o mediante cualquier otro medio adecuado que dé como resultado la eliminación del agua de la matriz. Subsiguientemente, las matrices deshidratadas se empapan en una disolución acuosa que contiene el agente activo. Durante este procedimiento de empapamiento, las matrices se rehidratan, absorbiendo al mismo tiempo parte del agente activo.

Una de las posibles aplicaciones de la presente invención descansa en la fabricación de vendajes para heridas que contienen uno o más factores estimulantes de la reparación de heridas y/o un agente antiséptico adecuado. Los agentes estimulantes de la reparación de heridas que son idóneos para la incorporación en tal vendaje para heridas son, por ejemplo, factores de crecimiento tales como los que pertenecen a la clase de las familias de EGF, FGF, PDGF, TGF-\beta, VEGF, PD-ECGF o IGF. Otro agente adecuado sería una sustancia liberada a partir de plaquetas humanas, que se comercializa, por ejemplo, por Curative Technologies Inc. con el nombre Procuren. También sería posible la incorporación de un medio acondicionado, un lisado o un extracto preparado a partir de queratinocitos, tal como se describe en las solicitudes de patentes US9106161 (Oregon Univ.), EP88101576 (Elsinger), WO 93/10217 (IG). Los agentes antisépticos adecuados incluyen antibióticos, sulfamidas o péptidos antibacterianos, quinolonas, antimicóticos, etc., en tanto que sean adecuados para uso tópico. Los vendajes para heridas que contienen agentes que promueven la reparación de heridas se pueden usar para el tratamiento de heridas que son difíciles de cicatrizar. Las lesiones que son aptas para tal tratamiento incluyen, pero no se limitan a, úlcera crónica, heridas de decúbito y úlceras de decúbito, úlceras del pie, lesiones de la córnea, perforaciones de la membrana timpánica, heridas quirúrgicas, sitios donantes de injertos de piel, heridas por quemadura, etc. En el caso de heridas por quemadura, los vendajes para heridas se pueden aplicar directamente sobre una quemadura de segundo o de tercer grado. Sin embargo, en el caso de quemaduras de tercer grado extensas, es preferible primero injertar la quemadura con piel autóloga intercalada. La aplicación de los vendajes para heridas de hidrogel de gelatina medicados de la presente invención, directamente sobre este injerto intercalado autólogo, estimulará el cierre de los intersticios del injerto intercalado, dando como resultado un cierre más rápido de la herida y una reducción concomitante de riesgos de infección y un acortamiento del tiempo de trata-
miento.

Para facilitar la aplicación sobre el sitio de tratamiento, los vendajes para heridas de hidrogel de gelatina medicados de la presente invención se pueden fabricar en diferentes formas. Por ejemplo, los vendajes de tipo lámina o película se pueden aplicar convenientemente sobre heridas de quemaduras, úlceras superficiales, sitios donantes de injerto de piel, y sobre otros tipos de heridas superficiales. Para reducir la evaporación de fluido y la deshidratación del vendaje y de la herida subyacente, el vendaje se puede cubrir con una membrana flexible, cuya permeabilidad al agua se escoge para obtener un nivel óptimo de humedad de la herida. También es posible fabricar laminados de hidrogel de gelatina de múltiples capas. Cada capa de tal laminado puede tener diferentes propiedades de liberación, y puede contener una sustancia activa diferente. Con la aplicación sobre la herida, esto dará como resultado la liberación controlada de los factores incorporados a partir de las capas subsiguientes, según un programa secuencial y temporal predefinido. Este programa dependerá en parte de las propiedades de liberación y de la biodegradación de las diferentes capas, de su grosor y de las propiedades de los factores incorporados. La obtención de tal suministro controlado de múltiples fármacos se considera deseable debido a que se sabe que el proceso de cicatrización ocurre en etapas diferentes, cada una de las cuales requiere la implicación de diferentes factores. Por ejemplo, una etapa de la cicatrización consiste en el desarrollo de tejido de granulación. Esta fase se puede estimular, por ejemplo, mediante la administración de PDGF o FGF. En la siguiente fase, la herida se cierra mediante un proceso de epitelialización, que se puede estimular mediante EGF. La inclusión de factores tales como VEGF o PD-ECGF puede optimizar un proceso tal como la vascularización, que a menudo es insatisfactoria, y que puede ser la causa subyacente en heridas crónicas tales como heridas isquémicas. El factor que se ha de liberar en un punto de tiempo para obtener los resultados óptimos de cicatrización depende parcialmente del tipo de herida. También se sabe que, algunas veces, el proceso de cicatrización puede ser aberrante, conduciendo a la formación de cicatrices o queloides persistentemente grandes. Tal formación de queloides está predispuesta por dos factores principales. El primero es la localización de la cicatriz, y el segundo es el antecedente genético del paciente. Por lo tanto, se anticipa que la formación de queloides resulta de la presencia atópica o superflua de ciertos factores, y que la presencia de ciertas capas en el vendaje para heridas se puede usar para secuestrar estos factores indeseados. Otros factores que se pueden secuestrar comprenden aquellos que pueden conducir a la formación superflua de colágeno y/o elastina, evitando de ese modo fenómenos tales como contracciones de la piel o formación de queloides. Una de las ventajas de la presente invención es que es posible el suministro programado de varios fármacos usando un solo vendaje, es decir, sin tener que cambiar los vendajes para heridas.

En caso de cavidades de heridas más profundas, tales como algunos tipos de úlceras de decúbito o de úlceras crónicas, puede ser más conveniente fabricar los vendajes para heridas de hidrogel de gelatina medicados de la presente invención en forma de micropartículas, espumas, pastas u otras formas que sean fácilmente conformables a la forma de la herida. Las micropartículas se pueden fabricar según cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica, con tal de que la actividad de las sustancias activas incorporadas no sea destruida. Para aumentar el período de duración de las partículas medicadas, también es posible liofilizarlas. El polvo o el granulado resultantes se pueden aplicar sobre la herida directamente, en cuyo caso tendrá el beneficio añadido de absorber el exceso de fluido de la herida, o se puede rehidratar primero mediante incubación en una disolución acuosa adecuada. Las partículas medicadas también se pueden formular en un excipiente adecuado, tal como vaselina, aceite de parafina, etc., para obtener una pasta que se puede usar, por ejemplo, para rellenar una cavidad.

En una de las realizaciones de la presente invención, la sustancia farmacológicamente activa se incorpora en matrices de hidrogel de gelatina de afinidad, tales como las descritas anteriormente. En este caso, la matriz contiene también compuestos adicionales reticulados, no difusibles o inmovilizados de otro modo, que tienen una afinidad por la sustancia activa. Esto da como resultado una reducción de la velocidad de liberación del agente activo y, en algunos casos, también pueden estabilizar al agente.

A continuación se dan unos pocos ejemplos de tales ligandos de afinidad que se pueden incorporar en matrices de hidrogel de gelatina de la presente invención.

Una clase está constituida por aquellas moléculas que presentan una afinidad por heparina que se une a proteínas, tal como heparina o análogos funcionales de la heparina, tales como sulfato de heparano, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de dextrano, o cualquier otro grupo polianiónico no tóxico que presente suficiente afinidad por un factor incorporado que se une a heparina. Los ejemplos de tales factores incluyen FGF, HB-EGF, anfirregulina y betacelulina.

Otro ejemplo de ligandos de afinidad puede consistir en cadenas hidrófobas, que podrían retardar la liberación de los agentes activos incorporados con naturaleza hidrófoba. La incorporación de tales cadenas en hidrogeles de gelatina de la presente invención se podría lograr, por ejemplo, mediante el uso de polisacáridos sustituidos con vinilos parcialmente hidrófobos. Éstos se pueden obtener, por ejemplo, mediante esterificación parcial de dextrano con ácidos grasos (por ejemplo, ácido caproico, ácido esteárico), seguido de la reacción de los ésteres de dextrano así obtenidos con anhídrido de ácido metacrílico.

Será claro para la persona experta en la técnica que la fabricación de vendajes para heridas medicados, con propiedades de liberación controlada, es sólo una de las aplicaciones de la presente invención. Se pueden prever muchas otras aplicaciones posibles del uso de los hidrogeles de gelatina de la presente invención como una matriz de liberación controlada. Las siguientes posibilidades están destinadas sólo como ejemplos y en ningún modo limitan el intervalo de posibles aplicaciones.

Por ejemplo, los hidrogeles de gelatina de la presente invención se pueden usar para la fabricación de dispositivos para el suministro transdérmico de fármacos. Se puede unir a la piel un parche de hidrogel de gelatina que contenga un fármaco suministrable de forma transdérmica, permitiendo una liberación lenta del fármaco a lo largo de un período de tiempo prolongado. Una película oclusiva unida a tal dispositivo puede evitar que el biopolímero se seque. En otra aplicación, se pueden inyectar intravenosamente, subcutáneamente o intramuscularmente micropartículas de hidrogel de gelatina cargadas con un fármaco particular. Equipadas con un sistema de marcado, tales micropartículas inyectadas se pueden usar para la administración tópica de compuestos con los que se cargaron las micropartículas. En principio, todos los fármacos para los cuales es deseable una liberación lenta durante un período que oscila entre unos pocos días hasta unas pocas semanas son aptos para la incorporación en micropartículas de hidrogeles de gelatina de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, fármacos contra el cáncer, hormonas, vacunas, anticonceptivos, fármacos cardiovasculares, fármacos neuroactivos, etc.

Leyendas de las figuras

Figura 1 Propiedades viscoelásticas de películas de hidrogel de gelatina, de gelatina modificada con vinilo y de gelatina modificada con vinilo reticulada.

Las películas de hidrogel de gelatina se prepararon y se expusieron a luz LWUV (365 nm, 10 mW/cm^{2}), como se describe en el ejemplo 2 A. Después de una semana de almacenamiento de las películas de hidrogel a 4ºC, se determinó la dependencia del módulo de almacenamiento (elástico) con la temperatura mediante deformación por cizallamiento oscilante y mediante barrido de temperatura que oscila desde 16 hasta 50ºC (velocidad de calentamiento 1,75ºC min^{-1}), a frecuencia constante (1 Hz) y a deformación de cizallamiento constante (\gamma = 0,05, 1,88 mrad). Gelmod: gelatina modificada con metacrilamida; gelmod * DMPA: gelatina modificada con metacrilamida + sistema fotoiniciador.

Figura 2 Propiedades viscoelásticas de películas de hidrogel de gelatina modificada con vinilo reticulada, al aumentar el tiempo de almacenamiento del hidrogel.

Se determinó la dependencia del módulo de almacenamiento (elástico) con la temperatura mediante deformación por cizallamiento oscilante y barrido de temperatura que oscila desde 16 hasta 50ºC (velocidad de calentamiento 1,75ºC min^{-1}), a frecuencia constante (1 Hz) y a deformación por cizallamiento constante (\gamma = 0,05, 1,88 mrad).

Figura 3 Sistema Transwell-COL para los estudios de liberación.

Para permitir la liberación de polipéptidos por un solo lado de las películas de hidrogel, se aplicaron muestras de película de hidrogel sobre una membrana microporosa de un inserto de cultivo celular, tratada con colágeno, y el volumen del medio de extracción se ajustó para que entre en contacto con la cara inferior de la membrana microporosa.

Figura 4 Liberación de ^{125}I-BSA (A) y ^{125}I-EGF (B) a partir de películas de hidrogel fabricadas de gelatina modificada con metacrilamida con un grado de sustitución de 60% (el 60% de los grupos \varepsilon-amino de la gelatina se modificaron con grupos laterales vinílicos), y preparadas como se describe en el Ejemplo 1. Las mismas unidades se aplican para el recuadro.

Figura 5 Liberación de ^{125}I-BSA (A) y ^{125}I-EGF (B) a partir de películas de hidrogel fabricadas de gelatina modificada con metacrilamida, con un grado de sustitución de 60% (60% de los grupos \varepsilon-amino de la gelatina se modificaron con grupos laterales vinílicos), y dextrano modificado con acrilamida, con un grado de sustitución de 10% (10 grupos laterales vinílicos por 100 unidades glucosídicas), y preparadas como se describe en el Ejemplo 1. Las mismas unidades se aplican para el recuadro.

Figura 6 Liberación de ^{125}I-BSA (A) y ^{125}I-EGF (B) a partir de películas de hidrogel fabricadas de gelatina modificada con metacrilamida, con un grado de sustitución de 60% (60% de los grupos \varepsilon-amino de la gelatina se modificaron con grupos laterales vinílicos), y dextrano modificado con metacrilato, con un grado de sustitución de 10% (10 grupos laterales vinílicos por 100 unidades glucosídicas), y preparadas como se describe en el Ejemplo 1. Las mismas unidades se aplican para el recuadro.

Figura 7 Preparación de los derivados modificados con vinilo.

La gelatina modificada con metacrilamida se puede preparar haciendo reaccionar gelatina (Gel-NH_{2}) con anhídrido metacrílico (A). El dextrano modificado con vinilo se puede preparar haciendo reaccionar dextrano (Dex-OH) con 2-vinil-4,4-dimetil-2-oxalin-5-ona (vinilazlactona) (B), o con anhídrido metacrílico (C).

Figura 8 Dependencia con la temperatura del módulo de almacenamiento G' de hidrogeles de metacrilamida de gelatina, DS = 35%, 46% y 60% con concentración de polímero de 15% en peso en agua; concentración de iniciador 0,006% en peso (Irgacure 2959); exposición a UV 30 min. (365 nm, 10 mW/cm^{2}); temperatura de almacenamiento 4ºC; tiempo de almacenamiento después de la irradiación con UV 2 días; deformación por cizallamiento oscilante \gamma = 0,05; frecuencia f = 1 Hz.

Figura 9 Dependencia con la temperatura del módulo de almacenamiento G' de hidrogeles de metacrilamida de gelatina, DS = 60% con concentración de polímero de 15% en peso en agua; concentración de iniciador 0,0004% en peso - 0,05% en peso (Irgacure 2959); exposición a UV 60 min. (365 nm, 10 mW/cm^{2}); temperatura de almacenamiento 4ºC; tiempo de almacenamiento después de la irradiación con UV 2 días; deformación por cizallamiento oscilante \gamma = 0,05; frecuencia f = 1 Hz.

Figura 10 Dependencia con la temperatura del módulo de almacenamiento G' de hidrogeles de metacrilamida de gelatina, DS = 60%, con concentración de polímero de 15% en peso en agua; dosis de irradiación \gamma 0, 3, 6, 15 y 25 kGy; temperatura de almacenamiento 4ºC; tiempo de almacenamiento antes de la irradiación \gamma 11 días; tiempo de almacenamiento después de la irradiación \gamma 7 días; deformación por cizallamiento oscilante \gamma = 0,05; frecuencia f = 1 Hz.

Figura 11 Dependencia con la temperatura del módulo de almacenamiento G' de hidrogeles de metacrilamida de gelatina, DS = 16%, 25 y 30% con concentración de polímero de 15% en peso en agua; dosis de irradiación \gamma 6 kGy; temperatura de almacenamiento 4ºC; tiempo de almacenamiento antes de la irradiación \gamma 11 días; tiempo de almacenamiento después de la irradiación \gamma 4 días; deformación por cizallamiento oscilante \gamma = 0,05; frecuencia f = 1 Hz.

Ejemplos

Ejemplo 1

Producción del películas de hidrogel de gelatina Preparación de metacrilamida de gelatina

La metacrilamida de gelatina se puede preparar haciendo reaccionar gelatina con anhídrido metacrílico (Figura 7A). Se disolvieron diez g de gelatina, que corresponden a alrededor de 3,28 nmoles de grupos \varepsilon-amino restos de lisina y de hidroxilisina, en 100 ml de tampón PBS (pH 7,4), y se agitaron a 50ºC. Después de la solubilización completa de la gelatina, se añadieron 0,5 ml de anhídrido metacrílico (3,35 mmoles). La mezcla de gelatina y anhídrido metacrílico se agitó durante 1 hora a 40-50ºC. Después, la mezcla se dializó frente a agua durante unos pocos días a 40ºC, y se liofilizó. La evaluación del contenido de grupos \varepsilon-amino libres de los restos de lisina y de hidroxilisina presentes en la gelatina, mediante el método con ácido trinitrobencenosulfónico, indica que un gramo de la gelatina modificada con metacrilamida obtenida aún contiene 0,284 nmoles de grupos \varepsilon-amino libres. Esta evaluación permite calcular que el 55% de los grupos \varepsilon-amino de la gelatina modificada están todavía libres, y que el 45% de los grupos amino de la gelatina se modificaron.

Preparación de dextrano modificado con acrilamida

El dextrano modificado con vinilo se puede preparar haciendo reaccionar dextrano con 2-vinil-4,4-dimetil-2-oxalin-5-ona (vinilazlactona) como se observa en la Figura 7B. Se disuelve un gramo de dextrano (MW ,40000) que corresponde a 6,2 meq de unidades glucosídicas, en 20 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Después, se añaden 0,26 g (1,86 mmoles) de vinilazlactona y 36,4 mg (0,3 mmoles) de 4-N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) al dextrano disuelto en DMSO, y se agitó a 50ºC durante 24 h. El polímero se aísla mediante precipitación en exceso de acetona. Después de secar y de redisolver en agua, se dializó frente a agua durante dos días a temperatura ambiente, y se liofilizó. Las medidas de RMN indican que se logró un 30% de sustitución vinílica del dextrano (30 grupos laterales vinílicos por 100 unidades glucosídicas).

Preparación de metacrilato de dextrano

El dextrano modificado con vinilo también se puede preparar haciendo reaccionar dextrano con anhídrido metacrílico (Figura 7C). Se disolvió un gramo de dextrano (MW 40000) (6,2 meq unidades glucosídicas) en 20 ml de DMSO. A la disolución de dextrano se añadieron 0,092 ml de anhídrido metacrílico (0,62 mmoles) y 36,4 mg (0,3 mmoles) de DMAP. Después de agitar a 50ºC durante 1 h, el polímero se precipitó en un gran volumen de mezcla de metanol:acetona (1:1). El producto seco se redisolvió entonces en agua, y se dializó durante dos días a temperatura ambiente y se liofilizó. El grado de sustitución se midió mediante experimento de RMN. Se logró un 10% de sustitución vinílica del dextrano (10 grupos laterales vinílicos por 100 unidades glucosídicas).

Preparación de una película de hidrogel de gelatina

La reticulación de la gelatina modificada con metacrilamida, o la copolimerización de metacrilamida de gelatina con dextrano sustituido con vinilo, o la reticulación de dextrano sustituido con vinilo en presencia de gelatina, estando la gelatina físicamente atrapada en una red semi-interpenetrante, se realizan en un medio acuoso en presencia de iniciadores de radicales. Los iniciadores pueden ser un sistema iniciador redox tal como persulfato de amonio + N,N,N',N'-tetrametilendiamina (1 \mumol/gramo de gel), o un fotoiniciador tal como 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (DMPA) + tratamiento con luz. Por ejemplo, para preparar películas de hidrogel mediante reticulación con radicales, las disoluciones de derivados modificados con vinilo (a 40ºC), que contienen DMPA como fotoiniciador, se pueden verter en un molde fabricado de dos placas de vidrio separadas por espaciadores de 1 mm de grosor, y se pueden irradiar (10 mW/cm^{2}) a 365 nm durante 10 minutos con una lámpara de LWUV, modelo VL-400L (Vilber Lourmat, Marne La Vallée, Francia). Después de la eliminación de las placas de vidrio, se obtiene una película flexible de 1 mm de grosor que es insoluble en agua.

Ejemplo 2

Propiedades viscoelásticas de gelatina modificada con metacrilamida reticulada A) Caracterización de las propiedades mecánicas (módulo elástico) de películas de hidrogel de metacrilamida de gelatina

Se usaron medidas de oscilación por cizallamiento dinámico, a pequeña deformación, para caracterizar las propiedades viscoelásticas de las películas de hidrogel de gelatina modificada con metacrilamida reticulada. La gelatina modificada con metacrilamida, con un grado de sustitución de 45% (45% de los grupos \varepsilon-amino de la gelatina se modificaron con grupos laterales vinílicos), se preparó como se describe en el Ejemplo 1. La reticulación de la gelatina modificada con metacrilamida se realizó en medio acuoso en presencia de 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (DMPA) usada como fotoiniciador. Se disolvió metacrilamida de gelatina (1 g) en 10 ml (10% en peso) de una disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,4), calentada a 40ºC. A la disolución de gelatina modificada con metacrilamida se añadió DMPA (6 mg), y se agitó a 40ºC durante 1 minuto. La mezcla caliente se vertió entonces en un molde hecho de dos placas de vidrio separadas mediante espaciadores de 1 mm de grosor, y se expuso durante 10 minutos a la luz (365 nm, 10 mW/cm^{2}) de una lámpara de LWUV, modelo VL-400L. Con fines comparativos, y para permitir la distinción entre la contribución respectiva de la reticulación física y química al módulo elástico del hidrogel, se prepararon películas de hidrogel de gelatina no reticulada y películas de hidrogel de gelatina modificada con metacrilamida, en ausencia de fotoiniciador (DMPA). Para la preparación del hidrogel de gelatina, se disolvió 1 g de gelatina en 10 ml (10% en peso) de una disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,4), calentada a 40ºC, y para los hidrogeles de gelatina modificada con metacrilamida se disolvió 1 g de gelatina modificada con metacrilamida en 10 ml (10% en peso) de una disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) calentada a 40ºC; ambas disoluciones se vertieron de forma separada en moldes hechos de dos placas de vidrio separadas por espaciadores de 1 mm de grosor. Las películas de hidrogel se mantuvieron a temperatura ambiente durante 1 hora, y después se almacenaron a 4ºC durante 1 semana. Las medidas reológicas en la deformación por cizallamiento oscilante se llevaron a cabo con un reómetro CLS^{2} (TA Instruments) usando placas rugosas paralelas, de 40 mm de diámetro y con una distancia de placa a placa de 800 \mum. La dependencia del módulo de almacenamiento (elástico) con la temperatura se determinó mediante deformación por cizallamiento oscilante y barrido de temperatura que oscila desde 16 hasta 50ºC (velocidad de calentamiento 1,75ºC min^{-1}), a frecuencia constante (1 Hz) y a deformación por cizallamiento constante (\gamma = 0,05, 1,88 mrad). En la Figura 1 se muestra la dependencia del módulo de almacenamiento G' (elástico) de las películas de hidrogel con la temperatura. Las películas de hidrogel de gelatina se formaron mediante gelación física solamente, y mostraron valores elevados de G' por debajo del punto de fusión de la gelatina. Cuando se aumentó la temperatura por encima del punto de fusión de la gelatina (temperatura de transición sol-gel: 28ºC-30ºC), el módulo elástico cayó rápidamente hasta valores muy bajos, debido a la ruptura de la red física de la gelatina. Los hidrogeles de gelatina modificada con metacrilamida, preparados sin adición de un fotoiniciador, mostraron sólo valores bajos de G', incluso por debajo de la temperatura de transición sol-gel, lo que indica que se puede formar una mala red física cuando la gelatina se modifica con grupos laterales de metacrilamida. Por encima de la temperatura de transición sol-gel, el módulo elástico disminuyó rápidamente hasta valores muy bajos, indicando que, en ausencia de fotoiniciador, no se formó ninguna reticulación química. Por contra, el tratamiento con luz de disoluciones de gelatina modificada con metacrilamida que contienen DMPA dio como resultado la producción de una película de hidrogel con valores elevados del módulo de almacenamiento (G'), tanto por debajo como por encima del punto de fusión de la gelatina, indicando que la presencia de un sistema fotoiniciador junto con el tratamiento con luz indujo una reticulación química del hidrogel. Se concluyó que las propiedades mecánicas (por ejemplo, el módulo elástico) de las películas de gelatina modificada con metacrilamida reticulada resultaron tanto de la reticulación química como de la formación de una estructura física de la gelatina modificada con metacrilamida. También se concluyó que se pueden producir películas de hidrogel de gelatina modificada con metacrilamida reticulada, con propiedades mecánicas apropiadas, para la fabricación de vendajes para heridas.

B) Caracterización de las propiedades mecánicas (módulo elástico) de películas de hidrogel de metacrilamida de gelatina al aumentar el tiempo de almacenamiento del hidrogel

El módulo de almacenamiento de las películas de hidrogel de gelatina modificada con metacrilamida reticulada se evaluó usando medidas de ensayo de oscilación a pequeñas deformaciones. La gelatina modificada con metacrilamida, con un grado de sustitución de 60% (el 60% de los grupos \varepsilon-amino de la gelatina se modificaron con grupos laterales de vinilo), se preparó como se describe en el Ejemplo 1. La reticulación de la gelatina modificada con metacrilamida se realizó en medio acuoso en presencia de DMPA, usado como fotoiniciador. La gelatina modificada con metacrilamida (1,5 g) se disolvió en 10 ml (15% en peso) de una disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,4), calentada a 40ºC. A la gelatina modificada con metacrilamida se añadió DMPA (6 mg), y se agitó a 40ºC durante 1 minuto. La mezcla caliente se vertió entonces en un molde hecho de 2 placas de vidrio separadas por espaciadores de 1 mm de grosor, y se expuso durante 10 minutos a la luz (365 nm, 10 mW/cm^{2}) de una lámpara de LWUV. Las películas de hidrogel reticuladas se mantuvieron a temperatura ambiente durante una hora, y después se almacenaron a 4ºC durante diversos períodos de tiempo. Las medidas reológicas a una deformación mediante cizallamiento oscilante se llevaron a cabo con un reómetro CSL^{2} (TA Instruments) usando placas rugosas paralelas de 40 mm de diámetro y de distancia de placa a placa de 800 \mum. La dependencia del módulo de almacenamiento (elástico) con la temperatura se determinó mediante deformación por cizallamiento oscilante y barrido de temperatura que oscila desde 16 hasta 50ºC (velocidad de calentamiento 1,75ºC min^{-1}), a frecuencia constante (1 Hz) y a deformación por cizallamiento constante (\gamma = 0,05, 1,88 mrad). En la Figura 2 se muestra la dependencia del módulo de almacenamiento (elástico) G' de una película de hidrogel, que consiste en gelatina modificada con metacrilamida reticulada, almacenada durante diferentes períodos de tiempo, con la temperatura. Las propiedades mecánicas del hidrogel (por ejemplo, el módulo elástico) resulta de la gelación física del componente de la gelatina, y de la reticulación química de la gelatina modificada con vinilo. El barrido de temperatura de las muestras de hidrogel por encima y por debajo del punto de fusión de la gelatina permite identificar la contribución respectiva de la reticulación química y física al módulo elástico del hidrogel. El tratamiento con luz de las mezclas de gelatina modificada con metacrilamida y DMPA dio como resultado la producción de películas de hidrogel con valores del módulo de almacenamiento (G') elevados, por encima y por debajo del punto de fusión de la gelatina, indicando la formación de enlaces químicos en las películas de hidrogel de gelatina. Al aumentar el tiempo de almacenamiento de la película de hidrogel, los valores de G' aumentaron en el intervalo de temperatura por debajo de 25ºC, pero permanecieron constantes en el intervalo de temperatura por encima de 25ºC, indicando que el aumento en el módulo de almacenamiento del hidrogel, al aumentar el tiempo de almacenamiento, resultó sólo de un aumento de la contribución de la formación de estructura física de la cadena de gelatina. Después de una o dos semanas de almacenamiento del hidrogel, los valores de G' se estabilizaron, indicando que, después del período de maduración del hidrogel, se pueden obtener películas de hidrogel de gelatina modificada con metacrilamida reticulada, con propiedades mecánicas estables (módulo elástico).

Ejemplo 3

Liberación controlada de polipéptidos marcados con ^{125}I (EGF y BSA) a partir de películas de hidrogel de gelatina reticulada Preparación de las películas

Las películas de hidrogel de gelatina reticulada, que contienen los factores yodados, se prepararon usando procedimientos similares a como se describe anteriormente, añadiéndose los polipéptidos a la gelatina, o a la gelatina modificada, antes de la reticulación de los hidrogeles. Los hidrogeles de gelatina contenían 0,02% de timerosal como conservante. La concentración de las proteínas de ensayo yodadas, en la matriz de hidrogel de gelatina, fue aproximadamente 5 \mug/ml.

Ensayo de liberación usando un sistema que imita a una herida

Para la evaluación de la cinética de liberación de los vendajes de liberación controlada para heridas, no es ideal un sistema de ensayo de elución en el que la muestra del vendaje se sumerge en el fluido de extracción en agitación continua. Puesto que este tipo de elución se lleva a cabo por medio de un procedimiento de extracción activo, la liberación en tal sistema es mucho más rápida que la que se observaría en una herida. Shinde y Erhan (Bio-Med. Mat. Eng. 2: p. 127-131, 1992) han dado a conocer tal tipo de sistema para determinar las propiedades de liberación de películas de gelatina flexibilizadas cargadas con insulina. Aquí se ha adoptado un sistema de ensayo alternativo que imita la situación de una herida. Para cuantificar la liberación de los polipéptidos a partir de películas de hidrogeles de gelatina, se adoptó el sistema de liberación mostrado en la Figura 3. Se colocaron muestras (1,3 cm^{2}) de las películas de hidrogel de gelatina sobre una membrana microporosa tratada con colágeno (3 \mum de diámetro de poro) de un inserto de cámara de cultivo celular Transwell-COL de Costar, que se coloca a su vez en un pocillo de una placa de 6 pocillos. El volumen del medio de disolución (1 ml de PBS que contiene 0,1% de caseína y 0,02% de timerosal) se ajustó para que entre en contacto con la cara inferior de la membrana microporosa. Por lo tanto, los compuestos incorporados en el hidrogel se liberaron sólo por una cara de las muestras de hidrogel de gelatina. Este tipo de sistema de liberación se usó a fin de imitar las condiciones que predominan en una herida abierta, y para proporcionar una determinación más realista de la cinética de liberación que un sistema de inmersión simple en el que el material incorporado se habría solubilizado más rápidamente. Para simular las condiciones de la herida de forma más realista, el ensayo de liberación se llevó a cabo en una incubadora termostatizada a 37ºC. A puntos particulares de tiempo, se retiró 1 ml de fluido de extracción y se sustituyó por 1 ml de fluido reciente. Para cuantificar la cantidad de proteína marcada liberada, la radioactividad presente en las muestras de líquido de extracción retiradas se midió en un contador gamma. Para evaluar adicionalmente la estabilidad con el almacenamiento de las películas de hidrogel de gelatina cargadas con proteína, se determinaron perfiles de liberación en las películas que se habían almacenado a 4ºC durante un día y dos meses. Las muestras del líquido de extracción se almacenaron a -70ºC. Al final del experimento de liberación, todas las muestras del líquido de extracción se descongelaron y se precipitaron primero con TCA antes de las medidas de la radioactividad, para asegurarse de que sólo se cuantificaba la radioactividad asociada con las proteínas. Al final del experimento, también se determinó la radioactividad residual en los discos de hidrogel de gelatina, y en el filtro de Transwell-COL. En las Figs. 4, 5 y 6 se muestra la cinética de liberación de ^{125}I-BSA (MW: 68 kDa) y de ^{125}I-EGF
(MW: 6 kDa) a partir de películas de hidrogel de diversa composición. Después de un día o de dos meses de almacenamiento de los hidrogeles, todos los hidrogeles evaluados mostraron una liberación sostenida de polipéptidos hasta una incubación de 9 días. Después de este período de incubación, el 80-90% de ambos polipéptidos se liberaron en el medio de extracción. La cinética de liberación se caracterizó mediante una liberación explosiva que fue seguida de una liberación en forma de meseta. Aunque el ^{125}I-EGF se liberó más rápidamente que ^{125}I-BSA, los resultados confirman que también para proteínas más grandes la liberación ocurre con una eficacia elevada y según cinéticas que son favorables para la aplicación en vendajes medicados para heridas. También, la estabilidad de la matriz demuestra ser suficiente para permitir el almacenamiento prolongado, puesto que el almacenamiento del hidrogel no tiene ningún efecto sobre la cinética de liberación, o tiene un efecto minoritario. Se encontró que los nuevos hidrogeles, fabricados de derivados vinílicos de gelatina y dextrano, son un sistema de liberación apropiado para el suministro sostenido a medio plazo de polipéptidos.

Ejemplo 4

Influencia del grado de sustitución sobre geles de metacrilamida de gelatina Materiales y métodos

Se preparó gelatina tipo B (G-9382, lote 26H0347), de Sigma, mediante tratamiento alcalino de piel de bóvido. La resistencia del gel es 225 Bloom.

El anhídrido metacrílico (MAA) se obtuvo de Aldrich, y se usó según se recibió.

La 1-(4-(2-hidroxietoxi)-fenil)-2-hidroxi-2-metil-1-propan-1-ona (Irgacure® 2959) se obtuvo de Ciba.

El ácido trinitrobencenosulfónico se obtuvo de Serva, y la acetil-lisina de Bachem.

Las membranas de diálisis Spectra/Por®1 (MW 6000-8000) se obtuvieron de Polylab (Antwerpen, Bélgica).

Preparación de metacrilamida de gelatina

Se disolvieron 100 g de gelatina (32,8 mmoles de grupos \varepsilon-amino de lisina e hidroxilisina) en 1 litro de disolución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4), y se agitó a 50ºC. Después de la solubilización total de la gelatina, se añadieron 10 ml de anhídrido metacrílico (67,1 mmoles). La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a 40-50ºC. Después, la mezcla se diluyó con 1 litro de agua, y se dializó frente a agua durante 1 día a 40ºC, y se liofili-
zó.

Se puede preparar metacrilamida de gelatina, con menores grados de sustitución, reduciendo la cantidad de anhídrido metacrílico.

La determinación de los grupos amino libres en la gelatina modificada se midió mediante el método con ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) (Habeeb, Anal. Biochem., 14, 328-336, 1966). Se mezcló un ml de las disoluciones de proteína (gelatina o metacrilamida de gelatina en agua) con 1 ml de tampón de NaHCO_{3} (pH 8,5) (0,05 M) y 1 ml de disolución de TNBS (0,1%). Las mezclas se protegieron de la luz y se mantuvieron a 37ºC durante 2 horas. Después, se añadieron 0,5 ml de HCl caliente (1 N), y se midió la absorbancia a 345 nm. Todas las muestras se prepararon por triplicado.

Este método de UV se realizó con una curva de calibración de acetil-lisina. La evaluación del porcentaje de los grupos \varepsilon-amino libres que quedan después de la modificación de la gelatina permite calcular el grado de sustitución (DS) de la metacrilamida de gelatina.

La reacción de la gelatina con un exceso de anhídrido metacrílico conduce a metacrilamidas de gelatina con un grado de sustitución de hasta 70%, mientras que la reacción con un equivalente de anhídrido sólo conduce a la modificación de 46% (46 grupos laterales vinílicos por 100 grupos \varepsilon-amino en la gelatina inicial).

Preparación de películas de hidrogel

Para irradiar las muestras, se usó una lámpara de LWUV modelo VL-400L (Vilber Lourmat, Marne La Vallée) con un chorro de 365 nm.

Las medidas reológicas en la deformación por cizallamiento oscilante, sobre los hidrogeles, se llevan a cabo con un reómetro CSL^{2} (TA Instruments) usando placas rugosas paralelas de 40 mm de diámetro y con una distancia de placa a placa de 800 \mum. La dependencia del módulo de almacenamiento (elástico) con la temperatura se determinó mediante deformación por cizallamiento oscilante y barrido de temperatura en el intervalo de 16 hasta 50ºC (velocidad de calentamiento 1,75ºC min^{-1}), a frecuencia constante (1 Hz) y a deformación por cizallamiento constante (\gamma = 0,05, 1,88 mrad).

La reticulación de la gelatina modificada con metacrilamida se realizó en medio acuoso, en presencia de un fotoiniciador (Irgacure® 2959). Se disolvieron 1,5 g de metacrilamida de gelatina en 10 ml (15% en peso) de disolución iniciadora (0,006% en peso), a 40ºC. La mezcla caliente se vertió entonces en un molde hecho de dos placas de vidrio separadas por espaciadores de 1 mm de grosor. La disolución de hidrogel que contiene el iniciador de UV se expuso entonces a luz LWUV (365 nm, 10 mW/cm^{2}) durante 30 minutos a 30ºC. Después de las placas de vidrio, se obtuvo una película transparente flexible de 1 mm de grosor, que es insoluble en agua.

Influencia del grado de sustitución sobre geles de metacrilamida de gelatina

Los hidrogeles de gelatina modificada con metacrilamida (gelmod) se prepara como se describe anteriormente. Las películas de hidrogel que contienen gelatina con un número diferente de grupos laterales de vinilo se evalúan mediante
medidas reológicas en la deformación por cizallamiento oscilante. El grado de sustitución (DS) se define como el por-
centaje de grupos \varepsilon-amino que se modifican a un grupo vinilo, y se determina mediante el método de Habeeb (TNBS). El DS tiene un impacto apreciable sobre el módulo de almacenamiento G' por encima de 30ºC, y la reticulación química está de este modo muy influenciada por el número de grupos laterales vinílicos reactivos. Los geles de gelatina modificada, con DS de 35% o menos, muestran una caída grande del módulo de almacenamiento. La constitución de
reticulaciones químicas en los geles poco sustituidos (< 35%) es insignificante. Para obtener hidrogeles fuertes quími-
camente reticulados, son apropiadas metacrilamidas de gelatina con un DS de alrededor de 46% (véase la Figura

\hbox{8).}

Ejemplo 5

Influencia de las concentraciones de iniciador (IRGACURE® 2959)

Los hidrogeles de gelatina de metacrilamida (gelmod) se prepararon como se describe en el Ejemplo 4. La dependencia del módulo de almacenamiento con la temperatura está fuertemente influida por las concentraciones de iniciador en el gel. Se observa una amplia caída de G' cuando se usa una disolución de iniciador menor que 0,002% en peso (0,21 mg de Irgacure® 2959 por 10 ml de disolución de polímero). Los hidrogeles con una disolución de iniciador del 0,003% en peso o más muestran un módulo de almacenamiento más elevado a temperatura elevada, y por lo tanto están químicamente reticulados de forma más densa. Las propiedades mecánicas de los hidrogeles de metacrilamida de gelatina aumentan con una mayor concentración de iniciador. Aunque cuando se aplican concentraciones mayores que 0,025% en peso, los hidrogeles se hacen duros y frágiles (véase la Figura 9).

Ejemplo 6

Efecto de la dosis de irradiación sobre geles de metacrilamida de gelatina

Se evaluó el efecto de las diferentes dosis de irradiación sobre las propiedades viscoelásticas de los hidrogeles de metacrilamida de gelatina. Para preparar las películas ensayadas, se usó metacrilamida de gelatina con un grado elevado de sustitución (DS 60%). Los hidrogeles de gelatina modificada con metacrilamida (gelmod) se prepararon como se describe en el Ejemplo 4. Las películas de hidrogel se irradiaron en su molde (entre placas de vidrio), a temperatura ambiente. Se produce una fuerte reticulación química durante la irradiación, y se obtienen hidrogeles duros pero frágiles. Incluso con dosis bajas de 3 kGy, se mide un módulo de almacenamiento G' muy alto (Figura 10). Para aplicaciones de vendajes para heridas, son necesarios hidrogeles más elásticos, y se recomienda la irradiación de metacrilamida de gelatina con un menor grado de sustitución.

Ejemplo 7

Efecto de la dosis de 6 kGy sobre geles de metacrilamida de gelatina con diferente grado de sustitución

Se irradiaron hidrogeles de gelatina con un grado bajo de sustitución, a fin de obtener materiales menos frágiles como se describe anteriormente. Los hidrogeles de gelatina modificada con metacrilamida (gelmod) se preparan adicionalmente como se describe en el Ejemplo 4.

Se observa una amplia caída de G' (Figura 11) cuando se irradia (6 kGy) metacrilamida de gelatina con un grado de sustitución de 16%, debido a la fusión del polímero no reticulado químicamente. La gelación física de la gelatina funde por encima de 30ºC. Se obtiene un hidrogel químicamente reticulado más denso con grados de sustitución por encima de 25%, y se forman hidrogeles fuertes pero elásticos, incluso a temperaturas por encima del punto de fusión de la gelatina.

Claims

1. Un medicamento que contiene una matriz biopolímera que comprende gelatina modificada con metacrilamida reticulada, o gelatina modificada con metacrilamida copolimerizada con polisacáridos sustituidos con vinilo.

2. Un medicamento según la reivindicación 1, en el que están asociados otros compuestos a dicha matriz, perteneciendo dichos otros compuestos a una o más de las siguientes clases:

-: un oligo- o polisacárido polisulfatado, tal como heparina, sulfato de heparano, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de dextrano, o fragmentos de los mismos;

-: un polianión biocompatible que tiene la capacidad de unirse a factores de crecimiento que se unen a heparina;

-: un proteoglicano que contiene cadenas de glicosaminoglicanos capaces de unirse a factores de crecimiento que se unen a heparina;

-: un análogo funcional de la heparina, que se puede unir o estabilizar a factores de crecimiento que se unen a heparina;

-: un anticuerpo monoclonal o policlonal o una microproteína obtenida mediante presentación de fagos, que tiene una afinidad elevada y selectiva por factores moleculares que pueden modular el proceso de cicatrización de heridas;

-: una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco, preferiblemente un fármaco antiséptico o cicatrizante, que preferiblemente pertenece a uno de los siguientes grupos: factores de tipo EGF, factores de tipo FGF, factores de tipo TGF-\beta, factores de tipo IGF, factores de tipo PDGF, lisado celular de queratinoci-tos;

-: compuestos que tienen una afinidad sustancial por el fármaco incorporado, para ralentizar la liberación del fármaco a partir de la matriz, y/o estabilizar el fármaco.

3. Un medicamento según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha matriz está en forma de una película hidratada o seca, o en una forma de espuma hidratada o seca, o en forma de microperlas hidratadas o secas, o en forma de un polvo seco, o en forma de fibras hidratadas o secas que se pueden fabricar en un tejido no tejido o tejido.

4. Un medicamento que contiene una matriz biopolímera según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se combinan múltiples formas de dicha matriz, teniendo cada forma propiedades diferentes con respecto a la composición química y/o a las características físicas y/o de liberación controlada.

5. Uso de una matriz biopolímera según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un vendaje para heridas y/o de un dispositivo de liberación controlada.

6. Uso de una matriz biopolímera según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un vendaje para heridas para tratar una de las siguientes enfermedades:

-: heridas de la piel (incluyendo quemaduras, úlceras rebeldes o crónicas, úlceras de pie de diabéticos, heridas necróticas y de masa de tejido muerto, heridas quirúrgicas, úlceras de decúbito y escaras de decúbito, heridas isquémicas),

-: cicatrización y formación de queloides,

-: necrotización de tejidos que rodean a una herida,

-: contracciones de la piel,

-: exceso de exudado o formación de masa de tejido muerto,

-: heridas o defectos de la córnea,

-: tratamiento postquirúrgico tras reconstrucciones de la membrana timpánica, u otras reconstrucciones del oído medio,

-: otorrea crónica,

-: trastornos dermatológicos.

7. Un medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha matriz está cubierta con una película semipermeable, escogiéndose la permeabilidad para controlar la humedad de la herida cubierta con dicha matriz biopolímera, y/o para mantener la humedad de la herida dentro de una ventana terapéuticamente óptima.

8. Un dispositivo de liberación controlada o lenta para liberar fármacos o vacunas según las reivindicaciones 1 a 5, para el suministro transdérmico de fármacos.

9. Un dispositivo de liberación controlada o lenta según cualquiera de las reivindicaciones 5 u 8, que comprende micropartículas cargadas con un fármaco o una vacuna que se puede inyectar intravenosa, subcutánea o intramuscularmente.

10. Un dispositivo de liberación controlada o lenta según cualquiera de las reivindicaciones 5, 8 ó 9, en el que dicha matriz está cubierta con una película oclusiva o semipermeable, para evitar que dicha matriz se seque, o para controlar el suministro de dicho fármaco o vacuna.