EP1499639A1

EP1499639A1 - Neue nukleinsäuresequenzen und proteine von tumoren und neoplasien der schilddrüse

Info

Publication number: EP1499639A1
Application number: EP03747451A
Authority: EP
Inventors: Jörn Bullerdiek
Original assignee: Universitaet Bremen
Current assignee: Universitaet Bremen
Priority date: 2002-05-01
Filing date: 2003-05-02
Publication date: 2005-01-26
Also published as: WO2003093310A1; JP2006510344A; AU2003232255A1; US20070015150A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäuren und Proteine von Tumoren und Neoplasien der Schilddrüsen, wobei die Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ, ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst. Weiterhin betrifft die Erfindung bei Tumoren und Neoplasien der Schilddrüsen beobachtete Fusionsproteine, wobei die Fusionsproteine eine Aminosäuresequenz gemäss SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 aufweisen.

Description

Neue Nukleinsäuresequenzen und Proteine von Tumoren und Neoplasien der Schilddrüse

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren mit bei Hyperplasien und/oder Tumoren geänderter Expression, Nukleinsäure kodierend für das humanen Gen DRIP, welche auch synonym als THADA (Thyroid Adenoma Associated) bezeichnet wird, und deren Tumor spezifischen Neukombinationen und insbesondere Homologen davon, diese enthaltenden Nektoren und Zellen, von diesen codierte Polypeptide, dagegen gerichtete Antikörper, Verfahren zum Bestimmen von als Tu- mortherapeutika geeigneten Verbindungen, Verfahren zum Bestimmen von Genen, die an der Entstehung von Schilddrüsentumoren beteiligt sind und Verwendungen der besagten Nukleinsäuren.

Die Bedeutung der Schilddrüse infolge ihrer Hormonproduktion für die Kontrolle des Wachstums und der Entwicklung des Körpers ist in der Medizin ebenso wie die mit einer Funktionsstörung dieser Drüse zumindest in einigen Fällen im wahrsten Sinne des Wortes augenfälligen Veränderungen seit langem bekannt.

Hinsichtlich der Pathogenese von Strumen und Schilddrüsentumoren allgemein ist es insbesondere auf molekularer Ebene noch nicht gelungen, eine umfassende Vorstellung zu entwickeln. Derzeit werden zwei Konzepte diskutiert, wobei eines davon ausgeht, dass das hyperplastische Gewebe als infolge chronischer Stimulation durch ein trophisches Hormon, was letztendlich das Wachstum polyklonaler Knoten zur Folge hat, bedingt betrachtet wird. Dieses Konzept wird als nicht-neoplastische endokrine Hyperplasie (NNEH) bezeichnet. Das zweite Konzept geht davon aus, dass die Knoten echte klonale Tumoren darstellen.

Im Falle der Schilddrüse hat sich gezeigt, dass das auf andere Drüsen anwendbare einfache Konzept der nicht-neoplastischen endokrinen Hyperplasie nicht anwendbar ist. Eine Übersicht über die derzeit auf diesem Gebiet angestellten Überlegungen findet sich bei Studer, H. (1995); Endocri- ne Reviews, Vol. 16, No. 4, Seiten 411-426 und Derwahl M und Studer H. (2002), Trends Endocri- nol Metab, Vol. 13 No. 1, Seiten 23-8.

Für die Behandlung von Strumen und Schilddrüsentumoren ist somit eine frühzeitige Diagnose erforderlich, um geeignete therapeutische Konzepte zur Anwendung gelangen zu lassen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Diagnose und Therapie von Funktionsstörungen der Schilddrüse, Hyperplasien der Schilddrüse und Tumoren der Schilddrü- se auf der molekularen Ebene bereitzustellen, insbesondere sollen Nukleinsäuresequenzen bereitgestellt werden, die an den Pathogenitätsmechanismen beteiligt und auch geeignet sind, diese weitergehend zu untersuchen, sowie solche, die auf die Pathogenitätsmechanismen einwirken oder diese beeinflussen können.

Darüber hinaus sollen darauf aufbauende Medikamente sowie allgemein pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt werden.

Desweiteren sollen Kits zur Diagnose und/oder Therapie . von Funktionsstörungen der Schilddrüse, Hyperplasien der Schilddrüse und Tumoren der Schilddrüse ebenso wie Verfahren zum Nachweisen dieser zur Verfügung gestellt werden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch eine Nukleinsäure mit bei Hyperplasien und/oder Tumoren geänderter Expression, wobei die Nukleinsäure eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ.ID.No 1, SEQ.ID.No 3, SEQ.ID.No.4, SEQ.ID.No 9, und SEQ. ID. No 11 bis 16 oder jeweils einen Teil oder ein Fragment davon umfasst. (Hierin bedeutet SEQ.ID.No. 11 bis SEQ.ID.No. 16 alle Sequenzen von 11 bis 16, d.h. SEQ.ID.No. 11, SEQ.ID.No. 12, SEQ.ID.No, 13 etc., bis SEQ.ID.No.16). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch solche, die ein Exon oder den Übergangsbereich zwischen zwei Exons umfassen. Der Übergangsbereich kann dabei so kurz sein, wie es erforderlich ist, um einen spezifischen Nachweis des Übergangsbereiches, insbesondere für die diagnostische Anwendung, zu ermöglichen. Die entsprechenden Längen sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Ein Übergangsbereich kann dabei ein solcher zwischen zwei Exons eines Gens aber auch ein solcher zwischen zwei Exons zweier verschiedener Gene sein, wie dies beispielsweise bei den hierin offenbarten Fusionsgenen, hierin auch synonym als Fusionstranskripte bezeichnet, vorliegt. Dabei ist bei den Genen und bei den Fusionsgenen insbesondere jener Bereich oder jene Exons für bevorzugterweise die Diagnose des Vorliegens der hierein beschriebenen Tumoren und Neoplasien der Schilddrüse verwendbar, der/die in dem jeweiligen Bruchpunktbereich, wie er hierin offenbart wird, angeordnet sind.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe, die epitheliale Tumoren mit einer Veränderung der chromosomalen Bande 2p und Tumore mit einer Veränderung der chromosomalen Bande 2p21-22 umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Hyperplasie ausgewählt ist aus der Gruppe, die Hyperplasien der Schilddrüse umfasst.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass SEQ. ID. No. 11 für DRIP, insbesondere humanes DRIP, oder einen Teil davon codiert. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass SEQ. ID. No. 12 für DRIP, insbesondere humanes DRIP, oder einen Teil davon codiert.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass SEQ. ID. No. 16 für DRIP, insbesondere humanes DRIP, oder einen Teil davon codiert.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass SEQ. ID. No. 1 für das erfindungsgemässe Fusionsprotein oder einen Teil davon codiert. Das erfindungsgemässe Fusionsprotein wird hierin auch als DRIP-FUS Ib bezeichnet.

In einer weiteren Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass SEQ. ID. No. 9 für das erfindungsgemässe Fusionsprotein oder einen Teil davon codiert. Das erfindungsgemässe Fusionsprotein wird hierin auch als DRIP-FUS Ha bezeichnet.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass SEQ. ID. No. 13 für das erfindungsgemässe Fusionsprotein oder einen Teil davon codiert. Das erfindungsgemässe Fusionsprotein wird hierin auch als DRIP-FUS I bezeichnet.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass SEQ. ID. No. 14 für das erfindungsgemässe Fusionsprotein oder einen Teil davon codiert. Das erfindungsgemässe Fusionsprotein wird hierin auch als DRIP-FUS la bezeichnet.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass SEQ. ID. No. 15 für das erfindungsgemässe Fusionsprotein oder einen Teil davon codiert. Das erfindungsgemässe Fusionsprotein wird hierin auch als DRIP-FUS II bezeichnet.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass SEQ. ID. No. 3 für FUS I, insbesondere humanes FUS I, oder einen Teil davon codiert.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass SEQ. ID. No. 4 für FUS II, insbesondere humanes FUS II, oder einen Teil davon codiert.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes für die gleiche Aminosäuresequenz codieren würde wie eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure, die an eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisiert, insbesondere unter stringenten Bedingungen.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Vektor, wobei der Vektor eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Vektor weiterhin mindestens ein Element umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Promotoren, Terminatoren und Enhancer umfasst. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Vektor ein Expressionsvektor ist.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass mindestens ein Promotor im Leserahmen mit mindestens einem für ein Polypeptid codierenden Teil einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ist.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Polypeptid codiert durch eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der Sequenzen gemäß SEQ. ID.No. 2, SEQ. ID.No. 5 bis SEQ. ID.No. 8, SEQ. ID.No. 10 und SEQ. ID.No. 17.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polypeptid modifiziert ist.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Zelle, insbesondere eine isolierte Zelle, die einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch Antikörper, wobei der Antikörper gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet ist.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Antikörper gegen eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gerichtet ist.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Ribozym, wobei das Ribozym gegen eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäure gerichtet ist.

In einer Ausführugsform ist vorgesehen, dass das Ribozym zumindest einen Teil einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder einer dazu im wesentlichen komplementären Nukleinsäure umfasst.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Anti-sense Nukleinsäure umfassend eine Sequenz, die der ganzen oder einer Teilsequenz im wesentlichen entspricht oder im wesentlichen komplementär zu einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequen- zen ist. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „im wesentlichen" unabhängig vom jeweiligen Kontext, in dem er verwendet wird, eine Homologie von mindestens 70 %, bevorzugterweise mindestens 80 % und bevorzugtererweise mindestens 90 %.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine interferierende RNA, hierin auch als RNAi bezeichnet, bevorzugterweise durch eine kleine interferierende RNA, umfassend eine Sequenz, die im wesentlichen komplementär oder im wesentlichen identisch ist mit einer der Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einem Teil davon, wobei bevorzugterweise die RNAi einen Bereich mit einer Länge von 21 bis 23 Nukleotiden umfasst, der im wesentlichen komplementär oder im wesentlichen identisch ist.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Primer oder eine Nukleinsäuresonde umfassend eine Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure im wesentlichen komplementär oder im wesentlichen identisch ist mit einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder einem Teil davon, wobei der Primer und/oder die Nukleinsäureseonde eine Länge von 12 bis 32 Nukleotiden, bevorzugterweise von 14 bis 28 Nukleotiden und bevorzugtererweise von 20 bis 28 Nukleotiden umfasst.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Bestimmen einer Verbindung, die die Wirkung eines Translationsproduktes einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche beeinflusst, insbesondere inhibiert, umfassend die folgenden Schritte:

Bereitstellen des Translationsproduktes und der Verbindung

Inkontaktbringen des Translationsproduktes und der Verbindung in einem System, das die Wirkung des Translationsproduktes darstellt, und

Bestimmen, ob unter dem Einfiuss der Verbindung eine Änderung der Wirkung des

Translationsproduktes auftritt. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung um ein Krebs- oder Tumormittel.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Bestimmen einer Verbindung, die die Wirkung eines Transkriptionsproduktes einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beeinflusst, insbesondere inhibiert, umfassend die folgenden Schritte:

Bereitstellen des Transkriptionsproduktes und der Verbindung

Inkontaktbringen des Transkriptionsproduktes und der Verbindung in einem System, das die Wirkung des Transkriptionsproduktes darstellt, und

Bestimmen, ob unter dem Einfiuss der Verbindung eine Änderung der Wirkung des

Transkriptionsproduktes auftritt. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung um ein Krebs- oder Tumormittel.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das System ausgewählt ist aus der Gruppe, die zelluläre Expressionssysteme, zellfreie Expressionssysteme, Assay zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen Verbindung und Translationsprodukte, und Assay zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen Verbindung und Transkriptionsprodukte umfasst. In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung von Genen, die für die Entstehung von Hyperplasien und Tumoren, insbesondere der Schilddrüse, verantwortlich sind umfassend die folgenden Schritte:

Ermitteln der Bruchpunkte bei chromosomalen Translokationen der Hyperplasien und der Tumoren,

Bestimmen von Genen, die innerhalb eines Bereichs von etwa 400 kbp, bevorzugterweise etwa 320 kB, bevorzugterweise etwa 150 kbp, in jede Richtung ab dem Bruchpunktbereich liegen, und

Bestimmen, ob die Translation/ Transkription des Gens in einer Zelle der Hyperplasie oder des Tumors gegenüber einer nicht-Hyperplasie-Zelle oder einer nicht-Tumor- Zelle verändert ist. In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, des erfindungsgemäßen Ribozyms, der erfindungsgemäßen antisense-Nukleinsäure, der erfindungsgemäßen RNAi und/oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonde zur Diagnose, insbesondere in vitro, und/oder Therapie von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hyperplasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, des erfindungsgemäßen Ribozyms, der erfindungsgemäßen antisense-Nukleinsäure, der erfindungsgemäßen RNAi und/oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonde zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere zur Therapie und/oder Prävention von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines der erfindungsgemäßen Polypeptide zur Diagnose, insbesondere in vitro, und/oder Therapie von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines der erfindungsgemäßen Polypeptide zur Herstellung eines Medikaments.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines der erfindungsgemäßen Antiköφer zur Diagnose, insbesondere in vitro, und/oder Therapie von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines der erfindungsgemäßen Antiköφer zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere zur Therapie und/oder Prävention von Funktionsstörungen der Schilddrüse und oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Kit zur Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit mindestens ein Element umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die eine Nukleinsäure, einen Vektor, ein Polypeptid, eine Zelle, einen Antiköφer, ein Ribozym, eine antisense-Nukleinsäure, eine RNAi, einen Primer, und/oder eine Nukleinsäuresonde, jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfasst.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren der Schilddrüse, umfassend die folgenden Schritte:

Kontaktieren von Schilddrüsenmaterial mit dem Agens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die eine Nukleinsäure, einen Vektor, ein Polypeptid, einen Antiköφer, ein Ribozym und eine Zelle, jeweils gemäß der vorliegenden Erfindung, umfasst, und Bestimmen, ob Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumore der Schilddrüse vorliegen.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Schilddrüsenmaterial ex vivo vorliegt.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Schilddrüsenmaterial Teil eines zoologischen Präparates ist.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und eines Teils davon als Primer und/oder als Sonde.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Primer zum Darstellen und/oder Screenen und/oder Detektieren einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, der Primer oder die Sonde zu einem Teil einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen komplementär oder im wesentlichen identisch ist.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch das Verfahren zum Darstellen einer Nukleinsäure, die eine Sequenz umfasst, welche in Schilddrüsentumoren oder Strumen nachgewiesen werden kann, bei denen eine Translokation mit Bruchstelle in der chromosomalen Bande 2p21-22 vorliegt, wobei die Sequenz innerhalb der chromosomalen Bande 2p21-22 liegt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Primers zum Durchführen einer Polymerase-

Kettenreaktion,

Bereitstellen eine der Bande 2p21-22 des humanen Chromosoms 2 entnommenen

Nukleinsäuresequenz oder einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren,

Mischen der Nukleinsäuresequenz bzw. der Nukleinsäure mit den Primern,

Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: mindestens ein Agens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die eine Nukleinsäure, einen Vektor, ein Polypeptid, eine Zelle, einen Antiköφer, eine antisense-Nukleinsäure, eine RNAi, einen Primer und/oder eine Nukleinsäuresonde und/oder ein Ribozym, jeweils gemäß der vorliegenden Erfindung, sowie Kombinationen davon umfasst, und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumoren und Hypeφlasien, wobei vorgesehen ist, dass eine Verbindung an einen Patienten, insbesondere an einen Patienten, der an einem Tumor, insbesondere an einem Schilddrüsentumor oder einer Hypeφlasie leidet, verabreicht wird, die die Auswirkungen der geänderten Expression einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren verhindert. Dabei kann die Änderung sowohl eine Erhöhung der Expression wie auch eine Verringerung der Expression sein.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer Verbindung, die die Auswirkungen der geänderten Expression einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren verhindert, zur Herstellung eines Medikamentes.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Medikament für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumoren, insbesondere von Tumoren der Schilddrüse, und/oder Hypeφlasien ist bzw. verwendet wird.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer Nukleinsäure mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder davon codierte Polypeptide oder Derivate davon zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere zur Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schild- drüsentumoren und/oder zur Herstellung eines diagnostischen Mittels, insbesondere für die Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polypeptid eine Aminosäuresequenz gemäß No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 aufweist.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure mit der Nukleinsäure gemäß einer der SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes hybridisieren würde.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines Polypeptids mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 umfasst, oder Derivate davon zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere zur Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren und/oder zur Herstellung eines diagnostischen Mittels, insbesondere für die Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfmdungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Screenen eines Mittels zur Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren, und/oder eines diagnostischen Mittels für die Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren, umfassend die Schritte:

Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung,

Bereitstellen eines Expressionsssystems und/oder Aktivitätssystems;

Inkontaktbringen der Kandidaten- Verbindung mit dem Expressionssystem und/oder dem

Aktivitätssystem;

Bestimmen, ob unter dem Einfiuss der Kandidaten- Verbindung die Expression und/oder die

Aktivität einer Nukleinsäure mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der

Gruppe, SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder davon codierte Polypeptide und/oder Polypeptide mit einer Sequenz gemäß SEQ.

ID. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 Derivate davon verändert wird.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Kandidaten- Verbindung in einer Verbindungsbibliothek enthalten ist. In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Kandidaten- Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe von Verbindungsklassen, die Peptide, Proteine, Antiköφer, Anticaline, funktionale Nukleinsäuren und kleine Moleküle umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die funktionalen Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe, die Aptamere, Aptazyme, Ribozyme, Spiegelmere, Antisense-Oligonukleotide und RNAi umfasst.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Verwendung einer Nukleinsäure mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder davon codierte Polypeptide oder Derivate davon und/oder eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ. ID. No.

2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 oder eines Derivates davon und/oder eines insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartners einer Nukleinsäure mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder davon codierte Polypeptide oder Derivate davon und/oder einer dafür codierenden Nukleinsäure und/oder der Wechselwirkungspartner eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 oder eines Derivates davon als Zielmolekül für die Entwicklung und/oder Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren, und/oder für die Entwicklung und/oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Tumoren der Schilddrüse.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Medikament oder das diagnostische Mittel ein Agens umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antiköφer, Peptide, Anticaline, kleine Moleküle, Antisense-Moleküle, Aptamere, Spiegelmere und RNAi-Moleküle umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Agens mit einer Nukleinsäure mit einer Sequenz in Wechselwirkung tritt, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder mit einer für einen insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner codierenden Nukleinsäure, insbesondere mit mRNA, genomischer Nukleinsäure oder cDNA in Wechselwirkung tritt.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines Polypeptids, das mit einem Peptid in Wechselwirkung tritt, das von einer Nukleinsäure mit einer Sequenz codiert wird, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1,

3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder einem Polypeptid gemäß SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 und/oder mit einem insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner davon in Wechselwirkung tritt zur Entwicklung oder Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren, und/oder zur Entwicklung oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antiköφer und bindende Polypeptide umfasst.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer Nukleinsäure, die mit einem Polypeptid in Wechselwirkung tritt, wobei das Polypeptid von einer Nukleinsäure mit einer Sequenz codiert, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder einem Polypeptid gemäß SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 und/oder mit einem insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner davon zur Entwicklung oder Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren, und/oder zur Entwicklung oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Aptamere und Spiegelmere umfasst.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer ersten Nukleinsäure, die mit einer zweiten Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, wobei die zweite Nukleinsäure eine Sequenz aufweist, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder mit einer Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, die für einen Wechselwirkungspartner eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 codiert zur Entwicklung oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die in Wechselwirkung tretende ersten Nukleinsäure ein Antisense-Oligonukleotid, ein Ribozym und/oder RNAi ist.

In einer Ausführungsform der letzten beiden Aspekt ist vorgesehen, dass die zweite Nukleinsäure die jeweilige cDNA oder mRNA ist. In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend mindestens ein Agens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, wie durch die verschiedenen erfindungsgemäßen Verwendungen definiert, und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, insbesondere zur Prävention und/oder Behandlung von Funktionsstörun- gen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Kit für die Charakterisierung des Zustandes der Schilddrüse, umfassend mindestens ein Agens, das durch eine der erfindungsgemäßen Verwendungen definiert ist.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 oder ein funktionsfähiges Fragment davon.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids gemäß einer der erfindungsgemäßen Verwendungen.

Weitere Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass es eine Reihe von Genen bzw. Nukleinsäuresequenzen gibt, deren gegenüber normalem Gewebe geänderte Expression mit dem Auftreten von Tumoren und Hypeφlasien in Verbindung gebracht werden kann und kausal damit verbunden zu sein scheint.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass es im Falle bestimmter Hypeφlasien bzw. Tumoren zu einer Änderung der Expression bestimmter Gene bzw. Sequenzen kommt. Unter Änderung soll dabei hierin insbesondere entweder eine Erhöhung der Expression oder aber eine Verringerung der Expression verstanden werden. Als Referenz dient dabei das Maß der Expression des in Frage stehenden Gens bzw. der in Frage stehenden Sequenz in Zellen bzw. Gewebe, die bzw. das verschieden ist bzw. sind von Zellen der Hypeφlasien bzw. Tumoren.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde weiterhin festgestellt, dass es im Falle bestimmter Hypeφlasien bzw. Tumoren zu einer Änderung der Nukleotidsequenz bestimmter Gene bzw. Sequenzen im Bezug zum Normalgewebe kommt. Derartige Sequenzen, die hierin auch als Fusionsgene, Fusionsproteine oder Fusionstranskripte bezeichnet werden, sind beispielsweise die hierin offenbarten DRIP-FUS I und DRIP-FUS II mit deren jeweiligen Splicevarianten, bzw. die dafür codierenden Nukleinsäuren und Aminosäuresequenzen.

Schließlich wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch noch festgestellt, dass Zellen von Schilddrüsentumoren und auch kultivierte Zellen von Schilddrüsentumoren oft einen Bruch am Chromosom 2p21-22 besitzen. Dabei konnte der Bruchpunktbereich auf 316 kbp eingegrenzt werden. 206kbp des DRIP - Gens liegen im Bruchpunktbereich (synonym auch als Bruchpunktcluster bezeichnet). Genauer gesagt liegen die Exons 27 bis 38 im Bruchpunktbereich. Das 3' Ende des DRIP Gens liegt zum Telomer des Chromosoms 2p. Die DNA des DRIP-Gens ist 365186 bp lang und weist insgesamt 38 Exons auf. Die mRNA Sequenz und verschiedenen Splice- Varianten sind in den verschiedenen SEQ ID Nos angegeben.

Die hierin offenbarte Sequenz des DRIP-Gens beinhaltet eine Reihe von codierenden Sequenzen (engl. CDS). Es können mehrere mögliche codierende Sequenzen bestimmt werden, wobei das erste AUG der angegebenen DRIP mRNA als Translationsstart favorisiert wird, die alle erfindungsgemäße Nukleinsäuren bzw. Aminosäuresequenzen und Peptide bzw. Proteine im Sinne der vorliegenden Erfindung darstellen. Ein Wechselwirkungspartner des DRIP-Gens bzw. des davon codierten Polypeptids stellt der so genannte Todesrezeptor (engl. death receptor) dar.

Soweit hierin auf „stringenten Bedingungen" Bezug genommen wird, handelt es sich dabei um solche Bedingungen, wie sie hierin, insbesondere in den Beispielen, im Zusammenhang mit PCR, Northern Blot und Southern Blot beschrieben sind.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können im Sequenzprotokoll mRNA-Sequenzen auch als DNA-Sequenzen dargestellt sein. Weiterhin können codierende Sequenzen (CDS) auch in Form der translatierten Aminosäuresequenz dargestellt sein.

Zur Ermittlung der genomischen Struktur des Bruchpunktclusters wurde ein Bereich von genomischer DNA von 506 kbp untersucht. Dazu wurden die in Tabelle 1 dargestellten BAC-Klone herangezogen und analysiert.

Tabelle 1: Untersuchte BAC-Klone zum Bruchpunktbereich.

Die genauere Herkunft der BAC - Clone (z.B. Bibliothek usw.) ist den Genbankeintragungen zu entnehmen.

206kbp des hierin offenbarten DRIP - Gens liegen im Bruchpunktbereich, wobei genauer die Exons 27 bis 38 im Bruchpunktbereich liegen. Das 3' Ende des DRIP Gens liegt zum Telomer. Eine Darstellung der Bruchpunktregion ist in Fig. 12 wiedergegeben.

Das DRIP - Gen

Genomische Organisation des DRIP-Gens

Genomische Größe des DRIP-Gens

Das DRIP- Gen ist 365186 bp groß und in SEQ ID No. 12 vollständig dargestellt. In Tabelle 2 sind die Exon- und Introngrößen und deren relativer Lage zu bestimmten Klonen aufgeführt. Hierin werden die Formulierungen Seq ID vr und SEQ ID No. synonym verwendet.

Tabelle 2: Größendetails des DRIP - Gens.

DRIP mRNA Struktur

Das DRIP-Gen besitzt Splice- Varianten. Das größte Transkript hat 6090 bp. Die hierin offenbarte Sequenz, enthält alle möglichen CDS. Die Exongrößen sind dabei in Tabelle 2 wiedergegeben. DRIP Transkripte

Es gibt zwei DRIP-Transkripte. SEQ. ID. No. 11 beschreibt das cDNA-Transkript von Exon 1 bis Exon 38 durchgehend. SEQ. ID. No. 16 beschreibt eine Splicevariante de DRIP cDNA- Transkripts von Exon 1 bis Exon 26 und von Exon 29 bis Exon 38. Fig. 13 zeigt eine schematische Darstellung der DR -mRNA-Srruktur.

Zusammenfassend können die verschiedenen Transkripte des DRIP-Gens wie folgt zusammenfassend charakterisiert werden.

Das DRIP Standardtranskript umfasst 6090bp und 38 Exons

In einer Splicevariante der DRIP mRNA fehlen Exon 27 und Exon 28. Darüber hinaus finden sich noch DRIP-homologe EST's und mRNAs, die in Tabelle 4 dargestellt sind.

Tabelle 3: Liste der homologen, d. h. dem Gen entsprechenden DRIP mRNAs

DRIP Expression

Das DRIP-Gen wird ubiquitär exprimiert. Ein Hinweis auf Expressionsdaten findet sich in der UniGene Datenbank des NCBI unter der Cluster Nr. Hs 16063 Homo sapiens. Es erfolgt beispielsweise eine starke Expression im Sage Northern in der Tumorzellinie MCF7 (Mamma Tumorzelllinie). Im Northemblot, wie in Fig. 11 dargestellt, zeigt sich eine verstärkte Expression in der Bauchspeicheldrüse und im Hoden.

DRIP - Protein

Open reading frame des DRIP-Gens

Der Open reading frame (ORF) des DRIP Gens ist in Fig. 13 dargestellt und in SEQ ID No 11 und SEQ ID No 16 enthalten. In den Beschreibungen zu den beiden SEQ ID No sind die Positionen von Anfang und Ende des ORF festgelegt.

Charakterisierung des erfindungsgemäßen Fusionsgens DRIPFUS1 aus Schilddrüsentumoren

Wie in Beispiel 1 näher beschrieben existiert in der Schilddrüsenzellline S325t/sv40 ein Fusionschromosom der(2) mit einem kleinen Stück des Chromosoms 3 (von 3p bis 3telomer). Aus diesem Fusionschromosom entsteht ein DRIP Fusionsprotein; das hierin als DRIP-FUS I bezeichnet wird. Eine Übersichtskizze der mRNA von DRIP-FUS I mit seinen Splicevarianten ist dargestellt in Fig. 14. Die mRNA ist in SEQ ID No 1, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14 und die Aminosäuresequenzen sind in SEQ.ID.No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 2 dargestellt.

Die DRIP-FUS I Fusionsgen cDNA und seine Splicevarianten wurden mit einer Standard 3' RACE - Technik ermittelt

Die angelagerte Sequenz des Chromosoms 3 stammt aus den BAC Klonen Rpll-167M22 (Acc: AC093174) und Rpl 1-33519 (Acc: AC091492). Eine Homologie der Sequenz von Chromosom 3 zu bekannten Genen ist nicht ersichtlich. Es sind neue Genstrukturen, die nur in Tumoren exprimiert werden.

Ohne darauf festgelegt sein zu wollen, geht der vorliegende Erfinder davon aus, dass das DRIP-FUS I-Gen an der Hypeφlasie und Tumorentstehung maßgeblich beteiligt ist. Das Gen bzw. die dafür codierende Sequenz ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und kann im Rahmen der hierin offenbarten Verwendungen entsprechend angewandt werden. Des weiteren ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure auch der Teil der für das erfindungsgemäße Fusionsprotein codierenden Nukleinsäuresequenz, der vom Chromosom 2 stammt. Gleiches gilt für den Teil der Nukleinsäuresequenz, der vom Chromosom 3 stammt. Die erfindungsgemäß verwendbaren Sequenzen, d. h. Teilsequenzen, ergeben sich unmittelbar aus der Sequenz gemäß SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 13, SEQ. ID. No. 14 bzw. den Annotierungen hieraus. Das gleiche gilt sinngemäß für das Polypeptid bzw. die entsprechende Aminosäuresequenz.

Weitere Fusionsgene/Fusionsproteine sind in den Figuren beschrieben.

Schließlich ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass alle hierin offenbarten Exons, Transkripte, cDNAs, ORFs und dergleichen als erfindungsgemäße Nukleinsäure verstanden werden und entsprechend der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können.

Zu den hier in Frage stehenden Tumoren gehören insbesondere eine erste Gruppe von epithe- lialen Tumoren, insbesondere solche mit einer Veränderung in der chromosomalen Bande 2p21-22, und eine zweite Gruppe von Tumoren, die eine Veränderung im chromosomalen Arm 2p aufweisen. Unter Veränderung soll dabei hierin insbesondere eine Chromosomentranslokation, Chromosomen- deletion, Chromosomeninsertion und Chromosomeninversion verstanden werden.

Die erste Gruppe von Tumoren umfasst dabei insbesondere auch Tumoren der Schilddrüse und bevorzugterweise epitheliale Tumoren der Schilddrüse. Die zweite Gruppe von Tumoren umfasst, unter anderem, Leukämien, wie beispielsweise die chronisch lymphatische Leukämie oder die akut myeloische Leukämie, B-Zell-Lymphome, Gliome, maligne fibröse Histozytome, Osteosarko- me, Leiomyosarkome, Liposarkome, Ovarialtumore, Brusttumore, Nierenkarzinome, Pankreaskar- zinom und Gallenblasenkarzinome.

Nach der WHO-Klassifikation sind die Tumoren der Schilddrüse meist epithelialen Ursprungs und lassen sich in benigne und maligne Formen unterteilen. Bei den benignen Schilddrüsentumoren wird zwischen „echten" Adenomen und Schilddrüsenhypeφlasien, d. h. benigne, adenoma- töse Strumaknoten, die als „Tumor-ähnliche Läsionen" bezeichnet werden, unterschieden. Diese Hypeφlasien sind meist polyklonale Knoten und haben oft einen variablen, makrofollikulären Aufbau, mit unvollständiger Kapselbildung. Schilddrüsenadenome dagegen sind gekapselte Tumoren, die sich vom Follikelepithel ableiten. Diese meist solitär auftretenden Tumoren sind gleichförmig aufgebaut und unterscheiden sich strukturell vom angrenzenden Schilddrüsengewebe. Sie lassen sich mikroskopisch (feingeweblich) nach ihrem Differenzierungsgrad in normofollikuläre (simpel/einfach), makrofollikuläre (kolloid), mikrofollikuläre (fetal), trabekuläre oder solide (embryonal) Adenome unterteilen.

Die hierin verwendete Abkürzung DRIP steht für den englischen Begriff „death receptor interacting protein" (deutsch: Todesrezeptor interagierendes Protein). Dieses Protein ist ein Ligand oder Adapter von Todesrezeptoren (engl. death receptors), insbesondere von death receptor 5 (DR5), und in der Funktion der Apoptose des zellulären Geschehens beteiligt. Dem DRIP-Gen kommt eine Funktion in der Signalinitiierung oder Signalweiterleitung zu.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfmdungsgemäßen Sequenzen generell auch die jeweils komplementären Sequenzen umfassen, die sich insbesondere durch Watson- Crick-Basenpaarung ergeben.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind weiterhin solche Nukleinsäuresequenzen umfasst, die insbesondere unter den Standard-Bedingungen für Northern-Blot-Hybridisierungen für den Nachweis von single-copy-Sequenzen mit den Sequenzen gemäß SEQ.ID.No 1, SEQ.ID.No 3, SEQ.ID.No 4, SEQ.ID.No. 9 und/oder SEQ.ID.No 11 bis SEQ.ID.No 16 hybridisieren oder mit solchen Sequenzen ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes hybridisieren würden. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise die folgenden. Als molekulare Sonde wird ein spezifisches Fragment verwendet. Die radioaktive Markierung mit ³²P erfolgte nach dem Prinzip der „random primer extension". Nach einer Prähybridisierung der Membran in ExpressHyb™ Hybridi- sierungslösung (Clontech Laboratories, Palo Alto, U.S.A.) für 30 min bei 68°C erfolgte die Hybridisierung der Membran mit 100 ng Sonde in ExpressHyb™ Hybridisierungslösung für 60 min bei 68°C. Danach wird die Membran zweimal für 20 min bei Raumtemperatur in 2 x SSC / 0.05 % SDS und viermal für 10 min bei 50°C in 0.1 x SSC / 0.1 % SDS gewaschen. Die Signale werden beispielsweise auf einem STORM Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, U.S.A.) detek- tiert.

Erfmdungsgemäße Nukleinsäuren sind auch solche, die ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes mit einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und der für die Aminosäuresequenz der hierin offenbarten Polypeptide und insbesondere die Fusionsproteine codierenden Nukleinsäuren, wie beispielsweise dargestellt als SEQ. ID. No. 1, SEQ.ID.No 9, SEQ.ID.No 11 und/oder SEQ ID No 13 bis 16, hybridisieren würde.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Bestimmen einer Verbindung, die die Wirkung eines Translationsproduktes einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beeinflusst, kann es sich auch um ein Verfahren zum Screenen einer Verbindungsbibliothek handeln. Derartige Verbindungsbibliotheken sind bevorzugterweise Bibliotheken niedermolekularer Verbindungen. Grundsätzlich wird dabei so vorgegangen, dass das Translationsprodukt einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einer Verbindung in einem System in Kontakt gebracht wird, wobei das System die Wirkung des besagten Translationsproduktes und damit eine Wirkung der Verbindung auf das Translationsprodukt darstellt bzw. in Form eines detektierbaren Signals widergibt. Diese Wirkung kann sich beispielsweise in einer veränderten Funktion hinsichtlich Stärke, Substratspezifität (Erkennung, Bindung, Transport) und/oder Rezeptorspezifität bzw. -affinität oder der Membranassoziation, wie beispielsweise in der Signalweiterleitung ausdrücken. Die Wirkung könnte ebenfalls einen Einfiuss auf enzymatische Prozesse innerhalb oder außerhalb einer Zelle haben. Die Wirkung kann dabei sowohl im zellfreien, im zellulären System, in der Zellkultur und/oder in transgenen Tiermodellen übeφrüft werden, d.h. in vitro, in vivo und in situ.

Soweit bei den erfindungsgemäßen Verfahren oder Anwendungen Bezug genommen wird auf Tumoren oder Hypeφlasien sollen hierunter alle hierin im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren offenbarten Tumoren oder Hypeφlasien umfasst verstanden werden.

Mit den vorliegenden Nukleinsäuresequenzen eröffnen sich somit neue Möglichkeiten sowohl zur Diagnose als auch zur Therapie der hierin beschriebenen Erkrankungen sowie der Untersuchung der mit dem Auftreten bei diesen Erkrankungen, insbesondere bei Strumen und Schilddrüsentumoren bzw. Schilddrüsenkarzinomen verbundenen Mechanismen. Insbesondere wird durch Kenntnis der Sequenzen die Möglichkeit gegeben, auf molekularer Ebene geeignete diagnostische und therapeutische Mittel i. S. von - pharmazeutischen - Zusammensetzungen sowie Medikamenten mittelbar oder unmittelbar einzusetzen. Die erfindungsgemäßen Nuklemsäuresequenzen können in für den Fachmann auf diesem Gebiet bekannter Art und Weise für die Gestaltung geeigneter diagnostisch und therapeutisch einsetzbarer Mittel im obigen Sinne sowie Kits und Verfahren verwendet werden.

Unter Nukleinsäure sollen dabei sowohl DNA-Sequenzen als auch RNA-Sequenzen, einschließlich Hybriden davon, verstanden werden, einschließlich hiervon abgeleiteter Derivate mit geändertem Rückgrat wie PNA und LNA. Dies schließt auch ein, dass die Nukleinsäuren einzelsträngig, doppelsträngig oder als Tripelstruktur vorliegen.

Es kann ebenfalls vorgesehen sein, dass sich die Strängigkeit der DNA, d. h. ob diese beispielsweise einzelsträngig oder doppelsträngig vorliegt, über die Länge der Nukleinsäuresequenz ändert.

Insbesondere kann auch vorgesehen sein, dass die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz nicht vollständig, sondern als Fragment vorliegt. Bevorzugterweise handelt es sich bei den Fragmenten um 5'- oder 3'-terminale Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.

Desweiteren ist es innerhalb des Umfangs der hierin vorliegenden Offenbarung, dass die Nuklemsäuresequenzen in mutierter Form oder als Allele, wie sie in verschiedenen Populationen vorkommen, vorliegen können. Unter Mutation sollen hierin alle dem Fachmann bekannten Mutationen, die innerhalb einer Nukleinsäuresequenz auftreten können, verstanden werden, einschließlich Punktmutationen sowie Nichtpunktmutationen, d. h. Inversionen, Insertionen und Deletionen. Insbesondere Translokationen, die zum Zugewinn oder Verlust von Nukleinsäuresequenzen führen und/oder besonders Fusionsgene hervorbringen.

Insbesondere unter dem Aspekt der Interaktion der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit anderen Nukleinsäuren soll hierin das Kriterum der Hybridisierung herangezogen werden, welches in der Technik allgemein anerkannt ist. Es wird anerkannt werden, dass durch Wahl geeigneter Hybridisierungsbedingungen die Stringenz der Hybridisierung innerhalb eines bestimmten Bereiches verändert werden kann und somit eine Hybridisierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen an Nukleinsäuresequenzen möglich wird, deren Grad der Abweichung von der unvollständig korrespondierenden, d. h. komplementären Sequenz schwanken kann.

Unter Nukleinsäuresequenz im erfindungsgemäßen Sinne soll auch jene Sequenz verstanden werden, die mit einer der erfindungsgemäßen Sequenzen hybridisieren würde, wenn nicht die Degeneration des genetischen Codes wäre. Dies bedeutet, dass mit Blick auf den in der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz vorhandenen offenen Leserahmen, bzw. die offenen Leserahmen, diese(r) unter Verwendung des genetischen Codes in eine Aminosäuresequenz translatiert werden kann/können. Infolge der Degeneration des genetischen Codes ist es jedoch möglich, ausgehend von der solchermaßen erhaltenen Aminosäuresequenz, wieder unter Verwendung des genetischen Codes eine Nukleinsäuresequenz zu gewinnen, die so verschieden ist, dass sie für sich genommen, mit der für die Bestimmung der Aminosäuresequenz herangezogenen Nukleinsäuresequenz möglicherweise nicht mehr hybridisieren kann.

Ausgehend von den hierin offenbarten Nukleinsäuren ist es für den Fachmann möglich, eine geeignete antisense-Nukleinsäure, insbesondere antisense-RNA zu erzeugen, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen interagieren kann. Aufgrund dieser Interaktion ist eine direkte Beeinflussung der die Nukleinsäuresequenzen involvierenden Vorgänge möglich. Diese Interaktion kann beispielsweise auf der Ebene der Transkription ebenso wie auf der Ebene der Translation erfolgen.

Unter Nukleinsäuresequenzen sollen hierin auch allgemein Nukleinsäuresequenzen verstanden werden, die durch Isolierung aus dem genannten Gewebe bevorzugterweise in situ oder ex vivo, beispielsweise aus entsprechenden Zeil-, Gewebe- oder Organkulturen, gewonnen werden können. Es sollen hierin jedoch auch entsprechende Nukleinsäuresequenzen verstanden werden, die aus Genbanken, insbesondere menschlichen Genbanken und noch bevorzugter Genbanken des menschlichen Chromosoms 2, 3 und 7, isolierbar sind oder aus diesen entnommen werden können. Des Weiteren soll hierin der Begriff Nukleinsäuresequenzen auch solche Nukleinsäuren umfassen, die mittels geeigneter Synthesetechniken herstellbar sind, einschließlich der Polymerasekettenreaktion, und anderer im Stand der Technik bekannter, biochemischer und chemischer Syntheseverfahren.

Die erfindungsgemäßen Sequenzen können darüber hinaus modifiziert vorliegen.

Unter Modifikation soll hierin unter anderem Fragmentierung, Insertion, Deletion und Reversion von (Teil-)Sequenzen der erfinderischen Nukleinsäuresequenzen verstanden werden. Dies schließt auch die Insertion anderer Nukleinsäuresequenzen ein. Diese Nukleinsäuresequenzen können beispielsweise für bestimmte Domänen codieren, als Spacer und/oder als Elemente zur Transla- tions- und Transkriptionsregulierung dienen.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren dergestalt modifiziert sein, dass sie Sequenzen oder Moleküle umfassen, die eine Interaktion mit anderen Molekülen erlauben. Dies kann beispielsweise in Form einer Bindungsstelle an einen festen Träger oder einer Sequenz, die die Bindung an ein Nukleinsäure-bindendes Protein vermittelt, erfolgen.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen markiert sein. Hierin soll unter Markierung grundsätzlich sowohl direkte als auch indirekte Markierung verstanden werden. Eine Markierung kann unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Markierungen sowie Markierungsverfahren erfolgen und schließt insbesondere radioaktive, nicht-radioaktive und Fluo- reszenzmarkierung ein. Nicht-radioaktive Markierungen umfassen, unter anderem, die Verwendung von Digoxygenin, Avidin, Streptavidin und Biotin.

Unter Vektor sollen hierin insbesondere rekombinante Vektoren, wie sie in der Technik bekannt sind, verstanden werden. Der Begriff des Vektors wie hierin verwendet, schließt, unter anderem, virale Vektoren, wie beispielsweise adenovirale oder retrovirale Vektoren und Phagensysteme, sowie Plasmidvektoren, einschließlich Cosmidvektoren, und künstliche Chromosomen, die in proka- ryontischen und/oder eukaryontischen Systemen verwendet werden können, ein.

Neben den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können die erfmdungsgemäßen Vektoren weitergehende Elemente umfassen, die im Stand der Technik bekannt sind. Die jeweiligen Elemente, wie beispielsweise Promotoren, Terminatoren und Enhancer, werden entsprechend dem jeweiligen Wirtszellsystem in für den Fachmann bekannter Art und Weise ausgewählt. Insbesondere ist hierin die Verwendung eines geeigneten eukaryontischen Promotors und eines induzierbaren Promotors bevorzugt. Neben der Verwendung der genannten Elemente einzeln oder in beliebiger Kombination ist es auch noch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass in derartigen Vektoren solche Elemente enthalten sind, die dazu führen, dass zumindest die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, oder ein Teil davon, in das Genom des Wirtszellsystems integriert wird.

Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass mindestens eines der genannten Elemente im Leserahmen („in-frame") mit mindestens einem offenen Leserahmen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen verbunden ist, und ganz besonders vorteilhaft ist es, wenn mittels eines zusätzlich eingeführten Promotors die Transkriptionsrate des speziellen offenen Leserahmens kontrolliert wird, wobei der Promotor dann typischerweise in geeignetem Abstand und „in-frame" mit dem offenen Leserahmen angeordnet ist.

Dabei kann weiterhin vorgesehen sein, dass ein offener Leserahmen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt unter den vorgenannten Bedingungen, eine Signalsequenz aufweist, die eine Translokation des vom offenen Leserahmen codierten Genproduktes über eine Membran und ggf. infolge dessen eine weitergehende Modifikation des Genprodukts erlaubt. Derlei Signalsequenzen schließen solche für den Transport des synthetisierten Proteins zum endoplasmati- schen Retikulum, Golgi-Apparat, zu Lysosomen, zu Zellorganellen, wie Mitochondrien und Chlo- roplasten, sowie zum Zellkern ein. Das solchermaßen mögliche Durchlaufen verschiedener zellulärer Kompartimente erlaubt eine posttranslationale Modifikation und damit ggf. eine weitergehende vorteilhafte Ausbildung des Genproduktes.

Neben Signalsequenzen kann ein derartiges Konstrukt auch zusätzliche Nukleinsäuresequenzen enthalten, die dazu führen, dass das Genprodukt eines offenen Leserahmens der erfmdungsge- mäßen Nukleinsäuresequenzen ein Fusionsprotein ausbildet, wobei der anfusionierte Teil einer Domäne eines anderen Proteins entsprechen kann und z. B. der Detektion des Genproduktes des offenen Leserahmens der erfindungsgemäßen Sequenzen dient, oder der Interaktion mit anderen Molekülen bzw. Strukturen im biologischen System, wobei das biologische System bevorzugt die Zelle ist.

Neben den vorgenannten und den weiteren sich für den Fachmann aus der Beschreibung ergebenden Vorteile der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen sind diese auch den aus den genannten Nukleinsäuresequenzen ableitbaren bzw. von diesen codierten Polypeptiden inhärent. Diese Polypeptide können zum einen direkt aus einem offenen Leserahmen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz abgeleitet werden, oder sind durch einen in einem Wirtsorganismus exprimierten erfindungsgemäßen Vektor in für den Fachmann bekannter Weise herstellbar. Dabei wird typischerweise der Wirtsorganismus zunächst mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformiert, der Wirtsorganismus vermehrt und das Polypeptid aus dem Wirtsorganismus, bzw. im Falle einer Sekretion desselben in das Medium, aus diesem gewonnen.

Neben einer direkten Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide und der sie codierenden Nukleinsäuren zur Beeinflussung des - zellulären - Geschehens in Schilddrüsengewebe können diese auch in der Reinigung, beispielsweise über Affinitätschromatographie, von am zellulären Geschehen beteiligten anderen Komponenten, oder zur Herstellung geeigneter Antiköφer verwendet werden, die dann, unter anderem, ihrerseits zu therapeutischen und/oder diagnostischen Zwecken verwendbar sind. Auf diese Art und Weise lassen sich unter anderem somit Wechselwirkungspartner der erfindungsgemäßen Polypeptide ermitteln bzw. isolieren.

In Abhängigkeit von den jeweils bestehenden Erfordernissen, wie posttranslationaler Modifikation oder erwünschtem Reinheitsgrad und dergleichen, kann bei Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide in einem Wirtsorganismus entweder ein prokaryontischer oder ein eukaryonti- scher Wirtsorganismus von Vorteil sein.

Die erfmdungsgemäßen Polypeptide können in geeigneter Weise modifiziert sein bzw. werden. Unter Modifikation soll, unter anderem, eine Fragmentierung, insbesondere Verkürzung, des Moleküls verstanden werden. Modifikation im hierin verwendeten Sinne beinhaltet auch die Markierung des Polypeptids. Letzteres kann mittels sowohl hochmolekularer als auch niedermolekularer Verbindungen erfolgen und schließt die radioaktive, nicht-radioaktive und Fluoreszenzmarkierung ein. Eine Markierung kann auch beispielsweise in Form einer Phosphorylierung oder Glycosylie- rung des Proteins vorliegen. Entsprechende Markierungsverfahren bzw. Modifikationsverfahren sind in der Technik bekannt (siehe z. B. Protein Methods, 2^nd ed., D. M. Bollag et al., Wiley Liss, Inc., New York, NY, 1996) und werden hierin vollumfänglich durch Bezugnahme aufgenommen.

Unter Modifikation wird erfindungsgemäß auch jede Form von posttranslationaler Modifikation, wie sie den Fachleuten bekannt sind, verstanden, insbesondere proteolytische Verarbeitung des Polypeptids, Anhängen oder Abtrennen von Resten am N-Terminus, Acetylierung des N-Terminus, Myristoylierung des N-Terminus, Anhängen von Glycosyl-Phosphatidyl-Resten, Farnesyl-Resten oder Geranylgeranyl-Resten an den C-Terminus, N-Glycosylierung, O-Glycosylierung, Anhängen von Glycosaminoglycan, Hydroxylierung, Phosphorylierung, ADP-Ribosylierung und Bildung von Disulfidbrücken.

Ebenso ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide durch Mutation(en), insbesondere Aminosäuremutation(en) aus einem erfindungsgemäßen Polypeptid hervorgehen oder hervorgegangen sind. Unter Aminosäuremutation wird sowohl eine Mutation verstanden, bei der eine Aminosäure durch eine in ihrer Seitenkette ähnliche Aminosäure ausgetauscht wird (konservative Mutation), beispielsweise I zu L oder D zu E, sowie eine Mutation, bei der eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure ausgetauscht wird, ohne dass dieser Austausch sich nachteilig auf die Funktion des codierten Polypeptids auswirkt (stille Mutation). Die Funktion des codierten Polypeptids kann durch einen geeigneten Assay übeφrüft werden. Geeignete funktionale Assays für DRIP, d. h. für apoptotische Vorgänge, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt (siehe z.B. Lizard G. al., Ann Pathol 1997 Mar; 17(1): 61-6.).

Mit den erfindungsgemäßen Zellen lassen sich weitergehende Vorteile realisieren. Diese umfassen unter anderem die Herstellung entsprechender Nukleinsäuresequenzen bzw. daraus abgeleiteter Genprodukte.

Insbesondere die Insertion der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen im Genom einer Zelle ist von besonderer Bedeutung, beispielsweise für das weitere Studium des Einflusses derartiger Sequenzen, insbesondere im zellulären Umfeld. Dabei können Gendosiseffekte und dergleichen untersucht bzw. zu diagnostischen und/oder therapeutischen Zwecken ausgenutzt werden. Ganz besonders vorteilhaft scheint dabei ein Zustand, bei dem ausgehend von diploiden Zellen lediglich ein Chromosom eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, und bevorzugt in der ihrer Position in Bande 2p21-22 entsprechenden Position insertiert, enthält und das zweite Chromosom keine Chromosomentranslokation unter Einbeziehung der chromosomalen Bande 2ρ21- 22 aufweist. Derartige Zellen können beispielsweise als Positiv- und/oder Negativkontrolle in einem diagnostischen Ansatz dienen. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass neben dem jeweiligen erfindungsgemäßen Translationsprodukt oder der/den dafür codierenden Nukleinsäure(n), wie hierin beschrieben, auch andere Mittel verwendet werden können, um die von dem jeweiligen Translationsprodukt oder der dafür codierenden Nukleinsäure ausgehenden Wirkungen zu erzeugen oder auch zu unterdrücken. Derartige Mittel können beispielsweise im Rahmen eines sogenannten Screening- Verfahrens ermittelt werden. Dabei werden in einem ersten Schritt eine oder mehrere sogenannte Kandidatenverbindungen bereitgestellt. Kandidatenverbindungen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind dabei solche Verbindungen, deren Eignung in einem Testsystem festgestellt werden soll, die hierin offenbarten Erkrankungen, insbesondere Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren, zu behandeln bzw. als diagnostische Mittel für die Diagnose derselben herangezogen zu werden. Zeigt die Kandidatenverbindung in dem beschriebenen Testsystem eine entsprechende Wirkung, stellt sie ein entsprechendes, d. h. prinzipiell geeignetes Mittel zur Behandlung dieser Erkrankungen dar. In einem zweiten Schritt wird sodann die Kandidatenverbindung mit einem (Translationsprodukt-) Expressionssystem oder mit einem (Translationsprodukt-) Aktivitätssystem in Kontakt gebracht. Ein Translationsprodukt-Expressionssystem ist dabei ein Expressionssystem, welches die Expression des Translationsproduktes zeigt, wobei der Umfang der Expression grundsätzlich veränderbar ist. Ein Translationsprodukt-Aktivierungssystem ist dabei im Wesentlichen ein Expressionssystem, wobei hier weniger auf die Expression des Translationsproduktes als vielmehr auf dessen Aktivität bzw. dessen Aktivierungszustand und dessen Be- einflussbarkeit abgestellt wird. Dabei ist beachtlich, dass das Translationsprodukt als solches nicht das Ergebnis eines tatsächlichen Expressionsvorganges sein muss, sondern auch dem entsprechenden Aktivitätssystem bereits als Polypeptid oder Protein zugegeben werden kann. Konkret wird in diesem Falle festgestellt, ob sich unter dem Einfiuss einer Kandidatenverbindung die Aktivität des Translationsproduktes verändert. Dabei kann unabhängig vom Vorliegen des jeweiligen konkreten Expressionssystems oder Aktivitätssystem grundsätzlich sowohl eine Verringerung der Expression bzw. Aktivität als auch eine Erhöhung der Expression bzw. Aktivität erfolgen. Typischerweise handelt es sich bei dem Expressionssystem und/oder dem Aktivitätssystem um einen in vitro-Ansatz, wie beispielsweise einen Zellextrakt oder ein Fragment eines Zellextraktes wie beispielweise einen Zellkernextrakt. Ein derartiger Ansatz kann aber auch ein hinsichtlich der beteiligten Komponenten mehr oder weniger genau definierter (bio-)chemischer Ansatz sein. Ein Translationsprodukt- Expressionssystem im Sinne der vorliegenden Erfindung kann jedoch auch eine Zelle sein, bevorzugterweise eine Zelle der Schilddrüse, der Hypeφlasien der Schilddrüse oder der einen Schilddrüsentumoren ausbildenden Zellen. Eine Feststellung darüber, inwieweit eine Erhöhung oder Verringerung des Expressionssystems erfolgt, kann dabei auf einer jeden Ebene der Expression festgestellt werden, d. h. beispielsweise durch Zunahme oder Abnahme der Menge der für das Translationsprodukt codierenden Nukleinsäure, insbesondere der mRNA, oder aber auch des im Expressionssystem unter dem Einfiuss der Kandidatenverbindung hergestellten Translationsproduktes, d. h. des jeweiligen Proteins. Die hierfür erforderlichen Techniken wie beispielsweise ein Verfahren zur Quantifizierung von mRNA sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook et al. (Sambrook, Joseph: Molecular Cloning: A laboratory manual/ J. Sambrook; E.F. Fritsch; T. Mani- atis - Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press), 19XX 1. Aufl. u.d.T. Mani- atis, Thomas P.: Molecular Cloning; Verf. der 3. Auflage: Joseph Sambrook und David W. Russell; Literaturangaben ISBN 0-87969-309-6 ISBN 0-87969-576-5 ISBN 0-87969-577-3 1. - 2. ed., 4. [Dr.]. - 1989). Des Weiteren sind dem Fachmann auch Verfahren bekannt zur Bestimmung des Gehaltes der Menge von Translationsprodukt, beispielsweise durch Verwendung geeigneter Antikörper. Antiköφer können nach den allgemein bekannten und beispielsweise in Current Protocols („Current Protocols in Protein Science", hrsg. von Coligan J.E.; Dünn B.M., Hidde L.P. Speicher D.W., Wingfield P.T.; John Wiley & Sons) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Weiterhin ist es möglich, dass im Rahmen des Expressionssystems das hergestellte Translationsprodukt eine Markierung trägt. Eine derartige geeignete Markierung ist beispielsweise die Markierung mit His₆ (Janknecht R et al. (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88 (20): 8972-6).

Im Falle des Translationsprodukt-Aktivitätssystems wird die Erhöhung der Aktivität oder Verringerung der Aktivtät des Translationsproduktes typischerweise in einem funktionalen Assay getestet, wie dies bereits im Zusammenhang mit der Definition der mutierten Translationsprodukte, genauer der mutierten erfindungsgemäßen Polypeptide, beschrieben wurde.

Das in Kontakt bringen von Kandidatenverbindungen und Expressionssystem oder Aktivitätssystem erfolgt dabei in der Regel durch Zugeben einer bevorzugterweise wässrigen Lösung der Kandidatenverbindung zu dem entsprechenden Reaktionssystem, d. h. dem Expressionssystem oder dem Aktivitätssystem, die hierin auch allgemein als Testsysteme bezeichnet werden. Die wässrige Lösung kann dabei bevorzugterweise eine Pufferlösung sein.

Die Verwendung von Kandidatenverbindungen erfolgt in der Regel in der Form, dass in einem jeden Test jeweils nur eine einzelne Kandidatenverbindung in dem entsprechenden Testsystem verwendet wird. Dabei ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass entsprechende Tests parallel und in einem Hochdurchsatzverfahren (engl. high through-put system) durchgeführt werden. In dem letzten Schritt des erfmdungsgemäßen Screening- Verfahrens, bestehend in dem Bestimmen, ob unter dem Einfiuss der Kandidatenverbindung die Expression bzw. Aktivität des Translationsproduktes oder einer dafür codierenden Nukleinsäure verändert wird, erfolgt in der Regel durch Vergleich des Verhaltens des Testsystems ohne Zusatz der Kandidatenverbindung mit demjenigen des Testsystems mit Zusatz der Kandidatenverbindung. Bevorzugterweise wird die Kandidatenver- bindung in einer Verbindungsbibliothek enthalten sein. Als Verbindungsbibliothek ist dabei grundsätzlich eine jede Verbindungsbibliothek unabhängig von der Verbindungsklasse denkbar. Geeignete Verbindungsbibliotheken sind beispielsweise Bibliotheken kleiner Moleküle. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass andere Verbindungsklassen als kleine Moleküle verwendet werden, wie beispielsweise Peptide, Proteine, Antiköφer, Anticaline und Nukleinsäuren, insbesondere auch funktionale Nukleinsäuren.

Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das erfindungsgemäße Translationsprodukt bzw. die dafür codierende Nukleinsäure als Zielmolekül (engl. ,target') für die Erzeugung der vorstehend genannten Verbindungsklassen wie insbesondere Peptide, Proteine, Antiköφer, Anticaline und funktionale Nukleinsäuren verwendet werden. Die entsprechenden Verbindungen, d. h. Peptide, Proteine, Antiköφer, Anticaline und funktionale Nukleinsäuren, können sodann in dem erfindungsgemäßen Screening- Verfahren verwendet werden.

Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass jene Verbindungen, d. h. Peptide, Proteine, Antiköφer, Anticaline und funktionale Nukleinsäuren, die gegen das erfindungsgemäße Translationsprodukt bzw. die dafür codierende(n) Nukleinsäure(n) erzeugt werden, als Mittel im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden, d. h. als Mittel für die Therapie von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren bzw. als entsprechende diagnostische Mittel.

Peptide und insbesondere bindende Peptide im Sinne der vorliegenden Erfindung sind dabei bevorzugterweise solche Proteine und Peptide, die an das erfindungsgemäße Translationsprodukt oder einen oder den/die Wechselwirkungspartner, insbesondere den/die natürlichen Wechselwirkungspartner, des erfindungsgemäßen Translationsproduktes, bevorzugterweise in biologischen Systemen, insbesondere in der Schilddrüse bzw. Hypeφlasien der Schilddrüse oder Schilddrüsentumoren und der sie aufbauenden Zellen, binden. Gleiches gilt auch für die hierin im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung beschriebenen Antiköφer, Anticaline, funktionalen Nukleinsäuren und kleinen Moleküle. Gleichzeitig kann ein jedes Mitglied der vorstehend genannten Verbindungsklassen bevorzugterweise mit dem erfindungsgemäßen Translationsprodukt oder einer dafür codierenden Nukleinsäure in Wechselwirkung treten und somit die entsprechende Aktivität des Translationsproduktes bzw. der dazu codierenden Nukleinsäure beeinflussen. Die Bedingungen, unter denen ein derartiges Inwechselwirkungtreten erfolgt, sind den Fachleuten bekannt und entsprechen dabei jenen Bedingungen, unter denen in der Anwendung ein Inwechselwirkungtreten erfolgen soll. Bevorzugterweise handelt es sich bei den Bedingungen um physiologische Bedingungen, bevorzugterweise um in biologischen System der hierin beschriebenen Erkrankungen vorherrschende Bedingungen.

Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, derartige Mitglieder zu erzeugen bzw. zu verwenden bzw. einem entsprechenden Screening- Verfahren zu unterziehen, die mit dem Wechselwirkungspartner, insbesondere dem natürlichen Wechselwirkungspartner des erfindungsgemäßen Translationsproduktes, oder einer dafür codierenden Nukleinsäure, in Wechselwirkung treten und die Expression bzw. Aktivität des Wechselwirkungspartners oder der dafür codierenden Nukleinsäure beeinflussen. Auch hier bezeichnet der Begriff „beeinflussen" entweder Erhöhung oder Verringerung der Expression, des Expressionsumfangs oder der Aktivität, wie hierin allgemein offenbart. Infolge der Wechselwirkung der besagten Mitglieder mit den Wechselwirkungspartnern des erfindungsgemäßen Translationsproduktes bzw. der dafür codierenden Nukleinsäure wird somit die an das Translationsprodukt gekoppelte Kaskade von Reaktionen unterbrochen, so dass die natürlicherweise beobachtete Wirkung des erfindungsgemäßen Translationsproduktes bzw. der von ihr codierten Nukleinsäure unterbrochen wird, was im Rahmen der hierin offenbarten Therapie bzw. Diagnose betreffend Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren verwendet werden kann.

Diese Peptide, im folgenden hierin auch als bindende Peptide oder bindende Proteine bezeichnet, können mit im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise phage-display gescreent bzw. hergestellt werden. Die Techniken sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Dabei wird bei der Erzeugung derartiger Peptide typischerweise so vorgegangen, dass eine Peptid- Bibliothek angelegt wird, beispielsweise in Form von Phagen, und diese Bibliothek in Kontakt gebracht wird mit einem Zielmolekül, im vorliegenden Falle beispielsweise mit einem Translationsprodukt oder dem natürlichen Wechselwirkungspartner des Translationsproduktes der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Die bindenden Peptide werden sodann typischerweise als Komplex zusammen mit dem Zielmolekül von den nicht bindenden Mitgliedern der Bibliothek entfernt. Es ist dabei im Rahmen der Kenntnisse der Fachleute auf diesem Gebiet, dass die Bindungseigenschaften zumindest bis zu einem bestimmten Umfang von den jeweils konkret vorliegenden Versuchsbedingungen, wie beispielsweise Salzgehalt und dergleichen, abhängen. Nach Abtrennen der mit einer höheren oder stärkeren Affinität an das Zielmolekül bindenden Peptide von den nicht-bindenden Mitgliedern der Bibliothek bzw. vom Zielmolekül, im vorliegenden Fall beispielsweise vom erfin- dungsgemäßen Translationsprodukt, können diese sodann charakterisiert werden. Ggf. ist vor der Charakterisierung ein Amplifikationsschritt, beispielsweise durch Vermehrung der entsprechenden, das Peptid bzw. die Peptide oder Protein(e) codierenden Phagen erforderlich. Die Charakterisierung umfasst bevorzugterweise die Sequenzierung der an das Translationsprodukt oder seinen natürlichen Wechselwirkungspartner bindenden Proteine, je nachdem, welches der beiden Moleküle als Zielmolekül in dem phage-display Screening-Verfahren eingesetzt wurde. Die Peptide sind dabei hinsichtlich ihrer Länge grundsätzlich nicht beschränkt. Typischerweise werden in derartigen Verfahren jedoch Peptide mit einer Länge von 8 - 20 Aminosäuren erhalten bzw. verwendet. Die Größe der Bibliotheken beträgt 10² - 10¹⁸, bevorzugterweise 10⁸ - 10¹⁵ verschiedene Peptide. Eine spezielle Form von an Zielmolekülen bindenden Peptiden stellen die Anticaline dar, wie sie beispielsweise in der deutschen Patentanmeldung DE 197 42 706 beschrieben sind.

Im Lichte der hierin offenbarten technischen Lehre können sodann auch Antiköφer gegen ein Genprodukt, insbesondere ein erfindungsgemäßes Translationsprodukt wie ein Polypeptid, oder die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen hergestellt werden. Damit ergeben sich auch in diesem Falle die dem Fachmann allgemein aus dem Vorhandensein von Antiköφern gegen chemische Verbindungen bekannten Vorteile, insbesondere bei in vitro- und in vivo-Anwendungen. Insbesondere ist mit den Antiköφern beispielsweise eine Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen, d. h. der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder der erfindungsgemäßen Polypeptide bzw. Translationsprodukte möglich, deren Detektion, aber auch die Beeinflussung der biologischen Aktivität, einschließlich der biologischen Verfügbarkeit, der Verbindungen, auf die der Antiköφer gerichtet ist, sowohl in situ, als auch ex vivo, in vivo und/oder in vitro. Genauer gesagt können insbesondere unter Verwendung von monoklonalen Antiköφern die Genprodukte spezifisch detektiert werden bzw. auf zellulärer Ebene eine Interaktion der Genprodukte bzw. Nukleinsäuresequenz mit anderen zellulären Komponenten beeinflusst und somit spezifisch in das zelluläre Geschehen eingegriffen werden. In Abhängigkeit von der Wirkung der jeweiligen Verbindungen, auf die der Antiköφer gerichtet ist und auf die er im betrachteten System seine Wirkung entfaltet, können prinzipiell stimulierende wie inhibierende Effekte erzielt werden.

Unter Antiköφer werden hierin sowohl polyklonale Antiköφer als auch monoklonale Antiköφer verstanden. Besonders bevorzugt jedoch sind monoklonale Antiköφer aufgrund der erhöhten Spezifität. Es sind jedoch Anwendungsfälle denkbar, in denen zum einen die Reinheit bzw. Spezifi- tät von polyklonalen Antiköφern ausreichend bzw. die Vielzahl der bei polyklonalen Antiköφern realisierten Spezifitäten und anderen Eigenschaften in vorteilhafter Weise genutzt werden können. Die Herstellung und Verwendung von Antiköφern ist beispielsweise beschrieben in Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow & D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1988), dessen Offenbarung hierein durch Bezugnahme aufgenommen wird.

Weiterhin ist es im Rahmen dieser Erfindung, dass der Antiköφer auch ein einzelkettiger Antiköφer sein kann.

Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Antiköφer fragmentiert, insbesondere verkürzt ist. Dies schließt ein, dass der Antiköφer weitestgehend trunkiert ist, solange noch die Antiköφer-spezifϊsche Eigenschaft, d. h. Bindung an ein definiertes Epitop, gegeben ist. Trun- kierung ist besonders dann von Vorteil, wenn der entsprechende Antiköφer auf zellulärer Ebene verwendet werden soll, da er gegenüber einem vollständigen Antiköφer verbesserte Permeations- und Diffusionseigenschaften aufweist.

Darüber hinaus sind auch noch andere Formen der Modifikation vorgesehen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind und beispielsweise beschrieben sind in Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow & D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1988). Allgemein kann festgehalten werden, dass die Modifizierung von Antiköφern prinzipiell in ähnlicher Weise erfolgen kann, wie die von Polypeptiden und, in bestimmtem Umfang, von Nukleinsäuren, und das hierzu oben Gesagte sinngemäß auch für den erfindungsgemäßen Antiköφer gilt.

Eine weitere Verbindungsklasse, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Screening- Verfahrens ebenso wie bei der erfmdungsgemäßen Herstellung von Medikamenten und diagnostischen Mitteln verwendet werden kann, sind funktionale Nukleinsäuren. Unter funktionalen Nukleinsäuren sollen hierin insbesondere Aptamere, Aptazyme, Ribozyme, Spiegelmere, Antisense- Oligonukleotide und RNAi verstanden werden.

Aptamere sind D-Nukleinsäuren, entweder einzelsträngig oder doppelsträngig, auf RNA- oder DNA-Basis, die spezifisch an ein Zielmolekül binden. Die Herstellung von Aptameren ist bspw. beschrieben im Europäischen Patent EP 0 533 838. Dabei wird wie folgt vorgegangen:

Eine Mischung aus Nukleinsäuren, d. h. potentiellen Aptameren, wird bereitgestellt, wobei eine jede Nukleinsäure aus einem Segment aus wenigstens acht aufeinanderfolgenden, randomisier- ten Nukleotiden besteht und diese Mischung mit dem Target, im vorliegenden Falle somit mit einem Translationsprodukt, insbesondere einem erfindungsgemäßen Translationsprodukt, dafür codierender/codierenden Nukleinsäure(n), Wechselwirkungspartnern des Translationsproduktes, insbesondere den natürlichen Wechselwirkungspartnern, und/oder für sie codierende(r) Nukleinsäure(n) in Kontakt gebracht wird, wobei Nukleinsäuren, die an das Target binden, ggf. auf der Grundlage einer erhöhten Affinität, verglichen mit der Affinität der Kandidatenmischung, vom Rest der Kandidatenmischung abgetrennt werden und die solchermaßen erhaltenen an das Target bindenden Nuklein- säuren amplifiziert werden. Diese Schritte werden mehrfach wiederholt, so dass am Ende des Verfahrens spezifisch an das jeweilige Target oder Zielmolekül bindende Nukleinsäuren, eben die sogenannten Aptamere, erhalten werden. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass diese Aptamere stabilisiert werden können, bspw. durch Einführung bestimmter chemischer Gruppen, die den Fachleuten auf dem Gebiet der Aptamer-Entwicklung bekannt sind. Aptamere werden derzeit bereits therapeutisch eingesetzt. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die solchermaßen hergestellten Aptamere für die Targetvalidierung und als Leitsubstanzen für die Entwicklung von Medikamenten, insbesondere von kleinen Molekülen, verwendet werden.

Auf einem grundsätzlich ähnlichen Prinzip beruht die Herstellung oder Erzeugung von Spie- gelmeren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf der Grundlage eines erfindungsgemäßen Translationsproduktes, der dafür codierenden Nukleinsäure(n), der Translationsprodukt- Wechselwirkungspartner, insbesondere der natürlichen Wechselwirkungspartner, und/oder der für sie codierenden Nukleinsäure(n) als Zielmolekül entwickelt werden können. Die Herstellung von Spiegelmeren ist bspw. beschrieben in der internationalen Patentanmeldung WO 98/08856. Spiegelmere sind L-Nukleinsäuren, d.h. bestehen aus L-Nukleotiden, und zeichnen sich im wesentlichen dadurch aus, dass sie in biologischen Systemen eine sehr hohe Stabilität aufweisen und gleichzeitig, vergleichbar den Aptameren, mit einem Zielmolekül spezifisch wechselwirken bzw. an dieses binden können. Bei der Herstellung der Spiegelmere wird dabei so vorgegangen, dass eine heterogene Population aus D-Nukleinsäuren erzeugt wird, die Population mit dem optischen Antipoden des Zielmoleküls in Kontakt gebracht wird, im vorliegenden Falle somit beispielsweise mit dem D- Enantiomer des natürlicher Weise auftretenden L-Enantiomers eines Translationsproduktes, sodann jene D-Nukleinsäuren abgetrennt werden, die nicht mit dem optischen Antipoden des Zielmoleküls in Wechselwirkung getreten sind, die D-Nukleinsäuren, die mit der optischen Antipode des Zielmoleküls in Wechselwirkung getreten sind, bestimmt, ggf. abgetrennt und sequenziert werden und anschließend L-Nukleinsäuren synthetisiert werden, die in ihrer Sequenz mit derjenigen zuvor für die D-Nukleinsäure(n) ermittelten Sequenz(en) identisch sind. Ähnlich dem Verfahren zur Herstellung von Aptameren ist es auch hier möglich, durch mehrfaches Wiederholen der Schritte geeignete Nukleinsäuren, d.h. Spiegelmere, anzureichern bzw. zu erzeugen, die das Translationsprodukt, einen oder mehrere seiner insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner, je nachdem, welche der vorstehend genannten Verbindungen als Zielmolekül eingesetzt wird, oder einer dafür codierenden Nukleinsäure binden.

Eine weitere Form der funktionalen Nukleinsäuren, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind sogenannte Aptazyme. Aptazyme sind beispielsweise beschrieben von Piganeau, N. et al. (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, Nr. 29, Seiten 4369-4373. Dabei handelt es sich um eine spezifische Form von Aptameren, die sich dadurch auszeichnen, dass sie neben dem Aptameranteil, der spezifisch an das Zielmolekül, im vorliegenden Falle ein erfindungsgemäßes Translationsprodukt oder einen Wechselwirkungspartner davon, bindet, noch einen Ribozymanteil enthalten kann mit der Folge, dass nach Bindung des Zielmoleküls des Aptameranteils des Aptazyms der Ribozymanteil aktiviert wird und es infolge dessen zu einer Spaltung einer als Substrat des Ribozymanteils des Aptazyms fungierenden Nukleinsäure kommt. Bei entsprechender Gestaltung des Ribozymsubstrates kann dabei beispielsweise eine Änderung der Fluoreszenz infolge einer Änderung der räumlichen Anordnung eines Fluoreszenzdonors relativ zu einem Fluoreszenzakzeptor auf dem Ribozym- substrat beobachtet werden. Aptazyme eignen sich insoweit insbesondere für die Anwendung im Rahmen einer Targetvalidierung betreffend ein Translationsprodukt und seiner Wechselwirkungspartner sowie als diagnostisches Mittel im Sinne der vorliegenden Erfindung. Gleichwohl ist auch eine therapeutische Anwendung in dem Umfang möglich, wie sie im Zusammenhang mit den hierin beschriebenen Ribozymen offenbart ist.

Den vorstehend genannten Verbindungsklassen ist dabei gemein, dass sie bevorzugt an das jeweilige Protein oder Polypeptid, d. h. das bzw. ein, bevorzugterweise ein erfindungsgemäßes, Translationsprodukt oder den Wechselwirkungspartner davon, binden oder gegen dieses erzeugt werden. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass diese Verbindungsklassen und insbesondere die funktionalen Nukleinsäuren als Targetmolekül die für die vorstehend genannten bevorzugterweise erfindungsgemäßen Proteine bzw. Polypeptide codierende(n) Nukleinsäure(n) bzw. die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als Targetmolekül zum Gegenstand haben.

Eine weitere Klasse von Verbindungen, die unter Verwendung eines Translationsproduktes, bevorzugterweise eines erfindungsgemäßen Translationsproduktes, und/oder eines Wechselwirkungspartners davon und insbesondere der für diese codierenden Nukleinsäure(n) bzw. einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hergestellt bzw. entwickelt werden können, sind Ribozyme, Antisense- Oligonukleotide und RNAi.

All diesen Klassen von Verbindungen ist dabei gemein, dass sie nicht auf der Ebene des Translationsproduktes, d.h. auf der Ebene der Proteine (Translationsprodukt und Wechselwirkungspartner davon) ihre Wirkung entfalten, sondern auf der Ebene der für das jeweilige Protein codierenden Nukleinsäure(n), insbesondere der für ein Translationsprodukt codierenden mRNA bzw. der mRNA, die für einen Wechselwirkungspartner des Translationsproduktes codiert. Grundsätzlich ist dabei auch die entsprechende genomische DNA oder die korrespondierende cDNA als Zielmolekül geeignet. Bei Ribozymen handelt es sich um katalytisch aktive Nukleinsäuren, die bevorzugterweise aus RNA aufgebaut sind und aus zwei Teilbereichen bestehen. Der erste Teilbereich ist für eine ka- talytische Aktivität verantwortlich, wohingegen der zweite Teil für eine spezifische Wechselwirkung mit einer Ziel-Nukleinsäure verantwortlich ist. Kommt es zur Ausbildung einer Wechselwirkung zwischen der Ziel-Nukleinsäure und dem zweiten Teil des Ribozyms, typischer Weise durch Hybridisierung von zueinander im wesentlichen komplementären Basenbereichen, kann der kataly- tische Teil des Ribozyms entweder intramolekular oder intermolekular, wobei letzteres bevorzugt ist, die Ziel-Nukleinsäure hydrolysieren für den Fall, dass die katalytische Wirkung des Ribozyms eine Phosphodiesterase-Aktivität ist. In der Folge kommt es zu einem - ggf. weiteren - Abbau der codierenden Nukleinsäure, wobei der Titer des Zielmoleküls sowohl auf der Nukleinsäure- als auch der Proteinebene sowohl intrazellulär als auch extrazellulär verringert werden kann und somit ein therapeutischer Ansatz für die Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren bereitgestellt wird. Ribozyme, deren Verwendung sowie Konstruktionsprinzipien sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und bspw. beschrieben in Doherty und Doudna (Ribozyme structures and mechanisms. Annu Rev Biophys Biomol Struct 2001;30:457-75) und Lewin und Hauswirth (Ribozyme gene therapy: applications for molecular medicine. Trends Mol Med 2001, 7:221-8).

Mit Blick auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Ribozym neben dem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst bzw. die Verwendung des erfindungsgemäßen Ribozyms als Medikament, und insbesondere zur Behandlung von Funktionsstörungen, Hypeφlasien und Tumoren der Schilddrüse, ist es auch möglich, dass das Ribozym so konstruiert wird, dass es spezifisch auf eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen einwirkt und somit auch hier die Expression bzw. Translation auf zellulärer Ebene kontrolliert, was insbesondere unter dem therapeutischen aber auch diagnostischen Aspekt von Bedeutung ist. Dabei kann aufgrund der Tatsache, dass Ribozyme sowohl intra- als auch intermolekulare katalytische Wirkungen zeigen, auch vorgesehen sein, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen dergestalt geändert werden, dass Bereiche ihrer selbst durch die Ribozymaktivität des geänderten Bereiches gespalten werden. Auch hierin eröffnet sich eine insbesondere therapeutische Möglichkeit, deren Ausgestaltung dem Fachmann im Lichte der nun vorhandenen Sequenzinformation möglich ist.

Ribozyme sind, ähnlich den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen selbst, besonders dann von Vorteil, aber nicht nur dann, wenn sie, beispielsweise mittels Gentherapie, in die Effektor- zelle eingebracht werden. Jedoch ist auch denkbar, dass entsprechende Modifikationen ex vivo vorgenommen werden und solchermaßen modifizierte Zellen dann zur Reimplantation, entweder allo- gen oder autogen, zur Verfügung stehen. Die Herstellung und Verwendung von Ribozymen ist in Ribozyme Protocols (Philip C. Turner, Ed., Humana Press, Totowa, NY, 1997) offenbart und wird hierin mit einbezogen. Dies gilt grundsätzlich für eine jede der hierin beschriebenen funktionalen Nukleinsäuren.

Auf einem grundsätzlich ähnlichen Wirkmechanismus beruht die Verwendung von Anti- sense-Oligonukleotiden zur Herstellung eines Medikamentes bzw. diagnostischen Mittels im Sinne der vorliegenden Erfindung. Antisense-Oligonukleotide hybridisieren infolge Basenkomplementari- tät typischer Weise mit einer Ziel-RNA, normaler Weise mit mRNA und aktivieren dadurch RNa- seH. RNaseH wird sowohl durch Phosphodiester als auch Phosphorothioat-gekoppelte DNA aktiviert. Phosphorodiester-gekoppelte DNA wird jedoch mit Ausnahme von Phosphorothioat- gekoppelter DNA schnell durch zelluläre Nukleasen abgebaut. Diese resistenten, nicht-natürlicher Weise auftretende DNA-Derivate inhibieren RNaseH nicht, wenn sie mit RNA hybridisiert sind. Mit anderen Worten, Antisense-Polynukleotide sind nur als DNA-RNA-Hybridkomplex wirksam. Beispiele für derartige Antisense-Oligonukleotide finden sich, u.a., in US-Patent US 5,849,902 oder US 5,989,912. Prinzipiell besteht das wesentliche Konzept der Antisense-Oligonukleotide darin, gegen bestimmte RNA eine komplementäre Nukleinsäure bereitzustellen. Mit anderen Worten, ausgehend von der Kenntnis der Nukleinsäuresequenz eines Translationsproduktes bzw. seines oder seiner Wechselwirkungspartner(s), insbesondere der jeweiligen mRNA, können durch Basenkomplementa- rität geeignete Antisense-Oligonukleotide hergestellt werden, die zu einem Abbau von Nukleinsäure, bevorzugterweise codierender Nukleinsäure wie hnRNA oder mRNA, führen. Dieser Abbau kann sodann in einem Expressions- oder Aktivitätssystem qualitativ oder quantitativ erfasst werden.

Eine weitere Klasse von Verbindungen, die als Medikament bzw. diagnostisches Mittel im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet, identifiziert oder hergestellt werden kann, ist die sogenannte RNAi. RNAi ist eine doppelsträngige RNA, die RNA-Interferenz vermittelt und typischerweise eine Länge von etwa 21 bis 23 Nukleotiden aufweist. Dabei entspricht einer der beiden Stränge der RNA einer Sequenz eines bzw. des abzubauenden Gens bzw. der dazu korrespondierenden mRNA. Mit anderen Worten, ausgehend von der Kenntnis der für ein Translationsprodukt und/oder dessen Wechselwirkungspartner codierenden Nukleinsäure(n), insbesondere der mRNA, kann eine doppelsträngige RNA hergestellt werden, wobei einer der beiden RNA-Stränge im Wesentlichen komplementär zu der besagten, für das Translationsprodukt und/oder dessen Wechselwirkungspartner codierenden Nukleinsäure(n) ist, bevorzugterweise zur mRNA, und diese dann zum Abbau der entsprechenden codierenden Nukleinsäure führt und damit einhergehend zu einer Verringerung des Titers der jeweiligen Translationsprodukte, d. h. der Proteine. Die Erzeugung und Ver- wendung von RNAi als Medikament bzw. diagnostisches Mittel ist den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und bspw. beschrieben in den internationalen Patentanmeldungen WO 00/44895 und WO 01/75164.

Mit Blick auf die Wirkmechanismen der vorstehend beschriebenen Klassen von Verbindungen, nämlich Ribozymen, Antisense-Oligonukleotiden sowie RNAi, ist es somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung, neben dem erfindungsgemäßen Translationsprodukt, d. h. dem jeweiligen Polypeptid bzw. Protein, und dessen insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner(n) auch die jeweils dafür codierende(n) Nukleinsäure(n), insbesondere die entsprechende mRNA, cDNA oder genomische DNA, zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren bzw. für die Herstellung eines diagnostischen Mittels für die Diagnose der vorstehend genannten Erkrankungen bzw. Funktionsstörungen und für das Überwachen des Verlaufes der Erkrankung bzw. der angesetzten Therapie, entweder direkt oder als Zielmolekül, entweder vollständig oder teilweise zu verwenden.

Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Translationsproduktes, der dafür codierenden Nukleinsäure, des oder der Translationsprodukt- Wechselwirkungspartner(s), insbesondere des/der natürlichen Wechselwirkungspartner(s), und/oder der für diese codierende(n) Nukleinsäure(n) als Zielmolekül für die Herstellung bzw. Entwicklung eines Medikaments für die Behandlung oder Therapie von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren, ebenso wie bei der Herstellung und/oder der Entwicklung von Mitteln für die Diagnose derselben, können auch Bibliotheken kleiner Moleküle verwendet werden. Auch dabei wird das Zielmolekül mit einer Bibliothek in Kontakt gebracht und jene Mitglieder der Bibliothek, die daran binden, ermittelt, ggf. von den anderen Mitgliedern der Bibliothek bzw. vom Zielmolekül abgetrennt und optional weiter charakterisiert. Auch hier wird die Charakterisierung des kleinen Moleküls nach den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannten Verfahrensweisen erfolgen, so z. B. die Verbindung identifiziert und die Molekularstruktur bestimmt werden. Die Bibliotheken umfassen dabei so wenig wie zwei und soviel wie bis zu mehrere hunderttausend Mitglieder.

Im Zusammenhang mit den verschiedenen hierin offenbarten Klassen von Verbindungen, die als therapeutisches Mittel oder diagnostisches Mittel erfindungsgemäß verwendet werden können, ist dabei ein Aspekt der, dass bestimmte Klassen direkt mit einem Translationsprodukt oder seinem Wechselwirkungspartner in Wechselwirkung treten bzw. an dieses binden. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die besagten Verbindungen der verschiedenen Klassen, insbesondere wenn es sich dabei um Peptide, Antiköφer, Anticaline, Aptamere, Aptazyme und Spiegelmere handelt, den Wechselwirkungspartner des Translationsproduktes durch eine mehr oder weniger spezifische Wechselwirkung für das Translationsprodukt blockieren. Insoweit ist der Begriff der Verwendung von einem Translationsprodukt hierin auch dahingehend zu verstehen, dass er die Verwendung eines oder mehrerer des/der Translationsprodukt- Wechselwirkungspartner(s), wie bspw. Rezeptoren und Transkriptions- und Translationsfaktoren, umfasst. Die hierin beschriebenen Verfahren sind dann insoweit zu modifizieren, als dass anstelle des Translationsprodukt-Proteins bzw. der für sie codierenden Nukleinsäure, ein Wechselwirkungspartner davon in den verschiedenen Selektionsverfahren, Assays, Screening- Verfahren oder Herstellungsverfahren eingesetzt wird.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Wechselwirkungspartnern von einem Translationsprodukt, insbesondere von einem erfindungsgemäßen Translationsprodukt, insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartnern, solche Moleküle und Strukturen verstanden, mit denen das besagte Translationsprodukt in Wechselwirkung tritt. Dabei sind insbesondere jene Moleküle und Strukturen umfasst, mit denen das Protein in einem biologischen System unter normalen und/oder auch unter pathologischen Bedingungen in Wechselwirkung tritt. Ein geeigneter Wechselwirkungspartner von DRIP ist beispielsweise DR5 (engl. death receptor 5), wie er beispielsweise beschrieben ist in Hymowitz SG, Christinger HW, Fuh G, Ultsch M, O'Connell M, Kelley RF, Ashkenazi A, de VosAM., OMIM, Protein, Structure Triggering cell death: the crystal structure of Apo2L/TRAIL in a complex with death receptor 5.Mol Cell. 1999 Oct;4(4):563-71. Ashkenazi A, Dixit VM. Related Articles, Nucleotide, Protein Apoptosis control by death and decoy receptors.Curr Opin Cell Biol. 1999 Aρr;l l(2):255-60. Review, oder Mitsiades N, Poulaki V, Mitsiades CS, Koutras DA, Chrousos GP.Related Articles, Apoptosis induced by FasL and TRAIL/Apo2L in the pathogenesis of thyroid diseases. Trends Endocrinol Metab. 2001 Nov;12(9):384-90. Review.

Hinsichtlich der Gestaltung des erfindungsgemäßen Kits zur Diagnose und/oder Therapie von Funktionsstörungen, Hypeφlasie und Tumoren der Schilddrüse, d. h. allgemein den hierin beschriebenen Erkrankungen, ist anzumerken, dass die genaue Gestaltung eines derartigen Kits, d. h. welche Komponente(n) explizit darin aufgenommen wird bzw. werden, dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, und insbesondere möglich ist im Lichte der oben gemachten Ausführungen hinsichtlich der Wirkung bzw. Verwendbarkeit der hierin offenbarten erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und deren Translationsprodukt. Der erfindungsgemäße Kit wird in jedem Fall mindestens eines der erfmdungsgemäßen Elemente umfassen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die die erfindungsgemäße(n) Nukleinsäure(n), den Vektor, das Polypeptid, die Zelle, den Antiköφer, das Ribozym sowie mindestens eine der verschiedenen Verbindungen der verschiedenen Klassen, wie sie hierin charakterisiert wurden, insbesondere der Antiköφer, Peptide, Proteine, Anticaline, kleine Moleküle, Aptamere, Spiegelmere, Ribozyme, Aptazyme, Antisense-Oligonukleotide sowie RNAi, spezifisch für die erfmdungsgemäßen Nukleinsäuren oder erfindungsgemäßen Translationsprodukte sowie die Wechselwirkungspartner davon, insbesondere die natürlichen Wechselwirkungspartner, sowie der jeweils dafür codierenden Nukleinsäuren, jeweils bevorzugterweise in ihrer erfindungsgemäßen Ausprägung, umfasst. Weitere Elemente des erfindungsgemäßen Kits, die einzeln oder in Kombination in dem erfindungsgemäßen Kit enthalten sein können, sind aus der Gruppe ausgewählt, die Puffer, Negativ-Kontrollen, Positiv-Kontrollen und Benutzungsanweisungen umfasst. Typischer Weise sind die einzelnen Verbindungen bzw. Bestandteile in trockener oder flüssiger Form, bevorzugterweise für den einzelnen Anwendungsfall portioniert, in dem Kit enthalten. Der Kit kann dabei bevorzugterweise verwendet werden zur Bestimmung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren. Hinsichtlich der Verwendung der erfindungsgemäßen Zellen ist insbesondere deren Verwendung als Reimplantat bzw. als Positiv- und/oder Negativkontrolle in entsprechenden diagnostischen bzw. therapeutischen Ansätzen im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Funktionsstörungen und Hypeφlasien und/oder Tumoren der Schilddrüse, auch i. S. von Karzinomen und Strumen, ist es möglich, dass das Schilddrüsenmaterial in situ, ex vivo, in vivo oder in vitro vorliegt. Der Begriff „Schilddrüsenmaterial", wie hierin verwendet, bezeichnet insbesondere Material, bevorzugterweise zelluläres Material der Schilddrüse in deren normalem und/oder pathogenen Zustand. Der Begriff des Schilddrüsenmaterials umfasst damit auch Material von Schilddrüsen mit einer Funktionsstörung, von Hypeφlasien der Schilddrüse, von Tumoren der Schilddrüse, einschließlich Karzinomen und Strumen. Die Bestimmung, ob eine Funktionsstörung, Hypeφlasie und/oder Tumor vorliegt, erfolgt letzten Endes durch Vergleich der Wirkung des eingesetzten erfindungsgemäßen Agens bzw. Agenzien auf das zu untersuchende Schilddrüsenmaterial mit dessen/deren Wirkung auf „normales" Schilddrüsengewebe. Weitere Ausgestaltungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich für den Fachmann auf der Grundlage der hierin enthaltenen Offenbarung.

Die oben gemachten Ausführungen hinsichtlich der verschiedenen Ausführungsformen sowie den damit realisierbaren Vorteilen gelten sinngemäß auch für die erfindungsgemäßen Medikamente, und insbesondere für solche Mittel zur Diagnose und/oder Therapie und/oder Prävention von Funktionsstörungen, Hypeφlasien und/oder Tumoren der Schilddrüse in Form der erfmdungsgemäßen Sequenz(en), bzw. deren Verwendung, in Form des erfindungsgemäßen Vektors, bzw. dessen Verwendung, in Form des erfmdungsgemäßen Polypeptids, bzw. dessen Verwendung, in Form der erfindungsgemäßen Zelle, bzw. deren Verwendung, in Form des Ribozyms, bzw. dessen Verwen- düng, die hierin offenbart werden. Gleiches gilt auch für die erfindungsgemäß hergestellten bzw. selektierten Verbindungen aus der Gruppe, die bindende Peptide, Anticaline und funktionale Nukleinsäuren umfassen, wobei diesen Verbindungen gemeinsam ist, dass sie gegen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder den davon codierten Polypeptiden oder deren Wechselwir- kungspartner(n) oder den dafür codierenden Nukleinsäuren gerichtet sind, d. h. gegen diese als Zielmolekül hergestellt oder selektiert werden. Die entsprechenden Medikamente können einen Gehalt an einem oder mehreren der vorgenannten Agenzien oder Verbindungen aufweisen.

Gleiches gilt auch für die erfmdungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen. Dabei ist es möglich, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung neben dem optionalen pharmazeutisch akzeptablen Träger nur eine der aufgeführten Verbindungen umfasst. Alternativ ist es auch im Rahmen der Erfindung, dass die pharmazeutische Zusammensetzung mehrere der genannten Verbindungen neben dem pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.

Unter pharmazeutisch akzeptablem Träger sollen hierin alle dem Fachmann bekannten Träger verstanden werden, die typischerweise in Abhängigkeit von der Applikationsform ausgewählt werden. Ein pharmazeutisch akzeptabler Träger kann, unter anderem, Wasser, Pufferlösungen, alkoholische Lösungen und dergleichen sein.

Hinsichtlich des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Primern, sei daraufhingewiesen, dass es sich dabei um solche handelt, die eine spezifische Darstellung der erfmdungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, bzw. Teilen davon, erlauben.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Darstellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz können, aus welcher Quelle auch immer, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bzw. diesen entsprechende Sequenzen oder deren komplementäre Sequenzen unter Verwendung von erfindungsgemäßen Primern als Primer für eine Polymerasekettenreaktion, in all ihren verschiedenen Ausführungen, verwendet werden. Das Design geeigneter Primer sowie die Durchführung von Polymerase-Kettenreaktionen ist beispielsweise in PCR & PCR 2: A practical approach (M. J. McPherson, P. Quirke und G. R. Taylor, Eds., IRL Press, Oxford, England 1991, & M. J. McPher- son und B. D. Harnes, Eds., IRL Press, Oxford, England 1995) offenbart und wird hierin mit einbezogen.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, einschließlich erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, umfassen insbesondere das hierin offenbarte DRIP-Gen, das hierin auch als DRIP in speziellen Ausprägungsformen des erfindungsgemäßen DRIP bezeichnet wird und die für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine codierende Nukleinsäuren. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuresequenzen sind insbesondere auch die nachfolgend angeführten Nukleinsäuren, die die mit „SEQ. ID. No." hierin bezeichneten Nukleinsäuresequenzen umfassen, solche Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuresequenzen, die die nachfolgend mit „SEQ. ID. No." bezeichneten Nukleinsäuresequenzen teilweise oder vollständig umfassen und weitergehende Nukleotide, insbesondere am 5'- und/oder 3 '-Ende umfassen, solche Nukleinsäuren, die in Ergänzung zu den mit „SEQ. ID. No." hierin bezeichneten Sequenzen weitere Nukleotide enthalten, im Falle des erfindungsgemäßen DRIP-Sequenz bzw. -Gens ergänzt durch weitere Nukleotide aus dem BAC RP11 339H12 bzw. RP11 204D19. Die relative Anordnung der vorstehend genannten Klone ist in Fig. 12 dargestellt.

Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass Teile oder Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als solche als erfindungsgemäße Nukleinsäuren bezeichnet und/oder verwendet werden. Dies gilt insbesondere bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Herstellung bzw. Generierung von Medikamenten auf der Grundlage von RNAi, auch als siRNA bezeichnet, Ribozymen, Aptazymen und anti-sense-Molekülen. Dies liegt im Konstruktionsprinzip der vorstehenden Verbindungsklassen begründet, die im wesentlichen identisch oder komplementär zu der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen, sind. Die Länge des zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren im wesentlichen identischen oder komplementären Bereichs beträgt bevorzugterweise 15 bis 49, bevorzugtererweise 15 bis 31 und am bevorzugtesten 21 bis 23 Nukleotide. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren sind damit auch jene Teile oder Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere auch der im Sequenzprotokoll enthaltenen bzw. angegebenen Sequenzen, die 15 bis 49, bevorzugterweise 15 bis 30 und am bevorzugtesten 21 bis 23 Nukleotide umfassen. Der Startpunkt für eine derartige Sequenz bzw. ein derartiges Nukleinsäuremolekül kann dabei an einer beliebigen Stelle der jeweiligen Nukleinsäure bzw. Nukleinsäuresequenz liegen, bevorzugterweise an einem Punkt, an dem die Anzahl der Nukleotide, die bis zum Ende der Sequenz noch vorhanden sind, ausreicht, um die für den erwünschten Längenbereich erforderlichen Nukleotide bereitzustellen.

Wie hierin verwendet, bezeichnet ein Größenordnungsbereich von X bis Y alle Längen X, Y und alle ganzzahligen Längen dazwischen. So umfasst beispielsweise der Längenbereich 21 bis 23 Nukleotide die Längen von 21, 22 und 23 Nukleotiden.

Weiterhin sind erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch die hierin offenbarten Primer und insbesondere die sonstigen Fragmente, die hinsichtlich ihrer Sequenz hierin individualisiert oder individualisierbar sind. Weiterhin umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren solche Nukleinsäuren, die für ein Polypeptid codieren, wobei das Polypeptid eine Sequenz aufweist bzw. umfasst, wie sie hierin mit einer oder mehreren der „SEQ. ID. No." , insbesondere SEQ.ID. No 2, 10, 17 und/oder 5 bis 8 bezeichnet werden. Schließlich sind erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch jene, die ein oder mehrere Exons und/oder ein oder mehrere der Introns einer oder mehrerer der hierin offenbarten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfassen, insbesondere der mit den SEQ. ID. Nos. 1 und 3 und 4 und 9 und 11 bis 16 bezeichneten Nukleinsäuren.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide, die hierin auch kurz als Polypeptide bezeichnet werden, sind insbesondere Translationsprodukte eines oder mehrer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Fragmente davon. Dabei können die Translationsprodukte vollständig oder verkürzt vorliegen. Diese Translationsprodukte werden hierin entweder allgemein als Translationsprodukt, unabhängig von der Anzahl, oder als erfindungsgemäßes Translationsprodukt bezeichnet. Erfindungsgemäße Translationsprodukte oder Polypeptide im Sinne der vorliegenden Erfindung sind insbesondere jene Teile der entsprechenden Polypeptide, die Teil einer Domänenstruktur sind, insbesondere einer solchen Domäne, die in einem zellulären System extrazellulär vorhanden ist. Dies gilt auch für die Fusionsproteine, die ebenfalls wie vorstehend beschrieben vollständig oder verkürzt erfindungsgemäß verwendet werden können.

Die für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere für das erfindungsgemäße DRIP, welche im Stand der Technik als solche fragmentarisch bereits beschrieben sind können auch durch die folgenden Nukleinsäuresequenzen gekennzeichnet bzw. dargestellt werden: Die genomische Sequenz aus 2p21-22, beginnend auf dem BAC RP11 339H12-(AC010883), fortlaufend über BAC RP11 183F15 (AC092838) bzw. BAC RP11 1069E24, endet mit dem letzten bp von BAC Rpl l 204D19 (AC92615). Die Sequenzen sind mit den Zugangsnummern (Accession numbers der GenBank Datenbank) AC010883 (RP11 339H12), AC092838 (RP11 183F15), AC92615 (Rpl l 204D19) veröffentlicht. Die Länge dieser genomischen Sequenz beträgt 506295 Basenpaare

Die hierin offenbarten Sequenzen umfassen insbesondere humane Sequenzen, dabei zeigt : SEQ. ID. No. 1 mRNA der DRIP-FUS Ib-Splicevariante mRNA,

SEQ. ID. No. 2 die DRIP-FUS Ib-Splicevariante, die codierende Sequenz (CDS) und somit die Aminosäuresequenz des ersten Fusionsproteins, wobei dessen DRIP- Anteil die Exons 1 bis 28 umfasst, SEQ. ID. No. 3 den genomischen Sequenzbereich, in dem die FUS I Komponente auf Chromosom 3 liegt, SEQ. ID. No. 4 den genomischen Sequenzbereich, in dem die FUS II Komponente auf Chromosom 7 liegt,

SEQ. ID. No. 5 die codierende Sequenz (CDS) von DRIP und somit die Aminosäuresequenz, wobei DRIP die Exons 1 bis 38 umfasst,

SEQ. ID. No. 6 die codierende Sequenz (CDS) und somit die Aminosäuresequenz des ersten

Fusionsproteins, FUS. I, wobei dessen DRIP-Anteil die Exons 1 bis 28 umfasst,

SEQ. ID. No. 7 die codierende Sequenz (CDS) und somit die Aminosäuresequenz der Splicevariante des ersten Fusionsproteins (FUS la), wobei dessen DRIP-Anteil die Exons 1 bis 28 umfasst,

SEQ. ID. No. 8 die codierende Sequenz (CDS) und somit die Aminosäuresequenz des zweiten

Fusionsproteins (FUS II), wobei dessen DRIP-Anteil die Exons 1 bis 28 umfasst,

SEQ. ID. No. 9 die Splicevariante mRNA des DRIP-FUS Ila-Fusionsgens aus Schilddrüsentumor,

SEQ. ID. NO. 10 die Aminosäuresequenz der Splicevariante des DRIP-FUS Ha - Proteins,

Für die SEQ. ID. Nos 1 bis 2 sowie 6 bis 10 bezeichnet DRIP den Teil von DRIP, der die E- xons 1 bis 28 umfasst und SEQ. ID. No. 5 denjenigen Teil, der die Exons 1 - 38 umfasst. Weiterhin zeigt hierin

SEQ. ID. NO. 11 die DRIP-mRNA-Sequenz umfassend die Exons 1 bis 38,

SEQ. ID. No. 12 die genomische Sequenz von DRIP umfassend die Exons 1 bis 38,

SEQ. ID. No. 13 die mRNA-Sequenz des DRIP-FUS I- Gens, wobei dieses die Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens sowie die Exons I, la und II von FUS I aus der Chromosom 3p25 Region umfasst,

SEQ. ID. No. 14 die mRNA-Sequenz einer Splice-Variante des DRIP-FUS I-Gens, wobei dieses die Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens sowie das Exon II von FUS I aus der Chromosom 3p25 Region umfasst,

SEQ. ID. No. 15 die mRNA-Sequenz des DRIP-FUS II- Gens, wobei diese die Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens sowie Exon A von FUS II aus der Chromosom 7p 15 Region umfasst,

SEQ. ID. No. 16 die mRNA-Sequenz der DRIP Splicevariante; wobei dieses die Exons 1 bis 26 und 29 bis 38 des DRIP-Gens umfasst, SEQ. ID. No. 17 die codierende Sequenz (CDS) der DRIP Splicevariante und somit die Aminosäuresequenz, wobei DRIP die Exons 1 bis 26 und 29 bis 38 umfasst. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass jegliche hierin für eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Polypeptide, Proteine, Nukleinsäuren bzw. der davon, wie hierin offenbart, abgeleiteten Verbindungen, insbesondere auch einer im Rahmen eines Screeningverfahrens, das diese einzeln, in Kombination oder als Fragment(e) verwendet, erhaltenen Verbindung, wie kleine Moleküle, bindende Peptide, Antiköφer, Anticaline und funktionale Nukleinsäuren, offenbarte Verwendung grundsätzlich auch für die jeweils anderen vorstehend genannten Moleküle oder Verbindungen hiermit offenbart ist.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Figuren, Beispiele sowie des Sequenzprotokolls erläutert, woraus sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei zeigt: Fig. 1: eine schematische Darstellung der genomischen Lage des Bruchpunktbereichs auf

Chromosom 7p 15 ; Fig. 2: eine schematische Darstellung der genomischen Lage des Bruchpunktbereichs auf

Chromosom 3p25; Fig. 3: eine schematische Darstellung der genomischen Lage des Bruchpunktbereiches auf der(2) bei der Zelllinie S325T/SV40, die das Fusionstranskript DRIP-FUS I aufweist; Fig. 4: eine schematische Darstellung der genomischen Lage des Bruchpunktbereiches auf der(2) bei der Zelllinie S533T/SV40, die das Fusionstranskript DRIP-FUS II aufweist; Fig. 5: ein Karyogramm des Primärtumors S 533, der eine Translokation t(2;7)(p21;pl5) aufweist; Fig. 6: ein Karyogramm der aus der Primärkultur S 533 hergestellen Zellllinie S 533 T/SV

40; Fig. 7 a: eine Metaphase der Zellinie S325T/SV40 mit einer t(2;3;20)(p21 ;ql 1.2;p25) nach G-

Banding; Fig. 7 b: eine Metaphase der Zellinie S325T/SV40 mit einer t(2;3;20)(p21;ql l.2;p25) nach

FISH mit BAC 1069E24, wobei die Hybridisierungssignale auf Chromosom 2, der(2) und der(20) lokalisiert sind, die mit Pfeilen markiert sind; Fig. 8: das Ergebnis des Nachweises des Bruchpunktes in der Zellinie S 533/TSV40, der zum Fusionstranskript DRIP-FUS II führt; Fig. 9 Karyogramm und FISH-Ergebnisse der Zellinie S 325/TSV40; Fig. 10 Nachweis des ersten und des zweiten Fusionsproteins mittels RT-PCR;

Fig. 11 das Ergebnis einer Northern-Blot- Analyse unter Verwendung einer DRIP- spezifischen Sonde;

Fig. 12 schematisch die genomische Lage von DRIP relativ zum Bruchpunkcluster bei verschiedenen benignen Schilddrüsentumoren und Hypeφlasien mit 2p21- Veränderungen, wobei der Translokationsbruch bei den Zellinien S 325/TSV 40 und* S 533/TSV 40 in Intron 28 lokalisiert ist;

Fig. 13 schematisch eine Darstellung der DRIP-mRNA mit seiner Splicevariante;

Fig. 14 eine schematische Darstellung der drei Formen des Fusionstranskriptes DRIP-FUS I; und

Fig. 15 eine schematische Darstellung der zwei Formen des zweiten Fusionsgens DRIP-FUS

II. In Ergänzung zu den im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen wird unter Bezugnahme darauf folgendes offenbart.

SEQ. ID. No. 1

SEQ. ID. No. 1 stellt das Fusionsgen DRIP-FUS Ib (Splicevariante); nachgewiesen in der Zelllinie S325T/SV40 mit einer t(2;20;3)(p21;ql 1.2;p25) dar.

Folgende Positionen der mRNA Sequenzpositionen entsprechen den beschriebenen Exons: Position auf der mRNA Seq. Exon Nr. (Anzahl der bp) 1..108 ExonOl 108 109..208 Exon02 100 209..303 Exon03 95 304..434 Exon04 131 435..583 Exon05 149 584..616 ExonOό 33 617..665 Exon07 49 666..853 Exon08 188 854..948 Exon09 95 949..1169 Exon10 221 1170..1861 Exon11 692 1862..2040 Exon12 179 2041..2196 Exon13 156 2197..2319 Exon 14 123

2320..2443 Exon 15 124

2444..2595 Exon 16 152

2596..2806 Exon 17 211

2807..2942 Exon 18 136

2943..3079 Exon 19 137

3080..3238 Exon20 159

3239..3396 Exon21 158

3397..3506 Exon22 110

3507..3639 Exon23 133

3640..3753 Exon24 114

3754..3876 Exon25 123

3877..3968 Exon26 92

3969..4058 Exon27 90

4059..4190 Exon28 132

4191..4308 DRIP-FUS I; Exon I 118

4309..4473 DRIP-FUS I; Exon la 165

4474..4731 DRIP-FUS I; Exon II 258

SEQ. ID. No. 3

SEQ. ID. No. 3 stellt die genomische Sequenz von Chromosom 3p25 dar, wie sie neben der DRIP-Sequenz in der Nukleinsäure gemäß SEQ. ID. No. 13 und 14 enthalten ist. Die genomische Sequenz umfasst in diesem Falle sowohl Exon I als auch Exon II von Chromosom 3p25, wobei E- xon I die Nukleotidpositionen 81174 bis 81291 und Exon II die Nukleotidpositionen 85616 bis 85873 der SEQ ID No 3 einnnimmt. Die genomische Struktur wurde dem BAC-Klon RP 11 - 167M22 entnommen.

SEQ. ID. No. 4

SEQ. ID. No. 4 stellt den genomischen Sequenzbereich von FUS II Exon A und AI von #7pl5 dar, wie es Teil des zweiten Fusionsgens ist. Die genomische Sequenz wurde aus dem BAC- Klon RP 111-370L16 erhalten. Das Exon A entspricht den Positionen 7686 bis 8949 der genomischen Sequenz gemäß SEQ ID No 4. SEQ. ID. No. 5

SEQ. ID. No. 5 stellt die codierende Sequenz (CDS) von DRIP und somit das entsprechende Peptid dar, wobei DRIP die Exons 1 bis 38 umfasst. Es umfasst insgesamt 1953 Aminosäuren.

SEQ. ID. No. 6

SEQ. ID. No. 6 stellt die codierende Sequenz (eds) und somit die Aminosäuresequenz des ersten Fusionsproteins DRIP-FUS I dar, wobei dessen DRIP-Anteil die Exons 1 bis 28 umfasst. Es umfasst insgesamt 1387 Aminosäuren.

SEQ. ID. No. 7

SEQ. ID. No. 7 stellt die codierende Sequenz (CDS) und somit die Aminosäuresequenz der Splicevariante des ersten Fusionsproteins dar, wobei dessen DRIP-Anteil die Exons 1 bis 28 umfasst. Es umfasst insgesamt 1353 Aminosäuren.

SEQ. ID. No. 8

SEQ. ID. No. 8 stellt die codierende Sequenz (CDS) und somit die Aminosäuresequenz des zweiten Fusionsproteins dar, wobei dessen DRIP-Anteil die Exons 1 bis 28 umfasst. Es umfasst insgesamt 1353 Aminosäuren.

SEQ. ID. No. 9

SEQ. ID. No. 9 stellt die Fusionsgen DRIP-FUS Ha (Splicevariante) dar; nachgewiesen in der Zelllinie S533T/SV40 mit einer t(2;7)(p21;pl5). Die Sequenzlänge beträgt 5580 bp. Die Exons (hier Features) sind wie folgt Lokalisiert: Merkmale

Anordnung Exon-Nr. Bas exon 1..108 ExonOl 108 exon 109..208 Exon02 100 exon 209..303 Exon03 95 exon 304..434 Exon04 131 exon 435..583 Exon05 149 exon 584..616 Exon06 33 exon 617..665 Exon07 49 exon 666..853 Exon08 188 exon 854..948 Exon09 95 exon 949..1169 ExonlO 221 exon 1170..1861 Exon 11 692 exon 1862..2040 Exon 12 179 exon 2041-2196 Exon 13 156 exon 2197..2319 Exon 14 123 exon 2320..2443 Exon 15 124 exon 2444-2595 Exon 16 152 exon 2596-2806 Exon 17 211 exon 2807-2942 Exon 18 136 exon 2943-3079 Exon 19 137 exon 3080-3238 Exon20 159 exon 3239-3396 Exon21 158 exon 3397-3506 Exon22 110 exon 3507-3639 Exon23 133 exon 3640..3753 Exon24 114 exon 3754-3876 Exon25 123 exon 3877-3968 Exon26 92 exon 3969-4058 Exon27 90 exon 4059-4190 Exon28 132 exon 4191-4316 Chr. 7pl5_ _DRIP-FUS II_Exon Al ^" exon 4317-5580 Chr. 7p 15_. _DRIP-FUS II_ExonA

SEQ. ID. No. 10

SEQ. ID. No. 10 stellt die codierende Sequenz (CDS) und somit die Aminosäuresequenz der Splicevariante des zweiten Fusionsproteins DRIP-FUS Ila dar, wobei dessen DRIP-Anteil die Exons 1 bis 28 umfasst. Es umfasst insgesamt 1366 Aminosäuren.

SEQ. ID. No. i l

SEQ ID No 11 stellt die mRNA von DRIP umfassend die Exons 1 bis 38 dar. Die Länge der mRNA beträgt 6090 bp. Der offene Leserahmen (ORF) beginnt mit Position 133 und endet mit Position 5994. Zum Nachweis der mRNA können die folgenden Primer verwendet werden, die an verschiedene Stellen der mRNA hybridisieren. Primer Name Sequenz

DRIPVRU1 5 ' ATGGGAGAACCAAATCGTCATCCAAGCATG 3 ' DRIP VRL2 5 ' TCAACATGCCGCTTCTGTTCTTGGAAGAGTTAA 3 ' DRIPVRU3 5 ' TTTCCGGCAAAACCACATTCATGGGACACT 3 ' DRIP VRL4 5 ' TACTGGGGCAGGCCTGGCACCTTGAAG 3 ' DRIPVRU5 5' TGGCCGTCGTTGAAGTCCTCACCAGT 3' DRIPVRL6 5' GCCAGCCGGACTTTGAGAGGAGACAGAAG 3' DRIPVRU9 5' GCTTCAGGCAGCAGCAGCATTTCCA 3' DRIPVRL10 5' ATTGGGATGAGGCCTTCAGGGGATGA 3' DRIPVRL10 5' ATTGGGATGAGGCCTTCAGGGGATGA 3' DRIPVUl 1 5' CCTGCCCCAGTACCTCCAGAGCCTCAC 3' DRIPVL12 5' GAACTCCTTTGGGGTCAGATGGACACAGTG 3* DRIPVU13 5' ACTGCATGGACCCTGGTGAGTGGCT 3' DRIPVL14 5' GCATGTGGTGGGAAATGACTTTGGAAG 3' DRIPVUl 5 5' CTCAGCACAAGCACCAAACCATACGACTGT 3' DRIPVU16 5' AGAGTAAATCCAAACGTGAACCAGAGAATGAGT 3' DRIPVRU17 5' GCCTGGGAGAAAATATTATTCCTTATGTTG 3* DRIPVUl 8 5" GTCTGGGCAGTGCGAAATTCATCCAC 3* DRIPVU19 5' AGACTCTACGCTTCCCCGATGGATGGT 3' DRIPL20 5' CAGGCGCGTATCTCTGAACAATGCTCTAAG 3' DRIPVL21 5' GAAGGGTGCTGTTTGGTTAACTCATTCTC 3' DRIPVU22 5* GCGAATAGCTAGAGCTCATGGACATCT 3 ' DRIPVU23 5' ATTTTTACCAAGGTTTTAAGCGATGATGA 3' DRIPVL24 5' AGTGAGCCGGTGCATTTGGAGAAG 3' DRIPVU25 5' CTCAGACGCCGACGTGCACGAGTGACTA 3' DRIPVL26 5' ACGAGAAGTAAAACGGTGCATAGCCTCAGGT 3' DRIPVU27 5' GGATATCTTAGCAGGCATTTATCTTTCTTTGAGTCT 3 ' DRIPVL28 5' ATATTTTGCCATATGGGAGAATCGGAAGTC 3 ' FOSTSWI14187 5' ATTTATGTTCAACATGTTTCCTGC 3' RVSTSWI14187 5' TGCAGAATCGAGGCAGTTAA 3' SEQ. ID. No. 12

Die SEQ. ID. No. 12 stellt die genomische Sequnz des DRIP - Gens auf Chromosom 2p21- 22 dar.

Die Länge der genomischen DNA von DRIP, das die Exons 1 bis 38 umfasst, beträgt 365186 bp. Folgende Exonpositionen können in genomischen DNA angegeben werden:

Position in der genom. DNA Seq Exon Nr. Anzahl Basen des Exons

1..108 ExonOl 08

3623-3722 Exon02 100

3993..4087 Exon03 95

5085..5215 Exon04 131

9037..9185 Exon05 149

9305..9337 Exon06 33

9590..9638 Exon07 49

14110-14297 Exon08 188

17431..17525 Exon09 95

18796..19016 Exon 10 221

21011..21702 Exonl 1 692

23046..23224 Exon 12 179

24176..24331 Exon 13 156

25528..25650 Exon 14 123

29217-29340 Exonl 5 124

35653-35804 Exonl 6 152

39483-39693 Exon 17 211

43699-43834 Exon 18 136

44113..44249 Exon 19 137

46670..46828 Exon20 159

54722-54879 Exon21 158

66890..68159 Exon22 1270

68050..68159 Exon22 110

87258..87390 Exon23 133

90303..90416 Exon24 114

97083-97205 Exon25 123 110713..110804 Exon26 92 165736..165825 Exon27 90 167807..167938 Exon28 132 197899..198067 Exon29 169 251801..251916 Exon30 116 275498.275592 Exon31 95 302825.303204 Exon32 380 303816.303934 Exon33 119 304270.304342 Exon34 73 308977.309130 Exon35 154 316142.316273 Exon36 132 363156.363325 Exon37 170 364695.365186 Exon38 492

Zum Nachweis der DNA können die folgenden Primer verwendet werden, die an verschiedene Stellen der DNA hybridisieren. Primer Name Sequenz

DRIPVRU1 5 ' ATGGGAGAACCAAATCGTCATCCAAGCATG 3 ' DRIPVRL2 5 ' TCAACATGCCGCTTCTGTTCTTGGAAGAGTTAA 3 ' DRIP VRU3 5 ' TTTCCGGCAAAACCACATTCATGGGACACT 3 ' DRIPVRL4 5' TACTGGGGCAGGCCTGGCACCTTGAAG 3' DRIPVRU5 5' TGGCCGTCGTTGAAGTCCTCACCAGT 3' DRIPVRL6 5' GCCAGCCGGACTTTGAGAGGAGACAGAAG 3' DRIPVRU7 5' CTGGCAAATTCCATGGTTCTGTCTTGAAGTGA 3' DRIPVRL8 5' CAATGGAACCAGAACATGAAGCCAAGCAGTCT 3' DRIPVRU9 5' GCTTCAGGCAGCAGCAGCATTTCCA 3' DRIPVRL10 5' ATTGGGATGAGGCCTTCAGGGGATGA 3' DRIPVUl 1 5* CCTGCCCCAGTACCTCCAGAGCCTCAC 3' DRIPVL12 5' GAACTCCTTTGGGGTCAGATGGACACAGTG 3' DRIPVU13 5' ACTGCATGGACCCTGGTGAGTGGCT 3' DRIPVL14 5' GCATGTGGTGGGAAATGACTTTGGAAG 3' DRIPVUl 5 5' CTCAGCACAAGCACCAAACCATACGACTGT 3' DRIPVU16 5' AGAGTAAATCCAAACGTGAACCAGAGAATGAGT 3' DRIPVRU17 5' GCCTGGGAGAAAATATTATTCCTTATGTTG 3' DRIPVUl 8 5' GTCTGGGCAGTGCGAAATTCATCCAC 3' DRIPVUl 9 5' AGACTCTACGCTTCCCCGATGGATGGT 3* DRIPL20 5' CAGGCGCGTATCTCTGAACAATGCTCTAAG 3' DRIPVL21 5' GAAGGGTGCTGTTTGGTTAACTCATTCTC 3' DRIPVU22 5' GCGAATAGCTAGAGCTCATGGACATCT 3* DRIPVU23 5^* ATTTTTACCAAGGTTTTAAGCGATGATGA 3' DRIPVL24 5' AGTGAGCCGGTGCATTTGGAGAAG 3 ' DRIPVU25 5' CTCAGACGCCGACGTGCACGAGTGACTA 3' DRIPVL26 5' ACGAGAAGTAAAACGGTGCATAGCCTCAGGT 3* DRIPVU27 5' GGATATCTTAGCAGGCATTTATCTTTCTTTGAGTCT 3 ' DRIPVL28 5' ATATTTTGCCATATGGGAGAATCGGAAGTC 3 ' DRIPVU29 5' TAGCATCCTGGACTAATTCAGCCATACAAG 3' DRIPVU30 5' GACGGTGGAGCAGGTAAAAGAAATAGG 3 ' DRIPVL31 5' GCAGCTGGGGAGTGTGGACAAC 3 ' DRIPVU32 5' TTAATTCATCAGCATTGCCAAGTAAGGATAG 3 ' DRIPVL33 5' GGACATCAAAAGGAGCTTCTCTACCAC 3 ' DRIPVU34 5' AGTGGAGAGCGGGAGACGAATG 3 ' DRIPVL35 5' AAGAATAGGATGGGGGTTGGTGAG 3 ' DRIPVU36 5 ' AGCCTAACGGACAGCCTGAATGGGA 3 ' FOSTSWI14187 5' ATTTATGTTCAACATGTTTCCTGC 3' RVSTSWI14187 5' TGCAGAATCGAGGCAGTTAA 3'

Die Sequenzen der Exons 1-38 können der SEQ. ID. No. 11 entnommen werden

SEQ. ID. No. 13

SEQ. ID. No. 13. umfasst die mRNA-Sequenz des DRIP-FUS I- Gens, wobei dieses die die Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens sowie die Exons I, la und II von Chromosom 3p25 umfasst. Die Gesamtlänge der mRNA beträgt 4558 Basen. Die Anordnung der Exons 1 bis 28 desjenigen Teils der mRNA, die von DRIP stammt, entspricht der Anordnung der Exons 1 bis 28 in DRIP, wie dies auch in SEQ. ID. No. 11 und 12 gezeigt ist. Exon I von Chromosom 3p25 umfasst die Nukleotide 4191..4308 und Exon II von Chromosom 3p25 die Nukleotide 4309..4566 der Sequenz gemäß SEQ ID No 13. Das Fusionsgen DRIP-FUS I wurde in der Zellinie S325T/SV 40 mit einer t(2;20;3) (p21;ql l.2; p25) nachgewiesen. Die folgenden Primer wurden verwendet zum Nachweis der Nukleinsäure nach SEQ. ID. No. 13:

Primer Sequenz

DRIPVRU1 5' ATGGGAGAACCAAATCGTCATCCAAGCATG 3'

DRIPVRU9 5' GCTTCAGGCAGCAGCAGCATTTCCA 3'

DRIPVRL10 5' ATTGGGATGAGGCCTTCAGGGGATGA 3*

DRIPVUl 5 5' CTCAGCACAAGCACCAAACCATACGACTGT 3'

DRIPVU16 5' AGAGTAAATCCAAACGTGAACCAGAGAATGAGT 3' DRIPVRU17 5* GCCTGGGAGAAAATATTATTCCTTATGTTG 3'

DRIPVUl 8 5' GTCTGGGCAGTGCGAAATTCATCCAC 3*

DRIPVUl 9 5* AGACTCTACGCTTCCCCGATGGATGGT 3'

DRIPL20 5' CAGGCGCGTATCTCTGAACAATGCTCTAAG 3'

DRIPVL21 5* GAAGGGTGCTGTTTGGTTAACTCATTCTC 3*

DRIPVU22 5' GCGAATAGCTAGAGCTCATGGACATCT 3'

DRIPVU23 5' ATTTTTACCAAGGTTTTAAGCGATGATGA 3*

DRIPVL24 5* AGTGAGCCGGTGCATTTGGAGAAG 3 ^»

DRIPVU25 5* CTCAGACGCCGACGTGCACGAGTGACTA 3'

DRIPVL26 5' ACGAGAAGTAAAACGGTGCATAGCCTCAGGT 3 *

DRIPVU27 5* GGATATCTTAGCAGGCATTTATCTTTCTTTGAGTCT 3 '

DRIPVL28 5* ATATTTTGCCATATGGGAGAATCGGAAGTC 3'

FUSVL01 5' TGCTTTGGGAGCCAGGTCACTGAGTTACTAC FUSVL02 5' ACTGCTTTGGGAGCCAGGTCACTGAGT FUSVL03 5' TCCAGGGAAATTCACTGCTTTGGGAGCCA

SEQ. ID. No. 14

SEQ. ID. No. 14 zeigt die mRNA-Sequenz einer Splice- Variante des DRIP-FUS I-Gens, nachgewiesen in der Zelllinie S325T/SV40 mit einer t(2;20;3)(p21;ql l.2;p25), wobei dieses die Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens sowie das Exon II , mit der Position 4191 bis 4448 der mRNA Sequenz, von Chromosom 3p25 umfasst. Diese Splice- Variante wurde aus der gleichen Zellinie erhalten wie im Zusammenhang mit SEQ. ID. No. 13 beschrieben. Die mRNA weist in diesem Falle eine Länge von 4448 Basen auf. Die genomische Sequenz des Teils der Nukleinsäuren gemäß SEQ. ID. No. 13 und 14, die von DRIP zu dem jeweiligen Fusionsgen beigetragen werden, entsprechen den Bereichen, wie sie im Zusammenhang mit SEQ ID No 12 offenbart sind.

SEQ. ID. No. 15

SEQ. ID. No. 15 zeigt die mRNA-Sequenz des zweiten Fusionsgens, das hierin auch als DRIP-FUS II bezeichnet wird das zum einen aus den Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens besteht und zum anderen aus dem Exon A von #7pl5. Die Länge der mRNA beträgt 5454 Basen, wobei die ersten 4190 Basen denjenigen der mRNA von DRIP entsprechen und die Basen 4191. bis 5454 dem Exon A von #7 l5. Für den Nachweis der Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens eignen sich die entpre- chenden Primer, wie sie im Zusammenhang mit SEQ. ID. No. 13 beschrieben wurden. Für den Nachweis des Sequenzanteils, der auf #7pl5 zurückgeht können an den folgenden Nukleotidpositionen von SEQ ID No 16 die folgenden Primer verwendet werden:

Primer Name Sequenz

FUSIIL01 5' GGTAGCGGGAGCAATCACAAAACTGTAA FUSIIL02 5' CTCTTCTTTTGATAGGACAGCCCTTGTTCTGA FUSIIL03 5' GACCGCTTCTTGCAGAGGCTGAGAGTC

SEQ. ID. NO. 16

SEQ. ID. No. 16 zeigt die mRNA-Sequenz der DRIP-Splicevariante. Der offene Leserahmen (ORF) beginnt mit Position 133 und endet mit Position 5772.

In Ergänzung zu den in der Figurenübersicht gegebenen Erläuterungen wird unter Bezug auf die einzelnen Figuren noch folgendes offenbart.

Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der genomischen Lage des Bruchpunktbereichs auf Chromosom 1, genauer #7pl5. Der Bruchpunkt ist bedeutsam für die Bereitstellung desjenigen Teils des Fusionstranskriptes DRIP-FUS II, welches von Chromosom 7 stammt. Die Ergebnis wurden an der Zelllinie S533/TSV40 ermittelt. Die Länge des Bruchpunktbereiches ist telomerwärts nicht definiert. Exon A, wie es in DRIP-FUS II enthalten ist, kann dabei aus dem BAC-Klon RP 11 - 379L16 (AC 079780) erhalten werden. Exon A und Alist dabei in Fig 1 a) relativ zu dem BAC- Klon vergrößert dargestellt.

Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung der genomischen Lage des Bruchpunktbereichs auf Chromosom 3, genauer #3p25. Der Bruchpunkt ist bedeutsam für die Bereitstellung desjenigen Teils des Fusionstranskriptes DRIP-FUS I, welches von Chromosom 3 stammt. Die Ergebnis wurden an der Zelllinie S325T/SV40 ermittelt. Die Länge des Bruchpunktbereiches ist telomerwärts nicht definiert. Die Exons I la und II von Chromosom 3, die im Fusionstranskript DRIP-FUS I enthalten sind, können aus den BAC-Klonen RP 11 -167M22 (AC093174) und RP 11-335119 (AC091492) erhalten werden. Die Exons I la und II sind in Fig 2 a) relativ zu dem BAC-Klon vergrößert dargestellt.

Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung der genomischen Lage des Bruchpunktbereiches auf der(2) bei der Zelllinie S325T/SV40, die das Fusionstranskript DRIP-FUS I aufweist. Dabei zeigt Fig 3 a) die Bezeichnung der chromosomalen Abschnitte auf der(2) und Fig. 3 b) die genomische Struktur von DRIP-FUS I, wobei Exon I (Ex I), Exon la und Exon II (Ex II) am 3 '-Ende angeordnet und vergrößert dargestellt sind. Wie in Fig. 3 c) dargestellt, ist die Größe des Bruchstückbereichs zwischen Exon I (#3p25) und Exon 28 (#2p21) nicht definiert und deshalb eine Längenangabe zu angrenzenden BAC-Klonen nicht möglich. Die BAC-Klone sind aus der BAC-Bibliothek RP 11 entnommen und können durch ihre Identifikationsnummer und die Zugangsnummer von Genebank eindeutig identifiziert werden.

Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung der genomischen Lage des Bruchpunktbereiches auf der(2) bei der Zelllinie S533T/SV40, die das Fusionstranskript DRIP-FUS II aufweist. Dabei zeigt Fig 2 a) die Bezeichnung der chromosomalen Abschnitte auf der(2) und Fig. 2 b) die genomische Struktur von DRIP-FUS II, wobei Exon A (Ex A) und Exon AI (ExAl) am 3 '-Ende angeordnet und vergrößert dargestellt sind. Wie in Fig. 4 c) dargestellt, ist die Größe des Bruchstückbereichs zwischen Exon A (#7pl5) bzw. Exon AI und Exon 28 (#2p21) nicht definiert und deshalb eine Längenangabe zu angrenzenden BAC-Klonen nicht möglich. Die BAC-Klone sind aus der BAC- Bibliothek RP 11 entnommen und können durch ihre Identifikationsnummer und die Zugangsnummer von Genebank eindeutig identifiziert werden.

Fig. 5 zeigt das nach Standardverfahren hergestellt Karyogramm des Primärtumors S 533, der eine Translokation t(2;7)(p21;pl5) aufweist. Die Translokationen sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Fig. 6 zeigt das nach Standardverfahren hergestellt Karyogramm der aus der Primärkultur S 533 hergestellen Zellllinie S 533/TSV 40. Dabei ist ersichtlich, dass die im Primärtumor ersichtlichen Translokationen auch in der aus dem Primärtumor etablierten Zelllinie erhalten bleiben.

Fig. 8 zeigt das Ergebnis des Nachweises des Bruchpunktes in der Zellinie S 533/TSV40, der zum Fusionstranskript DRIP-FUS II führt. Dabei wurde eine sogenannte Doppel-FISH an der Zelllinie S 533/TSV40 mit den BAC-Klonen RP 11-339H12 und RP 11 - 204 D19 durchgeführt. Das Er- gebnis ist in der rechten Teilfigur dargestellt. Gleichzeitig wurde eine GTG-Färbung des Bandenmusters der Chromosomen durchgeführt. Die Ergebnisse der Doppel-FISH stehen im Einklang mit dem Ergebnis der GTG-Färbung, wie durch die in beiden Abbildungen auf die Bruchpunkte weisenden Pfeile angezeigt.

Fig. 9 zeigt ein Karyogramm und FISH-Ergebnisse der Zellinie S 325/TSV40. Das Ka- rygramm wurde gemäß den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Standard- Verfahren hergestellt bzw. die FISH gemäß Standard- Verfahren durchgeführt. In Fig. 9 a) ist ein Teil des Giemsa- gefärbten Karyotypes und das geeignete Ideogramm der Schilddrüsenadenomzellinie S 325/TSV40 dargestellt. Die Zellinie weist eine Translokation t(2; 20;3)(p21; qll.2;p25) auf. Jeweils links ist der Normalzustand und rechts die derivatisierten Chromosomen 2, 20 und 3 dargestellt. Fig. 9 b) zeigt eine Metaphase der Zellinie S 325/TSV40 mit Translokation t(2; 20;3)(p21; qll.2;p25) nach Giem- sa-Färbung; die Chromosomen 2, der(2) und der(20) sind durch Pfeile gekennzeichnet; Fig. 9 c) zeigt die gleichen Metaphasen nach FISH mit BAC 1069E24, wobei die Hybridisierungssignale auf Chromosom 2, der(2) und der(20) angeordnet und durch Pfeile markiert sind.

Fig. 10 zeigt das Ergebnis einer RT-PCR, wobei das Fusionstranskript des ersten Fusionsproteins DRIP-FUS I aus der Zellinie S 325 und das Fusionstranskript des zweiten Fusionsproteins DRIP-FUS II aus der Zellinie S533 erhalten wurde. Die Pfeile zeigen die Lage der jeweiligen Transkripte an, wobei im Falle von DRIP-FUS I die drei Splice- Varianten erhalten wurden und bei DRIP-FUS II zwei Spieicevarianten. Die mit M markierte Spur ist die Referenzspur, die verschiedene Längenstandards enthält.

Fig. 11 zeigt das Ergebnis einer Northern-Blot- Analyse unter Verwendung einer DRIP- spezifischen Sonde. Hierzu wurde RNA, die aus den verschiedenen angegebenen Geweben entnommen worden war, auf eine Oberfläche aufgebracht und mit einer DRIP-spezifischen Sonde hybridisiert. Die Sonde wies eine Länge von 880 pb auf und entstammte den Exons 25 bis 32 des DRIP-Gens. Die verwendete Sonde entsprach dem Primer DRIPVRU17/VRL4.

Fig. 12 zeigt schematisch die genomische Lage von DRIP relativ zum Bruchpunkcluster bei verschiedenen benignen Schilddrüsentumoren und Hypeφlasien mit 2p21-22-Veränderungen. Die genomische Sequenz von DRIP kann durch die überlappenden BAC-Klone 339H12 (AC 010883), 183F15 (AC 092838), 1069E24 (AQ694385; AQ 703756) und 204 D19 (AC 092615) dargestellt werden. Der Translokationsbruch der Zelllinien S 325/TSV 40 und S533/TSV 40 (hierin auch als S 533 bezeichnet) erfolgt in Intron 28. Infolge eines Bruches in diesem Bereich kommt es zu den beiden Fusionsproteinen DRIP-FUS I und DRIP-FUS II. Fig. 13 zeigt schematisch eine Darstellung der DRIP-mRNA wobei die 6090 bp umfassende DRIP-mRNA insgesamt alle 38 Exons umfasst und der sich daraus ergebende offene Leserahmen (ORF) eine Länge von 5862 bp aufweist. Der ORF beginnt dabei in Exon 2 und erstreckt sich in 3'- Richtung bis zum Exon 38 des DRIP-Gens,. Weiterhin ist in Fig. 13 eine Splice-Variante des DRIP- Gens dargestellt, bei der die Exons 27 und 28 deletiert wurden. Auch diese Variante des DRIP-Gens stellt eine erfindungsgemäße Nukleinsäure dar bzw. das davon codierte Peptid ein erfindungsgemäßes Peptid. Der ORF der Splice-Variante umfasst insgesamt 5640 bp und beginnt ebenfalls in Exon 2 und erstreckt sich bis in Exon 38.

Fig. 14 zeigt eine schematische Darstellung von drei Formen des Fusionstranskriptes DRIP- FUS I. Die erste Form umfasst dabei die Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens und die Exons I und II von Bande 25 von Chromosom 3 (hierin auch als #3p25, oder auch Chromosom 3p25 bezeichnet). Die Länge dieser Form beträgt 4566 bp. Der ORF beginnt in Exon 2 und erstreckt sich bis in Exon I von #3 p25. Der ORF selbst wird von insgesamt 4164 bp gebildet entsprechend 1388 Aminosäureresten. Die zweite Form des ersten Fusionstranskriptes DRIP-FUS II umfasst ebenfalls die Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens, jedoch lediglich Exon II von #3p25. Diese Form weist eine Länge von 4448 bp auf, wobei der ORF wiederum in Exon 2 beginnt und sich bis in Exon II erstreckt. Der ORF weist dabei eine Länge von 4062 bp auf entsprechend 1354 Aminosäureresten.

Die dritte Form umfasst dabei die Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens und die Exons L a und II von Bande 25 von Chromosom 3 (hierin auch als #3p25, oder auch Chromosom 3p25 bezeichnet). Die Länge dieser Form beträgt 4731 bp. Der ORF beginnt in Exon 2 und erstreckt sich bis in Exon I von #3 p25. Der ORF selbst wird von insgesamt 4164 bp gebildet entsprechend 1388 Aminosäureresten.

Fig. 15 zeigt eine schematische Darstellung des zweiten Fusionsgens DRIP-FUS II, das in der Zelllinie S 533/TSV40 gefunden wurde. Das erste Fusionsgentranskript DRIP-FUS II umfasst unsgesamt 5454 bp und wird ausgebildet von den Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens und Exon A von der Bande pl5 von Chromosom 7, welches am 3 'Ende des Fusionstranskriptes angeordnet ist. Der ORF beginnt in Exon 2 und erstreckt sich etwas in Exon A hinein. Der ORF umfasst insgesamt 4062 bp entsprechend 1354 Aminosäureresten.

Die Splicevariante DRIP-FUS Ila umfasst unsgesamt 5580 bp und wird ausgebildet von den Exons 1 bis 28 des DRIP-Gens und Exon AI und A von der Bande pl5 von Chromosom 1, welches am 3 'Ende des Fusionstranskriptes angeordnet ist. Der ORF beginnt in Exon 2 und erstreckt sich etwas in Exon AI hinein. Der ORF umfasst insgesamt 4101 bp entsprechend 1367 Aminosäureresten. Soweit hierin nichts Gegenteiliges angegeben ist, handelt es sich bei den angegebenen Sequenzen um menschliche Sequenzen, bevorzugt um isolierte Sequenzen und bevorzugterweise um isolierte menschliche Sequenzen.

Die hierin offenbarten Sequenzen wurden im Sequenzprotokoll wiedergegeben und stellen einen wesentlichen Teil der Beschreibung dar.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele weiter erläutert, aus denen sich ebenso wie aus den Figuren und dem Sequenzprotokoll weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben.

Beispiel 1: Molekulargenetische Untersuchungen an Schilddrüsenadenomen mit 2p21- Aberrationen

Strukturelle Aberrationen mit Beteiligung der Chromosomenregion 2p21 charakterisieren eine zytogenetische Subgruppe bei benignen Schilddrüsentumoren. Für die Identifizierung dieses Bruchpunktes wurden aus benignen Schilddrüsentumoren mit 2p21 -Translokationen zwei Zellinien etabliert. Diese Zellinien und einen zusätzlichen Primärtumor wurde für FISH-Studien mit 18 BAC- Klonen eingesetzt. Alle Bruchpunkte wurden innerhalb eines Bereichs von etwa 450 kb lokalisiert. Die Koinzidenz des Bruchpunktbereiches bei den etablierten Zellinien und dem Primärtumor bestätigt die Übertragbarkeit der aus den Zellinien erhaltenen Daten auf Primärtumoren.

Material und Methoden

Nach der Operation wurde ein Stück Tumorgewebe unfixiert in sterile Hank's Lösung mit 2% Antibiotika gegeben (200 IU/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin). Zur Kultivierung der Zellen wurde das Tumorgewebe mechanisch zerkleinert und zum Gewebeaufschluss 3-4 h mit 0,35%iger Kollagenase (Serva, Heidelberg, Deutschland) behandelt. Die Zellsuspension in Enzym- lösung wurde zentrifugiert und das Zellpellet in Kulturmedium mit 20% fetalem Kälberserum und 2% Antibiotika kultiviert (TC 199 mit Earle's Salzen mit 20% fetalem Kälberserum und 2% Antibiotika, 200 IU/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin). Die Chromosomenpräparation erfolgte nach einer für die pleomoφhen Adenome der Speicheldrüse beschriebenen Methode (Bullerdiek et al., 1987). Die Karyotypbeschreibung erfolgte nach der ISCN (1995).

Die Zellinien wurden mittels Transfektion mit einem SV40-Plasmid (SV40 "early region") etabliert (Kazmierczak et al., 1990; Beige et al., 1992). Zwei Zellinien und ein Primärtumor wurden für FISH-Studien eingesetzt. Das Karyotyp eines der Primärtumoren wurde bereits veröffentlicht (Bol et al., 1999). Alle Tumoren, die in diese Studie einsetzt wurden, sind durch klonale Aberration von 2p21 charakterisiert.

Zur Klonierung des Bruchpunktes wurden 18 BAC-Klone verwendet,die aus der RPCI-11- Library aus dem Ressourcenzentrum für Genomforschung (Berlin, Deutschland) isoliert wurden. Sie wurden mittels QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) isoliert.

Die Fluoreszenz in situ Hybridizierung (FISH) erfolgte an Metaphasen, die vorher zur Identifizierung der Chromosomen GTG gebändert wurden. Die Isolierung der Metaphasen und die FISH erfolgten nach einer von Wanschura et al. (1995) modifizierten Protokoll von Kievits et al. (1990). BAC-DNA wurde mit Biotin-14-dUTP und Digoxigenein-14-dUTP mittels Nick-Translation markiert (Gibco BRL, Life Technologies, Eggenstein, Germany). Für jedes BAC wurden jeweils etwa 10 Metaphasen der Zellinien und Primärtumoren analysiert. Die Analyse der Chromosomen erfolgte nach der Gegenfärbung mit DAPI oder Propidiumiodid am Zeiss Axiophot Fluoreszenz Mikroskop mit einem FITC-Filter (Zeiss, Oberkochem, Deutschland). Die Aufzeichnung der Ergebnisse erfolgte mit dem Power Gene Karyotyping System (PSI, Halladale, U.K.).

Ergebnisse

Die Fluoreszenz in situ Hybridisieungsstudien wurden zunächst an den beiden etablierten Zellinien durchgeführt. Für FISH- Analysen wurden 18 BAC-Klone eingesetzt, die in der Chromosomenbande 2p21 lokalisiert sind. Für jedes BAC wurden 10 GTG-gebänderte Metaphasen analysiert. Nachdem die Bruchpunktregion in den beiden Zellinien zwischen den BAC-Klonen 339H12 und 1069E24 eingeengt wurde, wurden der Primärtumor eines der Zellinien und ein weiterer Primärtumor getestet. FISH-Analysen zeigen, dass die Bruchpunkte der untersuchten Zellinien und der Primärtumoren zwischen den BAC-Klonen 339H12 und 1069E24 lokalisiert sind.

Diskussion

In der Literatur wurden bisher über 450 zytogenetische Untersuchungen an Schilddrüsenhy- peφlasien und Adenomen berichtet. Etwa 20% dieser Läsionen zeigen chromosomale Veränderungen, die in unterschiedliche Subgruppen eingeteilt werden. 19q 13 -Veränderungen bilden dabei die größte Subgruppe mit strukturellen Chromosomenaberrationen (Beige et al., 1998). Klonale Aberrationen von Chromosom 2 wurden ebenfalls häufig gefunden. In dieser Gruppe war die Chromosomenbande p21 am häufigsten von Aberrationen betroffen (Bol et al., 1999).

Die häufigen klonale Veränderungen in der Chromosomenbande 2p21 zeigen, dass diese Aberrationstyp eine eigene zytogenetische Subgruppe bei benignen Schilddrüsentumoren bildet. Der molekulargenetische Hintergrund dieser Aberration ist bisher nicht bekannt. Zur Identifizierung des Bruchpunktes wurden zwei Zellinien mit 2p21 -Translokationen aus benignen Schilddrüsentumoren etabliert und diese Zellinien und zwei Primärtumore für FISH-Untersuchungen mit BAC-Klonen aus der Chromosomenbande 2p21 eingesetzt. Die Ergebnisse der FISH- Analysen zeigen, dass die Bruchpunkte der untersuchten Tumoren zwischen den BAC-Klonen 339H12 und 1069E24 liegen. Bei der Zellinie S533T/SV40 wurden mit keinem der beiden BAC-Klone Signale auf derivativen Chromosomen festgestellt. Dies könnte möglicherweise auf eine Deletion in diesem Chromosomensegment oder auf zu kurze Überlappungssequenzen der beiden BAC-Klone zurückgeführt werden, die nicht ausreichend detektierbare Signale zeigen.

Das BAC-Klon 339H 12 hat eine Länge von 215532 bp und die Länge des BACs 1069E24 wird nach Restriktionsanalysen auf etwa 270 kb geschätzt, da es nicht komplett sequenziert wurde. Die bekannte Überlappungssequenz der beiden BAC-Klone beträgt etwa 45728 bp, so dass die maximale Größe der Bruchpunktregion auf ca. 450kb geschätzt wird.

Literatur

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Cancer 16:149-151 (1996). Beige G, Roque L, Soares J, Bruckmann S, Thode B, Fonseca E, Clode A, Bartnitzke S, Castedo S,

Bullerdiek J: Cytogenetic investigations of 340 thyroid hypeφlasias and adenomas revealing cor- relations between cytogenetic findings and histology. Cancer Genet Cytogenet 101:42-48 (1998). Bol S, Beige G, Thode B, Bartnitzke S, Bullerdiek J: Structural abnormalities of chromosome 2 in benign thyroid tumors. Three new cases and review of the literature. Cancer Genet Cytogenet

114:75-77 (1999).

Bondeson L, Bengtsson A, Bondeson AG, Dahlenfors R, Grimelius L, Wedell B, Mark J: Chromosome studies in thyroid neoplasia. Cancer 64:680-685 (1989).

Bullerdiek J, Böschen C, Bartnitzke S: Aberrations of chromosome 8 in mixed salivary gland tumors: cytogenetic findings on seven cases. Cancer Genet Cytogenet 24:205-212 (1987). Johnson BA, Geha M, Blackwell TK: Similar but distinct effects of the tristetraprolin/TISl l imme- diate-early protein on cell survival. Oncogene 23: 1657-16564 (2000).

ISCN: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Mitelman F (ed.) S. Karger, Basel (1995)

Kievits T, Dauwerse JG, Wiegant J, Devilee P, Breuning MH, Cornelisse CJ, van Ommen GJB, Pearson PL: Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in situ hybridiza- tion. Cytogenet Cell Genet 53:134-136 (1990).

Knauff JA, Elisei R, Mochly-Rosen D, Liron T, Chen XN, Gonsky R, Korenberg JR, Fagin JA: In- volvement of protein kinase Cε (PKCε) in thyroid cell death. A truncated chimeric PKCε cloned from a thyroid cancer cell line protects thyroid cells from apoptosis. J Biol Chem 274:23414- 23425 (1999).

Roque L, Castedo S, Gomes P, Soares P, Clode A, Soares J: Cytogenetic findings in 18 follicular thyroid adenomas. Cancer Genet Cytogenet 67:1-6 (1993). Sozzi G, Miozzo T, Cariani TC, Bongarzone I, Pilotti S, Pierotti MA, Della Porta G: A t(2;3)(ql2-

13;p24-25) in follicular thyroid adenomas. Cancer Genet Cytogenet 64:38-41 (1992). Teyssier JR, Ferre D: Frequent clonal chromosomal changes in human non-malignant tumors. Int J Cancer 44:828-832 (1989). Teyssier JR, Liautaud-Roger F, Ferre D, Patey M, Dufer J: Chromosomal changes in thyroid tumors.

Relation with DNA content, karyotypic features, and clinical data. Cancer Genet Cytogenet

50:249-263 (1990). Wanschura S, Hennig Y, Deichet! U, Schoenmakers EFPM, Van de Ven WJM, Bartnitzke S,

Bullerdiek J: Molecular-cytogenetic refmement of the 12ql4— ql5 breakpoint region affected in uterine leiomyomas. Cytogenet Cell Genet 71:131-135 (1995).

Beispiel 2: Nachweis von DRIP und für DRIP codierenden Nukleinsäuren in primären Schilddrüsentumoren und Zellinien

Im Rahmen des vorliegenden Beispiels wurde unter Verwendung der nachfolgend weiter charakterisierten Primer und Verfahrensweisen betreffend RNA-Isolierung die Expression von mRNA in primären Schilddrüsentumoren und Zellinien mittels PCR nachgewiesen, wobei weiterhin die durch Datenbanksequenzvergleiche ermittelten Intron-ZExongrenzen übeφrüft wurden. Durch Sequenzierung der erhaltenen Sequenzen wurde überraschenderweise verschiedene Fusionsgen und Splicevarianten davon aufgefunden, welches das Ergebnis der entsprechenden Chromosomen- translokation darstellt.

Standard-PCR-Bedingungen (20 μl-Ansatz)

Template/Matrize : cDNA (2 μl) oder genomische DNA (1 μl) oder BAC-DNA (1 ng)

lOxPCR-Puffer (- Mg) (Gibco BRL/Invitrogen) : 2 μl

Primer up/low: 1 μl (Arbeitslösung 10 μmol) dNTP's: 1 μl

MgCl²⁺(Gibco BRL/rnvitrogen): 0,6 μl taq-Polymerase (5 U/μl) (Gibco BRL/Invitrogen): 0,25 μl

Aqua Bidest: add 12,15 μl (wenn cDNA) oder add 13,15 μl (wenn genomische DNA) Cyclen: 35

Cycler: Eppendorf Mastercycler

Anm.: Gradient von 50°C bis 70°C / Template 2,5 μl

Primer Lokalisation Template Transkriptlänge Bedingungen

DRIPVRU5/ Exon 35/ WRO 483 bp Prim. Denaturierung : 3 min /

DRΓPVRL 6 Exon 38 (cDNA) 95°C

Sek. Denaturierung: 30 sek /

95°C

Annealing: 30 sek /

60,8°C

Extension: 50 sek /

72°C

Final Extension: 10 min /

72°C

Cycler: Eppendorf Mastercycler

Anm.: Gradient von 50°C bis 70°C

Primer Lokalisation Template TranskriptBedingungen länge

DRIPVUl 6/ Exon 14/ MCF 7 820 bp Prim. Denaturierung : 3 min /

DRIPVRL10 Exon 19 (cDNA) 95°C

Sek. Denaturierung: 45 sek /

95°C

Annealing: 30 sek /

55,5°C

Extension: 30 sek /

72°C

Final Extension: 10 min /

72°C

Cycler: Gradientencycler Biometra

Anm.: Gradient von 50°C bis 70°C

72°C

Final Extension: 10 min /

72°C

Cycler: Eppendorf Mastercycler Anm.: Gradient von 50°C bis 70°C

PCR I

PCR II

Final Extension: 10 min

72°C

Cycler: Gradientencycler Biometra

Anm.: cDNA Klon aus Transformation des PCR-Produktes aus PCR II

Primersequenzen

Verwendete Zelllinien

MCF-7 (human breast adenocarcinoma) No: DSM ACC 115 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) HELA (human cervix carcinoma) No: DSM ACC 57 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)

WRO BAC 339H12 BAC 204D19

Protokoll zur RNA-Isolierung

Behandlung mit Trizol (Abzug!; gestopfte Pipettenspitzen!)

I. Lösen der Zellen

Medium vollständig aus der Zellkulturflasche absaugen (Impfbank); Abzug mit Ethanol (70 %) auswischen; 1,5 ml Cup vorbereiten (sterile Cups, nicht autoklaviert); Zugabe von 1 ml Trizol direkt in die Zellkulturflasche; Suspendieren der Zellen durch auf- und abpipettieren; Zellsuspension mit der Pipette in das Cup überführen; Aufbewahrung der Zellen bei -80°C; Benutzte Pipettenspitzen in Autoklavierabfall; Zellkulturflaschen unter dem Abzug ausdampfen lassen.

II. Phasentrennung

Wasserbad auf 30°C vorheizen; Zentrifuge auf 4°C kühlen; Zellsuspension (auftauen und) Inkubation bei RT für 5 min; Zugabe von 200 μl Chloroform pro ml Trizol; Suspension kräftig schütteln; Inkubation im Wasserbad bei 30°C für 2-3 min; Zentrifugation bei 12ooo xg und 4°C für 15 min.

III. RNA-Präzipitation

Obere Phase (RNA!) mit einer Pipette in ein neues, steriles 1,5 ml Cup überführen; Zugabe von 500 μl Iso-Amylalkohol (Isopropanol); vorsichtig schwenken; Inkubation im Wasserbad bei 30°C für 10 min; Zentrifugation bei 12ooo xg und 4°C für 10 min; Anschließend SOFORT Überstand mit mit einer Pipette abnehmen; Phenolabfall(i).

IV. Waschen der RNA

Zugabe von 1 ml Ethanol (75 %) zum Pellet - kurz vortexen; Zentrifugation bei 7500 xg und 4°C für 5 min; Anschließend SOFORT Überstand mit einer Pipette abnehmen; Phenolabfall(i); Pellet bei RT unter dem Abzug mind. 10 min trocknen lassen; Wasserbad auf 55°C (oder 60°C) stellen. V. Lösen der RNA

Zugabe von 30-50 μl steriles dH₂O (steril), je nach Größe des Pellets; Inkubation im Wasserbad bei 55°C für 10 min; Anschließend Proben sofort auf Eis; Aufbewahrung bei -80°C (oder Konzentrationsbestimmung) .

VI. Konzentrationsbestimmung

60 μl steriles dH₂O in Kunststoffküvette vorlegen; Leerwert messen; Zugabe von 1 μl RNA - mischen; Konzentrationsbestimmung bei 260/280 nm + Quotient; Aufbewahrung der RNA bei - 80°C.

FISH

Die Durchführung von FISH ist beispielsweise beschrieben bei Kieviets et al. (Kievits T, Dauwerse IG, Wiegant I, Devilee P, Breuning MH, Cornelisse CJ, van Ommen GIB, Pearson PL: Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 53:134-136 (1990)).

3'-RACE-RT-PCR-Bedingungen an S533/TSV40 zum Nachweis des DRIP-FUS2 Gens

Templatebezeichnung: cDNA gewonnen aus der Aufreinigung der totalen RNA von Zellen der Zelllinie S533T/SN40 nach Reverse Transkriptase Reaktion mit AP- Primer (poly T plus UAP-2 teilsequenz)

PCR-Bedingungen für die Sonden-Herstellung (DRIP-FUS2)

Templatebezeichnung: EIL3500 (cDNA-Klon; aus PCR mit DRIPVUl 6/DRIPVRL2) Produktlänge: 20 lbp

* dNTP-Mix: 1.5μl DIG-11-dUTP alkali labile (25nM; Röche) + 3μl dNTPs (lOmM)

•^ Aufreinigung der Sonden-DNA mit PCR-Purification Kit (Qiagen) 3'-RACE-RT-PCR-Bedingungen für S325/TSV40 zum Nachweis des DRIP-FUS 1

Gens

Templatebezeichnung: S325T/SV40 (cDNA)

Art des Upper-Primers und des Lower-Primers sowie des Reaktionsansatzes identisch wie bei 3 '-RACE-RT-PCR für S 533/TSV 40

PCR-Bedingungen für die Sonden-Herstellung (DRIP-FUSl)

* dNTP-Mix: 2μl DIG-11-dUTP alkali labile (25nM; Röche) + 4μl dNTPs (lOmM)

Protokoll für die nicht-radioaktive Hybridisierung (Southern-Blot) (RACE-PCR DRIP-FUSl und DRIP-FUS2)

I.

5 min in 2xSSC

2 x 10 min in Depurinierungspuffer 2 x 15 min in Denaturierungspuffer 3 x 10 min in Neutralisierungspuffer 5 min in 20xSSC

II.

Vakuumpumpe mind. 15 min vor dem Blotting anstellen (warmlaufen lassen)

Whatman-Filter und Hybond-N-Membran (Amersham Pharmacia Biotech) ausschneiden (etwas größer als das Gel)

Blot-Apparatur (Model 785 vacuum blotter; Biorad) zusammen bauen

Vakuum anlegen (5 inch/mm Hg)

Vorsichtig 20xSSC angießen, sobald das Gel angesaugt ist

Blotten für 1-2 Std (je nach Größe/Dicke des Gels) Alle 10 min Gel mit 20xSSC überschichten

Nach dem Blot: - Taschen des Gels auf der Membran mit Bleistift markieren

DNA auf Membran fixieren: UV-Crosslinken in Fluo-Link (Biometra) bei Einstellung 0,4 (= 40 sek)

III. Hybridisierung

Express-Hybridisierungs-Lösung (Clontech) im Wasserbad auf

60°C vorwärmen

Hybridisierungsofen auf 60°C vorwärmen

Membran auf ein Gaze-Tuch legen und von unten her aufrollen und in eine Hybridisierungsflasche geben

Zugabe von 5 ml Exp-Hyb-Lösung

Prähybridisierung für 30 min* bei 60°C im Hybridisierungsofen-Ofen

Nach 20 min* Sonde denaturieren: 10 min bei 95°C (im PCR-Block, Biometra) - Sonde danach sofort auf Eis!

In Sarstedt-Röhrchen pipettieren: 5 ml Exp-Hyb-Lösung + 2 μl Sonde (80ng/μl) - vortexen

Exp-Hyb-Lösung+Sonde zur Membran in Hybridisierungsflasche geben

Hybridisierung über Nacht im Hybridisierungsofen bei 60°C

IN. Membran waschen

Vorbereitung: 1) 0,lxSSC/0,l%SDS in Hybridisierungsofen auf 60°C vorwärmen, 2) Puffer l/l%Blockingreagenz herstellen, dazu: 90 ml Puffer 1 + 10 ml 10%Blocking-Reagenz mischen, davon: 10 ml in Sarstedt-Röhrchen abpipettieren (für Punkt 27)

Membran auf dem Schüttler für x min in:

2 x 15 min in 2xSSC/0,l%SDS bei RT

2 15 min in 0,lxSSC/0,l%SDS (vorgewärmt)

5 min in Puffer l/0,3%Tween-20

30 min in Puffer l/l%Blocking-Reagenz

30 min in 10 ml Puffer l/l%Blocking-Reagenz + lμl anti-dig-

AP, FAB-Fragmente (150U/200μl; Enzo)

2 x 15 min in Puffer l/0,3%Tween-20

5 min in Puffer 3 V. Nachweis

In einem 1,5 ml Cup folgende Komponenten zusammen pipettieren

Mittlere Membran: 1,5 ml Puffer 3 + 15 μl CPD-Star (25 mM; Cellmark Diagnostics)

Membran in eine Folie legen und an 3 Seiten zuschweißen

Zugabe der Lösung direkt auf die Membran (auf die DNA-Seite)

Folie luftblasenfrei zuschweißen und in Autoradiographie-

Kassette legen - DNA-Seite nach oben

Im Fotolabor bei Rotlicht weiter arbeiten!

Hyperfilm-ECL (Amersham Pharmacia Biotech) auf Membran legen; Ecke markieren und Taschen von der Membran auf Film kennzeichnen

10 min belichten lassen

Film solange in Entwicklerbad legen, bis er schwärzt

Film 10 min in Fixierbad legen

Film 10 min in Wasser + Eisessig wässern

Film im Trockenschrank trocknen

Puffer für Southern Blot

Depurinierungspuffer

0,25 M HC1 [20 ml HC1 (37%)] add. Bidest > 1000 ml

Denaturierungspuffer (2000 ml)

0,5 NaOH [40 g NaOH (Mw: 40 g/mol)]

1,5 M NaCl [175,32 gNaCl (Mw:58,44 g/mol)] add. Bidest > 2000 ml pH 7,4

Neutralisierungspuffer (2000 ml)

1,5 M NaCl [175,32 gNaCl (Mw: 58,44 g/mol)]

0,5 M Tris-HCl [157,6 g Tris-HCl (Mw : 157,6 g/mol)] pH 7,4

20xSSC (2000 ml)

3 M NaCl [350,64 gNaCl (Mw : 58,44 g/mol)]

0,3 M Na-Citrat [176,46 g Na-Citrat (Mw : 294,1 g/mol)] add. Bidest > 2000 ml pH 7,0

Puffer 1 (2000 ml)

0,1 M Maleinsäure [23,2 g Maleinsäure (Mw: 116,07 g/mol)]

0,15 M NaCl [17,4 g NaCl (Mw: 58,44 g/mol)]

15,8 g NaOH [(Mw: 40 g/mol)] add. Bidest > 2000 ml pH 7,5

2xSSC/0,l%SDS (1000 ml)

100 ml 20xSSC

5 ml 20%SDS add. Bidest > 1000 ml

0,lx SSC/0,1%SDS (1000 ml)

5 ml 20xSSC

5 ml 20%SDS add. Bidest > 1000 ml

Waschpuffer (1000 ml) Puffer 1 [997 ml Puffer 1] 0,3% Tween20 [3 ml Tween20]

Blocking-Stock-Lösung (250 ml)

10% (w/v) Blocking-Reagens [25 g Blocking-Reagens] in Puffer 1 [add. Puffer 1 > 250 ml]

Puffer 3 (1000 ml) 0,1 M Tris-HCl [15,76 g Tris-HCl (Mw: 157,6 g/mol)]

0,1 M NaCl [5,84 g NaCl (Mw: 58,44 g/mol)] add. Bidest > 1000 ml pH 9,5

0,4 M NaOH (1000 ml)

16 g NaOH [(Mw: 40 g/mol)] add. Bidest > 1000 ml

Strip-Puffer (1000 ml)

0,lxSSC [5 ml 20xSSC]

0,1%SDS [5 ml 20%SDS]

0,2 M Tris-HCl [31,52 g Tris-HCl (Mw: 157,6 g/mol)] add. Bidest > 1000 ml

PCR-Nachweise

Durchgeführte DRIP- bzw. DRIP-FUS PCRs

Tabelle: Durchgeführte DRIP- bzw. DRIP-FUS PCRs an cDNAbzw. genomischer DNA

PCR - Bedingungen im Einzelnen

Standard PCR - Mix definieren:

Templatebezeichnung: DIL3500 (cDNA-Klon; aus PCR mit DRIPVUl 6/DRIPVRL2)

Produktlänge: 880bp

Standard PCR - Mix Thermocycler:

Als Ergebnis wurde erhalten: Hauptbande bei 880bp; eine schwache Bande bei ~650bp: heterogenes Klongemisch mit Klonen mit Exon 14 und Exon 15 sowie Klonen ohne Exon 14 und Exon 15 (Splicevariante)

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: MCF-7 (cDNA) Produktlänge: 130bp

Standard PCR - Mix

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: BAC204D19 (genomische DNA) Produktlänge: 505bp

Standard PCR - MIX

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: HeLa (cDNA) Produktlänge: 505bp

Standard PCR-Mix

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: BAC204D19 (genomische DNA) Produktlänge: 479bp

Standard PCR-Mix

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: DIL3500 (cDNA-Klon; aus PCR mit DRIPVUl 6/DRIPVRL2) Produktlänge: 20 lbp

Standard PCR-MIX

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: MCF-7 (cDNA) Produktlänge: 20 lbp

Standard PCR-MIX

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: S325T/SV40 (cDNA) Produktlänge: 20 lbp

Standard PCR-MIX

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: S533T/SV40 (cDNA) Produktlänge: 20 lbp

Standard PCR-Mix

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: BAC 339H12 (genomische DNA) Produktlänge: 98 lbp

Standard PCR-MIX

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: DIL3500 (cDNA-Klon; aus PCR mit DRIPVUl 6/DRIPVRL2) Produktlänge: 370bp

Standard PCR-MIX

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: WRO (cDNA) Produktlänge: 1049bp

Standard PCR-Mix

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: MCF-7 (cDNA) Produktlänge: 162bp

Standard PCR-Mix

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: DIL3500 (cDNA-Klon; aus PCR mit DRIPVUl 6/DRIPVRL2) Produktlänge: 820bp

Standard PCR-MIX

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: WRO (cDNA) Produktlänge: ~ 3.5kbbp Kommentar: Amplifϊzierung erfolgt in zwei hintereinander folgenden PCRs

Upper-Primer Lower-Primer

DRIPVUl 6 DRLPVRL2

PCR I Volumen (Konzentration)

Standard PCR-Mix

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: DIL3500 (cDNA-Klon; aus PCR mit DRIPVUl 6/DR VRL2) Produktlänge: 560bp

Standard PCR - Mix

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: S533T/SV40 (cDNA) Produktlänge: 699bp

Standard PCR-Mix

PCR-Bedingungen FUS II Fusionstranskript: Templatebezeichnung: S533T/SV40 (cDNA)

Produktlänge: 1142bp

PCR-Bedingungen für DRIP-FUS I Fusionstranskript: Templatebezeichnung: S325T/SV40 (cDNA)

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: S325T/SV40 (cDNA)

Produktlänge: 165bp (ohne Exon I); 283bp (inkl. Exon I)

PCR-Bedingungen Templatebezeichnung: BAC 339H12 (genomische DNA)

Produktlänge: 130bp

Standard PCR-Mix

PCR-Bedingungen

Templatebezeichnung: HeLa (cDNA)

Produktlänge: 130bp

Standard PCR-Mix

PCR-Bedingungen

Templatebezeichnung: WRO (cDNA)

Produktlänge: 764bp

Standard PCR-Mix

Die in der vorstehenden Beschreibung, dem Sequenzprotokoll und den Ansprüchen offenbarten Aspekte der Erfindung, Ausführungen davon sowie Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in Ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein. Der Offenbarungsgehalt der Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.

Claims

Ansprüche

1. Nukleinsäure mit bei Hyperplasien und/oder Tumoren geänderter Expression, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ. ID. No. 11 bis 16 und jeweils Fragmente davon umfasst.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe, die epitheliale Tumoren mit einer Veränderung der chromosomalen Arm 2p und Tumoren mit einer Veränderung der chromosomalen Bande 2p21-22 umfasst.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hyperplasie ausgewählt ist aus der Gruppe, die Hypeφlasien der Schilddrüse umfasst.

4. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus einer Nukleinsäure gemäß SEQ. ID. No. 1, 9, 13, 14 und/oder 15.

5. Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes für die gleiche Aminosäuresequenz codieren würde wie eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Nukleinsäure, die an eine der Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 hybridisiert, insbesondere unter stringenten Bedingungen.

7. Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure nach einem der vorangehenden Ansprüche umfasst.

8. Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er weiterhin mindestens ein Element umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Promotoren, Terminatoren und Enhancer umfasst.

9. Vektor nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Expressionsvektor ist.

10. Vektor nach Anspruch 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Promotor im Leserahmen mit mindestens einem für ein Polypeptid codierenden Teil einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 ist.

11. Polypeptid codiert durch eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 2 oder 5 bis 8, 10 oder 17.

12. Polypeptid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es modifiziert ist.

13. Zelle, insbesondere eine isolierte Zelle, die einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 10 umfasst.

14. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen ein Polypeptid nach Anspruch 11 oder 12 gerichtet ist.

15. Antikörper nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gerichtet ist.

16. Ribozym, dadurch gekennzeichnet, dass es gegen eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gerichtet ist.

17. Ribozym nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es zumindest einen Teil einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer dazu im wesentlichen komplementären Nukleinsäure umfasst.

18. Anti-sense Nukleinsäure umfassend eine Sequenz, die im wesentlichen komplementär zu oder im wesentlichen identisch mit einer der Nukleinsäuresequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 ist.

19. RNAi umfassend eine Sequenz, die im wesentlichen komplementär oder im wesentlichen identisch ist mit einer der Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einem Teil davon, wobei bevorzugterweise die RNAi einen Bereich mit einer Länge von 21 bis 23 Nukleotiden umfasst, der im wesentlichen komplementär oder im wesentlichen identisch ist.

20. Primer oder Nukleinsäuresonde umfassend eine Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure im wesentlichen komplementär oder im wesentlichen identisch ist mit einer der Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einem Teil davon, wobei der Primer und/oder die Nukleinsäure- seonde eine Länge von 12 bis 32 Nukleotiden, bevorzugterweise von 14 bis 28 Nukleotiden und bevorzugtererweise von 20 bis 28 Nukleotiden umfasst.

21. Verfahren zum Bestimmen einer Verbindung, die die Wirkung eines Translationsproduktes einer Nukleinsäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche beeinflusst, insbesondere inhibiert, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

Bereitstellen des Translationsproduktes und der Verbindung

Bestimmen, ob unter dem Einfiuss der Verbindung eine Änderung der Wirkung des Translationsproduktes auftritt.

22. Verfahren zum Bestimmen einer Verbindung, die die Wirkung eines Transkriptionsproduktes einer Nukleinsäure nach einem der vorangegangenen Ansprüche beeinflusst, insbesondere inhibiert, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

Bereitstellen des Transkriptionsproduktes und der Verbindung

Inkontaktbringen des Transkriptionsproduktes und der Verbindung in einem System, das die

Wirkung des Transkriptionsproduktes darstellt, und Bestimmen, ob unter dem Einfiuss der Verbindung eine Änderung der Wirkung des Transkriptionsproduktes auftritt.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass das System ausgewählt ist aus der Gruppe, die zelluläre Expressionssysteme, zellfreie Expressionssysteme, Assay zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen Verbindung und Translationsprodukte, und Assay zur Bestimmung der Wechselwirkung zwischen Verbindung und Transkriptionsprodukte umfasst.

24. Verfahren zur Bestimmung von Genen, die für die Entstehung von Hyperplasien und Tumoren, insbesondere der Schilddrüse, verantwortlich sind umfassend die folgenden Schritte:

Ermitteln der Bruchpunkte bei chromosomalen Aberrationen der Hyperplasien und/oder der Tumoren,

Bestimmen von Genen, die innerhalb eines Bereichs von 400 kbp, bevorzugterweise 150 kbp, in jede Richtung ab dem Bruchpunktbereich des Chromosomen arms 2p, bevorzugterweise der Bande Chromosoms 2p21-22, liegen, und

Bestimmen, ob die Translation/Transkription des Gens in einer Zelle der Hyperplasie oder des Tumors gegenüber einer nicht-Hyperplasie-Zelle oder einer nicht-Tumor-Zelle verändert ist.

25. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und/oder eines Ribozyms nach Anspruch 16 oder 17 und/oder einer Antisense-Nukleinsäure nach Anspruch 18 und/oder einer RNAi nach Anspruch 19 und/oder einer Nukleinsäuresonde nach Anspruch 20 zur Diagnose, insbesondere in vitro, und/oder Therapie von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hyperplasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

26. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und/oder eines Ribozyms nach Anspruch 16 oder 17 und/oder einer Antisense-Nukleinsäure nach Anspruch 18 und/oder einer RNAi nach Anspruch 19 und oder einer Nukleinsäuresonde nach Anspruch 20 zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere zur Therapie und/oder Prävention von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

27. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 11 bis 12 zur Diagnose, insbesondere in vitro, und/oder Therapie von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

28. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 11 bis 12 zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere zur Therapie und/oder Prävention von Funktionsstörungen der Schild- drüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

29. Verwendung eines Antiköφers nach einem der Ansprüche 14 bis 15 zur Diagnose, insbesondere in vitro, und/oder Therapie von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

30. Verwendung eines Antiköφers nach einem der Ansprüche 14 bis 15 zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere zur Therapie und/oder Prävention von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

31. Kit zur Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit mindestens ein Element umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die eine Nukleinsäure, einen Vektor, ein Polypeptid, eine Zelle, einen Antiköφer, eine Antisense-Nukleinsäure, RNAi, ein Ribozym, einen Primer und/oder eine Nukleinsäuresonde, jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfasst.

32. Verfahren zum Nachweis von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Tumoren der Schilddrüse, gekennzeichnet durch die Schritte:

Kontaktieren von Schilddrüsenmaterial mit dem Agens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die eine Nukleinsäure, einen Vektor, ein Polypeptid, einen Antiköφer, eine Antisense- Nukleinsäure, RNAi, ein Ribozym und eine Zelle, jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfasst, und

Bestimmen, ob Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumore der Schilddrüse vorliegen.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Schilddrüsenmaterial ex vivo vorliegt.

34. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Schilddrüsenmaterial Teil eines zytologischen Präparats ist.

35. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Teils davon als Primer und/oder als Sonde.

36. Primer zum Darstellen und/oder Screenen und/oder Detektieren einer Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass er zu einem Teil einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 im wesentlichen komplementär oder im wesentlichen identisch ist.

37. Verfahren zum Darstellen einer Nukleinsäure, die eine Sequenz umfasst, welche in Schilddrüsentumoren oder Strumen nachgewiesen werden kann, bei denen eine Aberration mit Bruchstelle in der chromosomalen Bande 2p21-22 vorliegt, wobei die Sequenz mindestens teilweise innerhalb der chromosomalen Banden 2p21-22 liegt, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Schritte umfasst:

Bereitstellen von Primern, insbesondere Primer nach Anspruch 35, zum Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion,

Bereitstellen eine der Bande 2p21-22 des humanen Chromosoms 2 entnommenen Nukleinsäuresequenz oder einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, Mischen der Nukleinsäuresequenz bzw. der Nukleinsäure mit den Primern, Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion.

38. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: mindestens ein Agens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die eine Nukleinsäure, einen Vektor, ein Polypeptid, eine Zelle, einen Antiköφer, eine Antisense-Nukleinsäure, RNAi, ein Ribozym, einen Primer und/oder eine Nukleinsäuresonde, jeweils gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, sowie Kombinationen davon umfasst, und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

39. Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumoren und Hypeφlasien, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung an einen Patienten verabreicht wird, die die Auswirkungen der geänderten Expression der Nukleinsäuren nach einem der vorangegangen Ansprüche verhindert.

40. Verwendung einer Verbindung, die die Auswirkungen der geänderten Expression der Nukleinsäuren nach einem der vorangegangen Ansprüche verhindert, zur Herstellung eines Medikamentes.

41. Verwendung nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumoren und/oder Hypeφlasien, insbesondere von Tumoren und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse ist.

42. Verwendung einer Nukleinsäure mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder davon codierte Polypeptide oder Derivate davon zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere zur Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren und/oder zur Herstellung eines diagnostischen Mittels, insbesondere für die Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren.

43. Verwendung nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid eine Aminosäuresequenz gemäß No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 aufweist.

44. Verwendung nach Anspruch 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure mit der Nukleinsäure gemäß einer der SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 ohne die Dege- neriertheit des genetischen Codes hybridisieren würde.

45. Verwendung eines Polypeptids mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 umfasst, oder Derivate davon zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere zur Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren und/oder zur Herstellung eines diagnostischen Mittels, insbesondere für die Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren.

46. Verfahren zum Screenen eines Mittels zur Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren, und/oder eines diagnostischen Mittels für die Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren, umfassend die Schritte:

Bereitstellen einer Kandidaten- Verbindung,

Bereitstellen eines Expressionsssystems und/oder Aktivitätssystems;

Aktivitätssystem;

ID. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 Derivate davon verändert wird.

47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Kandidaten- Verbindung in einer Verbindungsbibliothek enthalten ist.

48. Verfahren nach Anspruch 46 oder 47, dadurch gekennzeichnet, dass die Kandidaten- Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe von Verbindungsklassen, die Peptide, Proteine, Antikörper, Anticaline, funktionale Nukleinsäuren und kleine Moleküle umfasst.

49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalen Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe, die Aptamere, Aptazyme, Ribozyme, Spiegelmere, Antisense- Oligonukleotide und RNAi umfasst.

50. Verwendung einer Nukleinsäure mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder davon codierte Polypeptide oder Derivate davon und/oder eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ. ED. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 oder eines Derivates davon und/oder eines insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartners einer Nukleinsäure mit einer Sequenz, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder davon codierte Polypeptide oder Derivate davon und/oder einer dafür codierenden Nukleinsäure und/oder der Wechselwirkungspartner eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 oder eines Derivates davon als Zielmolekül für die Entwicklung und/oder Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren, und/oder für die Entwicklung und/oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Tumoren der Schilddrüse.

51. Verwendung nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament oder das diagnostische Mittel ein Agens umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antiköφer, Peptide, Anticaline, kleine Moleküle, Antisense-Moleküle, Aptamere, Spiegelmere und RNAi-Moleküle umfasst.

52. Verwendung nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass das Agens mit einer Nukleinsäure mit einer Sequenz in Wechselwirkung tritt, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder mit einer für einen insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner codierenden Nukleinsäure, insbesondere mit mRNA, genomischer Nukleinsäure oder cDNA in Wechselwirkung tritt.

53. Verwendung eines Polypeptids, das mit einem Peptid in Wechselwirkung tritt, das von einer Nukleinsäure mit einer Sequenz codiert wird, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder einem Polypeptid gemäß SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 und/oder mit einem insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner davon in Wechselwirkung tritt zur Entwicklung oder Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren, und/oder zur Entwicklung oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

54. Verwendung nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antiköφer und bindende Polypeptide umfasst.

55. Verwendung einer Nukleinsäure, die mit einem Polypeptid in Wechselwirkung tritt, wobei das Polypeptid von einer Nukleinsäure mit einer Sequenz codiert, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder einem Polypeptid gemäß SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 und/oder mit einem insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner davon zur Entwicklung oder Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Schilddrüsentumoren, und/oder zur Entwicklung oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

56. Verwendung nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Aptamere und Spiegelmere umfasst.

57. Verwendung einer ersten Nukleinsäure, die mit einer zweiten Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, wobei die zweite Nukleinsäure eine Sequenz aufweist, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die SEQ. ID. No. 1, 3, 4, 9 und SEQ ID No 11 bis 16 umfasst, oder Derivate davon und/oder mit einer Nukleinsäure in Wechselwirkung tritt, die für einen Wechselwirkungspartner eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 codiert zur Entwicklung oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

58. Verwendung nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass die in Wechselwirkung tretende ersten Nukleinsäure ein Antisense-Oligonukleotid, ein Ribozym und/oder RNAi ist.

59. Verwendung nach Anspruch 57 oder 58, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Nukleinsäure die jeweilige cDNA oder mRNA ist.

60. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend mindestens ein Agens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, wie durch die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 50 bis 59 definiert, und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, insbesondere zur Prävention und/oder Behandlung von Funktionsstörungen der Schilddrüse und/oder Hypeφlasien der Schilddrüse und/oder Tumoren, insbesondere Schilddrüsentumoren.

61. Kit für die Charakterisierung des Zustandes der Schilddrüse, umfassend mindestens ein A- gens, das durch die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 50 bis 59 definiert ist.

62. Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 5 bis 8, 10 und 17 oder ein funktionsfähiges Fragment davon.

63. Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 62 gemäß einer Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche.