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EP3818181A1 - Procede et dispositif pour la detection et differenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes par oligochromatographie - Google Patents

Procede et dispositif pour la detection et differenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes par oligochromatographie

Info

Publication number
EP3818181A1
EP3818181A1 EP19734437.7A EP19734437A EP3818181A1 EP 3818181 A1 EP3818181 A1 EP 3818181A1 EP 19734437 A EP19734437 A EP 19734437A EP 3818181 A1 EP3818181 A1 EP 3818181A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hybridization
amplification
nucleotide
sequences
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19734437.7A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Laetitia AVRAIN
Florence NAZÉ
Pascal Mertens
Olivia LEFÈVRE
Thierry Leclipteux
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Coris Bioconcept SPRL
Original Assignee
Coris Bioconcept SPRL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Coris Bioconcept SPRL filed Critical Coris Bioconcept SPRL
Publication of EP3818181A1 publication Critical patent/EP3818181A1/fr
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection and differentiation of point mutations in microorganisms, in particular a bacterium, comprising a step of amplification of one or more DNA targets, whether or not preceded by a step of transcription inverse of one or more RNA, and followed by a step of detection by oligochromatography of the amplified products and of differentiation (or discrimination) of point mutations (mutations by substitution, insertion or deletion of nucleic bases).
  • Point mutations or (mono) nucleotide polymorphisms, can be responsible for pathologies in living beings or even allow certain microorganisms to adapt to an unfavorable environment, as in the case of the appearance of resistance to anti-infective agents.
  • nucleotide polymorphisms that is to say to detect the insertion or deletion of a nucleotide base, as well as the substitution of a "wild" type nucleotide base by another nucleotide base (mutated), capable, possibly, of conferring a new phenotype.
  • polymorphic variants or subpopulations can also coexist in a single individual. For example, some bacteria resistant to antibiotics coexist with sensitive bacteria. The detection of these different sub-populations can have consequences on the severity of the disease or on the choice of treatment to be administered to the patient.
  • nucleotide polymorphisms in a coding sequence one of the major difficulties is to be able not only to identify the region or the position in the genome of the mutated nucleic base, but also, in the case of coding regions, to determine specifically the amino acid modified by the point mutation. Indeed, a single position of the genome can present different nucleotide polymorphisms, generating where appropriate the synthesis of different amino acids. In some cases, the response to the severity of the pathology or the sensitivity or resistance to the anti-infective agent is dependent on the amino acid synthesized. It is therefore essential to be able to identify the modified nucleotide base with respect to the wild-type coding sequence.
  • This method allows both the multiplex amplification of targets and the specific detection of point mutations within at least nine mutational positions on each amplified target nucleotide sequence (also called amplicon) from a single sample of nucleic acids.
  • This method allows in particular:
  • nucleotide probes complementary to the mutated target nucleotide sequences capture probes immobilized on an oligochromatography support
  • Another advantage of the method of the invention is its speed, since it can be executed quickly, in less than 90 minutes, preferably in less than 60 minutes, or even in preferred conditions in less than 30 minutes.
  • the hybridization and washing steps of the invention are carried out in 20 minutes or less.
  • An additional advantage of the method according to the invention is its simplicity, since it can easily be carried out in a maximum of 2 stages, preferably in a single stage.
  • this method represents a diagnostic tool for (mono) nucleotide polymorphisms in the medical field and more particularly in that of infectious diseases and antibiotic resistance.
  • the present invention relates to a method of detection and differentiation by oligochromatography of at least one point mutation in the genome of a microorganism, preferably a bacterium, present in a biological sample comprising the following steps:
  • a- amplification of at least one target nucleotide sequence said target nucleotide sequence being capable of carrying a point mutation, that is to say of presenting, at a given position, the deletion of a nucleotide, the substitution of this nucleotide with another nucleotide or the insertion of a nucleotide just before or just after said position;
  • step b detection by oligochromatography, among the amplified target nucleotide sequences obtained in step a) of wild-type nucleotide sequences or carriers of a point mutation, by a hybridization carried out at a hybridization temperature of at least 55 ° C., preferably between 55 and 80 ° C, said target nucleotide sequences amplified with several capture probes which contain 18 to 35 bases immobilized on a membrane, one of these capture probes being complementary and specific to part of the sequence wild-type nucleotide, each of the others being complementary and specific to a part of nucleotide sequence comprising at least one point mutation, and the detection of the amplified target nucleotide sequences hybridized on the capture probes.
  • oligochromatography it is understood within the meaning of the present invention a method of detection and differentiation of nucleic acids present in a liquid by migration of this liquid by capillary action in an appropriate support, called oligochromatographic support, to allow their hybridization to specific capture probes immobilized on the oligochromatographic support and therefore allow their separation from the liquid.
  • an oligochromatographic support has the capacity to spontaneously transport a fluid by capillary action. Oligochromatography must therefore be considered, in the context of the present invention, as being a method of dynamic transport of the liquid, preferably a method of lateral flow.
  • the support is preferably a porous membrane.
  • the oligochromatography technique offers several advantages such as simplicity and speed of production, unlike certain techniques known in the state of the art such as detection by "microarray” which may require numerous steps as well only specialized and expensive equipment.
  • the transposition of a method carried out on a microarray type chip to an oligochromatographic support is not easy, however, as the techniques are different.
  • a method for detecting viruses or bacteria by oligochromatography is known from document WO2004099438A1.
  • the method according to this document does not allow precise identification of the position or the mutated nucleotide base, unlike the method according to the present invention which makes it possible to detect and identify point mutations, especially to differentiate and d '' identify different point mutations at the same position.
  • hybridization temperature of at least 55 ° C. and capture probes which contain from 18 to 35 bases makes it possible to carry out the hybridization without the use a specific hybridization buffer.
  • hybridization according to the method of the invention can be carried out directly from the PCR product in its amplification buffer (solution comprising the amplified target nucleotide sequences obtained in step a)).
  • the membrane can be deposited on a rigid structural support, preferably a rigid structural support of the tab type, in order to maintain it and facilitate its handling.
  • the rigid structural support preferably the rod, comprises a lower absorbent which is present upstream of the membrane relative to the direction of migration by capillarity of the PCR product and corresponds to a region d application where the PCR product obtained in step a) of the method is deposited.
  • the rigid structural support preferably the rod, comprises an upper absorbent which is present downstream of the membrane relative to the direction of migration by capillarity of the PCR product and corresponds to a region harvest where the part of the PCR product not captured in step b) of the method is recovered.
  • the membrane is considered to be the detection region, that is to say the region where the capture probes are immobilized.
  • the membrane can be of different natures; it may for example be a nitrocellulose, cellulose, cellulose acetate, nylon, acrylic and nylon copolymer membrane.
  • the membrane is a nitrocellulose membrane.
  • the support comprises a micro-pillar network.
  • the hybridization is carried out using the same buffer as that obtained during the amplification of step a) of the method according to the invention.
  • the amplification and the hybridization are carried out in the same buffer, also called, in the context of the present invention, the amplification buffer.
  • the method according to the present invention comprises:
  • a- amplification of at least one target nucleotide sequence in an amplification buffer said target nucleotide sequence being capable of carrying one or more point mutation (s), that is to say of presenting, at one or more given position (s), the deletion of a nucleotide, the substitution of this nucleotide by another nucleotide or the insertion of a nucleotide just before or just after said position;
  • the determination of a hybridization temperature of at least 55 ° C. allows nucleotide discrimination via the temperature, which makes the use of a specific hybridization buffer unnecessary.
  • the hybridization temperatures specifically disclosed are 42 ° C and 37 ° C, respectively. According to these prior documents, at least two successive washings must be carried out after the hybridization step in a specific hybridization buffer to ensure the specificity of the hybridization of a capture probe.
  • the hybridization of step b) is carried out in the amplification buffer of step a) at a temperature of at least 55 ° C.
  • the biological sample consists of nucleic acids extracted from biological samples (humans, animals, plants, etc.); it may in particular consist of a sample extracted from an animal or from an individual such as a mammal, more particularly from a human, or from a food composition.
  • the biological sample is preferably lysed in a chemical lysis buffer or by thermal lysis or by mechanical lysis or by enzymatic lysis before being extracted by manual or automated extraction methods generally combining two to three of the following steps such as retention or separation by affinity on a chromatographic column or magnetic beads, chemical precipitation, centrifugation ...
  • the target nucleotide sequences can be DNA sequences, in particular single-stranded or double-stranded or partially double-stranded DNA sequences, as well as cDNA sequences obtained by reverse transcription of RNA sequences.
  • the method according to the invention can comprise an optional step, prior to step a), corresponding to the reverse transcription of the RNA contained in the sample.
  • the amplified target sequences have a size of between 50 and 200 bases, in particular from 70 to 150 bases.
  • Step a) of amplification can be carried out by any method known to those skilled in the art; more particularly, it can be carried out by PCR or by isothermal amplification, in particular by the LAMP (Loop-Mediated Amplification) method (Notomi et al., Nucleic acid Res., 2000, 28, e63) or RPA (Recombinase Polymerase Amplification) (Piepenburg et al., PLOS Biol., 2006, 4 (7 ), e204) or NASBA (Nucleic Acid sequence-based amplification) (Guatelli et al., PNAS, 1990, 87 (5), 1874-1878).
  • LAMP Loop-Mediated Amplification
  • RPA Recombinase Polymerase Amplification
  • NASBA Nucleic Acid sequence-based amplification
  • MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
  • the amplification step is carried out by PCR.
  • the reaction mixture for amplification also called the amplification buffer, can contain several reagents such as a buffer, enzymes, deoxynucleotides triphosphates (dNTPs), additives, and in particular several pairs of primers for the simultaneous amplification of multiple sequences in a single sample.
  • a buffer such as a buffer, enzymes, deoxynucleotides triphosphates (dNTPs), additives, and in particular several pairs of primers for the simultaneous amplification of multiple sequences in a single sample.
  • dNTPs deoxynucleotides triphosphates
  • the two stages of reverse transcription and amplification by PCR can be carried out either in closed reaction tubes, inserted in a programmable instrument which heats and cools a stationary reaction chamber (such as a thermocycler), or in a microfluidic device with single use in which the reaction mixture circulates on static zones each having a defined temperature.
  • reverse transcription is performed at a single temperature before successive heating and cooling cycles allow targets to be multiplied (amplified) by PCR reaction.
  • these steps are carried out in continuous flow in a microfluidic system as described in European Patent EP 2 870 260 or in patent application EP 3 075 451.
  • nucleotide sequences used as primers for the amplification preferably by PCR, is made according to the target nucleotide sequence (s) to be amplified and detected.
  • the selection of these primers is within the reach of those skilled in the art, as well as their possible labeling with elements such as metallic particles, preferably gold particles, colloids, polystyrene particles, colored particles. , (para) -magnetic particles or fluorescent elements or any other marker allowing detection.
  • the amplified target nucleotide sequence can be labeled, directly or indirectly, with different detection markers, preferably fluorophores (or fluorescent elements) or nanoparticles such as colloidal gold.
  • the amplicon can be labeled (i) either from the amplification stage by the use of an amplification primer marked with a fluorophore ( Figure IA), (ii) or after resuspension of a probe fluorescent or a probe coupled to a colloidal gold conjugate ( Figure IB) deposited at the region application of the oligochromatography support, the sequence of which is different from the sequence of the immobilized capture probe and complementary to part of the amplified target nucleotide sequence, (iii) either by the incorporation of a primer marked with a hapten (for example DIG, DNP or FAM) and the resuspension of the receptor for this hapten, a receptor itself coupled to a detection marker ( Figure IC).
  • a hapten for example DIG, DNP
  • the marker is a fluorescent marker, preferably consisting of cyanine (Cy5) or of a marker having similar fluorescent properties.
  • Markers having different types of staining or different wavelengths of fluorescence can be used for the labeling of the amplified target nucleotide sequences so as to facilitate their simultaneous or consecutive detection on the support, each color being specific for a sequence or a group of amplified target nucleotide sequences initially present in the test sample, their colorimetric detection can thus be obtained by means known to those skilled in the art.
  • the number of different nucleotide sequences which can be detected by the method according to the invention can be adapted according to the needs of the application.
  • the method of the invention is modular and makes it possible to adapt the number of capture probes present on the oligochromatographic support according to the number of target nucleotide sequences to be detected.
  • between about 2 sequences and about 50 target nucleotide sequences preferably between about 4 sequences and about 40 target nucleotide sequences are amplified and detected in the same sample.
  • 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 target sequences are amplified and detected in the same sample.
  • the capture probes used to detect by hybridization the target nucleotide sequences amplified in step a), have a length of between 18 and 35 bases, preferably between 20 and 32 bases. Their sequence is defined according to the region in which the point mutation is sought.
  • the capture probes according to the invention have a size of 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 or 35 bases.
  • the capture probes can be formed from purine, pyrimidine, degenerate, universal, or LNA (lock nucleic acid), ANA (altritol nucleic acid), HNA (hexitol nucleic acid), etc. nucleotide bases. nucleic acid type PNA (peptide nucleic acid) but which can be paired with nucleotide sequences or combinations of these different types of bases.
  • the melting temperature (Tm) of the capture probes is between 68 and 80 ° C, preferably between 70 and 78 ° C.
  • the melting temperature is also well known as the melting temperature.
  • the Tm of the capture probes is calculated according to the “Nearest-neighbor two-state” model.
  • the capture probes may be entirely specific for a target sequence or contain, in addition to the sequence defined according to the region in which the point mutation is sought (for example in addition to their 18 to 35 bases), spacers (“ spacers ”) of nucleotide or chemical nature.
  • the nucleotide type spacer is a sequence of at least 2 T (thymine), preferably between 5T and 8T, and the chemical type spacer is a carbon type chain of at least 3 carbons and a maximum of 12 carbons.
  • the capture probes are immobilized on the support, preferably on an oligochromatography membrane, allowing the capture or the hybridization of the amplified target nucleotide sequences.
  • the capture probes specific to each point mutation, whether or not starting with a spacer, are immobilized on the support, preferably on an oligochromatography membrane in the form of points ("spotted") ( Figure 2), in particular via covalent bonds or via a carrier molecule to facilitate attachment to the support and accessibility of the probe.
  • the carrier molecule is added to the nucleotide sequence of the probe, regardless of the presence of the spacer. This fixation can be direct or indirect; in the latter case, the capture probe is coupled to a first molecule, such as biotin, itself fixed on the membrane by a second complementary protein molecule, such as avidin, streptavidin or derived molecules.
  • the membrane whether or not held on the rigid support, may be in the form of a strip.
  • a strip according to the invention can be dipped in a reaction tube or placed in a microfluidic system.
  • a strip according to the invention has a length of 40 to 60 mm and a width of 4 to 10 mm. More particularly, a strip according to the invention has a length of 57 mm and a width of 5 mm.
  • the support can also be a microfluidic detection chip made of a cycloolefin polymer.
  • the hybridization temperature is at least 56 ° C, preferably at least 57 ° C, preferably at least 58 ° C, even more preferably at least minus 59 ° C, even more preferably at least 60 ° C.
  • the hybridization temperature is at least 60 ° C, preferably between 60 ° C and 80 ° C, preferably between 60 ° C and 73 ° C, again more preferably between 62 ° C and 73 ° C.
  • the hybridization temperature is between 67 ° C and 73 ° C.
  • the different steps of the method according to the invention can be carried out either in a single microfluidic device, or in tubes. closed reactions then requiring a detection step, separate from the amplification, on the oligochromatographic support.
  • the method is implemented in a microfluidic device, as described in European Patent EP 2 870 260 and shown in Figure 3; this microfluidic device is inserted into dedicated equipment allowing the temperatures of reverse transcription, PCR and detection to be managed.
  • the flow of the reaction mixture is conditioned by a peristaltic pump and the detection zone is read using a camera.
  • Software for analyzing the signals observed makes it possible to differentiate the (mono) nucleotide polymorphisms.
  • the method according to the invention is carried out using reaction tubes which are inserted into a thermocycler allowing the possible RT-PCR and PCR to be carried out.
  • the amplified target nucleotide sequences are then detected after migration on the oligochromatographic support, on which the capture probes are immobilized. Reading the optical zone and analyzing the signals are then carried out using a reader and analysis software.
  • the hybridization is followed by washing with a migration buffer.
  • a migration buffer In particular, after the step of capturing the target nucleic acid sequences amplified by hybridization with the immobilized capture probes, the oligochromatographic support is washed with a buffered solution aimed at eliminating the primers marked in excess and the aspecific hybridizations.
  • the buffered solution can be introduced either at the level of the buffer reservoir in the microfluidic device as described in ( Figure 3, reference 12), or at the bottom of a tube in the case of vertical oligochromatography.
  • the terms “migration buffer” and “buffered wash solution” are used interchangeably. Buffered solution refers to buffered washing solution unless expressly stated otherwise.
  • the migration buffer is different from the amplification buffer.
  • the migration buffer is a phosphate-based buffer supplemented with TRIS, with salts (KCI and MgCI 2 ) and with saturants (casein hydrolyzate and threalose).
  • the solution buffer is introduced into the buffer reservoir of the microfluidic device ( Figure 3, reference 12)
  • the buffered solution is subjected to the temperatures first of the reverse transcription, of the PCR, then of the hybridization at the level of the oligochromatographic device.
  • the tube containing the buffered washing solution is heated to the temperature allowing hybridization between the nucleotide probes immobilized on the oligochromatography device and the amplified nucleotide sequences.
  • the support is washed with the buffered solution, for example for 5, 10, 15, 20 or 30 minutes, or when the dedicated equipment establishes the best signal / background noise ratio at each probe spot. nucleotide.
  • the detection zone is exposed to the light source of dedicated equipment or a microscope in order to detect and quantify the signal either of a fluorescent marker or of a detectable element in the visible light spectra such as colloidal gold beads.
  • the exposure time is adapted to the method used, for example, it can be between 1 and 5000 ms, in particular between 50 ms and 1500 ms.
  • the signal intensities are measured at each position (“spot”) where a nucleotide capture probe is immobilized on the oligochromatographic device; this is the specific signal, and around each position it is the background noise.
  • this equipment positions an analysis grid allowing the automatic quantification of the light signal for each spot and for the background noise signal around each spot.
  • the signal strength is higher when the probe recognizes its homologous sequence in the amplicon.
  • the amplicon is wild type, the wild probe will be brighter. For example, if in the wild sequence the nucleotide in position X is G then it is the spot with the probe carrying a C complementary to the G in position X which will be brighter.
  • the amplicon is of the mutated type, the mutated probe will be brighter. For example, if in the mutated sequence the nucleotide in position X is replaced by a T (G> T) then it is the spot with the probe carrying an A at position X which will be brighter.
  • an analysis algorithm facilitates the interpretation of the results.
  • the point mutation to be detected is likely to be present in the genome of a microorganism, in particular a bacterium or a virus.
  • the method is intended to detect a point mutation in the bacterial genome of Mycobacterium tuberculosis.
  • the method is intended to detect a point mutation in the viral genome of the genus Enterovirus.
  • bacterial genome means the bacterial chromosome and the natural bacterial plasmids.
  • a point mutation represents a deletion, insertion or substitution of a nucleotide in a codon of the bacterial genome which can lead to the expression of a protein having an amino acid modified compared to the wild-type sequence of this protein.
  • the wild sequence of a gene or a protein is that present mainly in nature.
  • the method according to the invention allows the detection of a point mutation associated with resistance to an antibiotic.
  • the antibiotic can be chosen from the following families: beta-lactams, glycopeptides, aminoglycosides, macrolides, phenicolics, cyclins, fusidic acids, oxazolidinones, quinolones, sulfonamides and trimethoprim, nitrated products ( nitrofurans and nitroimidazoles), anti-tuberculosis drugs in particular, it may be a point mutation associated with resistance in Mycobacterium tuberculosis to rifampicin, isoniazid, pyrazinamide, ethanbutol and fluoroquinolones ...
  • Resistance to first-line antibiotics can result from a point mutation localized in the gene: for example in the rpoB gene for resistance to rifampicin, or in the katG, inhA or kasA gene for resistance to isoniazid.
  • the point mutation is localized in the rpoB gene (gene for the subunit b of RNA polymerase).
  • Table 1 presents a list of capture probes targeting different mutational positions within the rpoB gene in M. tuberculosis.
  • Table 1 Sequences of the probes targeting wild and mutated genotypes detected at the level of the rpoB gene. The numbering in italics is linked to the first numbering of the codons in function of the Escherichia coli genome. The numbering in bold is linked to the new codon nomenclature, based on the genome of Mycobacterium tuberculosis.
  • the point mutation is localized in the katG gene (heme-containing enzyme catalase-peroxidase), in the kasA gene (3-oxoacyl-ACP synthase) or in the promoter region of the inhA gene (enoyl-acyl carrier protein reductase gene).
  • table 2 presents a list of capture probes targeting different mutational positions within the katG and inhA genes in M. tuberculosis.
  • Table 2 Sequences of the probes targeting wild and mutated genotypes detected at the level of the katG and inhA genes.
  • the method according to the invention allows the detection of mononucleic polymorphisms within the genus Enterovirus and thus allows grouping at the diagnostic level, in particular for a simultaneous diagnosis of Enteroviruses and Rhinoviruses (species belonging to the genus Enterovirus).
  • the present invention also relates to an oligochromatographic support on which specific capture probes are immobilized.
  • the oligochromatographic support and the capture probes are as defined above.
  • said support comprises a capture probe complementary and specific to the wild sequence of the target region and at least one capture probe complementary and specific to the mutated sequence of the target region.
  • the present invention also relates to a microfluidic device comprising the oligochromatographic support according to the invention.
  • the microfluidic device is as described in European Patent EP 2 870 260.
  • the present invention finally relates to a reagent kit comprising at least primers for amplification of a target region and the oligochromatographic support according to the invention.
  • Figure 1 Schematic representation of amplicon hybridization and amplicon labeling systems.
  • Figure 2 Schematic representation of capture probes immobilized on the oligochromatographic support: checkerboard of 40 spots and example of 4 capture probes including the one with the wild genotype; probe 1 has a mutation in position 5 (G> C), probe 2 has a mutation in position 5 (G> T) and probe 3 has a mutation in position 4 (A> G).
  • Figure 3 Microfluidic device described in European Patent EP 2 870 260.
  • Figure 4 Histogram illustrating the detection of a strain of Mycobacterium tuberculosis mutated in position 526 and wild for positions 511-512-513; 516; 522; 529; 531; 533 at the level of the rpoB gene.
  • Figure 5 Histogram illustrating the detection of a strain of Mycobacterium tuberculosis mutated at position 315 at the level of the katG gene.
  • Figure 6 Histogram illustrating the specific detection of Enterovirus and Rhinovirus species.
  • rifampicin resistance to rifampicin is due to one or more (mono) nucleotide polymorphisms in the rpoB gene (gene for the subunit b of RNA polymerase, target of rifampicin in Mycobacterium tuberculosis).
  • the amplicon_l has 9 mutational positions and the amplicon_2 has a single mutational position. From 2 to 6 sequence variants are detected for each of the positions (Table 1).
  • the target regions of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis are amplified by PCR, followed by detection on an oligochromatographic support, in the microfluidic device as described in patent application EP 3075451.
  • the buffer tank (12) is filled with a volume of buffered washing solution which can range from 50 to 80 ⁇ L.
  • the reaction mixture tank (11) is filled with a volume of 10 to 20 ⁇ l of reaction mixture containing the sample and the amplification reagents, and, if appropriate, reverse transcription.
  • Closing of the device the microfluidic device is hermetically closed by a pump head (Patent application EP 3075451).
  • the device is inserted into appropriate dedicated equipment allowing the steps of reverse transcription, PCR amplification, hybridization of the amplification products to the probes immobilized on the oligochromatography device and washing of the reading area with buffered washing solution.
  • the composition of the amplification buffer is as follows: Titanium®Taq DNA polymerase kit (Takara) containing IX Titanium Taq PCR Buffer and 1.25X Titanium taq DNA polymerase, supplemented with 1.5 mM MgCl2, dNTPs 0, 8 mM, BSA 0.6 mg / mL, PEG, 1.5%, Betaine IM, DMSO 5% and the four primers for amplifying amplicons 1 and 2.
  • the PCR product (amplified DNA) present in the amplification buffer will reach the region of application (lower absorbent) of the oligochromatographic strip.
  • the liquid (amplification buffer comprising the PCR product) will then migrate through this absorbent and reach the nitrocellulose membrane at the level of which the capture probes are deposited.
  • the PCR product present in the amplification buffer will migrate entirely by capillarity in the membrane.
  • the membrane is then washed with the washing / migration buffer which will follow the same path as the PCR product at the microfluidic chip.
  • the hybridization and washing steps have a total duration of approximately 20 minutes and the total reaction time (amplification + hybridization + washing) is between 60 and 75 minutes. Hybridization takes place at a temperature of 71 ° C.
  • the device is managed by dedicated equipment allowing the management of the flow of the liquid in the channel of the microfluidic device via an active pumping system and the management of the temperature of at least two, and up to 5, heating zones under the reaction mixture tank, amplification chamber and PCR channel and a heating zone under the detection rod.
  • the results are interpreted by the dedicated equipment analysis software.
  • the identification of the wild or mutated character of each position of interest is carried out by the analysis of the fluorescence values between probes hybridizing at the same positions.
  • amino acids For example, for position 526/445 of the rpoB gene, 6 amino acids have been identified in natural variants: histidine (H) in the wild sequence, aspartate (D), asparagine (N), tyrosine (Y), leucine (L) or arginine (R) in mutated variants. Each of these amino acid changes is due to a mutation in the corresponding codon.
  • the amplification product hybridizes to each of these 6 probes and the signal intensity is measured.
  • the signal is related to the average of the signals of the 5 other probes.
  • the signal ratios thus calculated make it possible to identify the genotype at the position considered: the probe for which a signal ratio greater than the pre-determined cut-off value (for example the value 2) is obtained corresponds to the sequence present in the 'sample.
  • the genotype is wild for positions 511-512-513-522-529-531 and 533 (identified by a ratio greater than 2, dark gray histogram bars) and the genotype is mutated H526Y (black bar) for position 526 (nomenclature of F. coli) ( Figure 4).
  • the light gray bars represent the ratio obtained for each of the probes which correspond to the wild-type H526 and to the mutants not detected. ( Figure 4).
  • the amino acid change is identified.
  • the histidine at position 526 is replaced by a tyrosine; amino acids at other positions are wild type.
  • This method also makes it possible to detect mixtures of strains or variants.
  • the protocol for the reverse transcription, amplification, hybridization and washing steps can be transposed from example 1.
  • the hybridization and washing steps have a total duration of approximately 20 minutes and the total reaction time (amplification + hybridization + washing) is between 60 and 75 minutes.
  • Hybridization takes place at a temperature of 71 ° C.
  • a target sequence of 85 nucleotides was therefore selected at the level of the katG gene and a sequence of 123 nucleotides was selected at the level of the inhA gene (Table 4).
  • inhA gene the different mutational positions are found in the promoter region of the gene. A mutation at this level therefore does not induce the formation of a new amino acid but the overexpression of the gene which will lead to resistance to isoniazid.
  • the target regions of the katG gene and of the promoter region of the inhA gene of Mycobacterium tuberculosis are amplified separately by PCR, followed by detection on an oligochromatographic support in the microfluidic device, as described in the previous example .
  • the results are interpreted by the dedicated equipment analysis software.
  • the mutational position 315 can present 4 different amino acids: the serine (S) which corresponds to the wild sequence, threonine (T), found in two of the mutated sequences, asparagine ( N) and isoleucine (I). Each of these amino acid changes is due to a mutation in the corresponding codon.
  • S serine
  • N threonine
  • I isoleucine
  • the amplification product hybridizes to each of these 5 probes and the signal strength is measured. For each probe, the signal is related to the average of the signals of the 4 other probes.
  • the signal ratios thus calculated allow the genotype to be identified at the position considered: the probe for which a signal ratio greater than a predetermined cut-off is obtained corresponds to the sequence present in the sample.
  • the genotype for position 315 is mutated S315N (nomenclature of F. coli).
  • the light gray bars represent the ratio obtained for each of the probes which correspond to undetected wild and mutant genotypes ( Figure 5).
  • the amino acid change is identified.
  • the serine is replaced by an asparagine.
  • the protocol for the reverse transcription, amplification, hybridization and washing steps can be transposed from example 1.
  • the hybridization and washing steps have a total duration of approximately 20 minutes and the total reaction time (amplification + hybridization + washing) is between 60 and 75 minutes.
  • Hybridization takes place at a temperature between 50 ° C and 66 ° C.
  • the detection of (mono) nucleotide polymorphisms was evaluated on genetic material mimicking sequences of the genus Enterovirus.
  • the genus Enterovirus includes 12 species including 9 Enteroviruses (A to H and J) and 3 Rhinoviruses (A to C). Some Enteroviruses cause respiratory symptoms, similar to Rhinoviruses. This clinical similarity, as well as their belonging to the same phylogenetic group, allows grouping at the diagnostic level. A conserved region within this Enterovirus genus was therefore selected for a simultaneous diagnosis of Enteroviruses / Rhinoviruses. Two subspecies, enterovirus A and Rhinovirus C were then selected to demonstrate the differentiation of two sequences with only a G / A difference basis (Table 5).
  • the target sequences of these two subspecies were detected specifically by tube oligochromathography after being amplified by PCR.

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Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de détection et de différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes, en particulier une bactérie, comprenant une étape d'amplification d'une ou plusieurs cibles d'ADN, précédée ou non d'une étape de transcription inverse d'un ou plusieurs ARN, et suivie d'une étape de détection par oligochromatographie des produits amplifiés et de différenciation (ou discrimination) de mutations ponctuelles (mutations par substitution, insertion ou délétion de bases nucléiques).

Description

Procédé et dispositif pour la détection et différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes par oligochromatographie
Domaine technique
La présente invention se rapporte à une méthode de détection et de différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes, en particulier une bactérie, comprenant une étape d'amplification d'une ou plusieurs cibles d'ADN, précédée ou non d’une étape de transcription inverse d'un ou plusieurs ARN, et suivie d'une étape de détection par oligochromatographie des produits amplifiés et de différenciation (ou discrimination) de mutations ponctuelles (mutations par substitution, insertion ou délétion de bases nucléiques).
Arrière-plan technologique
Les mutations ponctuelles, ou polymorphismes (mono)nucléotidiques, peuvent être responsables de pathologies chez les êtres vivants ou encore permettre à certains micro organismes de s'adapter à un environnement défavorable, comme dans le cas de l'apparition d'une résistance à des agents anti-infectieux.
Les techniques disponibles actuellement permettent difficilement d'identifier rapidement plusieurs polymorphismes nucléotidiques c'est-à-dire de détecter l'insertion ou la délétion d'une base nucléotidique, de même que la substitution d'une base nucléotidique de type "sauvage" par une autre base nucléotidique (mutée), capables, éventuellement, de conférer un nouveau phénotype.
Plusieurs variants ou sous-populations polymorphiques peuvent également coexister chez un seul individu. Par exemple, certaines bactéries résistantes aux antibiotiques coexistent avec des bactéries sensibles. La détection de ces différentes sous-populations peut avoir des conséquences sur la gravité de la maladie ou encore sur le choix du traitement à administrer au patient.
Dans le cas de polymorphismes nucléotidiques dans une séquence codante, l'une des difficultés majeures est de pouvoir non seulement identifier la région ou la position dans le génome de la base nucléique mutée, mais également, dans le cas de régions codantes, de déterminer spécifiquement l'acide aminé modifié par la mutation ponctuelle. En effet, une seule et même position du génome peut présenter différents polymorphismes nucléotidiques, engendrant le cas échéant la synthèse d'acides aminés différents. Dans certains cas, la réponse à la gravité de la pathologie ou la sensibilité ou la résistance à l'agent anti-infectieux est dépendante de l'acide-aminé synthétisé. Il est donc primordial de pouvoir identifier la base nucléotidique modifiée par rapport à la séquence codante sauvage.
A l'heure actuelle, il existe plusieurs technologies pouvant être utilisées pour la détection et la caractérisation d'une mutation ponctuelle. Par exemple, on peut notamment citer :
- Les techniques de PCR « molecular beacons » ou « Taqman » permettant d'identifier les polymorphismes nucléotidiques par l'hybridation de sondes « beacons » ou « Taqman » spécifiques à la région d’intérêt après amplification de la séquence cible par PCR. Cependant, certaines sondes peuvent couvrir plusieurs positions mutationnelles ce qui ne permet pas d'identifier spécifiquement la base nucléotidique mutée et par conséquent le nouvel acide aminé formé (dans le cas d’un gène codant). L'autre limitation de cette technique est le recours à des fluorophores différents pour le marquage des sondes spécifiques. Les appareils de PCR en temps réel permettant la quantification des fluorophores sont limités à 4, voire 5, canaux de fluorescence, ce qui limite le nombre de mutations détectées par réaction PCR.
- La PCR avec agent intercalant suivie d'une analyse par High Resolution Melting (HRM). L'amplification de la cible est réalisée en présence d'un intercalant de l'ADN, puis une courbe de dissociation des doubles brins d'ADN est réalisée sous l'effet de températures croissantes. Les liaisons entre les bases G-C étant plus fortes que pour une liaison A-T, cette technique peut permettre de discriminer des acides nucléiques sauvages, d'acides nucléiques hétérozygotes (mutation sur un seul des deux brins d'ADN), d'acides nucléiques homozygotes (mutation sur les deux brins d'ADN), mais ne permet de détecter qu'une seule mutation par réaction PCR et doit être préférentiellement comparée au signal obtenu pour une séquence sauvage.
- Les techniques de digital PCR permettent d'augmenter significativement la sensibilité de détection de mutants au sein d'une large population sauvage. Elles permettent ainsi d'affiner le diagnostic, voire même de faire du pronostic. Comme décrit pour les techniques de PCR, les instruments de lecture de la fluorescence sont limités à la détection de 4 ou 5 variants par échantillon ce qui nécessite soit la multiplication des essais pour un même échantillon soit la limitation en terme de mutations détectées.
- Le séquençage de Sanger et le séquençage à haut débit. Toutefois, ces méthodes nécessitent des équipements coûteux ainsi que des temps de préparation et d'analyses relativement longs pouvant aller d'une dizaine d'heures à une dizaine de jours.
Les documents US2010/0261163A1 et EP1076099A2 divulguent des méthodes de type « microarray » pour identifier des mutations ponctuelles dans le génome de Mycobacterium tuberculosis. Les méthodes selon ces documents sont basées sur l'hybridation complémentaire d'une séquence nucléotidique, précédemment amplifiée par PCR et marquée par fluorescence, avec plusieurs sondes de capture immobilisées sur une puce, appelée puce « microarray », chaque sonde de capture étant immobilisée sous la forme d'un point. Ces documents divulguent plusieurs sondes de captures ciblant différentes positions mutationnelles au sein du gène rpoB associées à une résistance à la rifampicine ainsi que des positions mutationnelles au sein des gènes katG et inhA associées à la résistance à l'isoniazide. Selon les méthodes des documents US2010/0261163A1 et EP1076099A2, l'étape d'hybridation des séquences cibles, préalablement amplifiées et marquées, avec les sondes de capture immobilisées sur une puce « microarray » est réalisée dans une chambre d'hybridation statique et nécessite l'utilisation d'un tampon spécifique pour l'hybridation et plusieurs solutions de lavages. Les méthodes selon ces documents sont, par conséquent, très longues (au minimum 6 heures, voire plus d'une journée) et compliquées car elles nécessitent un grand nombre d'étapes de réalisation.
Description de l'invention
Il demeure ainsi nécessaire de mettre au point une technique d'identification de mutations ponctuelles qui soit sensible, rapide, facile et qui permette d'identifier un plus grand nombre de mutations ponctuelles simultanément ; c'est ce à quoi sont parvenus les Inventeurs en mettant au point une méthode permettant une détection rapide, facile et efficace de séquences nucléotidiques spécifiques, susceptibles de porter une mutation ponctuelle et permettant une corrélation de cette détection à des formes mutées de microorganismes, telles que des bactéries résistantes à des agents anti-infectieux comme des antibiotiques.
Cette méthode permet à la fois l'amplification multiplexe de cibles et la détection spécifique de mutations ponctuelles au sein d'au moins neuf positions mutationnelles sur chaque séquence nucléotidique cible amplifiée (aussi appelé amplicon) à partir d'un seul et même échantillon d'acides nucléiques.
La présente méthode permet en particulier :
- de détecter la position mutée par la présence de sondes nucléotidiques complémentaires aux séquences nucléotidiques cibles mutées (sondes de capture immobilisées sur un support d'oligochromatographie) ;
- d'identifier spécifiquement la base nucléotidique mutée, et par conséquent l'acide aminé introduit par le codon muté dans le cas d’une mutation présente dans une séquence codante ;
- de détecter simultanément au moins neuf positions mutationnelles sur une seule séquence d'ADN; - de présenter, pour chaque position mutationnelle, une sonde de capture correspondant au type sauvage et des sondes de capture correspondant aux mutations possibles (jusqu'à au moins 5 sondes mutées par position mutationnelle) ;
- de distinguer, dans un même échantillon, des populations microbiennes sauvages et mutées.
Un autre avantage de la méthode de l’invention est sa rapidité, car elle peut être exécutée rapidement, en moins de 90 minutes, de préférence en moins de 60 minutes, voire dans des conditions préférées en moins de 30 minutes. En particulier, les étapes d'hybridation et de lavages de l'invention sont réalisées en 20 minutes ou moins.
Un avantage additionnel de la méthode selon l'invention est sa simplicité, car elle peut facilement être réalisée en 2 étapes au maximum, de préférence en une seule étape.
Ainsi, cette méthode représente un outil de diagnostic des polymorphismes (mono)nucléotidiques dans le domaine médical et plus particulièrement dans celui des maladies infectieuses et de la résistance aux antibiotiques.
Plus spécifiquement, la présente invention se rapporte à une méthode de détection et de différenciation par oligochromatographie d'au moins une mutation ponctuelle du génome d'un microorganisme, de préférence d'une bactérie, présent dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :
a- l'amplification d'au moins une séquence nucléotidique cible, ladite séquence nucléotidique cible étant susceptible de porter une mutation ponctuelle, c'est-à-dire de présenter, à une position donnée, la délétion d'un nucléotide, la substitution de ce nucléotide par un autre nucléotide ou encore l'insertion d'un nucléotide juste avant ou juste après ladite position ;
b- la détection par oligochromatographie, parmi les séquences nucléotidiques cibles amplifiées obtenues à l'étape a) de séquences nucléotidiques sauvages ou porteuses d'une mutation ponctuelle, par une hybridation réalisée à une température d'hybridation d'au moins 55 °C, de préférence entre 55 et 80 °C, desdites séquences nucléotidiques cibles amplifiées avec plusieurs sondes de capture qui contiennent de 18 à 35 bases immobilisées sur une membrane, l'une de ces sondes de capture étant complémentaire et spécifique d'une partie de la séquence nucléotidique sauvage, chacune des autres étant complémentaires et spécifiques d'une partie de séquence nucléotidique comprenant au moins une mutation ponctuelle, et la détection des séquences nucléotidiques cibles amplifiées hybridées sur les sondes de capture.
Par le terme « oligochromatographie », il est entendu au sens de la présente invention une méthode de détection et de différenciation d'acides nucléiques présents dans un liquide par migration de ce liquide par capillarité dans un support approprié, appelé support oligochromatographique, pour permettre leur hybridation à des sondes de capture spécifiques immobilisées sur le support oligochromatographique et permettre donc leur séparation du liquide.
Selon la présente invention, un support oligochromatographique a la capacité de transporter spontanément un fluide par capillarité. L'oligochromatographie doit donc être considérée, dans le cadre de la présente invention, comme étant une méthode à transport dynamique du liquide, de préférence une méthode à flux latéral. Dans le cadre de la présente invention, le support est de préférence une membrane poreuse.
Il a été observé de manière surprenante que l'obtention d'une méthode de détection et de différenciation selon l'invention, à savoir qui est sensible, rapide et facile, est possible grâce à l'utilisation de la technique d'oligochromatographie et par l'utilisation d'une température d'hybridation d'au moins 55 °C et de sondes de captures qui contiennent de 18 à 35 bases.
En effet, la technique de l'oligochromatographie offre plusieurs avantages tels que la simplicité et la rapidité de réalisation, contrairement à certaines techniques connues de l'état de l'art telles que la détection par « microarray » qui peuvent nécessiter de nombreuses étapes ainsi que du matériel spécialisé et coûteux. La transposition d'une méthode réalisée sur une puce de type « microarray » à un support oligochromatographique n'est toutefois pas chose aisée, tant les techniques sont différentes.
Une méthode de détection de virus ou de bactéries par oligochromatographie est connue du document W02004099438A1. Toutefois, la méthode selon ce document ne permet pas d'identifier précisément la position, ni la base nucléotidique mutée, et ce contrairement à la méthode selon la présente invention qui permet de détecter et d'identifier des mutations ponctuelles, spécialement de différencier et d'identifier des mutations ponctuelles différentes à la même position.
Par ailleurs, dans le cadre de la présente invention, l'utilisation d'une température d'hybridation d'au moins 55 °C et de sondes de capture qui contiennent de 18 à 35 bases permet de réaliser l'hybridation sans l'utilisation d'un tampon d'hybridation spécifique. Ainsi, l'hybridation selon la méthode de l'invention peut être réalisée directement à partir du produit PCR dans son tampon d'amplification (solution comprenant les séquences nucléotidiques cibles amplifiées obtenues à l'étape a)). En d'autres termes, il n'est pas nécessaire de devoir ajouter un tampon d'hybridation au produit PCR obtenu à l'étape a), préalablement à la réalisation de l'étape d'hybridation, et ce contrairement aux documents US2010/0261163A1 et EP1076099A2 selon lesquels un tampon d'hybridation est ajouté avant le dépôt du produit PCR sur les puces « microarray » pour réaliser l'étape d'hybridation.
Avantageusement, la membrane peut être déposée sur un support structurel rigide, de préférence un support structurel rigide de type tigette, afin de la maintenir et de faciliter sa manipulation.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le support structurel rigide, de préférence la tigette, comprend un absorbant inférieur qui est présent en amont de la membrane par rapport au sens de migration par capillarité du produit PCR et correspond à une région d'application où le produit PCR obtenu à l'étape a) de la méthode est déposé.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le support structurel rigide, de préférence la tigette, comprend un absorbant supérieur qui est présent en aval de la membrane par rapport au sens de migration par capillarité du produit PCR et correspond à une région de récolte où la partie du produit PCR n'étant pas capturée à l'étape b) de la méthode est récupérée.
Selon la présente invention, la membrane est considérée comme étant la région de détection, c'est-à-dire la région où les sondes de capture sont immobilisées.
La membrane peut être de différentes natures ; il peut s'agir par exemple d'une membrane de nitrocellulose, de cellulose, d'acétate de cellulose, de nylon, de copolymère acrylique et nylon. De préférence, la membrane est une membrane de nitrocellulose.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le support comprend un réseau micro- pillaire.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, l'hybridation est réalisée à partir du même tampon que celui obtenu lors de l'amplification de l'étape a) de la méthode selon l'invention. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, l'amplification et l'hybridation sont réalisées dans le même tampon, également appelé, dans le cadre de la présente invention, le tampon d'amplification.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode selon la présente invention comprend:
a- l'amplification d'au moins une séquence nucléotidique cible dans un tampon d'amplification, ladite séquence nucléotidique cible étant susceptible de porter une ou plusieurs mutation(s) ponctuelle(s), c'est-à-dire de présenter, à une ou plusieurs position(s) donnée(s), la délétion d'un nucléotide, la substitution de ce nucléotide par un autre nucléotide ou encore l'insertion d'un nucléotide juste avant ou juste après ladite position ;
b- la détection par oligochromatographie parmi les séquences nucléotidiques cibles amplifiées obtenues à l'étape a) de séquences nucléotidiques sauvages ou porteuses d'une mutation ponctuelle par une hybridation réalisée dans le tampon d'amplification à une température d'hybridation d'au moins 55 °C, desdites séquences nucléotidiques cibles amplifiées avec plusieurs sondes de capture qui contiennent de 18 à 35 bases immobilisées sur une membrane, l'une de ces sondes de capture étant complémentaire et spécifique d'une partie de la séquence nucléotidique sauvage, chacune des autres étant complémentaires et spécifiques d'une partie de séquence nucléotidique comprenant au moins une mutation ponctuelle, et la détection des séquences nucléotidiques cibles amplifiées hybridées sur les sondes de capture.
Selon l'invention, la détermination d'une température d'hybridation d'au moins 55 °C permet la discrimination nucléotidique via la température, ce qui rend l'utilisation d'un tampon d'hybridation spécifique non nécessaire. Selon les méthodes des documents US2010/0261163A1 et EP1076099A2, les températures d'hybridation divulguées spécifiquement sont, respectivement, de 42 °C et de 37 °C. Selon ces documents antérieurs, au moins deux lavages successifs doivent être réalisés après l'étape d'hybridation dans un tampon d'hybridation spécifique pour assurer la spécificité de l'hybridation d'une sonde de capture.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'hybridation de l'étape b) est réalisée dans le tampon d'amplification de l'étape a) à une température d'au moins 55 °C.
L'échantillon biologique consiste en des acides nucléiques extraits d'échantillons biologiques (humains, animaux, plantes...) ; il peut notamment consister en un échantillon extrait d’un animal ou d’un individu tel qu’un mammifère, plus particulièrement d’un humain, ou d'une composition alimentaire.
L'échantillon biologique est préférentiellement lysé dans un tampon de lyse chimique ou par lyse thermique ou par lyse mécanique ou par lyse enzymatique avant d'être extrait par des méthodes d'extractions manuelles ou automatisées combinant en général deux à trois des étapes suivantes telles que la rétention ou séparation par affinité sur colonne chromatographique ou de billes magnétiques, de précipitation chimiques, de centrifugations ...
Les séquences nucléotidiques cibles peuvent être des séquences d’ADN, en particulier des séquences d’ADN simple brin ou double brin ou partiellement double brin, ainsi que des séquences d’ADNc obtenues par transcription inverse de séquences d’ARN. Ainsi, la méthode selon l'invention peut comprendre une étape optionnelle, préalable à l'étape a), correspondant à la transcription inverse de l'ARN contenu dans l'échantillon.
Dans un mode de réalisation, les séquences cibles amplifiées ont une taille comprise entre 50 et 200 bases, en particulier de 70 à 150 bases.
L'étape a) d'amplification peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier ; plus particulièrement, elle peut être réalisée par PCR ou par amplification isotherme, notamment par la méthode LAMP (Loop-Mediated Amplification) (Notomi et al., Nucleic acid Res., 2000, 28, e63) ou RPA (Recombinase Polymerase Amplification) (Piepenburg et al., PLOS Biol., 2006, 4(7), e204) ou NASBA (Nucleic Acid sequence-based amplification) (Guatelli et al., PNAS, 1990, 87(5), 1874-1878). Il est également possible d'utiliser la technique de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) (Schouten et al., Nucleic Acid Res., 2002, 30, e57). La MLPA est une variante de la PCR multiplexe et permet d'amplifier de multiples séquences nucléotidiques cibles avec une paire d'amorces universelles.
De préférence, l'étape d'amplification est réalisée par PCR.
Le mélange réactionnel pour l'amplification, également appelé le tampon d'amplification, peut contenir plusieurs réactifs comme un tampon, des enzymes, des désoxynucléotides triphosphates (dNTPs), des additifs, et notamment plusieurs couples d'amorces pour l'amplification simultanée de séquences multiples dans un seul échantillon.
Les deux étapes de transcription inverse et d'amplification par PCR peuvent être réalisées soit dans des tubes réactionnels fermés, insérés dans un instrument programmable qui chauffe et refroidit une chambre de réaction stationnaire (tel qu'un thermocycleur), soit dans un dispositif microfluidique à usage unique dans lequel le mélange réactionnel circule sur des zones statiques ayant chacune une température définie. En général, la transcription inverse est réalisée à une température unique avant que des cycles successifs de chauffe et de refroidissement permettent la multiplication (amplification) des cibles par réaction de PCR. Selon un mode de réalisation préféré, ces étapes sont réalisées en flux continu dans un système microfluidique tel que décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260 ou dans la demande de brevet EP 3 075 451.
Le choix des séquences nucléotidiques utilisées comme amorces pour l’amplification, de préférence par PCR, est fait en fonction de la ou des séquence(s) nucléotidique(s) cibles à amplifier et à détecter. La sélection de ces amorces est à la portée de l’homme de l’art, ainsi que leur marquage éventuel par des éléments comme des particules métalliques, de préférence des particules d’or, des colloïdes, des particules de polystyrène, des particules colorées, des particules (para)-magnétiques ou des éléments fluorescents ou tout autre marqueur permettant la détection.
La séquence nucléotidique cible amplifiée (amplicon) peut être marquée, directement ou indirectement, par différents marqueurs de détection, de préférence des fluorophores (ou éléments fluorescents) ou des nanoparticules comme l'or colloïdal. Le marquage de l'amplicon peut se faire (i) soit dès l'étape d'amplification par l'utilisation d'une amorce d'amplification marquée par un fluorophore (Figure IA), (ii) soit après resuspension d'une sonde fluorescente ou d'une sonde couplée à un conjugué à l'or colloïdal (Figure IB) déposée au niveau de la région d'application du support d'oligochromatographie, dont la séquence est différente de la séquence de la sonde de capture immobilisée et complémentaire d'une partie de la séquence nucléotidique cible amplifiée, (iii) soit par l’incorporation d’une amorce marquée par un haptène (par exemple DIG, DNP ou FAM) et la resuspension du récepteur de cet haptène, récepteur lui-même couplé à un marqueur de détection (Figure IC).
De préférence, le marqueur est un marqueur fluorescent, de préférence constitué de cyanine (Cy5) ou d’un marqueur ayant des propriétés fluorescentes similaires.
Des marqueurs présentant différents types de coloration ou différentes longueurs d'ondes de fluorescence peuvent être utilisés pour le marquage des séquences nucléotidiques cibles amplifiées de manière à faciliter leur détection simultanée ou consécutive sur le support, chaque couleur étant spécifique d’une séquence ou d’un groupe de séquences nucléotidiques cibles amplifiées et présentes initialement dans l’échantillon testé, leur détection colorimétrique peut ainsi être obtenue par des moyens connus de l’homme de l’art.
Le nombre de séquences nucléotidiques différentes pouvant être détectées par la méthode selon l'invention peut être adapté selon les besoins de l’application. La méthode de l’invention est modulable et permet d’adapter le nombre de sondes de capture présentes sur le support oligochromatographique selon le nombre de séquences nucléotidiques cibles à détecter.
Dans un mode de réalisation préféré, entre environ 2 séquences et environ 50 séquences nucléotidiques cibles, de préférence entre environ 4 séquences et environ 40 séquences nucléotidiques cibles sont amplifiées et détectées dans le même échantillon.
En particulier, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 séquences cibles sont amplifiées et détectées dans un même échantillon.
Pour la mise en oeuvre de l'étape b) de détection par oligochromatographie, les sondes de capture, utilisées pour détecter par hybridation les séquences nucléotidiques cibles amplifiées à l'étape a), ont une longueur comprise entre 18 et 35 bases, de préférence entre 20 et 32 bases. Leur séquence est définie en fonction de la région dans laquelle la mutation ponctuelle est recherchée.
En particulier, les sondes de capture selon l'invention ont une taille de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 bases.
Les sondes de capture peuvent être formées de bases nucléotidiques puriques, pyrimidiques, dégénérées, universelles, ou de type LNA (lock nucleic acid), ANA (altritol nucleic acid), HNA (hexitol nucleic acid), ... ou des sondes non-nucléiques de type PNA (peptide nucleic acid) mais pouvant s'apparier à des séquences nucléotidiques ou encore des combinaisons de ces différents types de bases. Avantageusement, la température de fusion (Tm) des sondes de capture est comprise entre 68 et 80 °C, préférentiellement entre 70 et 78 °C. La température de fusion est également bien connue comme étant la température de melting. Selon la présente invention, la Tm des sondes de capture est calculée selon le modèle « Nearest-neighbor two-state ».
Les sondes de capture peuvent être entièrement spécifiques d'une séquence cible ou bien contenir en plus de la séquence définie en fonction de la région dans laquelle la mutation ponctuelle est recherchée (par exemple en plus de leurs 18 à 35 bases) des espaceurs («spacers ») de nature nucléotidiques ou chimiques. Selon un mode de réalisation particulier, l'espaceur de type nucléotidique est une séquence d'au moins 2 T (thymine), de préférence entre 5T et 8T, et l'espaceur de type chimique est une chaîne de type carbonée de minimum 3 carbones et de maximum 12 carbones.
Les sondes de capture, avec ou sans espaceur, sont immobilisées sur le support, de préférence sur une membrane d'oligochromatographie, permettant la capture ou l'hybridation des séquences nucléotidiques cibles amplifiées.
Les sondes de capture spécifiques à chaque mutation ponctuelle, débutant ou non par un espaceur, sont immobilisées sur le support, de préférence sur une membrane d'oligochromatographie sous forme de points ("spottées") (Figure 2), notamment via des liaisons covalentes ou via une molécule porteuse pour faciliter l’accrochage sur le support et l’accessibilité de la sonde. La molécule porteuse s'ajoute à la séquence nucléotidique de la sonde, indépendamment de la présence de l'espaceur. Cette fixation peut être directe ou indirecte ; dans ce dernier cas, la sonde de capture est couplée à une première molécule, telle que la biotine, elle- même fixée sur la membrane par une seconde molécule protéique complémentaire, telle que l'avidine, la streptavidine ou des molécules dérivées.
En particulier, la membrane, maintenue ou non sur le support rigide, peut être sous la forme d'une tigette. Une tigette selon l'invention peut être trempée dans un tube réactionnel ou disposée dans système microfluidique.
En particulier, une tigette selon l'invention a une longueur de 40 à 60 mm et une largueur de 4 à 10 mm. Plus particulièrement, une tigette selon l'invention a une longueur de 57 mm et une largeur de 5 mm.
Dans un mode de réalisation particulier, le support peut également être une puce de détection microfluidique en polymère de cyclo-oléfine.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la température d'hybridation est d'au moins 56°C, de préférence d'au moins 57°C, préférentiellement d'au moins 58°C, encore plus préférentiellement d'au moins 59°C, de manière encore plus préférentielle d'au moins 60°C. Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la température d'hybridation est d'au moins 60°C, de préférence comprise entre 60°C et 80°C, préférentiellement comprise entre 60°C et 73°C, encore plus préférentiellement comprise entre 62°C et 73°C.
Selon un mode de réalisation particulier, la température d'hybridation est comprise entre 67°C et 73°C.
Comme indiqué plus tôt, les différentes étapes de la méthode selon l'invention, c'est-à- dire, la transcription inverse optionnelle, l'amplification et la détection, peuvent être réalisées soit dans un dispositif microfluidique unique, soit dans des tubes réactionnels fermés nécessitant alors une étape de détection, séparée de l'amplification, sur le support oligochromatographique.
Selon un mode de réalisation, la méthode est mise en oeuvre dans un dispositif microfluidique, tel que décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260 et représenté à la Figure 3 ; ce dispositif microfluidique est inséré dans un équipement dédié permettant de gérer les températures de la transcription inverse, de la PCR et de la détection. Le flux du mélange réactionnel est conditionné par une pompe péristaltique et la lecture de la zone de détection est réalisée à l'aide d'une caméra. Un logiciel d'analyse des signaux observés permet de différencier les polymorphismes (mono)nucléotidiques.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, elle est réalisée à l'aide de tubes réactionnels qui sont insérés dans un thermocycler permettant la réalisation de l'éventuelle RT-PCR et de la PCR. Les séquences nucléotidiques cibles amplifiées (amplicons), sont ensuite détectées après migration sur le support oligochromatographique, sur lequel sont immobilisées les sondes de capture. La lecture de la zone optique et l'analyse des signaux sont ensuite réalisées à l'aide d'un lecteur et d'un logiciel d'analyse.
Avantageusement, l'hybridation est suivie d'un lavage à l'aide d'un tampon de migration. En particulier, après l'étape de capture des séquences nucléiques cibles amplifiées par hybridation avec les sondes de capture immobilisées, le support oligochromatographique est lavé par une solution tamponnée visant à éliminer les amorces marquées en excès et les hybridations aspécifiques. La solution tamponnée peut être introduite, soit au niveau du réservoir de tampon dans le dispositif microfluidique tel que décrit dans (Figure 3, référence 12), soit au fond d'un tube dans le cas d'une oligochromatographie verticale. Les termes « tampon de migration » et « solution tamponnée de lavage » sont utilisés de manière interchangeable. La solution tamponnée se réfère à la solution tamponnée de lavage sauf s'il est indiqué expressément le contraire. De préférence, le tampon de migration est différent du tampon d'amplification. De préférence, le tampon de migration est un tampon de base phosphate supplémenté en TRIS, en sels (KCI et MgCI2) et en saturants (hydrolysat de caséine et thréalose). Dans le cas où la solution tamponnée est introduite au niveau du réservoir de tampon du dispositif microfluidique (Figure 3, référence 12), la solution tamponnée est soumise aux températures d'abord de la transcription inverse, de la PCR, puis de l'hybridation au niveau du dispositif oligochromatographique. Dans le cas où la migration est réalisée dans un tube à la verticale, le tube contenant la solution de lavage tamponnée est chauffé à la température permettant l'hybridation entre les sondes nucléotidiques immobilisées sur le dispositif oligochromatographie et les séquences nucléotidiques amplifiées.
De préférence, le lavage du support avec la solution tamponnée est réalisé, par exemple pendant 5, 10, 15, 20 ou 30 minutes, ou quand l'équipement dédié établit le meilleur rapport signal/bruit de fond au niveau de chaque spot de sondes nucléotidiques.
Dans un mode de réalisation préféré, la zone de détection est exposée à la source lumineuse d'un équipement dédié ou d'un microscope afin de détecter et de quantifier le signal soit d’un marqueur fluorescent, soit d’un élément détectable dans les spectres de lumière visible telle que des billes d'or colloïdal. Le temps d'exposition est adapté à la méthode mise en oeuvre, à titre d'exemple, il peut être compris entre 1 et 5000 ms, en particulier entre 50 ms et 1500 ms.
Les intensités des signaux sont mesurées au niveau de chaque position (« spot ») où est immobilisée une sonde nucléotidique de capture sur le dispositif oligochromatographique; il s'agit du signal spécifique, et autour de chaque position, il s'agit du bruit de fond.
Dans le cas de l’utilisation d’un équipement spécifique au dispositif microfluidique précité, cet équipement positionne une grille d’analyse permettant la quantification automatique du signal lumineux pour chaque spot et pour le signal de bruit de fond autour de chaque spot.
L'intensité du signal est plus élevé lorsque la sonde reconnaît sa séquence homologue dans l'amplicon. Si l'amplicon est de type sauvage, c'est la sonde sauvage qui sera plus lumineuse. Par exemple, si dans la séquence sauvage le nucléotide en position X est G alors c'est le spot avec la sonde portant un C complémentaire au G en position X qui sera plus lumineuse. Si l'amplicon est de type muté, c'est la sonde mutée qui sera plus lumineuse. Par exemple, si dans la séquence mutée le nucléotide en position X est remplacé par un T (G>T) alors c'est le spot avec la sonde portant un A à la position X qui sera plus lumineux. De préférence, un algorithme d'analyse facilite l'interprétation des résultats.
De préférence, la mutation ponctuelle à détecter est susceptible d'être présente dans le génome d'un microorganisme, en particulier d'une bactérie ou d'un virus.
Selon un mode de réalisation préféré, la méthode est destinée à détecter une mutation ponctuelle dans le génome bactérien de Mycobacterium tuberculosis.
Selon un autre mode de réalisation, la méthode est destinée à détecter une mutation ponctuelle dans le génome viral du genre Enterovirus. Dans le cadre de la présente invention, on entend par génome bactérien, le chromosome bactérien et les plasmides bactériens naturels.
Une mutation ponctuelle représente une délétion, insertion ou substitution d'un nucléotide dans un codon du génome bactérien pouvant conduire à l'expression d'une protéine ayant un acide aminé modifié par rapport à la séquence sauvage de cette protéine. La séquence sauvage d'un gène ou d'une protéine est celle présente majoritairement dans la nature.
Dans le cas particulier de la détection d'une mutation ponctuelle dans le génome d'une bactérie, la méthode selon l'invention permet la détection d'une mutation ponctuelle associée à une résistance à un antibiotique. L'antibiotique peut être choisi parmi les familles suivantes : les béta-lactamines, les glycopeptides, les aminosides, les macrolides, les phénicolés, les cyclines, les acides fusidiques, les oxazolidinones, les quinolones, les sulfamides et triméthoprime, les produits nitrés (nitrofuranes et nitroimidazoles), les antituberculeux en particulier, il peut s'agir d'une mutation ponctuelle associée à une résistance chez Mycobacterium tuberculosis à la rifampicine, à l'isoniazide, à la pyrazinamide, à l'ethanbutol et aux fluoroquinolones ...
La résistance aux antibiotiques de première intention peut résulter d'une mutation ponctuelle localisée dans le gène : par exemple dans le gène rpoB pour la résistance à la rifampicine, ou dans le gène katG, inhA ou kasA pour la résistance à l'isoniazide.
Dans le cas de la résistance à la rifampicine, la mutation ponctuelle est localisée dans le gène rpoB (gène de la sous-unité b de l'ARN polymérase). De manière non limitative, le tableau 1 présente une liste de sondes de capture ciblant différentes positions mutationnelles au sein du gène rpoB chez M. tuberculosis.
Tableau 1 : Séquences des sondes ciblant les génotypes sauvages et mutés détectés au niveau du gène rpoB. La numérotation en italique est liée à la première numérotation des codons en fonction du génome à'Escherichia coli. La numérotation en gras est liée à la nouvelle nomenclature des codons, basée sur le génome de Mycobacterium tuberculosis.
Dans le cas de la résistance à l'isoniazide, la mutation ponctuelle est localisée dans le gène katG (heme-containing enzyme catalase-peroxidase), dans le gène kasA (3-oxoacyl-ACP synthase) ou dans la région promotrice du gène inhA (gène de enoyl-acyl carrier protein reductase). De manière non limitative, le tableau 2 présente une liste de sondes de capture ciblant différentes positions mutationnelles au sein des gènes katG et inhA chez M. tuberculosis.
Tableau 2 : Séquences des sondes ciblant les génotypes sauvages et mutés détectés au niveau des gènes katG et inhA.
Dans le cas de la détection d'une mutation ponctuelle dans le génome d'un virus, la méthode selon l'invention permet la détection de polymorphismes mononucléiques au sein du genre Enterovirus et permet ainsi un regroupement au niveau du diagnostic, en particulier pour un diagnostic simultané des Enterovirus et des Rhinovirus (espèces appartenant au genre Enterovirus).
La présente invention se rapporte également à un support oligochromatographique sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques. Le support oligochromatographique et les sondes de captures sont tels que définis précédemment.
Selon un mode de réalisation, ledit support comprend une sonde de capture complémentaire et spécifique de la séquence sauvage de la région cible et au moins une sonde de capture complémentaire et spécifique de la séquence mutée de la région cible.
La présente invention se rapporte encore à un dispositif microfluidique comprenant le support oligochromatographique selon l'invention. De préférence, le dispositif microfluidique est tel que décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260.
La présente invention se rapporte enfin à une trousse de réactifs comprenant au moins des amorces d'amplification d'une région cible et le support oligochromatographique selon l'invention.
Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention.
Cependant, les exemples ne sont présentés qu'à titre illustratif et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention.
Figures
Figure 1 : Représentation schématique de l'hybridation de l'amplicon et des systèmes de marquage de l'amplicon.
Figure 2 : Représentation schématique de sondes de captures immobilisées sur le support oligochromatographique : damier de 40 spots et exemple de 4 sondes de capture dont celle ayant le génotype sauvage ; la sonde 1 a une mutation en position 5 (G > C), la sonde 2 a une mutation en position 5 (G > T) et la sonde 3 a une mutation en position 4 (A > G).
Figure 3 : Dispositif microfluidique décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260.
1. chambre d'amplification, 2. chambre de détection, 3. canal, 4. support oligochromatographique
(tigette), 5. partie proximale de la tigette, 6. partie distale de la tigette, 7. région d'application, 8. région de détection, 9. région absorbante, 10. communication fluidique, 11. réservoir de mélange réactionnel, 12. réservoir de tampon, 13. tuyau de contact avec le système de pompage, 14. tuyau de liaison.
Figure 4 : Histogramme illustrant la détection d'une souche de Mycobacterium tuberculosis mutée en position 526 et sauvage pour les positions 511-512-513 ; 516 ; 522 ; 529 ; 531 ; 533 au niveau du gène rpoB.
Figure 5 : Histogramme illustrant la détection d'une souche de Mycobacterium tuberculosis mutée en position 315 au niveau du gène katG.
Figure 6 : Histogramme illustrant la détection spécifique des espèces Enterovirus et Rhinovirus.
Exemples
Exemple 1 - Détection de souches de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou résistantes à la rifampicine
Il est connu que la résistance à la rifampicine est due à un ou des polymorphismes (mono)nucléotidiques dans le gène rpoB (gène de la sous-unité b de l'ARN polymérase, cible de la rifampicine chez Mycobacterium tuberculosis).
Deux séquences cibles, respectivement de 113 et 119 nucléotides, ont donc été sélectionnées au niveau du gène rpoB (Tableau 3).
Tableau 3. Séquences cibles du gène rpoB amplifiées par PCR. Les séquences des amorces sont indiquées en gras.
Sur ces séquences, 10 positions mutationnelles montrant des polymorphismes (mono)nucléotidiques impliqués dans la résistance à la rifampicine ont été ciblées. L'amplicon_l comporte 9 positions mutationnelles et l'amplicon_2 comporte une seule position mutationnelle. De 2 à 6 variants de séquences sont détectés pour chacune des positions (Tableau 1).
Dans cette application, les régions cibles du gène rpoB de Mycobacterium tuberculosis sont amplifiées par PCR, suivie d'une détection sur support oligochromatographique, dans le dispositif microfluidique tel que décrit dans la demande de brevet EP 3075451.
Remplissage du dispositif : le réservoir de tampon (12) est rempli par un volume de solution de lavage tamponnée pouvant aller de 50 à 80 pL. Le réservoir de mélange réactionnel (11) est rempli par un volume de 10 à 20 pL de mélange réactionnel contenant l'échantillon et les réactifs d'amplification, et, le cas échéant, de transcription inverse. Fermeture du dispositif : le dispositif microfluidique est fermé hermétiquement par une tête de pompe (Demande de brevet EP 3075451).
Amplification et détection : le dispositif est inséré dans un équipement dédié approprié permettant la réalisation des étapes de transcription inverse, d'amplification par PCR, d'hybridation des produits d'amplification aux sondes immobilisées sur le dispositif d'oligochromatographie et de lavage de la zone de lecture par la solution de lavage tamponnée.
Les étapes et les réactifs pour réaliser la transcription inverse et l'amplification sont connus de l'homme de métier.
Dans cet exemple, la composition du tampon d'amplification est la suivante : Titanium®Taq DNA polymerase kit (Takara) contenant IX Titanium Taq PCR Buffer et 1,25X Titanium taq DNA polymerase, additioné de MgCI2 1,5 mM, dNTPs 0,8 mM, BSA 0,6 mg/mL, PEG, 1,5%, Betaine IM, DMSO 5% et les quatre amorces permettant d'amplifier les amplicons 1 et 2.
Après amplification par PCR dans les différentes boucles du canal microfluidique, le produit PCR (ADN amplifié) présent dans le tampon d'amplification va atteindre la région d'application (absorbant inférieur) de la tigette oligochromatographique. Le liquide (tampon d'amplification comprenant le produit PCR) va ensuite migrer à travers cet absorbant et atteindre la membrane de nitrocellulose au niveau de laquelle sont déposées les sondes de capture. Le produit PCR présent dans le tampon d'amplification va migrer entièrement par capillarité dans la membrane. La membrane est ensuite lavée par le tampon de lavage/de migration qui suivra le même trajet que le produit PCR au niveau du chip microfluidique. Les étapes d'hybridation et de lavage ont une durée totale d'environ 20 minutes et le temps total de réaction (amplification + hybridation + lavage) se situe entre 60 et 75 minutes. L'hybridation se fait à une température de 71°C .
Le dispositif est géré par un équipement dédié permettant la gestion du flux du liquide dans le canal du dispositif microfluidique via un système de pompage actif et la gestion de la température d'au moins deux, et jusqu'à 5, zones de chauffe sous le réservoir de mélange réactionnel, la chambre d'amplification et le canal PCR et d'une zone de chauffe sous la tigette de détection.
Les résultats sont interprétés par le logiciel d'analyse de l'équipement dédié. L’identification du caractère sauvage ou muté de chaque position d’intérêt est réalisée par l’analyse des valeurs de fluorescence entre sondes s'hybridant aux mêmes positions.
Par exemple, pour la position 526/445 du gène rpoB, 6 acides aminés ont été identifiés dans des variants naturels: l'histidine (H) dans la séquence sauvage, l'aspartate (D), l'asparagine (N), la tyrosine (Y), la leucine (L) ou l'arginine (R) dans des variants mutés. Chacun de ces changements d'acide aminé est dû à une mutation dans le codon correspondant.
Six sondes couvrant ce codon ont été immobilisées sur le damier de la tigette oligochromatographique, chaque sonde étant spécifique à un des codons (sauvage ou muté, Tableau 1).
Le produit d'amplification s'hybride à chacune de ces 6 sondes et l’intensité du signal est mesurée. Pour chaque sonde, le signal est rapporté à la moyenne des signaux des 5 autres sondes. Les rapports de signaux ainsi calculés permettent d’identifier le génotype à la position considérée : la sonde pour lequel un rapport de signaux supérieur à la valeur cut-off pré déterminée (par exemple la valeur 2) est obtenu correspond à la séquence présente dans l’échantillon.
Dans le cas des positions 511-512-513, l'utilisation d'une sonde de type « sauvage » commune pour ces 3 positions permet de pallier au problème de proximité des séquences, alors que les sondes correspondant aux génotypes mutés sont spécifiques de chaque position, respectivement en position 511/ 430, 512/ 431, 513/ 432.
Exemple d'une souche Mycobacterium tuberculosis portant la mutation H526Y :
Dans cet exemple, le génotype est sauvage pour les positions 511-512-513-522-529-531 et 533 (identifié par un ratio supérieur à 2, barres d'histogramme gris foncé) et le génotype est muté H526Y (barre noire) pour la position 526 (nomenclature d'f. coli) (Figure 4).
Les barres gris clair représentent le ratio obtenu pour chacune des sondes qui correspondent au génotype sauvage H526 et aux mutant non détectés. (Figure 4). Le changement d'acide aminé est identifié. L'histidine en position 526 est remplacée par une tyrosine; les acides aminés aux autres positions sont de type sauvage.
Cette méthode permet également de détecter des mélanges de souches ou de variants.
Exemple 2 - Détection de souches de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou résistantes à l'isionazide
Le protocole pour les étapes de transcription inverse, d'amplification, d'hybridation et de lavage est transposable de l'exemple 1. Dans cet exemple, les étapes d'hybridation et de lavage ont une durée totale d'environ 20 minutes et le temps total de réaction (amplification + hybridation + lavage) se situe entre 60 et 75 minutes. L'hybridation se fait à une température de 71 °C.
Chez Mycobacterium tuberculosis, il est connu que les résistances à l'isoniazide sont majoritairement dues à un ou des polymorphismes (mono)nucléotidiques dans le gène katG ou dans la région promotrice du gène inhA.
Une séquences cible de 85 nucléotides a donc été sélectionnée au niveau du gène katG et une séquence de 123 nucléotides a été sélectionnée au niveau du gène inhA (Tableau 4).
Tableau 4. Séquences cibles des gènes katG et inhA amplifiées par PCR. Les séquences des amorces sont indiquées en gras.
Une position montrant des polymorphismes (mono)nucléotidiques impliqués dans la résistance l'isoniazide a été ciblée dans la séquence cible du gène katG, tandis que 3 positions ont été ciblées dans la séquence promotrice du gène inhA. Entre 2 à 5 variants de séquences sont détectés pour chacune des positions (Tableau 2).
Dans le cas du gène inhA, les différentes positions mutationnelles se retrouvent au niveau de la région promotrice du gène. Une mutation à ce niveau n'induit donc pas la formation d'un nouvel acide aminé mais la surexpression du gène qui va entraîner une résistance à l'isoniazide.
Comme dans l'exemple précédent, les régions cibles du gène katG et de la région promotrice du gène inhA de Mycobacterium tuberculosis sont amplifiées séparément par PCR, suivie d'une détection sur support oligochromatographique dans le dispositif microfluidique, comme décrit dans l'exemple précédent.
Les résultats sont interprétés par le logiciel d'analyse de l'équipement dédié.
L’identification du caractère sauvage ou muté de chaque position d’intérêt est réalisée par l’analyse des valeurs de fluorescence entre sondes s'hybridant aux mêmes positions. Exemple d'une souche Mycobacterium tuberculosis portant la mutation S315N :
Par exemple, dans le cas du gène katG, la position mutationnelle 315 peut présenter 4 acides aminés différents : la serine (S) qui correspond à la séquence sauvage, la thréonine (T), retrouvée dans deux des séquences mutées, l'asparagine (N) et l'isoleucine (I). Chacun de ces changements d’acide aminé est dû à une mutation dans le codon correspondant. La synthèse de la thréonine peut être induite par deux polymorphismes nucléotidiques différents.
Cinq sondes couvrant ce codon ont été immobilisées sur le damier de la tigette oligochromatographique, chaque sonde étant spécifique à un des codons (sauvage ou muté, Tableau 2).
Le produit d’amplification s'hybride à chacune de ces 5 sondes et l’intensité du signal est mesurée. Pour chaque sonde, le signal est rapporté à la moyenne des signaux des 4 autres sondes. Les rapports de signaux ainsi calculés permettent d’identifier le génotype à la position considérée : la sonde pour lequel un rapport de signaux supérieur à un cut-off prédéterminé est obtenu correspond à la séquence présente dans l’échantillon.
Dans cet exemple, le génotype pour la position 315 est muté S315N (nomenclature d'f. coli). Les barres grises claires représentent le ratio obtenu pour chacune des sondes qui correspondent aux génotypes sauvages et mutant non détectés (Figure 5). Le changement d'acide aminé est identifié. La sérine est remplacée par une asparagine.
Exemple 3 - Détection spécifique des espèces Enterovirus et Rhinovirus
Le protocole pour les étapes de transcription inverse, d'amplification, d'hybridation et de lavage est transposable de l'exemple 1. Dans cet exemple, les étapes d'hybridation et de lavage ont une durée totale d'environ 20 minutes et le temps total de réaction (amplification + hybridation + lavage) se situe entre 60 et 75 minutes. L'hybridation se fait à une température comprise entre 50°C et 66 °C.
La détection de polymorphismes (mono)nucléotidiques a été évaluée sur du matériel génétique mimant des séquences du genre des Enterovirus. Le genre Enterovirus comprend 12 espèces dont 9 Enterovirus (A à H et J) et 3 Rhinovirus (A à C). Certains Enterovirus provoquent des symptômes respiratoires, similaires aux Rhinovirus. Cette similarité clinique ainsi que leur appartenance à un même groupe phylogénétique, permettent un regroupement au niveau du diagnostic. Une région conservée au sein de ce genre Entérovirus a donc été sélectionnée pour un diagnostic simultané des Enterovirus/Rhinovirus. Deux sous-espèces, l'enterovirus A et le Rhinovirus C ont ensuite été sélectionnées pour réaliser la démonstration de différenciation de deux séquences présentant seulement une base de différence G/A (Tableau 5).
Tableau 5. Séquences des sondes de détection spécifiques à chaque virus
Les séquences cibles de ces deux sous-espèces ont été détectées spécifiquement par oligochromathographie en tube après avoir été amplifiées par PCR.
Les résultats montrent qu'à une température d'hybridation de 55°C et plus, de préférence de 60°C et plus, une amélioration significative est obtenue par rapport à la capacité de différencier les deux virus (Figure 6). La température optimale de différenciation permet aux deux sondes d'être spécifiques de leurs cibles respectives.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de détection et de différenciation par oligochromatographie d'au moins une mutation ponctuelle du génome d'un microorganisme, de préférence d'une bactérie, présent dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :
a- l'amplification d'au moins une séquence nucléotidique cible ; ladite séquence nucléotidique cible étant susceptible de porter une mutation ponctuelle, c'est-à-dire de présenter, à une position donnée, la délétion d'un nucléotide, la substitution de ce nucléotide par un autre nucléotide ou encore l'insertion d'un nucléotide juste avant ou juste après ladite position ;
b- la détection par oligochromatographie parmi les séquences nucléotidiques cibles amplifiées obtenues à l'étape a) de séquences nucléotidiques porteuses d'une mutation ponctuelle par une hybridation réalisée à une température d'hybridation d'au moins 55 °C desdites séquences nucléotidiques cibles amplifiées avec plusieurs sondes de capture qui contiennent de 18 à 35 bases immobilisées sur une membrane, l'une de ces sondes de capture étant complémentaire et spécifique d'une partie de la séquence nucléotidique sauvage, chacune des autres étant complémentaires et spécifiques d'une partie de séquence nucléotidique comprenant au moins une mutation ponctuelle, et la détection des séquences nucléotidiques cibles amplifiées hybridées sur les sondes de capture.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'amplification et l'hybridation sont réalisées dans le même tampon.
3. Méthode selon l'une quelconque la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape préalable de transcription inverse de l'ARN contenu dans l'échantillon.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'amplification est réalisée par PCR ou par amplification isotherme.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique cible amplifiée est marquée, directement ou indirectement, par un marqueur.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les séquences de capture contiennent un espaceur.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'hybridation est suivie d'un lavage à l'aide d'un tampon de migration.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'hybridation est réalisée à une température d'au moins 60°C, de préférence comprise entre 60°C et 80°C, préférentiellement comprise entre 60°C et 73°C, encore plus préférentiellement comprise entre 62°C et 73°C.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'hybridation est réalisée à une température comprise entre 67°C et 73°C.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la membrane est une membrane de nitrocellulose, de cellulose, d'acétate de cellulose, de nylon, de type « réseau micro-pillaire » ou de copolymère acrylique et nylon.
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la mutation ponctuelle à détecter est présente dans le génome bactérien de Mycobacterium tuberculosis.
12. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite mutation ponctuelle est associée à :
- une résistance à la rifampicine et est localisée dans le gène rpoB, ou
- à la résistance à l'isoniazide respectivement localisée dans le gène katG et le promoteur du gène inhA.
13. Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que les sondes de capture sont choisies parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 et 39.
14. Support oligochromatographique sur lequel sont immobilisées des sondes de capture choisies parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 et 39.
15. Dispositif microfluidique comprenant le support oligochromatographique selon la revendication 14.
16. Trousse de réactifs comprenant au moins des amorces d'amplification d'une région cible d'un génome bactérien et le support oligochromatographique selon la revendication 14.
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