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EP1713899A2 - Verfahren und vorrichtung zur charakterisierung von zellen, zellverbänden und/oder gewebe - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur charakterisierung von zellen, zellverbänden und/oder gewebe

Info

Publication number
EP1713899A2
EP1713899A2 EP05701395A EP05701395A EP1713899A2 EP 1713899 A2 EP1713899 A2 EP 1713899A2 EP 05701395 A EP05701395 A EP 05701395A EP 05701395 A EP05701395 A EP 05701395A EP 1713899 A2 EP1713899 A2 EP 1713899A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
tissue
cell
parameters
cell groups
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05701395A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Markus Eblenkamp
Ulrich Steinseifer
Erich Wintermantel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Muenchen
Original Assignee
Technische Universitaet Muenchen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universitaet Muenchen filed Critical Technische Universitaet Muenchen
Publication of EP1713899A2 publication Critical patent/EP1713899A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
    • G01N15/147—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1497—Particle shape

Definitions

  • the invention relates to a device and a method for characterizing cells, cell assemblies and / or tissues.
  • the appearance of a two- or three-dimensional cell culture has specific morphological features both at the individual cell level and at the level of the total cell population, each of which is dependent on the type of the cultivated cells. So the cells differ z. B. in their size, shape, in the size of the cell nucleus, in the granularity, the migratory activity, the spatial relationship of the cells with each other (disperse or coherent) or with three-dimensional cell cultures in their spatial orientation. If the cell culture is to be described or its quality is to be assessed, microscopic methods are currently used in particular to record the characteristics of the cell culture.
  • the morphological assessment of the cell population which is largely carried out “by hand” (not automatically), is strongly dependent on the knowledge and experience of the examiner and therefore remains subjective.
  • the morphological assessment has the advantages that it can be carried out online without disrupting the growth of the cell population to be analyzed, that individual cells of a population can be analyzed, that they can be carried out quickly and finally that they are inexpensive is.
  • the cells to be cultivated are detached from their original tissue by enzymatic and mechanical processes and, after purification, transferred to appropriate culture vessels.
  • the original tissue e.g. bone, cartilage, adipose tissue
  • different procedures and protocols are used.
  • the cells are taken up in a further step (cultivation of the cells in vitro) in a nutrient solution (“medium”), transferred into a cell culture vessel and cultivated in an incubator at 37 ° C. and 100% atmospheric humidity.
  • the nutrient solution consists of water from a mixture of salts, nutrients, vitamins as well as growth and differentiation factors, the composition of which is specific to the type of cells to be cultivated.
  • the necessary media are only available to a certain extent and are usually mixed together in the laboratory by hand is regularly changed by vacuuming off the old medium and adding new one. With some cell cultures it is necessary to add different media with different compositions in the course of the cultivation according to a defined protocol.
  • the adherent cells are detached from the surface of the culture vessel by enzymatic or mechanical methods.
  • the cells are cleaned by centrifugation, then counted and sown in a defined amount in new culture vessels.
  • the quality of the cell population is assessed at regular intervals (analyzes during cultivation). Particular attention is paid to the typical morphology of the cells, the growth behavior and any contamination from microorganisms or undesired cell populations.
  • the analyzes are carried out in the form of a microscopic assessment. This can be used online, but is personnel-intensive. In addition, microscopic assessment requires a morphologically trained eye and remains subjective in some areas (especially when assessing the typical cell morphology).
  • the device according to the invention comprises an analysis unit which has means by means of which morphological parameters of cells, cell groups or tissues are recorded. Furthermore, the device has means by means of which the detected parameters are evaluated for the purpose of objective morphological characterization of the cells, the cell assemblies or the tissue.
  • An essential idea of the device according to the invention or the method according to the invention is to describe the morphological image of the cell culture or individual cells preferably by means of a large number of morphometric data. In this way, morphometric values can be obtained which are characteristic of the respective cell culture or the individual cells ("morphometric finger printing").
  • the analysis unit preferably has, for example, a software-assisted imaging unit, for example a microscope, and a software-assisted image analysis unit, expert knowledge integrated in the image analysis unit in order to be able to carry out the evaluation of the detected parameters or an appropriate characterization.
  • the analysis unit is preferably designed such that the degree of confluency, the cell morphology as a measure of the quality of the cell culture, the proliferation behavior, the contamination with microorganisms or other cell populations and / or the cell differentiation can be determined and evaluated. It is conceivable, for example, to include the cell size, the cell shape, the size of the cell nucleus, the granularity, the migratory activity, the growth behavior, the spatial relationship of the cells with one another (disperse, coherent) or, in the case of three-dimensional cell cultures, also the spatial orientation of the cells record and then evaluate.
  • indices that relate the recorded values to one another in a suitable manner. It is conceivable, for example, as a quotient from the size of the cells and from the fourfold value of the object index To form the square root of the cell area. This index can be used, for example, to distinguish a fibroblast culture from an endothelial cell culture. In principle, any indices can be formed from the recorded parameters that have sufficient distinctive character with regard to the characterization of the cells, cell assemblies or the tissue.
  • the analysis unit has means for statistical evaluation of the detected parameters.
  • statistics can be created from morphometric values that are characteristic of the respective cell culture or the respective individual cells.
  • the statistically determined parameters can be, for example, the mean, the standard deviation and the median of the morphological values.
  • the statistical evaluation can relate to the directly recorded parameters, such as, for example, the size of the cells, or also to the above-mentioned indices, which can be formed in a suitable manner from the recorded values, provided this is helpful for the characterization.
  • a database with reference parameters is provided which are typical for the cells, cell assemblies or the tissue. It is further provided that the device has comparison means by means of which the detected parameters can be compared with the reference parameters. Based on this comparison, a statement about the cell population or the type and shape of the cell cluster or tissue can be provided automatically or objectively. It is possible for experts to set up a database in which the morphometric data for reference cultures or cells are available. By comparing the values of a cell culture to be examined with those from the file, expert knowledge can thus be indirectly integrated into the morphological examination and the morphological description of the cell culture to be examined can be objectified.
  • the quality of the cell culture can be assessed without the presence of an expert.
  • the database can also be used to identify individual unknown structures (e.g. sediment deposits, subcellular structures) and to detect morphologically comprehensible phenomena (screening for microbial contamination).
  • the method according to the invention or the device according to the invention can be evaluated by means of directly detected variables, such as the cell size, or by means of the indices mentioned, which can be formed in a suitable manner.
  • the analysis unit has means by means of which adjacent pixels of the captured image with a similar brightness value are combined to form an image object. Since the morphological structures (eg cell boundaries) appear in the phase contrast images practically only via the brightness values and not via color differences, the resulting image objects reflect the morphological structures.
  • the image objects can be combined by combining neighboring pixels with a similar brightness value.
  • the invention further relates to a device for cultivating cells, cell groups and tissues with an incubator.
  • the device is characterized in that it also has a device for the objective characterization of the cells, the cell assemblies or the tissue according to one of claims 1 to 6.
  • the special feature of the invention is that the device for the objective characterization of the cells, the cell assemblies or the tissue is an integral part of an apparatus for the cultivation of cells, cell assemblies or tissue.
  • it is an apparatus for the automatic cultivation of cells, cell assemblies and tissue, ie an automatic cell culture device with an integrated analysis unit for the objective characterization of the cells, cell assemblies or the tissue.
  • the analysis unit also automatically records and evaluates morphological parameters during the cultivation. It is possible to include the result of the evaluation in the decision-making processes of the automation, ie to operate the device or the cell cultivation depending on the evaluation.
  • the device also has a manipulator, a transporter for transporting the culture vessels between the incubator, the manipulator and the analysis unit, and a control unit, by means of which the device can preferably be operated automatically.
  • the invention according to this embodiment thus has several functional groups, which are described in more detail below:
  • the detector is a core element of the invention. It is used to monitor the cell population during cultivation.
  • the detector or the above-mentioned analysis unit consists of an imaging unit and a software-based image analysis unit with integrated expert knowledge with which the complexity of the morphological parameters can be recorded.
  • an incubator incubator
  • the manipulator automatically carries out all the work steps that were previously carried out purely by hand or with partial machine support. These include Aspiration and pipetting of solutions, centrifugation, opening of the culture vessels, mechanical detachment of the cells etc.
  • the transporter which consists of a combination of conveyor belt and robot with gripper arm, the cell culture vessels are transported back and forth between the automatic components detector, incubator and manipulator.
  • an intelligent control unit which controls the individual components of the device and coordinates their activity.
  • the intelligent The control unit receives the necessary processing from the detector or the analysis unit.
  • the software-supported image analysis unit automatically carries out complex morphometric image analyzes.
  • This unit is characterized in particular by the fact that the expert knowledge that is required to record and evaluate the complex morphology can be implemented very flexibly.
  • the invention further relates to a method with the features of claim 10.
  • Advantageous embodiments of the method are the subject of the dependent claims.
  • contour of the image objects (A: fibroblast cells, B: endothelial cells),
  • Figure 1 shows an example of a cell culture to be characterized. Possible characterization features are: Cell population consists of x% rounded and y% elongated cells; the cells have small vesicles on the edge; some of the cells form strands.
  • Typical characteristics of the cell structure according to FIG. 2 are: cells form three-dimensional structures; the cells are rather elongated, the cells are not very granular.
  • the characteristics of the cells according to FIG. 3 are: The cells are distinguished by extreme striation (“stress fibers”), the cells have a prominent nucleolus, the cells are flat, the cells are large, the cells have a jagged edge.
  • stress fibers extreme striation
  • the characteristics of the cells according to FIG. 4 are: There are two cell populations, namely large flat cells lying in a loose bandage, partially striped, and smaller roundish cells which form a cobblestone-like bandage.
  • the above-mentioned parameters of the cell populations that can be detected by means of an imaging unit can be used to characterize them.
  • the aim is to use a morphological index to distinguish a fibroblast culture from an endothelial cell culture.
  • the cell cultures can be seen from FIG. 5, FIG. 5 A representing the fibroblast culture and FIG. 5 B the endothelial cell culture.
  • the characterization is carried out using a morphometric analysis of the cell culture images (phase contrast images).
  • This formula describes the degree of fractality.
  • the factor 1/4 and the square root normalize the picture objects so that objects of different sizes can be compared with each other (the quotient of object size / area is very dependent on the size of the objects).
  • This index has now been calculated for each image object. If all object index values of the image objects are now represented in a histogram, a type of characteristic curve is obtained for the respective cell culture, as can be seen from FIG. 7a.
  • Parameters for describing the histogram course are e.g. B. the mean, the standard deviation and the median. It can be seen that the two curves according to FIG. 7a show a different course.
  • the curve for the endothelial cell culture is bulbous.
  • the values for the mean, the standard deviation and the median are also different for the fibroblast and endothelial cell culture (fibroblasts: mean 2.17; standard deviation: 0.91; median: 1.96. Endothelial cells: mean: 2.36; standard deviation: 0.96; Median: 2.18).
  • the values mentioned can thus be used for the objective numerical characterization of the cell culture morphology.
  • Another characteristic that distinguishes the fibroblast culture from the endothelial cell culture is the alignment of the individual image objects. As can be seen in FIG. 6, the main axes of neighboring image objects in the fibroblast culture are largely parallel, whereas this is much less the case in endothelial cell culture.
  • This object property too, can be mathematically determined by appropriate programming work and can be used to characterize the morphological appearance of the cell cultures (FIG. 7b). The mean value of the distribution shown on the left is 15.97 for the fibroblast cell culture, and that of the distribution shown on the right is 36.04 for the endothelial cell culture.
  • indices can be defined and used for characterization.
  • the indices can e.g. B. arranged in a two-dimensional array and the index values are color-coded. This creates a colored pattern that is characteristic of cell culture.
  • the individual index values can be combined into a new index using arithmetic operations. So there would be z. B. sense to combine the above-defined index of size and area (fractality) with the index that describes the parallelism, since the image objects are characteristic of the fibroblast culture because they both have a relatively low fractality and are arranged in parallel.
  • the new index defined in this way is more distinctive due to the combination.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Charakterisierung von Zellen, Zellver­bänden und/oder Gewebe mit einer Analyseeinheit, die Mittel aufweist, mittels derer morphologische Parameter von Zellen, Zellverbänden oder Gewebe erfasst wer­den, und die ferner Mittel aufweist, mittels derer die erfassten morphologischen Pa­rameter zum Zwecke der objektiven morphologischen Charakterisierung der Zellen, Zeltverbände oder des Gewebes ausgewertet werden. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur objektiven Charakterisierung von Zellen, Zellverbänden und/oder von Gewebe.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Charakterisierung von Zellen, Zellverbänden und/oder Geweben
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Charakterisierung von Zellen, Zellverbänden und/oder Geweben.
Zelltherapeutische Verfahren besitzen als zentrales Werkzeug der regenerativen Medizin einen hohen Stellenwert für zukünftige innovative Behandlungsmethoden. Dabei werden Zellen in vitro in industriellem Maßstab standardisiert gezüchtet und ggf. manipuliert. Des Weiteren ist es bekannt, Zellkulturen als Versuchsobjekte in der Pharmaindustrie zur Austestung von Pharmaka einzusetzen.
Das Erscheinungsbild einer zwei- oder dreidimensionalen Zellkultur besitzt sowohl auf Einzelzellniveau als auch auf Niveau der Gesamtzellpopulation spezifische morphologische Merkmale, die jeweils von der Art der kultivierten Zellen abhängig sind. So unterscheiden sich die Zellen z. B. in ihrer Größe, Form, in der Größe des Zellkerns, in der Granularität, der migratorischen Aktivität, der räumlichen Beziehung der Zellen untereinander (dispers oder kohärent) oder bei dreidimensionalen Zellkulturen in ihrer räumlichen Ausrichtung. Soll die Zellkultur beschrieben bzw. in ihrer Qualität beurteilt werden, werden derzeit vor allem mikroskopische Verfahren verwendet, um die Charakteristika der Zellkultur zu erfassen. Hierbei ist jedoch die morphologische Beurteilung der Zellpopulation, die weitgehend „per Hand" (nicht automatisiert) durchgeführt wird, stark vom Wissen und der Erfahrung des Untersuchers abhängig und bleibt daher subjektiv. Gegenüber anderen Verfahren zur Charakterisierung der Zellpopulation (z. B. molekularbiologische Methoden, FACS-Analysen) hat die morphologische Beurteilung die Vorteile, dass sie online durchgeführt werden kann, ohne die zu analysierende Zellpopulation in ihrem Wachstum zu stören, dass einzelne Zellen einer Population analysiert werden können, dass sie schnell durchgeführt werden kann und schließlich dass sie preiswert ist.
Im folgenden wird exemplarisch ein heute übliches Verfahren zur Züchtung von adharenten Zellen dargestellt. In mehreren Phasen des Verfahrensablaufes sind morphologische Beurteilungen der Zellkultur notwendig:
In einem ersten Schritt (Isolation der Zellen) werden die zu kultivierenden Zellen aus ihrem Ursprungsgewebe durch enzymatische und mechanische Verfahren herausgelöst und nach Aufreinigungen in entsprechenden Kulturgefäßen überführt. Abhängig von den Eigenschaften des Ursprungsgewebes (z. B. Knochen, Knorpel, Fettgewebe) kommen hierbei unterschiedliche Verfahren und Protokolle zum Einsatz.
Die Zellen werden nach der Isolation in einem weiteren Schritt (Kultivierung der Zellen in vitro) in einer Nährlösung („Medium") aufgenommen, in ein Zellkulturgefäß überführt und in einem Inkubator bei 37°C und 100 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die Nährlösung besteht neben Wasser aus einem Gemisch an Salzen, Nährstoffen, Vitaminen sowie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, dessen Zusammensetzung für die Art der zu kultivierenden Zellen spezifisch ist. Die notwendigen Medien sind nur bis zu einem gewissen Grad erhältlich und werden in der Regel im Labor eigenhändig zusammengemischt. Das Medium wird in regelmäßigen Ab- ständen gewechselt, indem das alte Medium abgesaugt und neues hinzugegeben wird. Bei einigen Zellkulturen ist es notwendig, im Laufe der Kultivierung nach einem definierten Protokoll verschiedene Medien mit unterschiedlichen Zusammensetzungen hinzuzugeben. Da adhärente Zellkulturen auf der Oberfläche des Zellkulturgefäßes wachsen, muss in regelmäßigen Abständen mikroskopisch kontrolliert werden, ob auf der Oberfläche noch genügend Platz zum Wachsen vorhanden ist („Grad der Konfluenz"). Wenn dieses nicht mehr der Fall ist, so müssen die Zellen auf mehrere neue Zellkulturgefäße aufgeteilt werden („Passagierung").
Bei der Passagierung werden die adharenten Zellen durch enzymatische oder mechanische Verfahren von der Oberfläche des Kulturgefäßes abgelöst. Durch Zentri- fugation werden die Zellen aufgereinigt, anschließend gezählt und in einer definierten Menge in neuen Kulturgefäßen ausgesät.
Neben der Bestimmung des Konfluenzgrades wird in regelmäßigen Abständen die Qualität der Zellpopulation beurteilt (Analysen während der Kultivierung). Besonderes Augenmerk wird dabei auf eine typische Morphologie der Zellen, auf das Wachstumsverhalten sowie eventuell vorhandener Kontaminationen durch Mikroorganismen oder nicht erwünschte Zellpopulationen gelegt. Die Analysen werden in Form einer mikroskopischen Beurteilung durchgeführt. Diese kann online angewendet werden, ist aber personalintensiv. Zudem erfordert die mikroskopische Beurteilung ein morphologisch geschultes Auge und bleibt in einigen Bereichen (insbesondere bei der Beurteilung der typischen Zellmorphologie) subjektiv.
Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, mittels dessen Zellen, Zellverbände und/oder Gewebe objektiv morphologisch charakterisierbar sind.
Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 , durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 7 sowie durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 10 gelöst. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst eine Analyseeinheit, die Mittel aufweist, mittels derer morphologische Parameter von Zellen, Zellverbänden oder Geweben erfasst werden. Ferner weist die Vorrichtung Mittel auf, mittels derer die erfassten Parameter zum Zwecke der objektiven morphologischen Charakterisierung der Zellen, der Zellverbände oder des Gewebes ausgewertet werden. Ein wesentlicher Gedanke der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, das morphologische Bild der Zellkultur bzw. einzelner Zellen vorzugsweise durch eine Vielzahl von morphometrischen Daten zu beschreiben. Es können auf diese Weise morphometrische Werte erhalten werden, die charakteristisch für die jeweilige Zellkultur bzw. die jeweiligen Einzelzellen sind („morphome- trisches Finger-Printing"). Im Gegensatz zu einer bildlichen Erfassung der Morphologie ist der morphometrische Finger-Print objektiviert. Die erfindungsgemäße Analyseeinheit weist vorzugsweise eine z.B. Software-gestützte bildgebende Einheit, beispielsweise ein Mikroskop, und eine Software-gestützte bildanalytische Einheit auf, wobei in der bildanalytischen Einheit integriertes Expertenwissen vorliegt, um die Auswertung der erfassten Parameter bzw. eine zutreffende Charakterisierung vornehmen zu können.
Die Analyseeinheit ist vorzugsweise derart ausgeführt, dass der Grad der Kon- fluenz, die Zellmorphologie als Maß für die Qualität der Zellkultur, das Proliferati- onsverhalten, die Kontamination mit Mikroorganismen oder anderen Zellpopulationen und/oder die Zelldifferenzierung ermittelbar und auswertbar ist. Denkbar ist es beispielsweise, die Zellgröße, die Zellform, die Größe des Zellkerns, die Granulari- tät, die migratorische Aktivität, das Wachstumsverhalten, die räumliche Beziehung der Zellen untereinander (dispers, kohärent) oder bei dreidimensionalen Zellkulturen auch die räumliche Ausrichtung der Zellen zu erfassen und sodann auszuwerten.
Grundsätzlich ist es möglich, eine Auswertung der erfassten Parameter durch die Bildung von Indizes vorzunehmen, die die erfassten Werte auf geeignete Weise miteinander in Beziehung setzen. Denkbar ist beispielsweise, als Objekt-Index einen Quotienten aus dem Umfang der Zellen sowie aus dem vierfachen Wert der Quadratwurzel der Zellfläche zu bilden. Dieser Index kann beispielsweise dazu herangezogen werden, eine Fibroblastenkultur von einer Endothelzellkultur zu unterscheiden. Grundsätzlich können aus den erfassten Parametern beliebige Indizes gebildet werden, die hinsichtlich der Charakterisierung der Zellen, Zellverbände oder des Gewebes hinreichende Unterscheidungskraft aufweisen.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Analyseeinheit Mittel zur statistischen Auswertung der erfassten Parameter aufweist. Bei einer derartigen Ausführung der Erfindung kann eine Statistik aus morphometrischen Werten, die charakteristisch für die jeweilige Zellkultur bzw. die jeweiligen Einzelzellen ist, erstellt werden. Die statistisch ermittelten Parameter können beispielsweise der Mittelwert, die Standardabweichung und der Mediän der morphologischen Werte sein. Dabei kann sich die statistische Auswertung auf die unmittelbar erfassten Parameter, wie beispielsweise die Größe der Zellen beziehen, oder auch auf die oben genannten Indizes, die in geeigneter Weise aus den erfassten Werten gebildet werden können, sofern dies für die Charakterisierung hilfreich ist.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist eine Datenbank mit Referenzparametern vorgesehen, die für die Zellen, Zellverbände bzw. das Gewebe typisch sind. Ferner ist vorgesehen, dass die Vorrichtung Vergleichsmittel aufweist, mittels derer die erfassten Parameter mit den Referenzparametern vergleichbar sind. Aufgrund dieses Vergleiches kann automatisiert bzw. objektiviert eine Aussage über die Zellpopulation bzw. die Art und Gestalt des Zellverbandes oder des Gewebes geliefert werden. Möglich ist es, durch Experten eine Datenbank aufzubauen, in der die morphometrischen Daten für Referenzkulturen bzw. Zellen vorliegen. Durch Vergleich der Werte einer zu untersuchenden Zellkultur mit denen aus der Datei kann somit indirekt Expertenwissen in die morphologische Untersuchung integriert und die morphologische Beschreibung der zu untersuchenden Zellkultur objektiviert werden. Durch Vergleich von statistisch erfassten morphometrischen Charakteristi- ka der zu untersuchenden Zellkultur mit denen aus einer Datenbank kann ohne die Anwesenheit eines Experten die Qualität der Zellkultur beurteilt werden. In ähnlicher Weise kann die Datenbank auch zur Identifizierung einzelner, für den Untersu- cher unbekannter Strukturen (z. B. Sedimentablagerungen, subzelluläre Strukturen) sowie zum Aufspüren von morphologisch fassbaren Phänomenen (Screening für mikrobielle Kontaminationen) verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Vorrichtung kann eine Auswertung mittels unmittelbar erfaßter Größen, wie z.B. der Zellgröße, oder mittels der genannten Indizes vornehmen, die in geeigneter Weise gebildet werden können.
In weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Analyseeinheit Mittel aufweist, mittels derer benachbarte Pixel des erfassten Bildes mit ähnlichem Helligkeitswert zu einem Bildobjekt zusammengefasst werden. Da sich in den Pha- senkontrastbildem die morphologischen Strukturen (z. B. Zellgrenzen) praktisch nur über die Helligkeitswerte und nicht über Farbunterschiede abzeichnen, spiegeln die entstandenen Bildobjekte die morphologischen Strukturen wieder. Dabei können die Bildobjekte durch Zusammenfassung benachbarter Pixel mit ähnlichem Helligkeitswert zusammengefasst werden.
Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen, Zellverbänden und Geweben mit einem Inkubator. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass sie ferner eine Vorrichtung zur objektiven Charakterisierung der Zellen, der Zellverbände oder des Gewebes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 aufweist. Die Besonderheit der Erfindung besteht darin, dass die Vorrichtung zur objektiven Charakterisierung der Zellen, der Zellverbände oder des Gewebes integraler Bestandteil einer Apparatur zur Kultivierung von Zellen, Zellverbänden bzw. Gewebe ist. In bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich um eine Apparatur zur automatischen Kultivierung von Zellen, Zellverbänden und Gewebe, d.h. einen Zellkulturautomaten mit integrierter Analyseeinheit zur objektiven Charakterisierung der Zellen, Zellverbände bzw. des Gewebes. Ferner ist bevorzugt, dass auch die Analyseeinheit automatisiert morphologische Parameter während der Kultivierung erfasst und auswertet. Dabei besteht die Möglichkeit, das Ergebnis der Auswertung in die Entscheidungs- prozesse der Automatisierung einfließen zu lassen, d.h. die Vorrichtung bzw. die Zellkultivierung in Abhängigkeit der Auswertung zu betreiben.
In bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung weist die Vorrichtung ferner einen Manipulator, einen Transporter zum Transport der Kulturgefäße zwischen dem Inkubator, dem Manipulator und der Analyseeinheit sowie eine Steuereinheit auf, mittels derer die Vorrichtung vorzugsweise automatisch betreibbar ist. Die Erfindung gemäß dieser Ausgestaltung weist somit mehrere Funktionsgruppen auf, die im folgenden näher beschrieben werden:
Der Detektor stellt ein Kernelement der Erfindung dar. Er dient zur Überwachung der Zellpopulation während der Kultivierung. Der Detektor bzw. die oben genannte Analyseeinheit besteht aus einer bildgebenden Einheit sowie einer Softwaregestützten bildanalytischen Einheit mit integriertem Expertenwissen, mit der die morphologischen Parameter in ihrer Komplexität erfasst werden können.
Da für die Zellkultivierung von Zellen Körperbedingungen simuliert werden müssen, ist dem Zellkulturautomaten ein Inkubator (Brutschrank) integriert.
Der Manipulator bewerkstelligt all die Arbeitsschritte automatisch, die bislang rein per Hand oder mit teilweise maschineller Unterstützung durchgeführt werden. Hierzu gehören u.a. Absaugen und Pipertieren von Lösungen, Zentrifugieren, Öffnen der Kulturgefäße, mechanisches Ablösen der Zellen etc.
Mithilfe des Transporters, der aus einer Kombination aus Förderband und Roboter mit Greifarm besteht, werden die Zellkulturgefäße zwischen den automatischen Komponenten Detektor, Inkubator und Manipulator hin und her transportiert.
Des weiteren ist eine intelligente Steuereinheit vorgesehen, die die Einzelkomponenten der Vorrichtung ansteuert und deren Tätigkeit koordiniert. Die zur intelligen- ten Bearbeitung notwendigen Informationen erhält die Steuereinheit durch den Detektor bzw. die Analyseeinheit.
In weiterer Ausgestaltung dieser Vorrichtung führt die Software-gestützte bildanalytische Einheit automatisch komplexe morphometrische Bildanalysen durch. Diese Einheit zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass das Expertenwissen sehr flexibel implementiert werden kann, das zur Erfassung und Bewertung der komplexen Morphologie erforderlich ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruches 10. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sind Gegenstand der Unteransprüche.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden anhand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispieles näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 bis 4: unterschiedliche exemplarische Abbildungen von zu charakterisierenden Zellpopulationen,
Fig. 5: Darstellungen einer konfluenten Fibroblastenstruktur (A) und einer Endothelzellkultur (B),
Fig. 6: Kontur der Bildobjekte (A: Fibroblasten-, B: Endothelzellen),
Fig. 7a: Häufigkeitsverteilung des Bildobjekt-Indexes (Umfang / (4 x Quadratwurzel der Fläche)) der Bildobjekte gemäß Fig. 5,
Fig. 7b: Häufigkeitsverteilung der Hauptachsenrichtung der Zellpopulationen gemäß Fig. 5.
Figur 1 zeigt exemplarisch eine zu charakterisierende Zellkultur. Denkbare Charakterisierungsmerkmale sind: Zellpopulation besteht aus x % rundlichen und y % länglichen Zellen; die Zellen tragen am Rand kleine Bläschen; teilweise formieren sich die Zellen in Strängen.
Typische Charakteristika der Zellstruktur gemäß Figur 2 sind: Zellen bilden dreidimensionale Gebilde; die Zellen sind eher länglich, die Zellen sind wenig granuliert.
Charakteristika der Zellen gemäß Figur 3 sind: Die Zellen zeichnen sich durch extreme Streifung aus („Stress Fibers"), die Zellen haben einen prominenten Nucleo- lus, die Zellen sind flächig, die Zellen sind groß, die Zellen haben einen zackigen Rand.
Charakteristika der Zellen gemäß Figur 4 sind: Es liegen zwei Zellpopulationen vor, nämlich große flächige Zellen, in einem lockeren Verband liegend, teilweise gestreift, und kleinere rundliche Zellen, die einen pflastersteinartigen Verband bilden.
Wie dies nachfolgend noch näher beschrieben wird, können die oben genannten, mittels einer bildgebenden Einheit erfassbaren Parameter der Zellpopulationen zu deren Charakterisierung herangezogen werden.
Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. die Arbeitsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird anhand eines im folgenden dargestellten Beispiels näher erläutert. Ziel ist es, mithilfe eines morphologischen Indexes eine Fibrobla- stenkultur von einer Endothelzellkultur zu unterscheiden. Die Zellkulturen sind aus Figur 5 ersichtlich, wobei Figur 5 A die Fibroblastenkultur und Figur 5 B die Endothelzellkultur darstellt. Die Charakterisierung erfolgt mithilfe einer morphometrischen Analyse der Zellkulturbilder (Phasenkontrastbilder).
Es wurde ein Analyseregelwerk gebildet, nach dem benachbarte Pixel mit ähnlichem Helligkeitswert zu Bildobjekten zusammengefasst werden. Da sich in den Phasenkontrastbildern die morphologischen Strukturen (z. B. Zellgrenzen) praktisch nur über die Helligkeitswerte und nicht über Farbunterschiede abzeichnen, spiegeln die entstandenen Bildobjekte die morphologischen Strukturen wieder. Wie man bei der Betrachtung des Erscheinungsbilds der beiden Zellkulturen gemäß Figur 5 sieht, zeichnet sich die Fibroblastenkultur vor allem durch längliche morphologische Strukturen aus (spindelförmiger Aspekt von Fibroblasten), während die Endothelzellkultur einen pflastersteinartigen Aspekt hat (Figur 5). Die untenstehenden Abbildungen zeigen, dass sich dieses auch in Form der während der Computeranalyse entstandenen Bildobjekte widerspiegelt: Bei der Fibroblastenkultur sind vermehrt Objekte mit länglichem Charakter zu finden, die ein im Vergleich zu den Bildobjekten der Endothelzellkultur geringeres Maß an Fraktalitat aufweisen, wie dies aus Figur 6 hervorgeht.
Von jedem Bildobjekt wurde nun Umfang und Fläche (jeweils in Pixel) in eine Excel- Tabelle ausgegeben. Anschließend wurde ein Objektindex wie folgt definiert: Index = Objektumfang/(4 x Quadratwurzel (Objektfläche)).
Diese Formel beschreibt das Maß der Fraktalitat. Der Faktor 1/4 sowie die Quadratwurzel bewirken eine Normierung der Bildobjekte, so dass auch Objekte unterschiedlicher Größe miteinander verglichen werden können (der Quotient Objektumfang/Fläche ist stark von der Größe der Objekte abhängig).
Für jedes Bildobjekt wurde nun dieser Index berechnet. Stellt man nun sämtliche Objekt-Indexwerte der Bildobjekte in einem Histogramm dar, so erhält man eine Art Kennkurve für die jeweilige Zellkultur, wie dies aus Figur 7a hervorgeht. Kenngrößen zur Beschreibung des Histogrammverlaufs sind z. B. der Mittelwert, die Standardabweichung sowie der Mediän. Man erkennt, dass die beiden Kurven gemäß Figur 7a einen unterschiedlichen Verlauf zeigen. Die Kurve für die Endothelzellkultur ist bauchiger. Auch die Werte für den Mittelwert, die Standardabweichung sowie den Mediän sind für die Fibroblasten- und Endothelzellkultur unterschiedlich (Fibroblasten: Mittelwert 2,17; Standardabweichung: 0,91 ; Mediän: 1 ,96. Endothelzellen: Mittelwert: 2,36; Standardabweichung: 0,96; Mediän: 2,18).
Die genannten Werte können somit zur objektiven numerischen Charakterisierung der Zellkulturmorphologie herangezogen werden. Ein weiteres Charakteristikum, das die Fibroblastenkultur von der Endothelzellkultur unterscheidet, ist die Ausrichtung der einzelnen Bildobjekte. Wie man in Figur 6 erkennt, liegen die Hauptachsen von benachbarten Bildobjekten in der Fibroblastenkultur größtenteils parallel, während dieses bei der Endothelzellkultur wesentlich weniger der Fall ist. Auch diese Objekteigenschaft ist durch entsprechende Programmierarbeit mathematisch erfassbar und kann zur Charakterisierung der morphologischen Erscheinung der Zellkulturen herangezogen werden (Figur 7b). Der Mittelwert der links dargestellten Verteilung beträgt 15,97 für die Fibroblasten- zellkultur, der der rechts dargestellten Verteilung 36,04 für die Endothelzellkultur.
In entsprechender weise können zahlreiche Indizes definiert und zur Charakterisierung herangezogen werden. Hierzu können die Indizes z. B. in einem zweidimen- sionalen Array angeordnet und die Indexwerte farbkodiert werden. So entsteht ein für die Zellkultur charakteristisches farbiges Muster.
Zum anderen können aber die einzelnen Indexwerte durch arithmetische Operationen zu einem neuen Index zusammengefasst werden. So gäbe es z. B. Sinn, den oben definierten Index aus Umfang und Fläche (Fraktalitat) mit dem Index zu kombinieren, der die Parallelität beschreibt, da für die Bildobjekte der Fibroblastenkultur charakteristisch ist, da sie sowohl eine relativ geringe Fraktalitat besitzen als auch parallel angeordnet sind. Der so definierte neue Index hat durch die Kombination bessere Unterscheidungskraft.
Aufgrund des wachsenden Wirtschaftssektors in dem Bereich der zelltherapeutischen Verfahren wird es mehr und mehr nötig sein, Zellen unter zertifizierbaren Bedingungen zu züchten. Dies gilt auch für den Bereich der pharmazeutischen Industrie, in der Medikamente anhand von Zellkulturen getestet werden. Durch Vergleich des statistisch erfassten morphometrischen Finger-Prints einer Zellkultur mit dem, der in der Datei für diesen Zelltyp als Referenz abgelegt ist, ist es möglich, auch die morphologische Beurteilung zu zertifizieren.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Charakterisierung von Zellen, Zellverbänden und/oder Gewebe mit einer Analyseeinheit, die Mittel aufweist, mittels derer morphologische Parameter von Zellen, Zellverbänden und/oder von Gewebe erfasst werden, und die Mittel aufweist, mittels derer die erfassten morphologischen Parameter zum Zwecke der objektiven morphologischen Charakterisierung der Zellen, Zellverbände und/oder des Gewebes ausgewertet werden.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Analyseeinheit eine bildgebende Einheit und eine bildanalytische Einheit umfasst.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyseeinheit derart ausgeführt ist, dass der Grad der Konfluenz, die Zellmorphologie als Maß für die Qualität der Zellkultur, das Proliferationsverhalten, die Anwesenheit von Mikroorganismen und/oder die Zelldifferenzierung ermittelbar und auswertbar ist.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyseeinheit Mittel zur statistischen Auswertung der erfassten morphologischen Parameter aufweist.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Datenbank mit für Zellen, Zellverbände und/oder Gewebe typischen Referenzparametern vorgesehen ist und dass die Vorrichtung Vergleichsmittel aufweist, mittels derer die erfassten Parameter mit den Referenzparametern verglichen werden.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyseeinheit Mittel aufweist, mittels derer benachbarte Pixel eines erfassten Bildes mit ähnlichem Helligkeitswert zu einem Bildobjekt zusammengefasst werden.
7. Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen, Zellverbänden und/oder Gewebe mit einem Inkubator, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ferner eine Vorrichtung zur objektiven Charakterisierung von Zellen, Zellverbänden und/oder Gewebe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 aufweist.
8. Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ferner einen Manipulator, einen Transporter zum Transport eines oder mehrer Zellkulturgefäße zwischen dem Inkubator, Manipulator und der Analyseeinheit sowie eine Steuereinheit zum Betrieb der Vorrichtung aufweist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuereinheit derart ausgeführt ist, dass die Vorrichtung automatisch betrieben wird.
10. Verfahren zur Charakterisierung von Zellen, Zellverbänden und/oder Gewebe, bei dem morphologische Parameter der Zellen, Zellverbände und/oder von Gewebe erfasst werden und die erfassten morphologischen Parameter sodann zum Zwecke der objektiven morphologischen Charakterisierung der Zellen, Zellverbände und/oder des Gewebes ausgewertet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass aus den erfassten Parametern zum Zwecke der Auswertung für die Zellen, die Zellverbände und/oder das Gewebe charakteristische statistische Werte bestimmt werden.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die statistischen Werte mit Werten aus einer Referenzdatenbank verglichen werden, die für Zellen, Zellverbände und/oder Gewebe charakteristische Werte enthält.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren weiterhin die Kultivierung von Zellen, Zellverbänden und/oder von Gewebe umfasst.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultivierung in Abhängigkeit von den ausgewerteten Parametern vorgenommen wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erfassung und Auswertung der morphologischen Parameter sowie die Kultivierung der Zellen automatisiert erfolgt.
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