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EP1173156A2 - Method for producing a polyurethane matrix with covalently immobilised biomolecules - Google Patents

Method for producing a polyurethane matrix with covalently immobilised biomolecules

Info

Publication number
EP1173156A2
EP1173156A2 EP00927092A EP00927092A EP1173156A2 EP 1173156 A2 EP1173156 A2 EP 1173156A2 EP 00927092 A EP00927092 A EP 00927092A EP 00927092 A EP00927092 A EP 00927092A EP 1173156 A2 EP1173156 A2 EP 1173156A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polyurethane
polyurethane matrix
polar
matrix
wound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP00927092A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Norbert Ettner
Thomas Mahler
Ernst Schaumann
Michael Schink
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TJ Smith and Nephew Ltd
Original Assignee
Beiersdorf AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beiersdorf AG filed Critical Beiersdorf AG
Publication of EP1173156A2 publication Critical patent/EP1173156A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/83—Chemically modified polymers
    • C08G18/85—Chemically modified polymers by azo compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/093—Polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/08—Processes
    • C08G18/0838—Manufacture of polymers in the presence of non-reactive compounds
    • C08G18/0842—Manufacture of polymers in the presence of non-reactive compounds in the presence of liquid diluents
    • C08G18/0847—Manufacture of polymers in the presence of non-reactive compounds in the presence of liquid diluents in the presence of solvents for the polymers
    • C08G18/0852—Manufacture of polymers in the presence of non-reactive compounds in the presence of liquid diluents in the presence of solvents for the polymers the solvents being organic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G2220/00—Compositions for preparing gels other than hydrogels, aerogels and xerogels

Definitions

  • the invention relates to a process for the production of polyurethane wound dressings on which biomolecules relevant to wound healing, such as superoxide dismutase, are immobilized, with which it is possible to initiate or promote the normal healing process.
  • biomolecules relevant to wound healing such as superoxide dismutase
  • the ⁇ -amino groups of the amino terminus and the ⁇ -amino groups of the surface-exposed amino acid side chains of lysine and arginine can function as functional amino groups in proteins, antibodies and enzymes.
  • other reagents such as carbonylditriazole (CDT) (cf. C. Delgado et al. 1992, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249) can also be used for activation.
  • CDT carbonylditriazole
  • EP 0 087 786 describes a process for immobilizing the iron chelator desferrioxamine by binding the primary amino group, DFO being bound to agarose-polyaldehyde gel beads.
  • SOD Pyatak et al., 1980, Res. Com. Chem. Path. And Pharmacol., 29, 115
  • catalase A. Abukovski et al., 1976, J. Biol.
  • WO 98/02189 describes a method for coupling enzymes or proteins relevant to wound healing to polyhydroxy polymers such as cellulose. The swelling of a polyhydroxy polymer in organic solvents is claimed.
  • Polyurethane gels also belong to the group of polyhydroxy compounds, but have the disadvantage compared to cellulose, for example, that they swell strongly under the known conditions for activating the hydroxy groups.
  • proteins or peptides are mixed as active agents to form polyurethane-crosslinked microgels in the dry state.
  • the microgels swell to form hydrogels in the aqueous medium and release the protein or peptide from the hydrogel matrix.
  • US 5,000,955 also describes polyurethane hydrogels for cosmetic, biological and medical applications. Cubic phases consisting of glyceryl monooleate can immobilize enzymes through non-covalent bonds, as reported in WO 96/39125. The immobilization maintains the enzymatic activity and is even increased over a longer period compared to dissolved enzyme.
  • DE 40 26 153 describes the production of a polyurethane plastic foam, in the pores of which a hydrogel is embedded.
  • Proteolytic enzymes such as trypsin, gelatinase, chyothrypsin and collagenase are bound to the hydrogel consisting of polysaccharides via an activation reaction with CDI or the coupling agent bromocyanine.
  • EP 0 236 610 describes the incorporation (encapsulation) of oxidatively active enzymes such as, for example, glucose oxidase into a urethane prepolymer. The enzyme is activated by contact with serum and produces oxidizing substances such as hydrogen peroxide to fight bacteria in infected wounds.
  • non-immobilized enzymes for wound cleaning are incorporated into a polysaccharide-based wound dressing.
  • Cellulose sponge pieces which are produced by immersion and soaking in an enzyme solution are proposed as enzyme carriers. After contact of the enzyme carrier with the wound, the non-immobilized proteolytically active enzymes are released into the wound.
  • a proteolytic wound dressing as a dry powder or scatter powder in the form of spherical particles from 0.05 to 0.5 mm based on polysaccharides such as dextran, chitin and chitosan, to which a protease is bound, is described in DE 34 44 746.
  • Glutaraldehyde, cyanogen bromide, 2-amino-4.6-dichloro-s-triazine and introduction of isothiocyanate groups with thiophosgene were used to activate the polysaccharide matrix.
  • the principle of moist wound healing can currently be regarded as the state of the art in the treatment of wounds that are difficult or not healing.
  • the wound dressing must absorb most of the exudate and at the same time leave a liquid film on the wound itself, in which the actual moist wound healing takes place.
  • the wound In the case of dry and weakly exuding wounds, the wound must be supplied with sufficient moisture to achieve rehydration of the dehydrated tissue.
  • new blood vessels then proliferate and bacterial growth diminishes with the setting of a suitable pH value.
  • tissue damage factors is generally understood to mean substances or substances which prevent or slow down the healing process of wounds and thus lead to the formation of chronic wounds.
  • Suspended cells present in the wound exudate for example inflammatory cells such as leukocytes and macrophages
  • Cell fragments or dissolved components such as antigens, radicals (such as reactive oxygen species, ROS), ions (such as iron ions), proteins and peptides included.
  • ROS reactive oxygen species
  • the inflammatory phase of wound healing which follows blood clotting and platelet aggregation after injury and trauma, neutrophils and monocytes preferentially migrate into the damaged tissue. There they begin with phagocytosis of germs and the breakdown of destroyed tissue and foreign antigens. Activated and stimulated by chemical messengers and microorganisms, there is a greatly increased production of ROS, also called “oxidative burst”. These ROS are stored in granules and, when further stimulated, are released into the extracellular tissue in high local concentrations to combat microorganisms. In normal wound healing, once the immunological stimuli have been successfully removed, the inflammatory phase ends and tissue reconstruction can begin.
  • the enzyme bound to the polyurethane gels has a high specificity for the substrate present in the wound fluid. This selective removal or elimination of the substrate makes the healing process more chronic, i.e. H. difficult or non-healing wounds improved or initiated.
  • an enzyme-doped PU gel consisting of the enzymes SOD and / or catalase or a mixture of the two enzymes, it is possible to remove ROS selectively from the wound fluid.
  • the enzyme SOD catalyzes the dismutation reaction of reactive superoxide into the less toxic intermediate stages hydrogen peroxide and oxygen. It occurs as a dimeric or tetrameric form.
  • the various enzymes with molecular weights of 32,000 to 56,000 Da have metal ions such as copper and zinc (Cu-Zn-SOD), manganese (Mn-SOD) or iron (Fe-SOD) as co-factors in the catalytic center.
  • the ubiquitous enzyme SOD plays the major role in cellular defense against the oxygen-mediated toxicity of ROS and in regulating the intracellular oxygen concentration (Fridovich, 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 97).
  • the hydrogen peroxide formed by the reaction of the SOD is then converted by the redox enzyme catalase, which is ubiquitous in aerobic organisms, into the non-toxic molecules water and oxygen in a multi-stage catalytic cycle (Gouet et al., 1996, Nature Structural Biology, 3, 951).
  • the enzymes gluthathione peroxidase and myeloperoxidase are also capable of breaking down hydrogen peroxide.
  • the object of the invention is to produce a water-insoluble, water-absorbing polyurethane matrix by a new method, which can be used for medical purposes and are particularly suitable for promoting the healing of chronic wounds.
  • the object is achieved by immobilizing enzymes in the production of the polyurethane matrix which interact with the ROS present in wound fluids from chronic wounds, i.e. with factors that hinder the wound healing process, whereby these additional substances are covalently bound to the PU matrix.
  • the invention describes a method for producing a polyurethane matrix with covalently immobilized biomolecules, the polyurethane matrix being placed in a solvent mixture, the solvent mixture containing at least 80% non-polar solvents (in particular between 80% and 95%) in which the polyurethane matrix does not swell at all or only swells slightly and in which the activation reagent is located, so that the subsequent immobilization of the biomolecule preferably takes place on the surface of the polyurethane matrix or on layers near the surface.
  • the polyurethane matrix is a polyurethane gel or a polyurethane foam or a polyurethane film made therefrom.
  • the essentially water-free and partly self-adhesive PU gel compositions are known, for example, from DE 196 18 825, EP 0 057 839, EP 0 147 588 and DE 43 08 347.
  • the gels described there are composed of polyhydroxy compounds and aromatic or aliphatic polyisocyanates.
  • a polyurethane gel consisting of Levagel (copolymer of propylene oxide and ethylene oxide with a molecular weight of approx.
  • the polyurethane swells to such an extent that it tears even at low mechanical loads.
  • low molecular weight components of the polyurethane gel are removed from the gel matrix.
  • the PU matrix swells strongly, some of the substances can also be immobilized inside the PU matrix and thus have no use for the application.
  • the solvent mixture consists in particular of approximately 80% to 95% of the non-polar solvents and approximately 20% to 5% of the polar to slightly polar organic solvents, in particular 90% of the non-polar solvents and 10% of the polar to slightly polar organic solvents.
  • the polar to slightly polar organic solvents are in particular selected from the group consisting of acetone, ethers, ketones, esters, amides, for example methyl tert-butyl ketone, dioxane, diethyl ether, dimethyl glycol, dichloromethane, ethyl acetate, dimethylformamide.
  • Hexane, heptane and / or petroleum ether are preferably used as non-polar solvents.
  • the polyurethane gel likewise shows only a slight tendency to swell in water, although the general use of water as a solvent for the activation is ruled out because CDI and CDT decompose in water.
  • the activation reagent thiocarbonyldiimidazole (TCDI) can be used to solve this problem.
  • a method for producing a polyurethane matrix with covalently immobilized biomolecules is claimed, the polyurethane matrix being introduced in water as a solvent for the TCDI (approx. 1% by weight) in which the polyurethane matrix does not swell or only swells slightly and in which the activation reagent is located, so that the subsequent immobilization of the biomolecule preferably takes place on the surface of the polyurethane matrix or on layers near the surface.
  • the biomolecule is selected from the group consisting of antibodies, chelators, enzyme inhibitors, enzymes, peptides and other proteins.
  • the polyurethane matrix produced according to the invention can be used particularly advantageously for the production of wound dressings.
  • the biomolecule covalently bound to the polyurethane matrix should interact with interfering factors present in wound exudate that hinder the wound healing process, the interfering factors from the group consisting of suspended cells and cell fragments and dissolved components such as antigens, radicals, ions, proteins, peptides, lipids and free fatty acids are selected, the interaction comprising binding, complexing, chelating the interfering factor or a chemical reaction with the interfering factor and the substances being covalently bound to a carrier material.
  • interfering factors from the group consisting of suspended cells and cell fragments and dissolved components such as antigens, radicals, ions, proteins, peptides, lipids and free fatty acids are selected, the interaction comprising binding, complexing, chelating the interfering factor or a chemical reaction with the interfering factor and the substances being covalently bound to a carrier material.
  • the wound dressing is particularly selected from the group consisting of bandages, gauze, bandages, compresses, wadding, plasters, foils, films, hydrocolloid bandages, gels and the like.
  • the wound dressing should be able to absorb moisture.
  • the interfering factors are preferably iron ions and the substance interacting with the interfering factors is a chelator, which is again selected in particular from the group of immobilizable complexing agents such as desferrioxamine.
  • the interfering factors are reactive oxygen radicals and the substance interacting with the interfering factors is a radical scavenger, this being selected in particular from the group consisting of superoxide dismutase, catalase, gluthathione peroxidase, myeloperoxdase and enzyme mimics or another combination thereof.
  • the interference factor is furthermore preferably a protease and the substance interacting with the interference factor is a protease inhibitor, this in particular from the group consisting of natural proteinogenic protease inhibitors from the class of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases such as, for example, alpha-2-antiplasmin, alpha -2-macroglobulin, alpha-1 antichymotrypsin, soybean trypsin inhibitor and alpha-1 protease inhibitor is selected.
  • a protease inhibitor this in particular from the group consisting of natural proteinogenic protease inhibitors from the class of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases such as, for example, alpha-2-antiplasmin, alpha -2-macroglobulin, alpha-1 antichymotrypsin, soybean trypsin inhibitor and alpha-1 protease inhibitor is selected.
  • the interfering factors can then be iron ions and the substance interfering substance desferrioxamine, alternatively reactive oxygen radicals and the substance interacting with the interfering factors can be a radical scavenger, the radical scavenger from the group consisting of superoxide dismutase, catalase, gluthathione peroxidase, myeloperoxidase and enzyme Mimics or a combination thereof is selected.
  • the interfering factor can be a protease and the substance interacting with the interfering factor can be a protease inhibitor, the protease inhibitor being selected from the group consisting of natural proteinogenic protease inhibitors from the class of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, aprotinin and alpha-2-antiplas - min, alpha-2 macroglobulin, alpha-1 antichymotrypsin, soybean trypsin inhibitor and alpha-1 protease inhibitor is selected.
  • coupling to a PU matrix is also possible via spacer molecules, ie ⁇ , ⁇ -difunctional substances, such as, for example, 1, 6-diaminohexane or 6-aminohexane carboxylic acid.
  • PU gel matrices produced by a novel method are made available for the first time as wound dressings to improve the healing process of chronic wounds.
  • the active biomolecules are also removed when the PU matrix is removed, without remaining in the wound or in the wound fluid.
  • the biomolecules used for the interaction which are covalently integrated into the PU matrix, are therefore only temporarily introduced into the wound and are removed from the wound area after they have performed their intended purpose (i.e. the interactions mentioned above have occurred).
  • the toxic ROS the proteolytic dissolution of dead tissue and the killing of microorganisms, the healing process becomes chronic, i.e. H. difficult or non-healing wounds improved or initiated.
  • a markedly increased protease activity is found in the chronic wound (Weckroth et al., 1996, J. invest. Dermatol., 106, 1119; Grinell & Zhu, 1996, J. Invest. Dermatol. 106, 335) in the Comparison to the acute wound. Enzymes such as SOD and catalase, which have a protective effect on the healing of wounds, would be proteolytically broken down and thus ineffective.
  • a polyurethane gel to which such enzymes are covalently bound acts as a protective shield and can prevent the attack of proteases, as has been shown to be dissolved enzymes modified with polyethylene glycol (JS Beckman et al., 1988, J. Biol. Chem., 14, 6884; Y.
  • polyurethane gels were used, which consisted of a polyol component (Levagel, Bayer, Leverkusen) and a diisocyanate component such as hexamethylene diisocyanate (Bayer, Leverkusen) with an NCO / OH ratio of 0.3 to 0.7.
  • the water was then decanted off and, after washing three times with distilled water, the PU pieces were dried on siliconized release paper.
  • the reaction ran at room temperature for 18 hours, with vigorous stirring.
  • the buffer solution was then poured off.
  • the polyurethane pieces were then washed a total of three times with distilled water in order to remove residues of the uncoupled 6-aminohexanoic acid or of the 1,6-diaminohexane.
  • the pieces of polyurethane coupled with 6-aminocarboxylic acid or 1, 6-diaminohexane were then air-dried to constant weight.
  • the coupling product made of polyurethane and DFO was detected using a color reaction, which is also a functionality assay: complex formation of iron with dissolved DFO results in a 1: 1 ratio of the intensely orange colored DFO-iron-III complex ferrioxamine (Hallaway et al ., 1989, PNAS, 86, 10108).
  • the DFO-coupled polyurethane matrix was incubated for 2-3 hours with 200 ⁇ M iron sulfate (pH 5.0) with gentle stirring, resulting in a brown-red coloration of the polyurethane matrix, which proves the immobilization of DFO. Finally, the polyurethane matrix was washed several times with distilled water to remove unbound iron. After leaving to stand overnight, the color intensified. A control with inactive polyurethane did not lead to staining with iron sulfate solution.
  • the reaction ran at room temperature for 18 hours, with vigorous stirring.
  • the buffer solution was then decanted off and the polyurethane pieces were washed a total of three times in order to detach non-specifically bound protein from the polyurethane matrix, first with a 0.1% aqueous polyoxyethylene sorbitan monolaurate solution (Tween-20) from Fluka (Buchs), then with saturated NaCI solution (Merck, Darmstadt) and finally with distilled water.
  • the dye reacted specifically with primary amino groups of the protein (S. Udenfried et. Al., 1972, Science 178, 871), the hydrolysis products and the dye itself not being fluorescent.
  • the decomposition of the dye and the formation of the fluorescent product took place very quickly in aqueous solution, so that there were no disturbances from side reactions.
  • Proteins immobilized on the polyurethane matrix can be stained with trinitrobenzenesulfonic acid (P. Cuatrecasas, C.B. Anfinsen, Affinity Chromatographie, Methods of Enzymologie, 1971, 22, p.363).
  • 500 ⁇ l of a 5% aqueous TNBS solution were added to a piece of polyurethane with immobilized BSA in 30 ml of distilled water. The solution was heated on the water bath with stirring for one hour. The non-specifically bound dye was then removed from the polyurethane matrix using distilled water. This process was repeated until the wash water remained colorless. It could be shown that the polyurethane matrix coupled with enzyme had an orange coloration of the polyurethane matrix compared to an untreated polyurethane matrix.
  • the enzyme yeast SOD, Dismutin ® BT, (Pentapharm, Basel) was used. Before being used in the coupling reaction with the activated polyurethane matrix, the SOD solution was buffered in order to separate stabilizers such as parabens. For this purpose, 2 ml of the SOD solution were pipetted into a microconcentrator (Amincon, Witten) with an exclusion volume of 10 kDa. The mixture was then centrifuged in a centrifuge (Hettich, model EBA 3S, Tuttlingen) at a speed of 3000 rpm for 30 minutes. The filtrate was discarded and the supernatant made up with 1 ml of the coupling buffer or water. This process was repeated 3 times and then the SOD solution in a concentration of 1.5 mg / ml (1:10 dilution) is used for coupling with the activated polyurethane.
  • the coupling reaction was carried out using 10 identical polyurethane pieces, the activation reactions from Examples 1 being used. Coupling conditions and processing of the products are identical to those described in Example 5 for coupling BSA to a polyurethane matrix.
  • the detection of the coupling of the yeast SOD to the polyurethane matrix was carried out using an ELISA.
  • the SOD-immobilized PU gel matrix with a human anti (Cu / Zn) superoxide dismutase antibody from sheep was diluted 1: 500 at room temperature for one hour in a 24-well - Cell culture plate (Greiner, Frickenhausen) incubated.
  • the substrate tetramethylbenzidine (TMB) was converted by the peroxidase, which resulted in a color reaction that can be quantified by spectroscopy.
  • a 96-well microtiter plate with round bottom (Greiner, Frickenhausen) was coated with 20 ⁇ g / ml yeast SOD Dismutin® BT (Pentapharm, Basel) in 1 ml buffer (50 mM NaHCO 3 , pH 9.4) per well and incubated overnight in the refrigerator at 4 ° C. The non-specific bindings were then blocked with 1 ml per well of 20% pig serum (Gibco, Düsseldorf) for one hour on a shaker at room temperature.
  • the TMB substrate solution was prepared by dissolving (10 mg / mL DMSO) and then adding 70 ⁇ l of TMB stock solution to 10 ml acetate buffer. 1 ml of the TMB solution was added per well and started with 13 ⁇ l H 2 O 2 (3%) and incubated for 20 min at room temperature on the shaker. After 20 min, the resulting color reaction was stopped by adding 140 ⁇ l per well of 2M H 2 SO 4 and determined photometrically at 450 nm with an ELISA reader MR 5000 at a reference of 550 nm.
  • Serum albumin described on an activated polyurethane matrix (Example 5).
  • An ELISA was carried out as evidence of the coupling reaction (see

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Abstract

According to the inventive method for producing a polyurethane matrix with covalently immobilised biomolecules, the polyurethane matrix is presented in a solvent mixture containing an at least 80 % non polar solvent in which the polyurethane matrix does not swell or swells only slightly and in which the activating reagent is contained, so that the subsequent immobilisation of the biomolecule preferably takes place on the surface of the polyurethane matrix or on layers near to the surface.

Description

Beschreibung description
Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisiertenProcess for producing a polyurethane matrix with covalently immobilized
BiomolekülenBiomolecules
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polyurethan-Wundauflagen, an die wundheilungsrelevante Biomoleküle wie zum Beispiel Superoxid-Dismutase immobilisiert sind, mit denen es möglich ist, den normalen Heilungsprozeß einzuleiten beziehungsweise zu fördern. Durch eine temporäre und lokal begrenzte Applikation der wundheilungsfördernden Enzyme werden fehlende oder nicht ausreichend vorhandene Faktoren ausgeglichen und ergänzt.The invention relates to a process for the production of polyurethane wound dressings on which biomolecules relevant to wound healing, such as superoxide dismutase, are immobilized, with which it is possible to initiate or promote the normal healing process. By temporarily and locally limited application of the wound healing promoting enzymes, missing or insufficiently existing factors are compensated for and supplemented.
Die Aktivierung der funktionellen Gruppen zur kovalenten Kopplung von Proteinen, Antikörpern und Enzymen oder niedermolekularen organischen Substanzen über Amino- gruppen sind in Standardwerken wie zum Beispiel W. H. Scouten, Immobilized Enzymes and Cells, in Methods Enzymol., Ed. K. Mosbach, 1987; 135:30 und in Immobilization of Enzymes and Cells, 1997; Ed. G. F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey; H.A. Staab, H. Bauer, K.M. Schneider in Azolides in Organic Synthesis and Biochemi- stry, Wiley-VCH, 1998 ausführlich beschrieben. Als funktionelle Aminogruppen bei Proteinen, Antikörpern und Enzymen können die α-Aminogruppen des Aminoterminus und die ω-Aminogruppen der oberflächenexponierten Aminosäureseitenketten von Lysin und Arginin fungieren. Zur Aktivierung können aber auch andere Reagenzien wie beispiels- weise Carbonylditriazol (CDT) (vergleiche C. Delgado et al. 1992, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249) verwendet werden.The activation of the functional groups for the covalent coupling of proteins, antibodies and enzymes or low molecular weight organic substances via amino groups are described in standard works such as, for example, W. H. Scouten, Immobilized Enzymes and Cells, in Methods Enzymol., Ed. K. Mosbach, 1987; 135: 30 and in Immobilization of Enzymes and Cells, 1997; Ed. G.F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey; HA. Staab, H. Bauer, K.M. Schneider in Azolides in Organic Synthesis and Biochemistry, Wiley-VCH, 1998. The α-amino groups of the amino terminus and the ω-amino groups of the surface-exposed amino acid side chains of lysine and arginine can function as functional amino groups in proteins, antibodies and enzymes. However, other reagents such as carbonylditriazole (CDT) (cf. C. Delgado et al. 1992, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249) can also be used for activation.
Entsprechende Kopplungsverfahren sind als Stand der Technik bekannt und werden zum Beispiel bei der Herstellung von Stoffen für präparative und analytische Anwen- düngen eingesetzt. So ist beispielsweise in der EP 0 087 786 ein Verfahren zur Immobilisierung des Eisen-Chelators Desferrioxamin über Bindung der primären Aminogruppe beschrieben, wobei DFO an Agarose-Polyaldehyd-Gelperlen gebunden wird. Die kovalente Modifizierung von SOD (P. Pyatak et al., 1980, Res. Com. Chem. Path. and Pharmacol., 29, 115), Katalase (A. Abukovski et al., 1976, J. Biol. Chem., 252, 3582) und anderen Enzymen (M. L. Nucci et al., 1991 , Advanced Drug Delivery Reviews, 6, 133) mit Polyethylenglykol durch Kopplung von aktiviertem Polyethylengly- kol an Aminogruppen der Enzyme ist offenbart. Hirano et al. (1994, J. Controlled Release, 28, 203) beschreibt die Herstellung von SOD- Polymerkonjugaten mit aktiviertem Divinylether und Maleionsäureanhydrid. Fortier beschreibt in der WO 95/15352 die kovalente Einbindung von Peroxidase und Katalase über Aminogruppen in ein Polymergel bestehend aus dem Protein BSA und voraktiviertem Polyethylenglykol. Maneke und Polakowski (1981 , J. Chrom, 215, 13) beschreiben die Immobilisierung von α-Chymotrypsin an eine Polymermatrix aus Polyvinylalkohol und Terephthalaldehyd.Corresponding coupling methods are known as prior art and are used, for example, in the manufacture of substances for preparative and analytical applications. fertilize. For example, EP 0 087 786 describes a process for immobilizing the iron chelator desferrioxamine by binding the primary amino group, DFO being bound to agarose-polyaldehyde gel beads. The covalent modification of SOD (P. Pyatak et al., 1980, Res. Com. Chem. Path. And Pharmacol., 29, 115), catalase (A. Abukovski et al., 1976, J. Biol. Chem., 252, 3582) and other enzymes (ML Nucci et al., 1991, Advanced Drug Delivery Reviews, 6, 133) with polyethylene glycol by coupling activated polyethylene glycol to amino groups of the enzymes is disclosed. Hirano et al. (1994, J. Controlled Release, 28, 203) describes the preparation of SOD polymer conjugates with activated divinyl ether and maleionic anhydride. Fortier describes in WO 95/15352 the covalent incorporation of peroxidase and catalase via amino groups into a polymer gel consisting of the protein BSA and preactivated polyethylene glycol. Maneke and Polakowski (1981, J. Chrom, 215, 13) describe the immobilization of α-chymotrypsin on a polymer matrix made of polyvinyl alcohol and terephthalaldehyde.
In der WO 98/02189 wird eine Methode zur Kopplung von wundheilungsrelevanten Enzymen oder Proteinen an Polyhydroxypolymere wie beispielsweise Cellulose beschrieben. Dabei wird das Aufquellen eines Polyhydroxypolymers in organischen Lösungsmitteln beansprucht.WO 98/02189 describes a method for coupling enzymes or proteins relevant to wound healing to polyhydroxy polymers such as cellulose. The swelling of a polyhydroxy polymer in organic solvents is claimed.
Polyurethangele zählen ebenfalls zu den Polyhydroxyverbindungen, haben aber beispielsweise gegenüber Cellulose den Nachteil, daß sie unter den bekannten Bedingungen zur Aktivierung der Hydroxygruppen stark quellen.Polyurethane gels also belong to the group of polyhydroxy compounds, but have the disadvantage compared to cellulose, for example, that they swell strongly under the known conditions for activating the hydroxy groups.
In WO 96/31551 werden im trockenen Zustand Proteine oder Peptide als aktive Agen- tien zu Polyurethan-vemetzten Microgelen gemischt. Die Microgele quellen im wäßrigen Medium zu Hydrogelen auf und setzen aus der Hydrogelmatrix das Protein beziehungsweise das Peptid wieder frei. Auch US 5,000,955 beschreibt Polyurethan-Hydrogele für kosmetische, biologische und medizinische Anwendungen. Kubische Phasen bestehend aus Glycerylmonooleat können Enzyme durch nicht-kovalente Bindungen, wie in WO 96/39125 berichtet, immobilisieren. Dabei bleibt durch die Immobilisierung die enzymati- sche Aktivität erhalten und ist sogar, im Vergleich zu gelöstem Enzym, über einen längeren Zeitraum erhöht. DE 40 26 153 beschreibt die Herstellung eines Polyurethan-Kunststoffschaums, in dessen Poren ein Hydrogel eingelagert ist. An das aus Polysacchariden bestehende Hydro- gel werden proteolytisch wirkende Enzyme wie zum Beispiel Trypsin, Gelatinase, Chy- motrypsin und Kollagenase über eine Aktivierungsreaktion mit CDI oder dem Kopplungsreagenz Bromcyan gebunden. EP 0 236 610 beschreibt die Einarbeitung (Inkapsulie- rung) von oxidativ wirkenden Enzymen wie zum Beispiel Glucoseoxidase in ein Urethanpräpolymer. Das Enzym wird durch Kontakt mit Serum aktiviert und produziert oxidierend wirkende Substanzen wie Wasserstoffperoxid zur Bekämpfung von Bakterien in infizierten Wunden.In WO 96/31551, proteins or peptides are mixed as active agents to form polyurethane-crosslinked microgels in the dry state. The microgels swell to form hydrogels in the aqueous medium and release the protein or peptide from the hydrogel matrix. US 5,000,955 also describes polyurethane hydrogels for cosmetic, biological and medical applications. Cubic phases consisting of glyceryl monooleate can immobilize enzymes through non-covalent bonds, as reported in WO 96/39125. The immobilization maintains the enzymatic activity and is even increased over a longer period compared to dissolved enzyme. DE 40 26 153 describes the production of a polyurethane plastic foam, in the pores of which a hydrogel is embedded. Proteolytic enzymes such as trypsin, gelatinase, chyothrypsin and collagenase are bound to the hydrogel consisting of polysaccharides via an activation reaction with CDI or the coupling agent bromocyanine. EP 0 236 610 describes the incorporation (encapsulation) of oxidatively active enzymes such as, for example, glucose oxidase into a urethane prepolymer. The enzyme is activated by contact with serum and produces oxidizing substances such as hydrogen peroxide to fight bacteria in infected wounds.
Nach DE 36 06 265 werden therapeutisch wirksame nicht-immobilisierte Enzyme zur Wundreinigung in eine Wundauflage auf Polysaccharidbasis eingearbeitet. Als Enzymträger werden Cellulose-Schwammstücke vorgeschlagen, die durch Tauchen und Trän- ken in eine Enzymiösung hergestellt werden. Nach Kontakt des Enzymträgers mit der Wunde werden die nicht-immobilisierten proteolytisch wirkenden Enzyme in die Wunde abgegeben.According to DE 36 06 265, therapeutically effective non-immobilized enzymes for wound cleaning are incorporated into a polysaccharide-based wound dressing. Cellulose sponge pieces which are produced by immersion and soaking in an enzyme solution are proposed as enzyme carriers. After contact of the enzyme carrier with the wound, the non-immobilized proteolytically active enzymes are released into the wound.
Ein proteoiytischer Wundverband als Trockenpuder oder Streupulver in Form von sphärischen Teilchen von 0,05 bis 0,5 mm auf Basis von Polysaccariden wie Dextran, Chitin und Chitosan, an denen eine Protease gebunden ist, wird in DE 34 44 746 beschrieben. Zur Aktivierung der Polysaccharidmatrix wurden Glutaraldehyd, Bromcyan, 2-Amino-4.6-dichlor-s-triazin und Einführen von Isothiocyanatgruppen mit Thiophosgen eingesetzt.A proteolytic wound dressing as a dry powder or scatter powder in the form of spherical particles from 0.05 to 0.5 mm based on polysaccharides such as dextran, chitin and chitosan, to which a protease is bound, is described in DE 34 44 746. Glutaraldehyde, cyanogen bromide, 2-amino-4.6-dichloro-s-triazine and introduction of isothiocyanate groups with thiophosgene were used to activate the polysaccharide matrix.
Seit Menschengedenken ist die Heilung von therapieresistenten Wunden eine große Herausforderung für die Medizin und Naturwissenschaften. Die heutigen Anforderungen an die Funktion von interaktiven Wundauflagen für chronische Wunden gehen zurück auf G. Winter (1962, Nature 193, 293) und sind jüngst von T. D. Turner neu formuliert worden (1994, Wound Rep. Reg. 2, 202). Im Vordergrund steht dabei die Schaffung eines feuchten Wundheilungsmilieus, das im Gegensatz zur traditionellen trockenen Wundbehandlung mit zum Beispiel Mullkompressen den natürlichen Abläufen der Wundheilung physiologische und damit bessere Konditionen bietet.Since time immemorial, healing therapy-resistant wounds has been a major challenge for medicine and the natural sciences. The current requirements for the function of interactive wound dressings for chronic wounds go back to G. Winter (1962, Nature 193, 293) and have recently been reformulated by TD Turner (1994, Wound Rep. Reg. 2, 202). In the foreground is the creation of a moist wound healing environment, which is in contrast to the traditional dry Wound treatment with, for example, gauze compresses offers the natural processes of wound healing physiological and therefore better conditions.
Das Prinzip der feuchten Wundheilung kann derzeit als der Stand der Technik in der Therapie schwer oder nicht heilender Wunden angesehen werden. Die Wundauflage muß die Hauptmenge des Exsudates aufnehmen und gleichzeitig aber auf der Wunde selbst einen Flüssigkeitsfilm belassen, in dem die eigentliche feuchte Wundheilung stattfindet. Bei trockenen und schwachexsudierenden Wunden muß die Versorgung der Wunde mit ausreichend Feuchtigkeit erfolgen um eine Rehydrierung des dehydrierten Gewebes zu erreichen. In der auf diese Weise etablierten feuchten Wunde kommt es dann zur Proliferation von neuen Blutgefäßen und vermindertem Bakterienwachstum unter Einstellung eines geeigneten pH-Wertes. Erfüllt werden diese Anforderungen von Strukturen, wie beispielsweise Hydrogelen, Alginaten und Superabsorber enthaltenden Wundauflagen die einen Überschuß von Wundexsudat aufnehmen können.The principle of moist wound healing can currently be regarded as the state of the art in the treatment of wounds that are difficult or not healing. The wound dressing must absorb most of the exudate and at the same time leave a liquid film on the wound itself, in which the actual moist wound healing takes place. In the case of dry and weakly exuding wounds, the wound must be supplied with sufficient moisture to achieve rehydration of the dehydrated tissue. In the moist wound established in this way, new blood vessels then proliferate and bacterial growth diminishes with the setting of a suitable pH value. These requirements are met by structures such as hydrogels, alginates and superabsorbent-containing wound dressings that can absorb excess wound exudate.
Unter dem Begriff „Störfaktoren" werden allgemein Stoffe oder Substanzen verstanden, die den Heilungsprozeß von Wunden verhindern oder verlangsamen und damit zur Ausbildung von chronischen Wunden führen. Dabei sind im Wundexsudat vor- handene suspendierte Zellen (zum Beispiel entzündliche Zellen wie Leukozyten und Makrophagen) und Zellfragmente oder gelöste Bestandteile wie Antigene, Radikale (wie zum Beispiel reaktive Sauerstoffspezies, ROS), Ionen (wie zum Beispiel Eisen- Ionen), Proteine und Peptide eingeschlossen.The term “disruptive factors” is generally understood to mean substances or substances which prevent or slow down the healing process of wounds and thus lead to the formation of chronic wounds. Suspended cells present in the wound exudate (for example inflammatory cells such as leukocytes and macrophages) and Cell fragments or dissolved components such as antigens, radicals (such as reactive oxygen species, ROS), ions (such as iron ions), proteins and peptides included.
In der entzündlichen Phase der Wundheilung, die der Blutgerinnung und Blutplättchen- Aggregation nach Verletzung und Trauma folgt, wandern bevorzugt Neutrophile und Monozyten in das geschädigte Gewebe ein. Dort beginnen sie mit der Phagozytose von Keimen und dem Abbau von zerstörtem Gewebe und fremden Antigenen. Durch chemische Botenstoffe und Mikroorganismen aktiviert und stimuliert, kommt es zu einer stark erhöhten Produktion von ROS, auch „oxidative burst" genannt. Diese ROS werden in Granula gespeichert und bei weiterer Stimulierung in hohen lokalen Konzentrationen in das extrazelluläre Gewebe zur Bekämpfung von Mikroorganismen freigegeben. In der normal verlaufenden Wundheilung kommt es nach erfolgreicher Beseitigung der immunologischen Reize zur Beendigung der entzündlichen Phase, und der Wiederaufbau des Gewebes kann beginnen. Bleiben jedoch diese Reize bestehen, wandern weitere Leukozyten in das Gewebe nach und werden wiederum aktiviert, was zu einer dau- erhaft entzündeten oder chronischen Wunde führt. Die Ausschüttung von ROS (O. Senel et al., 1997, Annais of Plastic Surgery, 39, 516) und proteolytischen Enzymen führt zu einer Schädigung des Gewebes (Halliwell & Gutteridge, 1989, Free Radicals in Biology and Medicine, 2. Auflage, Clarendon Press, Oxford).In the inflammatory phase of wound healing, which follows blood clotting and platelet aggregation after injury and trauma, neutrophils and monocytes preferentially migrate into the damaged tissue. There they begin with phagocytosis of germs and the breakdown of destroyed tissue and foreign antigens. Activated and stimulated by chemical messengers and microorganisms, there is a greatly increased production of ROS, also called “oxidative burst”. These ROS are stored in granules and, when further stimulated, are released into the extracellular tissue in high local concentrations to combat microorganisms. In normal wound healing, once the immunological stimuli have been successfully removed, the inflammatory phase ends and tissue reconstruction can begin. However, if these stimuli persist, further leukocytes migrate into the tissue and are activated again, which leads to a permanently inflamed or chronic wound. The release of ROS (O. Senel et al., 1997, Annais of Plastic Surgery, 39, 516) and proteolytic enzymes leads to tissue damage (Halliwell & Gutteridge, 1989, Free Radicals in Biology and Medicine, 2nd edition, Clarendon Press, Oxford).
Es ist erforderlich, daß das an die Polyurethangele (PU-Gele) gebundene Enzym eine hohe Spezifität für das in der Wundflüssigkeit vorhandene Substrat besitzt. Durch diese selektive Entfernung beziehungsweise Eliminierung des Substrats wird der Heilungsprozeß chronischer, d. h. schwer oder nicht heilender Wunden verbessert beziehungsweise eingeleitet.It is necessary that the enzyme bound to the polyurethane gels (PU gels) has a high specificity for the substrate present in the wound fluid. This selective removal or elimination of the substrate makes the healing process more chronic, i.e. H. difficult or non-healing wounds improved or initiated.
Im Falle eines enzymdotierten PU-Gels, das aus den Enzymen SOD und/oder Katalase oder aus einer Mischung der beiden Enzyme besteht, ist ein selektives Entfernen von ROS aus der Wundflüssigkeit möglich. Das Enzym SOD katalysiert die Dismutationsreaktion von reaktivem Superoxid in die weniger toxischen Zwischenstufen Wasserstoffperoxid und Sauerstoff. Es tritt als dimere oder tetramere Form auf. Die verschiedenen Enzyme mit Molekulargewichten von 32.000 bis 56.000 Da haben Metall-Ionen wie Kupfer und Zink (Cu-Zn-SOD), Mangan (Mn-SOD) oder Eisen (Fe-SOD) als Co-Faktoren im katalytischen Zentrum. Das ubiquitäre Enzym SOD spielt die Hauptrolle in der zellulären Verteidigung gegen die sauerstoffvermittelte Toxizität von ROS und bei der Regulierung der intrazellulären Sauerstoffkonzentration (Fridovich, 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 97). Das durch die Reaktion der SOD gebildete Wasserstoffperoxid wird anschließend durch das in aeroben Organismen ubiquitäre Redoxenzym Katalase in einem mehrstufigen katalytischen Zyklus in die nichttoxischen Moleküle Wasser und Sauerstoff umge- wandelt (Gouet et al., 1996, Nature Structural Biology, 3, 951). Außer Katalase sind auch die Enzyme Gluthathion-Peroxidase und Myeloperoxidase befähigt, Wasserstoffperoxid abzubauen. Aufgabe der Erfindung ist es, eine wasserunlösliche, wasseraufnehmende Polyurethanmatrix nach einem neuen Verfahren zu fertigen, die für medizinische Zwecke einsetzbar sind und sich in besonderem Maße zur Förderung der Heilung von chronischen Wunden eignen.In the case of an enzyme-doped PU gel consisting of the enzymes SOD and / or catalase or a mixture of the two enzymes, it is possible to remove ROS selectively from the wound fluid. The enzyme SOD catalyzes the dismutation reaction of reactive superoxide into the less toxic intermediate stages hydrogen peroxide and oxygen. It occurs as a dimeric or tetrameric form. The various enzymes with molecular weights of 32,000 to 56,000 Da have metal ions such as copper and zinc (Cu-Zn-SOD), manganese (Mn-SOD) or iron (Fe-SOD) as co-factors in the catalytic center. The ubiquitous enzyme SOD plays the major role in cellular defense against the oxygen-mediated toxicity of ROS and in regulating the intracellular oxygen concentration (Fridovich, 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 97). The hydrogen peroxide formed by the reaction of the SOD is then converted by the redox enzyme catalase, which is ubiquitous in aerobic organisms, into the non-toxic molecules water and oxygen in a multi-stage catalytic cycle (Gouet et al., 1996, Nature Structural Biology, 3, 951). In addition to catalase, the enzymes gluthathione peroxidase and myeloperoxidase are also capable of breaking down hydrogen peroxide. The object of the invention is to produce a water-insoluble, water-absorbing polyurethane matrix by a new method, which can be used for medical purposes and are particularly suitable for promoting the healing of chronic wounds.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man bei der Herstellung der Polyurethanmatrix Enzyme immobilisiert, die mit den in Wundflüssigkeiten von chronischen Wunden vorhandenen ROS wechselwirken, d.h. mit Faktoren, die den Wundheilungsprozess behindern, wobei man diese zusätzlichen Substanzen kova- lent an die PU-Matrix bindet.According to the invention, the object is achieved by immobilizing enzymes in the production of the polyurethane matrix which interact with the ROS present in wound fluids from chronic wounds, i.e. with factors that hinder the wound healing process, whereby these additional substances are covalently bound to the PU matrix.
Dementsprechend beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen, wobei die Polyurethan- matrix in einem Lösungsmittelgemisch vorgelegt wird, wobei das Lösungsmittelgemisch zumindest zu 80% unpolare Lösungsmittel enthält (insbesondere zwischen 80% und 95%), in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Aktivierungsreagenz befindet, so daß die anschließende Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Polyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet.Accordingly, the invention describes a method for producing a polyurethane matrix with covalently immobilized biomolecules, the polyurethane matrix being placed in a solvent mixture, the solvent mixture containing at least 80% non-polar solvents (in particular between 80% and 95%) in which the polyurethane matrix does not swell at all or only swells slightly and in which the activation reagent is located, so that the subsequent immobilization of the biomolecule preferably takes place on the surface of the polyurethane matrix or on layers near the surface.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform ist die Polyurethanmatrix ein Polyurethangel oder ein daraus hergestellter Polyurethanschaum oder eine daraus hergestellte Polyurethan-Folie. Die im wesentlichen wasserfreien und zum Teil selbstklebenden PU-Gelmassen sind zum Beispiel bekannt aus DE 196 18 825, EP 0 057 839, EP 0 147 588 sowie DE 43 08 347. Die dort beschriebenen Gele setzen sich zusammen aus Polyhydroxyverbin- dungen und aromatischen oder aliphatischen Polyisocyanaten. Bevorzugt wird ein Polyurethangel bestehend aus Levagel (Copolymer aus Propylenoxid und Ethylen- oxid mit einem Molekulargewicht von ca. 6400 g/mol, Bayer, Leverkusen) und Hexa- methylendiisocyanat mit einem NCO/OH-Verhältnis von 0,3 bis 0,7 verwendet. Da nicht alle OH-Funktionalitäten während der Vernetzungsreaktion abreagieren, stehen für die kovalente Kopplung an eine PU-Matrix zur Immobilisierung von Substanzen in der hier beschriebenen Art und Weise freie OH-Funktionalitäten zur Verfügung. Für den Einsatz der erfindungsgemäßen Polyurethanprodukte als Wundauflage ist es von Vorteil, wenn die immobilisierten Substanzen direkt an der PU-Oberfläche angebunden sind. Für die Aktivierungsreaktion sind Lösungsmittel erforderlich, die das Aktivierungsreagenz lösen. In Aceton, Dioxan, Diethylether, Dimethylglycol oder Dichlormethan sowie Alkoholen und in Mischungen der genannten Lösungsmittel quillt das Polyurethan so stark, daß es bereits bei geringen mechanischen Belastungen zerreißt. Außerdem werden niedermolekulare Bestandteile des Polyurethangels aus der Gelmatrix herausgelöst. Dadurch gehen einerseits gerade die Bestandteile verloren, die über viele freie OH-Gruppen für die Aktivierung und Kopplung verfügen und andererseits werden die mechanischen Eigenschaften des Polyurethangels verändert. Des weiteren können bei einer starken Quellung der PU-Matrix die Substanzen zum Teil auch im Inneren der PU-Matrix immobilisiert werden und haben damit für die Anwendung keinen Nutzen.In a first preferred embodiment, the polyurethane matrix is a polyurethane gel or a polyurethane foam or a polyurethane film made therefrom. The essentially water-free and partly self-adhesive PU gel compositions are known, for example, from DE 196 18 825, EP 0 057 839, EP 0 147 588 and DE 43 08 347. The gels described there are composed of polyhydroxy compounds and aromatic or aliphatic polyisocyanates. A polyurethane gel consisting of Levagel (copolymer of propylene oxide and ethylene oxide with a molecular weight of approx. 6400 g / mol, Bayer, Leverkusen) and hexamethylene diisocyanate with an NCO / OH ratio of 0.3 to 0.7 is preferably used . Since not all OH functionalities react during the crosslinking reaction, free OH functionalities are available for covalent coupling to a PU matrix for the immobilization of substances in the manner described here. For the use of the polyurethane products according to the invention as a wound dressing, it is advantageous if the immobilized substances are bound directly to the PU surface. Solvents that dissolve the activation reagent are required for the activation reaction. In acetone, dioxane, diethyl ether, dimethyl glycol or dichloromethane, as well as alcohols and in mixtures of the solvents mentioned, the polyurethane swells to such an extent that it tears even at low mechanical loads. In addition, low molecular weight components of the polyurethane gel are removed from the gel matrix. On the one hand, this means that the components that have many free OH groups for activation and coupling are lost, and on the other hand the mechanical properties of the polyurethane gel are changed. Furthermore, if the PU matrix swells strongly, some of the substances can also be immobilized inside the PU matrix and thus have no use for the application.
Das Lösungsmittelgemisch besteht insbesondere aus ungefähr 80% bis 95% der unpolaren Lösungsmittel und aus ungefähr 20% bis 5% der polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel, insbesondere aus 90% der unpolaren Lösungsmittel und 10% der polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel. Die polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel sind insbesondere gewählt aus der Gruppe Aceton, Ether, Ketone, Ester, Amide, beispielsweise Methyl-tert.butylketon, Dioxan, Diethylether, Dimethylglycol, Dichlormethan, Ethylacetat, Dimethylformamid. Als unpolare Lösungsmittel kommen vorzugsweise Hexan, Heptan und/oder Petrolether (zum Beispiel Petrolether 35/60) zum Einsatz. In unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan, Heptan oder Petrolether findet kaum eine Quellung der Polyurethanmatrix statt. In diesen Lösungsmitteln sind die Aktivierungsreagenzien, wie zum Beispiel CDI oder CDT nahezu unlöslich. Bei der Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus 80% bis 95% der unpolaren Lösungsmittel, wie Hexan, Heptan oder Petrolether, und 20% bis 5% der polaren bis leicht polaren organi- sehen Lösungsmittel werden die Quellung und damit die genannten Nachteile stark unterdrückt, und es kann sich dennoch genug Aktivierungsreagenz lösen. In Wasser zeigt das Polyurethangel ebenfalls eine nur geringe Quellneigung, wobei die generelle Verwendung von Wasser als Lösungsmittel für die Aktivierung jedoch deshalb ausscheidet, weil sich CDI und CDT in Wasser zersetzen. Zur Lösung diese Problems kann als Alternative das Aktivierungsreagenz Thiocarbonyldiimidazol (TCDI) eingesetzt werden.The solvent mixture consists in particular of approximately 80% to 95% of the non-polar solvents and approximately 20% to 5% of the polar to slightly polar organic solvents, in particular 90% of the non-polar solvents and 10% of the polar to slightly polar organic solvents. The polar to slightly polar organic solvents are in particular selected from the group consisting of acetone, ethers, ketones, esters, amides, for example methyl tert-butyl ketone, dioxane, diethyl ether, dimethyl glycol, dichloromethane, ethyl acetate, dimethylformamide. Hexane, heptane and / or petroleum ether (for example petroleum ether 35/60) are preferably used as non-polar solvents. There is hardly any swelling of the polyurethane matrix in non-polar solvents such as hexane, heptane or petroleum ether. The activation reagents, such as CDI or CDT, are almost insoluble in these solvents. When using a solvent mixture of 80% to 95% of the non-polar solvents, such as hexane, heptane or petroleum ether, and 20% to 5% of the polar to slightly polar organic solvents, the swelling and thus the disadvantages mentioned are strongly suppressed, and it can still release enough activation reagent. The polyurethane gel likewise shows only a slight tendency to swell in water, although the general use of water as a solvent for the activation is ruled out because CDI and CDT decompose in water. As an alternative, the activation reagent thiocarbonyldiimidazole (TCDI) can be used to solve this problem.
In dieser alternativen Lösungsmöglichkeit wird ein Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen beansprucht, wobei die Polyurethanmatrix in Wasser als Lösungsmittel für das TCDI (ca. 1 Gew.-%) vorgelegt wird, in dem die Poiyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Akti- vierungsreagenz befindet, so daß die anschließende Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Polyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet.In this alternative solution, a method for producing a polyurethane matrix with covalently immobilized biomolecules is claimed, the polyurethane matrix being introduced in water as a solvent for the TCDI (approx. 1% by weight) in which the polyurethane matrix does not swell or only swells slightly and in which the activation reagent is located, so that the subsequent immobilization of the biomolecule preferably takes place on the surface of the polyurethane matrix or on layers near the surface.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante ist das Biomolekül aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Chelatoren, Enzyminhibitoren, Enzymen, Peptiden und anderen Proteinen ausgewählt.In a further preferred embodiment variant, the biomolecule is selected from the group consisting of antibodies, chelators, enzyme inhibitors, enzymes, peptides and other proteins.
Besonders vorteilhaft läßt sich die erfindungsgemäß hergestellte Polyurethanmatrix zur Herstellung von Wundauflagen einsetzen.The polyurethane matrix produced according to the invention can be used particularly advantageously for the production of wound dressings.
Das an die Polyurethanmatrix kovalent gebundene Biomolekül sollte mit in Wundexsudat vorhandenen Störfaktoren, die den Wundheilungsprozeß behindern, wechselwirken, wobei die Störfaktoren aus der Gruppe bestehend aus suspendierten Zellen und Zellfragmenten sowie gelösten Bestandteilen wie Antigene, Radikale, Ionen, Proteine, Pep- tide, Lipide und freie Fettsäuren ausgewählt sind, wobei die Wechselwirkung ein Binden, Komplexieren, Chelatisieren des Störfaktors oder eine chemische Reaktion mit dem Störfaktor umfaßt und wobei die Substanzen kovalent an ein Trägermaterial gebunden sind.The biomolecule covalently bound to the polyurethane matrix should interact with interfering factors present in wound exudate that hinder the wound healing process, the interfering factors from the group consisting of suspended cells and cell fragments and dissolved components such as antigens, radicals, ions, proteins, peptides, lipids and free fatty acids are selected, the interaction comprising binding, complexing, chelating the interfering factor or a chemical reaction with the interfering factor and the substances being covalently bound to a carrier material.
Beispielsweise ist es möglich, mit den enzymimmobilisierten Polyurethangelen toxische ROS in der Wundflüssigkeit von chronischen Wunden unschädlich zu machen. Die Wundauflage ist besonders aus der Gruppe bestehend aus Verbänden, Verbandmull, Binden, Kompressen, Watten, Pflastern, Folien, Filmen, Hydrokolloidverbänden, Gelen und dergleichen ausgewählt.For example, it is possible to use the enzyme-immobilized polyurethane gels to render toxic ROS in the wound fluid harmless from chronic wounds. The wound dressing is particularly selected from the group consisting of bandages, gauze, bandages, compresses, wadding, plasters, foils, films, hydrocolloid bandages, gels and the like.
Schließlich sollte die Wundauflage in der Lage sein, Feuchtigkeit aufzunehmen.Finally, the wound dressing should be able to absorb moisture.
Vorzugsweise sind die Störfaktoren Eisenionen und die mit den Störfaktoren wechselwirkende Substanz ein Chelator, wobei dieser nun wieder insbesondere aus der Gruppe von immobilisierbaren Komplexbildnern wie zum Beispiel Desferrioxamin ausgewählt ist.The interfering factors are preferably iron ions and the substance interacting with the interfering factors is a chelator, which is again selected in particular from the group of immobilizable complexing agents such as desferrioxamine.
Weiter vorzugsweise sind die Störfaktoren reaktive Sauerstoffradikale und die mit den Störfaktoren wechselwirkende Substanz ein Radikalfänger, wobei dieser insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Superoxiddismutase, Katalase, Gluthathion-Peroxidase, Myeloperoxdase und Enzym-Mimics oder einer anderen Kombination davon ausgewählt ist.More preferably, the interfering factors are reactive oxygen radicals and the substance interacting with the interfering factors is a radical scavenger, this being selected in particular from the group consisting of superoxide dismutase, catalase, gluthathione peroxidase, myeloperoxdase and enzyme mimics or another combination thereof.
Weiter vorzugsweise sind der Störfaktor eine Protease und die mit dem Störfaktor wechselwirkende Substanz ein Protease-Inhibitor, wobei dieser insbesondere aus der Gruppe bestehend aus natürlichen proteinogenen Protease-Inhibitoren aus der Klasse der tissue Inhibitors of Matrixmetalloproteinases wie zum Beispiel Alpha-2-Antiplasmin, Alpha-2-Makroglobulin, Alpha-1-Antichymotrypsin, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Alpha-1 -Protease-Inhibitor ausgewählt ist.The interference factor is furthermore preferably a protease and the substance interacting with the interference factor is a protease inhibitor, this in particular from the group consisting of natural proteinogenic protease inhibitors from the class of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases such as, for example, alpha-2-antiplasmin, alpha -2-macroglobulin, alpha-1 antichymotrypsin, soybean trypsin inhibitor and alpha-1 protease inhibitor is selected.
Dann können die Störfaktoren Eisenionen sein und die mit den Störfaktoren wechselwir- kende Substanz Desferrioxamin, alternativ reaktive Sauerstoffradikale und die mit den Störfaktoren wechselwirkende Substanz ein Radikalfänger, wobei der Radikalfänger aus der Gruppe bestehend aus Superoxiddismutase, Katalase, Gluthathion-Peroxidase, Myeloperoxidase und Enzym-Mimics oder einer Kombination davon ausgewählt ist.The interfering factors can then be iron ions and the substance interfering substance desferrioxamine, alternatively reactive oxygen radicals and the substance interacting with the interfering factors can be a radical scavenger, the radical scavenger from the group consisting of superoxide dismutase, catalase, gluthathione peroxidase, myeloperoxidase and enzyme Mimics or a combination thereof is selected.
Weiterhin kann der Störfaktor eine Protease sein und die mit dem Störfaktor wechselwirkende Substanz ein Protease-Inhibitor, wobei der Protease-Inhibitor aus der Gruppe bestehend aus natürlichen proteinogenen Protease-Inhibitoren aus der Klasse der Tissue Inhibitors of Matrixmetalloproteinases, Aprotinin, Alpha-2-Antiplas- min, Alpha-2-Makroglobulin, Alpha-1-Antichymotrypsin, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Alpha-1-Protease Inhibitor ausgewählt ist.Furthermore, the interfering factor can be a protease and the substance interacting with the interfering factor can be a protease inhibitor, the protease inhibitor being selected from the group consisting of natural proteinogenic protease inhibitors from the class of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, aprotinin and alpha-2-antiplas - min, alpha-2 macroglobulin, alpha-1 antichymotrypsin, soybean trypsin inhibitor and alpha-1 protease inhibitor is selected.
Weiterhin wird erfindungsgemäß beschrieben, daß eine Kopplung auch über Spacer- moleküle, das sind α,ω-difunktionelle Substanzen, wie beispielsweise 1 ,6-Diaminohexan oder 6-Aminohexancarbonsäure, an eine PU-Matrix möglich ist.Furthermore, it is described according to the invention that coupling to a PU matrix is also possible via spacer molecules, ie α, ω-difunctional substances, such as, for example, 1, 6-diaminohexane or 6-aminohexane carboxylic acid.
Durch die vorliegende Erfindung werden erstmals nach einem neuartigen Verfahren hergestellte PU-Gelmatrices als Wundauflage zur Verbesserung des Heilungsverlaufs von chronischen Wunden zur Verfügung gestellt.By means of the present invention, PU gel matrices produced by a novel method are made available for the first time as wound dressings to improve the healing process of chronic wounds.
Die aktiven Biomoleküle werden beim Entfernen der PU-Matrix ebenfalls mit entfernt, ohne daß sie in der Wunde beziehungsweise in der Wundflüssigkeit verbleiben. Die zur Wechselwirkung verwendeten, kovalent in die PU-Matrix eingebundenen Biomoleküle werden somit nur vorübergehend in die Wunde eingebracht und werden, nachdem sie ihre bestimmungsgemäße Aufgabe verrichtet haben (d. h., die oben genannten Wechselwirkungen eingegangen sind), wieder aus dem Wundbereich entfernt. Durch die selektive Beseitigung beziehungsweise Eliminierung der toxischen ROS, das proteolytische Auflösen von totem Gewebe und das Abtöten von Mikroorganismen wird der Heilungsprozeß chronischer, d. h. schwer oder nicht heilender Wunden verbessert beziehungsweise eingeleitet.The active biomolecules are also removed when the PU matrix is removed, without remaining in the wound or in the wound fluid. The biomolecules used for the interaction, which are covalently integrated into the PU matrix, are therefore only temporarily introduced into the wound and are removed from the wound area after they have performed their intended purpose (i.e. the interactions mentioned above have occurred). Through the selective removal or elimination of the toxic ROS, the proteolytic dissolution of dead tissue and the killing of microorganisms, the healing process becomes chronic, i.e. H. difficult or non-healing wounds improved or initiated.
In der chronischen Wunde findet man eine deutlich erhöhte Proteaseaktivität (Weck- roth et al., 1996, J. invest. Dermatol., 106, 1119; Grinell & Zhu, 1996, J. Invest. Der- matol. 106, 335) im Vergleich zur akuten Wunde. Enzyme wie zum Beispiel SOD und Katalase, die durch ihre schützende Wirkung wundheiiungsfördernd wirken, würden dadurch proteolytisch abgebaut und somit unwirksam. Ein Polyurethangel, an das solche Enzyme kovalent gebunden sind, wirkt als Schutzschild und kann den Angriff von Proteasen verhindern, wie mit Polyethylenglykol modifizierten gelösten Enzymen gezeigt wurde (J. S. Beckman et al., 1988, J. Biol. Chem., 14, 6884; Y. Inada et al., 1995, Tibtech, 13, 86). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es somit nicht nur, möglichst ein feuchtes Wundmilieu zu generieren, um den Heilungsprozeß chronischer Wunden zu verbessern, sondern der Heilungsprozeß kann auch erfindungsgemäß dadurch weiter beschleunigt werden, zum Beispiel durch die oben genannten Umwandlungspro- zesse.A markedly increased protease activity is found in the chronic wound (Weckroth et al., 1996, J. invest. Dermatol., 106, 1119; Grinell & Zhu, 1996, J. Invest. Dermatol. 106, 335) in the Comparison to the acute wound. Enzymes such as SOD and catalase, which have a protective effect on the healing of wounds, would be proteolytically broken down and thus ineffective. A polyurethane gel to which such enzymes are covalently bound acts as a protective shield and can prevent the attack of proteases, as has been shown to be dissolved enzymes modified with polyethylene glycol (JS Beckman et al., 1988, J. Biol. Chem., 14, 6884; Y. Inada et al., 1995, Tibtech, 13, 86). It is therefore not only within the scope of the present invention to generate as moist a wound environment as possible in order to improve the healing process of chronic wounds, but the healing process can also be accelerated further according to the invention, for example by the above-mentioned conversion processes.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert, ohne diese damit unnötig einschränken zu wollen.The present invention is explained below using examples, without wishing to restrict them unnecessarily.
BeispieleExamples
Für die folgenden Beispiele wurden Polyurethangele eingesetzt, die aus einer Polyol- komponente (Levagel, Bayer, Leverkusen) und einer Diisocyanatkomponente wie beispielsweise Hexamethylendiisocyanat (Bayer, Leverkusen) mit einem NCO/OH- Verhältnis von 0,3 bis 0,7 bestanden.For the following examples, polyurethane gels were used, which consisted of a polyol component (Levagel, Bayer, Leverkusen) and a diisocyanate component such as hexamethylene diisocyanate (Bayer, Leverkusen) with an NCO / OH ratio of 0.3 to 0.7.
Beispiel 1 Herstellung einer mit N,N'-Carbonyldiimidazol (CDI) oder N,N'-CarbonylditriazolExample 1 Preparation of an with N, N'-carbonyldiimidazole (CDI) or N, N'-carbonylditriazole
(CDT) aktivierten Polyurethanmatrix(CDT) activated polyurethane matrix
Die Experimente zur Herstellung einer CDI-aktivierten beziehungsweise CDT-aktivierten Polyurethanmatrix wurden wie folgt durchgeführt. 10 identische Polyurethanstücke (1 ,2 mm Dicke, 15 mm Durchmesser, 275 mg/Stück) wurden in einem Gemisch aus 90 ml trockenem Hexan (oder Petrolether 35/60) und 10 ml trockenem Aceton mit 1 g (6,25 mmol) CDI (Sigma, Steinheim) oder 1 g (6,1 mmol) CDT (Sigma, Steinheim) aktiviert.The experiments for the production of a CDI-activated or CDT-activated polyurethane matrix were carried out as follows. 10 identical polyurethane pieces (1.2 mm thick, 15 mm diameter, 275 mg / piece) were mixed in a mixture of 90 ml dry hexane (or petroleum ether 35/60) and 10 ml dry acetone with 1 g (6.25 mmol) CDI (Sigma, Steinheim) or 1 g (6.1 mmol) CDT (Sigma, Steinheim) activated.
In beiden Fällen lief die Reaktion in einem 250 ml Rundkolben eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Feuchtigkeitsausschluß und mäßigem Rühren. Danach wurde das Lösungsmittel abdekantiert und die CDI-aktivierten beziehungsweise CDT-aktivierten Polyurethanstücke auf silikonisiertem Trennpapier an der Luft bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Beispiel 2 Herstellung einer mit Thiocarbonydiimidazol (TCDI) aktivierten PolyurethanmatrixIn both cases, the reaction was run in a 250 ml round-bottomed flask for one hour at room temperature with the exclusion of moisture and moderate stirring. The solvent was then decanted off and the CDI-activated or CDT-activated polyurethane pieces were dried in air on siliconized release paper to constant weight. Example 2 Preparation of a polyurethane matrix activated with thiocarbonydiimidazole (TCDI)
Es wurden 10 identische Polyurethanstücke, wie in Beispiel 1 beschrieben, in 100 ml dest. Wasser mit 1 g Thiocarbonyldiimidazol (TCDI, Fiuka, 5,6 mmol) aktiviert. Die Reaktion lief zwei Stunden bei 32 °C und mäßigem Rühren in einem 250 ml Rundkolben.There were 10 identical polyurethane pieces, as described in Example 1, in 100 ml of dist. Water activated with 1 g thiocarbonyldiimidazole (TCDI, Fiuka, 5.6 mmol). The reaction ran for two hours at 32 ° C with moderate stirring in a 250 ml round bottom flask.
Danach wurde das Wasser abdekantiert, und die PU-Stücke wurden, nach dreimaligem Waschen mit destilliertem Wasser, auf silikonisiertem Trennpapier getrocknet.The water was then decanted off and, after washing three times with distilled water, the PU pieces were dried on siliconized release paper.
Beispiel 3Example 3
Kopplung der Spacermoleküle 6-Aminohexansäure oder 1,6-Diaminohexan an eineCoupling of the spacer molecules 6-aminohexanoic acid or 1,6-diaminohexane to one
PolyurethanmatrixPolyurethane matrix
10 identische Polyurethanstücke wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und anschließend in 20 ml NaHCO3-Puffer (100 mM, pH 8.0), im weiteren als Kopplungs-10 identical pieces of polyurethane were activated as described in Example 1 and then in 20 ml of NaHCO 3 buffer (100 mM, pH 8.0), subsequently as a coupling
, puffer bezeichnet, gelegt. Dazu wurden entweder 500 mg (3,81 mmol) 6-Aminohexan- säure analytical grade (Serva, Heidelberg) oder 500 mg (4,3 mmol) 1 ,6-Diaminohexan (Fluka, Buchs) gegeben., buffer designated, placed. Either 500 mg (3.81 mmol) of 6-aminohexanoic acid analytical grade (Serva, Heidelberg) or 500 mg (4.3 mmol) of 1, 6-diaminohexane (Fluka, Buchs) were added.
Die Reaktion lief über 18 Stunden bei Raumtemperatur, wobei intensiv gerührt wurde. Danach wurde die Pufferlösung abgegossen. Die Polyurethanstücke wurden dann insgesamt je dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, um Reste der nicht gekoppelten 6-Aminohexansäure oder des 1 ,6-Diaminohexans zu entfernen. Anschließend wurden die mit 6-Aminocarbonsäure beziehungsweise 1 ,6-Diaminohexan gekoppelten Polyurethanstücke an der Luft bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.The reaction ran at room temperature for 18 hours, with vigorous stirring. The buffer solution was then poured off. The polyurethane pieces were then washed a total of three times with distilled water in order to remove residues of the uncoupled 6-aminohexanoic acid or of the 1,6-diaminohexane. The pieces of polyurethane coupled with 6-aminocarboxylic acid or 1, 6-diaminohexane were then air-dried to constant weight.
Beispiel 4 Kopplung von Desferoxamin (DFO) an eine aktivierte PolyurethanmatrixExample 4 Coupling of desferoxamine (DFO) to an activated polyurethane matrix
10 identische Polyurethanstücke, die wie in den Beispielen 1 oder 2 angegeben aktiviert wurden, wurden in 20 ml Kopplungspuffer gelegt. Anschließend wurden je 200 mg DFO (0,30 mmol) (Sigma, Deisenhofen) zugegeben. Die Kopplungsreaktion lief unter intensi- vem Rühren über 18 Stunden bei Raumtemperatur ab. Danach wurde die Pufferlösung abgegossen und mehrfach durch destilliertes Wasser ersetzt, um unspezifisch gebundenes DFO aus dem Polymer herauszuwaschen.10 identical pieces of polyurethane, which were activated as indicated in Examples 1 or 2, were placed in 20 ml of coupling buffer. Then 200 mg DFO (0.30 mmol) (Sigma, Deisenhofen) were added. The coupling reaction ran under intense v Stir for 18 hours at room temperature. The buffer solution was then poured off and replaced several times with distilled water in order to wash out non-specifically bound DFO from the polymer.
Der Nachweis des Kopplungsproduktes aus Polyurethan und DFO erfolgte mit einer Farbreaktion, die zugleich einen Funktionalitäts-Assay darstellt: Durch Komplexbildung von Eisen mit gelöstem DFO entsteht im Verhältnis 1:1 der intensiv orange gefärbte DFO-Eisen-Ill-Komplex Ferrioxamin (Hallaway et al., 1989, PNAS, 86, 10108). Die DFO- gekoppelte Polyurethanmatrix wurde 2-3 Stunden mit 200 μM Eisensulfat (pH 5.0) unter leichtem Rühren inkubiert, wobei es zu einer braunroten Färbung der Polyurethanmatrix kam, die die Immobilisierung von DFO beweist. Abschließend wurde die Polyurethanmatrix mehrfach mit destilliertem Wasser gewaschen, um nichtgebundenes Eisen zu entfernen. Nach dem Stehenlassen über Nacht kam es zu einer Farbintensivierung der Muster. Eine Kontrolle mit nicht aktiviertem Polyurethan führte zu keiner Anfärbung mit Eisensulfatlösung.The coupling product made of polyurethane and DFO was detected using a color reaction, which is also a functionality assay: complex formation of iron with dissolved DFO results in a 1: 1 ratio of the intensely orange colored DFO-iron-III complex ferrioxamine (Hallaway et al ., 1989, PNAS, 86, 10108). The DFO-coupled polyurethane matrix was incubated for 2-3 hours with 200 μM iron sulfate (pH 5.0) with gentle stirring, resulting in a brown-red coloration of the polyurethane matrix, which proves the immobilization of DFO. Finally, the polyurethane matrix was washed several times with distilled water to remove unbound iron. After leaving to stand overnight, the color intensified. A control with inactive polyurethane did not lead to staining with iron sulfate solution.
Beispiel 5 Kopplung von bovinem Serumalbumin (BSA) an eine aktivierte PolyurethanmatrixExample 5 Coupling of bovine serum albumin (BSA) to an activated polyurethane matrix
10 identische Polyurethanstücke wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, aktiviert und danach in 20 ml Kopplungspuffer gelegt. Dazu gibt man 200 mg BSA (Serva, rezeptor grade, lyophilisiert, 2,985 μmol).10 identical polyurethane pieces were activated as described in Example 1 and then placed in 20 ml of coupling buffer. Add 200 mg BSA (Serva, receptor grade, lyophilized, 2,985 μmol).
Die Reaktion lief über 18 Stunden bei Raumtemperatur, wobei intensiv gerührt wurde. Danach wurde die Pufferlösung abdekantiert, und die Polyurethanstücke wurden insgesamt dreimal gewaschen, um unspezifisch gebundenes Protein von der Polyurethanmatrix zu lösen, zuerst mit einer 0,1 %igen wässrigen Polyoxyethylensorbitanmono- laurat-Lösung (Tween-20) von Fluka (Buchs), danach mit gesättigter NaCI-Lösung (Merck, Darmstadt) und zuletzt mit destilliertem Wasser.The reaction ran at room temperature for 18 hours, with vigorous stirring. The buffer solution was then decanted off and the polyurethane pieces were washed a total of three times in order to detach non-specifically bound protein from the polyurethane matrix, first with a 0.1% aqueous polyoxyethylene sorbitan monolaurate solution (Tween-20) from Fluka (Buchs), then with saturated NaCI solution (Merck, Darmstadt) and finally with distilled water.
Als Nachweis des an Polyurethan immobilisierten BSA wurde eine Färbung mit dem Fluoreszensfarbstoff Fluorescamin (Fluram®) von Fluka (Buchs) durchgeführt. 15 mg des Farbstoffs wurden in 10 ml trockenem Aceton aufgelöst. Zu einem BSA- gekoppelten Polyurethanstück, das in 1 ml eines NaHCO3-Puffers (100 mM, pH = 8.0) eingelegt war, wurden 250 μl der Fluorescaminlösung gegeben. Die Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszensmikroskop Fluovert FS (Leica, Bensheim) bei einer Anregungs- frequenz von 390 nm und einer Emissionsfrequenz von 475 nm beobachtet.As proof of the BSA immobilized on polyurethane, staining was carried out with the fluorescent dye Fluorescamin (Fluram®) from Fluka (Buchs). 15 mg of the dye was dissolved in 10 ml of dry acetone. 250 μl of the fluorescamine solution were added to a piece of polyurethane coupled to BSA, which was placed in 1 ml of a NaHCO 3 buffer (100 mM, pH = 8.0). The fluorescence was observed with a fluorescence microscope Fluovert FS (Leica, Bensheim) at an excitation frequency of 390 nm and an emission frequency of 475 nm.
Der Farbstoff reagierte spezifisch mit primären Aminogruppen des Proteins (S. Uden- fried et. al., 1972, Science 178, 871), wobei die Hydrolyseprodukte und der Farbstoff selbst nicht fluoreszierend waren. Die Zersetzung des Farbstoffes sowie die Bildung des fluoreszierenden Produktes erfolgten in wässriger Lösung sehr schnell, so daß keine Störungen durch Nebenreaktionen auftraten.The dye reacted specifically with primary amino groups of the protein (S. Udenfried et. Al., 1972, Science 178, 871), the hydrolysis products and the dye itself not being fluorescent. The decomposition of the dye and the formation of the fluorescent product took place very quickly in aqueous solution, so that there were no disturbances from side reactions.
An die Polyurethanmatrix immobilisierte Proteine können mit Trinitrobenzolsulfonsäure angefärbt werden (P. Cuatrecasas, C.B. Anfinsen, Affinity Chromatographie, Methods of Enzymologie, 1971 , 22, S.363). Zu einem Polyurethanstück mit immobilisiertem BSA in 30 ml destilliertem Wasser wurden 500 μl einer 5%igen wässrigen TNBS-Lösung gegeben. Die Lösung wurde unter Rühren eine Stunde auf dem Wasserbad erhitzt. Danach wurde unspezifisch gebundener Farbstoff mit destilliertem Wasser von der Polyurethanmatrix entfernt. Dieser Vorgang wurde solange wiederholt, bis das Wasch- wasser farblos blieb. Es konnte gezeigt werden, daß die mit Enzym gekoppelte Polyurethanmatrix im Vergleich zu einer unbehandelten Polyurethanmatrix eine orange Färbung der Polyurethanmatrix aufwies.Proteins immobilized on the polyurethane matrix can be stained with trinitrobenzenesulfonic acid (P. Cuatrecasas, C.B. Anfinsen, Affinity Chromatographie, Methods of Enzymologie, 1971, 22, p.363). 500 μl of a 5% aqueous TNBS solution were added to a piece of polyurethane with immobilized BSA in 30 ml of distilled water. The solution was heated on the water bath with stirring for one hour. The non-specifically bound dye was then removed from the polyurethane matrix using distilled water. This process was repeated until the wash water remained colorless. It could be shown that the polyurethane matrix coupled with enzyme had an orange coloration of the polyurethane matrix compared to an untreated polyurethane matrix.
Beispiel 6 Kopplung von Superoxiddismutase (SOD) an eine aktivierte PoiyurethanmatrixExample 6 Coupling of Superoxide Dismutase (SOD) to an Activated Polyurethane Matrix
Als Enzym wurde Hefe-SOD, Dismutin® BT, (Pentapharm, Basel) eingesetzt. Vor dem Einsatz in die Kopplungsreaktion mit der aktivierten Polyurethanmatrix wurde die SOD- Lösung umgepuffert, um Stabilisatoren wie zum Beispiel Parabene abzutrennen. Dazu wurden 2 ml der SOD-Lösung in einen Mikrokonzentrator (Amincon, Witten) mit einem Ausschlußvolumen von 10 kDa pipettiert. Dann wurde in einer Zentrifuge (Hettich, Modell EBA 3S, Tuttlingen) bei einer Drehzahl von 3000 rpm 30 Minuten zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen und der Überstand mit 1 ml des Kopplungspuffers oder Wasser aufgefüllt. Dieser Vorgang wurde 3 mal wiederholt und anschließend wurde die SOD-Lösung in einer Konzentration von 1 ,5 mg/ml (1 : 10 Verdünnung) für die Kopplung mit dem aktivierten Polyurethan eingesetzt.The enzyme yeast SOD, Dismutin ® BT, (Pentapharm, Basel) was used. Before being used in the coupling reaction with the activated polyurethane matrix, the SOD solution was buffered in order to separate stabilizers such as parabens. For this purpose, 2 ml of the SOD solution were pipetted into a microconcentrator (Amincon, Witten) with an exclusion volume of 10 kDa. The mixture was then centrifuged in a centrifuge (Hettich, model EBA 3S, Tuttlingen) at a speed of 3000 rpm for 30 minutes. The filtrate was discarded and the supernatant made up with 1 ml of the coupling buffer or water. This process was repeated 3 times and then the SOD solution in a concentration of 1.5 mg / ml (1:10 dilution) is used for coupling with the activated polyurethane.
Die Kopplungsreaktion wurde mit 10 identischen Polyurethanstücken durchgeführt, wobei die Aktivierungsreaktionen aus den Beispielen 1 angewandt wurden. Kopplungsbedingungen und Aufarbeitung der Produkte sind identisch wie in Beispiel 5 für die Kopplung von BSA an eine Polyurethanmatrix beschrieben.The coupling reaction was carried out using 10 identical polyurethane pieces, the activation reactions from Examples 1 being used. Coupling conditions and processing of the products are identical to those described in Example 5 for coupling BSA to a polyurethane matrix.
Der Nachweis der Kopplung der Hefe-SOD an die Polyurethan-Matrix wurde mit einem ELISA geführt. Zunächst wurde die mit SOD-immobilisierte PU-Gelmatrix mit einem humanen Anti-(Cu/Zn)-Superoxiddismutase-Antikörper aus Schaf (Calbiochem, Nr. 574597) in einer Verdünnung von 1 : 500 bei Raumtemperatur für eine Stunde in einer 24-Well-Zellkulturplatte (Greiner, Frickenhausen) inkubiert. An diesen primären anti- (Cu/Zn)-SOD-Antikörper band ein sekundärer Antikörper, der mit einer Peroxidase kon- jugiert ist. Das Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) wurde durch die Peroxidase umgesetzt, woraus eine Farbreaktion resultierte, die spektroskopisch quantifiziert werden kann. Nach dem Abstoppen der Farbreaktion wurden je 150 μl der Lösungen in ein Well einer 96-Well-Mikrotiterplatten transferiert und mit einem ELISA-Reader MR 5000 (Dynex, Denkendorf) photometrisch bei 450 nm bestimmt bei einer Referenz von 550 nm.The detection of the coupling of the yeast SOD to the polyurethane matrix was carried out using an ELISA. First, the SOD-immobilized PU gel matrix with a human anti (Cu / Zn) superoxide dismutase antibody from sheep (Calbiochem, No. 574597) was diluted 1: 500 at room temperature for one hour in a 24-well - Cell culture plate (Greiner, Frickenhausen) incubated. A secondary antibody, conjugated with a peroxidase, bound to this primary anti (Cu / Zn) SOD antibody. The substrate tetramethylbenzidine (TMB) was converted by the peroxidase, which resulted in a color reaction that can be quantified by spectroscopy. After the color reaction had stopped, 150 μl of the solutions were transferred into a well of a 96-well microtiter plate and determined photometrically at 450 nm with an ELISA reader MR 5000 (Dynex, Denkendorf) at a reference of 550 nm.
Für die Positivkontrolle wurde eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit Rundboden (Greiner, Frickenhausen) mit 20 μg/ml Hefe-SOD Dismutin® BT (Pentapharm, Basel) in je 1 ml Puffer (50 mM NaHCO3, pH 9.4) pro Well beschichtet und über Nacht im Kühlschrank bei 4° C inkubiert. Anschließend wurden mit je 1 ml pro Well an 20%igem Schweine- Serum (Gibco, Karlsruhe) für eine Stunde auf dem Schüttler bei Raumtemperatur die unspezifischen Bindungen blockiert. Nach 4 mal Waschen mit PBS-Puffer (135 mM NaCI, 3 mM KCI, 8 mM KH2PO4, 1 ,5 mM Na2HPO4, pH 7.5) mit 0,01% Tween-20 (Merck, Darmstadt) wurde der primäre Anti-(Cu/Zn)-Superoxiddismutase-Antikörper aus Schaf in einer Verdünnung von 1 : 500 in Verdünnungspuffer (0,5% Tween-20, 2% Schweine- Serum in PBS-Puffer) mit je 1 ml pro Well für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Danach wurde wiederum 4 mal mit Waschpuffer gewaschen und Peroxidase-konjugiertes Anti-Schaf IgG (Dianova, Nr. 713-035-147) als sekundärer Antikörper in einer Verdünnung von 1:10.000 je 1 ml pro Well eine Stunde bei Raum- temperatur auf dem Schüttler inkubiert. Nach weiterem 4-maligen Waschen mit Waschpuffer wurde die TMB-Substratlösung durch Auflösen von (10 mg/mL DMSO) und anschließender Zugabe von 70 μl TMB-Stammlösung zu 10 ml Acetatpuffer hergestellt. Pro Well wurden 1 ml der TMB-Lösung zugegeben und mit 13 μl H2O2 (3%) gestartet und für 20 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Nach 20 min wurde die entstehende Farbreaktion durch Zugabe von 140 μl pro Well 2M H2SO4 abgestoppt und mit einem ELISA-Reader MR 5000 photometrisch bei 450 nm bestimmt bei einer Referenz von 550 nm.For the positive control, a 96-well microtiter plate with round bottom (Greiner, Frickenhausen) was coated with 20 μg / ml yeast SOD Dismutin® BT (Pentapharm, Basel) in 1 ml buffer (50 mM NaHCO 3 , pH 9.4) per well and incubated overnight in the refrigerator at 4 ° C. The non-specific bindings were then blocked with 1 ml per well of 20% pig serum (Gibco, Karlsruhe) for one hour on a shaker at room temperature. After washing 4 times with PBS buffer (135 mM NaCl, 3 mM KCI, 8 mM KH 2 PO 4 , 1.5 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.5) with 0.01% Tween-20 (Merck, Darmstadt) the primary anti (Cu / Zn) superoxide dismutase antibody from sheep in a dilution of 1: 500 in dilution buffer (0.5% Tween-20, 2% porcine serum in PBS buffer) with 1 ml per well for incubated for one hour at room temperature on the shaker. Then it was washed again 4 times with washing buffer and peroxidase-conjugated anti-sheep IgG (Dianova, No. 713-035-147) as a secondary antibody in a dilution of 1: 10,000 per 1 ml per well for one hour at room temperature. temperature incubated on the shaker. After a further 4 washes with washing buffer, the TMB substrate solution was prepared by dissolving (10 mg / mL DMSO) and then adding 70 μl of TMB stock solution to 10 ml acetate buffer. 1 ml of the TMB solution was added per well and started with 13 μl H 2 O 2 (3%) and incubated for 20 min at room temperature on the shaker. After 20 min, the resulting color reaction was stopped by adding 140 μl per well of 2M H 2 SO 4 and determined photometrically at 450 nm with an ELISA reader MR 5000 at a reference of 550 nm.
Beispiel 7Example 7
Kopplung von Hefe-SOD an eine Polyurethanmatrix über die Spacer 6-Aminohexansäure und 1,6-DiaminohexanCoupling of yeast SOD to a polyurethane matrix via the spacers 6-aminohexanoic acid and 1,6-diaminohexane
Polyurethanstücke, vorbehandelt mit einem 6-Aminohexansäure-Spacer oder 1 ,6- Diaminohexan-Spacer, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden in 20 ml destilliertemPieces of polyurethane, pretreated with a 6-aminohexanoic acid spacer or 1,6-diaminohexane spacer as described in Example 2, were distilled in 20 ml
Wasser (pH-Wert mit 0,02 M Salzsäure auf 4,5 eingestellt) eingelegt. Unter leichtemWater (pH adjusted to 4.5 with 0.02 M hydrochloric acid). Under easy
Rühren wurden dazu 500 mg (2,61 mmol) N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimid-hydrochlorid (EDC) zugesetzt und nach 1 Minute 10 ml einer SOD LösungFor this purpose, 500 mg (2.61 mmol) of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) were added, and after 1 minute 10 ml of an SOD solution
(1 ,5 mg/ml) hinzugegeben. Die Kopplungsreaktion der Hefe-SOD an die Polyurethanmatrix lief für 18 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Bei(1.5 mg / ml) was added. The coupling reaction of the yeast SOD to the polyurethane matrix ran for 18 hours at room temperature with gentle stirring. at
Aufarbeitung und Reinigung des Polymers wurde wie unter Kopplung von bovinemWorkup and purification of the polymer was like coupling bovine
Serumalbumin (BSA) an eine aktivierte Polyurethanmatrix (Beispiel 5) beschrieben, verfahren. Als Nachweis der Kopplungsreaktion wurde ein ELISA durchgeführt (sieheSerum albumin (BSA) described on an activated polyurethane matrix (Example 5). An ELISA was carried out as evidence of the coupling reaction (see
Beispiel 6). Example 6).

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Herstellung einer Poiyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen, wobei die Polyurethanmatrix in einem Lösungsmittelgemisch vorgelegt wird, wobei das Lösungsmittelgemisch zumindest zu 80% unpolare Lösungsmittel enthält, in dem die Polyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Aktivierungsreagenz befindet, so daß die anschließende Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der Polyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet.1. Process for the preparation of a polyurethane matrix with covalently immobilized biomolecules, the polyurethane matrix being placed in a solvent mixture, the solvent mixture containing at least 80% non-polar solvent in which the polyurethane matrix does not swell or only swells slightly and in which the activation reagent is located, so that the subsequent immobilization of the biomolecule preferably takes place on the surface of the polyurethane matrix or on layers near the surface.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyurethanmatrix ein Polyurethangel oder ein daraus hergestellter Polyurethanschaum oder eine daraus hergestellte Polyurethan-Folie ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the polyurethane matrix is a polyurethane gel or a polyurethane foam made therefrom or a polyurethane film made therefrom.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittelgemisch aus ungefähr 80% bis 95% der unpolaren Lösungsmittel und aus ungefähr 20% bis 5% der polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel besteht, insbesondere aus 90% der unpolaren Lösungsmittel und 10 % der polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel, wobei die polaren bis leicht polaren organischen Lösungsmittel insbesondere gewählt sind aus der Gruppe Aceton, Ether, Ketone,3. The method according to claim 1, characterized in that the solvent mixture consists of approximately 80% to 95% of the non-polar solvents and from approximately 20% to 5% of the polar to slightly polar organic solvents, in particular from 90% of the non-polar solvents and 10% the polar to slightly polar organic solvents, the polar to slightly polar organic solvents being selected in particular from the group acetone, ether, ketones,
Ester, Amide.Esters, amides.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das unpolare Lösungsmittel Hexan, Heptan und/oder Petrolether ist.4. The method according to claim 1, characterized in that the non-polar solvent is hexane, heptane and / or petroleum ether.
5. Verfahren zur Herstellung einer Polyurethanmatrix mit kovalent immobilisierten Biomolekülen, wobei die Polyurethanmatrix in Wasser als Lösungsmittel vorgelegt wird, in dem die Poiyurethanmatrix gar nicht oder nur schwach quillt und in dem sich das Aktivierungsreagenz Thiocarbonyldiimidazol befindet, so daß die anschließende Immobilisierung des Biomoleküls bevorzugt an der Oberfläche der5. A process for producing a polyurethane matrix with covalently immobilized biomolecules, the polyurethane matrix being placed in water as a solvent, in which the polyurethane matrix does not swell or only swells, and in which the activating reagent thiocarbonyldiimidazole is located, so that the subsequent immobilization of the biomolecule is preferred the surface of the
Poiyurethanmatrix oder an oberflächennahen Schichten stattfindet. Polyurethane matrix or on layers near the surface.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Chelatoren, Enzyminhibitoren, Enzymen, Peptiden und anderen Proteinen ausgewählt ist.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the biomolecule is selected from the group consisting of antibodies, chelators, enzyme inhibitors, enzymes, peptides and other proteins.
7. Verwendung der nach einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellten Poiyurethanmatrix zur Herstellung von Wundauflagen.7. Use of the polyurethane matrix produced according to one of the preceding claims for the production of wound dressings.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Poiyurethanmatrix kovalent gebundene Biomolekül mit in Wundexsu- dat vorhandenen Störfaktoren, die den Wundheilungsprozeß behindern, wechselwirkt, wobei die Störfaktoren aus der Gruppe bestehend aus suspendierten Zellen und Zellfragmenten sowie gelösten Bestandteilen wie Antigene, Radikale, Ionen, Proteine, Peptide, Lipide und freie Fettsäuren ausgewählt sind, wobei die Wechselwirkung ein Binden, Komplexieren, Chelatisieren des Störfaktors oder eine chemi- sehe Reaktion mit dem Störfaktor umfaßt und wobei die Substanzen kovalent an ein8. Use according to one of the preceding claims, characterized in that the biomolecule covalently bonded in the polyurethane matrix interacts with disturbing factors present in wound exudate, which hinder the wound healing process, the disturbing factors from the group consisting of suspended cells and cell fragments and dissolved constituents such as antigens, radicals, ions, proteins, peptides, lipids and free fatty acids are selected, the interaction comprising binding, complexing, chelating the interfering factor or a chemical reaction with the interfering factor and wherein the substances are covalently attached to one
Trägermaterial gebunden sind.Carrier material are bound.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wundauflage aus der Gruppe bestehend aus Verbänden, Verbandmull, Binden, Kompressen, Watten, Pflastern, Folien, Filmen, Hydrokolloidverbänden,9. Use according to one of the preceding claims, characterized in that the wound dressing from the group consisting of bandages, gauze, bandages, compresses, cotton, plasters, foils, films, hydrocolloid bandages,
Gelen und dergleichen ausgewählt ist. Gels and the like is selected.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4098645A (en) * 1976-02-24 1978-07-04 W. R. Grace & Co. Immobilization of proteins with polyurethane polymers
US4250267A (en) * 1977-11-10 1981-02-10 W. R. Grace & Co. Immobilized biological material
CA1173387A (en) * 1980-09-17 1984-08-28 Wayne E. Swann Process for production of l-aspartic acids using immobilized microorganisms
DE3705687A1 (en) * 1987-02-23 1988-09-01 Boehringer Mannheim Gmbh POLYURETHANE MODIFIED ENZYMS
DE4308445A1 (en) * 1993-03-17 1994-09-22 Beiersdorf Ag Wound dressing based on hydrophilic polyurethane gel foams and process for their production

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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