ES2136595T5

ES2136595T5 - Carbonatos activos de oxidos de polialquileno para la modificacion de polipeptidos.

Info

Publication number: ES2136595T5
Application number: ES90906698T
Authority: ES
Inventors: Shmuel Zalipsky
Original assignee: Enzon Inc
Current assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-04-19
Filing date: 1990-04-19
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2010-04-19
Also published as: DE69034200T2; DE69033192D1; CA2053317C; EP0893439B1; EP0470128A1; DE69033192T2; EP0470128B2; JPH04504872A; ATE181732T1; DK0470128T4; HU903628D0; ES2247656T3; DE69034200D1; ES2136595T3; HUT64022A; AU5526690A; WO1990013540A1; EP0470128B1; DK0893439T3; CA2053317A1

Abstract

SE DESCRIBE EL CARBONATO POLI(ETILENO-GLICOL)-N-SUCINIMIDA Y SU PREPARACION. EL POLIETILENO GLICOL (PEC) SE CONVIERTE EN DERIVADOS DEL CARBONATO N-SUCCINIMIDA. ESTA FORMA DE POLIMERO REACCIONA CON LOS GRUPOS AMINO DE PROTEINAS EN BUFFERS ACUOSOS. LAS PROTEINAS MODIFICADAS TIENEN LAS PEG-CADENAS GRABADAS EN LA BASE DEL POLIPEPTIDO POR MEDIO DE ENLACES URETANO (CARBAMATE) ESTABLES, HIDROLISIS-RESISTENTES.

Description

Carbonatos activos de óxidos de polialquileno para la modificación de polipéptodos.

Estado de la técnica

La presente invención se refiere a una modificación química de polipéptidos mediante el enlace covalente de cadenas de óxido de polialquileno a una molécula de polipéptido como se describe en la solicitud de patente US Nº. 4,179,337, de Davis, et al. En "Enzymes as Drugs" de Abuchowski & Davis, Holcenberg & Roberts, eds. pp. 367-383, Juan Wiley & Sons, N.Y. (1981) se describe que tales preparaciones de polipéptidos presentan una inmunogenicidad y una antigenicidad reducidas y que además tienen una vida más larga en la corriente sanguínea en comparación con los polipéptidos padres. Estas propiedades beneficiosas de los polipéptidos modificados hacen que éstos resulten muy útiles en diversas aplicaciones terapéuticas, como la terapia enzimática.

Los grupos activos que se introducen en óxidos de polialquileno con el objetivo de enlazar posteriormente estos polímeros a proteínas debe cumplir los siguientes requisitos:

1.: Los grupos activos tienen que ser lo suficientemente reactivos como para proveer una reacción rápida con una proteína bajo condiciones normales;

2.: Los residuos liberados de los grupos activos durante el proceso de modificación no tienen que ser tóxicos y/o tienen que poderse separar rápidamente del aducto de proteína-polímero.

Para realizar el enlace covalente de polietilenoglicol (PEG) a una proteína, los grupos hidróxilos finales del polímero deben ser convertidos en primer lugar en grupos reactivos funcionales. Este proceso se denomina con frecuencia "activación" y el producto se denomina "PEG activado". En la mayoría de los casos se emplean derivados de metoxipolietilenoglicol (mPEG), cubiertos en un extremo con un grupo funcional y que reaccionan con, aminas en una molécula de proteína.

La forma más común que se emplea del PEG activado para la preparación de enzimas terapéuticas es el éster de poli(etilenoglicol)succinoil-N-hidroxisuccinimida (SS-PEG) [Abuchowski, et al. Cancer Biochem. Biophys. 7, 175-186 (1984), Esquema 1] El empleo de este polímero activado cumple los dos requisitos mencionados anteriormente. Sin embargo presenta un inconveniente mayor. El enlace del éster entre el polímero y el residuo del ácido succínico presenta una estabilidad limitada en medios acuosos [Patente US Nº. 4,670,417, Iwasaki, et al. (1987); Ulbrich, et al. Makromol. Chem. 187, 1131-1144 (1986)].

Esquema 1 Enlace convencional de PEG a una proteína que emplea SS-PEG como la forma activada del polímero

1

\newpage

Varios polietilenoglicoles que se han hecho funcionales (PEG) han sido empleados de forma efectiva en campos como la modificación de proteínas (Abuchowski & Davis, 1981, supra), en la química de péptidos [Zalipsky, et al., Int. J Peptide Protein Res.,30 740-783 (1987)] y en la preparación de conjugados con materiales biológicamente activos [Zalipsky, et al., Eur. Polym. J 19, 1177-1183 (1983) y Zalipsky y Barany, Polymer Preprints, Am Chem Soc. Div Polym. Chem.27(1),1 -2 (1986)] Los conjugados de proteína con PEG útiles en aplicaciones medicas han demostrado que garantizan, particularmente en lo que respecta a su estabilidad para la digestión proteolítica, una respuesta inmunológica reducida y tiempos de vida media más prolongados en la corriente sanguínea.

Para conseguir esto, la técnica precedente ha activado el grupo hidroxi de PEG con cloruro cianúrico y a continuación ha enlazado el compuesto resultante con proteínas (Abuchowski, et al. (1977) J. Biol Chem. 252, 3578; Abuchowski y Davis, 1981, supra). Sin embargo existen diversas desventajas en el empleo de este método, como la toxicidad del cloruro cianúrico y la reactividad no específica para aquellas proteínas que tienen grupos funcionales que no son aminos, como residuos de cisteínas o tirosinas esenciales libres.

Para poder superar estas y otras desventajas, se han introducido procedimientos alternativos, como derivados de succinimidilo succinato de PEG (SS-PEG) (Abuchowski, et al. 1984, supra, ver Esquema 1, arriba). Éste reacciona rápidamente con proteínas (30 minutos) bajo condiciones normales haciendo activos incluso los conjugados extensamente modificados, pero su uso presenta otra desventaja mayor. El enlace del éster entre el polímero y el residuo del ácido succínico presenta una estabilidad limitada en medios acuosos [U.S. Patente Nº. 4,670,417 a Iwasaki, et al. y Ulbrich, et al. Makromol Chem., 187,1131-1144 (1986)].

La formación de enlaces de uretano entre grupos aminos de una proteína y PEG supera el problema de la pérdida hidrolítica de las cadenas de polímeros [Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 11, 141-152 (1985)]. De hecho, se ha demostrado sobre derivados de PEG marcados de forma radioactiva que los enlaces de uretano son completamente estables bajo diversas condiciones fisiológicas [Larwood & Szoka J., Labeled Compounds Radiofarm.,21,603-614 (1984)]. El enlace de PEG a una proteína por medio de un derivado de carbamato fue realizado [Beauchamp, et al. Analyt. Biocem. 131, 25-33 (1983)] empleando PEG activado con carbonildiimidazol. Sin embargo, el polímero activado de esta manera no es muy reactivo y en consecuencia se necesitan largos periodos de tiempo de reacción (48 - 72 hrs a pH 8.5) para conseguir suficientes modificaciones. En consecuencia, resulta evidente que el agente activado por carbonildiimidazol no cumple el primer requisito apuntado anteriormente. Una desventaja adicional de este enfoque se encuentra en el coste relativamente elevado del carbonildiimidazol.

Se ha descrito el empleo de derivados de fenilcarbonato de PEG para la preparación de proteínas de PEG enlazadas a uretano [ver Veronese, et al. (1985), supra]. El inconveniente principal de este enfoque reside en la toxicidad de los residuos de fenol hidrófobos (p-nitrofenol o 2, 4, 5-triclorofenol) y su afinidad con las proteínas. Es evidente que este método no cumple el segundo requisito mencionado anteriormente.

La Patente U.S. Nº. 4,248,786 muestra compuestos del éster de hidroxisuccinimida y su empleo para enlazar proteínas activas biológicamente a materiales matrices de soportes líquidos o sólidos.

La Patente U. S. Nº. 4,891,430 muestra entre otras cosas un proceso para preparar carbonatos alfa-halogenados donde un terminal del carbonato es un radical N-succinimidilo, N-ftalimidilo o 1-benzotriazolilo.

La Solicitud de Patente Europea EP-A-0149520 muestra conjugados de lipasas y polialquilenoglicol. Los conjugados pueden formarse empleando uno de los diversos polímeros activados. Los grupos de succinimidilo carbonato y grupos relacionados con oxicarbonil-N-dicarboximida no han sido descritos.

En los Resúmenes de Patentes de Japón 13, Nº. 145 (C-583) [3493] se expone un método para inmovilizar las substancias derivadas de un cuerpo vivo. El método incluye la reacción de grupos aminos primarios de la sustancia derivada del cuerpo vivo con grupos funcionales introducidos en un polímero hidrófilo polifuncional, que se ha enlazado previamente a un soporte como una aminoetilcelulosa.

Cada una de las formas activadas del polímero tiene propiedades que se pueden considerar ventajosas o desventajosas, dependiendo del sistema de uso. A la luz de la multitud de aplicaciones de los polipéptidos de PEG, es deseable ampliar el arsenal de proteínas que modifican los reactivos de PEG y que se han realizado con una finalidad de uso específica.

Resumen de la invención

La presente invención provee un óxido de polialquileno que tiene la estructura

R_{1}--(O--R_{2})_{a}--(O--R_{3})_{b}-(O--R_{4})_{c}--O--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--O--R_{5}

\newpage

donde R_{1} es H, CH_{3} o un grupo de carboniloxi-N-dicarboximida; R_{2}, R_{3}, y R_{4} son independientemente seleccionados del grupo consistente en -CH_{2}CH_{2}- , -CH_{2}CH(CH_{3})- y -CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-; R_{5} es un grupo N-dicarboximida;

a es un número entero entre 1 y 1,000; b y c son cada uno un número entero entre 0 y 1,000; y la suma de a, b, y c se encuentra entre 10 y 1,000.

La presente invención también provee un proceso para preparar el compuesto que comprende la reacción de un compuesto que tiene la estructura

R_{1}--(O--R_{2})_{a}--(O--R_{3})_{b}--(O--R_{4})_{c}--O--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--X

donde R_{1} es H, CH_{3} o un grupo de carboniloxi-N-dicarboximida;

R_{2}, R_{3}, y R_{4} son independientemente seleccionados del grupo consistente en -CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2} CH(CH_{3})- y - CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-; X es un halógeno;

a es un número entero entre 1 y 1,000; b y c son cada uno un número entero entre 0 y 1,000; y la suma de a, b, y c se encuentra entre 10 y 1,000;

con una N-hidroxidicarboximida en presencia de una base.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Liberación de mPEG de los conjugados de PEG-BSA. Se incubaron soluciones de ambos tipos de conjugados de PEG-BSA (-61% de modificación) en una concentración de 4 mg/ml (por análisis de Bluret) en el tampón apropiado. A determinados intervalos de tiempo se inyectaron partes alícuotas de estas soluciones en una CLAR equipada con una columna Zorbax GF450 y con un detector de RI para cuantificar mPEG-5000.

Figura 2. Estabilidad de SS-PEG y SC-PEG a 22ºC. Condiciones experimentales: Los PEG activados fueron almacenados en forma de polvo fino en recipientes de polipropileno bien cerrados. A determinados intervalos de tiempo se analizaron muestras de cada uno de los polímeros para determinar el contenido de acilo activo.

Figura 3. Reactividad de PEG activado como función de pH. Condiciones experimentales: A un tampón de trietanolamina-borato (0,3 M, 1 ml) con el pH apropiado, se le añadió una solución controlada de NAL en agua (50 mM, 0,1 ml) seguido de una solución controlada del PEG activado apropiado en CH_{3}CN (50 mM de acilo activo, 0,1 ml). La solución resultante fue removida e incubada a 28ºC durante 1 h. Se empleó una mezcla de los mismos componentes pero dejando fuera SX-PEG como control. Se empleó la versión del análisis TNBS de Snyder, et al. [(1975) Anal. Biochem. 64, 284] para determinar el NAL que no reaccionó.

Descripción de la invención

La presente invención describe óxidos de polialquileno activados que presentan la estructura general:

R_{1}--(O--R_{2})_{a}--(O--R_{3})_{b}--(O_R_{4})_{c}--O--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--O--R_{5}

donde R_{1} es H, CH_{3} o un grupo carboniloxi-N-dicarboximida; R_{2}, R_{3}, y R_{4} son independientemente seleccionados de -CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH(CH_{3})- y - CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-; R_{5} es un grupo N-dicarboximida; a es un número entero entre 1 y 1000; b y c son cada uno un número entero entre 0 y 1000; y la suma de a, b, y c se encuentra entre 10 y 1000.

Más específicamente, la invención se refiere a la preparación y uso de un PEG activado nuevo, es decir, poli(etilenoglicol) de succinimidilo carbonato (SC-PEG) y el derivado bifuncional de PEG, es decir, poli(etilenoglicol)-bis-succinimidilo carbonato (BSC-PEG). Además, resultan posibles derivados heterobifuncionales de PEG (Zalipsky y Barany, supra); uno de los grupos finales es succinimidilo carbonato y el otro grupo final (R^{1}, ver Esquema 2, abajo) contiene un grupo reactivo funcional diferente, como un grupo carboxilo libre o una amina. Estos materiales reaccionan rápidamente con grupos aminos de proteínas para proveer un enlace de PEG a través de enlaces de uretano estables (Esquema 2, abajo). La reactividad de los agentes nuevos, SC-PEG y BSC-PEG, es comparable a la del SS-PEG que se emplea habitualmente. Así, se puede alcanzar un alto grado de modificación en condiciones normales (tampones acuosos, pH 5.8-11, preferentemente pH 7.0-9.5) dentro de un margen de cerca de 30-60 minutos y temperaturas moderadas (4-40ºC). Adicionalmente, los agentes son solubles en diversos disolventes orgánicos, resultando útiles e importantes de esta manera para el enlace de peso molecular bajo, péptidos protegidos parcialmente y otros ligantes biológicamente útiles.

El PEG no tiene por que ser de un peso molecular concreto, pero es preferible que el peso molecular se encuentre entre 500 y 40,000; más preferentemente entre 2,000 y 20,000. La elección del peso molecular de PEG se realiza en base a la naturaleza de la proteína concreta que se ha empleado, por ejemplo, el número de grupos aminos disponibles para la modificación.

La N-hidroxisuccinimida liberada durante la modificación de la proteína es un material no tóxico que se emplea a menudo en la química proteínica, especialmente para preparar aductos de proteína biológicamente activos. Como en el caso del PEG activado con carbonildiimidazol mencionado anteriormente y fenilcarbonatos de PEG, el producto de la modificación de la proteína con el empleo de SC-PEG o BSC-PEG tiene cadenas de PEG injertadas sobre la base del polipéptido a través de conexiones de carbamato (uretano). Sin embargo, debido a la elevada reactividad de los agentes nuevos, se puede alcanzar un alto grado de modificación en períodos de tiempo más breves. Una ventaja adicional del PEG activado con succinimida carbonato es que aquellos grupos funcionales activos que no reaccionan con grupos aminos de una proteína sufren una hidrólisis acuosa rápida produciendo N-hidroxisuccinimida, dióxido de carbono y PEG con terminación de hidroxi. Esto resulta particularmente importante en el caso de derivados de PEG bifuncionales (BSC-PEG). Estos materiales pueden servir para un doble objetivo: PEGilación y reticulación al mismo tiempo. El BSC-PEG, como cualquier material homobifuncional puede ser empleado para reticular dos proteínas diferentes. Cuando una molécula de BSC-PEG reacciona con una proteína por medio de sólo un grupo de los extremos, el otro grupo SC del polímero, que no reacciona con la amina, es hidrolizado y en consecuencia no se introduce ningún residuo extraño (potencialmente antígeno) en el conjugado de la proteína con PEG.

Las actividades biológicas de proteínas modificadas con SC-PEG y BSC-PEG se conservan en gran parte como se muestra a través de los ejemplos que aparecen más adelante. Hay una publicación anterior en la que la proteína (activador del plasminogen del tejido) conjugado con PEG de manera covalente por medio de enlaces de uretano presenta una actividad específica más alta que la misma proteína modificada con SS-PEG en aproximadamente la misma extensión [Berger & Pizzo, Blood, 71, 1641-1647 (1988)].

Esquema 2 Empleo de SC-PEG y BSC-PEG para el enlace de PEG en proteínas

2

Naturalmente, la utilidad de derivados de PEG activados con SC se extiende a la preparación de conjugados con PEG de péptidos de peso molecular bajo y otros materiales conteniendo grupos aminos libres.

Se desarrolló un procedimiento de cultivo único para la introducción de grupos SC en PEG (Esquema 3 abajo). Primero, se generó cloroformato de polietilenoglicol in situ mediante el tratamiento del polímero (PEG) con fosgeno. El cloroformato resultante fue hecho reaccionar a continuación con N-hidroxisuccinimida (HOSu) seguido de trietilamina (TEA) para dar los derivados activados de PEG deseados. Las preparaciones activadas del polímero fueron purificadas para eliminar los materiales de peso molecular bajó y determinadas de modo que contuvieran las cantidades teóricas de los grupos activos.

Esquema 3 Síntesis de N-succinimida carbonato derivados del poli(etilenoglicol).

3

Ejemplo 1

Preparación de SC-PEG: Se disolvió metoxipolietilenoglicol con un peso molecular de 5000 (Unión Carbide,60 g,12 mmol) en tolueno/diclorometano (3:1, 200 ml) y se trató con una solución de tolueno de fosgeno (30 ml, 57mmol) durante la noche. La solución fue evaporada hasta que se secó y el resto del fosgeno fue extraído al vacío. Se disolvió el residuo en tolueno/declorometano (2:1, 150 ml) y se trató con N- hidroxisuccinimida sólida (2,1 g, 18 mmol) seguido de trietilamina (1,7 ml, 12 mmol). Después de 3 horas, la solución fue filtrada y evaporada hasta que se secó. Se disolvió el residuo en etilacetato (600 ml) caliente (50ºC), se filtró para eliminar los restos insolubles y se enfrió para facilitar la precipitación del polímero. Se recogió el producto por filtración y a continuación se volvió a recristalizar a partir de etilacetato. El producto se secó al vacío sobre P_{2}O_{5}. El rendimiento fue de 52,5 g (85% de teoría).

Para determinar el contenido de carbonato activo del producto, se reaccionaron muestras del polímero con una cantidad medida de bencilamina en diclorometano y el exceso de amina fue valorado con ácido perclórico en dioxano. Estas valoraciones indicaban que 1 g del producto contenía 1,97 x 10^{-4} mol de carbonato activo (101% del contenido teórico). I.R. (película sobre NaCl, cm^{-1}) bandas características en: 1812 y 1789 (ambos C=O, succinimida); 1742 (C=O, carbonato); 1114 (CH_{2}OCH_{2}) ^{13}C-NMR (CDCl_{3}): \delta 168,5 (CH_{2}C=O); 151,3 (O-CO_{2}); 71,9 (CH_{3}OCH_{2}) 70,2 (PEG); 68,7 (CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 68,0 (CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 58,9 (CH_{3}O); 25,2 CH_{2}C=O) ppm.

Ejemplo 2

Preparación de BSC-PEG: Se convirtió polietilenoglicol de peso molecular 4600 (Carburo de unión, 50g, 21,7 mequiv. OH) en el correspondiente bis-N-hidroxisuccinimida carbonato empleando una solución de tolueno de fosgeno (50 ml, 96,5 mmol) y a continuación N- hidroxisuccinimida (3,8 g, 23 mmol) y trietilamina (3,2 ml, 23 mmol) siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Tras purificar el producto se obtuvo como un polvo blanco (51 g, 96%). El contenido de carbonato activo fue de 4,0 x 10-4 mollg (98% de teórico) determinado por valoraciones con ácido perclórico de bencilamina. I.R. (película sobre NaCl, cm-1) bandas características en: 1812 y 1789 (ambos C=O, succinimida); 1742 (C=O, carbonato); 1114 (CH_{2}OCH_{2}) ^{13}C-NMR (CDCl_{3}): \delta 168,5 (CH_{2}C=O); 151,3 (O-CO_{2}); 70,2 (PEG); 68,7 CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 68,0 (CH_{2}CH_{2}OCO_{2}); 25,2 (CH_{2}C=0) ppm. H-NMR (CDCl_{3}): \delta 4,35 (m, 4H, CH_{2}OCO_{2}); 3,55 (s, \sim400H, PEG); 2,74 (s, 8H, CH_{2}C=O) ppm.

Ejemplo 3

Preparación de conjugados de albúmina de suero bovino de polietilenoglicol (PEG-BSA):

A. SC-PEG (1 9) fue añadido a una solución agitada de albúmina de suero bovino (BSA) (100 mg) en 0,1 M fosfato de sodio, pH 7.8 (20 ml). Se empleó hidróxido sódico (0,5 N) para mantener el pH 7.8 durante 30 minutos. Se extrajo el exceso de PEG libre por diafiltración empleando 50 mM de salina tamponada de fosfato. La extensión de modificaciones de BSA fue aproximadamente del 50%, determinada por valoración con trinitrobencenesulfonato (TNBS) de grupos aminos [Habeeb, Analyt. Biochem. 14, 328-336 (1966)].

Se obtuvo el mismo grado de modificación cuando se repitió el experimento bajo condiciones idénticas empleando SS-PEG en lugar de SC-PEG.

B. SC-PEG(1g) fue añadido a una solución agitada de BSA (100mg) en 0,1 M de sodioborato, pH 9.2. Se empleó sodiomidroxida (0,5 N) para mantener el pH 9.2 durante 30 minutos. Se extrajo el exceso de PEG libre por diafiltración y se evaluó el producto para determinar el número de grupos aminos libres. Aproximadamente 68% (41) de los grupos aminos del BSA nativo fueron modificados.

C. BSC-PEG (1 g) fue añadido a una solución agitada de BSA (100 mg) en 0,1 M de borato de sodio, pH 9.2. Se empleó hidróxido sódico (0,5 N) para mantener el pH 9.2 durante 30 minutos. Se extrajo el exceso de PEG libre por diafiltración y se avaluó el producto para determinar el número de grupos aminos libres. Aproximadamente el 80% (48) de los grupos aminos del BSA nativo fueron modificados. El análisis del producto por CLAR (Filtración de gel) indicaba que más del 65% de PEG-BSA se encontraba en forma reticulada intermolecularmente y cerca del 35% del producto tenía el mismo peso molecular que el PEG-BSA del Ejemplo 3B.

Ejemplo 4

Preparación de PEG-glutaminasa: Una solución de Pseudomonas de glutaminasa 7A (200 mg) en 0,1 M de fosfato de sodio, pH 7.8 fue tratada con SC-PEG (4.7) g). Se agitó la solución y se mantuvo el pH 7.8 durante 30 minutos. Se extrajo el exceso de PEG libre por diafiltración empleando 50 mM de PBS.

Ejemplo 5

Preparación de PEG-Tripsina: Una solución de tripsina pancreática bovina (Boeringer-Manneim, 120 mg en 20 ml), que fue dializada durante la noche a 40ºC con 20 mM de CaCl_{2} en 1 mM de HCl, se dejó a 25ºC y se trató con SC-PEG (600 mg) durante 30 minutos. Durante este tiempo se mantuvo el pH 7.8 en el recipiente de reacción por valoración automática con 0,5 N de NaOH. La solución fue acidificada a pH 3 y extensamente diafiltrada para eliminar el exceso de polímero libre empleando 20 mM de CaCl_{2} en 1 mM de HCl como un fluido de sustitución. La tripsina modificada presentaba aproximadamente la mitad de los grupos aminos libres de la enzima madre (7 Cadenas de pEG por molécula de tripsina) determinado por valoración con TNBS de los grupos aminos (Habeeb 1966). El producto de tripsina PEG mantenía un 96% de actividad enzimática de la enzima madre hacia etiléster de Na-benzoil-L-arginina.

Ejemplo 6

Preparación de PEG-Arginasa: Una solución de arginasa de hígado bovino (Sigma, 90 mg) en 0,1 M de NaCl (20 ml) fue tratada con SC-PEG (1,3 g) a 27ºC mientras que se mantuvo el pH 8.0 por valoración automática con 0,5 N de NaOH. Después de 30 minutos se diafiltró la mezcla de reacción empleando 50 mM de PBS como un fluido de sustitución. Aproximadamente un 64% de los grupos aminos de la arginasa nativa fueron modificados (56 Cadenas de pEG por molécula de arginasa). El producto de PEG-arginasa retuvo el 70% de actividad específica de la enzima nativa al evaluarse con 2,3-butanodiona (Reactivo BUN-urea) a pH 9.5.

Ejemplo 7

Otros polipéptidos, entre los que se encuentra la quimiotripsina, asparaginasa, y deaminasa de adenosina, fueron modificados con SC-PEG empleando los procedimientos que se muestran aquí.

Los métodos de empleo de óxidos de polialquileno que se han hecho funcionales SC y/o BSC, como PEG y sus copolímeros se pueden aplicar generalmente para la preparación de otros polipéptidos modificados y otros componentes biológicamente activos que tengan grupos aminos.

Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a derivados de N-hidroxisuccinimida, resultará obvio para los expertos en la técnica que se pueden sustituir otras N-hidroxidicarboximidas. Derivados típicos de este tipo son N-hidroxiftalimida, N-hidroxiglutarimida, N- hidroxitetrahidroftalimida, N-hidroxi-5-nor-borneno-2,3-dicarboximida u otros derivados disubstituídos de hidroxilamina.

Ejemplo 8 Comparación de SC-PEG con SS-PEG

A. Como se ha visto en el Esquema 2, el producto de la modificación con proteína empleando SC-PEG tiene cadenas PEG injertadas sobre la base de polipéptido a través de enlaces de carbamato (uretano). Se esperaba que una mayor estabilidad del enlace de uretano con relación al enlace del éster producido empleando SS-PEG (ver Esquema 1) demostrara una diferencia clave entre los dos PEG activados y el correspondiente conjugado de proteína PEG. Nuestros estudios de hecho confirmaron esta esperanza. La figura 1 muestra los resultados de las medidas GF-PLC de las cantidades de mPEG libre producido como consecuencia de la incubación de conjugados de PEG-BSA derivados de cada uno de los PEG activados. Se aprecia considerablemente una mayor estabilidad del conjugado SC-PEG.

B. Para estimar las reacciones de SC-PEG y SS-PEG, se llevaron a cabo mediciones cinéticas de hidrólisis de los polímeros activados en tampón de fosfato y su aminolisis por N^{\alpha}-acetil-lisina (NAL). Los resultados de estos experimentos se encuentran resumidos en la Tabla 1. A partir de estos datos resulta claro que SS-PEG es un reactivo más reactivo que SC-PEG. La diferencia en los índices de hidrólisis fue mayor que la diferencia en los índices de aminolisis; consecuentemente, SC-PEG mostró ratios de K_{am}/K_{h} más favorables. La hidrólisis más lenta de SC-PEG también se manifestó en una estabilidad de almacenamiento superior del reactivo (Figura 2).

C. La reactividad de los PEG activados como función de pH se determinó empleando NAL como un modelo para el grupo \epsilon-amino de una proteína. Cada uno de los PEG activados fue hecho reaccionar con una cantidad equimolar de NAL con diferentes pH, y se midió el NAL que no reaccionó empleando la valoración TNBS (Figura 3). El pH óptimo para el empleo de SC-PEG se encontró que estaba cerca de 9.3. No resulta aconsejable el empleo de SS-PEG a pH>8.0, debido a la estabilidad limitada del éster de PEG-succinato. Sin embargo se descubrió que incluso a valores de pH menores de 8.0 este PEG activado era muy reactivo.

D. Ambos reactivos mostraron una reactividad elevada frente a la Tripsina que se hace comparable a la que producen los derivados de enzimas modificadas en condiciones normales (pH 7.5 - 8.5) en 30 minutos. Los productos fueron purificados por diafiltración, y los grados de modificaciones determinados por evaluación fluorométrica, según Stocks, et al. (1986) Anal. Biochem. 154, 232.

Todos derivados de tripsina modificados con PEG carecían esencialmente (<1% de nativo) de actividad proteolítica determinada por la prueba de Azocoll [Chavira, et al. (1984) Anal. Biocem.136, 446]. Las actividades específicas de las tripsinas modificadas con SS- y SC-PEG representativas hacia substratos de peso molecular bajo se encuentran resumidas en la Tabla 2. Los modificaciones apenas produjeron cambios en las actividades esterolíticas hacia el etiléster de benzoil-L-arginina, pero si que mejoró las actividades hacia las p-nitroanilidas. Las constantes cinéticas de Micaelis-Menten para diferentes tripsinas modificadas con SC- y SS-PEG fueron medidas empleando ZAPA como substrato. Estos resultados, que se encuentran resumidos en la Tabla 3, indican que, mientras que V_{max}, K_{cat}, y K_{cat} /K_{m} iban aumentando gradualmente a medida que iban decreciendo los valores de las modificaciones K_{m}.

En comparación con SS-PEG, SC-PEG es un reactivo aún menos reactivo y más selectivo. Esto se observa por sus ratios K_{am}/K_{h} más altos y un SC-PEG de mejor estabilidad de almacenamiento es un reactivo suficientemente reactivo como para producir conjugados de proteína PEG bajo condiciones normales en 30 minutos. Se puede emplear SC-PEG en un margen más amplio de pH que SS-PEG, mostrando la máxima reactividad a pH=9.3. Lo conjugados de proteína con PEG obtenidos por el empleo de SC-PEG son químicamente más estables que los conjugados derivados de SS-PEG. Los conjugados de Tripsina con PEG producidos por ambos PEGs activados presentan una propiedades muy similares: No muestran actividad proteolítica, muestran una actividad esterolítica bien preservada y una actividad aumentada espectacularmente hacia substratos de p-nitroanilida. Las constantes de Micaelis-Menten de las enzimas modificadas indican que el enlace de PEG a la tripsina produce un aumento tanto en el índice de renovación de ZAPA como en su afinidad hacia las enzimas modificadas.

TABLA 1 Comparación de las constantes de índice de primer orden para hidrólisis (K_{h}) y aminolisis (K_{am}) de SC-PEG y SS-PEG^{a}.

	Temp.	Hidrólisis: K_{h} ^{b}(min^{-1}) x 10^{3}			Aminolisis: K_{am} ^{c}(min^{-1}) x 10^{3}
pH	(ºC)	y	[t 1/2 (min)]		y [K_{am}/K_{h}]
		SC-PEG	SS-PEG	SC-PEG	SS-PEG
	4	0.87	[793]	1.84	[376]	2.64	[3.0]	3.74	[2.0]
7.0	27	6.05	[115]	10.4	[67]	26.4	[4.4]	41.4	[4.0]
	37	14.2	[49]	25.9	[27]	81.7	[5.8]	104	[4.0]

TABLA 1 (continuación)

	Temp.	Hidrólisis: K_{h} ^{b}(min^{-1}) x 10^{3}			Aminolisis: K_{am} ^{c}(min^{-1}) x 10^{3}
pH	(ºC)	y	[t 1/2 (min)]		y [K_{am}/K_{h}]
		SC-PEG	SS-PEG	SC-PEG	SS-PEG
	22	5.37	[129]	10.7	[65]	29.1	[5.4]	42.7	[4.0]
7.4	27	9.0	[77]	16.0	[43]	48.6	[5.4]	73.6	[4.6]
	37	19.3	[36]	37.6	[18]	145	[7.5]	193	[5.1]
	4	1.37	[505]	2.58	[268]	12.4	[9.1]	15.0	[5.8]
7.8	27	10.3	[67]	21.6	[32]	130	[12.6]	152	[7.0]
	37	21.	[32]	48.8	[14]	226	[10.6]	267	[5.5]
Todas las mediciones se realizaron siguiendo la apariencia del anión de la N-hidroxisuccinimida -Osu) a 260 nm
( en 0.008 M de fosfato sódico; la concentración del acilo activo de succinimidilo enlazado con PEG en tiempo
cero [SX-PEG] fue 0.1 mM; en los experimentos de aminólisis la concentración de Na etil-lisina en tiempo cero
[NAL]_{\alpha} fue 3 mM.

^{b}K_{h} = Índice_{h}/[SX-PEG]_{0}, donde Índice_{h} = dA_{260}/dt x 1 E_{260} x 1F; \sum_{260} = 8500 M^{-1} cm^{-1} es un coeficiente de extinción de -Osu; y F = [-Osu] / ([HOsu] + [ Osu)] = (1 + 10^{6\cdot0- pH})^{-1}.

^{c}K_{am} = Índice Total / [SX-PEG]_{0} - K_{h}. El indice Total en experimentos de aminólisis fue calculado de la misma manera que el Índice_{h} en los experimentos de hidrólisis.

TABLA 2 Resumen de la modificación, actividad esterolítica y actividad amidolítica datos para tipsina y sus derivados mPEG

Derivados^{a} de	Modif^{b}	BAEE^{c}	%	BAPA^{d}	%	ZAPA^{d}	%
Tripsina	(%)	(u/mg)	Nativo	(u/mg)	Nativo	(u/mg)	Nativo
Tripsina Nativa	0	92.4	100	1.26	100	7.81	100
SC-PEG_{N}-Tripsina
N = 6	42.3	103	112	2.26	179	15.3	196
N = 7	45.8	87.9	95.1	2.38	188	17.5	224
N = 9	58.8	90.1	97.5	2.67	212	18.9	242
N = 12	77.9	85.1	92.2	3.83	304	25.5	326
SS-PEG_{N}-Tripsina
N = 7	44.8	102	110	3.25	258	18.8	241
N = 12	770	94.3	102	4.34	344	24.7	316
^{a} Para SX-PEG_{h}-Tipsina, N = 15 x (% Modif)/100 y es redondeado al entero más próximo.
^{b} El porcentaje de grupos aminos modificados fue determinado por el análisis de fluorescamina [Stocks, et al.
(1986) Anal. Biochem. 154, 232].
^{c} El análisis de BAEE (éster etílico de Na-benzoil-L-arginina) fue realizado a pH 7.8, 37º con una concentración
del substrato de 0.5 mM. El coeficiente de extinción fue \varepsilon_{253} = 808 M^{-1} cm^{-1} [Kezdy, et al. (1965) Biochemistry
4,99].
^{d} Los análisis amidolíticos the BAPA (N\alpha-benzoil-D, L- arginina-p-nitroanilida) y ZAPA (N\alpha-CBZ-L-arginina-
p-nitroanilida) fueron realizados con una concentración del substrato de 1 mM en 50 mM Tris-HCl pH 8.1, 10
mM CaCl_{2}, a 37ºC. El coeficiente de extinción para la p- nitroanilina, \varepsilon_{410} = 8800 M^{-1} cm^{-1}, fue usado en ambos
análisis.

TABLA 3

Constantes Michaelis-Menten para actividad aminolitica de
tripsina nativa y sus derivados^{a} de mPEG
Derivados de
Tripsina	Km (mM)	V_{max} (\muM/min)	K_{cat} (min^{-1})	K_{cat}/K_{m} (mM^{-1} min^{-1})
Tripsina nativa	1.08	15.7	378	349
SC-PEG_{N-}
Tripsina
N = 7	0.29	19.6	470	1626
N = 9	0.21	20.2	484	2290
N = 12	0.11	22.9	549	4973
SSS-PEG_{N-}
Tripsina
N=7	0.21	18.6	447	2172
N = 12	0.13	22.5	539	4159
^{a} Las mediciones fueron realizadas a 37ºC con una concentración de proteína de Tripsina constante de
1,0 gg/ml (mediante el ensayo de Bluret). Se empleó N^{\alpha}- carbobenzoxi-L-arginina-p-nitroanilida (ZAP)
como substrato en concentraciones que variaban de 0,02 a 1,71 mM en 50 mM de tris-HCl pH 7.8 mM
de cloruro de calcio. Las constantes fueron calculadas a partir de lotes de Lineweaver-Burk de los índi-
ces iniciales de aparición de p-nitroanilina (\varepsilon_{410} =8800 M^{-1} cm^{-1}).

Claims

1. Óxido de polialquileno que presenta la estructura:

R_{1}--(O--R_{2})_{a}--(O--R_{3})_{b}--(O--R_{4})_{c} O--CO-- O--R_{5}

donde

-: R_{1} es H, CH_{3} o un grupo carboniloxi-N-dicarboximida;

-: R_{2}, R_{3} y R_{4} son independientemente seleccionados del grupo consistente en -CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH(CH_{3})- y -CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-;

-: R_{5} es un grupo N-dicarboximida;

-: a es un número entero entre 10 y 1,000;

-: b y c son cada uno un número entero entre 0 y 1,000; y

-: la suma de a, b y c se encuentra entre 10 y 1,000.

2. Óxido de polialquileno según la reivindicación 1, donde R_{1} es un grupo carboniloxi-N-dicarboximida y R_{5} es un grupo N-dicarboximida y las N- dicarboximidas de R_{1} y R_{5} son seleccionadas del grupo consistente en N-succinimida, N-ftalimida, N-glutarimida, N-tetrahidroftalimida y N-norborneno-2,3-dicarboximida.

3. Óxido de polialquileno según la reivindicación 2, donde R_{5} es un grupo N-succinimida.

4. Óxido de polialquileno según la reivindicación 1 que presenta la estructura:

4

donde R_{1} es CH_{3}.

5. Óxido de polialquileno según la reivindicación 1 que presenta la estructura:

5

\newpage

6. Proceso para preparar un óxido de polialquileno que presenta la estructura:

R_{1}--(O--R_{2})_{a}--(O--R_{3})_{b}--(O--R_{4})_{c} O--CO-- O--R_{5}

donde

-: R_{1} es H, CH_{3} o un grupo carboniloxi-N-dicarboximida;

-: R_{5} es un grupo N-dicarboximida;

-: a es un número entero entre 10 y 1,000;

-: b y c son cada uno un número entero entre 0 y 1,000; y

-: la suma de a, b y c se encuentra entre 10 y 1,000.

incluyendo la reacción de un compuesto que presenta la estructura:

R_{1}-(O-R_{2})_{a}-(O-R_{3})_{b}-(O-R_{4})_{c} O-CO-X

donde

-: R_{1} es H, CH_{3} o un grupo carboniloxi-N-dicarboximida;

-: R_{2}, R_{3} y R_{4} son independientemente seleccionados del grupo consistente en

-CH_{2}CH_{2}-, -CH_{2}CH(CH_{3})- y -CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}-;

-: X es un halógeno;

-: a es un número entero entre 10 y 1,000;

-: b y c son cada uno un número entero entre 0 y 1,000; y

-: la suma de a, b y c se encuentra entre 10 y 1,000. con una N-hidroxidicarboximida en presencia de una base.

7. Proceso según la reivindicación 6, donde dicha N-hidroxidicarboximida es N-hidroxisuccinimida.

8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, donde dicha base es trietilamina.

9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, donde R_{1} es un grupo carboniloxi-N-dicarboximida.