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EP2054510A2 - Enantioselective representation of aliphatic acyclic esters and ketones - Google Patents

Enantioselective representation of aliphatic acyclic esters and ketones

Info

Publication number
EP2054510A2
EP2054510A2 EP07785706A EP07785706A EP2054510A2 EP 2054510 A2 EP2054510 A2 EP 2054510A2 EP 07785706 A EP07785706 A EP 07785706A EP 07785706 A EP07785706 A EP 07785706A EP 2054510 A2 EP2054510 A2 EP 2054510A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
baeyer
radical
villiger
ketones
aliphatic acyclic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07785706A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Uwe T. Bornscheuer
Anett Kirschner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Greifswald
Original Assignee
Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald filed Critical Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Publication of EP2054510A2 publication Critical patent/EP2054510A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention relates to a process for the enantioselective (stereoselective) preparation of aliphatic acyclic esters from racemic aliphatic acyclic ketones by Baeyer-Villiger oxidation.
  • the invention further relates to the kinetic enzymatic racemate cleavage of racemic aliphatic acyclic ketones.
  • Baeyer and Villiger reported a reaction of cyclic ketones with peroxymonosulfuric acid, in which lactones were displayed (Baeyer and Villiger 1899).
  • the Baeyer-Villiger reaction has since been used in organic syntheses.
  • the chemical Baeyer-Villiger oxidation is normally catalyzed by peracids and found in one two-step procedure, which was described by Criegee (Criegee 1948).
  • Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs, E.C. 1.14.13.x) are enzymes that belong to the class of oxidoreductases and can convert aliphatic and cyclic ketones to esters and lactones using oxygen (Mihovilovic et al., 2002).
  • BVMOs are flavin-dependent (generally FAD) and require NAD (P) H to catalyze the oxidation reaction.
  • BVMOs can be formed from a variety of bacteria and fungi.
  • the best-studied BVMO to date is an enzyme from Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871, which is also referred to as cyclohexanone monooxygenase (CHMO). This enzyme converts a variety of mono- and bicyclic ketones (Donoghue et al., 1976, Stewart 1998).
  • BVMOs in addition to metal based chiral catalysts (Strukul 1998) is one way to enantioselectively esters and lactones represent.
  • the present invention solves these problems. It provides a method for the production of aliphatic acyclic esters from racemic aliphatic acyclic ketones by Baeyer-Villiger oxidation, in which the Baeyer-Villiger oxidation proceeds enantioselectively and Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMO) are used for the oxidation.
  • BVMO Baeyer-Villiger monooxygenases
  • enantioselective or stereoselective if an enantioselectivity E of more than 1, preferably more than 2, is reached, ie one enantiomer is present in excess over the other.
  • An industrial application is especially worthwhile if a high enantioselectivity E of at least 10, preferably of at least 40, is achieved.
  • enantioselectivity can be achieved in the enzymatic reaction of aliphatic acyclic ketones by means of BVMO.
  • Enantiomeric excess and enantioselectivity are determined as appropriate, e.g. Gas chromatographic analysis of the products of the reaction calculated according to the following formula (Chen 1982):
  • the Baeyer-Villiger monooxygenase used in the method of the invention is specific for aliphatic acyclic ketones.
  • the term aliphatic acyclic ketones indicates that the keto group is neither directly linked to an aromatic or cyclic group nor does the molecule contain aromatic or cyclic substituents.
  • ketones have a formula
  • R 1, R 2, R 3 and R 4 independently of one another are a substituted or unsubstituted, linear or branched alkyl radical, alkenyl radical, alkynyl radical, a hydroxyalkyl radical, carboxyl radical, alkoxycarboxyl radical, amino radical, aminoalkyl radical, aminocarbonyl radical, hydroxyl radical or a halogen radical,
  • R3 or R4 can also be hydrogen
  • R 1 is preferably a linear or branched alkyl radical having 1-6 C atoms, in particular methyl, ethyl, propyl, n-butyl or isobutyl.
  • R 2 is preferably a hydroxyl radical, amino radical or a halogen radical, ie, for example, chlorine, bromine or iodine. It is particularly preferred for the process according to the invention if R 2 is a hydroxyl radical, ie the ketone is a ⁇ -hydroxyketone.
  • the C atom attached to R2 is chiral, so R2, R3 and R4 are different.
  • racemic mixtures are used as starting materials.
  • R3 or R4 is hydrogen. It is particularly preferred that R 3 or R 4 is an alkyl radical having a chain length of 1 to 14 C atoms, in particular 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 C atoms, and that R3 or R4 - that is the other substituent - is hydrogen.
  • the alkyl radical is preferably linear and unsubstituted.
  • n 1, but n may be e.g. also be 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the ⁇ -hydroxyketone has the following formula:
  • R3 is an alkyl radical having a chain length of 2-20 C atoms, in particular having a chain length of 2-10 C atoms.
  • the ⁇ -hydroxy ketone at the ⁇ -C atom instead of the methyl group can carry a radical Rl according to the above definition.
  • Non-limiting examples of a linear or branched alkenyl of the invention i. for a hydrocarbon radical containing one or more C-C double bonds, propenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 3-pentenyl, 1,3-hexadienyl, etc. are.
  • Alkynyl 1 represents , for example, propynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 4-hexynyl, 1-decynyl, etc., ie a hydrocarbon radical which contains one or more C-C triple bonds.
  • hydrocarbon radicals are also included which contain both double and triple bonds.
  • hydrocarbon radicals mentioned may optionally be monosubstituted or polysubstituted, e.g. by alkyl, halogen, hydroxyl and / or amino groups.
  • Hydroxyalkyl stands for an abovementioned alkyl radical which is hydroxylated. For example, hydroxyethyl may be mentioned here.
  • Aminoalkyl-, Alkylaminoalkyl- each represent an above-mentioned alkyl radical which carries an amino group, which may be mono- but also dialkylated. Examples are the aminoethyl and the dimethylaminoethyl radical.
  • Alkoxyalkyl represents an abovementioned alkyl radical to which an alkoxy group is bonded. Examples of these are ethoxyethyl and ethoxypropyl.
  • Alkoxycarbonyl is a carbonyl radical to which an alkoxy group is bonded. Examples are the methoxycarbonyl and the ethoxycarbonyl.
  • Alkoxycarbonylalkyl is an abovementioned alkyl radical to which an alkoxycarbonyl group is bonded. Examples of these are ethoxycarbonylmethyl and methoxycarbonylmethyl radicals.
  • the method of the invention uses a Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO) derived from Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) or Pseudomonas putida (P. putida) or a functional derivative thereof.
  • BVMO Baeyer-Villiger monooxygenase
  • the BVMO from P. fluorescens has a particularly high specificity for ketones in which R3 is a short-chain alkyl radical, e.g. with 4, 6, or 8 C atoms, so that this enzyme is preferably used for the reaction of these ketones.
  • R3 is a short-chain alkyl radical, e.g. with 4, 6, or 8 C atoms, so that this enzyme is preferably used for the reaction of these ketones.
  • the BVMO from P. putida has a similar specificity. In both enzymes ⁇ -hydroxy ketones are preferred substrates.
  • the Baeyer-Villiger monooxygenase preferably comprises a sequence which has a homology of at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 95% to SEQ ID NO: 1 (BVMO from P. fluorescens) or SEQ ID NO: 3 (BVMO from P. putida).
  • the Baeyer-Villiger monooxygenase used in the method according to the invention preferably has the sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • the P. fluorescens BVMO sequence is published under the GenBank accession numbers AAC36351 (protein) and AF090329 (genome) and the BVMO sequence from P. putida under AAN68413 (protein) and AE015451 (genome), respectively.
  • the BVMO is able to convert aliphatic acyclic ketones to esters in a Baeyer-Villiger oxidation.
  • the Baeyer-Villiger monooxygenase sequence motif described by Fraaije et al. (2002, see also WO 03/020890) is also present in the protein sequence of the enzyme preferably used in the method according to the invention.
  • BVMO from P. fluorescens does not convert cyclic Baeyer-Villiger substrates, such as cycloketones or aromatic ketones, because the enzyme, when compared to characterized BVMOs with a known substrate spectrum, has the highest sequence similarity.
  • Hydroxyacetophenone monooxygenase HAPMO, 37% amino acid identity.
  • Phylogenetic analysis showed the same close affinity between HAPMO and the BVMO of P. fluorescens DSM50106.
  • BVMOs may also be used in the method of the invention, such as the tridecanone monooxygenase from P. cepacia (Britton and Markovetz 1977), the cyclohexanone monooxygenase (CHMO) from Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 (Donoghue et al., 1976) or the cyclopentanone monooxygenase (CPMO) from Comamonas sp. NCIMB 9872 (Griffin and Trudgill 1976).
  • CHMO can industrially rewarding be used for example for the implementation of a ß-hydroxyketone having a radical R3 with 1, 2, 3 or 4 C-atoms.
  • BVMO suitability of a BVMO for the implementation of a particular substrate or production of a specific ester for a specific, e.g. industrial purpose
  • a BVMO for the implementation of a particular substrate or production of a specific ester for a specific, e.g. industrial purpose
  • the ketones are preferably oxidized by incubating them with growing or quiescent cells containing the Baeyer-Villiger monooxygenases.
  • the enzyme it is not necessary to purify the enzyme prior to the reaction and to use it in isolation with cofactors such as NADPH isolated in the reaction.
  • cofactors such as NADPH isolated in the reaction.
  • this is also possible in principle, as shown, for example, in Britton and Markovetz, 1977.
  • Dormant cells are preferably used.
  • the cells also overexpress chaperones, for example, by expression of GroES / GroEL from plasmid vectors (Ikura et al., 2002, Lee et al., 2004, Nishihara et al., 1998, Nishihara et al., 2000).
  • the cells may be eukaryotic cells, such as yeasts, but are preferably bacterial cells, such as Escherichia coli, Pseudomonas sp. , Bacillus sp., Aspergillus sp. Most preferred is expression in E. coli, e.g. in E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3) or E. coli Origami TM (DE3). Preferably, the expression of the enzyme is inducible.
  • Preferred expression vectors are based on pJOE or pET vectors and are described in detail in the examples, e.g. the expression vector pJOE4072.6 or pET22BVMO.
  • the inventive method is preferably carried out at about 20 to 37 0 C.
  • an incubation temperature of about 25 to 30 0 C, in particular about 30 0 C, since volatile volatiles and esters evaporate here only to a small extent.
  • the temperature can also be varied for different steps.
  • the esters produced by the Baeyer-Villiger oxidation can be isolated and purified.
  • esters can be carried out by extraction with suitable solvents, for example dichloromethane. However, it was found that extraction with ethyl acetate gave a better yield. Subsequently, the ester of simultaneously extracted unreacted ketone be separated, for example by column chromatography on silica gel, in particular using a suitable solvent mixture, for example, of hexane: ethyl acetate 5: 1.
  • the present invention in addition to the process for the enantioselective preparation of aliphatic acyclic esters, simultaneously provides a process for the enantioselective preparation of aliphatic acyclic ketones.
  • the enantiomer unreacted by the particular enzyme is obtained.
  • the starting material used is a racemic mixture of ketones, from which an enantiomer is enantioselectively converted into the ester by the enzyme.
  • isolating and purifying the unreacted ketones e.g. by extraction and subsequent separation by column chromatography, this gives the other enantiomer of the ketone.
  • the process according to the invention is also a novel process for the racemate resolution of aliphatic acyclic ketones, ie for the separation of racemates into the enantiomers.
  • the process is referred to as catalytic kinetic resolution because the enzyme reacts one enantiomer of the reactant faster than the mirror image enantiomer of the ketone.
  • esters and / or ketones obtained by the process according to the invention preferably have a purity of the enantiomers of at least 70%, preferably at least 80%, 90% or 95% or 99%.
  • the process according to the invention is therefore also particularly advantageous since both enantioselective preparation of aliphatic acyclic ketones and aliphatic acyclic esters is possible with only one reaction step.
  • the present invention furthermore relates to the use of Baeyer-Villiger monooxygenases for carrying out the process according to the invention.
  • Particularly preferred here too is the use of the Baeyer-Villiger monooxygenases described above, in particular the BVMOs which originate from Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) or P. putida or are functional derivatives thereof.
  • the invention thus also relates to the use of Baeyer-Villiger monooxygenases for the steroe-selective Baeyer-Villiger oxidation of racemic aliphatic acyclic ketones.
  • E. coli JM109 was obtained from New England Biolabs (Beverly, MA, USA).
  • E. coli BL21 (DE3), Origami TM (DE3) and pET22b (+) were purchased from Novagen (Darmstadt, Germany).
  • P. fluorescens DSM 50106 is commonly available (for example, Khalameyzer et al., 1999) and may be obtained, for example, from DSMZ (Braunschweig, Germany).
  • the chaperone plasmid set containing plasmids pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2 and pTfl6 was purchased from TaKaRa Bio Inc. (Otsu, Japan).
  • the BVMO gene was used without stop codon by means of the polymerase chain reaction (PCR) using the oligonucleotides S3089 (5'-AAA ACA, TAT GAA TGC CCA CAG TGA TT-3 1 (SEQ ID NO: 4) and S3090 (5 ').
  • PCR polymerase chain reaction
  • S3089 5'-AAA ACA, TAT GAA TGC CCA CAG TGA TT-3 1 (SEQ ID NO: 4) and S3090 (5 ').
  • Taql DNA polymerase Biozym Diagnostik GmbH, Oldendorf, Germany
  • pJOE4072.6 was digested with Ndel and Hindl.II and the resulting small fragment (about 1.6 kb) carrying the gene and the His tag was digested with pET22b (+). which was digested with the same restriction enzymes (pET22BVMO).
  • Constructs without C-terminal His tag were prepared by converting the codon GGA from the BamHI site inserted between gene and His tag into the stop codon TGA using QuikChang TM Site Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, USA).
  • E. coli JM109 was transformed with pJOE constructs. Expression was performed in 30 ml LB medium (10 g tryptone, 10 g NaCl, 5 g yeast extract / L) containing 100 ⁇ g per ml ampicillin (LB amp ) at 37, 30 and 25 ° C. The cells were cultured to an optical density of 0.6 to 0.7 at 600 nm, at which time BVMO expression was induced by the addition of L-rhamnose (0.2% (w / v) final concentration). To After further cultivation for up to 20 hours, the cells were harvested by centrifugation and disrupted by sonication (60 seconds, 50% intensity) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.5).
  • Inclusion bodies were separated from the cell lysate by centrifugation for 10 minutes at 800 g, treated with 0.1% (v / v) Triton X-100 (37 ° C, 10 minutes) and washed twice with sodium phosphate buffer. Cell debris was removed from the cell lysate by additional centrifugation at high speed (10 minutes, 16000 g). Supernatants and fractions with inclusion bodies were analyzed by SDS-PAGE and Western blot.
  • E. coli BL21 (DE3) and Origami TM (DE3) were transformed with pET22b (+) constructs.
  • the cells were cultured in 30 ml LB ara p at 37, 30, 25 and 20 ° C. to an optical density of 0.7 to 0.8 at 600 nm. Thereafter, BVMO expression was induced by the addition of IPTG at a final concentration of 0.1 mM. After further expression for 20 hours, the cells were harvested by centrifugation and worked up as previously described.
  • E. coli JM109 and BL21 (DE3) cells were transformed with chaperone-encoding plasmids.
  • the cells were cultured in 20 ml LB containing 34 ⁇ g / ml chloramphenicol (LB cm ) at 37 ° C and competent cells were prepared. These were transformed with pJOE constructs (for JM109) or pET22b (+) constructs (for BL21 (DE3)) and selected on LB cm + a mp.
  • Racemic ⁇ -hydroxy ketones were synthesized via aldol condensation according to the method described by Smith and Levenberg (1981).
  • Hydroxyalkyl acetates were synthesized enzymatically using Candida antarctica lipase B. 5 mg of immobilized enzyme (Chirazyme L-2, C-2, Roche, Penzberg, Germany) were mixed with 300 ⁇ l of isooctane and 300 ⁇ l of vinyl acetate in a 2 ml glass jar. The reactions were started by addition of 10 ⁇ l of 1,2-diol and incubated at 25 ° C. in a thermoshaker (Eppendorf, Hamburg, Germany) for about two hours until the conversion was complete. The samples were used directly for GC analysis.
  • immobilized enzyme Chorazyme L-2, C-2, Roche, Penzberg, Germany
  • Hydroxyklaremethylester were synthesized from the corresponding ß-Keto acid methyl esters via ADH-catalyzed reduction, using an alcohol dehydrogenase from P. fluorescens DSM50106 was used (Hildebrand et al 2002). 5 mg of enzyme lyophilisate (produced recombinantly) were mixed with 800 ⁇ l of phosphate buffer (50 mM, pH 7.5), 200 ⁇ l of isopropanol and 2 ⁇ l of methyl ⁇ -keto acid ester. The reactions were incubated at 20 ° C. for 24 hours in a thermoshaker (Eppendorf, Hamburg, Germany). The reaction mixture was then extracted twice with 500 ⁇ l of ethyl acetate.
  • Methyl ⁇ -keto acid which was not commercially available, was prepared according to the method described by Oikawa et al. (1978).
  • E. coli JM109 pJOE4072.6 cells were cultured in 30 ml LB amp at 30 0 C to an optical density of 0.6 to 0.7 at 600 nm. Thereafter, BVMO expression was induced by addition of L-rhamnose at a final concentration of 0.2% (w / v). At the same time, 0.1 mmol of ⁇ -hydroxyketone was added and the culture was further incubated at 30 ° C. and 220 rpm. After certain periods, 500 ⁇ l samples were taken, extracted twice with dichloromethane and dried over anhydrous sodium sulfate. Excess solvent was removed in a nitrogen stream and the samples analyzed by gas chromatography.
  • BVMO in E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 was determined in 200 ml LB c ⁇ H . at p / which contained 0.5 mg per ml of L-arabinose, performed at 30 ° C.
  • the cells were cultured to an optical density of 0.5 to 0.6 at 600 nm, at which time BVMO expression was induced by the addition of L-rhamnose at a final concentration of 0.2% (w / v) , After further growth for four hours, the cells were harvested by centrifugation and washed once with sterile phosphate buffer (50 mM, pH 7.5).
  • the cells were resuspended in the same buffer to an optical density of about 40, and 1 ml aliquots of this cell suspension were placed in 2 ml tubes containing 5 ⁇ mol ⁇ -hydroxyket . and 10 ⁇ l of a sterile 1 M glucose solution.
  • the tubes were sealed with air-permeable lids (Lid Ba c / Eppendorf, Hamburg, Germany) and incubated at 30 0 C in a thermoshaker (Eppendorf, Hamburg, Germany). At certain times, 300 ⁇ l samples were taken, extracted twice with ethyl acetate and dried over anhydrous sodium sulfate. Excess solvent was removed in a nitrogen stream and the samples were analyzed by gas chromatography. ,
  • the cell pellet was resuspended in 60 ml of phosphate buffer (OD of about 10), divided into 3 times 20 ml and transferred to 250 ml shake flasks. Then, in each case 0.1 mmol substrate and 200 ul sterile 1 M glucose solution were added and incubated at 30 0 C and 200 rpm on an orbital shaker for 15 to 16 hours. Each reaction was extracted once with 10 ml of ethyl acetate, dried over anhydrous sodium sulfate, and excess solvent was removed under reduced pressure. The samples were analyzed by gas chromatography.
  • the BVMO gene from P. fluorescens DSM50106 was PCR amplified and inserted into the L-rhamnose inducible expression vector pJOE3075. Thereby, the gene without its stop codon was linked in-frame with six histidine codons and a stop codon already present in the vector (His-tag) to give plasmid pJOE4072.6.
  • BVMO expression was first performed in E. coli JM109 with pJOE4072.6. different Temperatures were tested and the amount of BVMO in the soluble fraction and in inclusion bodies was examined by SDS-PAGE and Western blot. Western blot analysis was used to identify the correct protein band of approximately 56 kDa corresponding to the BVMO. The best results were obtained at 30 0 C because less enzyme was found in inclusion bodies here, compared to 37 ° C, and the entire expression level was higher than at 25 ° C. Nevertheless, the amount of soluble BVMO was relatively low. Therefore, the BVMO gene was subcloned into the multi-copy vector pET22b (+) and expressed in BL21 (DE3).
  • Racemic ⁇ -hydroxy ketones la-c (Reaction Scheme 1) synthesized by the method described by Smith and Levenberg (1981) were subjected to kinetic resolution by Baeyer-Villiger enzymatic oxidation to yield hydroxyalkyl acetates 2a-c (Reaction Scheme 1). Small amounts of the other possible products, methyl hydroxyacid 3a-c, were also formed (Scheme 1).
  • Table 3 Results of the kinetic resolution of hydroxy ketones la-c (see Reaction Scheme 1) using resting cells of E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 at 30 0 C in shake flasks.
  • the BVMO from P. fluorescens preferably converts the (S) - ⁇ -hydroxy ketones to the corresponding (S) -hydroxyalkyl acetates.
  • reaction times could be significantly shortened by carrying out kinetic resolutions with a higher ratio of enzyme to substrate.
  • Reactions were performed with quiescent cells in small volumes of 1 ml of concentrated cell suspension in 2 ml tubes with air-permeable lids. When the same substrate concentrations were used as in shake flasks, high conversions could already be achieved after shorter reaction times (Table 4). In addition, the E values obtained were significantly higher.
  • Table 4 Results of the kinetic resolution of the hydroxyketones la-c (see reaction scheme 1) with resting cells of E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 at 30 0 C in 2 ml tubes with air-permeable lids.
  • BVMO cyclohexanone monooxygenase
  • CPMO cyclopentanone monooxygenase
  • the CHMO shows a higher enantioselectivity in the oxidation of Ia (Scheme 1) compared to the BVMO from P. fluorescens DSM 50106, while in the conversion of Ib (Scheme 1) the E value is lower (Table 5).
  • This enzyme is likely to have a substrate inhibition in ⁇ -hydroxy ketone Ic (Reaction Scheme 1), but the enantioselectivity of the kinetic resolution of this compound is estimated to be relatively low.
  • the CPMO shows no economically acceptable E values for the Baeyer-Villiger oxidation of ⁇ -hydroxy ketones (Table 6).

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Abstract

The invention relates to a method for the enantioselective production of aliphatic acyclic esters from racemic aliphatic acyclic ketones by means of Baeyer-Villiger oxidation. The invention further relates to the kinetic enzymatic racemate resolution of racemic aliphatic acyclic ketones.

Description

Enantioselektive Darstellung von aliphatischen azyklischen Enantioselective representation of aliphatic acyclic
Estern und KetonenEsters and ketones
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enantioselektiven (stereoselektiven) Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern aus racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen durch Baeyer-Villiger-Oxidation. Ferner ist Gegenstand der Erfindung die kinetische enzymatische Race- matspaltung von racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen.The present invention relates to a process for the enantioselective (stereoselective) preparation of aliphatic acyclic esters from racemic aliphatic acyclic ketones by Baeyer-Villiger oxidation. The invention further relates to the kinetic enzymatic racemate cleavage of racemic aliphatic acyclic ketones.
1899 berichteten Baeyer und Villiger von einer Reaktion zyklischer Ketone mit Peroxymonoschwefelsaure, bei der Laktone dargestellt wurden (Baeyer und Villiger 1899) . Die Baeyer- Villiger-Reaktion wurde seitdem bei organischen Synthesen verwendet. Die chemische Baeyer-Villiger-Oxidation wird normalerweise durch Persäuren katalysiert und findet in einem zweischrittigen Verfahren statt, das durch Criegee beschrieben wurde (Criegee 1948) .In 1899 Baeyer and Villiger reported a reaction of cyclic ketones with peroxymonosulfuric acid, in which lactones were displayed (Baeyer and Villiger 1899). The Baeyer-Villiger reaction has since been used in organic syntheses. The chemical Baeyer-Villiger oxidation is normally catalyzed by peracids and found in one two-step procedure, which was described by Criegee (Criegee 1948).
Baeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMOs, E. C. 1.14.13.x) sind Enzyme, die zu der Klasse der Oxidoreduktasen gehören und aliphatische und zyklische Ketone unter Verwendung von Sauerstoff in Ester und Laktone umwandeln können (Mihovilovic et al. , 2002) .Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs, E.C. 1.14.13.x) are enzymes that belong to the class of oxidoreductases and can convert aliphatic and cyclic ketones to esters and lactones using oxygen (Mihovilovic et al., 2002).
BVMOs sind Flavin-abhängig (im allgemeinen FAD) und benötigen NAD(P)H, um die Oxidationsreaktion zu katalysieren. BVMOs können von einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen gebildet werden. Die am besten untersuchte BVMO ist bisher ein Enzym aus Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871, welches auch als Cyclohexanon Monooxygenase (CHMO) bezeichnet wird. Dieses Enzym konvertiert eine Vielzahl von mono- und bizyklischen Ketonen (Donoghue et al . 1976, Stewart 1998). Neben Monooxygenasen, die Cycloketone umwandeln, welche auch in Comamonas (Griffin und Trudgill 1976) , Nocardia (Donoghue et al . 1976), Rhodococcus (Brzostowicz et al . 2003, Kostichka et al. 2001, WO 03/020890), Brevibacterium (Brzostowicz et al . 2002, WO 03/020890), Arthrobacter (Brzostowicz et al . 2003, Kyte et al . 2004, WO 03/020890) und Xanthobacter sp. (van Beilen et al . 2003) gefunden wurden, wurde auch von anderen BVMOs berichtet, die aromatische Ketone, zum Beispiel die 4- Hydroxyacetophenon Monooxygenase (Kamerbeek et al . 2001) und die Phenylaceton Monooxygenase (Fraaije et al . 2005) oder aliphatische offenkettige Ketone (Britton und Markovetz 1977, Fraaije et al . 2004) umwandeln können.BVMOs are flavin-dependent (generally FAD) and require NAD (P) H to catalyze the oxidation reaction. BVMOs can be formed from a variety of bacteria and fungi. The best-studied BVMO to date is an enzyme from Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871, which is also referred to as cyclohexanone monooxygenase (CHMO). This enzyme converts a variety of mono- and bicyclic ketones (Donoghue et al., 1976, Stewart 1998). In addition to monooxygenases which convert cycloketones, which are also known in Comamonas (Griffin and Trudgill 1976), Nocardia (Donoghue et al., 1976), Rhodococcus (Brzostowicz et al., 2003, Kostichka et al., 2001, WO 03/020890), Brevibacterium (Brzostowicz et al., 2002, WO 03/020890), Arthrobacter (Brzostowicz et al., 2003, Kyte et al., 2004, WO 03/020890), and Xanthobacter sp. (van Beilen et al., 2003) have also been reported by other BVMOs, the aromatic ketones, for example, 4-hydroxyacetophenone monooxygenase (Kamerbeek et al., 2001) and phenylacetone monooxygenase (Fraaije et al., 2005) or aliphatic open-chain Ketone (Britton and Markovetz 1977, Fraaije et al., 2004).
Da es auch in industriellen Verfahren immer mehr von Interesse ist, Baeyer-Villiger-Oxidationen enantioselektiv durchzuführen (Mihovilovic et al . 2004), stellen BVMOs neben Metall- basierten chiralen Katalysatoren (Strukul 1998) eine Möglichkeit dar, um enantioselektiv Ester und Laktone darzustellen.As Baeyer-Villiger oxidations are also becoming increasingly enantioselective in industrial processes (Mihovilovic et al., 2004), BVMOs, in addition to metal based chiral catalysts (Strukul 1998) is one way to enantioselectively esters and lactones represent.
Bisher wurde beschrieben, dass Substrate für Baeyer-Villiger Monooxygenasen (racemische oder prochirale) mono- und bizyklische Ketone (Alphand und Furstoss 1992, Carnell et al . 1991, Mihovilovic et al . 2005, Taschner und Black 1988, Taschner et al . 1993, Taschner und Peddada 1992) und racemische aromatische Ketone (Kamerbeek et al . 2003, Fraaije et al . 2005, Gonzalo et al . 2005) sein können, so dass hier eine enantioselektive Baeyer-Villiger-Oxidationen möglich ist.To date, it has been described that substrates for Baeyer-Villiger monooxygenases (racemic or prochiral) monocyclic and bicyclic ketones (Alphand and Furstoss 1992, Carnell et al 1991, Mihovilovic et al., 2005, Taschner and Black 1988, Taschner et al. Taschner and Peddada 1992) and racemic aromatic ketones (Kamerbeek et al., 2003, Fraaije et al., 2005, Gonzalo et al., 2005), so that an enantioselective Baeyer-Villiger oxidation is possible.
Eine enzymatische Konversion racemischer aliphatischer azyklischer Ketone wurde demgegenüber bisher nicht beschrieben.An enzymatic conversion of racemic aliphatic acyclic ketones, however, has not been described.
Eine chemische Baeyer-Villiger-Oxidation von aliphatischen azyklischen Ketonen ist bekannt. Park und Kozikowski (1988) berichteten von einer chemischen Baeyer-Villiger-Oxidation von ß-Hydroxyketonen unter Verwendung von Persäuren, bei der acylierte Diole entstanden. Die Reaktionen wurden jedoch nicht enantioselektiv durchgeführt.A Baeyer-Villiger chemical oxidation of aliphatic acyclic ketones is known. Park and Kozikowski (1988) reported a chemical Baeyer-Villiger oxidation of β-hydroxyketones using peracids to give acylated diols. However, the reactions were not performed enantioselectively.
Demgegenüber stellt sich dem Fachmann die Aufgabe, ein Verfahren zur enantioselektiven Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern bereitzustellen. Weiterhin besteht ein Bedarf, aliphatische azyklische Ketone enantioselektiv bereitstellen zu können.In contrast, it is the task of the skilled person to provide a process for the enantioselective preparation of aliphatic acyclic esters. Furthermore, there is a need to be able to provide aliphatic acyclic ketones enantioselectively.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgaben. Sie stellt ein Verfahren zur Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern aus racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen durch Baeyer-Villiger-Oxidation zur Verfügung, bei dem die Baeyer- Villiger-Oxidation enantioselektiv verläuft und man zur Oxidation Baeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMO) verwendet. Überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass optisch aktive aliphatische azyklische Ketone überhaupt Substrate von Baeyer-Villiger Monooxygenasen sein können, und dass diese mit hoher Enantioselektivität umgesetzt werden können.The present invention solves these problems. It provides a method for the production of aliphatic acyclic esters from racemic aliphatic acyclic ketones by Baeyer-Villiger oxidation, in which the Baeyer-Villiger oxidation proceeds enantioselectively and Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMO) are used for the oxidation. Surprisingly, it has been shown in the context of the present invention that optically active aliphatic acyclic ketones can even be substrates of Baeyer-Villiger monooxygenases, and that these can be reacted with high enantioselectivity.
Damit kann bei aliphatischen azyklischen Ketonen nun erstmals eine enantioselektive Baeyer-Villiger-Oxidation durchgeführt werden.Thus, in the case of aliphatic acyclic ketones, an enantioselective Baeyer-Villiger oxidation can now be carried out for the first time.
Diese wird als enantioselektiv bzw. als stereoselektiv bezeichnet, wenn eine Enantioselektivität E von mehr als 1, bevorzugt mehr als 2 erreicht wird, also ein Enantiomer gegenüber dem anderen im Überschuß vorliegt. Eine industrielle Anwendung ist vor allem lohnend, wenn eine hohe Enantioselektivität E von mindestens 10, bevorzugt von mindestens 40 erreicht wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass bei der enzymatischen Umsetzung aliphatischer azyklischer Ketone mittels BVMO eine derartige Enantioselektivität erreicht werden kann.This is referred to as enantioselective or stereoselective if an enantioselectivity E of more than 1, preferably more than 2, is reached, ie one enantiomer is present in excess over the other. An industrial application is especially worthwhile if a high enantioselectivity E of at least 10, preferably of at least 40, is achieved. In the context of the present invention, it has surprisingly been found that such enantioselectivity can be achieved in the enzymatic reaction of aliphatic acyclic ketones by means of BVMO.
Enantiomerenüberschuß und Enantioselektivität werden nach geeigneter, z.B. gaschromatographischer Analyse der Produkte der Reaktion nach folgender Formel berechnet (Chen 1982) :Enantiomeric excess and enantioselectivity are determined as appropriate, e.g. Gas chromatographic analysis of the products of the reaction calculated according to the following formula (Chen 1982):
Enantiomerenüberschuss : 100 mit AR - Peakflache des (R) -Enantiomers und As - Peakflache des (S) -EnantiomersEnantiomeric excess: 100 with A R - peak area of the (R) - enantiomer and As - peak area of the (S) - enantiomer
Umsatz : %C = s- 100 ees + eeP Sales:% C = s - 100 ee s + ee P
mit ees - Enantiomerenüberschuss des Substrates eeP - Enantiomerenüberschuss des Produktes v _ . . . . . . .„ „ In[Q - C)Q - ee5)] In[I - CQ + ee, )]with ee s - enantiomeric excess of the substrate ee P - enantiomeric excess of the product v _. , , , , , . "" In [Q - C) Q - ee 5 )] In [I - CQ + ee,)]
Enantioselektxvitat : E = — = ln[(l-Q(I+ees)] \n[\-C(\-eeP)]Enantioselectivity: E = - = ln [(lQ (I + ee s )] \ n [\ - C (\ - ee P )]
Bevorzugt ist die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Baeyer-Villiger Monooxygenase spezifisch für aliphatische azyklische Ketone . Dabei weist die Bezeichnung aliphatische azyklische Ketone darauf hin, dass die Ketogruppe weder direkt mit einer aromatischen oder zyklischen Gruppe verbunden ist noch das Molekül aromatische oder zyklische Substituenten enthält .Preferably, the Baeyer-Villiger monooxygenase used in the method of the invention is specific for aliphatic acyclic ketones. The term aliphatic acyclic ketones indicates that the keto group is neither directly linked to an aromatic or cyclic group nor does the molecule contain aromatic or cyclic substituents.
Insbesondere weisen die Ketone eine FormelIn particular, the ketones have a formula
1 1
auf, bei der Rl, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ein substituierter oder unsubstituierter, linearer oder verzweigter Alkylrest, Alkenylrest, Alkinylrest, ein Hydroxy- alkylrest, Carboxylrest , Alkoxycarboxylrest , Aminorest, Amino- alkylrest, Aminocarbonylrest , Hydroxylrest oder ein Halogenrest ist,in which R 1, R 2, R 3 and R 4 independently of one another are a substituted or unsubstituted, linear or branched alkyl radical, alkenyl radical, alkynyl radical, a hydroxyalkyl radical, carboxyl radical, alkoxycarboxyl radical, amino radical, aminoalkyl radical, aminocarbonyl radical, hydroxyl radical or a halogen radical,
wobei R3 oder R4 auch Wasserstoff sein können,where R3 or R4 can also be hydrogen,
mit der Maßgabe, dass R2 , R3 und R4 sich unterscheiden.with the proviso that R2, R3 and R4 are different.
Bevorzugt ist Rl ein linearer oder verzweigter Alkylrest mit 1-6 C-Atomen, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, n-Butyl, oder Isobutyl . R2 ist bevorzugt ein Hydroxylrest , Aminorest oder ein Halogenrest, also z.B. Chlor, Brom oder Iod. Besonders bevorzugt ist es für das erfindungsgemäße Verfahren, wenn R2 ein Hydroxylrest ist, das Keton also ein ß-Hydroxyketon ist.R 1 is preferably a linear or branched alkyl radical having 1-6 C atoms, in particular methyl, ethyl, propyl, n-butyl or isobutyl. R 2 is preferably a hydroxyl radical, amino radical or a halogen radical, ie, for example, chlorine, bromine or iodine. It is particularly preferred for the process according to the invention if R 2 is a hydroxyl radical, ie the ketone is a β-hydroxyketone.
Das mit R2 verbundene C-Atom ist chiral, R2 , R3 und R4 unterscheiden sich also. Bei dem erfindungsgetnäßen Verfahren werden als Edukte racemische Mischungen eingesetzt.The C atom attached to R2 is chiral, so R2, R3 and R4 are different. In the process according to the invention, racemic mixtures are used as starting materials.
Bevorzugt ist R3 oder R4 Wasserstoff . Besonders bevorzugt ist es, dass R3 oder R4 ein Alkylrest mit einer Kettenlänge von 1- 14 C-Atomen ist, insbesondere 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 C-Atomen, und dass R3 oder R4 - also der jeweils andere Substituent - Wasserstoff ist. Bevorzugt ist der Alkylrest linear und unsubstituiert . Als kurzkettige Alkyreste werden in der Folge Alkylreste mit einer Kettenlänge von 1-10 C-Atomen, als mittelkettige Alkylreste solche mit einer Kettenlänge von 11-14 C-Atomen bezeichnet.Preferably, R3 or R4 is hydrogen. It is particularly preferred that R 3 or R 4 is an alkyl radical having a chain length of 1 to 14 C atoms, in particular 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 C atoms, and that R3 or R4 - that is the other substituent - is hydrogen. The alkyl radical is preferably linear and unsubstituted. As a short-chain alkyl radicals in the sequence alkyl radicals having a chain length of 1-10 C-atoms, as medium-chain alkyl radicals are those having a chain length of 11-14 carbon atoms called.
Bevorzugt ist n=l, n kann jedoch z.B. auch 2, 3, 4, 5, 6 , 7 , 8, 9 oder 10 sein.Preferably, n = 1, but n may be e.g. also be 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das ß- Hydroxyketon folgende Formel auf:In a particularly preferred embodiment, the β-hydroxyketone has the following formula:
O OHOH
wobei R3 ein Alkylrest mit einer Kettenlänge von 2-20 C-Atomen ist, insbesondere mit einer Kettenlänge von 2-10 C-Atomen. Ferner kann das ß-Hydroxyketon am α-C-Atom anstelle der Methylgruppe einen Rest Rl entsprechend der obigen Definition tragen. Unter ' linearer oder verzweigter Alkylrest ■ wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Kohlenwasserstoffrest der allgemeinen Formel CnH2n+I verstanden. Explizit eingeschlossen sind die Reste Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek. Butyl, tert . Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl , Hexyl , Decyl , Dodecyl .wherein R3 is an alkyl radical having a chain length of 2-20 C atoms, in particular having a chain length of 2-10 C atoms. Further, the β-hydroxy ketone at the α-C atom instead of the methyl group can carry a radical Rl according to the above definition. A hydrocarbon radical of the general formula C n H as' linear or branched alkyl ■ understood 2n + I in the present invention. Explicitly included are the radicals methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec. Butyl, tert. Butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, decyl, dodecyl.
Nicht einschränkende Beispiele für ein erfindungsgemäßes lineares oder verzweigtes Alkenyl, d.h. für einen Kohlenwasserstoffrest, der eine oder mehrere C-C-Doppelbindungen enthält, sind Propenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 3-Pentenyl, 1,3- Hexadienyl u.a..Non-limiting examples of a linear or branched alkenyl of the invention, i. for a hydrocarbon radical containing one or more C-C double bonds, propenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 3-pentenyl, 1,3-hexadienyl, etc. are.
'Alkinyl1 steht für z.B. Propinyl, 2-Butinyl, 3-Butinyl, 4- Hexinyl, 1-Decinyl u.a., d.h. für einen Kohlenwasserstoffrest , der eine oder mehrere C-C-Dreifachbindungen enthält.Alkynyl 1 represents , for example, propynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 4-hexynyl, 1-decynyl, etc., ie a hydrocarbon radical which contains one or more C-C triple bonds.
Es versteht sich, dass auch Kohlenwasserstoffreste eingeschlossen sind, die sowohl Doppel- als auch Dreifachbindungen enthalten.It will be understood that hydrocarbon radicals are also included which contain both double and triple bonds.
Alle genannten Kohlenwasserstoffreste können gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein, z.B. durch Alkyl-, Halogen-, Hydroxy- und/oder Amino-Gruppen.All of the hydrocarbon radicals mentioned may optionally be monosubstituted or polysubstituted, e.g. by alkyl, halogen, hydroxyl and / or amino groups.
Hydroxyalkyl- steht für einen vorstehend genannten Alkylrest, der hydroxyliert ist. Beispielsweise sei hier Hydroxyethyl genannt .Hydroxyalkyl stands for an abovementioned alkyl radical which is hydroxylated. For example, hydroxyethyl may be mentioned here.
Aminoalkyl-, Alkylaminoalkyl- stehen jeweils für einen vorstehend genannten Alkylrest der eine Aminogruppe trägt, die mono- aber auch dialkyliert sein kann. Beispiele sind der Aminoethyl- und der Dimethylaminoethylrest . Alkoxyalkyl steht für einen vorstehend genannten Alkylrest, an den eine Alkoxygruppe gebunden ist. Beispiele hierfür sind der Ethoxyethyl- und der Ethoxypropylrest .Aminoalkyl-, Alkylaminoalkyl- each represent an above-mentioned alkyl radical which carries an amino group, which may be mono- but also dialkylated. Examples are the aminoethyl and the dimethylaminoethyl radical. Alkoxyalkyl represents an abovementioned alkyl radical to which an alkoxy group is bonded. Examples of these are ethoxyethyl and ethoxypropyl.
Alkoxycarbonyl steht für einen Carbonylrest , an den eine Alkoxygruppe gebunden ist. Beispiele sind der Methoxycarbonyl- und der Ethoxycarbonylrest .Alkoxycarbonyl is a carbonyl radical to which an alkoxy group is bonded. Examples are the methoxycarbonyl and the ethoxycarbonyl.
Alkoxycarbonylalkyl steht für einen vorstehend genannten Alkylrest an den eine Alkoxycarbonylgruppe gebunden ist. Beispiele hierfür sind der Ethoxycarbonylmethyl- und der Meth- oxycarbonylmethylrest .Alkoxycarbonylalkyl is an abovementioned alkyl radical to which an alkoxycarbonyl group is bonded. Examples of these are ethoxycarbonylmethyl and methoxycarbonylmethyl radicals.
Bevorzugt wird bei dem erfindungsgetnäßen Verfahren eine Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMO) verwendet, die aus Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) oder Pseudomonas putida (P. putida) stammt oder ein funktionelles Derivat davon ist. Diese weisen eine besonders hohe Spezifität für aliphatische azyklische Ketone auf und können diese mit hoher Enantioselektivität zu Estern umsetzen.Preferably, the method of the invention uses a Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO) derived from Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) or Pseudomonas putida (P. putida) or a functional derivative thereof. These have a particularly high specificity for aliphatic acyclic ketones and can implement them with high enantioselectivity to esters.
Dabei weist die BVMO aus P. fluorescens eine besonders hohe Spezifität für Ketone auf, bei denen R3 ein kurzkettiger Alkylrest ist, z.B. mit 4, 6, oder 8 C-Atomen, so dass dieses Enzym bevorzugt zur Umsetzung dieser Ketone verwendet wird. Die BVMO aus P. putida weist eine gleichartige Spezifität auf. Bei beiden Enzymen sind ß-Hydroxyketone bevorzugte Substrate.The BVMO from P. fluorescens has a particularly high specificity for ketones in which R3 is a short-chain alkyl radical, e.g. with 4, 6, or 8 C atoms, so that this enzyme is preferably used for the reaction of these ketones. The BVMO from P. putida has a similar specificity. In both enzymes β-hydroxy ketones are preferred substrates.
Bevorzugt umfasst die Baeyer-Villiger Monooxygenase eine Sequenz, die eine Homologie von mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95% zu SEQ ID NO: 1 (BVMO aus P. fluorescens) oder SEQ ID NO: 3 (BVMO aus P. putida) aufweist . Bevorzugt weist die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Baeyer-Villiger Monooxygenase die Sequenz nach SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 auf. Die Sequenz der BVMO aus P. fluorescens ist unter der GenBank Zugangsnummer AAC36351 (Protein) bzw. AF090329 (Genom) und die Sequenz der BVMO aus P. putida unter AAN68413 (Protein) bzw. AE015451 (Genom) veröffentlicht .The Baeyer-Villiger monooxygenase preferably comprises a sequence which has a homology of at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 95% to SEQ ID NO: 1 (BVMO from P. fluorescens) or SEQ ID NO: 3 (BVMO from P. putida). The Baeyer-Villiger monooxygenase used in the method according to the invention preferably has the sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. The P. fluorescens BVMO sequence is published under the GenBank accession numbers AAC36351 (protein) and AF090329 (genome) and the BVMO sequence from P. putida under AAN68413 (protein) and AE015451 (genome), respectively.
Als funktionelles Derivat ist die BVMO in der Lage, aliphatische azyklische Ketone in einer Baeyer-Villiger- Oxidation zu Estern umzusetzen. Die Effektivität der Umsetzung liegt bevorzugt mindestens bei C = 10% oder 30%, mehr bevorzugt bei mindestens C = 50% der Umsetzung durch das natürlich vorkommende Enzym.As a functional derivative, the BVMO is able to convert aliphatic acyclic ketones to esters in a Baeyer-Villiger oxidation. The effectiveness of the reaction is preferably at least C = 10% or 30%, more preferably at least C = 50% of the reaction by the naturally occurring enzyme.
Das Baeyer-Villiger Monooxygenase-Sequenzmotiv, das von Fraaije et al . (2002, siehe auch WO 03/020890) gefunden wurde, liegt auch in der Proteinsequenz der in dem erfindungsgemäßen Verahren bevorzugt verwendeten Enzyms vor.The Baeyer-Villiger monooxygenase sequence motif described by Fraaije et al. (2002, see also WO 03/020890) is also present in the protein sequence of the enzyme preferably used in the method according to the invention.
Es war jedoch überraschend, dass die BVMO aus P. fluorescens, keine zyklischen Baeyer-Villiger Substrate wie Cycloketone oder aromatische Ketone umwandelt, da das Enzym, wenn man es mit charakterisierten BVMOs mit einem bekannten Substrat- spektrum vergleicht, die höchste Sequenzähnlichkeit zu 4- Hydroxyacetophenon Monooxygenase (HAPMO, 37% Aminosäureidentität) aufweist. Eine phylogenetische Analyse zeigte die gleiche enge Verwandtschaft zwischen HAPMO und der BVMO von P. fluorescens DSM50106.However, it was surprising that the BVMO from P. fluorescens does not convert cyclic Baeyer-Villiger substrates, such as cycloketones or aromatic ketones, because the enzyme, when compared to characterized BVMOs with a known substrate spectrum, has the highest sequence similarity. Hydroxyacetophenone monooxygenase (HAPMO, 37% amino acid identity). Phylogenetic analysis showed the same close affinity between HAPMO and the BVMO of P. fluorescens DSM50106.
Eine ähnliche Substratspezifität wie bei dem Enzym aus P. fluorescens wurde auch für eine Baeyer-Villiger Monooxygenase aus Pseudomonas cepacia (Tridecanon Monooxygenase) gefunden. Im Gegensatz zu der BVMO aus P. fluorescens DSM50106 bevorzugt diese Tridecanon Monooxygenase jedoch mittelkettige Ketone mit C12 bis Ci4 und wandelt auch Cyclopentanon mit einer hohen spezifischen Aktivität um. Dieses Enzym ist aus Britton und Markovetz (1977) bekannt.Similar substrate specificity to the P. fluorescens enzyme was also found for a Baeyer-Villiger monooxygenase from Pseudomonas cepacia (tridecanone monooxygenase). In contrast to the BVMO from P. fluorescens DSM50106 preferred However this tridecanone monooxygenase medium ketones having C 12 to C 4, and also converts to cyclopentanone with a high specific activity. This enzyme is known from Britton and Markovetz (1977).
Es können in dem erfindungsgemäßen Verfahren auch andere BVMOs verwendet werden, so etwa die Tridecanon Monooxygenase aus P. cepacia (Britton und Markovetz 1977) , die Cyclohexanon Monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 (Donoghue et al . 1976) oder die Cyclopentanon Monooxygenase (CPMO) aus Comamonas sp. NCIMB 9872 (Griffin und Trudgill 1976) . Die Aktivität der CHMO und der CPMO gegenüber den ß-Hydroxyketonen nimmt jedoch bei steigender Kettenlänge der Substituenten deutlich ab. CHMO kann industriell lohnend etwa für die Umsetzung eines ß-Hydroxyketons mit einem Rest R3 mit 1, 2, 3 oder 4 C-Atomen eingesetzt werden.Other BVMOs may also be used in the method of the invention, such as the tridecanone monooxygenase from P. cepacia (Britton and Markovetz 1977), the cyclohexanone monooxygenase (CHMO) from Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 (Donoghue et al., 1976) or the cyclopentanone monooxygenase (CPMO) from Comamonas sp. NCIMB 9872 (Griffin and Trudgill 1976). However, the activity of the CHMO and the CPMO towards the β-hydroxy ketones decreases markedly as the chain length of the substituents increases. CHMO can industrially rewarding be used for example for the implementation of a ß-hydroxyketone having a radical R3 with 1, 2, 3 or 4 C-atoms.
Die Eignung einer BVMO für die Umsetzung eines bestimmten Substrates bzw. Herstellung eines bestimmten Esters für einen spezifischen, z.B. industriellen Zweck kann getestet werden, indem die BVMO, wie in den Beispielen beschrieben, mit dem Substrat inkubiert und die Produkte der Reaktion analysiert werden .The suitability of a BVMO for the implementation of a particular substrate or production of a specific ester for a specific, e.g. industrial purpose can be tested by incubating the BVMO with the substrate as described in the Examples and analyzing the products of the reaction.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Ketone bevorzugt oxidiert, indem man sie mit wachsenden oder ruhenden Zellen inkubiert werden, welche die Baeyer-Villiger Monooxygenasen enthalten. Dadurch ist es nicht notwendig, das Enzym vor der Reaktion aufzureinigen und gemeinsam mit Cofaktoren wie NADPH isoliert in der Reaktion einzusetzen. Auch dies ist jedoch grundsätzlich möglich, wie z.B: in Britton und Markovetz, 1977, gezeigt. Bevorzugt werden ruhende Zellen eingesetzt. Um die Bildung von Einschlußkörpern zu verringern, ist es bevorzugt, dass die Zellen ferner Chaperone überexprimieren, beispielsweise durch Expression von GroES/GroEL aus Plasmidvektoren (Ikura et al . 2002, Lee et al . 2004, Nishihara et al. 1998, Nishihara et al . 2000) .In the method of the invention, the ketones are preferably oxidized by incubating them with growing or quiescent cells containing the Baeyer-Villiger monooxygenases. Thus, it is not necessary to purify the enzyme prior to the reaction and to use it in isolation with cofactors such as NADPH isolated in the reaction. However, this is also possible in principle, as shown, for example, in Britton and Markovetz, 1977. Dormant cells are preferably used. In order to reduce the formation of inclusion bodies, it is preferred that the cells also overexpress chaperones, for example, by expression of GroES / GroEL from plasmid vectors (Ikura et al., 2002, Lee et al., 2004, Nishihara et al., 1998, Nishihara et al., 2000).
Die Zellen können eukaryotische Zellen, etwa Hefen, sein, sind jedoch bevorzugt bakterielle Zellen, wie Escherichia coli, Pseudomonas sp . , Bacillus sp., Aspergillus sp. Am meisten bevorzugt ist die Expression in E. coli, z.B. in E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3) oder E. coli Origami™ (DE3) . Bevorzugt ist die Expression des Enzyms induzierbar. Bevorzugte Expressionsvektoren basieren auf pJOE- oder pET- Vektoren und sind in den Beispielen im Detail beschrieben, wie z.B. der Expressionsvektor pJOE4072.6 oder pET22BVMO.The cells may be eukaryotic cells, such as yeasts, but are preferably bacterial cells, such as Escherichia coli, Pseudomonas sp. , Bacillus sp., Aspergillus sp. Most preferred is expression in E. coli, e.g. in E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3) or E. coli Origami ™ (DE3). Preferably, the expression of the enzyme is inducible. Preferred expression vectors are based on pJOE or pET vectors and are described in detail in the examples, e.g. the expression vector pJOE4072.6 or pET22BVMO.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt bei ca. 20 bis 370C durchgeführt. Besonders bevorzugt ist eine Inkubations- temperatur von ca. 25 bis 300C, insbesondere ca. 300C, da leicht flüchtige Ketone und Ester hier nur zu einem geringen Ausmaß verdampfen. Wie in den Beispielen beschrieben, kann die Temperatur auch für verschiedene Schritte variiert werden.The inventive method is preferably carried out at about 20 to 37 0 C. Particularly preferred is an incubation temperature of about 25 to 30 0 C, in particular about 30 0 C, since volatile volatiles and esters evaporate here only to a small extent. As described in the examples, the temperature can also be varied for different steps.
Zur Herstellung der Ester mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können die durch die Baeyer-Villiger-Oxidation erzeugten Ester isoliert und aufreinigt werden. Es ist alternativ auch möglich, gegebenenfalls nach Abtrennung der Zellen z.B. durch Oxidation oder ohne Aufreinigung eine direkte Umsetzung der Ester in dem Reaktionsgemisch durchzuführen. Diese weitere Umsetzung kann chemisch oder enzymatisch sein.For the preparation of the esters by the process according to the invention, the esters produced by the Baeyer-Villiger oxidation can be isolated and purified. Alternatively, it is also possible, optionally after separation of the cells e.g. to carry out a direct reaction of the esters in the reaction mixture by oxidation or without purification. This further reaction can be chemical or enzymatic.
Die Aufreinigung der Ester kann durch Extraktion mit geeigneten Lösungsmittlen, z.B. Dichlormethan erfolgen. Es wurde jedoch festgestellt, dass bei einer Extraktion mit Ethylacetat eine bessere Ausbeute erhalten wird. Anschließend kann der Ester von gleichzeitig extrahiertem nicht umgesetzten Keton getrennt werden, z.B. durch Säulenchromatographie an Kieselgel, insbesondere unter Verwendung einer geeigneten Lösungs- mittelmischung, beispielweise von Hexan: Ethylacetat 5:1.The purification of the esters can be carried out by extraction with suitable solvents, for example dichloromethane. However, it was found that extraction with ethyl acetate gave a better yield. Subsequently, the ester of simultaneously extracted unreacted ketone be separated, for example by column chromatography on silica gel, in particular using a suitable solvent mixture, for example, of hexane: ethyl acetate 5: 1.
Die vorliegende Erfindung stellt neben dem Verfahren zur enantioselektiven Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern gleichzeitig ein Verfahren zur enantioselektiven Herstellung von aliphatischen azyklischen Ketonen zur Verfügung. Insbesondere wird das von dem jeweiligen Enzym nicht umgesetzte Enantiomer erhalten. Bei der beschriebenen Baeyer-Villiger-Oxidation der Ketone wird als Ausgangsstoff eine racemische Mischung von Ketonen eingesetzt, von dem durch das Enyzm enantioselektiv ein Enantiomer in den Ester umgesetzt wird. Wenn man die nicht umgesetzten Ketone isoliert und aufreinigt, z.B. durch Extraktion und anschließende säulenchromatographische Trennung, erhält man damit das andere Enantiomer des Ketons .The present invention, in addition to the process for the enantioselective preparation of aliphatic acyclic esters, simultaneously provides a process for the enantioselective preparation of aliphatic acyclic ketones. In particular, the enantiomer unreacted by the particular enzyme is obtained. In the described Baeyer-Villiger oxidation of the ketones, the starting material used is a racemic mixture of ketones, from which an enantiomer is enantioselectively converted into the ester by the enzyme. When isolating and purifying the unreacted ketones, e.g. by extraction and subsequent separation by column chromatography, this gives the other enantiomer of the ketone.
Damit ist das erfindungsgemäße Verfahren auch ein neues Verfahren zur Racematspaltung von aliphatischen azyklischen Ketonen, also zur Trennung von Racematen in die Enantiomere. Das Verfahren wird als katalytische kinetische Racematspaltung bezeichnet, da durch das Enzym ein Enantiomer des Edukts schneller als das spiegelbildliche Enantiomer des Ketons umgesetzt wird.Thus, the process according to the invention is also a novel process for the racemate resolution of aliphatic acyclic ketones, ie for the separation of racemates into the enantiomers. The process is referred to as catalytic kinetic resolution because the enzyme reacts one enantiomer of the reactant faster than the mirror image enantiomer of the ketone.
Um eine möglichst vollständige Umsetzung und damit Abtrennung des einen Enantiomers zu erreichen, kann es vorteilhaft sein, den entstehenden Ester abzutrennen oder in einer anderen Reaktion weiter umzuwandeln, z.B. eine Hydrolyse des Esters durchzuführen .In order to achieve as complete a reaction as possible and thus separation of the one enantiomer, it may be advantageous to separate off the resulting ester or to further convert it in another reaction, e.g. to carry out a hydrolysis of the ester.
Bevorzugt haben die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ester und/oder Ketone eine Reinheit der Enantiomere von mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%, 90% oder 95% oder 99%.The esters and / or ketones obtained by the process according to the invention preferably have a purity of the enantiomers of at least 70%, preferably at least 80%, 90% or 95% or 99%.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist damit auch deshalb besonders vorteilhaft, da mit nur einem Reaktionsschritt sowohl eine enantioselektive Herstellung von aliphatischen azyklischen Ketonen als auch aliphatischen azyklischen Estern möglich wird.The process according to the invention is therefore also particularly advantageous since both enantioselective preparation of aliphatic acyclic ketones and aliphatic acyclic esters is possible with only one reaction step.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin auch die Verwendung von Baeyer-Villiger Monooxygenasen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Besonders bevorzugt ist auch hier die Verwendung der oben beschriebenen Baeyer-Villiger Monooxygenasen, insbesondere der BVMOs, die aus Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) oder P. putida stammen oder funktionelle Derivate davon sind.The present invention furthermore relates to the use of Baeyer-Villiger monooxygenases for carrying out the process according to the invention. Particularly preferred here too is the use of the Baeyer-Villiger monooxygenases described above, in particular the BVMOs which originate from Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) or P. putida or are functional derivatives thereof.
Die Erfindung betrifft damit auch die Verwendung von Baeyer- Villiger Monooxygenasen zur steroeselektiven Baeyer-Villiger Oxidation von racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen.The invention thus also relates to the use of Baeyer-Villiger monooxygenases for the steroe-selective Baeyer-Villiger oxidation of racemic aliphatic acyclic ketones.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung anhand der Baeyer-Villiger Oxidation spezifischer ß-Hydroxyketone unter Verwendung spezifischer BVMOs beispielhaft illustriert. Es ist dem Fachmann jedoch eine Vielzahl von Modifikationen möglich, die ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegen. In the following examples, the invention is exemplified by the Baeyer-Villiger oxidation of specific β-hydroxyketones using specific BVMOs. However, it is the person skilled in a variety of modifications possible, which are also within the scope of the invention.
BEISPIELEEXAMPLES
Baeyer-Villiger-Monooxygenase-katalysierte kinetische Spaltung racemischer aliphatischer azyklischer Ketone und enantio- selektive Herstellung aliphatischer azyklischer EsterBaeyer-Villiger monooxygenase-catalyzed kinetic cleavage of racemic aliphatic acyclic ketones and enantioselective preparation of aliphatic acyclic esters
Material und Methodenmaterial and methods
Chemikalienchemicals
Alle Chemikalien wurden, wenn nicht anderweitig angegeben, vonAll chemicals were used unless otherwise stated
Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) , Fisher ScientificSigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany), Fisher Scientific
(Schwerte, Deutschland) , VWR (Darmstadt, Deutschland) , ABCR(Schwerte, Germany), VWR (Darmstadt, Germany), ABCR
(Karlsruhe, Deutschland) und Roth GmbH (Karlsruhe,(Karlsruhe, Germany) and Roth GmbH (Karlsruhe,
Deutschland) erworben.Germany).
Bakterienstämme und PlasmideBacterial strains and plasmids
E. coli JM109 wurde von New England Biolabs (Beverly, MA, USA) erhalten. E.. coli BL21 (DE3) , Origami™ (DE3) und pET22b( +) wurden von Novagen erworben (Darmstadt, Deutschland) . P. fluorescens DSM 50106 ist allgemein erhältlich (zum Beispiel Khalameyzer et al . , 1999) und kann beispielsweise von der DSMZ (Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Das Chaperon- Plasmid-Set, welches die Plasmide pG-KJE8, pGro7 , pKJE7, pG- Tf2 und pTfl6 enthält, wurde vom TaKaRa Bio Inc. (Otsu, Japan) erworben.E. coli JM109 was obtained from New England Biolabs (Beverly, MA, USA). E. coli BL21 (DE3), Origami ™ (DE3) and pET22b (+) were purchased from Novagen (Darmstadt, Germany). P. fluorescens DSM 50106 is commonly available (for example, Khalameyzer et al., 1999) and may be obtained, for example, from DSMZ (Braunschweig, Germany). The chaperone plasmid set containing plasmids pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2 and pTfl6 was purchased from TaKaRa Bio Inc. (Otsu, Japan).
Herstellung der ExpressionsvektorenProduction of the expression vectors
Das BVMO-Gen wurde ohne Stopcodon mit Hilfe der Polymerase- kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der Oligonukleotide S3089 (5'-AAA ACA ,TAT GAA TGC CCA CAG TGA TT-31 (SEQ ID NO: 4) und S3090 (5'-AAA AGG ATC CTG AGA GGC TGC CTT CTG CC-31 (SEQ ID NO: 5) ) und Taql DNA Polymerase (Biozym Diagnostik GmbH, Oldendorf , Deutschland) aus P. fluorescens DNA amplifiziert . Die Sequenz des Enzyms ist unter der Zugangsnummer AF090329 bei der GenBank-Datenbank hinterlegt (siehe auch SEQ ID NO: 1) . Die Restriktionsstellen für Ndel und BamHI in den Primer- Sequenzen (unterstrichen) wurden verwendet, um das ampli- fizierte Fragment zwischen die Ndeϊ/BamHl Stellen des L-Rham- nose-induzierbaren Expressionsvektors pJOE3075 (Stumpp et al . 2000) zu klonieren. Dadurch wurde das BVMO Gen am C-terminalen Ende im Leseraster mit sechs Histidin Codons verbunden (His- Tag) , die in dem Vektor auf die BamHI Restriktionsstelle folgen. Dieses Plasmid wurde als pJOE4072.6 bezeichnet.The BVMO gene was used without stop codon by means of the polymerase chain reaction (PCR) using the oligonucleotides S3089 (5'-AAA ACA, TAT GAA TGC CCA CAG TGA TT-3 1 (SEQ ID NO: 4) and S3090 (5 '). -AAA AGG ATC CTG AGA GGC TGC CTT CTG CC-3 1 (SEQ ID NO: 5)) and Taql DNA polymerase (Biozym Diagnostik GmbH, Oldendorf, Germany) from P. fluorescens DNA. The sequence of the enzyme is deposited under the accession number AF090329 in the GenBank database (see also SEQ ID NO: 1). Restriction sites for Ndel and BamHI in the primer sequences (underlined) were used to clone the amplified fragment between the Ndeϊ / BamHI sites of the L-rhampton-inducible expression vector pJOE3075 (Stumpp et al., 2000). As a result, the BVMO gene at the C-terminal end was in-frame linked to six histidine codons (His-tag), which in the vector follow the BamHI restriction site. This plasmid was named pJOE4072.6.
Zur Subklonierung des BVMO Gens in pET22b(+) wurde pJOE4072.6 mit Ndel und Hindl.II verdaut und das erhaltene kleine Fragment (circa 1,6 kb) , welches das Gen und den His-Tag trug, wurde mit pET22b(+) ligiert, welches mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut wurde (pET22BVMO) . Konstrukte ohne C-termi- nalen His-Tag wurden hergestellt, indem das Codon GGA aus der BamHI Stelle, die zwischen Gen und His-Tag eingefügt war, in das Stopcodon TGA umgewandelt wurde, wobei Quik Change™ Site Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, USA) verwendet wurde .For subcloning the BVMO gene into pET22b (+), pJOE4072.6 was digested with Ndel and Hindl.II and the resulting small fragment (about 1.6 kb) carrying the gene and the His tag was digested with pET22b (+). which was digested with the same restriction enzymes (pET22BVMO). Constructs without C-terminal His tag were prepared by converting the codon GGA from the BamHI site inserted between gene and His tag into the stop codon TGA using QuikChang ™ Site Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, USA).
Genexpressiongene expression
Durch L-Rhamnose induzierbare Genexpression:L-Rhamnose Inducible Gene Expression:
E. coli JM109 wurde mit pJOE-Konstrukten transformiert. Die Expression wurde in 30 ml LB Medium (10 g Trypton, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt/L) , welches 100 μg pro ml Ampicillin enthielt (LBamp) bei 37, 30 und 25°C durchgeführt. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bis 0,7 bei 600 nm kultiviert, zu diesem Zeitpunkt wurde BVMO-Expression durch Zugabe von L-Rhamnose induziert (0,2% (w/v) Endkonzentration). Nach weiterer Kultivierung bis zu 20 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschall (60 Sekunden, 50% Intensität) in Natriumphosphat-Puffer (50 mM, pH 7,5) aufgeschlossen. Einschlusskörper wurden von dem ZeIl- Lysat durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 800 g getrennt, mit 0,1% (v/v) Triton X-100 behandelt (37°C, 10 Minuten) und zweimal mit Natriumphosphat-Puffer gewaschen. Zelltrümmer wurden aus dem Zell-Lysat durch zusätzliche Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit entfernt (10 Minuten, 16000 g) . Überstände und Fraktionen mit Einschlusskörpern wurden mit SDS- PAGE und Western Blot analysiert.E. coli JM109 was transformed with pJOE constructs. Expression was performed in 30 ml LB medium (10 g tryptone, 10 g NaCl, 5 g yeast extract / L) containing 100 μg per ml ampicillin (LB amp ) at 37, 30 and 25 ° C. The cells were cultured to an optical density of 0.6 to 0.7 at 600 nm, at which time BVMO expression was induced by the addition of L-rhamnose (0.2% (w / v) final concentration). To After further cultivation for up to 20 hours, the cells were harvested by centrifugation and disrupted by sonication (60 seconds, 50% intensity) in sodium phosphate buffer (50 mM, pH 7.5). Inclusion bodies were separated from the cell lysate by centrifugation for 10 minutes at 800 g, treated with 0.1% (v / v) Triton X-100 (37 ° C, 10 minutes) and washed twice with sodium phosphate buffer. Cell debris was removed from the cell lysate by additional centrifugation at high speed (10 minutes, 16000 g). Supernatants and fractions with inclusion bodies were analyzed by SDS-PAGE and Western blot.
Durch IPTG induzierte Genexpression:IPTG-induced gene expression:
E. coli BL21 (DE3) und Origami™ (DE3) wurden mit pET22b(+) - Konstrukten transformiert. Die Zellen wurden in 30 ml LBarap bei 37, 30, 25 und 200C bis zu einer optischen Dichte von 0,7 bis 0,8 bei 600 nm kultiviert. Danach wurde BVMO-Expression durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,1 mM induziert. Nach weiterer Expression für 20 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und wie bereits beschrieben aufgearbeitet.E. coli BL21 (DE3) and Origami ™ (DE3) were transformed with pET22b (+) constructs. The cells were cultured in 30 ml LB ara p at 37, 30, 25 and 20 ° C. to an optical density of 0.7 to 0.8 at 600 nm. Thereafter, BVMO expression was induced by the addition of IPTG at a final concentration of 0.1 mM. After further expression for 20 hours, the cells were harvested by centrifugation and worked up as previously described.
Co-Expression des BVMO-Gens mit für Chaperone kodierenden Plasmiden:Co-expression of the BVMO gene with chaperone-encoding plasmids:
E. coli JMl09 und BL21 (DE3) Zellen wurden mit für Chaperone kodierenden Plasmiden transformiert. Die Zellen wurden in 20 ml LB, welches 34 μg/ml Chloramphenicol enthielt (LBcm) bei 37°C kultiviert und kompetente Zellen wurden hergestellt. Diese wurden mit pJOE-Konstrukten (für JM109) oder pET22b(+)- Konstrukten (für BL21 (DE3)) transformiert und auf LBcm+amp selektiert. Expression wurde, wie bereits beschrieben, unter Verwendung von LBcm+amp, welches 0,5 μg/ml L-Arabinose (bei pGro7, pKJE7 und pTfl6) , 5 ng/ml Tetracyklin (bei pG-Tf2) oder L-Arabinose und Tetracyklin (bei pG-KJE8) in den oben angegebenen Konzentrationen enthielt, bei 300C durchgeführt.E. coli JM109 and BL21 (DE3) cells were transformed with chaperone-encoding plasmids. The cells were cultured in 20 ml LB containing 34 μg / ml chloramphenicol (LB cm ) at 37 ° C and competent cells were prepared. These were transformed with pJOE constructs (for JM109) or pET22b (+) constructs (for BL21 (DE3)) and selected on LB cm + a mp. Expression was, as previously described, using LB cm + amp , which 0.5 ug / ml L-arabinose (at pGro7, pKJE7 and pTfl6), 5 ng / ml tetracycline ((in pG-Tf2) or L-arabinose and tetracycline contained in pG-KJE8) in the concentrations given above, performed at 30 0 C.
Chemische SyntheseChemical synthesis
Racemische ß-Hydroxyketone wurden über Aldolkondensation nach dem von Smith und Levenberg (1981) beschriebenen Verfahren synthetisiert .Racemic β-hydroxy ketones were synthesized via aldol condensation according to the method described by Smith and Levenberg (1981).
Hydroxyalkylacetate wurden enzymatisch unter Verwendung von Candida antarctica Lipase B synthetisiert. 5 mg immobilisiertes Enzym (Chirazyme L-2, C-2, Roche, Penzberg, Deutschland) wurden mit 300 μl Isooctan und 300 μl Vinylacetat in einem 2 ml Glasgefäß gemischt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 10 μl 1,2-Diol gestartet und bei 25°C in einem Thermoschüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) für etwa zwei Stunden inkubiert, bis die Konversion vollständig war. Die Proben wurden direkt für die GC-Analyse verwendet .Hydroxyalkyl acetates were synthesized enzymatically using Candida antarctica lipase B. 5 mg of immobilized enzyme (Chirazyme L-2, C-2, Roche, Penzberg, Germany) were mixed with 300 μl of isooctane and 300 μl of vinyl acetate in a 2 ml glass jar. The reactions were started by addition of 10 μl of 1,2-diol and incubated at 25 ° C. in a thermoshaker (Eppendorf, Hamburg, Germany) for about two hours until the conversion was complete. The samples were used directly for GC analysis.
Hydroxysäuremethylester wurden aus den entsprechenden ß-Keto- säuremethylestern über ADH-katalysierte Reduktion synthetisiert, wobei eine Alkoholdehydrogenase aus P. fluorescens DSM50106 verwendet wurde (Hildebrand et al 2002) . 5 mg Enzym- Lyophilisat (rekombinant hergestellt) wurden mit 800 μl Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5), 200 μl Isopropanol und 2 μl ß- Ketosäuremethylester gemischt. Die Reaktionen wurden bei 200C 24 Stunden in einem Thermoschüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde dann zweimal mit 500 μl Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Verwendung von Stickstoff konzentriert. Die erhaltenen Produkte wurden über Gaschromatographie analysiert. ß-Ketosäuremethylester, die nicht kommerziell erhältlich waren, wurden nach dem von Oikawa et al . (1978) beschriebenen Verfahren synthetisiert.Hydroxysäuremethylester were synthesized from the corresponding ß-Keto acid methyl esters via ADH-catalyzed reduction, using an alcohol dehydrogenase from P. fluorescens DSM50106 was used (Hildebrand et al 2002). 5 mg of enzyme lyophilisate (produced recombinantly) were mixed with 800 μl of phosphate buffer (50 mM, pH 7.5), 200 μl of isopropanol and 2 μl of methyl β-keto acid ester. The reactions were incubated at 20 ° C. for 24 hours in a thermoshaker (Eppendorf, Hamburg, Germany). The reaction mixture was then extracted twice with 500 μl of ethyl acetate. The combined organic phases were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated using nitrogen. The products obtained were analyzed by gas chromatography. Methyl β-keto acid, which was not commercially available, was prepared according to the method described by Oikawa et al. (1978).
Biokatalyse unter Verwendung wachsender ZellenBiocatalysis using growing cells
E. coli JM109 pJOE4072.6 Zellen wurden in 30 ml LBamp bei 300C bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bis 0,7 bei 600 nm kultiviert. Danach wurde die BVMO-Expression durch Zugabe von L-Rhamnose in einer Endkonzentration von 0,2% (w/v) induziert. Zum gleichen Zeitpunkt wurden 0,1 mmol ß-Hydroxyketon hinzugefügt und die Kultur weiter bei 300C und 220 rpm inkubiert. Nach bestimmten Zeiträumen wurden 500 μl-Proben genommen, zweimal mit Dichlormethan extrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Überschüssiges Lösungsmittel wurde im Stickstoffström entfernt und die Proben mittels Gaschromatographie analysiert.E. coli JM109 pJOE4072.6 cells were cultured in 30 ml LB amp at 30 0 C to an optical density of 0.6 to 0.7 at 600 nm. Thereafter, BVMO expression was induced by addition of L-rhamnose at a final concentration of 0.2% (w / v). At the same time, 0.1 mmol of β-hydroxyketone was added and the culture was further incubated at 30 ° C. and 220 rpm. After certain periods, 500 μl samples were taken, extracted twice with dichloromethane and dried over anhydrous sodium sulfate. Excess solvent was removed in a nitrogen stream and the samples analyzed by gas chromatography.
Biokatalyse unter Verwendung ruhender ZellenBiocatalysis using resting cells
Die Expression von BVMO in E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 wurde in 200 ml LBcπH.amp/ welches 0,5 mg pro ml L-Arabinose enthielt, bei 300C durchgeführt. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte von 0,5 bis 0,6 bei 600 nm kultiviert, zu diesem Zeitpunkt wurde die BVMO-Expression durch Zugabe von von L-Rhamnose in einer Endkonzentration von 0,2% (w/v) induziert. Nach weiterem Wachstum für vier Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und einmal mit sterilem Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) gewaschen.The expression of BVMO in E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 was determined in 200 ml LB cπH . at p / which contained 0.5 mg per ml of L-arabinose, performed at 30 ° C. The cells were cultured to an optical density of 0.5 to 0.6 at 600 nm, at which time BVMO expression was induced by the addition of L-rhamnose at a final concentration of 0.2% (w / v) , After further growth for four hours, the cells were harvested by centrifugation and washed once with sterile phosphate buffer (50 mM, pH 7.5).
Für Biokatalyse-Reaktionen im analytischen Maßstab wurden die Zellen in dem gleichen Puffer bis zu einer optischen Dichte von etwa 40 resuspendiert und 1 ml Aliquots dieser Zellsuspension wurden in 2 ml Gefäßen mit 5 μmol ß-Hydroxyket.on und 10 μl einer sterilen 1 M Glukoselösung gemischt. Die Röhrchen wurden mit luftdurchlässigen Deckeln verschlossen (LidBac/ Eppendorf, Hamburg, Deutschland) und bei 300C in einem Thermo- schüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden 300 μl-Proben entnommen, zweimal mit Ethylacetat extrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Überschüssiges Lösungsmittel wurde im Stickstoffström entfernt und die Proben gaschromatographisch analysiert. .For biocatalysis reactions on an analytical scale, the cells were resuspended in the same buffer to an optical density of about 40, and 1 ml aliquots of this cell suspension were placed in 2 ml tubes containing 5 μmol β-hydroxyket . and 10 μl of a sterile 1 M glucose solution. The tubes were sealed with air-permeable lids (Lid Ba c / Eppendorf, Hamburg, Germany) and incubated at 30 0 C in a thermoshaker (Eppendorf, Hamburg, Germany). At certain times, 300 μl samples were taken, extracted twice with ethyl acetate and dried over anhydrous sodium sulfate. Excess solvent was removed in a nitrogen stream and the samples were analyzed by gas chromatography. ,
Für Biokatalyse-Reaktionen in Schüttelkolben wurde das Zellpellet in 60 ml Phosphatpuffer (OD von etwa 10) resuspendiert, auf dreimal 20 ml aufgeteilt und in 250 ml Schüttelkolben überführt. Dann wurden jeweils 0,1 mmol Substrat und 200 μl sterile 1 M Glukoselösung hinzugefügt und bei 300C und 200 rpm auf einem Orbital-Schüttler 15 bis 16 Stunden inkubiert. Jede Reaktion wurde einmal mit 10 ml Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und überschüssiges Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. Die Proben wurden gaschromatographisch analysiert.For biocatalysis reactions in shake flasks, the cell pellet was resuspended in 60 ml of phosphate buffer (OD of about 10), divided into 3 times 20 ml and transferred to 250 ml shake flasks. Then, in each case 0.1 mmol substrate and 200 ul sterile 1 M glucose solution were added and incubated at 30 0 C and 200 rpm on an orbital shaker for 15 to 16 hours. Each reaction was extracted once with 10 ml of ethyl acetate, dried over anhydrous sodium sulfate, and excess solvent was removed under reduced pressure. The samples were analyzed by gas chromatography.
ReaktionsSchema 1Reaction scheme 1
Reaktionsschema zur Konversion aliphatischer Ketone la-c zu den entsprechenden Estern 2a-c durch BVMO.Reaction scheme for the conversion of aliphatic ketones la-c to the corresponding esters 2a-c by BVMO.
BVMOBVMO
O2 H2OO 2 H 2 O
NADPH NADP+ NADPH NADP +
a: n = 3 b: n = 5 c: n = 7 Chirale gaschromatographische Analyse a: n = 3 b: n = 5 c: n = 7 Chiral gas chromatographic analysis
Chirale GC-Analysen (Tabelle 1) wurden auf einem Shimadzu GC- 14A Gaschromatographen mit einer chiralen ß-Cyclodextrin Säule (Hydrodex<B-ß-3P, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) durchgeführt. Injektions- und Detektionstemperatur wurden auf 2200C eingestellt .Chiral GC analyzes (Table 1) were performed on a Shimadzu GC-14A gas chromatograph with a chiral β-cyclodextrin column (Hydrodex <B -3P, Macherey-Nagel, Düren, Germany). Injection and detection temperature were set at 220 0 C.
Tabelle 1 Chirale GC-Analyse von ß-Hydroxyketonen la-c und Hydroxyalkylacetaten 2a-c (Reaktionsschema 1) .Table 1 Chiral GC analysis of β-hydroxy ketones la-c and hydroxyalkyl acetates 2a-c (Scheme 1).
Retentionszeitretention time
Verbindung Temperatur-Programm [min]Connection temperature program [min]
20 min, 900C/ ß-Hydroxyoctanon /20°C/min//ll0°C, 15 min 17.8/18.620 min, 90 0 C / ß-Hydroxyoctanon / 20 ° C / min // ll0 ° C, 15 min 17.8 / 18.6
15 min, 1200C/ ß-Hydroxydecanon /20°C/min//130°C, 15 min 12.7/13.315 min, 120 0 C / ß-Hydroxydecanon / 20 ° C / min // 130 ° C, 15 min 12.7 / 13.3
20 min, 135°C/ ß-Hydroxydodecanon /20°C/min//l45°C, 15 min 18.3/19.120 min, 135 ° C / β-hydroxydodecanone / 20 ° C / min // l45 ° C, 15 min 18.3 / 19.1
20 min, 900C/20 min, 90 ° C /
Hydroxyhexylacetat /20°C/min//ll0°C, 15 min 23.3/24.1Hydroxyhexyl acetate / 20 ° C / min // 11 ° C, 15 min 23.3 / 24.1
15 min, 1200C/ Hydroxyoctylacetat /20°C/min//l30°C, 15 min 23.3/24.115 min, 120 0 C / Hydroxyoctylacetat / 20 ° C / min // l30 ° C, 15 min 23.3 / 24.1
20 min, 135°C/ Hydroxydecylacetat /20°C/min//l45°C, 15 min 22.4/23.220 min, 135 ° C / hydroxydecyl acetate / 20 ° C / min // 45 ° C, 15 min 22.4 / 23.2
Ergebnisse und DiskussionResults and discussion
Klonierung des BVMO-Gens aus P. fluorescens DSM50106 und Genexpression in E. coliCloning of the BVMO gene from P. fluorescens DSM50106 and gene expression in E. coli
Das BVMO-Gen von P. fluorescens DSM50106 wurde mit PCR amplifiziert und in den mit L-Rhamnose induzierbaren Expressionsvektor pJOE3075 eingefügt. Dadurch wurde das Gen ohne sein Stopcodon im Leseraster mit sechs Histidin-Codons und einem bereits im Vektor (His-Tag) vorliegenden Stopcodon verbunden, um Plasmid pJOE4072.6 zu ergeben.The BVMO gene from P. fluorescens DSM50106 was PCR amplified and inserted into the L-rhamnose inducible expression vector pJOE3075. Thereby, the gene without its stop codon was linked in-frame with six histidine codons and a stop codon already present in the vector (His-tag) to give plasmid pJOE4072.6.
Die Expression von rekombinanter BVMO wurde zunächst in E. coli JM109 mit pJOE4072.6 durchgeführt. Unterschiedliche Temperaturen wurden erprobt und die Menge von BVMO in der löslichen Fraktion und in Einschlusskörpern wurde mit SDS-PAGE und Western Blot untersucht. Western Blot-Analyse wurde verwendet, um die korrekte Proteinbande von ungefähr 56 kDa, die der BVMO entsprach, zu identifizieren. Die besten Ergebnisse wurden bei 300C erhalten, da hier im Vergleich zu 37°C weniger Enzym in Einschlusskörpern gefunden wurde, und das gesamte Expressionsniveau höher als bei 25°C war. Dennoch war die Menge an löslicher BVMO relativ gering. Daher wurde das BVMO Gen in den Viel-Kopien-Vektor pET22b(+) subkloniert und in BL21 (DE3) exprimiert. Bei der Expression in BL21 (DE3) bei 300C war das Expressionsniveau im Vergleich zu JM109 pJOE4072.6 etwa fünffach höher, aber der Großteil des Enzyms wurde in Einschlusskörpern abgelagert. Eine Verringerung der Expressionstemperatur auf 200C erhöhte die Ausbeute an BVMO in der löslichen Fraktion nur geringfügig. Origami™ (DE3) als Wirt für die Expression führte zu den gleichen Ergebnissen. Weiterhin wurden keine Unterschiede in der Expression von BVMO mit und ohne His-Tag nachgewiesen.Expression of recombinant BVMO was first performed in E. coli JM109 with pJOE4072.6. different Temperatures were tested and the amount of BVMO in the soluble fraction and in inclusion bodies was examined by SDS-PAGE and Western blot. Western blot analysis was used to identify the correct protein band of approximately 56 kDa corresponding to the BVMO. The best results were obtained at 30 0 C because less enzyme was found in inclusion bodies here, compared to 37 ° C, and the entire expression level was higher than at 25 ° C. Nevertheless, the amount of soluble BVMO was relatively low. Therefore, the BVMO gene was subcloned into the multi-copy vector pET22b (+) and expressed in BL21 (DE3). When expressed in BL21 (DE3) at 30 0 C the expression level was about five times higher when compared to JM109 pJOE4072.6, but the majority of the enzyme was deposited in inclusion bodies. A reduction in the expression temperature to 20 0 C increased the yield of BVMO in the soluble fraction only slightly. Origami ™ (DE3) as the host for expression led to the same results. Furthermore, no differences in the expression of BVMO with and without His tag were detected.
Es wurde berichtet, dass Co-Expressionen von molekularen Chaperonen im Cytoplasma von E. coli die Ausbeute löslichen Proteins deutlich verstärken kann (Ikura et al . 2002, Lee et al . 2004, Nishihara et al . 1998, Nishihara et al . 2000). Daher wurden pJOE und pET22b(+) -Konstrukte mit unterschiedlichen Kombinationen von Chaperonen co-exprimiert , die durch das TaKaRa Chaperon-Plasmid-Set zur Verfügung gestellt wurden. Im Falle von JM109 pJOE4072.6 führte sowohl GroES/GroEL als auch GroES/GroEL zusammen mit DnaK/DnaJ/GrpE oder dem Trigger Faktor zu deutlich höheren Mengen an löslicher BVMO, wobei für DnaK/DnaJ/GrpE allein ein Einfluss auf die Expression nicht festgestellt werden konnte, da die Zellen nach Induktion der BVMO-Expression nicht weiter wuchsen und kaum Enzym herge- stellt wurde. Der Trigger Faktor allein zeigte nur einen geringen positiven Effekt auf die BVMO-Expression.It has been reported that coexpressions of molecular chaperones in the cytoplasm of E. coli can markedly enhance the yield of soluble protein (Ikura et al., 2002, Lee et al., 2004, Nishihara et al., 1998, Nishihara et al., 2000). Therefore, pJOE and pET22b (+) constructs were coexpressed with different combinations of chaperones provided by the TaKaRa chaperone plasmid set. In the case of JM109 pJOE4072.6, both GroES / GroEL and GroES / GroEL together with DnaK / DnaJ / GrpE or the trigger factor led to significantly higher amounts of soluble BVMO, whereas for DnaK / DnaJ / GrpE alone an influence on the expression did not occur could not be detected since the cells did not grow further after induction of BVMO expression and was posed. The trigger factor alone showed only a small positive effect on BVMO expression.
Bei BL21 (DE3) steigerte die Co-Expression von DnaK/DnaJ/GrpE die Menge von BVMO in der löslichen Fraktion mindestens zehnfach (nach sechs Stunden Expression) , mit etwa gleichen Mengen rekombinanten Enzyms in der löslichen Fraktion und in Einschlusskörpern. Die Kultur wuchs jedoch nicht viel über eine optische Dichte von 1. Wie bereits für JMlO9 erwähnt, führten GroES/GroEL genau wie GroES/GroEL zusammen mit DnaK/DnaJ/GrpE auch zu gesteigerten Mengen löslichen Enzyms, jedoch in einem geringeren Ausmaß.In BL21 (DE3), co-expression of DnaK / DnaJ / GrpE increased the amount of BVMO in the soluble fraction at least ten fold (after six hours of expression) with approximately equal amounts of recombinant enzyme in the soluble fraction and inclusion bodies. However, the culture did not grow much above an optical density of 1. As already mentioned for JM109, GroES / GroEL, like GroES / GroEL together with DnaK / DnaJ / GrpE, also led to increased levels of soluble enzyme but to a lesser extent.
Interessanterweise führte die Anwendung der gleichen Chaperone bei E. coli JM109 und BL21 (DE3) zu unterschiedlichen Ergebnissen. Während Co-Expression von DnaK/DnaJ/GrpE in BL21 (DE3) die Menge an löslicher BVMO etwa zehnfach erhöhte, kombiniert mit dramatisch reduziertem Zellwachstum, konnte in E. coli JM109, das die gleiche Inhibition des Zellwachstum zeigte, das Enzym nicht in großen Mengen nachgewiesen werden. Das kann an einem toxischen Effekt von großen Mengen aktiver BVMO für die Zellen liegen. Diese Annahme wurde weiter durch den Nachweis unterstützt, dass die lösliche Fraktion von E. coli BL21 (DE3) pET22BVMO pKJE7 (Co-Expression von Dnak/DnaJ/GrpE) kaum Baeyer-Villiger Monooxygenase-Aktivität zeigte, obwohl eine große Menge von BVMO-Enzym vorlag. Bei anderen BVMOs wurde bisher kein toxischer Effekt auf eine Expression in E. coli berichtet. Da das Enzym aliphatische offenkettige Ketone mit hoher Spezifität umwandelt, kann der toxische Effekt möglicherweise auf der Umwandlung von Zwischenprodukten der Fettsäure-Synthese oder von Lipid- membranbestandteilen beruhen. Substratspezifität und EnantioselektivitätInterestingly, the use of the same chaperones in E. coli JM109 and BL21 (DE3) gave different results. While co-expression of DnaK / DnaJ / GrpE in BL21 (DE3) increased the amount of soluble BVMO about ten-fold, combined with dramatically reduced cell growth, in E. coli JM109, which showed the same inhibition of cell growth, the enzyme could not in large Quantities are detected. This may be due to a toxic effect of large amounts of active BVMO on the cells. This assumption was further supported by the demonstration that the soluble fraction of E. coli BL21 (DE3) pET22BVMO pKJE7 (co-expression of Dnak / DnaJ / GrpE) barely showed Baeyer-Villiger monooxygenase activity, although a large amount of BVMO- Enzyme present. In other BVMOs, no toxic effect on expression in E. coli has been reported so far. Since the enzyme converts aliphatic open-chain ketones with high specificity, the toxic effect may possibly be due to the conversion of fatty acid synthesis intermediates or lipid membrane constituents. Substrate specificity and enantioselectivity
Racemische ß-Hydroxyketone la-c (ReaktionsSchema 1) , die nach dem von Smith und Levenberg (1981) beschriebenen Verfahren synthetisiert wurden, wurden einer kinetischen Racematspaltung durch enzymatische Baeyer-Villiger-Oxidation unterworfen und ergaben Hydroxyalkylacetate 2a-c (ReaktionsSchema 1) . Geringe Mengen der anderen möglichen Produkte, der Hydroxysäuremethyl- ester 3a-c, wurden ebenfalls gebildet (Reaktionsschema 1) .Racemic β-hydroxy ketones la-c (Reaction Scheme 1) synthesized by the method described by Smith and Levenberg (1981) were subjected to kinetic resolution by Baeyer-Villiger enzymatic oxidation to yield hydroxyalkyl acetates 2a-c (Reaction Scheme 1). Small amounts of the other possible products, methyl hydroxyacid 3a-c, were also formed (Scheme 1).
Unter Verwendung der BVMO aus P. fluorescens DSM 50106 wurden verschiedene Biokatalyse-Strategien entweder mit wachsenden oder ruhenden Zellen getestet (Tabellen 2-4) . Während die Ergebnisse aus den Reaktionen mit wachsenden Zellen von JM109 pJOE4072.6 für Ia und Ic (siehe Reaktionsschema 1) nicht auswertbar sind (Tabelle 2) , da hier die Umsetzung anscheinend relativ gering ist und die produzierten Ester offensichtlich sehr schlecht durch Dichlormethan extrahiert wurden, erreichte die Konversion von Ib (siehe Reaktionsschema 1) bereits mehr als 50%. Um das Extraktionsproblem zu überwinden, wurde in weiteren Experimenten anstelle von Dichlormethan Ethylacetat zur Extraktion verwendet. Daher konnte deutlich mehr Produkt nachgewiesen werden.Using P. fluorescens DSM 50106 BVMO, various biocatalysis strategies were tested with either growing or resting cells (Tables 2-4). While the results from the reactions with growing cells of JM109 pJOE4072.6 for Ia and Ic (see Reaction Scheme 1) are not evaluable (Table 2), since the reaction seems to be relatively low and the esters produced were apparently very poorly extracted by dichloromethane , the conversion of Ib (see Reaction Scheme 1) has already reached more than 50%. In order to overcome the extraction problem, ethyl acetate was used for extraction in further experiments instead of dichloromethane. Therefore, significantly more product could be detected.
Möglicherweise wird das Wachstum von Zellen durch ß- Hydroxyketone inhibiert, wie aus den geringen Umsätzen von Ia und Ic geschlossen werden kann. Dies würde jedoch nicht erklären, warum Ib eine Ausnahme sein sollte. Tabelle 2 : Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung der Hydroxyketone la-c (siehe Reaktionsschema 1) unter Verwendung von wachsenden Zellen von E. coli JM109 pJOE4072.6 bei 300C (n.b. - nicht bestimmbar).The growth of cells may be inhibited by ß-hydroxyketones, as can be concluded from the low conversions of Ia and Ic. However, this would not explain why Ib should be an exception. Table 2: Results of the kinetic resolution of hydroxy ketones la-c (see Reaction Scheme 1) using growing cells of E. coli JM109 pJOE4072.6 at 30 0 C (nd - not determined).
Substrat Zeit [h] C [%] %ees %eeP Substrate Time [h] C [%]% ee s % ee P
1a 20 n.b. 30 n.b. n.b.1a 20 n.b. 30 n.b. n.d.
1b 20 54 93 80 291b 20 54 93 80 29
1c 20 n.b. 21 n.b. n.b.1c 20 n.b. 21 n.b. n.d.
Die Werte für C (Umsatz, conversion) , %ees, %eeP (Enantiomeren- überschuß, enantiomeric excess) und E (Enantioselektivität , enantiomeric ratio) können nach dem von Chen et al . (1982) beschriebenen Verfahren berechnet werden.The values for C (conversion, conversion),% ee s ,% ee P (enantiomeric excess, enantiomeric excess) and E (enantioselectivity, enantiomeric ratio) can be determined according to the method described by Chen et al. (1982).
Um höhere Umsatzraten auch für die Substrate Ia und Ic (siehe ReaktionsSchema 1) zu erhalten, wurde eine kinetische Racematspaltung mit ruhenden Zellen von JM109 pGro7 pJOE4072.6 in Schüttelkolben durchgeführt (Tabelle 3) . Dieser rekombinante Stamm co-expremiert die Chaperone GroES/GroEL, um eine bessere Faltung der BVMO zu ermöglichen.In order to obtain higher conversion rates also for the substrates Ia and Ic (see Reaction Scheme 1), a kinetic resolution of quiescent cells of JM109 pGro7 pJOE4072.6 was carried out in shake flasks (Table 3). This recombinant strain coexpresses the chaperones GroES / GroEL to allow better folding of the BVMO.
Tabelle 3: Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung der Hydroxyketone la-c (siehe Reaktionsschema 1) unter Verwendung ruhender Zellen von E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 bei 300C in Schüttelkolben.Table 3: Results of the kinetic resolution of hydroxy ketones la-c (see Reaction Scheme 1) using resting cells of E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 at 30 0 C in shake flasks.
Substrat Zeit [h] C [%] %ees %eeP Substrate Time [h] C [%]% ee s % ee P
1a 16 24 31 96 731a 16 24 31 96 73
1b 16 52 92 84 381b 16 52 92 84 38
1c 15 42 65 90 37 Außer bei Ia (siehe Reaktionsschema 1) waren die Umsätze besser oder mindestens so gut wie mit wachsenden Zellen. Zusätzlich konnten die produzierten Ester viel besser mit Ethylacetat extrahiert werden. Daher war die GC-Analyse leichter und die Berechnung exakter C- und E-Werte möglich.1c 15 42 65 90 37 Except for Ia (see Scheme 1), sales were better or at least as good as with growing cells. In addition, the produced esters could be extracted much better with ethyl acetate. Therefore, GC analysis was easier and the calculation of exact C and E values was possible.
In Bezug auf die Enantioselektivität der BVMO aus P. fluorescens DSM 50106 gegenüber ß-Hydroxyketonen waren die E- Werte für alle drei getesteten Substrate moderat bis gut. Die BVMO aus P. fluorescens setzt bevorzugt die (S) -ß-Hydroxyketone in die entsprechenden (S) -Hydroxyalkylacetate um.With respect to the enantioselectivity of the BVMO from P. fluorescens DSM 50106 over β-hydroxy ketones, the E values were moderate to good for all three substrates tested. The BVMO from P. fluorescens preferably converts the (S) -β-hydroxy ketones to the corresponding (S) -hydroxyalkyl acetates.
Die Reaktionszeiten konnten deutlich verkürzt werden, indem kinetische Racematspaltungen mit einem höheren Verhältnis von Enzym zu Substrat durchgeführt wurden. Reaktionen wurden mit ruhenden Zellen in kleinen Volumina von 1 ml konzentrierter Zellsuspension in 2 ml Röhrchen mit luftdurchlässigen Deckeln durchgeführt. Wenn die gleichen Substratkonzentrationen wie in Schüttelkolben verwendet wurden, konnten bereits nach kürzeren Reaktionszeiten hohe Umsätze erreicht werden (Tabelle 4). Zusätzlich waren die erhaltenen E-Werte deutlich höher.The reaction times could be significantly shortened by carrying out kinetic resolutions with a higher ratio of enzyme to substrate. Reactions were performed with quiescent cells in small volumes of 1 ml of concentrated cell suspension in 2 ml tubes with air-permeable lids. When the same substrate concentrations were used as in shake flasks, high conversions could already be achieved after shorter reaction times (Table 4). In addition, the E values obtained were significantly higher.
Tabelle 4: Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung der Hydroxyketone la-c (siehe Reaktionsschema 1) mit ruhenden Zellen von E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 bei 300C in 2 ml Röhrchen mit luftdurchlässigen Deckeln.Table 4: Results of the kinetic resolution of the hydroxyketones la-c (see reaction scheme 1) with resting cells of E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 at 30 0 C in 2 ml tubes with air-permeable lids.
Substrat Zeit[h] C [%] %ees %eeP Substrate Time [h] C [%]% ee s % ee P
1a 8 40 61 93 541a 8 40 61 93 54
1b 4 48 84 91 551b 4 48 84 91 55
1c 2 45 74 90 41 Andere rekombinant erhältliche BVMOs, die Cyclohexanon Monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 (Donoghue et al . 1976) und die Cyclopentanon Monooxygenase (CPMO) aus Comamonas sp. NCIMB 9872 (Griffin und Trudgill 1976) , wurden ebenfalls auf ihre Enantioselektivität gegenüber ß-Hydroxyketonen la-c (siehe Reaktionsschema 1) getestet. Es wurden ruhende Zellen von E. coli BL21 (DE3) pKJE7 (kodierend für die Chaperone DnaK/DnaJ/GrpE) pMM4 (Lee et al. 2004), welche das CHMO Gen beherbergen und E. coli DH5α pCMO206, welche das CPMO Gen beherbergen, für die kinetische Racematspaltung im analytischen Maßstab in 2 ml Röhrchen verwendet. Biokatalyse-Reaktionen wurden auf die gleiche Art wie für E. coli JMl09 pGro7 pJOE4072.6 durchgeführt. Im Gegensatz zu der BVMO aus P. fluorescens DSM 50106 zeigten beide Enzyme deutlich höhere Aktivität gegenüber Ia (siehe Reaktionsschema 1) , während die Umsatzrate mit zunehmender Kettenlänge abnahm (Tabellen 5 und 6) .1c 2 45 74 90 41 Other recombinantly available BVMOs, the cyclohexanone monooxygenase (CHMO) from Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 (Donoghue et al., 1976) and the cyclopentanone monooxygenase (CPMO) from Comamonas sp. NCIMB 9872 (Griffin and Trudgill 1976) were also tested for their enantioselectivity towards β-hydroxyketones la-c (see Chart 1). Resting cells of E. coli BL21 (DE3) pKJE7 (encoding the chaperones DnaK / DnaJ / GrpE) pMM4 (Lee et al., 2004) harboring the CHMO gene and E. coli DH5α pCMO206 harboring the CPMO gene , used for analytical scale kinetic resolution in 2 ml tubes. Biocatalysis reactions were performed in the same manner as for E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6. In contrast to BVMO from P. fluorescens DSM 50106, both enzymes showed significantly higher activity towards Ia (see Reaction Scheme 1), while the turnover rate decreased with increasing chain length (Tables 5 and 6).
Tabelle 5 Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung der Hydroxyketone la-c (siehe Reaktionsschema 1) unter Verwendung ruhender Zellen von E. coli BL21 (DE3) pKJE7 pMM4 bei 300C (15 μmol Substrat) (n.b. - nicht bestimmbar) .Table 5 Results of the kinetic resolution of hydroxy ketones la-c (see Reaction Scheme 1) using resting cells of E. coli BL21 (DE3) pKJE7 pMM4 at 30 0 C (15 .mu.mol substrate) (nd - not determined).
Substrat Zeit[h] C [%] %ees %eeP Substrate Time [h] C [%]% ee s % ee P
1a 1 46 81 94 721a 1 46 81 94 72
1b 1 31 40 90 281b 1 31 40 90 28
1c 1 3 3 n.b. n.b.1c 1 3 3 n.b. n.d.
Zusätzlich zeigt die CHMO eine höhere Enantioselektivität bei der Oxidation von Ia (Reaktionsschema 1) verglichen zu der BVMO aus P. fluorescens DSM 50106, während bei der Umwandlung von Ib (Reaktionsschema 1) der E-Wert geringer ist (Tabelle 5) . Bei diesem Enzym wird wahrscheinlich eine Substrat- inhibition bei ß-Hydroxyketon Ic (Reaktionsschema 1) beobachtet, aber die Enantioselektivität der kinetischen Racematspaltung dieser Verbindung wird als verhältnismäßig gering eingeschätzt. Die CPMO zeigt bei der Baeyer-Villiger- Oxidation von ß-Hydroxyketonen keine wirtschaftlich annehmbaren E-Werte (Tabelle 6) .In addition, the CHMO shows a higher enantioselectivity in the oxidation of Ia (Scheme 1) compared to the BVMO from P. fluorescens DSM 50106, while in the conversion of Ib (Scheme 1) the E value is lower (Table 5). This enzyme is likely to have a substrate inhibition in β-hydroxy ketone Ic (Reaction Scheme 1), but the enantioselectivity of the kinetic resolution of this compound is estimated to be relatively low. The CPMO shows no economically acceptable E values for the Baeyer-Villiger oxidation of β-hydroxy ketones (Table 6).
Tabelle 6 Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung derTable 6 Results of the kinetic resolution of the
Hydroxyketone la-c (Reaktionsschema 1) mit ruhenden Zellen von E. coli DH5α pCMO206 bei 3O0C (15 μmol Substrat) .Hydroxyketones la-c (Reaction Scheme 1) with resting cells of E. coli DH5a pCMO206 at 3O 0 C (15 .mu.mol substrate).
Substrat Zeit[h] C [%] %ees %eeP Substrate Time [h] C [%]% ee s % ee P
1a 0.25 50 58 57 61a 0.25 50 58 57 6
1b 2 31 26 57 51b 2 31 26 57 5
1c 8 42 10 14 1.4 1c 8 42 10 14 1.4
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Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern aus racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen durch Baeyer-Villiger-Oxidation, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger-Oxidation enantioselektiv ist und man zur Oxidation Baeyer-Villiger Monooxygenasen verwendet.1. A process for the preparation of aliphatic acyclic esters of racemic aliphatic acyclic ketones by Baeyer-Villiger oxidation, characterized in that the Baeyer-Villiger oxidation is enantioselective and used for the oxidation of Baeyer-Villiger monooxygenases.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Enantioselektivität E von mindestens 10 erreicht wird.2. The method according to claim 1, characterized in that an enantioselectivity E of at least 10 is achieved.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Enantioselektivität E von mindestens 40 erreicht wird.3. Process according to claims 1 or 2, characterized in that an enantioselectivity E of at least 40 is achieved.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger Monooxygenase für aliphatische azyklische Ketone spezifisch ist.4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the Baeyer-Villiger monooxygenase is specific for aliphatic acyclic ketones.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Ketone eine Formel5. Process according to claims 1 to 4, characterized in that the ketones have a formula
aufweisen, wobei Rl, R2 , R3 und R4 unabhängig voneinander ein substituierter oder unsubstituierter, linearer oder verzweigter Alkylrest, Alkenylrest, Alkinylrest, ein Hydroxyalkylrest, Carboxylrest , Alkoxycarboxyrest , Aminorest, Aminoalkylrest , Aminocarbonylrest , Hydroxylrest oder ein Halogenrest ist, wobei R3 oder R4 auch Wasserstoff sein können,R 1, R 2, R 3 and R 4 independently of one another are a substituted or unsubstituted, linear or branched alkyl radical, alkenyl radical, alkynyl radical, a hydroxyalkyl radical, carboxyl radical, alkoxycarboxy radical, amino radical, aminoalkyl radical, aminocarbonyl radical, hydroxyl radical or a halogen radical, where R3 or R4 can also be hydrogen,
mit der Maßgabe, dass R2 , R3 und R4 sich unterscheiden.with the proviso that R2, R3 and R4 are different.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass Rl Methyl ist.6. The method according to claim 5, characterized in that Rl is methyl.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 5 oder 6 , dadurch gekennzeichnet, dass R2 ein Hydroxylrest , Aminorest oder ein Halogenrest ist.7. The method according to claims 5 or 6, characterized in that R2 is a hydroxyl radical, amino radical or a halogen radical.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass R3 oder R4 ein Alkylrest mit einer Kettenlänge von 2-14 C-Atomen und R3 oder R4 Wasserstoff ist.8. The method according to claims 5 to 7, characterized in that R3 or R4 is an alkyl radical having a chain length of 2-14 C-atoms and R3 or R4 is hydrogen.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Keton ein ß-Hydroxyketon ist.9. Process according to claims 1 to 8, characterized in that the ketone is a β-hydroxyketone.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das ß-Hydroxyketon folgende Formel aufweist10. The method according to claim 9, characterized in that the ß-hydroxyketone has the following formula
O OHOH
und R3 ein Alkylrest mit einer Kettenlänge von 2-14 C- Atomen ist.and R3 is an alkyl radical having a chain length of 2-14 C atoms.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger Monooxygenase aus P. fluorescens oder P. putida stammt oder ein funktionelles Derivat davon ist .11. The method according to claims 1 to 10, characterized in that the Baeyer-Villiger monooxygenase is derived from P. fluorescens or P. putida or is a functional derivative thereof.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger Monooxygenase eine Sequenz umfasst, die eine Homologie von mindestens 70% zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweist. 12. The method according to claim 11, characterized in that the Baeyer-Villiger monooxygenase comprises a sequence having a homology of at least 70% to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger Monooxygenase die Sequenz nach SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweist.13. The method according to claim 12, characterized in that the Baeyer-Villiger monooxygenase has the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
14. Verfahren nach den Ansprüchen 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Ketone mit wachsenden oder ruhenden E. coli inkubiert, welche die Baeyer-Villiger Monooxygenase exprimieren.14. The method according to claims 1-13, characterized in that the ketones are incubated with growing or dormant E. coli, which express the Baeyer-Villiger monooxygenase.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die E. coli ferner Chaperone überexprimieren.15. The method according to claim 14, characterized in that the E. coli also overexpress chaperones.
16. Verfahren nach den Ansprüchen 1-15, dadurch gekennzeichnet, dass man die erzeugten Ester isoliert und aufreinigt.16. The method according to claims 1-15, characterized in that one isolates and purifies the esters produced.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufreinigung der Ester eine Extraktion mit Dichlor- methan oder Ethylacetat umfasst .17. The method according to claim 16, characterized in that the purification of the ester comprises an extraction with dichloro methane or ethyl acetate.
18. Verfahren zur enantioselektiven Herstellung von alipha- tischen azyklischen Ketonen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Verfahren nach den Ansprüchen 1-15 durchführt und man die nicht umgesetzten Ketone isoliert und aufreinigt.18. A process for the enantioselective preparation of aliphatic acyclic ketones, which comprises carrying out a process according to claims 1-15 and isolating and purifying the unreacted ketones.
19. Verwendung von Baeyer-Villiger Monooxygenasen zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1-18.19. Use of Baeyer-Villiger monooxygenases for carrying out the method according to claims 1-18.
20. Verwendung von Baeyer-Villiger Monooxygenasen zur enantioselektiven Baeyer-Villiger Oxidation von racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen. 20. Use of Baeyer-Villiger monooxygenases for the enantioselective Baeyer-Villiger oxidation of racemic aliphatic acyclic ketones.
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