ES2241189T3 - Carbohidrato oxidasa y su uso para la coccion. - Google Patents
Carbohidrato oxidasa y su uso para la coccion.Info
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Abstract
Una carbohidrato oxidasa que es capaz de oxidar oligosacáridos de reducción con un residuo de glucosa en el extremo de reducción, y: a) es el polipéptido codificado por la secuencia de ADN que codifica la carbohidrato oxidasa clonada en el plásmido pCR2.1-TOPO presente en Escherichia coli NRRL B-30034, o b) es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia mostrada en ID SEC No: 2.
Description
Carbohidrato oxidasa y su uso para la
cocción.
La presente invención se refiere a una
carbohidrato oxidasa nueva y a su uso, p. ej. para la cocción.
En el proceso de fabricación del pan es conocido
el hecho de añadir aditivos de mejoramiento del pan y/o de
mejoramiento de la masa a la masa de pan, esta acción, entre otras
cosas, resulta en una textura, volumen, sabor y frescura del pan
mejoradas así como en una trabajabilidad y estabilidad mejoradas de
la masa.
Los "mejoradores" de la masa para reforzar
el gluten y mejorar las propiedades reológicas y de manipulación de
la masa son conocidas en la industria y han sido muy usados. Unos
oxidantes no específicos, como yodatos, peróxidos, ácido ascórbico,
bromato de potasio y azodicarbonamida tienen un efecto reforzante
del gluten. Se ha sugerido que estos mejoradores inducen la
formación de enlaces de interproteínas que refuerzan el gluten, y de
ese modo la
masa.
masa.
También se conoce el uso de glucosa oxidasa para
reforzar el gluten y mejorar las propiedades reológicas y de
manipulación de la masa. Así, US 2,783,150 expone el uso de glucosa
oxidasa en la harina para mejorar la dureza de la masa, y textura y
apariencia del pan cocido. EP 321 811 y EP 338 452 describen el uso
de la glucosa oxidasa para la cocción en combinación con otras
enzimas (sulfhidril oxidasa, hemicelulasa, celulasa). No obstante,
la eficacia de la glucosa oxidasa como un aditivo de mejoramiento
de la masa y/o del pan es limitada debido al bajo contenido en
glucosa generalmente en harinas de cereales usadas para la
preparación de productos cocidos.
Por lo tanto ha habido cierto interés en
identificar las oxidorreductasas que actúan en sustratos diferentes
de la glucosa. WO 96/39851 expone el uso de una hexosa oxidasa que
es capaz de oxidar D-glucosa y otros azúcares de
reducción que incluyen maltosa, lactosa, galactosa, xilosa,
arabinosa y celobiosa a sus lactonas respectivas con una hidrólisis
posterior a los ácidos aldobiónicos respectivos. WO 97/22257 expone
el uso de una piranosa oxidasa en cocción. La enzima cataliza la
oxidación de diferentes monosacáridos en la posición C2 con la
liberación concomitante de peróxido de hidrógeno. Aunque la glucosa
en su forma piranosa tiende a ser el sustrato preferido, la enzima
es capaz de oxidar otros sustratos, p. ej., furanosas, como la
xilosa.
Aunque las enzimas que catalizan la oxidación de
glucosa y otros azúcares directamente a los ácidos aldónicos
correspondientes parecen estar muy repartidas en la naturaleza, la
mayor parte de las oxidasas del azúcar conocidas son específicas de
los monosacáridos. Una oligosacárido oxidasa, aislada y purificada
de un cultivo de salvado de trigo de una cepa T1 de Acremonium
strictum aislada de la tierra, ha sido descrita por Lin, et
al, (1991, Biochim. Biophys. Acta 1118:41-47).
La enzima tiene la capacidad de oxidar oligosacáridos con un
residuo de glucosa en el extremo reductor. La enzima demostró
reactividad frente a la maltosa, lactosa, celobiosa y
maltooligosacáridos compuestos por hasta siete unidades de glucosa.
JP-A 5-84074 describe el uso de la
enzima como un reactivo analítico.
Los inventores han encontrado una carbohidrato
oxidasa nueva con la capacidad de oxidar maltodextrinas y
celodextrinas de forma más eficaz que la glucosa. La oxidasa nueva
puede obtenerse a partir de Microdochium, particularmente
M. nivale. Los inventores han aislado y depositado una cepa
de este tipo como CBS 100236 de M. nivale. La secuencia de
aminoácidos de la carbohidrato oxidasa nueva tiene una homología
muy baja (<20% de identidad) con las secuencias de aminoácidos
conocidas.
La presente invención proporciona una
carbohidrato oxidasa que es capaz de oxidar oligosacáridos
reductores con un residuo de glucosa en el extremo reductor, y:
a) es el polipéptido codificado por la secuencia
de ADN que codifica la carbohidrato oxidasa clonada en el plásmido
pCR2.1-TOPO presente en Escherichia Coli
NRRL B-30034, o
b) es un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia
mostrada en ID SEC NO: 2.
En una forma de realización preferida de la
invención la carbohidrato oxidasa se puede obtener a partir de una
cepa de M. nivale, preferiblemente de la cepa CBS 100236 de
M. nivale.
Además, la presente invención proporciona una
secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica dicha carbohidrato oxidasa.
Esta secuencia de ácidos nucleicos comprende:
a) la secuencia de ADN que codifica la
carbohidrato oxidasa clonada en el plásmido
pCR2.1-TOPO presente en Escherichia Coli NRRL
B-30034, o
b) una secuencia de ADN que tiene al menos el 80%
de identidad con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones
67-1550 de la SEC ID NO: 1.
Además, la presente invención proporciona un
constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos
nucleicos antes definida enlazada operativamente a una o más
secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la
carbohidrato oxidasa en un huésped de expresión adecuado.
Otra forma de realización de la presente
invención es un vector de expresión recombinante que comprende este
constructo de ácidos nucleicos, un promotor, y unas señales de
parada traduccionales y transcripcionales.
Una célula huésped recombinante que comprende
este constructo de ácidos nucleicos.
Esta invención además proporciona un método para
producir una carbohidrato oxidasa que comprende el cultivo de esta
célula huésped recombinante bajo condiciones que propician la
expresión de la carbohidrato oxidasa y la recuperación de la
carbohidrato oxidasa.
En otro aspecto, la presente invención comprende
el uso de la carbohidrato oxidasa para preparar una masa y/o un
producto cocido hecho a partir de una masa, y el uso de la
carbohidrato oxidasa para oxidar un oligosacárido con un residuo de
glucosa en el extremo reductor en el ácido correspondiente.
Las Figs. 1-3 ilustran los
plásmidos pBANe15, pEJG33 y pEJG35, respectivamente. Se
proporcionan los detalles en los Ejemplos.
La presente invención proporciona la adición de
la carbohidrato oxidasa a una masa. La carbohidrato oxidasa puede
ser añadida en forma de un aditivo de mejoramiento de la masa y/o
del pan según se describe más abajo.
La carbohidrato oxidasa es generalmente añadida
en una cantidad que es eficaz para proporcionar un efecto que se
puede medir en al menos una propiedad de interés de la masa y/o
producto horneado. El aditivo de mejora del pan y/o masa
generalmente está incluido en la masa en una cantidad
correspondiente al 0.01-5%, en particular al
0.1-3%. La enzima es normalmente añadida en una
cantidad correspondiente a 0.01-100 mg de proteína
enzimática por kg de harina, preferiblemente 0.1-25
mg por kg, más preferiblemente 0.1-10 mg por kg, y
más preferiblemente 0.5-5 mg por kg.
El nivel de oligosacáridos en la masa puede ser
aumentado por la adición de una amilasa que hidroliza el almidón
para formar oligosacáridos como un producto principal, p. ej., una
alfa-amilasa maltogénica de Bacillus
Stearothermophilus (comercialmente disponible como Novamyl®),
una alfa-amilasa de Aspergillus oryzae
(comercialmente disponible como Fungamyl®) o una
beta-amilasa.
El uso de la oligosacárido oxidasa puede dar como
resultado un volumen aumentado y una estructura granulada mejorada
y ablandamiento del producto cocido, así como una dureza aumentada,
estabilidad y pegajosidad reducida de la masa, dando así como
resultado una trabajabilidad mejorada. El efecto puede ser
adicional, o una consecuencia, de un efecto reforzante del gluten
según se discute más abajo. El efecto en la masa puede ser
particularmente ventajoso cuando se usa una harina de mala calidad.
La trabajabilidad mejorada es de importancia particular en relación
con la masa que debe ser procesada industrialmente.
La estabilidad de la masa es una de las
características más importantes de una masa de cocción y es
importante para aplicaciones a gran escala así como a pequeña
escala. Una masa estable, o fuerte, es capaz de una tolerancia
superior al tiempo de mezcla, tiempo de impermeabilización y de
vibraciones mecánicas durante el transporte de la masa, mientras que
una masa débil, o menos estable, es menos tolerante a estos
tratamientos. Mientras que la harina con un alto contenido de
gluten y una buena calidad de gluten contribuye a obtener una masa
fuerte, la harina con un contenido de proteína bajo o de poca
calidad de gluten provoca una masa débil. Así, una masa fuerte con
propiedades reológicas y de manipulación superiores es el resultado
de la harina que contiene una red de gluten fuerte.
La oligosacárido oxidasa puede ser añadida a
cualquier mezcla de sustancias de la masa, a la masa, o a
cualquiera de las sustancias que se deben incluir en la masa; es
decir, que la oligosacárido oxidasa puede ser añadida en cualquier
fase de la preparación de la masa y se puede añadir en una, dos o
más fases, si fuera apropiado y evitando la exposición de la enzima
a productos químicos fuertes o a condiciones en las que pudiera
inactivarse.
La carbohidrato oxidasa tiene una actividad más
alta en un maltooligosacárido con un grado de polimerización de
2-6 (particularmente maltosa, maltotriosa o
maltotetraosa) que en una glucosa con una concentración de sustrato
de 10 mM o inferior. Se puede hacer la comparación con una
concentración de sustrato de 1 mM o inferior, y la actividad en
maltotetraosa es preferiblemente más de dos veces la actividad en la
glucosa. La carbohidrato oxidasa puede tener una actividad oxidante
en maltodextrinas o celodextrinas maltotetraosa que es al menos dos
veces la actividad oxidante en la glucosa con una concentración de
sustrato de 0.83 mM.
Estas concentraciones de sustrato son
representativas de la concentración en masas típicas preparadas
según la práctica de cocción usual. Así, por ejemplo, en un
extracto hecho a partir de una masa la concentración de maltosa
resultó ser de 4.1 mM, que corresponde a 41 mmoles/kg de masa
obtenida de una extracción 1:10 durante 1 hora a 40ºC según está
descrito por Poulsen, C., et al (1996. Cereal Chem., 75:
51-57). Además, se mencionó que la cantidad de
maltosa extraíble podría ser más alta si había la actividad
amilolítica endógena suficiente (p. ej.,
beta-amilasa) presente en la harina, o se añadían
enzimas amilolíticas exógenas a la masa o harina, como ocurre con
frecuencia en la práctica. De forma similar, WO 96/39851 expone que
la maltosa está presente en la masa en un nivel del 1.4% (p/p).
Así, la cantidad de sustrato disponible, p. ej., maltosa, puede
diferir dependiendo del tipo y calidad de la harina, receta, mezcla
y proceso de fermentación, así como de la presencia de otros
aditivos.
Con pH 6 y 50 mM, la carbohidrato oxidasa de
M. nivale tiene la preferencia siguiente (en orden
descendente): celobiosa > maltosa > glucosa > xilosa >
lactosa. En base a la cinética de Michaeli-Menten,
los valores de K_{m} aparentes para los sustratos preferidos
son: 59 mM (celobiosa), 11 mM (maltosa), 42 mM (glucosa); V_{max}
es similar para la glucosa y maltosa. Así, la oxidasa muestra
preferencia para la maltosa sobre la glucosa, particularmente con
concentraciones de sustrato bajas (inferior a 10 mM).
La carbohidrato oxidasa de M. nivale es
capaz de oxidar oligosacáridos con un grado de polimerización (DP)
de DP2 -DP5, con una concentración de sustrato de 0.83 mM a un
nivel más alto que el monosacárido correspondiente. Así, la enzima
puede hidrolizar las maltodextrinas y las celodextrinas en las
cuales se enlazan las unidades monosacáridas mediante enlaces
glucosídicos alfa-1,4 o beta-1,4,
respectivamente, a un nivel más alto que la glucosa. La
carbohidrato oxidasa puede hidrolizar todas las celodextrinas que
tengan DP2-DP5 igualmente y a un nivel alrededor de
10 veces superior que la glucosa monosacárida. Con las
maltodextrinas como sustrato, la actividad carbohidrato oxidasa fue
1^{1/2}-veces más alta para la maltohexaosa hasta
casi 5 veces más alta para la maltotetraosa que para el
monosacárido.
La carbohidrato oxidasa es preferiblemente activa
y estable a un pH en la gama de 5-7, p. ej. con más
del 40% de actividad en esta gama, y más preferiblemente con una
actividad óptima en esta gama. La carbohidrato oxidasa de M.
nivale tiene un actividad óptima alrededor de un pH 6 y muestra
una actividad que es al menos del 80% (relativa a la actividad
máxima) en el margen de pH 5-7. A 40ºC, es estable
en el rango de pH 4-9, pero inestable con un pH
3.
La carbohidrato oxidasa es preferiblemente activa
y estable a 20-45ºC, p. ej. con más del 50% de
actividad en esta gama, y más preferiblemente con una actividad
óptima en esta gama. La carbohidrato oxidasa de M. nivale
tiene actividad óptima alrededor de 40ºC y muestra al menos el 70%
de actividad (con respecto a la actividad máxima) en la gama
30-60ºC. Con un pH 6, es estable hasta 60ºC, pero
se inactiva a 70ºC. Tiene una temperatura de desnaturalización de
73ºC.
La carbohidrato oxidasa es capaz de oxidarse
reduciendo los oligosacáridos con un residuo de glucosa en el
extremo reductor. Se oxida el residuo de glucosa en la posición 1
para formar el ácido correspondiente. Así, oxida la maltosa para
formar ácido maltobiónico y la lactosa para formar ácido
lactobiónico.
La actividad carbohidrato oxidasa puede ser
aislada, p. ej. esencialmente libre de otros polipéptidos sin
carbohidrato oxidasa, por ejemplo, más del 80% de pureza, y más
preferiblemente más del 90% de pureza en una base proteínica según
lo determinado por SDS-PAGE.
La carbohidrato oxidasa de M. nivale tiene
un peso molecular de aproximadamente 52 kDa según está determinado
por el SDS-PAGE y un punto isoeléctrico de
aproximadamente 8.9. Muestra deshidrogenasa como una actividad
lateral con aceptadores electrónicos como ferricianuro de potasio,
azul de metileno, benzoquinona y
2,6-diclorofenol-indofenol
(DCPIP).
La carbohidrato oxidasa puede además obtenerse a
partir de microorganismos de Xilariales; especialmente de
Xilariales mitospóricos como el género Microdochium,
particularmente las especies de M. nivale. Estas cepas son
fácilmente accesibles para el público en colecciones de cultivos,
como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung
von Microorganismen und Zellkulturen Gmbh (DSM) y Centraalbureau
Voor Schimmelcultures (CBS).
El género Microdochium está descrito en
Microdochium Syd (Samuels y Hallett, 1983, TBMS 81:473). Algunas
cepas de Microdochium han sido descritas bajo los sinónimos
Gerlachia, G. nivalis, G. oryzae, Fusarium nivale o
Rinchosporium oryzae. Están también descritas por
Monographella (Hyponectr) fide (Müller, 1977, Rev. mycol.
41:129).
Una cepa preferida es M. nivale, NN008551.
Esta fue aislada de fuentes naturales tomadas en India y
depositadas según el Tratado de Budapest en el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en materia de Patentes, del 4 Diciembre 1997 en el
Centraalbureau voor Schimmelcultures bajo el No de Asignación CBS
100236.
Los inventores han aislado el gen que codifica la
carbohidrato oxidasa de M. nivale CBS 100236 y la han
introducido en E. coli. La cepa de E. coli que
protege al gen fue depositada según el Tratado de Budapest en el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los
fines del Procedimiento en materia de Patentes, del 12 de Junio,
1998 en la Agricultural Research Service Collection (NRRL), 1815
North University Street, Peoria, IL, y denominada NRRL
B-30034.
La carbohidrato oxidasa puede ser añadida a la
masa como única enzima, o puede ser usada en combinación con una o
más enzimas adicionales. La enzima adicional puede ser una amilasa
(p. ej. según se ha descrito anteriormente), una ciclodextrina
glucanotransferasa, una peptidasa, en particular, una exopeptidasa,
una transglutaminasa, una lipasa, una fosfolipasa, una celulasa,
una hemicelulasa, en particular una pentosanasa como xilanasa, una
proteasa, una disulfuro isomerasa de proteína, p. ej., una
disulfuro isomerasa de proteína según se describe en WO 95/00636,
una glicosiltransferasa, y una oxidorreductasa, p. ej., una
peroxidasa, una lacasa, una glucosa oxidasa, una piranosa oxidasa,
una lipoxigenasa, una L-aminoácido oxidasa o una
carbohidrato oxidasa adicional, y similares.
La enzima adicional puede ser de cualquier
origen, incluido mamífero y vegetal, y preferiblemente de origen
microbiano (bacteria, levadura u hongo) y pueden ser obtenidos
mediante técnicas usadas de forma convencional en la técnica.
La amilasa puede derivar de una bacteria o un
hongo, en particular de una cepa de Aspergillus,
preferiblemente una cepa de A. Niger o A. oryzae, o
de una cepa de Bacillus. Algunos ejemplos son
alfa-amilasa, p. ej. de Bacillus
amyloliquefaciens, y amiloglucosidasa, p. ej. de A.
Niger. Los productos comerciales incluyen BAN y AMG (productos
de Novo Nordisk A/S, Dinamarca), Grindamyl A 1000 o A 5000
(disponible por Grindsted Products, Dinamarca) y Amilasa H y
Amilasa P (productos de Gist-Brocades, Países
Bajos).
La proteasa puede ser Neutrasa (disponible por
Novo Nordisk NS, Dinamarca).
La lipasa puede derivar de una cepa de
Thermomyces (Humicola), Rhizomucor, Candida, Aspergillus,
Rhizopus, o Pseudomonas, en particular de T.
lanuginosus (H. lanuginosa, EP 305,216), Rhizomucor
miehei (EP 238,023), C. antarctica (p. ej. Lipasa A o
Lipasa B descrita en WO 88/02775), A. Niger, Rhizopus
delemar o Rhizopus arrhizus o P. cepacia (EP
214,761 y WO 89/01032).
La masa es generalmente una masa de harina que
comprende polvo de harina de trigo o harina de trigo y/u otros
tipos de polvo de harina, harina o almidón como harina de maíz,
almidón de maíz, polvo de harina de centeno, harina de centeno,
harina de avena, polvo de harina de avena, harina de soja, polvo de
harina de sorgo, harina de sorgo, almidón de arroz, harina de arroz,
polvo de harina de patata, harina de patata o almidón de
patata.
La masa puede ser fresca, congelada o
precocida.
La masa es normalmente una masa leudada o una
masa para ser sometida a leudado. La masa puede ser leudada de
varias maneras, como por ejemplo añadiendo agentes de leudado
químicos, p. ej., bicarbonato sódico o añadiendo una levadura (masa
de fermentación), pero se prefiere leudar la masa añadiendo un
cultivo de levadura adecuado, como un cultivo de Saccharomyces
cerevisiae (levadura de panadería), p. ej. una cepa
comercialmente disponible de S. cerevisiae.
La masa puede también comprender otros
ingredientes de masa convencionales, p. ej.: proteínas, como leche
o leche en polvo, gluten, y soja; huevos (sea huevos enteros, yemas
de huevo o claras de huevo); manteca vegetal como grasa granulada o
aceite; un oxidante como ácido ascórbico, bromato de potasio,
yodato de potasio, azodicarbonamida (ADA) o persulfato de amonio;
un agente reductor como L-cisteína; un azúcar; una
sal como cloruro sódico, acetato de calcio, sulfato de sodio o
sulfato de calcio. La masa puede además comprender un emulsionante
como mono- o diglicéridos, ésteres de ácido diacetil tartárico de
mono- o diglicéridos, ésteres de azúcar de ácidos grasos, ésteres
poliglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácido láctico de
monoglicéridos, ésteres de ácido acético de monoglicéridos,
estearatos de polioxietileno, fosfolípidos, lecitina y
lisolecitina.
La masa puede ser una masa de pasta,
preferiblemente preparada a partir de harina de trigo duro o una
harina de calidad similar. Cuando se usa para la preparación de
pasta y fideos, la carbohidrato oxidasa puede dar como resultado un
refuerzo de la estructura del gluten y de ese modo proporcionar una
reducción de la pegajosidad de la masa, un aumento de la dureza de
la masa y un producto de masa con una textura mejorada.
El proceso de la invención puede ser usado para
cualquier producto cocido preparado a partir de una masa, sea de
tipo blando o crujiente, sea de tipo blanco, claro u oscuro. Unos
ejemplos son el pan (en particular pan blanco, integral o de
centeno), normalmente en forma de rebanadas o rollos, pan de tipo
baguette francesa, pan de pita, tortillas, pasteles, panquecas,
galletas, cookies, muffins (bizcocho inglés), cortezas de tarta,
pan crujiente, pan vaporizado, pizza y similares.
La presente invención también se refiere a una
premezcla, p. ej., en forma de una composición de harina, de masa
y/o productos cocidos hechos de masa, en los que la premezcla
comprende la carbohidrato oxidasa y opcionalmente otras enzimas
como las especificadas arriba. La premezcla puede ser preparada
mediante la mezcla enzimática de la(s)
enzima(s) pertinente(s) con un portador adecuado, como harina, almidón, un azúcar o una sal. La premezcla puede contener otros aditivos de mejoramiento de la masa y/o de mejoramiento del pan, p. ej. cualquier aditivo, incluyendo las enzimas, anteriormente mencionado.
enzima(s) pertinente(s) con un portador adecuado, como harina, almidón, un azúcar o una sal. La premezcla puede contener otros aditivos de mejoramiento de la masa y/o de mejoramiento del pan, p. ej. cualquier aditivo, incluyendo las enzimas, anteriormente mencionado.
La carbohidrato oxidasa puede ser proporcionada
como un aditivo mejorador de la masa y/o del pan en forma de un
granulado o polvo aglomerado. El aditivo de mejoramiento de la masa
y/o del pan preferiblemente tiene una distribución del tamaño de
las partículas limitada con más del 95% (en peso) de las partículas
en el rango de 25 a 500 \mum.
Los polvos granulados y aglomerados pueden ser
preparados por métodos convencionales, p. ej. pulverizando la
amilasa en un portador en un granulador de lecho fluidizado. El
portador puede consistir en núcleos de partículas con un tamaño de
partícula adecuado. El soporte puede ser soluble o insoluble, p.
ej. una sal (como NaCl o sulfato de sodio), un azúcar (como
sacarosa o lactosa), un alcohol de azúcar (como sorbitol), almidón,
arroz, sémola de maíz, o soja.
La carbohidrato oxidasa puede ser un polipéptido
que esté producido por Microdochium nivale CBS 100236, tenga
una secuencia de aminoácidos como la mostrada en ID SEC NO: 2, o
esté codificado por un gen presente en E. coli NRRL
B-30034; o puede ser un derivado análogo. El análogo
tiene al menos el 80% de identidad.
La secuencia de aminoácidos mostrada en ID SEC
NO: 2 tiene menos del 20% de identidad a secuencias conocidas. Es
idéntico en un 13.6% a la secuencia de aminoácidos de un precursor
de reticulina oxidasa de la amapola de California (GenPept,
Asignación No. 2897944) y en un 17.8% a la secuencia de aminoácidos
de una
6-hidroxi-D-nicotina
oxidasa de Arthrobacter oxidans (GenPept, Asignación
No.122805).
Una secuencia de aminoácidos de un polipéptido
puede ser determinada usando unos métodos estándar para obtener y
secuenciar péptidos, por ejemplo según se describe por Findlay y
Geisow, Eds., Protein Sequencing - a Practical Approach, 1989, IRL
Press. Una comparación con secuencias de aminoácidos de la técnica
precedente ha demostrado que ID SEC NO: 2 tiene sólo poca homología
(< 20%) con cualquier secuencia de aminoácidos de la técnica
precedente.
El polipéptido puede ser una variante que tenga
una secuencia de aminoácidos que difiera de no más de tres
aminoácidos, preferiblemente de no más de dos aminoácidos, y más
preferiblemente de no más de un aminoácido.
La carbohidrato oxidasa puede comprender al menos
una secuencia parcial que es la secuencia de aminoácidos
N-terminal mostrada en las posiciones
1-24 de ID SEC NO: 2 o las secuencias internas
mostradas en las posiciones 229-266,
249-271, 303-322,
336-347, 383-404,
405-414 y 420-440 de ID SEC NO: 2.
De forma alternativa, la carbohidrato oxidasa puede ser (idéntica)
preferiblemente al menos en un 90%, y más preferiblemente al menos
en un 97%, y retiene cualitativamente la actividad carbohidrato
oxidasa (a partir de ahora denominada "carbohidrato oxidasa
homóloga") y formas alélicas y fragmentos derivados, donde los
fragmentos retienen la actividad carbohidrato oxidasa.
En una forma de realización preferida, la
carbohidrato oxidasa homóloga comprende una secuencia de
aminoácidos que difiere de cinco aminoácidos, preferiblemente de
cuatro aminoácidos, más preferiblemente de tres aminoácidos,
incluso más preferiblemente de dos aminoácidos, y más
preferiblemente de un aminoácido de al menos una de dichas
secuencias de aminoácidos parciales.
La secuencia de aminoácidos de la carbohidrato
oxidasa homóloga puede diferir de cualquiera de las secuencias de
aminoácidos parciales por una inserción o eliminación de uno o más
residuos de aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos de
aminoácidos por residuos de aminoácidos diferentes. Los cambios de
aminoácidos son preferiblemente de una naturaleza menor, es decir,
sustituciones de aminoácidos conservadoras que no influyen
significativamente en la estructura terciaria y/o en la actividad
carbohidrato oxidasa. Los cambios de aminoácidos menores pueden
también incluir eliminaciones pequeñas, normalmente de uno a
aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones de terminales
amino o carboxilo, como un residuo de metionina de terminal amino;
un péptido de enlace pequeño de hasta aproximadamente
20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita
la purificación cambiando la carga neta u otra función, como una
trayectoria de polihistidina, un epitopo antigénico o un dominio de
unión.
Ejemplos de sustituciones conservadoras están
dentro del grupo de aminoácidos básicos (como arginina, lisina e
histidina), aminoácidos acídicos (como ácido glutámico y ácido
aspártico), aminoácidos polares (como glutamina y asparagina),
aminoácidos hidrofóbicos (como leucina, isoleucina y valina),
aminoácidos aromáticos (como fenilalanina, triptófano y tirosina) y
aminoácidos pequeños (como glicina, alanina, serina, y treonina).
Sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la
actividad específica son conocidas en la técnica y están descritas,
p. ej., por H. Neurath and R.L. Hill, 1979, en The Proteins,
Academic Press, Nueva York. Los cambios que ocurren más
frecuentemente son: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly,
Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/pro, Lys/Arg,
Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly así como sus
inversos.
La invención proporciona una secuencia de ácidos
nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica la carbohidrato oxidasa. La secuencia de ácidos nucleicos
que codifica la carbohidrato oxidasa puede comprender:
a) la carbohidrato oxidasa que codifica parte de
la secuencia de ADN clonada en un plásmido presente en
Escherichia coli NRRL B-30034, o
b) la secuencia de ADN que tiene al menos el 80%
de identidad con la mostrada en las posiciones
67-1550 de ID SEC NO: 1.
El grado de identidad puede ser aproximadamente
del 90%, preferiblemente aproximadamente del 95%, y más
preferiblemente aproximadamente del 97%.
La secuencia de ADN que codifica una carbohidrato
oxidasa puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que
produzca la carbohidrato oxidasa en cuestión, usando varios métodos
bien conocidos en la técnica para recolocar la secuencia de ácidos
nucleicos desde su ubicación natural a un sitio diferente donde
será reproducida.
La región de codificación de la carbohidrato
oxidasa de la secuencia de ácidos nucleicos que se halla en CBS
100236, o subsecuencias de ésta, pueden ser usadas para diseñar una
sonda de oligonucleótidos para aislar genes homólogos que codifican
carbohidrato oxidasa de otras cepas de géneros o especies
diferentes según unos métodos bien conocidos en la técnica. Así,
una biblioteca genómica o de ADNc preparada a partir de estos otros
organismos pueden ser seleccionadas para el ADN que hibrida con las
sondas según procedimientos de Southern blot estándar, con el
objetivo de identificar y aislar el gen correspondiente en su
interior. Estas sondas pueden ser considerablemente más cortas que
toda la secuencia, pero debería haber como mínimo 15,
preferiblemente al menos 25, y más preferiblemente al menos 40
nucleótidos de longitud. Las sondas más largas, preferiblemente de
no más de 1200 nucleótidos de longitud, pueden también ser usadas.
Ambas sondas de ADN y ARN pueden ser usadas. Las sondas están
normalmente etiquetadas para detectar el gen correspondiente (por
ejemplo, con 32P, 3H, biotina, o avidina). Según la presente
invención, las sondas preferidas pueden ser construidas basándose
en ID SEC NO: 1.
El ADN genómico u otro ADN de estos otros
organismos pueden ser separados por electroforesis en gel de
agarosa o de poliacrilamida, u otras técnicas de separación
conocidas en la técnica. El ADN de las bibliotecas o el ADN
separado puede ser transferido e inmovilizado en nitrocelulosa u
otro material portador adecuado. Con el objetivo de identificar
clones o ADN homólogos a la secuencia de ácidos nucleicos para la
carbohidrato oxidasa de la presente invención que se hallen en CBS
100236, el material portador se usa en un Southern blot donde el
material portador es finalmente lavado tres veces durante 30
minutos, cada vez usando 2X SSC, 0.2% de SDS preferiblemente a no
más de 40ºC, más preferiblemente no más de 45ºC, más
preferiblemente no más de 50ºC, más preferiblemente no más de 55ºC,
incluso más preferiblemente no más de 60ºC, especialmente no más de
65ºC. las moléculas hibridadas por la sonda de oligonucleótidos
bajo estas condiciones son detectadas usando una película de rayos
X.
Las secuencias de ácidos nucleicos aisladas de la
presente invención que son capaces de hibridar con una sonda de
oligonucleótidos que hibrida con la secuencia de ácidos nucleicos
para la carbohidrato oxidasa de la presente invención se hallan en
CBS 100236, su cadena complementaria, o una subsecuencia de ésta,
puede ser obtenida a partir de microorganismos de cualquier género,
por ejemplo, de una fuente bacteriana o micótica.
La carbohidrato oxidasa puede ser obtenida de (o
ser endógena a) una fuente microbiana dada. Así, la carbohidrato
oxidasa puede ser producida por el organismo fuente o por una
célula en la que se haya introducido un gen de la fuente.
Además, los genes homólogos pueden ser
identificados y obtenidos de otras fuentes que incluyen
microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., tierra,
composts, agua, etc.) usando las sondas arriba mencionadas. Las
técnicas para aislar microorganismos de los hábitats naturales son
bien conocidas en la técnica. La secuencia de ácidos nucleicos
puede luego derivar mediante una selección de forma similar de una
biblioteca genómica o de ADNc de otro microorganismo.
Una vez detectada una secuencia de ácidos
nucleicos con la sonda(s) anteriormente descrita, la
secuencia puede ser aislada o clonada utilizando técnicas que son
bien conocidas para los expertos en la técnica (ver, p. ej.,
Sambrook et al., 1989, supra). Las técnicas conocidas
usadas para aislar o clonar una secuencia de ácidos nucleicos
incluyen el aislamiento de ADN genómico, preparación de ADNc, o una
combinación de ello. La clonación de las secuencias de ácidos
nucleicos de la presente invención de este ADN genómico puede ser
efectuada, p. ej., usando la reacción en cadena de la polimerasa
señalada (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se
describe en US 4,683,202 o R.K. Saiki et al. (1988, Science
239:487-491). También ver, por ejemplo, Innis,
et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and
Application, Academic Press, Nueva York. La secuencia de ácidos
nucleicos puede ser clonada a partir de un organismo que produzca la
carbohidrato oxidasa, u otro o un organismo relacionado y así, por
ejemplo, puede ser una variante alélica o de especies de la región
de codificación de la carbohidrato oxidasa de la secuencia de
ácidos nucleicos.
De forma alternativa, la secuencia de ADN que
codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos
estándar establecidos, p. ej. el método de fosfoamidita descrito
por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981, Tetrahedron Letters
22:1859-1869) o el método descrito por Matthes et
al. (1984, The EMBO J. 3:801-805). En el método
de fosfoamidita mencionado, los oligonucleótidos son sintetizados,
p. ej. en un sintetizador de ADN automático, purificados,
templados, ligados y clonados en vectores apropiados.
La modificación de la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la carbohidrato oxidasa puede ser necesaria
para la síntesis de una carbohidrato oxidasa sustancialmente
similar a la carbohidrato oxidasa. El término "sustancialmente
similar" a la carbohidrato oxidasa se refiere a formas de origen
no naturales de la carbohidrato oxidasa. Esta carbohidrato oxidasa
puede diferir en algún aspecto de la ingeniería genética de la
carbohidrato oxidasa aislada de su fuente nativa. Por ejemplo,
puede ser interesante el hecho de sintetizar variantes de la
carbohidrato oxidasa donde las variantes difieran en la actividad
específica, termostabilidad, estabilidad oxidante, pH óptimo, o
similares usando, por ejemplo, la mutagénesis dirigida. La secuencia
análoga puede ser construida basándose en la región de codificación
de la carbohidrato oxidasa de la secuencia de ácidos nucleicos para
la carbohidrato oxidasa de la presente invención que se halla en
CBS 100236, una subsecuencia suya, y/o por introducción de
sustituciones de nucleótidos que no originan otra secuencia de
aminoácidos de la carbohidrato oxidasa codificada por la secuencia
de ácidos nucleicos, pero que corresponde al uso del codón del
organismo huésped destinado a la producción de la enzima, o por
introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden originar una
secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de
sustitución de nucleótidos, ver, p. ej., Ford, et al., 1991,
Protein Expression and Purification 2:95-107.
Estas sustituciones pueden hacerse fuera de las
regiones fundamentales para la función de la molécula y además dan
como resultado una carbohidrato oxidasa activa. Los residuos de
aminoácidos esenciales para la actividad carbohidrato oxidasa
codificados por la secuencia de ácidos nucleicos aislada, y en
consecuencia preferiblemente no sometida a sustitución, pueden ser
identificados según procedimientos conocidos en la técnica, como
por ejemplo la mutagénesis dirigida o mutagénesis de barrido de
alanina (ver, p. ej., Cunningham and Wells, 1989, Science
244:1081-1085). En esta técnica, las mutaciones son
introducidas en cada residuo con carga positiva en la molécula, y
las moléculas mutantes resultantes son evaluadas para la actividad
proteasa para identificar residuos de aminoácidos que son
fundamentales para la actividad de la molécula. Los lugares de
interacción del sustrato enzimático pueden también ser determinados
mediante el análisis de la estructura cristalina según se determina
por técnicas de este tipo tales como análisis de resonancia
magnética nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (ver,
p. ej., de Vos et al., 1992, Science
255:306-312; Smith, et al., 1992, Journal
of Molecular Biology 224:899-904; Wlodaver, et
al., 1992, FEBS Letters 309:59-64).
La carbohidrato oxidasa puede ser un polipéptido
fusionado donde está fusionado otro polipéptido en el
N-terminal o el C-terminal del
polipéptido o su fragmento. Un polipéptido fusionado es producido
mediante la fusión de una secuencia de ácidos nucleicos (o una
parte de ésta) que codifica otro polipéptido a una secuencia de
ácidos nucleicos (o una parte de ésta) de la presente invención.
Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidos en
la técnica, e incluyen, la ligadura de las secuencias de
codificación de los polipéptidos de modo que se hallen en la
estructura y que la expresión del polipéptido fundido esté bajo
control del mismo promotor(es) y terminador.
Otro método para identificar clones de
codificación de carbohidrato oxidasa incluye la introducción de
fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, como un
plásmido, la transformación de bacterias de carbohidrato
oxidasa-negativas con la biblioteca de ADN genómico
resultante, y luego la colocación en placas de las bacterias
transformadas en agar que contienen un sustrato para carbohidrato
oxidasa, permitiendo de ese modo que se identifiquen los clones que
expresan la carbohidrato oxidasa.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de
origen genómico mezclado y sintético, de origen mezclado sintético
y de ADNc o de origen mezclado genómico y de ADNc, preparado según
técnicas estándar para la ligadura de fragmentos de origen
sintético, genómico o de ADNc según sea apropiado donde los
fragmentos corresponden a varias secciones de toda la secuencia de
ADN.
La identidad de polipéptidos a la que se hace
referencia en esta especificación con reivindicaciones está
determinada como el grado de identidad entre dos secuencias que
indican una derivación de la primera secuencia a partir de la
segunda. La identidad puede idóneamente ser determinada según el
método descrito en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal
of Molecular Biology, 48, 443-45, con los ajustes
siguientes para la comparación de secuencias polipéptidas:
Penalidad de creación de GAP de 3.0 y penalidad de extensión de GAP
de 0.1. La determinación puede hacerse mediante un programa
informático conocido como GAP provisto en el paquete de programa
GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, agosto
1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison,
Wisconsin, USA 53711).
De forma alternativa, el grado de identidad puede
ser determinado por el método de Clustal (Higgins, 1989,
CABIOS 5: 151-153) usando el software
LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de
identidad y los parámetros siguientes de alineación múltiple:
Penalidad de GAP de 10, y penalidad de longitud de gap de 10. Los
parámetros de alineación por parejas fueron Ktuple = 1, penalidad
de gap = 3, ventanas = 5, y diagonales = 5.
La región madura de un polipéptido análogo puede
mostrar un grado de identidad preferiblemente de al menos el 90%, y
especialmente al menos el 95% con la secuencia de la carbohidrato
oxidasa anteriormente descrita.
Para objetivos de la presente invención, el grado
de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos está
determinada por el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5:
151-153) con una tabla de identidad, una penalidad
de gap de 10, y una penalidad de longitud de gap de 10.
La carbohidrato oxidasa puede ser producida por
cultivo aeróbico de un organismo huésped transformado que contenga
la información genética apropiada de la cepa anteriormente
mencionada. Estos transformantes pueden ser preparados y cultivados
por métodos conocidos en la técnica según se describe abajo.
La presente invención también se refiere a
constructos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de
ácidos nucleicos de la presente invención operativamente conectada
a una o más secuencias de control que pueden dirigir la expresión
de la secuencia de codificación en una célula huésped adecuada bajo
condiciones compatibles con las secuencias de control.
El constructo de ácidos nucleicos puede ser una
molécula de ácidos nucleicos, sea de cadena única o doble, que está
aislada de un gen de origen natural o que ha sido modificada para
contener segmentos de ácidos nucleicos que son combinados y
superpuestos de tal manera que de no ser así, no existirían en
naturaleza. El constructo de ácidos nucleicos puede ser un cassette
de expresión cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene todas
las secuencias de control requeridas para la expresión de una
secuencia de codificación de la presente invención. La secuencia de
codificación puede ser una secuencia que está transcrita en ARNm y
traducida en una carbohidrato oxidasa de la presente invención al
ponerse bajo el control de las secuencias de control apropiadas.
Los límites de la secuencia de codificación están generalmente
determinados por un codón de iniciación de traducción ATG en el
terminal 5' y un codón de parada de traducción en el terminal 3'.
Una secuencia de codificación puede incluir, pero no sin estar
limitada, ADN, ADNc, y secuencias de ácidos nucleicos
recombinantes.
Una secuencia de ácidos nucleicos aislada de la
presente invención puede ser manipulada de varias maneras para dar
la expresión de la carbohidrato oxidasa. La manipulación de la
secuencia de ácidos nucleicos antes de su introducción en un vector
puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión.
Las técnicas para modificar secuencias de ácidos nucleicos mediante
métodos de clonación son bien conocidas en la técnica.
Las secuencias de control pueden incluir todos
los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión
de la secuencia de codificación de la secuencia de ácidos
nucleicos. Cada secuencia de control puede ser nativa o externa a
la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la carbohidrato
oxidasa. Estas secuencias de control incluyen, pero no se limitan a,
un guía, un promotor, una secuencia señal, y un terminador de la
transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un
promotor, y señales de parada transcripcionales y traduccionales.
Las secuencias de control pueden ser provistas de enlaces para
introducir lugares de restricción específicos que faciliten la
ligadura de las secuencias de control con la zona de codificación
de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una carbohidrato
oxidasa.
La secuencia de control puede ser una secuencia
promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucleicos que sea
reconocida por la célula huésped para la expresión de la secuencia
de ácidos nucleicos. La secuencia promotora contiene secuencias de
control de la transcripción que median la expresión de la
carbohidrato oxidasa. El promotor puede ser cualquier secuencia de
ácidos nucleicos que muestre actividad transcripcional en la célula
huésped de elección y se puede obtener a partir de genes que
codifican la carbohidrato oxidasa extracelular o intracelular bien
homólogos o heterólogos a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente
invención, especialmente en un huésped bacteriano, son los
promotores obtenidos a partir del operón lac de E. coli, el
gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), el gen de
levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), el gen de
alfa-amilasa de Bacillus licheniformis
(amyL), el gen de amilasa maltogénico de Bacillus
Stearothermophilus (amyM), el gen de
alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens
(amyQ), el gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis
(penP), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, y el gen
procariótico de beta-lactamasa
(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of
the National Academy of Sciences EEUU 75:
3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et
al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU
80: 21-25). Otros promotores están descritos en
"Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific
American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et
al., 1989, supra.
Para la transcripción en un huésped micótico,
ejemplos de promotores útiles incluyen aquellos derivables del gen
que codifica la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae,
proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei,
a-amilasa neutral de A. Niger,
a-amilasa estable ácida de A. Niger,
glucoamilasa de A. Niger, lipasa de Rhizomucor
miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato
isomerasa de A. oryzae y acetamidasa de A.
nidulans.
La secuencia de control puede también ser una
secuencia de terminación de la transcripción adecuada, una
secuencia reconocida por la célula huésped de elección para
terminar la transcripción. La secuencia de terminación está
operativamente conectada al terminal 3' de la secuencia de ácidos
nucleicos que codifican la carbohidrato oxidasa. Cualquier
terminador que es funcional en la célula huésped de elección puede
ser usada en la presente invención.
La secuencia de control puede también ser una
secuencia guía adecuada, una región no traducida de un ARNm que es
importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia
guía está operativamente conectada al terminal 5' de la secuencia
de ácidos nucleicos que codifica la carbohidrato oxidasa. Cualquier
secuencia líder que es funcional en la célula huésped de elección
puede ser usada en la presente invención.
La secuencia de control puede también ser una
zona de codificación del péptido señal, que codifica para una
secuencia de aminoácidos conectada al terminal amino de la
carbohidrato oxidasa que puede dirigir la carbohidrato oxidasa
expresada en el vehículo secretor de la célula. La región de
codificación del péptido señal puede ser nativa para la carbohidrato
oxidasa o puede ser obtenida a partir de fuentes externas. El
extremo 5' de la secuencia de codificación de la secuencia de
ácidos nucleicos puede intrínsecamente contener una región de
codificación del péptido señal naturalmente conectada en una
estructura de lectura de la traducción con el segmento de la región
de codificación que codifica la carbohidrato oxidasa segregada. De
forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia de codificación
puede contener una zona de codificación del péptido señal que es
externa a esta parte de la secuencia de codificación que codifica
la carbohidrato oxidasa segregada. La región de codificación del
péptido señal externa puede ser requerida dónde la secuencia de
codificación normalmente no contiene una región de codificación del
péptido señal. De forma alternativa, la región de codificación del
péptido señal externa puede simplemente reemplazar a la región de
codificación del péptido señal natural con el fin de obtener una
secreción mejorada de la carbohidrato oxidasa relativa a la región
de codificación del péptido señal natural normalmente asociada a la
secuencia de codificación. Cualquier región de codificación del
péptido señal capaz de dirigir la carbohidrato oxidasa expresada en
el vehículo secretor de la célula huésped de elección puede ser
usada en la presente invención.
Una región de codificación del péptido señal
eficaz para una célula huésped bacteriana, en particular,
Bacillus, es la región de codificación del péptido señal
obtenida a partir del gen maltogénico de amilasa de Bacillus
NCIB 11837, el gen de alfa-amilasa de Bacillus
stearothermophilus, el gen de subtilisina de Bacillus
licheniformis, el gen de beta-lactamasa de
Bacillus licheniformis, los genes de proteasas neutrales de
Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y el gen
prsA de Bacillus subtilis. Además los péptidos señal están
descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:
109-137.
La presente invención también se refiere a
vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de
ácidos nucleicos de la presente invención, un promotor, y señales
de parada transcripcionales y traduccionales. Las distintas
secuencias de ácidos nucleicos y de control anteriormente descritas
pueden ser unidas entre sí para producir un vector de expresión
recombinante que puede incluir uno o más lugares de restricción
convenientes para permitir la inserción o sustitución de la
secuencia de ácidos nucleicos que codifican la carbohidrato oxidasa
en estas regiones. De forma alternativa, la secuencia de ácidos
nucleicos de la presente invención puede ser expresada mediante la
introducción de la secuencia de ácidos nucleicos o un constructo de
ácidos nucleicos que comprende la secuencia en un vector apropiado
para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia de
codificación está localizada en el vector de modo que la secuencia
de codificación está operativamente enlazada con las secuencias de
control apropiadas para la expresión, y posiblemente la
secreción.
El vector de expresión puede también comprender
en eucariotas una secuencia de poli-adenilación
operativamente conectada a la secuencia de ADN que codifica la
carbohidrato oxidasa. Las secuencias de terminación y
poli-adenilación pueden ser idóneamente derivadas de
las mismas fuentes que el promotor.
El vector de expresión recombinante puede ser
cualquier vector que puede estar convenientemente sujeto a
procedimientos de ADN recombinante y puede efectuar la expresión de
la secuencia de ácidos nucleicos. La elección del vector
normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula
huésped en la que se introducirá el vector. Los vectores pueden ser
plásmidos circulares lineales o cerrados. El vector puede ser un
vector de replicación autónomo, es decir, un vector que existe como
una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de
la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento
extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El
vector puede contener cualquier medio para asegurar la
autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que,
al introducirse en la célula huésped, se integre en el genoma y se
replique junto con el(los) cromosoma(s) en el que ha
sido integrado. El sistema de vector puede ser un único vector o
plásmido, dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el
ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped,
o un transposón.
Los vectores de la presente invención
preferiblemente contienen uno o más marcadores que se pueden
seleccionar que permiten una selección fácil de células
transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto
proporciona resistencia a biocidas, resistencia a metales pesados,
prototrofía a auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores
bacterianos que se pueden seleccionar son los genes de Bacillus
subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que
confieren resistencia antibiótica como resistencia a la ampicilina,
canamicina, eritromicina, cloranfenicol o tetraciclina. Además, se
puede realizar la selección por cotransformación, p. ej., como se
describe en WO 91/09129, donde el marcador seleccionable se halla
en un vector separado.
Los vectores de la presente invención contienen
un elemento(s) que permite la integración estable del vector
en el genoma huésped celular o la replicación autónoma del vector
en la célula independiente del genoma de la célula.
Los vectores de la presente invención pueden ser
integrados en el genoma de la célula huésped al introducirse en una
célula huésped. Para la integración, el vector puede depender de la
secuencia de ácidos nucleicos que codifican la carbohidrato oxidasa
o cualquier otro elemento del vector para la integración estable
del vector en el genoma por recombinación homóloga. De forma
alternativa, el vector puede contener secuencias de ácidos nucleicos
adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga
en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ácidos
nucleicos adicionales permiten que el vector se integre en el
genoma de la célula huésped en una ubicación precisa en el
cromosoma. Para aumentar la probabilidad de integración en una
ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener
preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, como 100
a 1,500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1,500 pares de bases,
y más preferiblemente 800 a 1,500 pares de bases, que sean
altamente homólogos a la secuencia blanco correspondiente para
realzar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos
integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la
secuencia blanco en el genoma de la célula huésped. Además, los
elementos integracionales pueden ser secuencias de ácidos nucléicos
no codificantes o codificantes.
Para la replicación autónoma, el vector puede
además comprender un origen de replicación que permita que el
vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en
cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los
orígenes de replicación de plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y
pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110,
pE194, pTA1060, y pAM\beta1 que permiten la replicación en
Bacillus. El origen de replicación puede ser uno que tenga
una mutación para hacer su función termosensible en la célula de
Bacillus (ver, p. ej., Ehrlich, 1978, Proceedings of the
National Academy of Sciences EEUU 75: 1433).
Más de una copia de una secuencia de ácidos
nucléicos que codifica una carbohidrato oxidasa de la invención
preenviada puede ser introducida en la célula huésped para ampliar
la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La ampliación
estable de la secuencia de ácidos nucleicos puede ser obtenida
integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el
genoma de la célula huésped usando métodos muy conocidos en la
técnica y seleccionando transformantes. Un método conveniente para
conseguir la ampliación de secuencias de ADN genómico está descrito
en WO 94/14968.
Unos procedimientos adecuados para construir
vectores que codifican una carbohidrato oxidasa y que contienen el
promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, son muy
conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo,
Sambrook et al., supra).
También puede ser deseable el hecho de añadir
secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión
de la carbohidrato oxidasa relativa al crecimiento de la célula
huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que provocan que
la expresión del gen se produzca o no como respuesta a un estímulo
químico o físico, que incluya la presencia de un compuesto
regulador. Sistemas reguladores en sistemas procarióticos
incluirían los sistemas de los operadores lac, tac, y trp. Otros
ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten la
amplificación genética. En estos casos, la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la carbohidrato oxidasa sería operativamente
conectada a la secuencia reguladora.
Mientras que la expresión intracelular puede ser
ventajosa en algunos aspectos, p. ej., cuando se usan ciertas
bacterias como células huéspedes, generalmente se prefiere que la
carbohidrato oxidasa expresada sea segregada extracelularmente.
La presente invención también se refiere a
células huéspedes recombinantes, que comprendan un constructo de
ADN o bien un vector de expresión según el modo descrito
anteriormente, que sean ventajosamente usados en la producción
recombinante de la carbohidrato oxidasa. La célula huésped puede
ser cualquiera proveniente de una célula madre que no sea idéntica
a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante la
replicación.
La célula es preferiblemente transformada con un
vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seguido de
la integración del vector en el cromosoma huésped.
"Transformación" significa que se introduce un vector que
comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención
en una célula huésped de modo que el vector se mantenga como un
integrante cromosómico o como un vector extracromosómico
autorreplicativo. La integración generalmente está considerada como
una ventaja puesto que la secuencia de ácidos nucleicos es más
susceptible de mantenerse estable en la célula. La integración del
vector en el cromosoma huésped ocurre por recombinación homóloga o
no-homóloga según el modo descrito
anteriormente.
La elección de una célula huésped en gran parte
dependerá del gen que codifica la carbohidrato oxidasa y su fuente.
La célula huésped puede ser una célula de un organismo más grande,
como un mamífero o un insecto, pero es preferiblemente una célula
microbiana, p. ej., una célula bacteriana o micótica (incluida la
levadura).
Ejemplos de células bacterianas adecuadas son
bacterias gram positivas que incluyen, pero no se limitan a, una
célula de Bacillus, p. ej., Bacillus alkalofilus,
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans,
Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus
lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus
pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y
Bacillus thuringiensis; o una célula de
Streptomyces, p. ej., Streptomyces lividans o
Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas como E.
coli y Pseudomonas sp. En una forma de realización
preferida, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus
lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o
Bacillus subtilis.
La transformación de una célula huésped
bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada por transformación de
protoplastos (ver, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General
Genetics 168:111-115), usando células competentes
(ver, p. ej., Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology
81:823-829, o Dubnau y
Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology
56:209-221), por electroporación (ver, p. ej.,
Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751),
o por conjugación (ver, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of
Bacteriology 169:5771-5278).
La célula huésped puede también ser una célula
eucariota, como una célula de mamífero, una célula de insecto, una
célula vegetal o una célula micótica. Unas células mamíferas útiles
son células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células
de riñón de hámster bebé (BHK), células COS, o un número cualquiera
de otras líneas celulares inmortalizadas disponibles, p. ej., de la
American Type Culture Collection.
En una forma de realización preferida la célula
huésped es una célula micótica. "Hongos" según se utiliza en
este caso, incluyen los hongos phyla Ascomycota, Basidomycota,
Chytridiomycota, y Zygomycota (según se define por
Hawkswort, et al., Ainswort y Bisby's Dictionary of The
Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press,
Cambridge, Reino Unido) así como Oomycota (según se cita en
Hawksworth, et al., 1995, supra, página 171) y todos
los hongos mitospóricos (Hawksworth, et al., 1995,
supra). Los grupos representativos de Ascomycota
incluyen, p. ej., Neurospora, Eupenicillium
(=Penicillium), Emericella (=Aspergillus),
Eurotium (=Aspergillus), y las levaduras reales
catalogadas arriba. Ejemplos de Basidiomycota incluyen
setas, royas, y carbones. Unos grupos representativos de
Chytridiomycota incluyen, p. ej., Allomyces,
Blastocladiella, Coelomomyces, y hongos acuáticos. Unos grupos
representativos de Oomycota incluyen, p. ej., hongos acuáticos de
Saprolegniomycetous (moldes de agua) como Achlya.
Ejemplos de hongos mitospóricos incluyen Aspergillus,
Penicillium, candida, y Alternaria. Unos grupos
representativos de Zygomycota incluyen, p. ej.,
Rhizopus y Mucor.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped micótica es una célula de levadura. "Levadura" según
se utiliza en este caso incluye levadura ascosporogénea
(Endomycetales), levadura basidiosporogénea, y levadura que
pertenece a los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Las
levaduras ascosporogéneas están divididas en las familias
Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae. Éstas están
compuestas por cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoideae
(p. ej., de género Schizosaccharomyces), Nadsonioideae,
Lipomycoideae, y Saccharomycoideae (p. ej., de género
Pichia, Kluyveromices y Saccharomyces). Las levaduras
basidiosporogéneas incluyen los géneros Leucosporidim,
Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, y
Filobasidiella. La levadura que pertenece a los Fungi
Imperfecti está dividida en dos familias,
Sporobolomycetaceae (p. ej., géneros Sorobolomyces y
Bullera) y Cryptococcaceae (p. ej., género
Candida). La levadura puede ser como se describe en Biology
and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and
Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series Nº. 9,
1980. La biología de la levadura y la manipulación de la genética
de la levadura es muy conocida en la técnica (ver, p. ej.,
Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B.J., and
Stopani, A.O.M., editors, 2ª edición, 1987; The Yeasts, Rose, A.H.,
and Harrison, J.S., editors, 2ª edición 1987; y The Molecular
Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern et al.,
editors, 1981).
En una forma de realización más preferida, la
célula huésped de levadura es una célula de una especies de
Candida, Kluyveromices, Saccharomyces, Schizosaccharomyces,
Pichia, o Yarrowia.
En una forma de realización más preferida, la
célula huésped de levadura es una célula de Saccharomyces
carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces
diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri,
Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En
otra forma de realización más preferida, la célula huésped de
levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otra forma
de realización más preferida, la célula huésped de levadura es una
célula de Yarrowia lipolytica.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped micótica es una célula micótica filamentosa. "Hongos
filamentosos" incluye todas las formas filamentosas de la
subdivisión Eumycota y Oomycota (tal y como se define por
Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos
filamentosos están caracterizados por una pared micelial vegetal
compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y
otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por
alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente
aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras
como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo
unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo. En
una forma de realización más preferida, la célula huésped micótica
filamentosa es una célula de unas especies de, pero no limitadas a,
Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor,
Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia,
Tolypocladium y Trichoderma.
En una forma de realización más preferida, la
célula huésped micótica filamentosa es una célula de Aspergillus
awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus
nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En
otra forma de realización más preferida, la célula huésped micótica
filamentosa es una célula de Fusarium cerealis, Fusarium
crookwellense, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium
sambucinum, Fusarium sulphureum, o Fusarium venenatum.
En otra forma de realización más preferida, la célula huésped
micótica filamentosa es una célula de Humicola insolens o de
Humicola lanuginosa. En otra forma de realización más
preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula de
Mucor miehei. En otra forma de realización más preferida, la
célula huésped micótica filamentosa es una célula de
Myceliophthora thermophilum. En otra forma de realización
más preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula
de Neurospora crassa. En otra forma de realización más
preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula de
Penicillium purpurogenum. En otra forma de realización más
preferida, la célula huésped micótica filamentosa es una célula de
Thielavia terrestris. En otra forma de realización más
preferida, la célula de Trichoderma es una célula de
Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma
longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma
viride.
Las células micóticas pueden ser transformadas
por un proceso que implica formación de protoplastos,
transformación de los protoplastos, y regeneración de la membrana
celular en cierto modo conocido per se. Procedimientos
adecuados para la transformación de células huéspedes de
Aspergillus están descritas en EP 238 023 y Yelton et
al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences
EEUU 81:1470-1474. Un método adecuado para
transformar especies de Fusarium está descrito por Malardier
et al., 1989, Gene 78:147-156 o en resumen
US Serie No. 08/269,449. La levadura puede ser transformada usando
los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson,
J.N. y Simon, M.I., editors, "Guide to Yeast Genetics and
Molecular Biology", Methods in Enzymology, volumen 194, págs
182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito,
et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; y Hinnen
et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences
EEUU 75:1920. Las células mamíferas pueden ser transformadas por
captación directa usando el método de precipitación de fosfato de
calcio de Graham y Van der Eb (1978, Virology 52:546).
La carbohidrato oxidasa puede ser producida por
métodos recombinantes que comprenden el cultivo de una célula
huésped según el modo descrito anteriormente bajo condiciones
propicias para la producción de dicha carbohidrato oxidasa y
recuperación de la carbohidrato oxidasa de las células y/o medio de
cultivo.
En estos métodos, las células son cultivadas en
un medio nutritivo adecuado para la producción la carbohidrato
oxidasa usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la
célula puede ser cultivada por cultivo en frasco de agitación,
fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluidas
fermentaciones continuas, discontinuas, alimentadas, o de estado
sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en
un medio adecuado y bajo condiciones que permiten la expresión y/o
aislamiento de la carbohidrato oxidasa. El cultivo se desarrolla en
un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y
carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la
técnica (ver, p. ej., M.V. Arbige et al., en Abraham L.
Sonenshein, James A. Hoch, y Richard Losick, editors, Bacillus
subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, American
Society For Microbiology, Washington, D.C., 1993, páginas
871-895). Unos medios adecuados están disponibles
por proveedores comerciales o pueden ser preparados según
composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type
Culture Collection). Si la carbohidrato oxidasa está segregada en
el medio nutritivo, la carbohidrato oxidasa puede ser recuperada
directamente del medio. Si la carbohidrato oxidasa no es segregada,
se recupera de lisatos celulares.
La carbohidrato oxidasa puede ser detectada
usando métodos conocidos en la técnica que son específicos del
polipéptido. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de
anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, o
la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, un ensayo
enzimático puede ser usado para determinar la actividad del
polipéptido.
La carbohidrato oxidasa resultante puede ser
recuperada por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la
carbohidrato oxidasa puede ser recuperada del medio nutritivo por
procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a,
centrifugado, filtración, extracción, pulverización en seco,
evaporación, o precipitación.
La carbohidrato oxidasa de la presente invención
puede ser purificada por una variedad de procedimientos conocidos
en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (p.
ej., de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, de
cromatoenfoque, y de exclusión de tamaño), procedimientos
electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio (IEF),
solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico),
o extracción (ver, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson and
Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989).
Premezcla:
- 7.2 mM de ácido 3-dimetilaminobenzoico (DMAB)
- 0.33 mM de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazono (MBT)
- 4 mg/ml de peroxidasa de Coprinus cinereus recombinante (rCiP)
- 0.4M/0.4M de tampón Fosfato/Citrato (pH 6)
Mezcla de incubación:
- 180 \mul 500 mM de glucosa 25 mM de citrato 25 mM de fosfato pH 6.0
- 20 \mul de Muestra.
La mezcla de incubación permite su incubación
durante 20 minutos a 30ºC. Luego 100 ml de la mezcla de incubación
y 100 ml de premezcla son mezclados juntos. Después de 30 segundos,
la absorbencia a 540 (o 490) nm es leída. Se incluye un estándar de
0.2 mM de H_{2}O_{2}.
Se realizan los ensayos en placas de
microtitración de 96 pocillos. 100 \mul de fosfato/citrato 0.1 M,
pH 6 son mezclados con 50 \mul de glucosa 0.24 M y 50 \mul de
premezcla (3 mM de 4-aminoantipirina (4AA), 7 mM de
N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina
(TOPS), 40 PODU/ml rCiP) y la reacción es iniciada añadiendo 40
\mul de solución de oxidasa diluida de forma adecuada. Se mide la
absorción a 490 nm como tiempo de función usando la placa de
microtitración Vmax preparada por Molecular Devices y la actividad
es tomada como la vertiente del aumento lineal en la absorción.
Una cepa de M. nivale, CBS 100236, fue
fermentada usando el medio completo siguiente:
| Medio de matraz de agitación: | BA |
| Rofec (Roquette) | 10 gramos |
| NH_{4}NO_{3} (Merck) | 10 gramos |
| KH_{2}PO_{4} (Merck) | 10 gramos |
| Solcafloc (Dicacel) | 40 gramos |
| MgSO_{4} - 7(H_{2}O) | 0.75 gramos |
| Plurónico 100% (BASF) | 0.1 ml |
| Agua corriente para un volumen final de 1000 ml. |
El pH fue ajustado a pH 6.5, luego se añadió 1
pastilla de 500 mg de CaCO_{3}. Cien ml del medio completo fueron
añadidos a cada matraz de agitación de 500 ml con 2 deflectores.
Los frascos de agitación fueron luego sometidos a autoclave durante
40 min. a 121ºC. Un inóculo fue preparado a partir de una
suspensión de esporas preparada a partir 5 cultivos inclinados de
PDA, que se desarrolló durante 7 días a 26ºC, luego se lavó en 20 ml
agua estéril y Tween 80 (ICI). Cada frasco de agitación fue
inoculado con 2 ml de la suspensión de esporas, luego cultivado
durante 10 días a 26ºC y con agitación constante a 125 rpm. Al
final del cultivo, las células fueron comprimidas, y la enzima fue
purificada del sobrenadante.
De una fermentación de 5 litros, 4300 ml de caldo
de fermentación centrifugado fue filtrado y concentrado a 660 ml
por ultrafiltración usando un filtro con un límite de peso
molecular de 10 kDa (Filtron). La enzima fue precipitada con
(NH_{4})_{2}SO_{4} entre 200 y 400 mg/ml. Después de
disolver el precipitado en 25 mM de Tris pH 7.5 la muestra fue
lavada por ultrafiltración hasta que la conductividad fue igual a
25 mM de Tris pH 7.5. La muestra fue pasada por una columna de 300
ml de Q-Sepharose XL (Pharmacia) equilibrada en el
mismo tampón y el producto filtrado fue recogido. Después de añadir
(NH_{4})_{2}SO_{4} a 100 mg/ml la muestra fue pasada
por una columna HIC (Toyopearl-butyl 650)
(TosoHaas) equilibrada con 25 mM de Tris pH 7.5; 100 mg de
(NH_{4})_{2}SO_{4} /ml. El producto filtrado fue lavado
con 25 mM de un tampón de acetato pH 5.0 y aplicado a una columna
de SP-Sepharose (Pharmacia) equilibrado en el mismo
tampón. La enzima ligada fue eluida usando un gradiente de sal
lineal a 1 M de NaCl en 25 mM de tampón de acetato pH 5.0 por 10
volúmenes de columna. Se agruparon las fracciones activas. El pulido
final de la preparación fue realizado por cromatografía de HIC en
una columna de fenil-superosa, usando un tampón de
25 mM de tampón acetato pH 5.0 con un gradiente lineal que varía de
2 M de (NH_{4})_{2}SO_{4} a 0 M por 20 volúmenes de
columna. Las fracciones activas fueron agrupadas y dializadas contra
25 mM de un tampón acetato pH 5.0 durante 24
horas.
horas.
El análisis de la proteína purificada por
SDS-PAGE indicó un peso molecular de
aproximadamente 52 kDa y un \mul de alrededor de 8.9 por
isoelectroenfoque.
La oxidasa purificada de M.nivale también
mostró un color amarillo fuerte, que sugiere la presencia de FAD
como cofactor. Un barrido de absorbencia de la enzima reveló dos
máximas de absorción, a 385 y 440 nm, característica de la
presencia de FAD en la enzima. En presencia de glucosa, el valor
máximo a 440 nm desapareció, indicando una reducción del FAD.
Una preparación altamente purificada de M.
nivale fue reducida y alquilada. Una muestra de la enzima fue
luego degradada con Lisil-endopeptidasa (Wako) o
TPCK-tripsina (Promega). Los péptidos fueron
aislados por RP-HPLC en una columna Vydac 218TP
(Vydac) en TFA (trifluoroacetato)/isopropanol y repurificados en
una columna Vydac 218TP en TFA/acetonitrilo. Los péptidos
seleccionados fueron analizados por degradación de Edman. La
secuencia N-terminal fue determinada por
secuenciación de la enzima purificada electrotransferida a una
membrana de PVDF.
Las secuencias parciales obtenidas fueron una
secuencia N-terminal mostrada en las posiciones
1-24 de ID SEC No: 2 y secuencias internas como se
muestra en las posiciones 229-266,
249-271, 303-322,
336-347, 383-404,
405-414, 420-440 de ID SEC No: 2.
Ninguna de las secuencias de la carbohidrato oxidasa mostró
homología a cualquier secuencia pertinente cuando se buscó en las
bases de datos Swissprot y EMBL.
Unos cultivos inclinados de agar de micelios de
Microdochium nivale (NN008551, CBS 100236) fueron enjuagados
con 10 ml de Tween 20 estéril al 0.008%. Un volumen de 2 ml de la
solución micelial fue inoculada en un frasco de agitación de 250 ml
que contenía 50 ml de un medio de MY50 pH 6.0. El medio de MY50 pH
6.0 se compuso por litro de 50 g de maltodextrina, 2 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 10 g de KH_{2}PO_{4}, 2 g de
K_{2}SO_{4}, 2 g de ácido cítrico, 10 g de extracto de
levadura, 2 g de urea, y 0.5 ml de oligoelementos de AMG. La
solución de oligoelementos de AMG fue compuesta por litro de 14.3 g
de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2.5 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O,
0.5 g de NiCl_{2}\cdot6H_{2}O, 13.8 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 8.5 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, y 3
g de ácido cítrico. El frasco de agitación fue incubado a 26ºC,
125 rpm durante 6 días.
Los micelios del cultivo de 6 días fueron
recogidos mediante un Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA),
enjuagados dos veces con aproximadamente 50 ml de 10 mM de
Tris-1 mM de EDTA pH 8.0 (TE), y escurridos hasta
secarse. Los micelios fueron luego congelados en nitrógeno líquido
y molidos hasta un polvo fino en un molinillo de café eléctrico
preenfriado con hielo seco. Una muestra del polvo de 2 g fue
transferida a un tubo cónico desechable estéril de 50 ml y un
volumen de 20 ml de tampón de tisis (100 mM de EDTA, 10 mM de Tris,
1% de Triton X-100, 500 mM de
guanidina-HCl, 200 mM de NaCl, pH 8.0) fue añadido
lentamente seguido de 20 \mug de RNasa A sin ADNsa por ml. La
mezcla fue incubada a 37ºC durante 30 minutos. Se añadió a
continuación proteinasa K a 0.8 mg por ml y la mezcla fue incubada
a 50ºC durante 2 horas adicionales. La mezcla lisada fue
centrifugada a 12-15,000 x g durante 20 minutos
hasta granular los fragmentos insolubles.
El sobrenadante lisado fue transferido a una
columna Qiagen-tip 500 Maxi (Qiagen, Santa Clarita,
CA) preequilibrada con 10 ml de tampón QBT (Qiagen, Santa Clarita,
CA) y la columna fue lavada con 30 ml de tampón QC (Qiagen, Santa
Clarita, CA). El ADN fue eluido con 15 ml de tampón QF (Qiagen,
Santa Clarita, CA) y 7 volúmenes de isopropanol esterilizado
filtrado fueron añadidos a la solución de ADN eluida. La solución
fue mezclada suavemente y luego centrifugada durante 20 minutos a
15,000 x g hasta granular el ADN. El ADN granulado fue lavado con 5
ml de hielo-frío 70% etanol, secado al aire, y
resuspendido en 500 \mul de TE.
Los datos de la secuencia de aminoácidos primaria
de los fragmentos N-terminal e internos de la
carbohidrato oxidasa purificada de Microdochium nivale
descrita en el ejemplo 2 fue usada para crear los siguientes
cebadores de la PCR degenerados para amplificar el gen de
carbohidrato oxidasa del ADN genómico de Microdochium nivale
preparado en el ejemplo 3:
Cebador delantero (secuencia peptídica
N-terminal): GCIGCIGGIGTICCIATHGAYAT (ID SEC
NO:3)
Cebador inverso (secuencia peptídica interna):
IGGRTCIGCRTARTTDATRTACAT (ID SEC NO:4)
La amplificación fue realizada usando el equipo
Hot Wax Optistart™ (Invitrogen, San Diego, CA) según las
instrucciones del fabricante. Seis reacciones fueron preparadas las
cuales diferían entre sí por el pH y la concentración de Mg^{2+}
según se muestra abajo en la tabla siguiente:
| 1.5 mM de MgCl_{2} | 2.5 mM de MgCl_{2} | 3.5 mM de MgCl_{2} | |
| pH 8.5 | reacción 1 | reacción 2 | reacción 3 |
| pH 9 | reacción 4 | ||
| pH 9.5 | reacción 5 | ||
| pH 10 | reacción 6 |
Las reacciones de amplificación (50 \mul)
contenían 1.62 \mug de ADN genómico de Microdochium nivale
como molde, 50 \mumol de cada cebador, 1x Tampón PCR, 5\mul de
una mezcla de dNTP del 0 mM, y un gránulo de HotWax™ Mg^{2+} que
contenía la cantidad apropiada de Mg^{2+}. Las reacciones fueron
cicladas en un variador térmico Perkin Elmer 480 programado como
sigue: Ciclo 1 a 94ºC durante 2.5 minutos y 72ºC durante 2 minutos;
ciclos 2-37 cada uno a 94ºC durante 45 segundos,
50ºC durante 45 segundos, y 72ºC durante 2 minutos; y ciclo 38 a
94ºC durante 45 segundos, 50ºC durante 45 segundos, y 72ºC durante
10 minutos. El ciclo 39 fue un ciclo de remojo a 4ºC.
Un volumen de 9 \mul de cada reacción fue
sometido a electroforesis en un gel de agarosa al 1% usando un
tampón 50 mM de Tris-50 mM de ácido
bórico-1 mM de EDTA (TBE). Las reacciones 4, 5, y 6
revelaron una banda más grande a 1335 bp. Las reacciones 4, 5, y 6,
fueron agrupadas y sometidas a electroforesis en un gel de agarosa
al 1% como antes. La banda 1335 bp fue cortada del gel y purificada
usando un Qiaex II Gel Extraction Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA).
El producto de la PCR purificado de 1335 bp fue luego clonado en
pCR2.1-TOPO (Invitrogen, San Diego, CA) y
transformado en células TOP10 de Escherichia coli
(Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante.
El ADN del plásmido fue aislado de los transformantes usando un
Wizard Maxi Prep kit (Promega, Madison, WI). El ADN del plásmido
aislado fue secuenciado usando un Secuenciador de ADN Biosystems
Prism 377 y un programa 377XL de recogida y de análisis (Perkin
Elmer, Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones
del fabricante. Los datos de la secuencia confirmaron que el
fragmento de 1335 bp codificó parte del gen de carbohidrato oxidasa
de Microdochium nivale.
Una muestra del ADN genómico preparada en el
ejemplo 3 fue analizada por hibridación Southern (Maniatis et
al., 1982, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). Aproximadamente 3
\mug del ADN genómico fueron digeridos con EcoRl, Kpnl, Notl,
Sacl, Sphl, o Xbal (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y
fraccionados por tamaños en un gel de agarosa usando un tampón de
TBE al 0.6%. El gel fue fotografiado bajo luz UV de corta longitud
de onda y puesto a remojo durante 30 minutos en 0.5 M de
NaOH-1.5 M de NaCl seguido de 15 minutos en 1 M de
Tris-HCl pH 8-1.5 M de NaCl. El ADN
del gel fue transferido a una membrana de hibridación Hybond N
(Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) por transferencia
capilar en 20X SSPE (3 M de cloruro de sodio-0.2 M
de fosfato dibásico de sodio-0.02 M de EDTA de
disodio) usando el método Turbo Blot (Schleicher and Schuell,
Keene, New Hampshire). La membrana fue reticulada con UV (UV
Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, CA) y luego puesta a
remojo durante 2 horas en el tampón de hibridación siguiente a 45ºC
con agitación suave: 5X SSPE, 50% de formamida (v/v), 0.3% de SDS, y
200 \mug/ml de ADN de testículos de salmón desnaturalizado y
cortado.
El fragmento de 1335 bp descrito en el ejemplo 4,
que contenía parte de la secuencia de codificación de la
carbohidrato oxidasa de Microdochium nivale, fue
radiomarcada por cebado aleatorio (Prime it II, Stratagene, La
Jolla, CA) con \alpha[^{32}P]dCTP (Amersham,
Arlington Heights, IL). El fragmento marcado
\alpha[^{32}P]dCTP fue añadido al tampón de
hibridación con una actividad de aproximadamente 1 x 10^{6} cpm
por ml de tampón. La mezcla fue incubada con la membrana durante
toda la noche a 45ºC en un baño maría agitado. Tras la incubación,
la membrana fue lavada tres veces durante quince minutos cada vez
en 2X SSC (0.3 M de NaCl, 30 mM de citrato sódico pH 7.0) con 0.2%
de SDS a 45ºC. La membrana fue secada en una toalla de papel
durante 15 minutos, luego envuelta con un cubrimiento de plástico,
y expuesta a una película radiográfica durante tres horas a -70ºC
con filtros intensificadores (Kodak, Rochester, NY).
El Southern Blot mostró la presencia de una banda
de 3 kb en la pista que contenía el producto digerido Sacl. Puesto
que el producto digerido Sacl produjo un tamaño de banda pequeño
suficiente para la amplificación y lo bastante grande para contener
el gen entero, se usó para aislar el gen completo por PCR
inversa.
La PCR Inversa fue usada para obtener el 5' y 3'
del ADN flanqueante del fragmento de 1335 pb para aislar la
secuencia de codificación entera del gen de carbohidrato oxidasa de
Microdochium nivale. Una muestra de 6 \mug de ADN
genómico de Microdochium nivale (Ejemplo 3) fue digerida
hasta completarse con Sacl y luego fue purificada usando el
QlAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA) según
las instrucciones del fabricante. Una muestra de 1 \mug del ADN
digerido purificado fue auto-ligado durante toda la
noche a 14-16ºC con 10 unidades de T4 Ligasa
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y un tampón IX ligasa en un
volumen final de 500 \mul. La ligasa fue luego inactivada por
calor incubando la reacción a 65ºC durante 15 minutos. La reacción
fue concentrada usando un Microcon 30 (Millipore, Bedford, MA). Los
productos reactivos fueron purificados usando el QlAquick
Nucleotide Removal Kit. Los productos auto-ligados
fueron luego usados como un molde para la PCR inversa.
Los cebadores siguientes fueron creados en los
extremos 5' y 3' del gen de carbohidrato oxidasa, en la dirección
opuesta a la PCR convencional, para la amplificación fuera de la
región conocida del producto de PCR de 1335 pb:
Superior 1199 pb: TCCAGTTCTACGACCGCTACG (ID SEC
NO:5)
Inferior 158 pb: CAGACTTGGCAGAGACCTTGA (ID SEC
NO:6)
La reacción de amplificación (100 \mul)
contenía 100 pmoles de cada cebador, 1 \mug del Sacl digerido y
ADN genómico auto-ligado, 10 \mul de una mezcla
de dNTP de 10 mM, tampón 1x Taq polimerasa (Perkin Elmer, Foster
City, CA), y 5 unidades de Taq polimerasa (Perkin Elmer, Foster
City, CA). Aceite mineral estéril fue estratificado sobre de la
reacción y colocado en un variador térmico Perkin Elmer Modelo 480
programado como sigue: Ciclo 1 a 94ºC durante 2.5 minutos y 72ºC
durante 2 minutos; ciclos 2-11 cada a 94ºC durante
30 segundos, 55ºC durante 45 segundos, y 72ºC durante 2 minutos;
ciclos 12-28 cada uno a 94ºC durante 30 segundos,
55ºC durante 45 segundos, y 72ºC durante 2 minutos con una
extensión de 20 segundos por ciclo; y ciclo 29 a 72ºC durante 10
minutos. El ciclo 30 fue un ciclo de remojo de 4ºC.
La reacción fue sometida a electroforesis en un
gel de agarosa al 1% usando un tampón TBE que reveló una banda de 3
kb. La banda de 3 kb fue cortada del gel y purificada usando un
Qiaex II Gel Extraction Kit. El producto de la PCR purificado de 3
kb fue luego clonado en pCR2.1-TOPO y transformado
en células TOP10 de Escherichia coli para generar
pEJG40/TOP10 de Escherichia coli. El pEJG40/TOP10
transformante de E. coli fue depositado según el Tratado de
Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de
Patentes, del 12 de Junio, 1998 en el Agricultural Research Service
Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL, y
denominado NRRL B-30034.
El ADN del plásmido fue aislado del transformante
usando un Wizard Maxi Prep Kit. El ADN del plásmido aislado fue
ordenado usando un Secuenciador de ADN Applied Biosystems Prism 377
y un programa de recogida y análisis 377XL según la técnica de
primer walking con la química de Dye Terminator (Giesecke et
al., 1992, Journal of Virol. Métodos 38: 47-60).
Además de los cebadores lac-delantero y
lac-inverso, se usaron los cebadores de
secuenciación de oligonucleótidos siguientes para la
secuenciación:
Cebadores de secuenciación para el fragmento de
1335 pb:
- IACRTCRAARTARTARTCIACRAARTT (SEC ID NO:7)
- RTTIACCCAICCRTC (SEC ID NO:8)
- IGGRTCIGCRTARTTDATRTACAT (SEC ID NO:9)
- DATRAARTCIACRTGRTCRAARTT (SEC ID NO:10)
- CCAYTGYTCIGGIGTICCRTARTA (SEC ID NO:11)
- CTCGCCACTTTCCCTGCTCCC (SEC ID NO:12)
- CTCGGTCACCAAGGCTCTCCC (SEC ID NO:13)
- GACCGCTACGACAACAACCAG (SEC ID NO:14)
Cebadores de secuenciación para el producto de la
PCR Inversa:
- TCGGAGAAATGAGAGCAACCA (SEC ID NO:15)
- AGCCGACGTCCAGCATAGCAG (SEC ID NO:16)
- ACCCTACCATACGAGTTCACG (SEC ID NO:17)
- GGTCGAATCGTCACAAAGTAT (SEC ID NO:18)
- CACTGGACTGCCGACTGGATG (SEC ID NO:19)
- CAACAACCAGACCTACCC (SEC ID NO:20)
- CTCAGCAGCACTTCTTTTCAT (SEC ID NO:21).
La secuenciación reveló una secuencia de ácidos
nucleicos con un marco de lectura abierto (ORF) de 1448 pb (ID SEC
NO:1) que contenía un intrón de 65 pb. El contenido G+C de este ORF
es del 58.33%. La posición 3 del inicio traduccional es una adenina
que concuerda con las reglas de Kozak en que la posición 3 es
siempre una adenina. Un motivo de TATA putativo está también
presente en -122, TATAAA.
La secuencia de aminoácidos deducida (ID SEC
NO:2) demostró una proteína de 495 aminoácidos con un peso
molecular calculado de 54,678 daltons. Basado en las reglas de Van
Heijne (Van Heijne, 1984, Journal of Molecular Biology 173:
243-251), los primeros 18 aminoácidos posiblemente
comprenden un péptido señal secretor que dirige el polipéptido
naciente en el retículo endoplásmico. Se obtuvo una puntuación de
30.395 usando el programa de van Heijne para predecir péptidos
señal. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos parciales
derivados de los fragmentos de carbohidrato oxidasa purificados de
Microdochium nivale (Ejemplo 2) coincidían con los
encontrados en la secuencia de aminoácidos deducida a excepción de
que pueda haber un protopéptido de cuatro aminoácidos en el que la
secuencia de aminoácidos N-terminal no siga
inmediatamente al péptido señal.
Dos cebadores de oligonucleótidos sintéticos
mostrados abajo fueron sintetizados para amplificar por PCR el gen
de carbohidrato oxidasa de ADN genómico de Microdochium
nivale para la subclonación y expresión en células huéspedes de
Fusarium y Aspergillus. Con el objetivo de facilitar
la subclonación del fragmento genético en los vectores de expresión
pDM181 y pBANE15, los sitios de restricción enzimática Swal y Pact
fueron introducidos en el extremo 5' y 3' del gen de
carboxipeptidasa, respectivamente.
Cebador delantero:
5'-GATTTAAATATGCGTTCTGCATTTATCTTG-3' (SEC ID
NO:22)
Cebador inverso:
5'-GTTAATTAATTATTTGACAGGGCGGACAGC-3' (SEC ID
NO:23)
Las letras en negrita (en las posiciones
10-30 de cada uno) representan la secuencia de
codificación.
Se realizó la PCR, la purificación, y la
subclonación como se describe en el ejemplo 4 excepto los
parámetros de oscilación que variaron como sigue: Ciclo 1 a 94ºC
durante 2 minutos, 60ºC durante 4 segundos, y 72ºC durante 45
segundos; ciclos 2-37 cada uno a 94ºC durante 45
segundos, 60ºC durante 45 segundos, y 72ºC durante 2 minutos; y
ciclo 38 a 94ºC durante 45 segundos, 60ºC durante 45 segundos, y
72ºC durante 6 minutos. El ciclo 39 fue un ciclo de remojo a
4ºC.
El vector pDM181 contiene el promotor y
terminador de proteasa de tipo tripsina de Fusarium
oxysporum como secuencias reguladoras y el gen bar de
Streptomyces hygroscopicus como un marcador que se puede
seleccionar para realizar transformaciones micóticas (WO 98/20136;
de Block et al., 1987, EMBO Journal 6:
2513-2518). El vector pBANE15 (Figura 1) contiene el
promotor TAKA y terminador AMG y el gen amdS de Aspergillus
nidulans como marcador seleccionable para realizar
transformaciones micóticas. Ambos vectores también contienen el gen
amp para la selección en E. coli.
El clon de carbohidrato oxidasa obtenido arriba
fue digerido con Swal y Pacl y purificado por
electroforesis en gel de agarosa al 0.8% usando un tampón TBE y un
Qiaex II Gel Extraction Kit. El fragmento digerido fue clonado en
pDM181 y pBANE15 previamente digerido con Swal y Pacl
dando como resultado los plásmidos de expresión pEJG35 y pEJG33,
respectivamente (Figuras 2 y 3).
Los plásmidos de expresión fueron transformados
en células XL10 Gold de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA).
Los transformantes que contenían los plásmidos correctos fueron
aislados y el ADN del plásmido fue preparado usando el Wizard Maxi
Prep Kit.
El pEJG33 fue transformado en JaL142 de cepas
huéspedes de Aspergillus oryzae sin proteasa (Christensen
et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422)
y JaL228 (WO 98/12300) usando la transformación de protoplastos
(Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of
Sciences EEUU 81: 1470-1474). Cien \mul de
protoplastos (2 x 10^{6}) fueron colocados en un tubo Falcon de
14 ml con aprox. 5 \mug de pEJG33 y mezclados suavemente. Un
volumen de 250 \mul de PEG 4000 al 60% en 10 mM de
Tris-HCl pH 7.5-10 mM de CaCl_{2}
fueron añadidos y mezclados por laminación suave. El tubo fue luego
incubado a 37ºC durante 30 minutos. Tres ml de STC (1.2 M de
Sorbitol, 10 mM de Tris pH 7.5, 10 mM de CaCl_{2}) fueron
añadidos y mezclados por inversión. La solución fue luego colocada
directamente en placas Cove compuestas por litro de 342.3 g de
sacarosa, 10 ml de CsCl 1.5 M, 10 ml de Acetamida 1 M, 20 ml de una
solución salina Cove IX, y 1% de agar. La solución salina Cove 50X
fue compuesta por litro de 26 g de KCl, 26 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 76 g de KH_{2}PO_{4}, y 50 ml de
metales traza de Cove. La solución de metales traza de Cove fue
compuesta por litro de 0.04 g de NaB_{4}O_{7}\cdot10H_{2}O,
0.4 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 1.2 g de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0.7 g de MnSO_{4}\cdotH_{2}O, 0.8
g de Na_{2}MoO_{2}\cdot2H_{2}O, y 10 g de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O. Las placas fueron incubadas durante 5
días a 37ºC. Los transformantes fueron transferidos a placas del
mismo medio e incubados durante 5 días a 37ºC. Los transformantes
fueron purificados estriando las esporas y recogiendo las colonias
aisladas usando las mismas placas bajo las mismas condiciones. En
total, se recuperaron 12 transformantes JaL142 de Aspergillus
oryzae y 22 transformantes JaL228 de Aspergillus
oryzae.
Los transformantes fueron desarrollados en placas
individuales COVE como antes, y luego evaluados para la actividad
carbohidrato oxidasa usando una placa indicadora descrita por
WiHeveen et al. (1990, Applied Microbial Biotechnology 33:
683). Los huéspedes no-transformados fueron usados
como controles. Un total de 11 transformantes positivos fueron
identificados. Se realizaron grupos de esporas de cada
transformante positivo con agua desionizada estéril. Un volumen de
500 \mul de cada grupo de esporas que incluía el huésped
no-transformado fue inoculado en frascos de
agitación de 125 ml que contenían 25 ml de un medio MY50. Los
frascos de agitación fueron incubados a 37ºC, 200 rpm durante 7
días. Puesto que la carbohidrato oxidasa de Microdochium
nivale contiene FAD como cofactor, un grupo de frascos también
contenían 52 \muM de riboflavina 5'-fosfato (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO).
Las muestras de 500 \mul fueron extraídas en
los días 3, 5, y 7 de cada matraz y evaluadas para la actividad
carbohidrato oxidasa. La actividad carbohidrato oxidasa fue medida
en una placa de 96 pocillos que contenían 10 \mul de sobrenadante
seguido de la adición de 1 \mul de o-anisidina, 69
\mul de tampón de Britton y Robinson pH 6.0, 10 \mul de 1 M de
D-glucosa, y 10 \mul de peroxidasa de
Coprinus cinereus (3.76 PODU/ml), obtenida como se describe
en WO 92/16634. La actividad fue medida a 405 nm durante 10 minutos
en mOD/min. Los transformantes todos produjeron actividad
carbohidrato oxidasa detectable. La adición de riboflavina
5'-fosfato a los frascos de agitación tuvieron un
efecto menor con respecto al aumento de la actividad. Las muestras
de 20 \mul de los máximos productores de carbohidrato oxidasa
fueron realizadas en un gel al 8-16% de
tris-glicina (Novex, San Diego, CA) que confirmaron
la producción de carbohidrato oxidasa.
Los transformantes con las actividades máximas
fueron purificados de esporas distribuyendo las colonias aisladas
en nuevas placas Cove dos veces sucesivamente y luego desarrollados
de nuevo en frascos de agitación y reevaluados para la actividad
carbohidrato oxidasa como antes para confirmar la producción de la
carbohidrato oxidasa.
Las fermentaciones de JaL228 que contenía pEJG33
de Aspergillus oryzae fueron realizadas a 34ºC, pH 7,
1000-1200 rpm durante 8 días en fermentadores de
laboratorio de 2 litros que contenían un medio compuesto por
Nutriosa, extracto de levadura, (NH_{4})_{2}HPO_{4},
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, ácido cítrico, K_{2}SO_{4},
CaCl_{2}\cdotH_{2}O, y solución de metales traza. La solución
de metales traza (1000X) estaba compuesta por litro de 22 g de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 11 g de H_{3}BO_{3}, 5 g de
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 5 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1.6 g
de CoCl_{2}\cdot5H_{2}O, 1.6 g de
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}, y 50 g de Na_{4}EDTA.
Una fermentación fue completada con 2 X 10-4 M de
FMN por litro (GOX003.8) mientras que la otra no lo fue
(GOX002.8).
Las muestras de ocho días fueron evaluadas según
el modo descrito anteriormente. Los resultados mostraron la
presencia de actividad carbohidrato oxidasa en ambas
fermentaciones, pero no se detectó ninguna diferencia en la
actividad carbohidrato oxidasa entre los dos caldos de
fermentación.
pEJG35 fue introducido en la cepa
CC1-3 de Fusarium venenatum (WO 97/26330)
usando el método de Royer et al. (1995, Bio/Technology 13:
1479-1483) con BASTA™ (selección de resistencia a la
fosfinotricina). El ingrediente activo en el herbicida BASTA™ es
fosfinotricina. BASTA™ fue obtenido a partir de AgrEvo (Hoechst
Schering, Rodovre, Dinamarca) y fue extraído dos veces con
fenol:cloroformo:isoamil alcohol (25:24:1), y una vez con
cloroformo:isoamil alcohol (24:1) antes del uso. Basado en el
crecimiento en presencia de BASTA™, 14 transformantes fueron
recuperados y luego desarrollados a temperatura ambiente en placas
de agar individuales compuestas por 20 ml de un medio de Vogels 50X
(Royer et al., 1995, supra), 25 g de sacarosa, 25 g
de agar noble, y 25 mM de NaNO_{3} completado con 5 mg de BASTA™
por ml. Los transformantes fueron luego evaluados para la
producción de carbohidrato oxidasa usando una placa indicadora
descrita por WiHeveen et al., 1990, supra. Cinco
transformantes dieron positivo. Un tampón de cada transformante
positivo que incluía CC1-3 de Fusarium
venenatum no transformado como control fue inoculado en frascos
de agitación individuales de 125 ml que contenían 30 ml de un medio
M400Da completado con 0.5 g de CaCl_{2} por litro e incubado a
30ºC, durante 7 días bajo agitación a 150 rpm. El medio M400Da
estaba compuesto por litro de 50 g de maltodextrina, 2 g de
MgSO_{4}, 2 g de KH_{2}PO_{4}, 4 g de ácido cítrico, 2 g de
urea, 0.5 g de CaCl_{2}, y 1 ml de metales traza Cove. Un grupo
de frascos también contenía 52 \muM de riboflavina
5'-fosfato.
En los días 3, 5, y 7, 500 \mul de caldo de
cultivo fueron eliminados de cada matraz y centrifugados. Los
sobrenadantes fueron evaluados para la actividad carbohidrato
oxidasa según se describe en el ejemplo 8. Los transformantes todos
produjeron actividad carbohidrato oxidasa detectable. La adición de
riboflavina 5'-fosfato a los frascos de agitación no
tuvieron esencialmente ningún efecto con respecto al aumento de la
actividad. Las muestras de 20 \mul de los máximos productores de
carbohidrato oxidasa fueron realizadas en un gel de
tris-glicina al 8-16% (Novex, San
Diego, CA), que confirmó la producción de carbohidrato oxidasa. Los
máximos productores fueron purificados de las esporas en placas
Vogels/BASTA™.
Una fermentación de una cepa
CC1-3 de Fusarium venenatum que contenía
pEJG35 fue realizada a 30ºC durante 8 días en un fermentador de 2
litros que contenía un medio compuesto por litro de 20 g de
sacarosa, 2.0 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 2.0 de
KH_{2}PO_{4}, 2.0 de ácido cítrico\cdotH_{2}O, 2.0 g de
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0.5 ml de metales traza de AMG (pH
ajustado a 4.5 antes de la esterilización), y una mezcla
esterilizada filtrada compuesta por litro de 2.5 g de úrea y 30 ml
de una mezcla de vitamina de soja, que fue añadida después de la
esterilización y enfriamiento del medio. Las corrientes de
alimentación eran mezclas sometidas a autoclave discontinuo
compuestas por sacarosa y úrea.
Se evaluaron muestras de ocho días según se
describe en el ejemplo 8. Los resultados mostraron la presencia de
actividad carbohidrato oxidasa.
Los dos caldos de JaL228 de fermentación de
JAL228 de Aspergillus oryzae, GOX002.8 (1.2 l) y GOX003.8
(1.4 l), preparados según se describe en el Ejemplo 8 fueron
combinados. Los caldos combinados fueron filtrados usando papel de
filtro Whatman #2 y luego lavados y concentrados por
ultrafiltración a 512 ml usando un Concentrador en espiral de tipo
Amicon equipado con una membrana S1Y10. La medición de la actividad
carbohidrato oxidasa según se describe en el Ejemplo 8 indicó
esencialmente el 100% de recuperación de la enzima.
El concentrado fue luego cargado en una columna
de Q-sefarosa (189 ml; Pharmacia Biotech, Inc.,
Piscataway, NJ) preequilibrada con 10 mM de
Tris-HCl pH 8. La carbohidrato oxidasa fue eluida
con 2M de NaCl en 10 mM de Tris-HCl pH 8. La
medición de la actividad carbohidrato oxidasa según el modo
descrito anteriormente indicó que la mayor parte de la enzima no se
enlazó con la columna.
La fracción de paso de flujo (760 ml) de la
columna de Q-sefarosa fue ajustada a pH 5.5 y
cargada en una columna de SP-Sefarosa (176 ml;
Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) preequilibrada con 10 mM de
MES pH 5.5. La carbohidrato oxidasa fue eluida con 1 M de NaCl en
10 mM de MES pH 5.5, produciendo una preparación de carbohidrato
oxidasa con pureza aparente electroforética por
SDS-PAGE. La tabla a continuación resume la
purificación de la carbohidrato oxidasa recombinante. En total una
purificación de 14 veces con una recuperación del 31% fue
conseguida basada en el ensayo de electrodo de oxígeno siguiente.
La carbohidrato oxidasa fue medida usando un electrodo de O_{2}
Hansatech con una solución de ensayo compuesta por 0.26 ml de 10 mM
de MES pH 5.5, 30 \mul de 1.0 M de D-glucosa, y 3
\mul de carbohidrato oxidasa.
SDS-PAGE que usa un gel de
SDS-PAGE de tris-glicina Novex del
8-16% indicó que las carbohidrato oxidasas
recombinantes obtenidas según se describe en los Ejemplos 8 y 9
tenían un peso molecular de aproximadamente 55 kDa, similar a la
carbohidrato oxidasa de tipo salvaje.
Se realizó la secuenciación
N-terminal de las carbohidrato oxidasas
recombinantes en un Secuenciador Proteínico Applied Biosystems 476A
(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) con HPLC
en línea y entrega de ácido trifluoroacético (TFA) de fase líquida.
Las preparaciones de oxidasas de carbohidratos recombinantes fueron
sometidas a SDS-PAGE usando Novex al 10% de gel
Bis-Tris-SDS-PAGE
usando un tampón Novex Nupage MOPS bajo condiciones de reducción.
Los geles fueron transferidos a membranas de PVDF (Novex, San
Diego, CA) durante 2 horas a 25 voltios en un tampón 10 mM de CAPS
pH 11.0. Las membranas de PVDF fueron coloreadas en Commassie Blue
R250 al 0.1% en 40% de metanol/1% de ácido acético y las bandas
observadas fueron cortadas. Las bandas cortadas fueron secuenciadas
a partir de un cartucho de transferencia usando reactivos de
secuenciación (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster
City, CA). Se realizó la detección de aminoácidos de
feniltiohidantoina por una HPLC en línea usando un Tampón A que
contenía el 3.5% de tetrahidrofurano en agua con 18 ml del
concentrado de la Premezcla (Perkin Elmer/Applied Biosystems
Division, Foster City, CA) que contenía ácido acético, acetato
sódico, y hexanesulfonato de sodio y el Tampón B que contenía
acetonitrilo. Se recogieron los datos y se analizaron en un
Macintosh Ilsi usando el software de Análisis de Datos Applied
Biosystems 610.
La secuenciación N-terminal de
ambas bandas cortadas produjo la secuencia mostrada en las
posiciones 1-21 de ID SEC No: 2 donde la posición 6
no fue determinable pero en base a la secuencia de aminoácidos
deducida es una cisteína. Los resultados de
N-terminal coincidían con la secuencia de
aminoácidos deducida, e indicaron un tratamiento correcto por los
huéspedes de Aspergillus oryzae y Fusarium
venenatum.
En 10 mM de MES-NaCl pH 5.5, la
carbohidrato oxidasa recombinante tuvo un espectro visible por UV
típico de las flavoproteinas según lo registrado en un
espectrofotómetro Shimadzu UV160U con una cubeta de cuarzo de
1-cm. La absorbencia relativa a 280 y 450 nm fue 19,
ligeramente más grande que el valor 12 obtenido en la enzima de
tipo salvaje. El coeficiente de extinción a 280 nm fue medido por
análisis de aminoácidos y fue 1.9 g/(l x cm), mientras que el valor
predicho fue 2.1 (que incluye la aportación de una molécula FAD).
Así, resultó que cada carbohidrato oxidasa recombinante contenía
una molécula de flavina (posiblemente FAD).
Considerando que la oxidación de cada molécula de
D-glucosa fue acoplada a la reducción de un O_{2}
a H_{2}O_{2}, la actividad carbohidrato oxidasa recombinante
fue medida usando un electrodo de O_{2} Hansatech según se
describe en el ejemplo 10. La carbohidrato oxidasa recombinante
oxidó la D-glucosa (0.1 M) con una actividad
específica de 4.0 IU/A_{280} o 116 vueltas/minuto a pH 5.5 y
20ºC. Según lo evaluado por el método peroxidasa/anisidina de
Coprinus cinereus descrito en el ejemplo 8, la carbohidrato
oxidasa recombinante tuvo la misma actividad específica que la
enzima de tipo salvaje.
La especificidad del sustrato para la
carbohidrato oxidasa de M. nivale fue determinada en una
microplaca a temperatura ambiente mezclándose en el siguiente
orden:
- 50 \mul 0.4/0.4 M de tampón fosfato/citrato (pH 6)
- 50 \mul de sustrato (360 mM)
- 50 \mul 21.6 mM de ácido 3-Dimetilaminobenzoico (DMAB)
- 50 \mul 1 mM de hidrazono 3-metil-2-benzotiazolinona (MBT)
- 50 \mul 75 \mug/ml, rec. peroxidasa de Coprinus cinereus (rCiP)
- 50 \mul de carbohidrato oxidasa.
La absorbencia a 595 nm fue continuada durante al
menos 3 minutos. El aumento de la absorbencia por minuto fue
calculada y usada como una medida para la actividad relativa.
Los resultados de la actividad de oxidación de la
carbohidrato oxidasa de la presente invención en varios sustratos
mono- y disacáridos están resumidos en la tabla abajo y muestran
que la carbohidrato oxidasa puede oxidar más azúcares de reducción
y muestra actividad más alta en maltosa y celobiosa que la glucosa
monosacárida correspondiente. La enzima no tuvo actividad en
azúcares no-reducidos, como fructosa, sacarosa,
trehalosa, y
metil-b-D-glucopiranosido.
Los resultados están mostrados como especificidad de sustrato de
oxidasa de M. nivale, relativa a la actividad óptima en
D-celobiosa.
| Sustrato | % Actividad |
| D-glucosa | 69 |
| 2-Desoxi-D-glucosa | 4,2 |
| D-galactosa | 31,3 |
| D-manosa | 3,2 |
| D-xilosa | 55,6 |
| D-maltosa | 83,5 |
| D-celobiosa | "100" |
| Lactosa | 52,5. |
Otros análisis de especificidad del sustrato
revelaron que la carbohidrato oxidasa de M. nivale fue capaz
de oxidar oligosacáridos de todos grados de polimerización (DP) que
fueron evaluados, DP2 -DP5, usando las condiciones de ensayo
anteriormente descritas, excepto para cambiar la concentración de
sustrato a 0.83 mM. Además, la enzima puede hidrolizar ambas
maltodextrinas y celodextrinas donde las unidades monosacáridas
están conectadas por enlaces glucosídicos alfa-1,4
o beta-1,4, respectivamente. La carbohidrato
oxidasa hidrolizó todas las celodextrinas evaluadas igualmente y a
un nivel 10 veces superior al monosacárido. Con maltodextrinas como
sustrato, la actividad carbohidrato oxidasa fue 1^{1/2} veces más
alta para la maltohexaosa hasta casi 5 veces más alta para la
maltotetraosa que para el monosacárido. Los resultados están
resumidos en la tabla siguiente, mostrando la influencia del grado
de polimerización y tipo de enlace 1,4 en la actividad carbohidrato
oxidasa con respecto a DP 1 (D- glucosa).
| % Actividad | |||
| DP | alfa-1,4 | beta-1,4 | |
| 1 | "100" | ||
| 2 | 211 | 949 | |
| 3 | 348 | 1147 | |
| 4 | 477 | 1111 | |
| 5 | 161 | 1014 |
El análisis de la actividad de oxidación de la
carbohidrato oxidasa de M. nivale en polisacáridos reveló
que la enzima era capaz de producir actividad significante en
carboximetilcelulosa (CMC), incluso después de la eliminación de
los oligosacáridos y monosacáridos más pequeños por diálisis cuando
se evaluó bajo las condiciones de ensayo anteriormente descritas
usando una concentración del sustrato del 1%. Los resultados están
resumidos en la tabla siguiente que muestra la actividad
carbohidrato oxidasa en carboximetilcelulosa con respecto a la
D-celobiosa.
| Sustrato | % Actividad |
| D-celobiosa | "100" |
| CMC | 17.7 |
| CMC, dializado | 8.8 |
La actividad de oxidación de la carbohidrato
oxidasa de M. nivale en varios sustratos fue medida a pH 7.8
(50 mM de tampón Tris-HCl), 10 mM de sustrato. Se
incluyen unos datos similares para la carbohidrato oxidasa de
Acremonium para su comparación (según se describe en BBA
(1991) 1118, 41-47).
| Microdochium | Acremonium | |
| Maltosa | 76.1 | 100 |
| Maltotriosa | 84.9 | 94 |
(Continuación)
| Microdochium | Acremonium | |
| Maltotetraosa | 100.0 | 74 |
| Maltopentaosa | 58.6 | 46 |
| Maltohexaosa | 41.2 | 66 |
| Maltoheptaosa | 32.5 | 56 |
| Lactosa | 67.0 | 59 |
| Glucosa | 39.6 | 64 |
| Celobiosa | 65.7 | 47 |
Para demostrar que el grupo de reducción en la
posición 1 está oxidado por la carbohidrato oxidasa de M.
nivale, la oxidación de maltosa fue seguida
cromatográficamente bajo las condiciones siguientes: 125 \mul de
tampón citrato-fosfato 0.2 M, pH 6 fue añadido a
250 \mul de maltosa 10 mM y 75 \mul de agua antes de añadir 50
\mul de carbohidrato oxidasa purificada de M. nivale. La
muestra fue incubada hasta 30 minutos a 40ºC con agitación
constante. La reacción fue detenida añadiendo 100 \mul de la
muestra a 900 \mul de agua a 95ºC. 50 \mul de la mezcla de
reacción fue luego analizada por cromatografía de intercambio
aniónico (columna CarboPac PA1, Dionex) seguida de detección
amperométrica a impulsos (Dionex) en el sistema Dionex
DX-500 usando las condiciones siguientes:
| Velocidad de flujo: | 1 ml/min |
| Tampón A: | 0.1 M de NaOH (desgaseado en He) |
| Tampón B: | 0.1 M de NaOH, 0.6 mM de acetato sódico (desgaseado en He) |
| Gradiente: | 0-3 minutos, 5% de tampón B |
| 3-19 minutos, 5-30% de tampón B | |
| 19-21 minutos, 30-100% de tampón B | |
| 21-23 minutos, 100% de tampón B | |
| 23-24 minutos 100-5% de tampón B |
Las maltodextrinas estándar
(DP1-7) fueron compradas a Sigma Chemical Co. El
ácido maltobiónico fue preparado según Fitting & Putman (1952)
J. Biol. Chem. 199:573.
Usando el método anterior, la maltosa está
detectada como un valor máximo con un tiempo de retención alrededor
de 8.0 minutos, mientras que el ácido maltobiónico está detectado
como un valor máximo con un tiempo de retención de unos 13.3
minutos. Con las condiciones anteriores, el ácido maltobiónico está
generado a partir de maltosa ante la carbohidrato oxidasa de M.
nivale, puesto que un valor máximo se desarrolla alrededor de
13.3 minutos. Así, la carbohidrato oxidasa oxida el grupo del
extremo reductor libre en la maltosa. La cantidad de ácido
maltobiónico producido está presentada abajo como \muM de ácido
maltobiónico en mezcla reactiva:
| Período de incubación (minutos) | Ácido maltobiónico (\muM) |
| 0 | 0 |
| 5 | 150 |
| 10 | 370 |
| 30 | 880 |
La cinética de estado de equilibrio fue realizada
variando la concentración de los sustratos de carbohidratos y
determinando la actividad carbohidrato oxidasa mediante el ensayo
de 4AA-TOPS. La cinética simple de
Michaelis-Menten fue prevista aunque la reacción no
es un simple mecanismo de un sustrato-un producto
(E+S\leftrightarrowES\rightarrowE+P).
La cinética de estado de equilibrio para la
carbohidrato oxidasa de M. nivale fue investigada usando
algunos sustratos preferidos. Se obtuvieron unas constantes
cinéticas a partir de un gráfico Lineweaver-Burke,
considerando la cinética simple de Michaelis-Menten
(aunque ésta es una suposición más bien pobre) para obtener valores
claros "K_{m}" y "V_{max}" para varios sustratos. Los
resultados para "K_{m}" fueron:
| Glucosa: | 42 mM |
| Maltosa: | 11 mM |
| Celobiosa: | 59 mM |
La carbohidrato oxidasa muestra la actividad
máxima en celobiosa; no obstante, "K_{m}" para celobiosa es
casi 6 veces superior que para la maltosa. Asimismo "K_{m}"
para la glucosa es significativamente superior que para la maltosa,
mientras que "V_{max}" es más o menos el mismo para los dos
sustratos. Así, la preferencia previamente mostrada de la maltosa
en las concentraciones bajas de sustrato está explicada por el
valor inferior de "K_{m}" para la maltosa.
La actividad carbohidrato oxidasa de M.
nivale en un margen de pH fue determinada en microplacas a
temperatura ambiente usando el método anteriormente descrito en el
ejemplo 12, pero evaluando los tampones ajustados al pH; el pH real
fue medido en la mezcla reactiva. Los resultados siguientes
(actividad relativa a la óptima a pH 6.32) mostraron que la
carbohidrato oxidasa tenía actividad óptima a pH
5-7, y un perfil razonablemente grande de actividad
de
pH.
pH.
| pH | % actividad |
| 3.38 | 5.58 |
| 4.28 | 27.69 |
| 5.31 | 88.97 |
| 6.32 | 100.00 |
| 7.15 | 96.20 |
| 8.05 | 57.25 |
El perfil de actividad de la temperatura para la
carbohidrato oxidasa fue determinado mezclando el tampón y sustrato
en un tubo de cristal y preincubándolo a varias temperaturas
(30-80ºC) durante al menos 5 minutos:
150 ml 0.4/0.4 M de fosfato/citrato pH 6
150 ml 180 mM de maltosa
150 ml de dilución de oxidasa.
Las reacciones fueron comenzadas por adición de
oxidasa y las muestras fueron incubadas a la temperatura apropiada
en un baño termostático, preparado a. Después de 5 minutos las
muestras fueron colocadas en hielo, y la formación de
H_{2}O_{2} fue determinada añadiendo 450 \mul de
DMAB:MBTH:rCiP (1:1:1) en las concentraciones respectivas como en el
ejemplo 12 y el aumento de la absorbencia a 590 nm fue medido
después de 10 segundos en un espectrofotómetro de ordenación de
diodos HP 8452A (Hewlett-Packard). Se incluyó un
estudio ciego sin incubación. Los resultados mostrados a
continuación (relativos al óptimo a 50ºC) indican que la enzima
está activa hasta al menos 60ºC con una actividad óptima a 50ºC.
| ºC | % actividad |
| 30 | 86.28 |
| 40 | 90.98 |
| 50 | 100.00 |
| 60 | 79.95 |
| 70 | 2.27 |
Una muestra de carbohidratos de M. nivale
fue desalada en 0.1 M de MES, pH 6 usando las columnas
NAP-5 de Pharmacia. La muestra (que contenía 6.5
mg/ml de oxidasa) fue cargada en el aparato VP-DSC
(MicroCal) y una exploración lineal de 20 a 90ºC fue realizada con
una frecuencia de exploración de 90º/h.
La temperatura de desnaturalización resultó ser
de 73ºC.
La carbohidrato oxidasa de M. nivale fue
preincubada durante 10 minutos a pH 6 a temperaturas variables
antes de medir la actividad residual por el ensayo de
4AA-TOPS:
| Temp ºC: | Actividad residual %: |
| 40 | 81 |
| 50 | 78 |
| 60 | 100 |
| 70 | 19 |
| 80 | 2 |
Los resultados muestran que la enzima es estable
hasta 60ºC pero inestable a 70ºC y en adelante. Esto según el
resultado obtenido a partir de experimentos de DSC.
La carbohidrato oxidasa de M. nivale fue
incubada durante 2 horas a 40ºC a pH variable antes de medir la
actividad residual por el ensayo de 4AA-TOPS:
| pH: | Res. Act. %: |
| 3 | 2 |
| 4 | 100 |
| 5 | 95 |
| 6 | 93 |
| 7 | 99 |
| 8 | 97 |
| 9 | 93 |
Los resultados muestran que la enzima es estable
en la gama de pH 4-9 pero inestable a pH 3.
| Harina de trigo | 100% (= 10 g) |
| Agua | 58% (incluida la solución enzimática) |
| Sal | 1.5% |
| Azúcar | 1.5% |
La harina de trigo fue del tipo Meneba. La harina
estaba libre de ácido ascórbico.
La masa fue mezclada en un Micro Mezclador de 10
g (tipo NSI-33R, de National Manufacturing Co.)
durante 2:30 minutos. La carbohidrato oxidasa de M. nivale
fue añadida antes de la mezcla. Después de la mezcla, la masa
permitió estar durante 90 minutos a 32ºC y con el 85% de humedad
relativa. El gluten fue lavado de la masa con una solución del 2%
de NaCl (7 minutos en un Glutomatic 2200, Perten Instruments), y
luego centrifugado en un Gluten Index Centrifuge 2015 (Perten
Instruments) durante 1 minuto.
Se analizó la reología del gluten en un sistema
de reómetro Bohlin VOR (Bohlin Instruments), realizando un barrido
de tensión con frecuencia constante (1 Hz), para valorar la
resistencia de la masa bajo oscilación. En este método, las
propiedades viscoelásticas de la masa están divididas en dos
componentes, el módulo de almacenamiento de corte dinámico G' y el
módulo de pérdida de corte dinámico G''. La proporción de la
pérdida y los módulos de almacenamiento es numéricamente igual a la
tangente del ángulo de fase viscoelástica d. Un aumento en el módulo
de almacenamiento G' y una reducción en el ángulo de fase d indican
una masa más grande y más elástica.
| Carbohidrato oxidasa | G' | G'' | d |
| Ninguno (Referencia) | 349,5 | 166,4 | 25,46 |
| 50 U/kg harina | 397,9 | 176,3 | 23,89* |
| 100 U/kg harina | 456,3* | 193,7* | 23,02* |
| 200 U/kg harina | 523,0* | 207,4* | 21,77* |
| 500 U/kg harina | 554,7* | 207,3* | 20,49* |
| 1000 U/kg harina | 708,5* | 249,4* | 19,40* |
Los resultados muestran que el módulo de
almacenamiento G' aumenta a medida que se añade la dosis de
carbohidrato oxidasa a la masa. Con respecto al ángulo de fase d,
todas las masas tratadas con carbohidrato oxidasa son diferentes a
la de referencia, y los ángulos de fase decrecen proporcionalmente
con la cantidad de enzima añadida. Así, la carbohidrato oxidasa
aumenta el módulo elástico, y por lo tanto aumenta la elasticidad de
la masa, de forma dependiente de la dosis. Las figuras son el
promedio de tres medidas independientes. Las figuras marcadas con
un asterisco son estadísticamente significantes a partir de la
referencia por el análisis de ANOVA a un nivel de importancia del
5%.
| Receta básica: | Harina (Meneba) 12 g (º100%) |
| Agua 60% (incluida la solución enzimática) | |
| Levadura 4% | |
| Azúcar 1.5% | |
| NaCl 1.5% |
La harina estaba libre de ácido ascórbico.
Procedimiento: La masa fue mezclada en un Micro
Mezclador de 10 g (tipo NSI-33R, de National
Manufacturing Co.) durante 2^{1/2} minutos. La carbohidrato
oxidasa de M. nivale fue añadida antes de mezclarse. La
temperatura de la masa final después de mezcla fue aprox. 27ºC. La
masa fue evaluada inmediatamente después de mezclarse.
La pegajosidad de la masa y la solidez fueron
medidas empíricamente según la escala siguiente:
| Sistema de | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| puntuación | ||||||
| Solidez: | muy blanda | demasiado | blanda/buena | normal | firme | demasiado firme |
| blanda | ||||||
| Pegajosidad: | casi líquida | demasiado | pegajosa | buena | seca | demasiado seca |
| pegajosa |
La evaluación fue realizada durante dos días,
usando tres réplicas para cada dosis al día. Los datos, resumidos
en la tabla siguiente, representan la media de seis evaluaciones.
Los resultados indican que la solidez y pegajosidad de la masa
muestran la misma tendencia de un aumento dependiente de la dosis
en la capacidad de la carbohidrato oxidasa para producir una masa
con una consistencia de masa excelente. A 200 y 300 Unidades/kg,
unos panaderos expertos evaluaron la masa con una solidez excelente
y suavidad, y una consistencia muy ligera.
| Carbohidrato oxidasa | Solidez | Pegajosidad |
| Ninguna (Referencia) | 3.0 | 2.3 |
| 10 U/kg harina | 3.0 | 3.0 |
| 50 U/kg harina | 3.5 | 3.4 |
| 100 U/kg harina | 4.0 | 4.0 |
| 200 U/kg harina | 4.0 | 3.8 |
| 300 U/kg harina | 4.1 | 4.1 |
| 500 U/kg harina | 4.8 | 4.8 |
| Bromato | 4.0 | 3.5 |
Con el objetivo de evaluar la tolerancia de la
carbohidrato oxidasa de Microdochium nivale (MCO) hacia
variaciones en diferentes parámetros del tratamiento, la MCO ha
sido evaluada en una prueba de cocción a escala estándar de "masa
recta europea" (2 kg harina). En comparación con el
procedimiento de cocción estándar
(ABF-SP.1217.01/01), la masa fue sometida a presión
mediante el aumento del contenido de agua, mediante el aumento del
tiempo de mezcla, y/o mediante el aumento del tiempo de
fermentación. La prueba pretendía esclarecer si la MCO puede hacer
la masa más resistente a estos cambios. Para simular un
procedimiento de cocción realístico se evaluó la MCO en combinación
con Fungamyl Super MA (xilanasa y amilasa). La disposición se
basaba en un diseño estadístico incompleto. Comparado con un
control, que no contenía la MCO, la adición de MCO resultó en una
mejor robustez de la masa/pan. P. ej. al evaluar la condición (=
área de "pie") se puede p. ej. concluir que no se observaron
interacciones significantes entre la dosificación de MCO
(0-200 U) y un aumento de la adición de agua del
1.5% y un aumento del tiempo de mezcla de + 2 minutos.
(Formulario pasa a página
siguiente)
<110> Novo Nordisk A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CARBOHIDRATO OXIDASA Y SU USO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 5421-WO, SLK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Microdoechium nivale
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1012)..(1076)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1011)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1077)..(1553)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)..(1550)
\vskip1.000000\baselineskip
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(Secuencia pasa a página
siguiente)
\newpage
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Microdochium nivale
\vskip1.000000\baselineskip
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(Secuencia pasa a página
siguiente)
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<400> 2
\newpage
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<210> 3
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<211> 23
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador
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<220>
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<221> base_modificada
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<222> (3)
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<223> i
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<220>
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<221> base_modificada
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<222> (6)
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<223> i
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base_modificada
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<222> (9)
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<223> i
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<220>
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<221> base_modificada
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<222> (12)
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<223> i
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<220>
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<221> base_modificada
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<222> (15)
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<223> i
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcngcnggng tnccnathga yat
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base_modificada
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<222> (1)
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<223> i
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<220>
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<221> base_modificada
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<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnggrtcngcr tarttdatrt acat
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccagttcta cgaccgctac g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagacttggc agagaccttg a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnacrtcraar tartartcna craartt
\hfill27
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<210> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<220>
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<221> base_modificada
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<222> (4)
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<223> i
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
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<400> 8
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\hfill15
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 9
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\hfill24
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<210> 10
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipdatraartcn acrtgrtcra artt
\hfill24
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<210> 11
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaytgytcn ggngtnccrt arta
\hfill24
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<210> 12
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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\hskip-.1em\dddseqskipctcgccactt tccctgctcc c
\hfill21
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<210> 13
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<211> 21
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcggtcacc aaggctctcc c
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccgctacg acaacaacca g
\hfill21
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<210> 15
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskiptcggagaaat gagagcaacc a
\hfill21
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<210> 16
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipagccgacgtc cagcatagea g
\hfill21
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<210> 17
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccctaccat acgagttcac g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcgaatcg tcacaaagta t
\hfill21
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<210> 19
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<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactggactg ccgactggat g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacaaccag acctaccc
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<220>
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<400> 21
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\hskip-.1em\dddseqskipctcagcagca cttcttttca t
\hfill21
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<210> 22
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<211> 30
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<213> Secuencia Artificial
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\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<400> 23
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttaattaat tatttgacag ggcggacagc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Una carbohidrato oxidasa que es capaz de
oxidar oligosacáridos de reducción con un residuo de glucosa en el
extremo de reducción, y:
a) es el polipéptido codificado por la secuencia
de ADN que codifica la carbohidrato oxidasa clonada en el plásmido
pCR2.1-TOPO presente en Escherichia coli
NRRL B-30034, o
b) es un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia
mostrada en ID SEC No: 2.
2. La carbohidrato oxidasa según la
reivindicación 1 que se puede obtener a partir de una cepa de
M. nivale, preferiblemente la cepa de M. nivale, CBS
100236.
3. Una secuencia de ácidos nucleicos que
comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la
carbohidrato oxidasa según la reivindicación 1 o 2.
4. La secuencia de ácidos nucleicos según la
reivindicación 3 que comprende:
a) la secuencia de ADN que codifica la
carbohidrato oxidasa clonada en el plásmido
pCR2.1-TOPO presente en Escherichia coli NRRL
B-30034, o
b) una secuencia de ADN que tiene al menos el 80%
de identidad con la secuencia de ADN mostrada en las posiciones
67-1550 de ID SEC No: 1.
5. Un constructo de ácidos nucleicos que
comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación
3 o 4 operativamente enlazada a una o más secuencias de control
capaces de dirigir la expresión de la carbohidrato oxidasa en un
huésped de expresión adecuado.
6. Un vector de expresión recombinante que
comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación
5, un promotor, y señales de parada transcripcionales y
traduccionales.
7. Una célula huésped recombinante que comprende
el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 5.
8. Un método para producir una carbohidrato
oxidasa que comprende el cultivo de la célula huésped según la
reivindicación 7 bajo condiciones propicias para la expresión de la
carbohidrato oxidasa y recuperación de la carbohidrato oxidasa.
9. Uso de la carbohidrato oxidasa según la
reivindicación 1 o 2 para preparar una masa y/o un producto cocido
hecho a partir de una masa.
10. Uso de la carbohidrato oxidasa según la
reivindicación 1 o 2 para oxidar un oligosacárido con un residuo de
glucosa en el extremo de reducción en el ácido correspondiente.
11. Uso según la reivindicación 10 para producir
ácido lactobiónico a partir de lactosa.
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